ЦИТОКИНОВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ АДГЕЗИОННЫХ МОЛЕКУЛ ICAM 1 И ПРОДУКЦИИ ХЕМОКИНА IL 8

Реклама
Ìåäèöèíñêàÿ èììóíîëîãèÿ
2000, Ò. 2, ¹ 1, ñòð 25-33
© 2000, ÑÏá ÐÎ ÐÀÀÊÈ
Îðèãèíàëüíûå ñòàòüè
ЦИТОКИНОВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ
АДГЕЗИОННЫХ МОЛЕКУЛ ICAM 1 И
ПРОДУКЦИИ ХЕМОКИНА IL 8
ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ
Соколов Д.И., Кузнецова С.А., Котов А.Ю.*, Симбирцев А.С.*,
Барышников А.Ю#., Полосухина Е.Р.#, Шейкин Ю.А.,Фрейдлин И.С.
*Институт экспериментальной медицины РАМН,
ГНЦ НИИ особочистых биопрепаратов, СанктПетербург;
#
Онкологический Научный Центр им.Н.Н.Блохина, Москва.
Резюме. При воспалении и иммунном ответе эндотелиальные клетки становятся мишенями действия
провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Активированные ЭК сами способны синтезиро
вать хемокин IL-8 и экспрессировать адгезионные молекулы, в частности, ICAM-1. Целью настоящего ис
следования явилось сравнительное изучение секреции IL8 и экспрессии ICAM1 (CD54) эндотелиальны
ми клетками перевиваемой человеческой линии ECV304, инкубированными в присутствии отдельных
цитокинов и различных их сочетаний. Клетки линии ECV304 отвечали на инкубацию с TNF-α трехкрат
ным усилением секреции IL8 и двукратным усилением экспрессии ICAM1. При совместном действии с
TNF-α IFN-γ поразному модулировал его стимулирующие эффекты в отношении ЭК: усиливал стимуля
цию экспрессии ICAM1 и ослаблял стимуляцию секреции IL-8. GM-CSF уменьшал стимулирующие эф
фекты провоспалительных цитокинов на экспрессию ICAM1 и секрецию IL-8 клетками ECV304. Эффек
ты противовоспалительного цитокина IL-10 оказались альтернативными в отношении секреции IL-8 и экс
прессии ICAM-1 клетками ECV304: он снижал стимулирующее действие провоспалительных цитокинов
на секрецию IL-8, но существенно усиливал стимулирующее действие провоспалительных цитокинов на
экспрессию ICAM-1. Обсуждаются кооперативные эффекты цитокинов на ЭК и возможности использова
ния перевиваемой линии ECV304 для изучения участия ЭК в воспалении и иммунном ответе.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: öèòîêèíû, àäãåçèîííûå ìîëåêóëû, ýíäîòåëèàëüíûå êëåòêè
Sokolov D., Kouznetsova S., Kotov A., Simbirtsev A., Baryshnikov A., Polosuchina E., Cheikine I., Freidlin I.
CYTOKINE REGULATION OF ADHESION MOLECULE ICAM-1 EXPRESSION AND CHEMOKINE
IL-8 PRODUCTION BY ENDOTHELIAL CELLS
Abstract. In inflammation and immune response endothelial cells (EC) become targets of pro- and anti-inflammatory
cytokines. Activated EC are capable of producing chemokine IL-8 and expressing adhesion molecules such as ICAM-1. The
aim of the present study was to comparatively evaluate IL-8 secretion and ICAM-1 (CD54) expression by the spontaneously
transformed human umbilical vein endothelial cell line ECV-304, incubated in the presence of different cytokines and their
combinations. We found that ECV-304 cells stimulated with TNF-α showed threefold increase in IL-8 secretion and twofold
increase in ICAM-1 expression. Concomitant treatment of EC with TNF-α and IFNγ showed that IFN-γ differentially modulated
TNF-α stimulating effects: up-regulated stimulation of ICAM-1 expression and down-regulated stimulation of IL-8 secretion.
GM-CSF attenuated stimulating effects of pro-inflammatory cytokines on ICAM-1 expression and IL-8 secretion by ECV304 cells, while anti-inflammatory cytokine IL-10 caused bi-directional changes of the parameters studied: it decreased
stimulation of IL-8 secretion by pro-inflammatory cytokines but significantly up-regulated stimulation of ICAM-1 expression
by pro-inflammatory cytokines. The cooperative influence of cytokines on EC and a possibility of using ECV-304 cell line
for evaluation of EC involvement in inflammatory and immune responses are discussed. (Med. Immunol., 2000, vol. 2, ¹
1, pp 25-33)
Àäðåñ äëÿ ïåðåïèñêè:
Ôðåéäëèí Èðèíà Ñîëîìîíîâíà - ÷ëåí-êîðð. ÐÀÌÍ, ä. ì. í., ïðîôåññîð, ðóêîâîäèòåëü îòäåëà èììóíîëîãèè ÍÈÈ ýêñïåðèìåíòàëüíîé ìåäèöèíû ÐÀÌÍ
197376, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã, óë. àêàäåìèêà Ïàâëîâà, 12, òåë. (812) 234-29-29; ôàêñ: (812) 234-94-89.
e-mail: [email protected]
25
Ñîêîëîâ Ä.È. è äð.
Ââåäåíèå
Эффективность воспалительного ответа опреде
ляется активностью рекрутирования фагоцитирую
щих клеток в очаг инфекции или воспаления. Кон
такт с возбудителем является сигналом секреции
моноцитами/макрофагами провоспалительных ци
токинов, в том числе TNFα. Аутокринная стиму
ляция макрофагов и паракринная стимуляция есте
ственных киллеров сопровождается продукцией и
секрецией цитокинов, среди которых есть как про
воспалительные (IFNγ, GMCSF), так и противовос
палительные: IL4, IL10 [20, 48]. Мишенями дей
ствия всех перечисленных цитокинов становятся
эндотелиальные клетки (ЭК) кровеносных сосудов
[6, 7, 22, 29]. На ЭК выявлены рецепторы для мно
гих цитокинов, включая интерлейкин1 (IL1), фак
тор некроза опухолейα (TNFα), интерферонγ
(IFNγ), ростовые факторы. Активированные ЭК
сами способны к синтезу ряда цитокинов, в том чис
ле хемокина IL8 [18, 33, 42,46]. Взаимодействие
лейкоцитов с ЭК опосредовано адгезионными моле
кулами, экспрессия которых на ЭК регулируется
цитокинами. Среди адгезионных молекул, экспрес
сируемых ЭК, особое место занимают межклеточные
адгезионные молекулы (ICAM), принадлежащие к
суперсемейству иммуноглобулинов [6, 28, 29, 31, 39].
Данные о влиянии разных цитокинов и их соче
таний на ЭК весьма противоречивы. Отчасти это
объясняется широким варьированием индивидуаль
ных особенностей первичных культур человеческих
эндотелиальных клеток вены пупочного канатика
(HUVEC), на модели которых выполнено большин
ство исследований. Перевиваемая линия ECV304
человеческих ЭК получена как результат спонтан
ной трансформации HUVEC при длительном куль
тивировании [44, 45]. По своим основным характе
ристикам перевиваемая линия ECV304 близка к ис
ходным HUVEC, но обеспечивает более высокую
воспроизводимость результатов исследований ЭК
при условии максимальной стандартизации культи
вирования клеток.
Целью настоящего исследования явилось сравни
тельное изучение секреции IL8 и экспрессии ICAM
1 (CD54) эндотелиальными клетками перевиваемой
человеческой линии ECV304, инкубированными
в присутствии отдельных цитокинов и различных их
сочетаний.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
Цитокины. В работе использовали рекомбинан
тные препараты человеческих цитокинов TNFα “Рефнолин” (специфическая активность препарата
1ЕД 0,06 нг) и IFNγ “гаммаферон” (НПО “Фер
мент”, “Sanitas”, Литва) коммерческий рекомбинан
тный препарат человеческого GMCSF “Leucomax”
(специфическая активность препарата 1ЕД 0,09 нг)
26
Ìåäèöèíñêàÿ èììóíîëîãèÿ
(“ScheringPlough”), рекомбинантный человеческий
IL4 (“Sigma”, США), рекомбинантный человечес
кий IL10 (“Sigma”, США).
Клетки. В работе использовали перевиваемую
линию ECV304 человеческих эндотелиальных кле
ток. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, со
держащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки
(“Биолот”, С.Петербург), 50 мкг/мл сульфата ген
тамицина (АО “Самсон”, С.Петербург), 2 мМ Lглу
тамина (“ICN”, США), 20 мМ HEPES (“ICN”, США).
Для культивирования использовали пластиковые
флаконы объемом 50 мл (“Sarstedt”, Австрия). Пе
ресев клеток осуществляли путем обработки моно
слоя смесью 0,25% растворов трипсина и версена
(“Биолот”, С.Петербург) в соотношении 1:3.
Накануне опыта производили пересев клеток
ECV304, часть полученной клеточной суспензии
тщательно ресуспендировали в культуральной сре
де и помещали в лунки плоскодонного 96луночно
го планшета (“Sarstedt”, Австрия) в концентрации
3×104 клеток на лунку и культивировали во влаж
ной атмосфере с 5% СО2 при 37°С для получения
однородного монослоя. На следующий день к эндо
телиальным клеткам, не меняя культуральной сре
ды, добавляли цитокины и их комбинации, после
чего культивирование продолжали в течение 2448 ча
сов. После окончания инкубации собирали образцы
культуральных жидкостей и замораживали (20°С) для
последующего определения количества IL8 при помо
щи иммуноферментного анализа (ИФА). Монослои
клеток в 96луночном планшете использовали для оп
ределения поверхностной экспрессии ICAM1 при по
мощи модификации иммуноферментного анализа
(клеточный ИФА).
Фиксация ЭК. После инкубации клетки линии
ECV304 фиксировали, внося в каждую лунку по 100
мкл 0,05% раствора глутаральдегида (“Reanal”, Вен
грия), приготовленного на забуференном физиоло
гическом растворе (рН=7,2). Затем клетки инкуби
ровали при комнатной температуре в течение 10
минут и отмывали один раз в 150 мкл забуференно
го физиологического раствора (рН=7,2), содержаще
го 0,05% твин20 (“Serva”, Германия).
Клеточный ИФА. Для оценки степени поверх
ностной экспрессии адгезионной молекулы ICAM
1 использовали модификацию иммуноферментного
анализа, подробно описанную нами ранее [1]. Зафик
сированные клетки инкубировали в течение 1 часа
во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С в присут
ствии мышиных моноклональных антител (клон
ICO184), специфичных к CD54/ICAM1 (НПЦ
МедБиоСпектр, г.Москва). Затем клетки отмывали
пять раз забуференным физиологическим раствором
(рН=7,2), содержащим 0,05% твин20, после чего в
каждую лунку добавляли поликлональные антите
ла к иммуноглобулинам мыши, меченые пероксида
зой хрена (НИИ вакцин и сывороток, С.Петербург).
2000, Ò. 2, ¹1
Öèòîêèíîâàÿ ðåãóëÿöèÿ ýêñïðåññèè ICAM-1 è IL-8 ýíäîòåëèàëüíûìè êëåòêàìè
После инкубации в течение 1 часа во влажной ат
мосфере с 5% СО2 при 37°С и 5кратной отмывки
забуференным физиологическим раствором
(рН=7,2), содержащим 0,05% твин20, проводили
дополнительную инкубацию в течение пяти минут
в темноте с 100 мкл субстратхромогенной смеси,
состоящей из 1 мг ортофенилендиамина (“Sigma”,
США) в 1 мл цитратфосфатного буфера (рН=5),
содержащем 0,06% перекиси водорода. Цветную ре
акцию останавливали добавлением в каждую лунку
100 мкл 1М серной кислоты. Оптическую плотность
учитывали с помощью автоматического спектрофо
тометра (“SLTSpectra”, Австрия) при длине волны
492 нм. Экспрессию ICAM1 на клетках ECV304
выражали в единицах оптической плотности. Сред
ние значения оптической плотности в контрольных
лунках принимали за фон и вычитали из всех осталь
ных значений оптической плотности.
Количественное определение уровня IL8 в на
досадочных жидкостях культур клеток определяли
с помощью ИФА,используя стандартные комерчес
кие наборы (“Цитокин”, С.Петербург), и выражали
в пг/мл.
Статистическую обработку полученных
данных проводили с вычислением критерия Стью
дента, используя компьютерную программу
STATISTICA 5.0.
Ðåçóëüòàòû
Полученные нами результаты свидетельствуют о
том, что перевиваемая линия ECV304 человеческих
эндотелиальных клеток характеризуется довольно
высокими уровнями спонтанной секреции IL8
(1.416±230 пг/мл) и конститутивной экспрессии
ICAM1 (0,812±0,062). Сопоставление с литературны
ми данными показывает, что по активности секреции
IL8 эти клетки не уступают HUVEC, а по уровню
экспрессии ICAM1 даже превосходят HUVEC.
Как и HUVEC, клетки линии ECV304 отвечали
на инкубацию с TNFα (400 ЕД/мл) усилением сек
реции IL8 – количество IL8 в культуральной жид
кости увеличивалось в три раза по сравнению с уров
нем спонтанной секреции. Другой провоспалитель
ный цитокин – IFNγ (400 ЕД/мл) не вызывал
изменений секреции IL8 клетками линии ECV304,
что согласуется с данным, полученным на HUVEC
[18, 30, 51]. При инкубации клеток линии ECV304 в
присутствии смеси цитокинов TNFα и IFNγ в те
чение 24 часов количество IL8 в культуральных
жидкостях оказалось достоверно ниже, чем при индук
ции секреции этого цитокина одним TNFα (рис. 1).
При тех же условиях инкубации клеток ECV304
TNFα усиливал экспрессию ICAM1 более чем в
два раза по сравнению с исходным уровнем. IFNγ
вызывал значительно менее выраженное, но стати
стически достоверное увеличение экспрессии ICAM1.
Рис. 1. Влияние TNF α, IFN γ и их смеси на секрецию IL 8
клетками линии ECV304.
На оси ординат концентрация IL8 в пг/мл. За ноль принят спон
танный уровень секреции IL8.
В отличие от влияния на секрецию IL8, смесь цито
кинов TNFα и IFNγ аддитивно усиливала экспрес
сию ICAM1 (рис. 2), что согласуется с данными,
полученными на HUVEC [30, 39, 37, 46].
Инкубация клеток линии ECV304 в присутствии
различных концентраций GMCSF от 10 до 1000 ЕД/
мл не вызывала достоверного изменения изученных
параметров. Повышение концентрации GMCSF до
2000 ЕД/мл вызвало статистически достоверное уг
нетение спонтанной секреции IL8. Среди изученных
сочетаний этого ростового фактора с провоспали
тельными цитокинами только сочетание GMCSF с
IFNγ оказывало статистически достоверное ингиби
рующее действие на секрецию IL8 клетками
ECV304 (рис. 3). Нам не удалось выявить какого
либо самостоятельного влияния GMCSF на эксп
рессию ICAM1 на клетках ECV304. При сочетании
этого ростового фактора с провоспалительными ци
токинами он вызывал статистически достоверное
снижение стимулирующих эффектов TNFα и сме
си TNFα+IFNγ на экспрессию ICAM1 на клетках
ECV304 (рис. 4).
Рис. 2. Влияние TNF α, IFN γ и их смеси на экспрессию
ICAM 1 клетками линии ECV304.
На оси ординат оптическая плотность, отражающая уровень
экспрессии ICAM1. За ноль принят спонтанный уровень
экспрессии ICAM1.
27
Ìåäèöèíñêàÿ èììóíîëîãèÿ
Ñîêîëîâ Ä.È. è äð.
Рис. 3. Влияние GM CSF и его сочетания с IFN γ на
секрецию IL 8 клетками линии ECV304.
На оси ординат концентрация IL8 в пг/мл. За ноль принят
спонтанный уровень секреции IL8.
Противовоспалительный цитокин IL4 не оказы
вал никакого действия ни на секрецию IL8, ни на
экспрессию ICAM1 клетками ECV304, ни на эффек
ты провоспалительных цитокинов при совместном
с ними использовании, что согласуется с данными
литературы, касающимися других ЭК [18, 37, 47].
Противовоспалительный цитокин IL10 самосто
ятельно не ингибировал секрецию IL8, а в концент
рации 200 нг/мл при 48часовой инкубации даже
вызывал статистически достоверный прирост секре
ции IL8, никак не влияя на экспрессию ICAM1 на
клетках ECV304 (рис.5, 6).
IL10 в сочетании с IFNγ при 24часовой инку
бации вызывал снижение стимулирующего эффек
та IFNγ на экспрессию ICAM1 на клетках линии
ECV304 (рис. 5).
Для изучения вариантов кооперативных эффек
тов IL10 с провоспалительными цитокинами про
водили преинкубацию клеток линии ECV304 в те
чение 24 часов в присутствии различных концент
раций IL10, затем вносили TNFα, IFNγ или их
смесь и продолжали инкубацию в течение 24 часов
или наоборот преинкубировали клетки в течение
24 часов в присутствии TNFα, IFNγ или их смеси,
а затем вносили IL10 на 24 часа. В случае преинку
Рис. 4. Влияние GM CSF и его сочетаний с TNF α, IFN γ и их
смесью на экспрессию ICAM 1 клетками линии ECV304.
На оси ординат оптическая плотность, отражающая уровень
экспрессии ICAM1.За ноль принят спонтанный уровень
экспрессии ICAM1.
28
Рис. 5. Влияние IL 10 и его сочетаний с TNF α, IFN γ и
их смесью на экспрессию ICAM 1 клетками линии
ECV304.
На оси ординат оптическая плотность, отражающая уровень
экспрессии ICAM1. За ноль принят спонтанный уровень
экспрессии ICAM1.
бации клеток с IL10 (100200 нг/мл) наблюдали
статистически достоверные приросты стимулирую
щего действия TNFα и его смеси с IFNγ на эксп
рессию ICAM1 (рис. 5).
В случае преинкубации клеток с IL10 в концен
трации 100 нг/мл наблюдали статистически досто
верное снижение стимулирующего действия TNFα
и его смеси с IFNγ на секрецию IL8. Статистичес
ки достоверное снижение стимулирующего секре
цию IL8 действия смеси провоспалительных цито
кинов наблюдали и в случае введения IL10 после
преинкубации клеток со смесью (рис. 6).
Îáñóæäåíèå
Полученные результаты свидетельствуют в
пользу того, что перевиваемая линия человеческих
эндотелиальных клеток ECV304 очень близка к ис
ходным клеткам HUVEC по поверхностному фено
типу, способности спонтанно секретировать хемоки
ны и отвечать на индуцирующие воздействия про
воспалительных цитокинов.
Рис. 6. Влияние IL 10 и его сочетаний с TNF α и его смесью
с IFN γ на секрецию IL 8 клетками линии ECV304.
На оси ординат концентрация IL8 в пг/мл. За ноль принят
спонтанный уровень секреции IL8.
2000, Ò. 2, ¹1
Öèòîêèíîâàÿ ðåãóëÿöèÿ ýêñïðåññèè ICAM-1 è IL-8 ýíäîòåëèàëüíûìè êëåòêàìè
ЭК разной тканевой локализации, выделенные из
разных источников, таких как вена пупочного кана
тика, крайняя плоть, высокий эндотелий венул, эн
дотелий гломерул почек, эндотелий синовиальной
сумки и другие, и разных уровней дифференциров
ки существенно различаются по чувствительности
к действию разных цитокинов: провоспалительных,
противовоспалительных, ростовых факторов [2, 4, 5,
14, 17, 18, 37, 43, 52, 56, 38]
Наиболее популярными клеточными линиями
для изучения роли ЭК в процессах воспаления, им
мунного ответа и ангиогенеза являются: первичная
культура эндотелиальных клеток из пупочной вены
человека (HUVEC Human umbilical vein endothelial
cells) [23, 53] и перевиваемая линия ECV304, кото
рая представляет собой спонтанно трансформиро
ванную культуру HUVEC [44, 45].
HUVEC широко используются в качестве мо
дельной системы ЭК, максимально приближенной
к естественным условиям организма, но их выделе
ние и культивирование сопряжены с рядом труд
ностей: высокий риск контаминации фибробласта
ми и/или гладкомышечными клетками и инфици
рования вирусами гепатита В и вирусами
иммунодефицита человека при получении; потреб
ность в экзогенных ростовых факторах, особых суб
стратах для культивирования (фибронектин, жела
тин), кофакторах (аскорбиновая кислота, гепарин),
высоких концентрациях сыворотки; низкая ско
рость пролиферации (удвоение популяции проис
ходит за 92 часа) и сравнительно короткий жизнен
ный цикл. Для получения клеток в достаточном
количестве их приходится собирать от нескольких
доноров, в результате чего клеточная популяция
получается гетерогенной, что затрудняет интерпре
тацию результатов [21]. В связи с этими недостат
ками проводился поиск других “модельных” линий
ЭК, одной из таких линий является ECV304 [25].
Эта линия не столь требовательна к условиям куль
тивирования, является более стабильной по
экспрессии различных поверхностных и секретиру
емых молекул. Экспрессия тромбомодулина, рецеп
тора витронектина (CD51), секреция ингибитора
активатора плазминогена I (PAII) и эндотелина
являются типичными “эндотелиальными” характе
ристиками этой линии [21, 24]. Линия ECV304 ис
пользовалась для изучения ангиогенеза, клеточной
миграции, секреции цитокинов, трансдукции сиг
нала фактора роста эндотелия сосудов (VEGF –
vascular endothelial growth factor) [24].
HUVEC и ECV304 имеют ряд общих характе
ристик, но имеют и существенные различия. У этих
клеток в отсутствие стимуляции определяется раз
ный репертуар поверхностных молекул. Так, с по
мощью моноклональных антител было выявлено,
что только HUVEC экспрессируют CD34, CD109,
CD140b, CD143 [31]. И те, и другие клетки харак
теризуются низким базовым уровнем экспрессии
CD142 (tissue factor, TF), которая усиливается под
действием TNFα с максимумом через 46 часов, но
возвращается к базальному уровню через 16 часов
после стимуляции [36]. И на тех, и на других клет
ках обнаружена экспрессия молекул CD49b, CD49c,
CD49f, CD51, CD54, CD55, CD105, CD141 (тром
бомодулин), CDw145, CDw146, CDw147, HLAI.
Различия в условиях культивирования клеток (ко
личество пассажей, используемая культуральная
среда, концентрация сыворотки, степень зрелости
монослоя и др.) приводят к фенотипическим раз
личиям в экспрессии поверхностных молекул на
клетках как первичной, так и перевиваемой клеточ
ной линии [31]. Еселектин не определяется на не
стимулированных HUVEC, однако обработка
ЛПС в течении 4 часов индуцировала его экспрес
сию на HUVEC, а на ECV304 этот селектин не
определялся ни до, ни после стимуляции [12, 21, 32].
По одним данным VCAM1 экспрессируется на по
коящихся клетках в обоих случаях, и инкубация с
ЛПС в течении 424 часов приводит к усилению его
экспрессии в обоих случаях [21]. По данным дру
гих авторов, на ECV304 не было обнаружено
VCAM1, но выявлены ICAM1 и CD36 [12]. Мо
нослой клеток HUVEC более активно по сравнению
с монослоем ECV304 захватывает и метаболизи
рует модифицированные (ацетилированные) ли
попротеиды низкой плотности через скевенджер
рецептор [21, 44, 45].
Несмотря на вышеперечисленные отличия линии
ECV304 от HUVEC по морфологическим, феноти
пическим и функциональным характеристикам, ис
пользование этой перевиваемой линии оправдано
стандартными характеристиками, не изменяющими
ся от пассажа к пассажу, как это было показано в слу
чае постепенного снижения экспрессии CD34 на
HUVEC [9, 15].
Полученные нами с использованием линии
ECV304 результаты свидетельствуют в пользу того,
что TNFα является универсальным ститмулятором
для ЭК, усиливающим не только экспрессию адге
зионных молекул, но и секрецию хемокинов ЭК. Ра
нее было показано, что TNFα в синергизме с IL1β
индуцировал продукцию IL6, IL8, GMCSF, MCP
1 эндотелиальными клетками коронарных артерий
или легочной артерии человека и HUVEC [41]. У кле
ток линии ECV304 также была выявлена способ
ность отвечать на воздействие TNFα продукцией IL
8 [9], что полностью согласуется с полученными нами
результатами. Неоднократно была показана способ
ность TNFα повышать экспрессию на поверхности
эндотелиальных клеток разного происхождения
адгезионных молекул: ICAM1, ELAM1, VCAM1,
он способен также индуцировать секрецию IL8,
MCP1, IL1, IL6, GMCSF, простогландинов, PGI2,
leukemia inhibitory factor, PDGF, GRO, NO [5, 18, 26,
29
Ñîêîëîâ Ä.È. è äð.
33, 37, 40, 42, 46, 47, 51, 54].
Полученные нами данные сравнительного иссле
дования влияния разных цитокинов на клетки
ECV304 показали, что IFNγ отличается от TNFα
менее выраженным стимулирующим действием, к
тому же только в отношении экспрессии ICAM1.
При совместном действии с TNFα IFNγ поразно
му модулировал его стимулирующие эффекты в от
ношении ЭК: усиливал стимуляцию экспрессии
ICAM1 и ослаблял стимуляцию секреции IL8.
Разное модулирующее действие IFNγ на эффек
ты TNFα было описано и другими авторами при изу
чении экспрессии разных адгезионных молекул и
цитокинов у ЭК. Так, например, IFNγ усиливает
действие TNFα на секрецию молекул семейства
RANTES и IL8 клетками HUVEC [27] или эндоте
лиальными клетками кожи [18, 27]. Синергизм этих
цитокинов также описан в отношении цитотоксичес
кой активности макрофагов, продукции активных
радикалов кислорода, изменения уровня экспрессии
адгезионных молекул на различных типах клеток [13,
16, 19, 27, 34]. IFNγ выступает в качестве синергис
та TNFα при стимуляции экспрессии CD40 на по
верхности клеток линии THP1 [16], экспрессии
МНС1, ICAM1, ELAM1 на поверхности HUVEC.
Обработка HUVEC интерферономγ усиливает ин
гибирующее действие TNFα на экспрессию CD34 [9].
С другой стороны, предобработка HUVEC интерфе
рономγ ингибирует индуцированную TNFα повер
хностную экспрессию Еселектина, что приводит к
снижению адгезии нейтрофилов к этим клеткам [30].
В литературе рассматриваются разные возможные
механизмы кооперативных эффектов TNFα и IFNγ.
Одним из механизмов служит усиление интерферо
номγ экспрессии рецепторов к TNFα и, наоборот, уси
ление фактором некроза опухолейα экспрессии ре
цепторов к IFNγ [13, 27]. Другим уровнем синергиз
ма или антагонизма могут служить внутриклеточные
события, связанные с передачей сигнала активации
от цитокиновых рецепторов [22, 27].
Ранее другими исследователями было показано,
что при действии in vitro на тканевые срезы GM
CSF вызывает усиление экспрессии ICAM1 на ЭК
гломерул почек [37]. В отличие от этого, нам не уда
лось выявить какоголибо самостоятельного влия
ния GMCSF на экспрессию ICAM1 на клетках
ECV304, а при сочетании его с провоспалительны
ми цитокинами он уменьшал их стимулирующие
эффекты на экспрессию ICAM1 на клетках
ECV304. На культуре эндотелиоцитов микрососу
дов кожи человека было показано отсутствие влия
ния GMCSF на экспрессию ICAM1, в то время как
IL1α, IL1β и TNFα в значительной степени сти
мулировали экспрессию этой адгезионной молеку
лы [10]. По некоторым данным, на клетках линии
HUVEC вообще отсутствует рецептор GMCSF
[57]. Угнетающее действие проявил этот ростовой
30
Ìåäèöèíñêàÿ èììóíîëîãèÿ
фактор в отношении спонтанной секреции IL8
клетками ECV304, более выраженным было сниже
ние секреции IL8 после инкубации клеток ECV304
со смесью GMCSF и IFNγ.
Противовоспалительный цитокин IL10 не толь
ко не ингибировал секрецию ЭК IL8, но даже слегка
ее усиливал в случае более длительной инкубации с
ним клеток. Вместе с тем, IL10 отчетливо ингибиро
вал стимулирующее действие провоспалительных ци
токинов на секрецию IL8. Не влияя на экспрессию
ICAM1 самостоятельно, IL10 существенно усили
вал стимулирующее действие провоспалительных ци
токинов на экспрессию ICAM1.
В литературе встречаются весьма противоречи
вые данные относительно влияния IL10 на ЭК. Одни
исследователи утверждают, что IL10 никак не влия
ет на ЭК и даже высказывают предположение об от
сутствии рецепторов IL10 у этих клеток [27, 41].
Другие исследователи, наоборот, показывают, что IL
10 имеет стимулирующий эффект, например, в отно
шении поверхностной экспрессии Еселектина и внут
риклеточной экспрессии мРНК для этой адгезионной
молекулы у HUVEC и эндотелиальных клеток кожи,
что ведет к увеличению адгезии к ним клеток линии
HL60. Кроме того, было показано, что предобработ
ка ЭК вены пупочного канатика интерлейкином10
ведет к снижению индуцированной экспрессии
ICAM1, VCAM1, а также к снижению индуцирован
ной продукции этими клетками IL6 и IL8 [52]. Пре
добработка HUVEC IL10 или IL4 в значительной
степени ингибировала TNFα, IL1β или ЛПСсти
мулированную экспрессию IL8 этими клетками [8].
По данным других исследователей инкубация
HUVEC с IL4 и IL10 не влияла на высвобождение
ими IL8, однако подобная инкубация в присутствии
ЛПС вызывала в 3 раза более сильную секрецию IL
8, чем инкубация только в присутствии ЛПС [11].
Клетки линии HUVEC, подверженные действию γ
излучения, активировались, что проявлялось стиму
ляцией продукции IL6 и IL8 и усилением экспрес
сии ICAM1. Последущая обработка этих клеток IL
4 снижала продукцию ими IL8 и, в незначительной
степени IL6, не влияя на повышенную экспрессию
ICAM1; обработка же IL10 значительно снижала
повышенную продукцию как IL6, так и IL8 [50].
Нами было показано, что IL4 в различных кон
центрациях не изменяет эффектов TNFα и IFNγ в
отношении экспрессии ICAM1. Нам не удалось
показать какоголибо влияния IL4 на экспрессию
ICAM1 у клеток линии ECV304. По поводу влия
ния IL4 на эндотелиальные клетки вены пупочно
го канатика у разных исследователей также нет еди
ного мнения. Так, одни исследователи не обнару
жили никакого самостоятельного влияния IL4 на
эти клетки [37], а другие говорят о его ингибирую
щем действии в отношении конститутивной эксп
рессии ICAM1 [46]. С другой стороны, несмотря
2000, Ò. 2, ¹1
Öèòîêèíîâàÿ ðåãóëÿöèÿ ýêñïðåññèè ICAM-1 è IL-8 ýíäîòåëèàëüíûìè êëåòêàìè
на то, что IL4 считается противовоспалительным
цитокином, он способен индуцировать экспрессию
VCAM1 на HUVEC [55]. Также было показано, что
IL4 не способен влиять на изменение уровня мРНК
IL8 у HUVEC [46], что согласуется с полученны
ми нами данными. Однако есть данные, что IL4
ингибирует экспрессию ICAM1 на HUVEC, сти
мулированную IL1, IFNγ или TNF [47].
В последнее время в литературе все чаще встреча
ются указания на стимулирующую роль IL10, IL4
по отношению к различным событиям провоспали
тельного характера, и, наоборот, IFNγ способен ин
гибировать эффекты провоспалительных цитокинов.
Так, например, было показано, что IL10 способен
усиливать экспрессию VCAM1 на HUVEC в присут
ствии активированных форболмиристатацетатом мо
ноцитов периферической крови [14] или усиливать
экспрессию Еселектина на HUVEC [52]. IL4 в ком
бинации с TNFα, IL1 или IFNγ увеличивал адге
зивность HUVEC для Тлимфоцитов, усиливая экс
прессию VCAM1 [47]. IL4 способен индуцировать
значительные уровни экспрессии внутриклеточной
мРНК и секреции белка моноцитарного хемотакти
ческого протеина1 у HUVEC [18].
Среди полученных нами результатов обращают
на себя внимание следующие: секрецию IL8 клет
ками линии ECV304, индуцированную TNFα, ин
гибировал не только противовоспалительный ци
токин IL10, но и провоспалительный цитокин IFNγ.
С другой стороны, противовоспалительный цито
кин IL10, как и провоспалительный IFNγ, суще
ственно усиливал стимулирующее действие TNF
α на экспрессию ICAM1. Возможно, ингибирую
щий или стимулирующий характер действия IL10
зависит от особенностей клетокмишеней. Так, ра
нее была выявлена разница эффектов IL10, кото
рый ингибировал продукцию цитокинов (IL6,
MCP1) мононуклеарными фагоцитами, но ампли
фицировал продукцию тех же цитокинов эндотели
альными клетками [41]. Ростовой фактор GMCSF
некоторыми исследователями причисляется к про
воспалительным на основании его стимулирующе
го действия на функции мононуклеарных фагоци
тов. Полученные нами результаты свидетельству
ют о превалировании ингибирующих эффектов
GMCSF в отношении ЭК. Все это свидетельству
ет о постепенном “размывании” грани между поня
тиями “провоспалительные” и “противовоспали
тельные” цитокины.
Работа поддержана Грантом РФФИ №9704
48889.
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû:
1. Кузнецова С.А., Косицкая Л.С., Соколов Д.И.,
Фрейдлин И.С., Полосухина Е.Р., Барышников А.Ю.
Использование иммуноферментного анализа для
оценки экспрессии адгезионных молекул на эндоте
лиальных клетках // Медицинская иммунология. 1999. № 5. – С.7174.
2. Abot S.E., Kaul A., Stevens C.R., Blake D.R.
Isolation and culture of synovial microvascular
endothelial cells: characterization and assessment of
adhesion molecule expression // Arthritis and
Rheumatism. – 1992. Vol. 35, №4 P.401406.
3. Aggarwal B., Pocsik E. Cytokines: from clone to
clinic // Archives Biochemistry and Biophysics. 2000.
Vol.292. P.335 345.
4. Arnman V., Stemme S., Rymo L., Risberg B.
Interferonγ modulates the fibrinolytic response in
cultured human endothelial cells // Tromb. Research. 1995. Vol.77, №5 P.43140.
5. Baumhueter S., Singer M.S., Henzel W.,
Hemmerich S., Renz M., Rozen S.D., Lasky L.A. Binding
of Lselectin to the vascular sialomucin CD34 //
Science. 1993. Vol.262 P.436438.
6. Bevilacqua M. Endothelial cellleukocyte
adhesion molecules. // Annu.Rev.Immunol. 1993. Vol.11 P.767773.
7. Biron C., Gazzinelly R. Effects of IL12 on immune
responses to microbial infections: a key mediator in
regulating disease outcome // Current Oppinion in
Immunology. – 1995. Vol.7. P.485496.
8. Chen C.C., Manning A.M. TGFbeta 1, IL10 and
IL4 differentially modulate the cytokineinduced
expression of IL6 and IL8 in human endothelial cells
// Cytokine. – 1996. Vol.8, №1 – P.5865.
9. Delia D., Lampugnani M.G., Resnati M., Dejana
E., Aiello A., Soligo D., Pierotti M.A., Greaves M.F.
CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion
molecules in vascular endothelial cells in vitro // Blood.
1993. Vol.81, №4 P.10011008.
10. Detmar M., Tenorio S., Hettmannsperger U.,
Ruszczak Z., Orfanos C.E. Cytokine regulation of
proliferation and ICAM1 expression of human dermal
microvascular endothelial cells in vitro // J. Invest.
Dermatol. – 1992. – Vol.98, №2 – P.147153.
11. De Beaux A.C., Maingay J.P., Ross J.A., Fearon
K.C., Carter D.C. Interleukin4 and interleukin10
increase endotoxinstimulated human umbilical vein
endothelial cell interleukin8 release // J. Interferon
Cytokine Res. – 1995. – Vol.15, №5 – P.441445.
12. Dobbie M.S., Hurst R.D., Klein N.J., Surtees
R.A.H. Upregulation of intercellular adhesion molecule1
expression on human endothelial cells by TNFα in an
invitro model of the bloodbrain barrier // Brain
Research. 1999. Vol.830. P.330336.
13. Doukas J., Pober J.S. IFNγ enhances endothelial
activation induced by tumor necrosis factor but not
interleukin1 // Journal of Immunology. 1990. Vol.145, №6 P.17271733.
14. Downing L.J., Strieter R.M., Kadell A.M., Wilke
C.A., Austin J.C., Hare B.D., Burdick M.D., Greenfield
L.J, Wakefield T.W. IL10 regulates thrombusinduced
31
Ñîêîëîâ Ä.È. è äð.
vain wall inflammation and thrombosis. // Journal of
Immunology. 1998. Vol.161. P.14711476.
15. Fina L., Molgaard H.V., Robertson D., Bradley
N.J, Monadhan P., Delia D., Sutherland D.R., Baker
M.A., Greaves M.F. Expression of the CD34 gene in
vascular endothelial cells // Blood. 1990. Vol.75, №12
P.24172426.
16. Francisco J.A., Kiener P.A., MoranDavis P.,
Letbetter J.A., Siesall P.A. Cytokine activation sensitizes
human monocytic and endothelial cells to the cytotoxic
effects of an antiCD40 immunotoxin // Journal of
Immunology. 1996. Vol.157, №4 P.16521658.
17. Gamble J.R., KhewGoodall Y., Vadas M.A.
Transforming growth factorbeta inhibits expression E
selectin by human endothelial cells // Journal of
Immunology. 1993. Vol.150, №10 P.44944503.
18. Goebeler M., Yoshimura T., Toksoy A., Ritter
U., Brocker E.B., Gillitzer R. The chemokine repertoire
of human dermal microvascular endothelial cells and its
regulation by inflammatory cytokines // Journal of
Investigative Dermatology. 1997. Vol.108, №4 P.445451.
19. Golding S., Emery P, Young S.P. Tenidap
modulated proinflammatory cytokine activation of
monocyte cell line // Journal of Immunology. 1995. Vol.154 P.53845390.
20. Harnett M. Antigen receptor signalnalling: from
the membrain to the nucleus // Journal of Immunology.
1994. Vol.15 P.15.
21. Hughes S.E. Functional characterization of the
spontaneously transformed human umbilical vein cell line
ECV 304: use in an in vitro model of angiogenesis //
Experimentall cell research. – 1996. Vol.225. – P.171185.
22. Jaattela M. Biologic activities and mechanisms of
action of tumor necrosis factora/cachectin // Journal of
Laboratory Investigation. 1991. Vol.64, №6 P.724.
23. Jaffe E.A., Nachman R.L., Becker C.G., Minik
C.R. Culture of human endothelial cells derived from
umbilical veins. Identification by morphologic and
immunologic criteria // Journal of Clinical
Investigation. 1973. Vol.52. P.27452756.
24. Kiessling F., Kartenbeck J., Haller C. Cellcell
contacts in the human cell line ECV304 exhibit both
endothelial and epithelial characteristics // Cell Tissue
Research. – 1999. Vol.297. – P.131140.
25. Lidington E.A., Moyes D.L., McCormack A.M.,
Rose M.L. A comparison of primary endothelial cells and
endothelial cell lines for studies of immune interactions
// Transpl. Immunol. – 1999. Vol.7, №4 – P.239246.
26. LopezPedrera C., Jardi M., InglesEsteve J.,
MunozCanoves P., Dorado G. Characterization of
tissue factor expression on the human endothelial cell
line ECV304 // American Journal of Hematology. 1997. Vol.56, №2 P.7178.
27. MarfainKoka A., Devergue O., Gorgone G.,
Portier A., Schall T.J., Galanaud P., Emilie D.
Regulation of the production RANTES chemokine by
32
Ìåäèöèíñêàÿ èììóíîëîãèÿ
endothelial cells. Synergistic induction by IFNγ plus
TNFα and inhibition by IL4 and IL13 // Journal of
Immunology. 1995. Vol.154, №4 P.18701878.
28. Mason J.C., Haskard D.O. The clinical
importance of leucocyte and endothelial cell adhesion
molecules in inflammation // Vascular Medicine
Review. 1994. Vol.5. P.249275.
29. Meershaert V., Furie M.B. The adhesion
molecules used by monocytes for migration across
endothelium include CD11a/CD18, CD11b/CD18 and
VLA4 on monocytes and ICAM1, VCAM1 and other
ligands on endothelium // Journal of Immunology. 1995. Vol.154, №8 P.40994112.
30. Merlose J., Tsurushita N., Liu G., Berg E.L. IFN
γ inhibits activationinduced expression of E and P
selectin on endothelial cells // Journal of Immunology.
1998. Vol.161. P.24572464.
31. Mutin M., DignatGeorge F., Sampol J.
Immunologic phenotype of cultured endothelial cells:
quantitative analysis of cell surface molecules // Tissue
Antigens. – 1997. Vol.50. P. 449458.
32. Munro J.M., Pober J.S., Cotran R.S. Recruitment
of neutrophils in the local endotoxin response:
association with de novo endothelial expression of
endothelial leukocyte adhesion molecule1 // Lab.
Invest. 1991. Vol.64, №2 – P.295299.
33. Paleolog E.M., Delasalle S.A.J., Buurman W.A.,
and Feldman M. Functional activities of receptors for
tumor necrosis factorα on human vascular endothelial
cells // Blood. 1994. Vol.84, №8 P.25782590.
34. Pirila L., Heino J. Altered integrin expression in
rheumatoid synovial lining type B cells: in vitro cytokine
regulation of a1b1, a6b1 and avb5 integrins // Journal
of Rheumatology. 1996. Vol.23, №10 P.16911698.
35. Ramasamy S., LipkeD.W., Meclain C.J., Hennig
B. Tumor necrosis factor reduces proteoglycan synthesis
in culture endothelial cells // Journal of Cellular
Physiology. 1995. Vol.162, №1 P.119126.
36. Reverdiau P., Jarousseau A.C., Thibault G.,
Khalfoun B., Watier H., Lebranchu Y., Bardos P., Gruel
Y. Tissue factor activity of syncytiotrophoblast plasma
membranes and tumoral trophoblast cells in culture //
Thromb. Haemost. 1995 Vol.31. – P.4954.
37. Savage C.O.S., Brooks C.J., Adu D., Richards G.,
Howie A.J. Cell adhesion molecule expression within
human glomerular and kidney organ culture // Journal
of Pathology. 1997. Vol.181, №1 P.111115.
38. Schwachula A., Riemann D., Kehlen A., Langner.
Characterization of the immunophenotype and
functional properties of fibroblastlike synoviocytes in
comparison to skin fibroblasts and umbilical vein
endothelial cells // J. Immunobiology. – 1994. Vol.190,
№12 – P.6792.
39. Shang X.Z., Lang B.J., Issekutz A.C. Adhesion
molecule mechanisms mediating monocyte migration
through synovial fibroblast and endothelium barriers:
role for CD11/CD18, very late antigen4, (CD49d/
2000, Ò. 2, ¹1
Öèòîêèíîâàÿ ðåãóëÿöèÿ ýêñïðåññèè ICAM-1 è IL-8 ýíäîòåëèàëüíûìè êëåòêàìè
CD29), very late antigen5 (CD49e/CD29) and
vascular cell adhesion molecule1 (CD106) // Journal
of Immunology. 1998. Vol.160. P.467474.
40. Simionescu M., Simionescu N. Proatherosclerotic
events: pathobiochemical changes occuring in the arterial
wall before monocyte migration // The FASEB Journal.
1993. Vol.7. P.1359.
41. Sirony M., Munoz C., Pollicino T., Sibony A.,
Sciacca F.L., Bernascony S., Vecchi A., Colotta F.,
Mantovani A. Divergent effects of interleukin10 on
cytokine production by mononuclear phagocytes and
endothelial cells // European Journal of Immunology. 1993. Vol.23, №10 P.26922695.
42. Strieter R.M., Koch A.E., Antony V.B., Fick R.B.,
Standiford T.J., Kunkel C.L. The immunopathology of
chemotactic cytokines: the role of interleukine8 and
monocyte chemoattractant protein1 // Journal of
Laboratory Clinical Medicine. 1994. Vol.123, №2 P.183197.
43. Szekanecz Z., Shah M.R., Pearce W.H., Koch A.E.
Intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) expression
and soluble ICAM1 (sICAM1) production by
cytokyneactivated human aortic endothelial cells: a
possible role for ICAM1 and sICAM1 in atherosclerotic
aortic aneurysms // Journal of Clinical Experimental
Immunology. 1994. Vol.98, №2 P.337343.
44. Takahashi R., Sawasaki Y. Letter to editor.Human
endothelial cell line, ECV304, produces prourokinase //
In Vitro Cell Dev.Biology. 1991. Vol.27A. P.766768.
45. Takahashi R and Sawasaki Y. Rare
spontaneously transformed human endothelial cell line
provides useful research tool // In Vitro Cell
Dev.Biology 1992. Vol.28A P.380382.
46. Thornhill M.H., Haskard D.O. IL4 regulates
endothelial cell activation by IL1, tumor necrosis factor
or IFNγ // Journal of Immunology. 1990. Vol.145,
№3 P.865872.
47. Thornhill M.H., Wellicom S.M., Mahiouz D.C.,
Lanchbury J.S.S., Kyangaung U., Hascard D.O. Tumor
necrosis factor combines with IL4 or IFNγ to selectively
enhance endothelial cell adhesiveness for Tcell // Journal
of Immunology. 1991. Vol.146, №2 P.592598.
48. Tomasi T. The discovery of secretory IgA and
the mucosal immune system // Immunology Today. 1992. Vol.13 P.416421.
49. Van den Berg R.H., FaberKrol M.C., Sim R.B.,
Daha M.R. The first subcomponent of complement, C1q,
triggers the production of IL8, IL6 and monocyte
chemoattractant peptide1 by human umbilical vein
endothelial cells // Journal of Immunology. 1998. Vol.161 P.69246930.
50. Van der Meeren A., Squiban C., Gourmelon P.,
Lafont H., Gaugler M.H. Differential regulation by IL
4 and IL10 of radiationinduced IL6 and IL8
production and ICAM1 expression by human
endothelial cells // Cytokine. – 1999. – Vol.11, №11 –
P.831838.
51. Villarette L.H., Remick D.G. Nitric oxide
regulation of IL8 expression in human endothelial cells //
Biochemistry and Biophysical Research Communications.
1995. Vol.211, №2 P.671676.
52. Voara R., Romero L.I., Karasek M.A.
Interleukin10 induces Eselectin on small and large
blood vessel endothelial cells // Journal of Experimental
Medicine. 1996. Vol.184, №3.
53. Warren J.B. Large vessel endothelial isolation //
The endothelium: an introduction to current research.
WileyLiss. 1990. P.263272.
54. Weber C., Negrescu E., Pietsh A., Fraukenberger
M., Zieglerheitbrock H.M.L., Sies W., Weber P.C.
Inhibitors of protein tyrosine kinase suppress TNF
stimulated induction of endothelial cell adhesion
molecules // Journal of Immunology. 1995. Vol.155,
№1 P.445451.
55. Weigel G., Bertalanffy P., Dubsky P.,
Griesmacher A., Wolner E. Mycophenolic acid
influences T helper 2 (Th2) cytokine induced expression
of intercellular cell adhesion molecule1 (ICAM1) on
human endothelial cells // Clin. Chem. Lab. Med. –
1999. – Vol.37, №3 – P.253257.
56. Wheller S.K., Perretti M. Dexamethasone
inhibits cytokineinduced intercellular adhesion
molecule1 upregulation on endothelial cell lines //
European Journal of Pharmacology. 1997. Vol.331,
№1 P.6571.
57. Yong K., Cohen H., Khwaja A., Jones H.M.,
Linch D.C. Lack of effect of granulocytemacrophage
and granulocyte colonystimulating factors on cultured
human endothelial cells // Blood. – 1991. – Vol.77, №8
– P.16751680.
поступила в редакцию 18.02.2000
принята к печати 28.02.2000
33
Скачать