Плотникова Ольга Михайловна Plotnikova Olga Mikhailovna Евдокимов Александр Николаевич кандидат химических наук,

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ И ФИЗИКА
УДК 577:574.24:612.019:591.1:351.777.61
ББК 28.672:52.84
Плотникова Ольга Михайловна
кандидат химических наук,
доцент
г. Курган
Plotnikova Olga Mikhailovna
Candidate of Chemistry,
Assistant Professor
Kurgan
Евдокимов Александр Николаевич
Научный сотрудник
г. Курган
Evdokimov Aleksandr Nikolaevich
Research Officer
Kurgan
Григорович Максим Александрович
кандидат биологических наук
г. Курган
Grigorovich Maksim Aleksandrovich
Candidate of Biology
Kurgan
Активность печеночных ферментов после введения
метилфосфоновой кислоты самцам лабораторных мышей
Liver Enzyme Changes in Response to Methylphosphonic Acid Insertion to
Male Laboratory Mice
Резюме: Показано, что после внутримышечного введения самцам
лабораторных мышей метилфосфоновой кислоты (МФК) в высоких (50, 2 мг/кг
массы животного) и низких (10-12, 10-15, 10-18 мг/кг) дозах через 3 суток
активность холинэстеразы, аспартат- и аланинаминотрансфераз плазмы крови
уменьшалась в среднем на 20-40% (в отличие от средних доз МФК, введение
которых мало влияло на активность этих ферментов); через 12 недель после
еженедельного введения низкой (10-15 мг/кг) дозы МФК активность ферментов
повышалась на 20-70%. Пероральное введение МФК не приводило к
достоверному изменению активности указанных ферментов.
Summary: It is shown that after intramuscular injection of methylphosphonic
acid (MPA) to the male laboratory mice in high (50, 2 mg/kg of animal weight) and
low (10-12, 10-15, 10-18 mg/kg) doses the activity of a cholinesterase and aspartate- and
alaninaminotranspherases of the blood plasma has decreased on the average of 2040% after 3 days (in contrast to the average doses of MPA, the injection of which has
had a little effect on the activity of these enzymes); 12 weeks after the injection of
low (10-15 mg/kg) dose of MPA the enzymes activity has increased by 20-70%. Oral
administration of the MPA has nor led to the significant changes in the activity of
these enzymes.
321
Вестник ЧГПУ 7’2011
Ключевые
слова:
метилфосфоновая
кислота,
активность
аминотрансфераз, холинэстеразы, плазма крови лабораторных мышей.
Key words: methylphosphonic acid, transaminases and cholinesterase activity,
blood plasma of laboratory mice.
Исследования
устойчивости
живых
организмов
к
действию
загрязняющих веществ антропогенного характера и в первую очередь
ксенобиотиков, которые не входят в биотический круговорот, а являются
прямым или косвенным продуктом хозяйственной деятельности человека,
является актуальным, так как ксенобиотики прочно вошли в нашу жизнь.
Наиболее опасными ксенобиотиками окружающей среды (Программа ООН по
окружающей среде, 2005 г.) наряду с хлорорганическими соединениями и
тяжелыми металлами, являются фосфорорганические соединения (ФОС),
поэтому проведение исследований по выявлению влияния ФОС на живые, и
особенно на теплокровные, организмы является актуальным.
Особый интерес к проблеме загрязнения ФОС окружающей среды в
настоящее время вызван широким использованием фосфонатов в сельском
хозяйстве в виде пестицидов (хлорофос, глифосат) и идущим в России
уничтожением фосфорорганических отравляющих веществ – зарина, зомана,
ви-икс, в результате гидролитического разложения которых образуются эфиры
и
соли
метилфосфоновой
химического
оружия в
кислоты
США
(МФК).
подтверждают
Результаты
уничтожения
возможность
загрязнения
метилфософонатами природных сред [10], а исследования воздействия
глифосата на живые организмы не исключают его влияния на активность
детоксицирующих ферментов в печени крыс [9].
В настоящее время влияние МФК на растительный и животный мир
изучено недостаточно: имеются данные о влиянии МФК на рост и
ферментативную активность растений [3, 7] и на биохимические субстраты
метаболизма лабораторных мышей в краткосрочном эксперименте [4], поэтому
изучение влияния МФК на живые организмы остается актуальным.
Одним из самых чувствительных показателей у живых организмов
является активность ферментов, все чаще используемая при экологических и
медицинских тестированиях [6]. Так, мониторинг активности сывороточной
холинэстеразы обязателен для людей, работающих с ФОС.
Вестник ЧГПУ 7’2011
322
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ И ФИЗИКА
Целью работы было изучение влияния различных доз МФК на активность
важнейших ферментов печени лабораторных мышей – холинстеразы (ХЭ),
аспартат- (АСТ) и аланин- (АЛТ) аминотрансфераз.
Объекты и методы исследования. Исследования проводили на самцах
лабораторных мышей (280 особей) линии СВА в возрасте 3-х месяцев массой
26±2 г, которые содержались в стандартных условиях аттестованного вивария.
Все работы проводили согласно принципам гуманного отношения к животным
в соответствии с международными рекомендациями по проведению медикобиологических исследований с использованием животных и правилами
лабораторной практики в Российской Федерации [5].
Животные были разделены на опытные и контрольные группы по 20
особей в каждой. Самцам опытных групп вводили нейтрализованные водные
растворы
МФК
соответствующей
концентрации
в
объеме
0,1
мл
(внутримышечно) или 1 мл (перорально), животным контрольных групп –
физиологический раствор того же объема. После декапитации у животных
брали цельную кровь, из которой после центрифугирования получали плазму.
Работа выполнялась в два этапа. На первом этапе было изучено влияние
различных доз МФК (высоких – 50, 2, средних – 10-3, 10-6, 10-9 и низких – 10-12,
10-15, 10-18 мг/кг массы животного) на активность ферментов ХЭ, АСТ и АЛТ
через 3 суток (острый эксперимент) после внутримышечного введения МФК
самцам лабораторных мышей и выявлены особенности изменения активности
ферментов. На втором этапе было исследовано влияние высокой (2 мг/кг) и
низкой (10-15 мг/кг) доз МФК после еженедельного введения в течение 12
недель растворов МФК одним группам мышей внутримышечно, другим –
перорально (хронический эксперимент).
Совокупности полученных экспериментальных данных в каждой выборке
обрабатывались все чаще используемыми в биологии и медицине методами
непараметрической статистики [1]. Результаты исследования представляли в
виде медианы, на основании которой считали различия значений в процентах
(%) в опытных группах относительно контрольных. Интерквартильные размахи
представлены в виде 25-го и 75-го процентилей. Достоверность различий
между двумя выборками оценивали с использованием W-критерия Вилкоксона323
Вестник ЧГПУ 7’2011
Манна-Уитни для независимых выборок. Критический уровень значимости при
проверке статистических гипотез принимали менее 0,05.
Активность ферментов определяли кинетическим фотометрическим
методом на биохимическом анализаторе StatFax 3300 (наборные методы
«ВекторБест», г. Новосибирск). Метод измерения активности ХЭ основан на
свойстве фермента гидролизовать бутирилтиохолин с образованием масляной
кислоты и тиохолина, который восстанавливает окрашенный гексацианоферрат
(III) – скорость снижения оптической плотности раствора (λ=405 нм)
пропорциональна активности ХЭ. При определении активности АСТ и АЛТ
использованы свойства L-аспартата и L-аланина взаимодействовать с αкетоглутаратом с образованием L-глутамата и оксалоацетата или пирувата,
которые восстанавливаются, соответственно, до яблочной (в присутствии
малатдегидрогеназы) или молочной (в присутствии лактатдегидрогеназы)
кислот в реакции с НАДН – скорость изменения оптической плотности
растворов при 320 нм прямо пропорциональна активности АСТ или АЛТ.
Результаты и их обсуждение. У самцов контрольных групп (n=20) в
период выполнения исследований для изучаемых ферментов были определены
следующие (принятые за контрольные) значения активностей (мккат/л): для ХЭ
– 113 (98-121), для АСТ – 4,37 (4,15-4,71), АЛТ – 1,14 (0,91-1,25); коэффициент
де Ритиса (отношение АСТ к АЛТ) составил 4,21 (3,31-4,93).
Результаты изменения активности изученных ферментов (рис. 1)
показали, что в плазме крови самцов через 3 суток после внутримышечного
введения
различных
доз
МФК
в
целом
все
показатели
изменялись
волнообразно. При этом активность АЛТ оставалась во всех вариантах
эксперимента ниже значений в контрольной группе. Особенностью является,
что после введения мышам как высоких, так и низких доз МФК уменьшались
примерно одинаково активности ХЭ (на 18-42%), АЛТ (на 27-45%), а после
введения средних доз МФК отмечены наименьшие изменения активностей всех
изучаемых ферментов. Снижение активности АЛТ привело к увеличению
интегрального показателя – коэффициента де Ритиса, отражающего состояние
печени, который был повышен у самцов всех опытных групп, но максимально в
1,4 раза после введения МФК в дозах 2 и 10-18 мг/кг массы животного.
Вестник ЧГПУ 7’2011
324
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ И ФИЗИКА
160
% от контроля
140
120
**
*
***
**
100
80
60
40
*
***
***
*
*
**
***
*
*
*
**
***
***
20
0
50
2
-3
-6
10
-9
10
ХЭ
10
АСТ
-12
-15
10
10
-18
10
АЛТ
Рис. 1. Изменение активности ХЭ, АСТ, АЛТ и коэффициента де Ритиса в плазме крови
самцов лабораторных мышей через 3 суток после введения различных доз МФК:
Примечания: 1) по оси абсцисс значения концентраций МФК в мг/кг массы животного;
2) достоверные отличия: * - при р<0,05, ** - при р<0,005, *** - при р<0,0005.
Понижение активности АЛТ может быть вызвано дефицитом его
кофермента – пиридоксальфосфата за счет переэтерификации с МФК, а также
при
состояниях,
связанных
с
повреждением
гепатоцитов,
способных
синтезировать АЛТ. Снижение активности ХЭ в сыворотке крови характерно
при
отравлениях
фосфорорганическими
отравляющими
веществами
и
инсектицидами, которые необратимо ингибируют активный центр этого
фермента [2]. Можно предположить, что МФК в активном центре ХЭ
взаимодействует с ОН-группой серина, приводя к обратимому ингибированию.
Для доз МФК 2 и 10-15 мг/кг, которые вызвали наибольшее число
достоверных и максимальных изменений в изучаемых показателях, был
выполнен хронический эксперимент, результаты которого обобщены на рис. 2.
Еженедельное (в течение 12 недель) внутримышечное введение самцам
лабораторных мышей растворов МФК привело к повышению активностей ХЭ и
аминотрансфераз, а пероральное введение МФК в течение этого же срока,
напротив, не вызвало достоверных изменений в активности этих ферментов.
Коэффициент де Ритиса достоверно уменьшался на 24% только после
внутримышечного введения МФК в дозе 2 мг/кг.
325
Вестник ЧГПУ 7’2011
180
**
% от контроля
160
**
140
ХЭ
*
120
АСТ
100
АЛТ
80
60
40
-15
2 мг/кг
10 мг/кг
внутримышечно
-15
2 мг/кг
10 мг/кг
перорально
Рис. 2. Изменение активности ферментов в плазме крови самцов через 12 недель после
внутримышечного, перорального введения высоких и низких доз МФК. Примечания: см. рис. 1.
Заключение. Таким образом, результаты острого 3-х суточного
эксперимента показали, что МФК в высоких и очень низких дозах влияла на
активность основных печеночных ферментов – ХЭ, АЛТ и АСТ, приводя после
внутримышечного введения, в основном, к уменьшению их активности и
увеличению коэффициента де Ритиса. Однако при хроническом воздействии в
течение 12 недель как высокой (2 мг/кг), так и низкой (10-15 мг/кг) доз МФК
снижение активности ферментов сменилось повышением их активности. Это
может
свидетельствовать
о
достаточных
адаптационных
возможностях
гепатоцитов к кратковременным хроническим нагрузкам фосфорорганических
ксенобиотиков, а также указывать на обратимость ингибирования ХЭ.
Показатели активности ХЭ и АЛТ, коэффициент де Ритиса могут быть
использованы в качестве биохимических маркеров при оценке воздействия на
теплокровные организмы метилфософнатов в высоких и низких дозах.
Библиографический список
1. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – М.: Практика, 1998. –
459 с.
2. Общая токсикология / ред. Б. А. Курляндского. М.: Медицина, 2002. – 608 с.
3. Огородникова, С.Ю. Реакция растений на действие метилфосфоновой кислоты /
С.Ю. Огородникова, Т.К. Головко // Теоретическая и прикладная экология. – 2007. № 1. – С.
78-93.
4. Плотникова, О.М. Особенности влияния различных доз метилфосфоновой
кислоты на основные биохимические показатели метаболизма лабораторных мышей / О.М.
Плотникова, И.В. Савинова, Н.Н. Матвеев, А.М. Корепин, А.Н. Евдокимов, С.Н. Лунева //
Вестник Челябинского государственного педагогического университета. – 2011. № 1. – С.
307-316.
5. Правила лабораторной практики в Российской Федерации. Приказ МЗ № 267. –
М.: 2003.
Вестник ЧГПУ 7’2011
326
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ И ФИЗИКА
6. Рощина, О.В. Влияние природных и антропогенных факторов на активность
ферментов сыворотки крови черноморских рыб (на примере морского ерша): автореф.
дис….канд. биол. наук / О.В. Рощина. – М., 2010. – 25 с.
7. Серебрякова, Н.Н. Влияние ксенобиотиков на физиологию и биохимию
листостебельных мхов / Н.Н. Серебрякова // Вестник Оренбургского гос. университета. – 2007. –
№ 12. – С. 71-75.
8. Требования Международного комитета по науке по использованию в
экспериментальных исследованиях лабораторных животных // Бюллетень ИКЛАС. – 1978. №
24. – С. 4-5.
9. Daruich, J. Effect of the herbicide glyphosate on enzymatic activity in pregnant rats and
their fetuses / J. Daruich, F. Zirulnik // Environmental Research. – 2001. V. 85. – № 3. – P. 226231.
10. Munro, N.B. The sources, fate and toxicity of chemical warfare agent degradation
products / N.B. Munro, S.S. Talmage, G.D. Griffin, L.C. Waters, A.P. Watson, J.F. King, V.
Hauschild // Environmental Health Perspectives. – 1999. – V. 107. – № 12. – P. 933-974.
Bibliography
1. Daruich, J. Effect of the Herbicide Glyphosate on Enzymatic Activity in Pregnant Rats
and Their Fetuses / J. Daruich, F. Zirulnik // Environmental Research. – 2001. – № 3. – P. 226-231.
2. Glants, S. Medico-Biological statistics / S. Glants. – M.: Practika, 1998. – 459 p.
3. General Toxicology / Ed. by B.A. Kurlyandski. - M.: Medicine, 2002. – 608 p.
4. Munro, N.B. The Sources, Fate and Toxicity of Chemical Warfare Agent Degradation
Products / N.B. Munro, S.S. Talmage, G.D. Griffin, L.C. Waters, A.P. Watson, J.F. King, V.
Hauschild // Environmental Health Perspectives. – 1999. – V. 107. – № 12. – P. 933-974.
5. Ogorodnikova, S.Yu. Plants Reaction on Methylphosphonic Acids / S.Yu.
Ogorodnikova, Т.К. Golovko // Theoretical and Applied Ecology. – 2007. - № 1. – P. 78-93.
6. Plotnikova, O. M. Particularities of Different Doses Influence of Methyilphosphonic
Acids on the Main Biochemical Factors of the Metabolism of Laboratory Mice // I.V. Savinova,
N.N. Matveev, A.M. Korepin, A.N. Evdokimov, S.N. Luneva / Herald of Chelyabinsk State
University. – 2011. - № 1. – P. 307-316.
7. Requirements of the International Committee on Science on the Usage of Experimental
Studies of lLboratory Animals // Bulletin of IKLAS. – 1978. - № 24. – P. 4-5.
8. Roshchina, O.V. Influence of Natural and Anthropogenic Dactors on the Enzyme
Activity of the Fish Blood Serum in the Black Sea (By the Example of the Rock-Fish): Synopsis of
Diss. .... Cand. of Biol. / O.V. Roshchina. – М., 2010. – 25 p.
9. Serebraykova, N.N. Xenobiotics Influence on the Physiology and Biochemistry of the
Leaf Mosses / N.N. Serebraykova // Herald of Orenburg State University. – 2007. – № 12. – P. 71-75.
10. The Rules of Laboratory Practices in the Russian Federation: Ministry of Health Order
№ 267. – М., 2003.
327
Вестник ЧГПУ 7’2011