диссертация (размещена 02.10.2015)
advertisement
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова» На правах рукописи Васильева Ольга Валерьевна Ангиогенные факторы в коже человека в возрастном аспекте 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук профессор Гунин А.Г. Чебоксары – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................. 11 1.1. Кожа: строение, функции .................................................................................... 11 1.2. Возрастные изменения организма человека ..................................................... 16 1.3. Общие сведения о возрастных изменениях кожи ............................................ 17 1.4. Общие сведения об ангиогенезе. Ангиогенез в коже человека ...................... 21 1.5. Регуляторы ангиогенеза ...................................................................................... 27 1.6. Иммуногистохимические маркеры клеточной пролиферации ....................... 40 1.7. Иммуногистохимические маркеры кровеносных сосудов .............................. 41 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ........................................ 44 2.1. Характеристика исследуемого материала ...................................................... 44 2.2. Забор и первичная обработка материала........................................................ 44 2.3. Методы исследования ...................................................................................... 45 2.4. Выявление Dll4 ................................................................................................. 45 2.5. Выявление Jag-1 ................................................................................................ 47 2.6. Выявление VEGF .............................................................................................. 47 2.7. Выявление ангиомотина ................................................................................... 48 2.8. Выявление эндостатина ................................................................................... 48 2.9. Выявление CD31 ............................................................................................... 49 2.10. Выявление CTGF .............................................................................................. 49 2.11. Выявление PCNA .............................................................................................. 50 2.12. Выявление фибробластов в дерме .................................................................. 51 2.13. Количественная оценка результатов .............................................................. 51 2.14. Статистическая обработка результатов.......................................................... 52 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .......................................................... 55 3.1. Исследование VEGF в дерме в различные возрастные периоды ...................... 55 3.2. Исследование Dll4 в сосудах дермы человека в различные возрастные периоды .......................................................................................................................... 62 3 3.3. Исследование Jag-1 в дерме человека в различные возрастные периоды ....... 68 3.4. Исследование ангиомотина в сосудах дермы в различные возрастные периоды ......................................................................................................................................... 75 3.5. Исследование эндостатина в сосудах дермы человека в различные возрастные периоды .......................................................................................................................... 82 3.6. Кровеносные сосуды дермы человека с позитивным окрашиванием на CD31 в различные возрастные периоды................................................................................... 88 3.7. Фибробласты дермы в различные возрастные периоды .................................... 93 3.8. Исследование CTGF в фибробластах и сосудах дермы человека в различные возрастные периоды ...................................................................................................... 96 3.9. Исследование PCNA-положительных фибробластов в дерме в различные возрастные периоды .................................................................................................... 102 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ............................................................ 107 ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 116 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................... 118 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 119 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА ................................................. 148 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследований Исследователи на протяжении долгого времени занимаются изучением механизмов старения организма. Было выдвинуто множество теорий, однако ни одна из них в настоящее время не может полноценно объяснить тонкие механизмы, происходящие в организме в процессе старения [63, 163]. Бесспорный интерес в рамках проблемы возрастных изменений организма человека представляет, в частности, старение кожи [137, 178]. Кожа, являясь барьерным органом, непосредственно окружающей среды – испытывает на ультрафиолетового себе и воздействие ионизирующего факторов излучения, воздействия высоких и низких температур, загрязнения внешней среды и т.д. [149]. Все это приводит к изменению структуры, цвета кожи, потере некоторых свойств, таких как эластичность и растяжимость, появлению морщин [179]. Однако, несмотря на интенсивное развитие дерматокосметологии, возможности современной медицины, преодолеть в полной мере появление возрастных изменений кожи на сегодняшний день невозможно. Для решения этой непростой проблемы необходимо знать механизмы, приводящие к возрастным изменениям. Тем не менее, как показывает современная ситуация в медицине на сегодняшний день, мы не располагаем достаточными знаниями в этой области. В процессе физиологического старения кожа подвергается структурным и морфофункциональным изменениям, главным среди которых являются изменения в межклеточном веществе дермы. Установлено, что с возрастом происходит уменьшение количества фибробластов – основных продуцентов внеклеточного матрикса дермы, изменяется их функциональная активность [147, 218]. Однако изменения численности фибробластов и их пролиферативной активности в 5 процессе старения от фетального периода до старости практически не описаны. Имеющиеся в литературе сведения либо охватывают короткий промежуток времени, либо характеризуют изменения, происходящие в дерме не в естественных условиях, а на модели искусственного старения [12, 81, 192]. Общеизвестно, что функционирование органов и тканей в физиологических и патологических условиях зависит от регулярной доставки к ним кислорода кровеносными сосудами. Образование кровеносных сосудов в эмбриональный период происходит за счет васкулогенеза, который заключается в формировании примитивных сосудистых сплетений, и ангиогенеза, связанного с ремоделированием и созреванием новых сосудов [209]. Затем на протяжении постнатального периода онтогенеза человека также постоянно происходят процессы физиологического, патологического и репаративного ангиогенеза. Одну из главных ролей в процессе формирования новых сосудов играют регуляторы ангиогенеза, в частности сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), регулирующий митоз эндотелиальных клеток сосудов и проницаемость сосудистой стенки [88], компоненты Notch-регуляторного пути – дельтаподобный лиганд 4 (Dll4) и Jagged-1 (Jag-1), влияющие на пролиферацию эндотелиоцитов [247], ангиомотин, который играет ключевую роль в миграции и определении полярности клеток эндотелия [43, 172], фрагмент коллагена XVIII типа – эндостатин, ингибирующий пролиферацию эндотелиальных клеток [94, 101], а также фактор роста соединительной ткани (CTGF), регулирующий адгезию, миграцию эндотелиальных клеток [230]. Хорошо изучена роль этих молекул в регуляторных путях в процессе формирования новых кровеносных сосудов при опухолевом росте [90, 99, 193, 229]. Однако роль молекул, принимающих участие в формировании сосудистой системы, в возрастных изменениях кровоснабжения кожи в физиологических условиях остается неизвестной [230]. Еще одним малоисследованным аспектом этой проблемы является отсутствие данных о биологической взаимосвязи между состоянием сосудистой системы и фибробластами дермы [154, 155]. Кроме того, исследования, проведенные в этой 6 области, также охватывают определенный период жизни, отсутствуют длительные наблюдения от эмбрионального этапа до глубокой старости [15]. Классические морфологические методы визуализации не всегда позволяют корректно оценить морфологическое и функциональное состояние различных типов клеток, что ведет к недостаточной изученности тонких механизмов функционирования. Но с внедрением иммуногистохимических методов значительно расширились возможности идентификации клеток и оценки их функционального состояния. Таким образом, исследование возрастных аспектов сосудистого обеспечения кожи, несомненно, актуально и может оказаться полезным в выявлении новых механизмов старения, а также в разработке способов его коррекции. Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось изучение возрастных изменений содержания и распределения регуляторов ангиогенеза в дерме человека. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: 1. Определить содержание и распределение сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в дерме человека в возрастном аспекте. 2. Изучить возрастные изменения в распределении дельтаподобного лиганда 4 (Dll4) в дерме человека. 3. Изучить содержание и распределение Jagged-1 (Jag-1) в дерме человека в онтогенезе. 4. Изучить распределение ангиомотина в дерме человека в возрастном аспекте. 5. Изучить возрастные изменения содержания эндостатина в дерме человека. 6. Исследовать возрастные изменения содержания фактора роста соединительной ткани (CTGF) в дерме человека. 7 Научная новизна Впервые выявлено, что уменьшение количества фибробластов дермы как основных продуцентов внеклеточного матрикса, происходящее в процессе физиологического старения, связано с ухудшением кровоснабжения дермы. Новыми являются данные о содержании регуляторов ангиогенеза в коже человека в возрастном аспекте. Приоритетными следует признать сведения о том, что возрастное увеличение содержания VEGF в кровеносных сосудах дермы не ведет к увеличению количества сосудов дермы. В работе впервые доказано влияние компонентов Notch пути на активность ангиогенеза в дерме человека на протяжении от эмбрионального периода до старости. Новыми являются сведения о негативном влиянии содержания Dll4, происходящее после 20 лет, на степень кровоснабжения дермы. Новизной обладают данные о возрастном увеличении содержания Jag-1 в сосудах дермы. Это, вероятно, является одним из механизмов ухудшения ангиогенеза дермы. Приоритетными являются данные о роли эндостатина в процессе формирования кровеносных сосудов дермы. Показано постепенное планомерное возрастное увеличение содержания эндостатина, ведущее к ухудшению ангиогенеза дермы. Новыми являются сведения о распределении ангиомотина в кровеносных сосудах дермы человека в возрастном аспекте. Впервые продемонстрировано снижение уровня ангиомотина в дермальных сосудах, что является одним из механизмов, приводящих к ухудшению ее кровоснабжения в возрастном аспекте. Новизной обладают данные о том, что с возрастом в фибробластах и кровеносных сосудах дермы отмечается повышение содержания CTGF, что взаимосвязано с ухудшением кровоснабжения дермы. Таким образом, впервые, используя методы иммуногистохимии, были получены новые знания о содержании регуляторов ангиогенеза в дерме в возрастном аспекте. 8 Научно-практическая значимость Проведенное исследование механизмов ангиогенеза в коже человека существенно расширяет и дополняет наши знания о морфологических и структурных изменениях в дерме человека, происходящих в процессе физиологического старения. Впервые представлены механизмы, ведущие к возрастным изменениям в ангиогенезе в коже человека. Полученные данные могут быть полезны для разработки клинических подходов в профилактике и терапии возрастных изменений кожи. Практическая значимость настоящей работы заключается в использовании полученных данных о возрастной регуляции ангиогенеза в дерме при проведении научных исследований в гистологии, патологической анатомии и геронтологии. Они дополняют существующие данные в области возрастной гистологии и могут быть использованы при чтении лекций и проведении практических занятий на медицинских и биологических факультетах вузов. Основные положения, выносимые на защиту 1. Содержание в кровеносных сосудах дермы человека сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), Jagged-1 (Jag-1), фактора роста соединительной ткани (CTGF) и эндостатина увеличивается, ангиомотина – уменьшается от 20 недель беременности до 85 лет жизни, а дельтаподобного лиганда 4 (Dll4) – увеличивается от 20 недель беременности до 20 лет с последующим снижением к 85 годам жизни. 2. Возрастные изменения содержания в кровеносных сосудах дермы человека регуляторов ангиогенеза (VEGF, Dll4, Jag-1, ангиомотин, эндостатин и CTGF) сопровождаются уменьшением численности кровеносных сосудов и фибробластов в дерме в онтогенезе. 9 Связь работы с базовыми научными программами Работа была поддержана следующими грантами: 2008-2011 гг. – грант РФФИ 08-04-97003 «Молекулярные механизмы старения кожи человека». 2011-2013 гг. – дополнительный заказ-наряд Министерства образования и науки Российской Федерации 4.1166.2011 «Исследование особенностей кожи человека в процессе старения». 2012-2013 гг. – государственный контракт ФЦП Федерального агентства по науке и инновациям 2012-1.3.2-12-000-1002-1416 «Изучение морфологических характеристик дермы кожи человека в зависимости от степени активности факторов ангиогенеза в различные возрастные периоды». 2012-2013 гг. – грант РФФИ 12-04-31065 «Молекулярная регуляция ангиогенеза в коже человека в онтогенезе». 2012 г. – грант РФФИ 12-04-00005 «Ангиогенез в коже человека в процессе старения». 2013 г. – грант РФФИ 13-04-97112 «Морфологические характеристики дермы кожи человека в зависимости от степени активности факторов ангиогенеза и иммунного ответа в различные возрастные периоды». Апробация работы Результаты работы, отражающие основные положения диссертации, представлялись на ежегодных итоговых конференциях медицинского факультета Чувашского государственного университета имени И.Н. Ульянова (2010-2014 гг.), международной научной конференции «Актуальные проблемы психологии и медицины в условиях модернизации образования и здравоохранения» (Чебоксары, 2012 г.), VIII международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: инновации в современном мире» (Москва, 10 2013 г.), The 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd International RESOLVE Meeting «Healthy Ageing and Regenerative Medicine» (Israel, 2013 г.), научной конференции «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии», посвященной 20-летию со дня основания Геронтологического общества при Российской академии наук (Санкт-Петербург, 2014 г.). Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них две в зарубежных и четыре в отечественных ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций, шесть тезисов докладов международных и всероссийских конференций и конгрессов. Место проведения работы Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова» (2010-2015 гг.). Работа одобрена этическим комитетом университета. Выписка из протокола заседания этического комитета № 1 от 25 сентября 2015 года. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения и выводов. Объем диссертации – 153 страницы машинописного текста. Работа содержит 44 рисунка. Список цитированной литературы включает 7 отечественных и 261 зарубежный источник. 11 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Кожа: строение, функции Кожа представляет собой наружный покров тела, площадь которого у взрослого человека составляет 1,5-2 м2. Кожа является барьерным органом, так как находится на границе внешней и внутренней среды. Она выполняет множество функций: защитная, иммунная, экскреторная, рецепторная, эндокринная, а также участвует в терморегуляции, депонировании крови и водносолевом обмене [2, 34]. Кожа состоит из трех слоев: наружный слой представлен эпидермисом, под ним залегает дерма и самый глубокий слой — гиподерма [2]. Эпидермис эпителием, эпидермиса представлен образующимся из (кератиноциты) многослойным эктодермы. плоским Среди располагаются ороговевающим эпителиальных неэпителиальные клеток клетки (меланоциты, клетки Лангерганса, Т-лимфоциты, клетки Меркеля) [115]. Основными клетками эпидермиса являются кератиноциты, которые образуют пять слоев — базальный, шиповатый, зернистый, блестящий и роговой. Особенностью кератиноцитов является то, что они непрерывно образуются в базальном слое и смещаются в вышележащие слои. Подвергаясь полной денуклеации, они дифференцируются, превращаясь в роговые чешуйки, слущивающиеся с поверхности кожи [79]. Отростчатые клетки эпидермиса представлены меланоцитами, клетками Лангерганса и клетками Меркеля [169]. Меланоциты – это пигментные клетки нейрального происхождения, образуются из нервной трубки и нервного гребня [79]. Тела меланоцитов находятся в базальном слое, а отростки проникают в шиповатый. Основная функция меланоцитов – это синтез пигмента меланина, 12 который в виде гранул (меланосом) транспортируются в их отростки, а из них — в кератиноциты, защищая последние от ультрафиолетового облучения [2, 119]. Дендритные клетки (клетки Лангерганса, эпидермальные макрофаги) антигенпредставляющие локализуются в клетки базальном или костномозгового происхождения, шиповатом Клетки слоях. — которые Лангерганса захватывают антигены, попадающие в эпидермис, осуществляют их процессинг, затем передают информацию лимфоцитам, вызывая развитие иммунной реакции [162]. Клетки Меркеля имеют нейральное происхождение. Связываясь с афферентным нервным волокном, клетки Меркеля выполняют механорецепторную функцию. Тело тактильных клеток локализуется в базальном слое, а отростки соединены с эпителиоцитами базального и шиповатого слоев посредством десмосом [169]. Эпидермис и дерма разделены базальной мембраной, состоящей из полудесмосом базальных кератиноцитoв, светлой пластины, плотной пластины и фибрoретикулярной пластины. Дерма (собственно кожа) представлена волокнистой соединительной тканью мезенхимального происхождения. Дерма включает два слоя – сосочковый и сетчатый. Сосочковый слой дермы состоит из рыхлой волокнистой соединительной ткани с лимфатическими и кровеносными капиллярами, нервными волокнами и окончаниями. В сосочковом слое содержатся в большом количестве клетки (фибробласты, тучные клетки, клетки костномозгового происхождения, макрофаги, лейкоциты, пигментные клетки) и небольшое количество внеклеточного матрикса (коллагеновые, эластические и ретикулярные волокна). Сетчатый слой образован плотной волокнистой соединительной тканью. Он представлен в основном коллагеновыми волокнами, выполняющими опорную функцию [42, 152]. Условная граница между сосочковым и сетчатым слоем проходит по одним данным на уровне субпапиллярного сплетения кровеносных сосудов [1], по другим — на уровне концевых отделов сальных желез [6]. 13 Среди клеток дермы выделяют постоянно присутствующие в ней – это фибробласты, эндотелиоциты лимфатических и кровеносных сосудов и блуждающие клетки, которые мигрируют из крови в дерму (макрофаги, тучные клетки, лейкоциты) [34]. Основная масса клеток дермы представлена фибробластами разной степени зрелости: юные, дифференцированные и зрелые фиброциты. Незрелые фибробласты проходят этапы последовательной дифференцировки, достигая зрелости. Процесс пролиферации фибробластов контролируется различными цитокинами и медиаторами, в частности интерлейкин-1α, инетерлейкин-1β и интерлейкин-8 [113, 199]. Основная часть фибробластов постоянно присутствует в дерме, но небольшая часть образуется из гемопоэтических стволовых клеток, мигрирующих из костного мозга в дерму [121]. Фибробласты являются основными продуцентами компонентов внеклеточного матрикса, включающих коллаген, фибронектин, эластин, протеогликаны, гликозаминогликаны и другие. Они также участвуют в поддержании гомеостаза в дерме за счет выработки цитокинов, факторов роста и ферментов, в том числе ферментов, разрушающих коллаген [77]. Морфологически фибробласты представляют собой клетки округлой или вытянутой формы с различным количеством отростков. Форма клетки и количество отростков зависят от степени зрелости фибробласта. Юные (недифференцированные) фибробласты имеют небольшие размеры, содержащие крупное ядро и равномерно распределенную по всему объему цитоплазму. Они имеют небольшое количество отростков, что определяет их способность к миграции в очаг повреждения, то есть, незрелые фибробласты участвуют в репаративных процессах и пролиферации. В качестве хемоаттрактанта выступают продукты деградации коллагена [113]. Дифференцированные фибробласты крупнее по сравнению с юными клетками. Они также имеют ядро овальной формы и большое количество цитоплазмы. Дифференцированные фибробласты обладают хорошей 14 подвижностью ввиду большого количества отростков, располагающихся на их поверхности. Они участвуют в синтезе, перестройке и даже разрушении межклеточного вещества дермы, поддерживая химический гомеостаз. Фиброцит – зрелая, дефинитивная (конечная) форма развития фибробластов. Они имеют веретенообразную форму с крыловидными отростками. Клетки содержат вытянутое ядро, небольшое число органелл, вакуолей, липидов и гликогена. Синтез коллагена и других веществ в фиброцитах резко снижен. Зрелые фибробласты участвуют в поддержании тканевой структуры дермы и медленном, непрерывном обновлении внеклеточного матрикса [92]. К мигрирующим клеткам дермы относят тучные клетки, выполняющие защитную, регуляторную, эффекторную и гомеостатическую функции. Наибольшая концентрация тучных клеток обнаружена в сосочковом слое вокруг кровеносных сосудов, а также рядом с придатками кожи и нервными окончаниями [75]. В дерме присутствуют клетки костномозгового происхождения – макрофаги, проникающие в нее из кровеносных сосудов. Основная функция макрофагов заключается в поглощении чужеродных антигенов, то есть осуществлении фагоцитоза, а также предоставлении информации лимфоцитам – антигенпрезентирующая функция [267]. В дерме также определяются стволовые клетки, мигрирующие из костного мозга. Здесь они подвергаются дифференцировке, в результате которой гемопоэтические стволовые клетки могут превращаться либо в фибробласты и участвовать в процессах регенерации в очаге воспаления, либо в тучные клетки и лейкоциты, а также в клетки кровеносных сосудов [41, 47]. Внеклеточный матрикс дермы состоит их трех компонентов: основное вещество дермы, адгезивные белки и волокнистые структуры (коллагеновые, эластические и ретикулярные волокна). Функции внеклеточного матрикса заключаются в формировании структурных основ дермы, механических контактов между клетками и создании путей миграции для клеток. Основное вещество имеет гелеобразную структуру, которая состоит из 15 гликозаминогликанов, гликопротеинов, гидратированных комплексов протеогликанов, растворимого коллагена, ферментов и продуктов деградации коллагена [59, 138]. Структурную основу дермы составляют коллагеновые волокна, включающие фибриллярный белок коллагена, синтезируемый фибробластами дермы. Коллагеновые волокна поддерживают архитектонику дермы, обеспечивают прочность и эластичность кожи [171]. Механическую прочность дермы обеспечивает коллаген I типа, находящийся преимущественно в сетчатом слое, а коллаген VII типа проникает в базальный слой эпидермиса и стабилизирует кожу, прочно связываясь с подлежащей соединительной тканью [46]. Существует мнение, что формирование коллагеновых волокон стимулируется декорином и фибромодулином [160]. Эластические волокна обладают хорошей растяжимостью, они обусловливают эластичность и упругость кожи. В состав эластических волокон входит эластин и фибриллин [128]. Ретикулиновые волокна – это разновидность коллагена. Они имеют тесные связи с основным веществом дермы, обеспечивают растяжимость кожи [54]. Кровоснабжение дермы осуществляют артерии гиподермы, которые образуются в результате слияния артерий межмышечных фасциальных перегородок, мышечно-кожных и надкостно-кожных артерий. Они образуют две сосудистые сети: поверхностную — на границе сосочкового и сетчатого слоя, и глубокую — на границе дермы и гиподермы. Кровеносные сосуды кожи формируют множество артериовенозных анастомозов с богатой симпатической иннервацией. Сосуды кожи участвуют в терморегуляции, депонировании крови, осуществляют транспортную и обменную функции [32, 82]. Гиподерма, или подкожная жировая клетчатка, представляет собой прослойку белой жировой ткани, состоящей из белых адипоцитов. Клетки гиподермы разделены между эластических волокон [11]. собой перегородками из коллагеновых и 16 1.2. Возрастные изменения организма человека Старение – это сложный неизбежный биологический процесс, характеризующийся потерей адаптационных резервов организма, нарушением физиологической целостности, что приводит к снижению функциональности, повышению восприимчивости к средовым факторам и, в конечном счете, к смерти организма [243]. Старение организма инициируется генетическими и внешними факторами окружающей среды. Изменения, происходящие в процессе старения, захватывают молекулярный, клеточный, организменный и системный уровни, характеризуются структурной и функциональной трансформацией организма [120, 158]. На протяжении многих лет исследование механизмов старения является актуальной областью в научном мире. Однако только в последние годы достигнут определенный прогресс, связанный с открытием способов контроля скорости старения с помощью генетических и биохимических процессов, сохраняемых в эволюции [225, 243]. Исследователями было выдвинуто сотни гипотез старения, но только некоторые из них имеют научную ценность. Самой распространенной гипотезой является теория генетически запрограммированного старения. В противоположность данной теории существует предположение, что старение связано с повреждением клеток, органелл, происходящем на уровне ДНК. Это приводит к накоплению мутаций (теория соматических мутаций) на уровне теломеров (теория теломеров), митохондриальной ДНК. Повреждения клеточных структур могут быть вызваны свободными радикалами – супероксид кислорода, перекись водорода, гидроксильные радикалы (свободнорадикальная теория) [187]. Старение организма захватывает все органы и системы, но в каждой из них имеются свои характерные особенности. В основе старения сердечно-сосудистой системы лежит дисфункция эндотелия, которая приводит к повышенной агрегации тромбоцитов, образованию тромбов и, как следствие, к гипоксии и ишемии [52, 93, 146]. В органах дыхательной системы с возрастом также 17 происходит структурная и морфологическая перестройка. Усиление фиброза в легочной паренхиме способствует снижению дыхательной поверхности легких. В результате снижается вентиляция легких, жизненная емкость легких, увеличивается остаточный дыхательный объем [33, 237]. Установлено, что с возрастом значительно уменьшается количество нейронов, особенно в черном веществе, гиппокампе, базальных ядрах, мозжечке. В результате этого активируются покоящиеся клетки микроглии, стимулируя выработку цитокинов, факторов роста. Их активация запускает иммунные реакции, приводящие к нейрональной дисфункции [78]. В периферической нервной системе старение вызывает уменьшение числа двигательных и чувствительных нейронов, демиелинизацию нервных волокон [148, 199]. Изменения, происходящие в репродуктивной системе, коррелируют с перестройкой в нервной системе, в частности гипоталамусе и гипофизе. В женском организме старение приводит к прекращению овариальной функции, переходу в менопаузу. Отмечается атрофия матки и маточных труб, образование фолликулярных кист в яичниках [210, 211]. В мужском организме также отмечается снижение уровня половых гормонов — андрогенов, яички подвергаются дегенеративным изменениям. В организме происходит комплекс эндокринных и метаболических изменений, что в первую очередь проявляется функциональными нарушениями в половой и центральной нервной системах, костях, мышцах, кожном покрове [13]. Таким образом, старение представляет собой комплексный процесс, характеризующийся структурно-функциональной перестройкой всех органов и систем. Одной из первых на возрастные изменения реагирует кожа, что проявляется внешними признаками старения. 1.3. Общие сведения о возрастных изменениях кожи Подобно всему организму кожа подвергается старению, которое представляет собой сложный биологический процесс, состоящий из внешнего и 18 внутреннего старения. Внутреннее старение генетически детерминировано, характеризуется изменением структуры межклеточного вещества, клеточного состава. Внешнее старение обусловлено воздействием факторов окружающей среды и имеет характерные морфологические признаки – появление морщин, изменение пигментации, снижение упругости и эластичности, дряблость, появление старческих пятен, телеангиоэктазий [153]. Морщины представляют собой видимые углубления на поверхности кожи. Их появление обусловлено структурными и физиологическими изменениями, происходящими в коже в процессе старения. Деградация внеклеточного матрикса дермы, изменение активности мимических мышц, структуры лицевых костей и хрящей, потеря подкожной жировой клетчатки являются основой для формирования морщин [179, 203]. С возрастом кожа претерпевает ряд характерных изменений и на гистологическом уровне. В эпидермисе с возрастом уменьшается число эпидермальных макрофагов (клеток Лангерганса), меланоцитов, что приводит к неравномерной пигментации [122, 260]. Наиболее выраженные возрастные изменения происходят в дерме. Эти изменения непосредственно связаны с изменением численности фибробластов как основных продуцентов внеклеточного матрикса. Популяционные изменения фибробластов зависят от их способности к самообновлению. Однако на сегодняшний день достоверно неизвестно, какая часть дермальных фибробластов способна к делению или находится в клеточном цикле в разные возрастные периоды. Установлено, что с возрастом происходит уменьшение численности фибробластов, это в свою очередь приводит к уменьшению основного вещества дермы, соединительной ткани, протеогликанов, гиалуроновой кислоты, что выражается в потере тургора, эластичности кожи и образовании морщин. Кроме этого, стареющие фибробласты начинают синтезировать ферменты коллагеназу, желатиназу, эластазу [218]. Под действием ферментов эластические волокна подвергаются деформации, они становятся тонкими, распределяются неравномерно. Сеть коллагеновых волокон с возрастом 19 теряет свою пространственную ориентацию, приобретает хаотичное расположение [38]. Многочисленные исследования показали, что с возрастом меняется морфологическая и функциональная активность фибробластов. Известно, что фибробласты кожи пожилых людей вырабатывают интерлейкин-6 и интерлейкин-8 в большем количестве, чем фибробласты молодых людей [242]. Экспериментальным путем на лабораторных мышах установлено, что в эмбриональном периоде в коже отмечается низкий уровень экспрессии трансформирующего фактора роста-β1, CD44, интерлейкина-6, интерлейкина-8 и высокое содержание гиалуроновой кислоты, что способствует полной ее регенерации при повреждении в отличие от кожи взрослых особей [111, 112]. Высокая экспрессия интерлейкина-10 в коже взрослых людей приводит к уменьшению воспалительной реакции, аномальному отложению коллагена и восстановлению нормальной архитектоники Исследователями установлено, что с при повреждении [212]. возрастом происходит изменением клеточной биомеханики фибробластов, что ведет к потере кожей упругости. В процессе старения отмечается повышение жесткости цитоскелета фибробластов в результате трансформации мономерного G-актина в фибриллярный F-актин [231]. Анализ фибробластов кожи четырех здоровых доноров 22-30 лет и шести здоровых доноров 81-92 лет показал хорошую миграционную активность молодых фибробластов. Фибробласты кожи пожилых людей продемонстрировали плохую миграционную возможность, что отразилось в неорганизованном построении актинового цитоскелета и низкой способности к сокращению коллагеновых волокон [207]. Определенные изменения в процессе хронологического старения происходят во внеклеточном матриксе. Отмечается уменьшение количества белков экстрацеллюлярного матрикса под действием металлопротеиназ [117]. Наряду с этим в межклеточном веществе дермы описана высокая экспрессия фибронектина, провоспалительных интерлейкинов и цитокинов. Снижение количества коллагена в тканях приводит к нарушению структурной целостности, 20 увеличению жесткости и, как следствие, к нарушению биомеханических свойств, дисбалансу в системе структура — функция внеклеточного матрикса. Кроме того, расположение коллагеновых волокон I типа становится менее организованным, носит фрагментарный характер [64]. Установлено, что в процессе старения фибробласты меняют спектр синтезируемых веществ в зависимости от пола. Так, уменьшение продукции гиалуроновой кислоты и гепаринсульфата характерно для лиц мужского и женского пола, а снижение синтеза хондроитин сульфата только для женского организма [53]. Одной из вероятных причин старения кожи является ухудшение ее кровоснабжения с возрастом. Исследование кожи 120 здоровых людей разного возраста показало, что старение сопровождается ухудшением микроциркуляции, которое определяется морфологическими изменениями в сосудах, изменением в микрогемодинамике и реологических свойств крови. Кожа пожилых лиц характеризуется уменьшенным количеством функционирующих капилляров [258]. Исследуя кожу людей в возрасте от 33 до 82 лет с использованием антител против антигена CD34, ученые выявили неуклонное снижение плотности капилляров в сосочковом слое дермы, начиная с 60 лет. Подобные изменения в сетчатом слое дермы не определялись ни в одном возрастном периоде [202]. На модели индуцированного старения кожи под воздействием ультрафиолетового облучения выявлена активация процесса ангиогенеза и нарушение лимфатического дренажа кожи [214]. Эндотелиальные клетки сосудов, находясь на границе между тканями и плазмой, обеспечивают поддержание гомеостаза. Они способны генерировать новые кровеносные сосуды, участвовать в воспалительных реакциях, коагуляции, заживлении ран. Ввиду того, что большинство патологических процессов происходит на уровне микрососудов, эндотелиоциты являются актуальной моделью для изучения клеточного старения [155]. Однако механизмы ухудшения кровоснабжения кожи в возрастном аспекте до конца еще не изучены. 21 1.4. Общие сведения об ангиогенезе. Ангиогенез в коже человека Функционирование органов и тканей в физиологических и патологических условиях зависит от регулярной доставки кислорода кровеносными сосудами. В последнее десятилетие исследователи активно занимаются изучением механизмов образования кровеносных сосудов. Существует два принципиально различных механизма их формирования — это васкулогенез и ангиогенез. Васкулогенез происходит у эмбриона и характеризуется образованием кровеносных сосудов de novo из предшественников эндотелиальных клеток. В период раннего эмбрионального дифференцируются в развития гемангиобласты, мезодермальные которые являются клетки общими предшественниками как клеток гемопоэза, так и эндотелиальных клеток, дающих начало кровеносным сосудам. При дальнейшей дифференцировке из гемангиобластов образуются ангиобласты. В результате агрегации ангиобластов формируются кровяные островки. Затем при слиянии кровяных островков образуется первичное сосудистое сплетение. Оно состоит из множества мелких капилляров, сформированных клетками эндотелия [4, 209]. Известно, что уже на этой стадии капилляры начинают дифференцироваться в артериальный или венозный сосуд. Это указывает на генетически запрограммированную специфичность клеток [72]. Недавние исследования показали принципиально новый механизм регуляции васкулогенеза. Для формирования основного осевого сосуда ангиобласты мигрируют в направлении от средней линии, где в качестве хемоаттрактанта выступает VEGF. Однако ученые показали, что на срединную миграцию ангиобластов влияет уровень экспрессии апелин рецепторов [244]. Ангиогенез – это процесс образования новых кровеносных сосудов из уже существующей сосудистой системы [209]. В процессе ангиогенеза происходит расширение первичного сосудистого сплетения за счет ветвления капилляров и формирование высокоорганизованной сосудистой сети. Образование новых сосудов начинается с локального разрушения стенки ранее существующего 22 сосуда, активации пролиферации и миграции эндотелиальных клеток. Это приводит к формированию трубчатых структур из клеток эндотелия, которые являются основой для стенки будущих сосудов. Дальнейшее созревание сосудистой сети приводит к слиянию капилляров в более крупные сосуды, артерии и вены [4]. Стенки капилляров и мелких сосудов состоят из одного слоя клеток, называемых перицитами, а стенки артерий и вен образованы несколькими слоями гладкомышечных клеток. Перициты представляют собой гетерогенную популяцию клеток мезенхимального происхождения, обладающих способностью к дифференцировке в мезенхимальные клетки другого типа, такие как гладкомышечные клетки, фибробласты и остеобласты [123]. Дисфункция перицитов, характеризующаяся нарушением их сократимости, играет одну из ключевых ролей в патогенезе фибропролиферативных и сосудистых заболеваний [241]. Также существует мнение, что перициты представляют собой популяцию стволовых клеток, обладающих мощным пролиферативным, регенераторным потенциалом в процессе заживления ран [89]. Таким образом, в сосудистой стенке выделяют два основных типа клеток: эндотелиальные клетки и перициты. Во время ангиогенеза клетки эндотелия выходят из свойственного им состояния покоя, начинают активно делиться и образуют так называемую эндотелиальную почку, которая прорывает базальную мембрану и внедряется в соединительную ткань. Эндотелиальные клетки активируются под воздействием факторов роста и компонентов внеклеточного матрикса. Прекращение действия этих факторов возвращает эндотелиальные клетки в состояние покоя [4, 209]. На протяжении постнатального периода онтогенеза человека также постоянно происходят процессы физиологического, патологического и репаративного ангиогенеза. Как известно, ангиогенез играет важную роль в развитии, нормальном росте ткани, заживлении ран, репродуктивном цикле у женщин (развитие плаценты и желтого тела, овуляция) и также имеет важное 23 значение в различных заболеваниях. Известно, что избыточная активность ангиогенеза приводит к развитию аутоиммунных заболеваний, например, ревматоидного артрита, саркомы Капоши, псориаза. Однако недостаточное формирование системы кровоснабжения способствует развитию язвенной болезни желудка, остеопороза, а также медленному заживлению ран и ишемии органов и тканей. Таким образом, роль ангиогенеза в организме человека неоднозначна. Образование новых сосудов также непосредственно связано с ростом опухолей. Этот процесс, известный как опухолевый ангиогенез, является неотъемлемой частью метастазирования. Ангиогенез свойственен всем видам опухолей: и доброкачественным, и злокачественным. Кровеносные сосуды опухоли имеют функциональные и морфологические отличия от нормальной сосудистой сети. В структуре их стенки отсутствуют перициты, сосудистая сеть имеет хаотичную организацию с множеством ветвлений и извитостью кровеносных сосудов. Сосуды обладают повышенной проницаемостью, а их рост детерминирован действием факторов роста [30]. В основе регуляции механизма неоангиогенеза лежит высвобождение ангиогенных факторов, источниками которых могут быть эндотелиальные и тучные клетки, макрофаги и другие [21]. Ангиогенные факторы приводят к активации эндотелиоцитов и миграции их за пределы базальной мембраны, а также к дальнейшему формированию ответвлений основных сосудов. Есть мнение, что миграция эндотелиоцитов инициируется активацией экспрессии эндотелиальных молекул адгезии, например Е-селектина. В состоянии покоя эндотелиоциты не пролиферируют и редко (один раз в 7-10 лет) делятся. Но воздействие ангиогенных факторов роста и цитокинов приводит к активации пролиферации эндотелиоцитов и ремоделированию сосуда, после чего вновь образованный сосуд приобретает стабильное состояние [4]. Известно, что ангиогенез детерминирован балансом между его стимуляторами и ингибиторами. В настоящее время известны следующие 24 стимуляторы неоангиогенеза: VEGF, ангиогенин, фактор роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста-1, трансформирующие факторы роста-α и β, NO, интерлейкин-8 и неспецифические Ингибиторы факторы, неоангиогенеза: такие как матриксные эндостатин, металлопротеиназы. тромбоспондин, ангиостатин, растворимые рецепторы VEGF, рестин, вазостатин, ингибиторы матриксных металлопротеиназ [24, 37, 74]. Молекулярные основы ангиогенеза кожи, а также факторы, влияющие на его активность, широко изучались на лабораторных животных. Экспериментальным путем установлено влияние гирудина на ангиогенез кожи лабораторных животных. Гирудин стимулирует ангиогенез кожи путем увеличения экспрессии VEGF и уменьшения экспрессии эндостатина и тромбоспондина-1 опосредованно через p38 MAPK-ERK путь [134]. Известно, что от активности ангиогенеза зависит интенсивность фиброза при многих фибропролиферативных заболеваниях. В этой связи было показано, что рецептор токсина сибирской язвы, также известный как эндотелиальный опухолевый маркер-8, вызывает снижение синтеза эндотелиальных компонентов базальной мембраны и гиперпролиферацию фенестрированных кровеносных сосудов в коже. Он также приводит к увеличению экспрессии VEGF, количества тучных клеток и макрофагов [208]. Механизм ангиогенеза кожи человека изучался А. Lafosse и другими на хронических длительно незаживающих ранах[35]. Они выяснили, что выделенные из жировой ткани стромальные клетки улучшают заживление раны путем стимуляции ангиогенеза и иммуномодуляции [35]. Установлено, что клеточная пролиферация, лежащая в основе заживления ран, непосредственно связана с ангиогенезом и фиброплазией. Эти два процесса являются взаимозависимыми, и дисбаланс в одной из составляющих может привести к длительному заживлению раны или формированию патологического рубца [76]. 25 Ряд исследователей изучали воздействие электрического тока на рост и образование новых сосудов кожи человека в остро возникших ранах. Они показали, что воздействие электрического тока усиливает экспрессию ангиогенных факторов роста, в частности VEGF-A и плацентарного фактора роста, а также способствует миграции кератоницитов, макрофагов, стимуляции фибробластов, что улучшает процесс заживления раны [22]. Терапевтический эффект мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из пуповины человека, изучался в процессе регенерации кожи. Было показано, что мезенхимальные стволовые клетки обладают определенным проангиогенным эффектом. Они опосредованно через Wnt4 индуцируют активацию β-катенина в эндотелиальных клетках, что приводит к повышению экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток [139]. Ангиогенез является актуальной проблемой и для больных сахарным диабетом [3]. При данном заболевании существует два противоположных эффекта: чрезмерный рост новых сосудов в сетчатке глаза приводит к развитию ретинопатии и недостаточная активность ангиогенеза в коже приводит к нарушению ее трофики и формированию венозных язв [3, 23, 58]. Широко изучен механизм ангиогенеза при опухолевых заболеваниях в качестве ключевого звена в процессе метастазирования [44]. В этой связи таргетная терапия опухолевых заболеваний, основанная на блокировании ангиогенеза, остается актуальной проблемой на сегодняшний день [30]. В современной биологии и медицине весьма актуальными являются вопросы роли ангиогенеза в патогенезе ишемических заболеваний. Известно, что одним из факторов, приводящих к активации роста новых сосудов, является гипоксия. Ответы клеток на гипоксию в основном регулируются активацией факторов транскрипции так называемого фактора, индуцированного гипоксией (HIFs) [194]. HIFs факторы играют защитную роль в развитии ишемических заболеваний, связанных с недостаточным развитием коллатерального кровотока при артериальной непроходимости, так как один из его димеров HIF-2α способен индуцировать экспрессию ангиогенных факторов роста [132]. 26 Изучение процесса образования и роста сосудов кожи в онтогенезе проводилось лабораторных на моделях животных. индуцированного Человек старения ежедневно человека подвергается или на воздействию ультрафиолетового, инфракрасного излучений, тепла. Доказано, что эти факторы индуцируют ангиогенез. Однако действие излучения на ангиогенез кожи неоднозначно: при остром воздействии активируются процессы васкуляризации, при хроническом длительном воздействии, наоборот, кровоснабжение кожи значительно ухудшается [60]. В качестве терапевтического способа для лечения фотостарения кожи предложено использовать гипербарическую оксигенацию. Было доказано, что использование гипербарической оксигенациии приводит к сокращению количества морщин, возникающих от воздействия ультрафиолетового излучения [31], которое связано с активацией проангиогенных факторов, таких как HIF-1α, VEGF, матриксных металлопротеиназ 2 и 9 [133]. Таким образом, проанализировав имеющиеся литературные источники, мы не нашли сведений о регуляции ангиогенеза кожи человека в возрастном аспекте в физиологических условиях. Все имеющиеся данные касательно механизмов васкуляризации кожи человека были получены в ходе изучения патологических состояний, в частности, регенерация при заживлении кожных ран и образование рубцов [35], опухолевый ангиогенез [44], а также изменение трофики кожи при сахарном диабете [3, 58], ишемических заболеваниях. Кроме того, особенности ангиогенеза кожи человека рассмотрены, в основном, на моделях индуцированного старения, например, на модели фотостарения [60, 124]. В имеющихся литературных источниках нами не обнаружено исследований по кровоснабжению кожи в возрастном аспекте от эмбрионального периода до глубокой старости [155]. Как правило, изучение васкуляризации кожи человека касалось какого-то одного промежутка жизни человека [66]. 27 1.5. Регуляторы ангиогенеза 1.5.1. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) Во время позднего эмбриогенеза и в постнатальный период образование и рост новых сосудов происходит за счет ангиогенеза — процесса, характеризующегося образованием сосудов из уже существующих. Данный процесс находится под стимулирующим влиянием факторов роста. Самым мощным из всех известных факторов роста, влияющих на ангиогенез, является VEGF [257]. VEGF представляет собой семейство белков, в которое входят VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, вирусный гомолог VEGF-E. Экспрессия эндотелиальных факторов роста дифференциально регулируется короткими шпильками мРНК [84]. Самым активным из семейства эндотелиальных факторов роста сосудов является VEGF-A. Первоначально он был выделен как фактор сосудистой проницаемости [88]. VEGF-A представляет собой гетеродимерный гликопротеин, который продуцируется различными типами клеток. Идентифицировано пять изоформ VEGF-А: VEGF 12, VEGF 165, VEGF 183, VEGF 189, VEGF 206. В отличие от других митогенов эндотелиальных клеток, таких как фактор роста фибробластов-β и тромбоцитарный фактор роста, VEGF синтезируется как предшественник, содержащий 226 аминокислот. VEGF обладает сильным ангиогенным действием, регулирует митоз эпителиальных клеток сосудов, способствует вазодилатации опосредованно через NO-синтетазный путь, увеличивает проницаемость сосудистой стенки, изменяя функцию гемато– энцефалического барьера [235]. Ангиогенный эффект VEGF-A реализуется через взаимодействие со специфическими рецепторами: VEGFR-1, VEGFR-2 и нейролипин-1, которые находятся в растворимой форме на васкулярных и лимфатических 28 эндотелиальных клетках [223]. VEGFR-1 также обнаруживается в остеобластах, клетках трофобласта [222]. Они способны связывать цитокины с последующей их нейтрализацией. Максимальная экспрессия рецепторов обнаруживается в пролиферирующем эндотелии выстилки сосудов и солидных опухолях. VEGFR-1 и VEGFR-2 имеют значительные отличия на биохимическом уровне. Так, VEGFR1 играет регуляторную роль, а VEGFR-2 является основным преобразователем ангиогенных сигналов в пути VEGF- VEGFR [116, 220]. Лиганд VEGF-B широко распространен во многих тканях, но максимальная его концентрация встречается в сердце и скелетных мышцах. В организме человека VEGF-B имеет две изоформы: VEGF-B 167 и VEGF-B 186 [74]. Роль лиганда VEGF-B в организме до конца не изучена. На лабораторных животных показано, что выключение гена VEGF-B приводит к формированию неполноценной сердечно-сосудистой системы, при этом животные остаются жизнеспособными [170]. В семействе VEGF выделяют лиганды, участвующие преимущественно в процессе лимфоангиогенеза, к ним относятся VEGF-C и VEGF-D [221]. Эти лиганды обладают структурной гомологией. Высокая экспрессия VEGF-C обнаружена при злокачественных опухолях желудочно-кишечного тракта, а VEGF-D у развивающихся эмбрионов, преимущественно в легочной мезенхиме. В тканях взрослых людей VEGF-D обнаруживается в сердце, легких, скелетной мускулатуре и тонком кишечнике [221]. Экспрессия VEGF также регулируется множеством проангиогенных факторов, в частности, эпидермальным ростовым фактором, фактором роста фибробластов, тромбоцитарным фактором роста. Кроме того, на уровень VEGF влияют факторы окружающей среды: рН, давление и концентрация кислорода. Результатом воздействия этих различных факторов на VEGF является стимуляция ключевых для ангиогенеза факторов, таких как антиапоптотические белки, молекулы клеточной адгезии и матриксные металлопротеиназы. 29 Многочисленные исследования показали роль сигнального пути VEGFVEGFR в физиологическом ангиогенезе от эмбрионального периода до глубокой старости. Экспериментальным путем на лабораторных мышах установлено, что выключение даже одного аллеля в гене VEGF приводит к летальному исходу ввиду неправильного формирования сосудистой сети [9], а выключение любого из генов рецепторов VEGFR ведет к смерти ввиду избыточной васкуляризации в эмбрионе [48]. In vitro на модели культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека и фибробластов человека показано, что VEGF играет центральную роль в ангиогенезе, поскольку VEGF-блокирующие агенты, такие как sFlt-1 и антитела, нейтрализующие анти-VEGF, подавляют ангиогенез и формирование трубчатой системы сосудов даже в присутствии других ангиогенных факторов, таких как фактор роста фибробластов, фактор роста гепатоцитов и ангиопоэтин-1 [213]. Недавние исследования продемонстрировали, что передача сигналов VEGFR также играет важную роль в нейронной системе, в обоих сенсорных и моторных нейронах. Таким образом, система VEGF-VEGFR может быть привлекательной мишенью для лечения заболеваний нервной системы, таких как боковой амиотрофический склероз [174]. Помимо этого, сигнальный путь VEGFVEGFR вовлечен в ряд хронических воспалительных заболеваний, например, ревматоидный артрит [227], ретинопатия [257]. Тем не менее наиболее изучена роль системы VEGF-VEGFR в процессе опухолевого ангиогенеза [17, 110]. Еще в 1970-х годах Фолькман в своих исследованиях предположил, что опухолевой ангиогенез является перспективным направлением в лечении онкологических заболеваний [129]. Начиная с 1980-х годов до настоящего времени получено достаточно данных о ведущей регуляторной роли системы VEGF-VEGFR в ангиогенезе опухоли [220]. Внутри опухоли создаются условия для развития гипоксии вследствие быстрого роста опухолевых клеток. Одним из индукторов VEGF является гипоксия, действующая через стабилизацию и активацию фактора транскрипции HIF-1α, рецепторы VEGFR, в частности VEGFR-2, также активируются в условиях гипоксии [217]. 30 На лабораторных животных показано, что антитела против человеческого VEGF эффективно подавляют рост ксенотрансплантатов опухоли человека, пересаженных в иммунно-дефицитных мышей [143]. В настоящее время широко применяется таргетная терапия VEGF-нейтрализующими антителами для лечения рака прямой кишки, легких, молочной железы, гепатоцеллюлярной карциномы. Механизм действия таргетной терапии связан либо с прямым непосредственным подавлением ангиогенеза, либо с поддержанием уже имеющегося апоптоза эндотелиальных клеток опухоли, либо с восстановлением нормальной проницаемости сосудов [220]. Таким образом, проанализировав имеющуюся медицинскую литературу о роли VEGF в ангиогенезе, мы не нашли данных о значении VEGF в возрастном уменьшении численности кровеносных сосудов в дерме. Все многочисленные исследования были в основном направлены на изучение функции системы VEGFVEGFR при различных заболеваниях, непосредственно связанных с изменением в системе кровообращения (опухоли, системные заболевания соединительной ткани, ретинопатия). Следует отметить, что в современной литературе отсутствуют данные о возрастном изменении степени экспрессии VEGF от антенатального периода до глубокой старости. 1.5.2. Дельтаподобный лиганд 4 (Dll4) и Jagged-1 (Jag-1) Современной науке известно несколько путей регуляции ангиогенеза. Помимо наиболее изученного пути VEGF-VEGFR существенную роль в данном процессе играет сигнальный путь Notch [142]. Регуляторный Notch путь является эволюционно консервативной сигнальной системой, которая контролирует судьбу и дифференцировку клеток во время развития разных тканей, а также играет важную роль в образовании новых сосудов у взрослых [114, 183]. У млекопитающих, в том числе и у человека, сигнальный путь Notch состоит из комплекса рецепторов и лигандов. Выделяют четыре рецептора Notch (Notch 1, 31 Notch 2, Notch 3, Notch 4) и шесть лигандов: Jag-1, Jag-2 и Dll1, Dll2, Dll3, Dll4. Notch 1 экспрессируется в различных типах клеток, тогда как Notch 4 преимущественно в клетках эндотелия сосудов, Notch 3 в эндотелии легких [250]. Все рецепторы и лиганды являются трансмембранными белками [161]. Notch рецепторы синтезируются в виде одноцепочечных предшественников, которые затем расщепляется на внеклеточную и трансмембранную субъединицу в комплексе Гольджи. Эти две субъединицы удерживаются вместе на клеточной мембране посредством нековалентных связей [250]. Взаимодействие рецепторлиганд вызывает протеолитическое расщепление рецептора, удаление внеклеточной субъединицы, ведущее к освобождению внутриклеточного домена Notch из клеточной мембраны. Внутриклеточный домен транслоцируется в ядро, где он связывается с ДНК-связывающим протеином CSL, вытесняя комплекс гистондезацетилазы-ко-репрессор из CSL белка. Это приводит к активации транскрипции Notch-зависимых генов [156]. Данный механизм считается каноническим путем активации системы Notch [127]. В последнее время получены данные о неклассическом CSL-независимом пути активации системы Notch, опосредованном внутриклеточным медиатором Notch-зависимой антиапоптической фосфатидил-инозитол-3 киназой [182], также системой VEGFA-VEGFR-2 в нейронных клетках [145]. Регуляторный путь сигнализации Notch играет важную роль в сердечнососудистой системе: контролирует дифференцировку кардиомиоцитов, образование клапанов сердца и сосудов. Таким образом, доказано, что мутация Notch рецепторов или его лигандов приводит к развитию врожденных сердечнососудистых заболеваний, таких как синдром Алажиля, церебральная аутосомнодоминантная артериопатия с подкорковыми инфарктами и лейкоэнцефалопатией, двустворчатый аортальный клапан, артериовенозная мальформация сосудов головного мозга [177]. В литературе имеются данные, что VEGF способен индуцировать синтез Dll4 в эндотелиальных клетках [173]. Это взаимодействие приводит к 32 формированию так называемых tip клеток, которые локализуются в терминальном участке вновь формируемого сосуда [145]. На модели клеточной культуры человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены было показано, что Notch система подавляет ветвление tip клеток. Подавление Notch сигнализации приводит к делению tip клеток, при этом обе дочерние клетки схожи с исходной. Так представлен бифуркационный механизм ветвления сосудов [125]. Tip клетки способны продуцировать Dll4, который действует на рецепторы Notch 1 и Notch 4, расположенные на соседних эндотелиоцитах, что приводит к резкому уменьшению количества рецепторов VEGFR-2. Таким образом образуются так называемые stalk клетки. Stalk клетки располагаются позади tip клеток. Их функция заключается в формировании эндотелиальной выстилки ствола нового кровеносного сосуда. Лиганд Jag-l в эндотелиальных stalk клетках инициирует синтез Notch 3 в клетках, расположенных глубже. Впоследствии происходит дифференцировка этих клеток в перициты и гладкомышечные клетки [145]. Экспериментальным путем на лабораторных мышах показан диаметрально противоположный эффект Notch-лигандов Dll4 и Jag-1 в регуляции ангиогенеза [181]. Установлено, что ингибирование Dll4 в клетках эндотелия индуцирует экспрессию Jag-1. Лиганд Jag-1, когда выключен путь активации Dll4 через Notch 1, способствует экспрессии VEGF и росту эндотелиальных клеток. Jag-1 также инициирует созревание новообразованных сосудов, возможно, путем связывания и активации рецептора Notch 4 [103]. Лиганд Dll4 рецепторов Notch 1 и Notch 4 играет одну из ключевых ролей в регуляции процесса образования новых сосудов. Этот факт подтверждается преимущественной экспрессией Dll4 эндотелиальными клетками сосудов [39]. Однако в последнее время Dll4 находят и в других тканях [185]. Установлено, что у большинства линий мышей делеция одного из аллелей Dll4 приводит к нарушению в развитии сосудистой системы в период раннего эмбрионального развития и к гибели эмбриона [130]. Также известно, что нарушение экспрессии эндотелиальными клетками протеина Dll4 имеет парадоксальный эффект в 33 процессе образования новых сосудов. С одной стороны, это приводит к чрезмерному образованию сосудистой сети, с другой – формируются дефектные сосуды с малым диаметром просвета или полным его отсутствием. Также происходит нарушение перфузии, изменение в строении перицитов как у эмбрионов, так и взрослых мышей [141]. Регуляторный Notch путь вовлечен в опухолевый ангиогенез. Его роль зависит от взаимодействия с другими сигнальными системами [86]. Notch 1 может выступать как в роли онкогена, например, при остром лимфобластном лейкозе у детей [165], так и быть опухолевым супрессором на мышиных моделях кожи, активируя waf1 и тем самым подавляя передачу сигнала Shh и Wnt [204]. Исследователями доказано, что экспрессия Dll4 в физиологических условиях в организме здорового человека низкая, однако она значительно повышается в опухолевых сосудах [87]. При этом экспрессия Dll4 в эндотелиоцитах зависит от уровня VEGF и FGF [254]. Высокий уровень Dll4 негативно коррелирует со степенью злокачественности рака молочной железы, мочевого пузыря [246], он также является предиктором выживаемости при раке яичников [40]. На лабораторных животных экспериментально было показано, что экспрессия Dll4 значительно повышается в эндотелиальных клетках капилляров кожи в условиях ишемии [248]. В недавних исследованиях Jag-1 идентифицирован как физиологический лиганд для CD46. Связывание Jag-1 с доменом DSL приводит к активации фактора комплемента CD46, что определяет функциональность Т-хелперов. Это наблюдение позволяет предположить, что лиганд Jag-1 играет роль в иммунных реакциях [240]. Установлено, что Jag-1 принимает участие в формировании гладкой мускулатуры сосудов, а также в обеспечении взаимодействия между эндотелиальными и периваскулярными клетками. Элиминирование Jag-1 из эндотелия сосудов приводит к серьезным дефектам в их строении и гибели организма [247]. Jag-1 играет роль в нескольких аспектах биологии рака, в частности, в опухолевом ангиогенезе, опухолевом росте клеток, трансформации 34 эпителиальных клеток в мезенхимальные, метастатизировании, а также определяет устойчивость к терапии некоторых видов рака [20, 150, 151, 166, 176, 205, 234, 236, 252]. Возрастные изменения в кровоснабжении кожи были изучены на модели индуцированного старения под действием ультрафиолетового света. Исследователями было установлено, что ультрафиолетовое облучение повышает активность некоторых ангиогенных факторов, в частности VEGF, фактора роста фибробластов, интерлейкин-8 [214]. Наряду с этим было отмечено снижение экспрессии антиангиогенных цитокинов, таких как интерферон-β и тромбоспондин-1. Эти наблюдения послужили основанием считать, что VEGF, продуцируемый кератиноцитами, является главным ангиогенным фактором в коже [214]. Тем не менее роль Notch-лигандов — Dll4 и Jag-1 в кровоснабжении дермы человека в возрастном аспекте остается неизученной. 1.5.3. Фактор роста соединительной ткани (CTGF) CTGF представляет собой протеин, богатый цистеином, принадлежащий к семейству CCN факторов [57, 61]. Члены семейства CCN сначала были идентифицированы как секретируемые белки, синтез которых индуцировался митогенными факторами роста или онкогенами. Первоначально был описан белок CYR 61 (богатый цистеином белок 61 — CCN1) [108], CTGF (CCN2) [67], NOV (CCN3) [201]. CCN4 (WISP1), CCN5 (WISP2) и CCN6 (WISP3) впоследствии были идентифицированы как Wnt-индуцируемые секретируемые белки [262]. Все вместе они составляют семейство шести гомологичных богатых цистеином белков. CCN белки имеют уникальную модульную структуру [57]. Функция белков семейства CCN в организме позвоночных многообразна. CCN1 и CCN2 играют важную роль в общем развитии, ангиогенезе и клеточной адгезии, в то время как CCN3 имеет решающее значение для развития скелетной и сердечной мускулатуры. CCN4, CCN5 и CCN6 рассматриваются как ингибиторы клеточного 35 роста [239]. Установлено, что они участвуют в процессе регенерации, заживления ран, занимают одно из звеньев в патогенезе фибропролиферативных заболеваний, рака. Протеины семейства CCN способны активировать апоптоз в качестве молекул клеточной адгезии, определять цитотоксичность фактора некроза опухоли-α, участвовать в самообновлении гемопоэтических стволовых клеток [189]. CTGF является так называемым клеточно-внеклеточным протеином. Функциональная особенность таких клеточно-внеклеточных протеинов заключается в том, что они способны связывать структурные компоненты внеклеточного матрикса и факторы роста, цитокины и протеазы. Реализация функции CTGF осуществляется через интегрирование различных веществ, локализующихся во внеклеточном матриксе. Это приводит к формированию биологического ответа клетки. Молекулярная структура CTGF позволяет ему связывать различные факторы роста, такие как VEGF, трансформирующий фактор роста-β, костный морфогенетический протеин-4 [61]. Связывание этих веществ с CTGF приводит к изменению их функциональной активности через трансформирование во взаимодействии с рецепторами. Помимо этого, CTGF связывается с белками внеклеточного матрикса и белками, локализующимися на наружной поверхности клеточной мембраны, такими как интегрины [118], фибронектин [49], синдеканы и перлекан [57, 73]. Интегрирование с этими белками позволяет CTGF участвовать в регуляции взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом, клеточной подвижности, адгезии и сигнализации [224]. Синтез CTGF индуцируется различными факторами роста, гипоксией, биомеханическим растяжением ткани, воздействием ультрафиолетового света [71]. Активация секреции CTGF под действием трансформирующего фактора роста-β опосредована Smad- регуляторным путем [10]. Большинство исследований о функции CTGF в физиологических условиях касались его участия в фиброзировании тканей как основного стимулятора образования экстрацеллюлярного матрикса [224]. Известно, что CTGF избыточно 36 экспрессируется при всех фиброзных состояниях, индуцируя синтез коллагена I типа [45]. И наоборот, потеря фибробластами способности синтезировать CTGF приводит к снижению накопления коллагена и резистентности к внешнему повреждению [51]. Известно, что VEGF индуцирует продукцию CTGF опосредованно KDR и Flt рецепторами и фосфатидил-инозитол-3-киназным путём [256]. Принимая во внимание факт, что CTGF взаимодействует с VEGF, становится очевидным его участие в ангиогенезе. Доказано, что CTGF обладает мощной ангиогенной активностью. Проангиогенный эффект CTGF связан не с прямой стимуляцией клеток, а с регулированием клеточных связей, участвующих в ангиогенезе [61, 159]. CTGF усиливает адгезию, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток и способствует формированию трубчатых структур [70]. CTGF также участвует в построении базальной мембраны эндотелиальных клеток, является посредником во взаимодействии эндотелиальных клеток с перицитами [50]. Имеются данные о способности CTGF привлекать CD34-позитивные стволовые клетки в эндотелий, что приводит к пролиферации эндотелия и неоваскуляризации. Тем не менее установлено, что для некоторых типов тканей CTGF не оказывает влияния на образование новых сосудов и ангиогенез [61]. Таким образом, в современных литературных источниках нет однозначного определения функции CTGF в физиологических условиях. Также не освещены вопросы о его роли в процессе ангиогенеза в дерме на протяжении жизни от эмбрионального периода до старости. 1.5.4. Ангиомотин Ангиомотин представляет собой богатый глутамином протеин с молекулярной массой 72 кДа, который кодируется у человека Amot геном [25, 191]. Первоначально ангиомотин был идентифицирован как ангиостатинсвязывающий белок в клетках эндотелия [172]. Ангиомотин принадлежит к 37 мотин-семейству каркасных белков, которое состоит из трех членов: ангиомотин, Amotl1 и Amotl2 [8, 135]. Известны две изоформы сплайсинга ангиомотина – p80 и p130, которые отличаются по составу N-концевого фрагмента. Изоформа ангиомотина р130 играет роль в определении формы клеток. Она имеет 409 аминокислот на N-концевом участке, что позволяет связываться с актиновыми волокнами [28]. Изоформа р80 в свою очередь повышает миграцию клеток. Ангиомотин локализуется в цитоплазме клетки в свободном состоянии и в виде трансмембранногого протеина [238]. Функциональная активность ангиомотина проявляется через PDZ-связывающий домен, локализующийся в C-терминальном конце молекулы [249]. Установлено, что ангиомотин способствует формированию плотных межклеточных контактов, участвует в миграции, определении полярности клеток эндотелия [43] и позиционируется в качестве фактора, усиливающего ангиогенез [172]. Ангиомотин и другие белки семейства мотинов связаны с эволюционно консервативным сигнальным Hippo путем, который представляет собой один из ключевых компонентов регуляции таких важных процессов, как апоптоз, контактное ингибирование роста клеток, и связанного с ним контроля размеров внутренних органов [102, 135, 259, 268]. Ангиомотин играет определенную роль в патогенезе рака, реализуя свои эффекты через консервативный путь сигнализации Hippo [26, 27, 136]. На наружной поверхности клетки имеется ангиостатин-связывающий домен, который способен взаимодействовать с ангиомотином. На лабораторных животных установлено, что в ишемизированной конечности Tsk-/+ мышей происходит снижение экспрессии ангиомотина и повышение экспрессии ангиостатина. Такой сдвиг равновесия между проангиогенными и антиангиогенными белками приводил к нарушению формирования новых коллатеральных сосудов [251]. Позитивное окрашивание на ангиомотин было описано в эндотелиальных, соединительнотканных, мышечных клетках [43]. Также его идентифицировали в 38 плаценте человека, а именно в крупных сосудах, капиллярах и в цитотрофобласте [24]. Тем не менее остается практически не изученным вопрос о локализации ангиомотина в структурах дермы человека. В литературных источниках нет данных о возрастных особенностях ангиогенного протеина, не определены соотношения уровня ангиомотина с количеством кровеносных сосудов и фибробластов в дерме. 1.5.5. Эндостатин Эндостатин представляет собой богатый остатками аргинина протеин с молекулярной массой 20 кДа, который является С-концевым фрагментом коллагена XVIII типа. Наряду с перлеканом и агрином коллаген XVIII типа у человека представляет собой один из основных протеогликанов базальных мембран и прилегающей к ним соединительной ткани. Эндостатин был впервые выделен из кондиционированной культуральной среды неметастатических клеток мышиной гемангиоэндотелиомы линии EOMA [7, 95]. Эндостатин имеет компактную глобулярную кристаллическую структуру, содержащую две дисульфидные связи. Он связывает один атом цинка с помощью трех N-концевых гистидиновых остатков. Образование эндостатина из коллагена XVIII типа катализируется протеолитическими ферментами, в том числе катепсином L и матриксными металлопротеиназами, которые расщепляют пептидные связи на уровне С-концевого домена. Таким образом, процесс образования эндостатина из коллагена рассматривается как один из местных механизмов регуляции ангиогенеза [65]. В качестве рецепторов эндостатина описаны нуклеолин и α5β1 интегрин [186]. Связывание эндостатина с α5β1 интегрином на поверхности эндотелиоцитов приводит к снижению интегрин-зависимой клеточной миграции. Антиангиогенное действие эндостатина также связано с ингибированием матриксной металлопротеиназой-2. Это приводит к нарушению инвазии вновь образованных клеток сосудов в матрикс соединительной ткани [168]. 39 Хорошо изучена функция эндостатина в организме человека [184, 206, 219]. Показано, что он ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток, ангиогенез и рост опухолей. Тем не менее остается много нерешенных вопросов в области молекулярного механизма действия эндостатина [94, 101]. На клеточной культуре пупочной вены человека показано, что эндостатин способен блокировать передачу сигнала по пути VEGF, взаимодействуя с рецептором VEGFR-2 эндотелиоцитов. Однако непосредственно с VEGF эндостатин не связывается [96]. Эндостатин является одним из ингибиторов киназы трансактиватора c-Jun (JNK), индуцируемой фактором некроза опухоли-α. Это взаимодействие приводит к подавлению экспрессии проангиогенных генов, контролируемых JNK [97]. Имеются работы, указывающие, что результат воздействия эндостатина (про - или антиангиогенный) определяется концентрацией белка и типом эндотелиальных клеток - мишеней. Так, клетки линии HUVEC представлены зрелыми эндотелиоцитами, а клетки линии eESC имеют эмбриональный фенотип. Эндостатин только в малой концентрации (50 нг/мл) оказывал проангиогенный эффект на эмбриональные эндотелиоциты. В то же время подобный эффект на зрелые клетки не распространялся [144]. Опубликованы сообщения о том, что эндостатин обладает АТФ-азной активностью, которая предположительно лежит в основе антиангиогенного действия на опухолевые клетки. Эндостатин с высоким содержанием АТФ-азы оказывает ингибирующее действие на пролиферацию, миграцию эндотелиальных клеток, а также формирование сосудистых трубочек [98]. Существует мнение, что антиангиогенный потенциал эндостатина обусловлен активацией околоклеточного протеолиза [261]. На модели канцерогенеза кожи мышей показано, что эндостатин может ингибировать опухолевый ангиогенез через VEGF-C сигнальный путь, снижая миграцию тучных клеток [96]. В дополнение к антиангиогенному эффекту недавние исследования на модели острого миокарда у крыс показали, что эндостатин подавляет аномальное ремоделирование тканей и рубцов [265]. Пептиды, выделенные из эндостатина, обладают сильным 40 антифиброзивным потенциалом. Отмечено подавление фиброза, вызванного воздействием трансформирующего фактора роста-β и блеомицином в коже человека и лабораторных мышей in vivo и in vitro в присутствии пептида Е4, полученного из эндостатина [264]. В лабораторных условиях на модели кожной раны уха кролика показано, что ингибирование ангиогенеза с помощью эндостатина приводит к лучшему заживлению раны и препятствует формированию гипертрофического рубца [100]. Однако, несмотря на хорошую изученность роли эндостатина в опухолевом ангиогенезе, фибропролиферативных заболеваниях, локализация его в структурах дермы человека, возрастные особенности распределения этого протеина и корреляция этих изменений с количеством кровеносных сосудов и фибробластов в дерме в настоящее время абсолютно не изучены. 1.6. Иммуногистохимические маркеры клеточной пролиферации 1.6.1. Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) PCNA представляет собой вспомогательный протеин с молекулярной массой 36 кДа, участвующий в репликации и репарации ДНК, контроле клеточного цикла [233]. Пролиферация – это новобразование клеток и внутриклеточных структур, лежащее в основе роста и дифференцировки тканей. Пролиферация осуществляется делением клетки за счет митоза. Исследование пролиферативной активности клеток является актуальной проблемой. В связи с этим существует множество способов для ее выявления: прямой подсчет митозов в препаратах, окрашенных гематоксилином, оценка сигналов нуклеотид, меченных в ДНК, проточная цитофлуометрия с определением клеток, находящихся в S-фазе [215]. Но наиболее достоверной методикой считается иммуногистохимическое определение моноклональных антител, специфичных к 41 антигенам определенной фазы клеточного цикла [105]. С этой точки зрения широко изучается PCNA, который, наряду с белком Ki-67, является самым распространенным маркером клеточной пролиферации. PCNA стимулирует активность ДНК-полимеразы-δ, тем самым повышает ее процессивность, выступая в качестве платформы, которая скользит вдоль ДНК матрицы [19]. Кроме ДНК-полимеразы-δ PCNA ассоциируется со множеством других белков, либо непосредственно участвуя в репликации и репарации ДНК, либо регулируя эти процессы [232]. PCNA взаимодействует с белками через специфический PCNA-связывающий белок (PIP), состоящий из восьми аминокислот. Из всех известных PIP белков р21 имеет высокое сродство к PCNA, ингибируя репликацию ДНК и клеточный рост [157]. Максимальная экспрессия PCNA достигается во время S-фазы клеточного цикла, когда формируется комплекс с ингибитором p21 [62, 85, 190, 200, 228]. 1.7. Иммуногистохимические маркеры кровеносных сосудов 1.7.1. CD31 CD31, или адгезионная молекула-1 тромбоцитов и эндотелия, представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 130 кДа, является структурной составляющей межклеточных адгезионных контактов эндотелиальных клеток [36]. Молекула моноцитов, тромбоцитов, CD31 регулирует проницаемость подавляет подвижность сосудистой выработку стенки, цитокинов, нейтрофилов, хемотаксис ингибирует активацию стимулирует образование простациклинов сосудистой стенкой [18]. CD31 выступает в качестве ключевого фактора, регулирующего барьерную функцию сосудов [197]. CD31 в больших количествах экспрессируется в эндотелиальных клетках. Также небольшие уровни CD31 определяются на поверхности неэритроидных клеток кровеносной 42 системы — тромбоцитов, моноцитов, нейтрофилов и лимфоцитов [175]. Стволовые клетки костного мозга и трансформированные клеточные линии миелоидных клеток и мегакариоцитов также экспрессируют CD31. Было установлено, что CD31 участвует в воспалительных процессах, способствует взаимодействию лейкоцитов с эндотелиальными клетками. Миграция лейкоцитов в очаг воспаления осуществляется в три этапа, CD31 контролирует один из них, а именно прохождение лейкоцитов через межклеточные переходы эндотелиальных клеток сосудов [263]. Молекулы CD31 способны взаимодействовать между собой (гомофильное связывание), а также с другими молекулами (гетерофильное связывание). CD31 рассматривается как ранний маркер опухолевого ангиогенеза [37]. Также CD31 играет определенную роль в эмбриональном ангиогенезе, формировании метастазов литературных данных [188]. Таким позволяет образом, считать комплекс CD31 имеющихся специфическим иммуногистохимическим маркером кровеносных сосудов. Таким образом, проанализировав современные литературные источники, мы пришли к выводу, что: 1. В современной практической медицине не существует универсальных методов, способных предотвратить старение кожи. Это связано с отсутствием данных об особенностях морфологических изменений, происходящих в коже в процессе хронологического старения, начиная с эмбрионального периода и до старости. 2. В современной научной литературе недостаточно освещены вопросы о пролиферативной активности фибробластов дермы, а также их количественном изменении в онтогенезе. 3. В литературе мало сведений о сосудистом обеспечении дермы в онтогенезе, от фетального периода и до старости. 4. В литературе отсутствуют сведения о содержании регуляторов ангиогенеза – VEGF, Dll4, Jag-1, эндостатина, ангиомотина, CTGF – в кровеносных сосудах дермы человека в онтогенезе. Кроме того, остается 43 неизвестным значение этих веществ в возникновении возрастных изменений в дерме человека. 5. Иммуногистохимическое исследование является наиболее объективной визуализирующей методикой для получения достоверных данных о структурно-функциональных изменениях дермы в онтогенезе. 44 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Характеристика исследуемого материала Объектом исследования служили кусочки кожи нижней части передней поверхности шеи (верхний угол стандартного разреза при аутопсии), полученные при аутопсии плодов человека, умерших от различных причин на сроке 20-40 недель беременности, и людей, умерших от различных причин в возрасте от 1 дня до 85 лет. Отобранные кусочки кожи были без видимых признаков повреждения, воспаления, наличия родимых пятен, рубцов. Проведение исследования одобрено этическим комитетом медицинского факультета Чувашского государственного университета имени И. Н. Ульянова. 2.2. Забор и первичная обработка материала Кусочки кожи размером 1×1 см тотчас после извлечения фиксировали погружением в 10%-й забуференный раствор формалина (pH 7,2-7,4) при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем образцы промывали в проточной воде в течение 24 часов. Следующим этапом мы производили обезвоживание тканей в спиртах возрастающей концентрации (70%-й, 80%-й, 90%-й, 96%-й и 100%-й этиловый спирт) по два часа в каждом. Далее последовательно выдерживали в двух порциях ксилола в течение двух часов при комнатной температуре, затем в смеси из ксилола и парафина в соотношении 1:1 при температуре 37°С в течение двух часов. После этого исследуемые образцы последовательно погружали в две порции чистого расплавленного парафина при температуре 60°С на один час, затем заливали в парафин. Из залитых в парафин 45 тканевых блоков при помощи микротома изготавливали поперечные срезы кожи толщиной 5-7 мкм, которые помещали на предметные стекла, предварительно смазанные раствором полилизина. Срезы на предметных стеклах затем подсушивались в термостате при температуре 37°С в течение двух суток. 2.3. Методы исследования Непрямым иммуногистохимическим методом мы определяли антигены, характерные для определенного типа клеток, в частности VEGF, Dll4, Jag-1, ангиомотин, эндостатин, CTGF, PCNA, CD31 в дерме человека. Для исключения погрешностей, которые могли бы возникнуть в случае даже минимальных отклонений при проведении иммуногистохимической реакции, нами были учтены многие исходные параметры. Мы учитывали температуру воздуха в лабораторном помещении, так как от нее напрямую зависит температура всех используемых растворов. Все препараты по этапам иммуногистохимической реакции проводили одномоментно за один раз. Для всех препаратов использовали одни и те же буферные растворы, инкубационные смеси. В связи с одновременным проведением большого количества срезов это представляло определенную техническую трудность. После завершения основного протокола постановки иммуногистохимических реакций проводили окрашивание срезов гематоксилином. Мы также производили окраску препаратов гематоксилином и эозином для последующего анализа фибробластов в дерме. 2.4. Выявление Dll4 Dll4 выявляли с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. На первом этапе мы проводили регидратацию. Подготовленные срезы 46 помещали последовательно в ксилол, 100%-й спирт и 96%-й спирт, дистиллированную воду по пять минут в каждом растворе при комнатной температуре. Следующим этапом проводили инактивацию эндогенной пероксидазы. Это достигали помещением препаратов в 0,1%-й раствор перекиси водорода на 10 минут. Далее срезы промывали, помещая последовательно (по пять минут в каждой) в дистиллированную воду и три порции 0,05 М трис-буфера с добавлением 0,15 М натрия хлорида (TBS) с рН 7,2-7,6. Затем следовала инкубация в растворе первых кроличьих антител против Dll4 (AHP1274, AbDSerotec, Великобритания). Антитела разводили на TBS с добавлением 0,1%ого тритона Х-100, в соотношении 1:100. Инкубация продолжалась в течение 12 часов при комнатной температуре. На следующем этапе промывали препараты в трех порциях TBS по 20 минут в каждой. Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). На следующем этапе промывали срезы тремя порциями TBS по 20 минут в каждой. Для проведения гистохимической реакции на пероксидазу использовали 3,3-диаминобензидин (SigmaChemical, США). Первоначально мы изготавливали инкубационный раствор, включающий в себя 100 мг имидазола,50 мг 3,3-диаминобензидина и 200 мл TBS с рН 7,4. Раствор профильтровывали, затем добавляли 25 мкл 33%-ого раствора перекиси водорода и тщательно перемешивали. В приготовленный раствор помещали исследуемые препараты на 10 минут при комнатной температуре. Результатом данной процедуры было окрашивание продукта реакции в коричневый цвет. На заключительном этапе проводили докрашивание клеточных ядер гематоксилином. В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов. После предварительной подготовки срезов и иннактивации эндогенной пероксидазы мы также промывали срезы в трех порциях раствора TBS с pH 7,2-7,4 по пять минут. Но затем проводили инкубацию в растворе с нормальной кроличьей сывороткой в 47 конечной концентрации 1% в течение 12 часов. Последующие этапы обработки срезов не отличались от иммуногистохимического окрашивания. При использовании данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания. 2.5. Выявление Jag-1 Jag-1 выявляли с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения Jag-1 в дерме в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против Jag-1 (NBP1-90208, NovusBiologicalsInc., США) в разведении 1:100. Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления Jag-1 были идентичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет. В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания. 2.6. Выявление VEGF VEGF выявляли непрямым иммуногистохимическим методом [126]. Для обнаружения VEGF в дерме в качестве первых антител использовали кроличьи антитела против VEGF (NBP1 -22844, NovusBiologicalsInc., США). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления VEGF были такими же, как при 48 выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет. В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания. 2.7. Выявление ангиомотина Ангиомотин выявляли при помощи непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения ангиомотин-позитивных структур дермы в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против ангиомотина (ab85143, Abcam, США). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления ангиомотина были такими же, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет. В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания. 2.8. Выявление эндостатина Выявление эндостатина производили с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения эндостатина в дерме в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против эндостатина (ab53702, Abcam, США). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, 49 DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления эндостатина были такими же, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет. В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания. 2.9 . Выявление CD31 CD31-иммунопозитивные кровеносные сосуды выявляли с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения CD31позитивных сосудов в дерме в качестве первых антител мы использовали мышиные моноклональные антитела против CD31 (M 0823, DakoCytomation, Дания). В качестве вторых антител использовали антимышиную EnVision систему, конъюгированную с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления CD31 были аналогичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет. В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания. 2.10. Выявление CTGF CTGF выявляли непрямым иммуногистохимическим методом [126]. Для обнаружения CTGF в качестве первых антител использовали поликлональные 50 кроличьи антитела против CTGF (AHP 1278, AbDSerotec, Великобритания). Визуализацию антигенов конъюгированной с проводили пероксидазой с (K помощью 4002, системы EnVision, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления были идентичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет. В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания. 2.11. Выявление PCNA PCNA выявляли непрямым иммуногистохимическим методом [126]. Для обнаружения PCNA-позитивных клеток дермы в качестве первых антител использовали кроличьи антитела против PCNA (AHP1419, AbDSerotec, Великобритания). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления были аналогичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет. В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания. 51 2.12. Выявление фибробластов в дерме Визуализацию фибробластов проводили в препаратах, окрашенных гематокислином и эозином, а также в срезах с иммуногистохимическими реакциями, где ядра докрашивались гематоксилином. После завершающего этапа иммуногистохимической реакции (реакция выявления эндогенной пероксидазы) предметные стекла со срезами промывали в дистиллированной воде в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее препараты погружали в предварительно профильтрованный раствор гематоксилина на семь минут при комнатной температуре. Затем все стекла промывали в дистиллированной воде при постоянном помешивании в течение одной минуты. Затем проводили обезвоживание в спиртах восходящей концентрации и после просветления в ксилоле срезы заключали в канадский бальзам. В результате окраски гематоксилином ядра клеток приобретают характерный сине-фиолетовый цвет. Для фибробластов характерна своеобразная морфология. Они выглядят как клетки с маленьким объемом цитоплазмы и веретенообразным или вытянутым угловатым ядром. 2.13. Количественная оценка результатов Количественную оценку результатов исследования проводили с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений, включающей в себя световой микроскоп Olympus CX-21, цифровую камеру Olympus Camedia 4040z, персональный компьютер и программу SigmaScanPro 5.0 (SPSS Inc., США). Используя световой микроскоп, находили участки дермы без волосяных фолликулов, которые фотографировали при увеличении объектива 40х [91]. Затем полученные фотографии переносили на компьютер и оценивали интенсивность окрашивания VEGF, Dll4, Jag-1, ангиомотина, эндостатина в кровеносных сосудах в трех - пяти случайно выбранных полях зрения в каждом срезе. Интенсивность 52 окраски определяли вслепую без исходных данных о возрасте и половой принадлежности субъекта, у которого был взят кусочек кожи для исследования. Интенсивность окрашивания квалифицировали по четырём степеням: без окрашивания, со слабым окрашиванием, со средним окрашиванием и с сильным окрашиванием [14, 216]. Затем данные по интенсивности окрашивания сопоставляли с возрастом и половой принадлежностью и рассчитывали процент случаев с каждой степенью окрашивания в каждой возрастной группе. Для определения числа кровеносных сосудов дермы с положительной окраской эндотелия на антиген CD31, количества фибробластов с положительной окраской на PCNA и общего числа фибробластов, фибробластов и сосудов с положительной окраской на CTGF вычисляли площадь сфотографированных участков и подсчитывали количество сосудов или соответствующих клеток в них [5, 14]. Как минимум 10 случайно выбранных срезов фотографировались у каждого человека и три - пять полей зрения были сфотографированы в каждом срезе. 2.14. Статистическая обработка результатов Все случаи мы группировали по возрастному принципу: Группа 1 — плоды на сроке беременности 20-40 недель. Группа 2— люди в возрасте от 1 дня до 20 лет. Группа 3 — люди в возрасте 21-40 лет. Группа 4 — люди в возрасте 41-60 лет. Группа 5 — люди в возрасте 61-80 лет. Для определения Dll4 исследовали 150 кусочков кожи (72 женщины и 78 мужчин): группа 1 – 24 случая, группа 2 – 41 случай, группа 3 – 33 случая, группа 4–25 случаев, группа 5 – 27 случаев. Для выявления Jag-1 использовали 120 кусочков кожи (58 женщин и 62 мужчины): группа 1 – 21 случай, группа 2 – 25 случаев, группа 3 – 21 случай, группа 4 – 25 случаев, группа 5 – 28 случаев. 53 Для выявления VEGF использовали 128 кусочков кожи (59 женщин и 69 мужчин): группа 1 – 21 случай, группа 2 –31 случай, группа 3 – 26 случаев, группа 4 – 24 случая, группа 5 – 26 случаев. Для исследования ангиомотина было использовано 115 кусочков кожи (57 женщин и 58 мужчин): группа 1 –22 случая, группа 2 – 26 случаев, группа 3 – 19 случаев, группа 4 – 21 случай, группа 5 – 27 случаев. Для исследования экспрессии эндостатина было использовано 99 кусочков кожи (46 женщин и 53 мужчины): группа 1 – 17 случаев, группа 2 – 23 случая, группа 3 – 16 случаев, группа 4 – 20 случаев, группа 5 – 24 случая. Для исследования CTGF было использовано 97 кусочков кожи (47 женщин и 50 мужчин): группа 1 – 18 случаев, группа 2 – 21 случая, группа 3 – 17 случаев, группа 4 – 19 случаев, группа 5 – 22 случая Для определения числа PCNA положительных клеток было изучено 139 кусочков кожи (104 мужчины и 35 женщин): группа 1– 25 случаев, группа 2 – 33 случая, группа 3 – 40 случаев, группа 4 – 26 случаев, группа 5– 15 случаев. Для исследования CD31-позитивных кровеносных сосудов было использовано 94 кусочка кожи (60 мужчин и 34 женщины): группа 1 – 23 случая, группа 2– 14 случаев, группа 3 – 24 случая, группа 4 – 15 случаев, группа 5 – 18 случаев. Для подсчета числа фибробластов было исследовано 357 кусочков кожи (218 мужчин и 139 женщин): группа 1 – 57 случаев, группа 2 – 55 случаев, группа 3 – 99 случаев, группа 4 – 84 случая, группа 5 – 64 случая. Достоверность изменений интенсивности окрашивания сосудов на Dll4, Jag1, VEGF, ангиомотин и эндостатин оценивали с помощью непараметрического критерия χ2. По каждой группе данных для CTGF, CD31, PCNA и фибробластов рассчитывались средние арифметические величины (М) и их стандартные ошибки (m). Достоверность влияния возраста или пола на исследуемые параметры кожи оценивалась с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Взаимосвязи между возрастом и параметрами кожи оценивались с применением 54 непараметрического рангового корреляционного анализа Спирмена. Корреляционный анализ проводился без разделения данных на возрастные группы. Достоверными считали отличия при р< 0,05. 55 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Исследование VEGF в дерме в различные возрастные периоды В коже человека, окрашенной на VEGF, мы выявили VEGF-позитивные сосуды по всей толщине дермы у плодов и лиц во всех возрастных периодах от 0 до 85 лет. Положительно окрашивались на VEGF преимущественно эндотелиальные клетки, а другие компоненты сосудистой стенки не были окрашены. Анализ степени окрашивания сосудов проводили во всех сосудах дермы без разделения на типы. Ввиду того, что у плодов и людей в возрасте старше 60 лет стирается граница между сосочковым и сетчатым слоями дермы, анализ интенсивности окрашивания сосудов на VEGF выполняли во всей толщине дермы без разделения на слои. Для исследования VEGF было использовано 128 кусочков кожи человека: 59 кусочков кожи от лиц женского пола и 69 кусочков от лиц мужского пола. В антенатальном периоде (группа 1) нами был проанализирован 21 образец кожи плодов: 12 образцов от плодов женского пола и 9 – от плодов мужского пола. Исследование показало, что у плодов преобладали случаи с не окрашенными на VEGF сосудами дермы, что составило 42,86%. Доля случаев со слабой иммунореактивностью сосудов дермы на VEGF составила 33,33% (рисунок 1, А). Количество случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на VEGF составило 19,05% (рисунок 1, Б). В антенатальном периоде доля случаев с сильной интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF была незначительна и составила 4,76% (рисунок 1, В). 56 А Б В Рисунок 1 – Кровеносные сосуды со слабой (А), средней (Б) и сильной (В) степенью окрашивания на VEGF в дерме плодов 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х В группе 2 (0-20 лет) мы исследовали 31 препарат кожи человека: 14 препаратов от лиц женского пола и 17 препаратов от лиц мужского пола. В данном возрастном периоде доля случаев с не окрашенными на VEGF сосудами дермы составила 29,03%. Количество случаев со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов дермы на VEGF равнялось 35,48% (рисунок 2, А). Доля случаев со средней степенью окрашивания сосудов дермы на VEGF составила 22,58%. Сильная иммунореактивность сосудов на VEGF в данной группе выявлена в 12,9% случаев (рисунок 2, Б). 57 Таким образом, в возрасте от 0 до 20 лет преобладали случаи со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на VEGF. А Б Рисунок 2 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на VEGF в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х При сравнении группы 1 (плоды на сроке беременности 20-40 недель) и группы 2 (0-20 лет) мы выявили уменьшение доли случаев с не окрашенными на VEGF сосудами дермы в постнатальном периоде. Количество случаев со слабой и средней иммунореактивностью сосудов на VEGF было практически идентично в обеих группах. В возрасте от 0 до 20 лет отмечается увеличение в 3 раза доли случаев с сильной интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF по сравнению с кожей плодов (рисунок 3). Отличия между группами 1 и 2 оценены статистически с помощью критерия χ2. Они оказались достоверными (р<0,001) по критерию χ2. Процент случаев 58 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20-40 недель беременности 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет нет окрашивания слабое окрашивание среднее окрашивание сильное окрашивание 61-85 лет Рисунок 3 – Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на VEGF в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 1 и 2 – p<0,001; между группами 2 и 3 – p<0,01. Отличия между группами 3 и 4, группами 4 и 5 недостоверны (критерий χ2) А Б Рисунок 4 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на VEGF в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х 59 В возрастном периоде от 21 до 40 лет мы исследовали 26 кусочков кожи: 7 кусочков кожи от лиц женского пола и 19 кусочков от лиц мужского пола. В группе 3 доля случаев с не окрашенными на VEGF микрососудами дермы составила 19,23%. Количество случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF составило 30,77% (см. рисунок 4, А). Доля случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF равнялась 34,62%. В возрасте от 21 до 40 лет сильная иммунореактивность сосудов на VEGF выявлена в 15,38% случаев (см. рисунок 4, Б). При сравнении группы 2 (0-20 лет) и группы 3 (21-40 лет) мы наблюдали сохранение тенденции к некоторому уменьшению доли случаев с не окрашенными на VEGF сосудами дермы в старшем возрастном периоде. Доля случаев со слабой и сильной интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF в сравниваемых группах сильно не отличалась. Количество случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF в группе 3 было больше, чем в группе 2, на 34% (см. рисунок 3). При сравнении группы 2 и группы 3 были выявлены достоверные изменения по критерию χ2 (р<0,01). В группе 4 (41-60 лет) мы исследовали 24 препарата кожи человека: 14 препаратов от лиц женского пола и 10 препаратов от лиц мужского пола. В данном возрастном периоде доля случаев с не окрашенными на VEGFсосудами дермы составила 12,5%. Количество случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на VEGF равнялось 29,17% (рисунок 5, А). В возрасте от 41 до 60 лет превалировали случаи со средней иммунореактивностью сосудов на VEGF, что составило 37,5% (рисунок 5, Б). Доля случаев с сильной интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF составила в данной группе 20,83%. Сравнивая группу 3 (21-40 лет) и группу 4 (41-60 лет), мы наблюдали сохранение тенденции к снижению доли случаев с не окрашенными на VEGF сосудами дермы. Доля случаев со слабой иммунореактивностью сосудов на VEGF в сравниваемых группах практически не отличалась. В возрасте от 41 до 60 лет 60 мы отмечали незначительное увеличение доли случаев со средней и сильной иммунореактивностью сосудов дермы на VEGF по сравнению с группой 3 (см. рисунок 3). Однако отличия между группой 3 и группой 4 по критерию χ 2 оказались статистически недостоверными. А Б Рисунок 5 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и средней (Б) степенью окрашивания на VEGF в дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет (4-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х В пятой группе (61-85 лет) мы проанализировали 26 препаратов кожи людей, среди которых 12 препаратов от лиц женского пола и 14 препаратов от лиц мужского пола. В возрасте от 61 до 85 лет мы так же, как и в предыдущие возрастные периоды, обнаружили препараты с не окрашенными на VEGF сосудами. Доля таких случаев составила 7,69%. Количество случаев со слабой иммунореактивностью сосудов на VEGF равнялось 30,77% (рисунок 6, А). В группе 5 превалировали случаи со средней интенсивностью окрашивания сосудов на VEGF, что составило 38,46%. Сильная иммунореактивность сосудов дермы на VEGF выявлена в 23,08% случаев (рисунок 6, Б). Мы проводили сравнение группы 4 (41-60 лет) и группы 5 (61-85 лет). Нами было выявлено уменьшение доли случаев с не окрашенными на VEGF сосудами 61 дермы в группе 5 (61-85 лет) относительно группы 4 (41-60 лет). Что касается случаев со слабой, средней и сильной интенсивностью окрашивания сосудов на VEGF, то достоверных различий по критерию χ2 в сравниваемых группах мы не выявили (см. рисунок 3). А Б Рисунок 6 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на VEGF в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х В исследовании была использована кожа плодов и людей мужского и женского пола. Мы провели анализ половых различий для возрастных изменений параметров дермы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не установили достоверного (р<0,05) влияния пола на изменение степени окрашивания на VEGF в кровеносных сосудах дермы. Таким образом, с возрастом мы наблюдали планомерное уменьшение числа случаев с отсутствием окрашивания кровеносных сосудов дермы человека на VEGF на 35,17% и увеличением доли случаев с сильной и средней степенью окрашивания на 18,32% и 19,41% соответственно. Это свидетельствует об 62 увеличении содержания и распределения VEGF в сосудах дермы от 20 недель беременности до 85 лет. 3.2. Исследование Dll4 в сосудах дермы человека в различные возрастные периоды В срезах кожи человека, окрашенных на Dll4, мы выявили Dll4-позитивные сосуды во всей толщине дермы как плодов, так и людей всех исследованных групп от 0 до 85 лет. Положительно окрашивались на Dll4 преимущественно эндотелиальные клетки сосудов, а другие компоненты сосудистой стенки не были окрашены. Анализ степени окрашивания сосудов проводили во всех сосудах дермы без разделения на типы по всей толщине дермы. Для исследования Dll4-позитивных сосудов дермы было использовано 150 кусочков кожи человека: 72 кусочка от лиц женского пола и 78 кусочков от лиц мужского пола. В группе 1 (плоды на сроке 20-40 недель беременности) исследовано 24 препарата: количество препаратов от плодов мужского и женского пола было одинаковым. Исследование показало, что в антенатальном периоде доля случаев, содержащих иммунонегативные на Dll4 кровеносные сосуды дермы, составляет 16,67%. Доля случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4 равнялась 75% (рисунок 7, А). Случаи, имеющие среднюю интенсивность окрашивания кровеносных сосудов на Dll4, составляли 8,33% (рисунок 7, Б). У плодов на сроке 20-40 недель беременности не выявили случаи с сильной интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4. В группе 2 (0-20 лет) исследован 41 образец кожи: 18 образцов кожи от лиц женского пола и 23 образца от лиц мужского пола. Количество случаев с не окрашенными на Dll4 кровеносными сосудами составило 4,88%. Как и в группе 1, в анализируемом возрастном периоде преобладали случаи со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных на Dll4, что составило 56,09% 63 (рисунок 8, А). Количество случаев со средней интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов на Dll4 равнялось 29,27% (рисунок 8, Б). Случаи с сильным окрашиванием кровеносных сосудов на Dll4 в возрасте от 0 до 20 лет составили 9,76%. А Б Рисунок 7 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и средней (Б) степенью окрашивания на Dll4 в дерме плодов человека на сроке 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Dll4. Увеличение 40х При сравнительном анализе группы 1 (20-40 недель беременности) и группы 2 (0-20 лет) было выявлено четырехкратное снижение количества случаев, не окрашенных на Dll4 кровеносных сосудов в группе 2 (рисунок 9). Количество случаев со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов дермы на Dll4 в группе 2 уменьшается незначительно по сравнению с группой 1. В возрастном периоде от 0 до 20 лет мы отметили значительное увеличение доли случаев со средней и сильной интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4 по сравнению с антенатальным периодом (группа 1). Отличия между двумя группами определены с помощью критерия χ2, они оказались статистически достоверными (р<0,01). 64 А Б Рисунок 8 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и средней (Б) степенью окрашивания на Dll4 в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа). Процент случаев Непрямая иммуногистохимическая реакция на Dll4. Увеличение 40х 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет 61-85 лет нет окрашивания слабое окрашивание среднее окрашивание сильное окрашивание Рисунок 9 – Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на Dll4 в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 1 и 2 – p<0,01; между группами 2 и 3 – p<0,01; между группами 3 и 4 – p<0,01 (критерий χ2). Отличия между группами 4 и 5 статистически недостоверны (критерий χ2) 65 В группе 3 (21-40 лет) проанализировано 33 случая: 12 случаев женского пола и 21 случай мужского пола. Количество случаев с не окрашенными на Dll4 кровеносными сосудами составило 3,03%. Случаи со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4 составили 57,58% (рисунок 10, А). Количество случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4 равнялось 36,36%. Доля случаев с сильной иммунореактивностью сосудов на Dll4 составила 3,03% (рисунок 10, Б). Таким образом, в возрастном периоде от 21 до 40 лет превалируют случаи со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4. А Б Рисунок 10 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Dll4 в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Dll4. Увеличение 40х При сравнении двух возрастных периодов 0-20 лет и 21-40 лет выявлено незначительное уменьшение доли случаев с не окрашенными на Dll4 сосудами в группе 3. Количество случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4 в двух анализируемых периодах идентично. В возрасте 21-40 лет нами выявлено сохранение тенденции к увеличению доли случаев со средней интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов. Количество случаев с 66 сильной иммунореактивностью на Dll4 кровеносных сосудов дермы уменьшается в группе 3 (21-40 лет) по сравнению с группой 2 (0-20 лет) практически в три раза (см. рисунок 9). Различия между двумя группами по критерию χ 2 статистически достоверны (р<0,01). В возрастном периоде от 41 до 60 лет (4-я группа) мы исследовали 25 препаратов кожи: 12 препаратов от лиц женского пола и 13 препаратов от лиц мужского пола. В данной группе не выявлены случаи с не окрашенными на Dll4 кровеносными сосудами. Доля случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4 абсолютно преобладала и составила 88% (рисунок 11, А). Средняя интенсивность окрашивания сосудов на Dll4 выявлена в 8% случаев. Количество случаев с сильной иммунореактивностью сосудов на Dll4 составило 4% (рисунок 11, Б). Исследование показало преобладание доли случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4 в группе 4 (41-60 лет). А Б Рисунок 11 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Dll4 в дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет (4-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Dll4. Увеличение 40х 67 Сравнивая группу 3 (21-40 лет) и группу 4 (41-60 лет), мы отметили сохранение тенденции к увеличению доли случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4 (см. рисунок 9). Однако в группе 4 отмечается четырехкратное уменьшение количества случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов по сравнению с группой 3. Количество случаев с сильной иммунореактивностью сосудов на Dll4 в анализируемых возрастных периодах практически идентично. Различия между двумя группами статистически достоверны по критерию χ2 (р<0,01). В группе 5 (61-85 лет) было 27 образцов кожи: 18 образцов от лиц женского пола и 9 от лиц мужского пола. В возрасте 61-85 лет мы не выявили случаи с не окрашенными на Dll4 сосудами. Количество случаев со слабой интенсивностью окрашивания на Dll4 составило 81,48%. Доля случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4 составила 14,81% (рисунок 12, А). Сильная интенсивность окрашивания сосудов на Dll4 нами определена в 3,71% случаев (рисунок 12, Б). А Б Рисунок 12 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Dll4 в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Dll4. Увеличение 40х 68 Таким образом, в возрастном периоде от 61 до 85 лет, как и во всех предыдущих периодах, превалируют случаи со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов. При сравнении группы (41-60 лет) с группой 5 (61-85 лет) отмечается увеличение доли случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов Dll4. Количество случаев с сильной интенсивностью окрашивания сосудов на Dll4 в группе 4 и группе 5 идентично (см. рисунок 9). Результаты исследования продемонстрировали, что содержание Dll4 в кровеносных сосудах дермы увеличивается от 20-40 недель беременности до 20 лет, что проявляется возрастанием числа объектов наблюдения со средней и сильной степенью окрашивания на Dll4 на 20,94% и 9,76% соответственно. С дальнейшим увеличением возраста интенсивность окрашивания кровеносных сосудов на Dll4 снижается, о чем свидетельствует снижение доли исследованных случаев со средней и сильной степенью окрашивания на Dll4 на 14,46% и 6,05% соответственно. В исследовании использовали кусочки кожи плодов мужского и женского пола, мужчин и женщин. Был проведен анализ половых различий для возрастных изменений параметров дермы. Для этого был выполнен однофакторный дисперсионный анализ, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не установили достоверного (р<0,05) влияния пола на изменение степени окрашивания на Dll4 кровеносных сосудов дермы. 3.3. Исследование Jag-1 в дерме человека в различные возрастные периоды В коже человека, окрашенной на Jag-1, мы выявили положительно окрашенные на Jag-1 кровеносные сосуды во всей толщине дермы как плодов, так и людей всех исследованных групп. Оценка степени окрашивания проводилась во 69 всех сосудах дермы без их дифференцировки на артериолы, венулы, капилляры. Нами было выявлено, что в разных возрастных группах количество случаев с разной степенью окрашивания сосудов на Jag-1 было неодинаковым. Для исследования Jag-1 позитивных сосудов дермы было использовано 120 образцов кожи человека: 58 образцов от лиц женского пола и 62 образца от лиц мужского пола. В антенатальном периоде (группа 1) оценен 21 кусочек кожи: 12 кусочков от плодов женского пола и 9 кусочков кожи от плодов мужского пола. Исследование показало, что у плодов преобладали случаи с не окрашенными на Jag-1 кровеносными сосудами дермы, что составило 65,6% (рисунок 13, А). Доля случаев со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов на Jag-1 составила 34,4% (рисунок 13, Б). В антенатальном периоде мы не выявили случаи со средней или сильной интенсивностью окрашивания сосудов на Jag-1. А Б Рисунок 13 – Кровеносные сосуды, не окрашенные на Jag-1 (А) и со слабой (Б) степенью окрашивания на Jag-1 в дерме плодов на сроке 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Jag-1. Увеличение 40х 70 Таким образом, в группе 1 (20-40 недель беременности) преобладали случаи с не окрашенными на Jag-1 сосудами дермы (рисунок 14). 100 90 Процент случаев 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет нет окрашивания слабое окрашивание среднее окрашивание сильное окрашивание 61-85 лет Рисунок 14 – Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на Jag-1 в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 1 и 2 – p<0,01; между группами 2 и 3 – p<0,01; между группами 3 и 4 – p<0,01; между группами 4 и 5 – p<0,05 (критерий χ2) В группе 2 (0-20 лет) проанализировано 25 препаратов кожи: 9 препаратов кожи от лиц женского пола и 16 – от лиц мужского пола. В данном возрастном периоде случаи с не окрашенными на Jag-1 кровеносными сосудами составили 20%. Доля случаев со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов дермы составила 54,2% (рисунок 15, А). Количество случаев со средней степенью окрашивания сосудов на Jag-1 равнялось 25,8% (рисунок 15, Б). В возрастном периоде от 0 до 20 лет мы не выявили случаи с сильным позитивным 71 окрашиванием сосудов на Jag-1. Таким образом, в возрастной группе 0-20 лет преобладали случаи со слабым окрашиванием кровеносных сосудов на Jag-1. А Б Рисунок 15 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и средней (Б) степенью окрашивания на Jag-1 в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Jag-1. Увеличение 40х При сравнении антенатального периода и возрастного периода 0-20 лет, мы выявили снижение доли случаев с не окрашенными на Jag-1 кровеносными сосудами. В группе 2 (0-20 лет) выявили случаи со средней интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов на Jag-1 (см. рисунок 14). Достоверность полученных данных оценена статистически с помощью критерия χ2. При сравнении группы 1 и группы 2 получены статистически достоверные отличия (р<0,01) по критерию χ2. В третьей группе (21-40 лет) был проанализирован 21 образец кожи: 8 образцов от лиц женского пола и 13 – от лиц мужского пола. В данном возрастном периоде доля случаев с не окрашенными на Jag-1 кровеносными сосудами составила 12%. Случаи со слабой иммунореактивностью сосудов на Jag1 в возрасте от 21 до 40 лет составляли 28% (рисунок 16, А). Количество случаев со средней интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов дермы на Jag-1 72 преобладало, что составляло 49,8%. Доля случаев с сильной степенью окрашивания кровеносных сосудов на Jag-1 в данном возрастном периоде была минимальна и составила 10,2% (рисунок 16, Б). А Б Рисунок 16 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Jag-1 в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Jag-1. Увеличение 40х При сравнении случаев группы 2 (0-20 лет) и группы 3 (21-40 лет) мы отметили уменьшение доли случаев со слабой иммунореактивностью сосудов на Jag-1 в возрастном периоде 21-40 лет и увеличение в два раза количества случаев со средней интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов на Jag-1 (см. рисунок 14). Отличия между группами 2 и 3 статистически достоверны по критерию χ2 (р<0,01). В группе 4 (41-60 лет) оценено 25 препаратов кожи: 11 препаратов от лиц женского пола и 14 препаратов от лиц мужского пола. В данном возрастном периоде случаи с не окрашенными на Jag-1 кровеносными сосудами составили 8%. Процент случаев со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов на Jag-1 в группе 4 составил 11,8% (рисунок 17, А). Количество случаев со средней степенью окрашивания кровеносных сосудов на Jag-1 равнялось 73 62,2%. В возрасте от 41 до 60 лет доля случаев с сильной интенсивностью окрашивания сосудов дермы на Jag-1 составила 18% (рисунок 17, Б). А Б Рисунок 17 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Jag-1 в дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет (4-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Jag-1. Увеличение 40х При сравнении группы 3 (21-40 лет) и группы 4 (41-60 лет) нами выявлено снижение в 1,5 раза доли случаев с не окрашенными на Jag-1 сосудами дермы в группе 4. Также в возрастном периоде 41-60 лет выявлено двукратное уменьшение доли случаев со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов на Jag-1 по сравнению с возрастным периодом 21-40 лет. Доля случаев со средней иммунореактивностью сосудов на Jag-1 имеет тенденцию к нарастанию в группе 4 (см. рисунок 14). Полученные результаты группы 4 статистически достоверно отличаются от результатов группы 3 по критерию χ2 (р<0,01). В группе 5 (61-85 лет) проанализировано 28 кусочков кожи человека: 18 кусочков от лиц женского пола и 10 кусочков от лиц мужского пола. В группе 5 случаи с не окрашенными на Jag-1 кровеносными сосудами были минимальны и составляли 2%. Доля случаев со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов на Jag-1 составила 8% (рисунок 18, А). Доля случаев со 74 средней интенсивностью окрашивания сосудов дермы на Jag-1 преобладала и равнялась 68% (рисунок 18, Б). Количество случаев с сильной иммунореактивностью сосудов на Jag-1 в возрасте от 61 до 85 лет составило 22%. А Б Рисунок 18 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и средней (Б) степенью окрашивания на Jag-1 в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Jag-1. Увеличение 40х При сравнительном анализе группы 4 (41-60 лет) и группы 5 (61-85 лет) мы выявили значительное снижение случаев с не окрашенными на Jag-1 кровеносными сосудами дермы в группе 5. В возрасте от 61 до 85 лет отмечается некоторое увеличение доли случаев со средней и сильной интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов дермы по сравнению со случаями из группы 4 (см. рисунок 14). Достоверность отличий оценена с помощью критерия χ2, они также оказались достоверными (p<0,05). В исследовании мы использовали кусочки кожи плодов и людей мужского и женского пола. Поэтому мы провели анализ половых различий для возрастных изменений параметров дермы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора использована половая принадлежность. 75 Результаты этого анализа не установили достоверного (р<0,05) влияния пола на изменение степени окрашивания на Jag-1 в кровеносных сосудах дермы. Таким образом, мы наблюдали возрастное увеличение процента случаев, в которых сосуды дермы имели большую иммунореактивность на Jag-1. Доля исследованных объектов с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на Jag-1 увеличивается от 20 недель беременности до 85 лет на 21,43% и 64,29% соответственно. Это свидетельствует об увеличении содержания и распределения Jag-1 в сосудах дермы от 20 недель беременности до 85 лет. 3.4. Исследование ангиомотина в сосудах дермы в различные возрастные периоды В коже человека, окрашенной на ангиомотин, мы выявили ангиомотинпозитивные структуры. Характерное специфическое коричневое окрашивание цитоплазмы имели клетки эпидермиса, фибробласты дермы, гландулоциты потовых желез и базальные клетки сальных желез. Соединительнотканные волокна дермы в нашем исследовании были иммунонегативны. Кровеносные сосуды с положительной окраской на ангиомотин мы выявляли в коже человека во всех возрастных периодах. Ангиомотин-позитивные структуры в составе оболочки сосудов дермы были представлены преимущественно эндотелиоцитами – клетками выраженной уплощенной формы, которые выстилают просвет кровеносного сосуда. В группе 1 (20-40 недель беременности) проанализировали 22 препарата кожи: 10 препаратов от плодов женского пола и 12 препаратов от плодов мужского пола. У плодов мы встречали небольшое число случаев с ангиомотиннегативными кровеносными сосудами, их количество составляло 4,54%. Доля случаев, в которых кровеносные сосуды имели слабое окрашивание на 76 ангиомотин, была больше и составила 27,27% (рисунок 19, А). Доля случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на ангиомотин преобладала и равнялась 40,91%. В группе 1 сильное окрашивание на ангиомотин сосудов дермы было выявлено в 27,27% случаев (рисунок 19, Б). А Б Рисунок 19 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на ангиомотин в дерме плодов на сроке 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на ангиомотин. Увеличение 40х Таким образом, мы выявили преобладание у плодов (группа 1) случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на ангиомотин (рисунок 20). В группе 2 (0-20 лет) рассмотрели 26 образцов кожи: 11 образцов от лиц женского пола и 15 от лиц мужского пола. Результаты исследования показали, что в группе 2 (0-20 лет) количество случаев с не окрашенными на ангиомотин кровеносными сосудами дермы составило 3,85%. Доля случаев со слабым окрашиванием сосудов дермы на ангиомотин равнялась 23,08%. Случаи со средней интенсивностью окрашивания сосудов на ангиомотин составили 42,31% (рисунок 21, А). Количество случаев с сильной иммунореактивностью кровеносных сосудов на ангиомотин не превышало 30,77% (рисунок 21, Б). 77 100 90 Процент случаев 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет нет окрашивания среднее окрашивание Рисунок 20 – 41-60 лет 61-85 лет слабое окрашивание сильное окрашивание Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на ангиомотин в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 2 и 3 – p<0,01; между группами 4 и 5 – p<0,001 (критерий χ2). Отличия между группами 1 и 2, группами 3 и 4 статистически недостоверны (критерий χ2) В группе 2 (0-20 лет), как и в группе 1 (20-40 недель беременности), отмечается преобладание случаев со средней степенью окрашивания кровеносных сосудов на ангиомотин. Полученные изменения были обработаны статистически с помощью критерия χ2. Однако, при сравнении результатов группы 1 (20-40 недель беременности) и группы 2 (0-20 лет) была выявлена недостоверная разница по интенсивности окрашивания сосудов на ангиомотин по критерию χ2 (см. рисунок 20). 78 А Б Рисунок 21 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на ангиомотин в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на ангиомотин. Увеличение 40х А Б Рисунок 22 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на ангиомотин в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на ангиомотин. Увеличение 40х Для исследования содержания ангиомотина в возрастном периоде от 21 до 40 лет рассмотрели 19 препаратов кожи: 11 препаратов были от лиц женского 79 пола и 9 от лиц мужского пола. В группе 3 (21-40 лет) нами показано, что количество случаев с не окрашенными на ангиомотин кровеносными сосудами было равно 5,26%. Слабую интенсивность окрашивания на ангиомотин имели сосуды в 15,79% случаев. Количество случаев со средней иммунореактивностью сосудов на ангиомотин в возрасте от 21 до 40 лет достигало 57,89% (см. рисунок 22, А). Сильную интенсивность окрашивания сосудов дермы на ангиомотин мы выявили в 21,05% случаев (см. рисунок 22, Б). В группе 3 (21-40 лет), как в группе 1 (20-40 недель беременности) и группе 2 (0-20 лет), мы отмечаем преобладание случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на ангиомотин (см. рисунок 20). По сравнению с группой 2 в группе 3 отмечено увеличение количества случаев с неокрашенными на ангиомотин кровеносными сосудами и случаев со средней степенью окрашивания. Количество случаев со слабо и сильно окрашенными на ангиомотин сосудами имеет тенденцию к снижению в группе 3 (21-40 лет) по сравнению с группой 2 (0-20 лет). Полученные результаты также оценены статистически при помощи критерия χ2, различия между группами оказались достоверными (p<0,01). В возрастном периоде от 41 до 60 лет проанализировали 21 препарат кожи: 9 кусочков кожи от лиц женского пола и 12 кусочков от лиц мужского пола. В группе 4 (41-60 лет) доля случаев с не окрашенными на ангиомотин сосудами составляла всего 4,76%. Слабое окрашивание на ангиомотин сосудов дермы выявлено в 19,05% случаев (рисунок 23, А). Количество случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на ангиомотин составляло 47,62%. Доля случаев с сильно окрашенными на ангиомотин кровеносными сосудами составила 28,57% (рисунок 23, Б). В возрастном периоде от 41 до 60 лет сохраняется выявленное в группах 1-3 преобладание случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на ангиомотин (см. рисунок 20). По сравнению с группой 3 (21-40 лет) в группе 4 (41-60 лет) нами отмечено недостоверное по критерию χ2 увеличение количества случаев со слабым и сильным окрашиванием сосудов на ангиомотин и 80 недостоверное уменьшение количества случаев с неокрашенными и среднеокрашенными на ангиомотин кровеносными сосудами. А Б Рисунок 23 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на ангиомотин в дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет (4-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на ангиомотин. Увеличение 40х В группе 5 (61-85 лет) мы рассмотрели 27 образцов кожи: 16 образцов кожи от лиц женского пола и 11 – мужского. В возрасте от 61 до 85 лет (группа 5) количество случаев с не окрашенными на ангиомотин кровеносными сосудами было выше по сравнению с группами 1-4 и составило 11,11%. Доля случаев со слабым окрашиванием сосудов на ангиомотин равнялась 48,15% (рисунок 24, А). Средняя интенсивность окрашивания кровеносных сосудов дермы на ангиомотин выявлена в 29,63% случаев. Нами было установлено, что в группе 5 (61-85 лет) только 11,11% случаев имело сильное окрашивание кровеносных сосудов дермы на ангиомотин (рисунок 24, Б). При сравнении группы 4 (41-60 лет) с группой 5 (61-85 лет) мы отметили уменьшение количества случаев с негативной, со средней и сильной интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов на ангиомотин в пожилом возрасте (см. рисунок 20). Однако количество случаев со слабой интенсивностью 81 окрашивания на ангиомотин абсолютно превалировало в группе 5 (в возрасте 6185 лет) над группами 1-4. Изменения между группами 4 и 5 статистически достоверны по критерию χ2 (p<0,001). А Б Рисунок 24 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на ангиомотин в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на ангиомотин. Увеличение 40х По результатам проведенного анализа мы выявили, что изменения интенсивности окрашивания кровеносных сосудов в группах 1-4 имели одинаковую тенденцию, а именно превалирование случаев со средней интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов на ангиомотин. В группе 5, объединяющей образцы кожи людей от 61 до 85 лет, наблюдалось общее снижение интенсивности окрашивания кровеносных сосудов дермы на ангиомотин с преобладанием случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на ангиомотин. Таким образом, содержание ангиомотина в кровеносных микрососудах дермы человека снижается от 20 недель беременности до 85 лет жизни, что подтверждается уменьшением доли исследованных объектов с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на 82 ангиомотин от 20 недель беременности до 85 лет на 11,29% и 16,16% соответственно. В исследовании была использована кожа плодов и людей мужского и женского пола. Мы провели анализ половых различий для возрастных изменений параметров дермы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не установили достоверного (р<0,05) влияния пола на изменение степени окрашивания кровеносных сосудов дермы на ангиомотин. 3.5. Исследование эндостатина в сосудах дермы человека в различные возрастные периоды В коже человека, окрашенной на эндостатин, мы выявили эндостатинпозитивные структуры. Положительную окраску на эндостатин в коже человека имели кератиноциты эпидермиса, фибробласты, гландулоциты потовых желез и базальные клетки сальных желез. Кровеносные сосуды с положительной окраской на эндостатин выявлялись в коже человека во всех возрастных группах и имели характерное специфическое коричневое окрашивание преимущественно в эндотелиальных клетках. Для исследования экспрессии эндостатина в сосудах дермы использовали 99 образцов кожи человека, 46 из них были от лиц женского пола и 53 от лиц мужского пола. В группе 1 (20-40 недель беременности) было проанализировано 17 препаратов: 7 препаратов кожи принадлежали женщинам и 10 – мужчинам. Результаты исследования показали, что у плодов (группа 1) доля случаев с не окрашенными на эндостатин сосудами дермы составила 35,29%. Количество случаев со слабым окрашиванием кровеносных сосудов на эндостатин равнялось 41,18%. Количество образцов с кровеносными сосудами, имеющими среднюю и сильную интенсивность окрашивания, составляло по 11,76% (рисунок 25). 83 А Б Рисунок 25 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме плодов 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х Таким образом, было показано, что в группе 1 (20-40 недель беременности) преобладали случаи со слабым окрашиванием на эндостатин (рисунок 26). Для оценки интенсивности окрашивания сосудов дермы на эндостатин в группе 2 (0-20 лет) использовали 23 образца кожи: 10 от лиц женского пола, 13 – мужского. В группе 2 (0-20 лет) количество случаев с не окрашенными на эндостатин сосудами составило 30,43%. Доля случаев, имеющих кровеносные сосуды дермы со слабым окрашиванием на эндостатин, равнялась 43,48%. Доля случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов дермы на эндостатин составила 17,39% (рисунок 27, А). Сильная интенсивность окрашивания сосудов на эндостатин была выявлена в 8,69% случаев (рисунок 27, Б). Процент случаев 84 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет нет окрашивания слабое окрашивание среднее окрашивание сильное окрашивание Рисунок 26 – Интенсивность иммуногистохимического 61-85 лет окрашивания на эндостатин в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Отличия между группами 1 и 2 статистически недостоверны (критерий χ 2). Достоверность отличий между группами 2 и 3 – p<0,001; между группами 3 и 4 – p<0,001; между группами 4 и 5 – p<0,01 (критерий χ2) А Б Рисунок 27 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х 85 Таким образом, в группе 2 (0-20 лет) превалируют случаи со слабой интенсивностью окрашивания микрососудов дермы на эндостатин. При сравнении группы 1 (20-40 недель беременности) и группы 2 (0-20 лет) мы выявили, что случаи с неокрашенными и со слабо окрашенными на эндостатин кровеносными сосудами не имели существенных различий (см. рисунок 26). Исследование показало незначительное увеличение количества случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на эндостатин в группе 2 (0-20 лет) по сравнению с группой 1 (20-40 недель беременности). Нами отмечено незначительное снижение доли случаев с сильной интенсивностью окрашивания сосудов на эндостатин в группе 2 (0-20 лет) по сравнению с группой 1 (20-40 недель беременности). Отличия между группами 1 и 2 оказались статистически недостоверными по критерию χ2. В группе 3 (21-40 лет) рассмотрели 15 препаратов кожи: 6 от лиц женского пола и 9 от лиц мужского пола. В возрасте от 21 до 40 лет количество случаев, содержащих эндостатин-негативные кровеносные сосуды, составило 13,33%. Доля случаев со слабым окрашиванием сосудов на эндостатин составляла 66,67% (рисунок 28, А). Количество случаев, имеющих среднюю интенсивность окрашивания сосудов на эндостатин в данной группе, равнялось 13,33%. Случаи с сильной иммунореактивностью кровеносных сосудов на эндостатин составляли 6,67% (рисунок 28, Б). В возрастном периоде от 21 до 40 лет так же, как в группе 1 и группе 2, преобладали случаи со слабым окрашиванием кровеносных сосудов на эндостатин. Результаты исследования показали (см. рисунок 26) значительное снижение случаев с эндостатин-негативными сосудами дермы и незначительное снижение эндостатин-позитивных случаев со средней и сильной интенсивностью окрашивания в группе 3 (21-40 лет) по сравнению с группой 2 (0-20 лет). Установлено абсолютное превалирование случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на эндостатин в возрасте от 21 до 40 лет. Полученные 86 результаты оценены статистически с помощью критерия χ2. Данные изменения статистически достоверно отличались от результатов для группы 2 (p<0,001). А Б Рисунок 28 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х В возрастном периоде от 41 до 60 лет исследовали 20 препаратов кожи: 9 препаратов от лиц женского пола и 11 от лиц мужского пола. В группе 4 (41-60 лет) доля случаев с не окрашенными на эндостатин кровеносными сосудами составила 10%. Количество случаев со слабо окрашенными кровеносными сосудами на эндостатин равнялось 20% (рисунок 29, А). В данной группе ровно половина препаратов интенсивностью кожи окрашивания (50%) на имела сосуды эндостатин. Доля дермы случаев со средней с сильной иммунореактивностью кровеносных сосудов на эндостатин составила 20% (рисунок 29, Б). В анализируемом возрастном периоде от 41 до 60 лет абсолютно превалировали случаи со средней интенсивностью окрашивания сосудов на эндостатин (см. рисунок 26). 87 А Б Рисунок 29 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет (4-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х При сравнении группы 3 (21-40 лет) с группой 4 (41-60 лет) отмечено незначительное уменьшение количества случаев с эндостатин-негативными сосудами и выраженное снижение доли случаев со слабой интенсивностью окрашивания с 66,66% для группы 3 до 20% для группы 4. Исследование показало абсолютное увеличение количества случаев со средней и сильной степенью окрашиванию кровеносных сосудов на эндостатин в группе 4 (41-60 лет) по сравнению с группой 3 (21-40 лет). Изменения для группы 4 достоверно отличались от группы 3 по критерию χ2 (p<0,001). Для оценки интенсивности экспрессии эндостатина в сосудах дермы в группе 5 (61-85 лет) мы исследовали 24 препарата кожи: 14 препаратов от лиц женского пола и 10 от лиц мужского пола. В группе 5 (61-85 лет) количество случаев, в которых сосуды не имели окрашивания на эндостатин, составило всего 4,17%. Количество случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов дермы было равно 25%. Доля случаев, в которых кровеносные сосуды имели среднюю интенсивность окрашивания на эндостатин, составила 37,5% (рисунок 88 30, А). Случаи с сильной иммунореактивностью кровеносных сосудов на эндостатин составляли 33,33% (рисунок 30, Б). В возрастном периоде от 61 до 85 лет отмечено незначительное преобладание доли случаев со средней степенью окрашивания сосудов на эндостатин (см. рисунок 26). При сравнении двух возрастных периодов от 41 до 60 лет и от 61 до 85 лет мы выявили, значительное уменьшение эндостатин-негативных случаев и случаев со средней интенсивностью окрашивания, незначительное увеличение количества случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на эндостатин в группе 5 (61-80 лет). Отмечено относительное увеличение количества случаев с сильным позитивным окрашиванием сосудов на эндостатин в группе 5 по сравнению с группой 4 – 33,33% и 20% соответственно. Отличия между группами 4 и 5 статистически достоверны по критерию χ2 (p<0,001). А Б Рисунок 30 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х Таким образом, интенсивность окрашивания сосудов дермы на эндостатин в нашем исследовании увеличивалась с возрастом, о чем свидетельствует 89 увеличение доли случаев с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на эндостатин от 20 недель беременности до 85 лет на 25,73% и 21,57% соответственно. Так же, как и на предыдущих этапах исследования, мы использовали кожу плодов и людей мужского и женского пола. В связи с чем был проведен анализ половых различий для возрастных изменений параметров дермы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа также не установили достоверного (р<0,05) влияния пола на изменение степени окрашивания на эндостатин в кровеносных сосудах дермы. 3.6. Кровеносные сосуды дермы человека с позитивным окрашиванием на CD31 в различные возрастные периоды CD31-позитивные кровеносные сосуды в коже человека мы определяли по характерному иммуногистохимическому коричневому окрашиванию. Кровеносные сосуды встречались во всех слоях дермы. Наше исследование показало, что в группе 1 (20-40 недель беременности) в дерме определяются многочисленные кровеносные сосуды (рисунок 31, А). Подсчет численности кровеносных сосудов дермы показал, что на 1 мм2 среза ткани дермы приходится 162,93±7,84 (M±m) CD31-положительный сосуд. В группе 2 (0-20 лет) нами отмечено, что кровеносные сосуды дермы концентрируются непосредственно под эпидермисом, в более глубоких слоях дермы их количество уменьшается (рисунок 31, Б). Эндотелиоциты, выстилающие кровеносные сосуды, имеют цитоплазму темно-коричневого цвета с четким контуром. Подсчеты показали, что в 1 мм2 среза ткани дермы содержится 153,29±14,38 CD31-позитивных кровеносных сосуда. 90 А Б Рисунок 31 – Кровеносные сосуды дермы, позитивные к CD31 в коже плода на сроке беременности 24 недели (А) и человека в возрасте 3-х лет (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на CD31. Увеличение 40х В возрасте от 21 до 40 лет (группа 3) большая часть кровеносных сосудов располагается небольшими скоплениями под эпидермисом. В остальных слоях дермы мы встречали единичные кровеносные сосуды (рисунок 32, А). Цитоплазма эндотелиоцитов также окрашена в темно-коричневый цвет, однако ее контур не всегда выглядит четким. При подсчете кровеносных сосудов, имеющих позитивное окрашивание на CD31, мы выявили, что в 1 мм2 среза ткани дермы содержится 92,85±6,95 подобных сосуда. В следующем возрастном периоде от 41 до 60 лет (группа 4) подсчет количества кровеносных сосудов с позитивным окрашиванием на CD31 показал, что в 1 мм2 среза ткани дермы содержится 84,88±5,44 кровеносных сосуда. В группе 4 мы отметили незначительное снижение количества CD31- положительных кровеносных сосудов в сравнении с группой 3 (21-40 лет). Цитоплазма эндотелиальных клеток сосудов окрашена в темно-коричневый цвет, контур клеток нечеткий. Кровеносные сосуды распределены равномерно преимущественно вдоль эпидермиса (рисунок 32, Б). 91 А Б Рисунок 32 – Кровеносные сосуды дермы, позитивные к CD31 в коже человека в возрасте 30 лет (А) и 58 лет (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на CD31. Увеличение 40х В пятой группе (61-85 лет) подсчет численности кровеносных сосудов показал прогрессивное их уменьшение по сравнению с предыдущими возрастными группами. В данном возрастном периоде кровеносные сосуды сильно увеличивались в размерах и располагались в основном под эпидермисом. В более глубоких слоях дермы кровеносные сосуды встречались редко. Эндотелиоциты имели цитоплазму темно-коричневого цвета с нечетким контуром клеток. Подсчет численности сосудов показал, что в 1 мм2 среза ткани дермы содержится 75,68±5,32 кровеносных сосудов с положительной окраской на CD31. Таким образом, в нашем исследовании мы вывили прогрессивное и неуклонное снижение количества кровеносных сосудов в дерме людей, имеющих позитивное окрашивание против антигена CD31, в зависимости от возраста (рисунок 33). Мы проводили корреляционный анализ между изменениями возраста и числа кровеносных сосудов в дерме, он показал наличие отрицательной достоверной взаимосвязи (r=-0,68; p<0,01). Корреляционный анализ выявил достоверную отрицательную взаимосвязь между изменениями общего числа 92 кровеносных сосудов и сосудов с положительной окраской на CTGF (r= -0,47; p<0,01). Количество CD31-позитивных сосудов дермы на 1 мм2 среза дермы 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 20-40 недель беременности 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет 61-85 лет Рисунок 33 – Численность CD31-позитивных кровеносных сосудов в дерме людей различного возраста (М±m). p<0,001 – однофакторный дисперсионный анализ В нашем исследовании мы использовали кусочки кожи, полученные от плодов мужского и женского пола, мужчин и женщин. Значение половой принадлежности в возрастных изменениях численности CD31-позитивных кровеносных сосудов в дерме было выполнено с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не выявили достоверного (р<0,05) влияния пола на изменения числа CD31-позитивных кровеносных сосудов в дерме. 93 3.7. Фибробласты дермы в различные возрастные периоды Фибробласты дермы мы определяли морфологически. Известно, что фибробласты представляют собой клетки с маленьким объемом цитоплазмы и веретенообразным или вытянутым угловатым ядром. Исследование показало, что у плодов на сроке беременности 20-40 недель (группа 1) дерма насыщена многочисленными фибробластами, которые располагаются преимущественно под эпидермисом. В более глубоких слоях – в сетчатом и сосочковом слое – мы отмечали разреженное распределение фибробластов (рисунок 34, А). Подсчет численности фибробластов показал, что в 1 мм2 среза ткани дермы человека содержится 6030,254 ± 334,3573 клеток (рисунок 35). Однако необходимо отметить, что приведенные данные подсчетов являются средней величиной между количеством клеток в сосочковом и сетчатом слоях, так как анализ мы осуществляли без разделения дермы на слои. А Б Рисунок 34 – Фибробласты дермы плода на 24-й неделе беременности (А) и человека в возрасте 20 лет (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 40х 94 В группе 2, объединяющей образцы кожи людей в возрасте от 0 до 20 лет, мы отметили значительное уменьшение количества фибробластов дермы по сравнению с предыдущим периодом. Подсчет численности фибробластов показал, что в 1 мм2 среза ткани дермы человека содержится 3831,659 ± 229,0286 клеток. В данном возрастном периоде фибробласты располагаются менее компактно, в дерме становится больше межклеточного вещества (см. рисунок 34, Б). В возрастном периоде от 21 до 40 лет (группа 3) мы отметили продолжающееся планомерное снижение численности фибробластов дермы. Подсчет показал, что в 1 мм2 среза ткани дермы человека содержится 2394,583 ± 75,35607 клеток. В группе 3 (21-40 лет) фибробласты располагаются в дерме равномерно, небольшими группами среди большого количества межклеточного вещества (рисунок 36, А). Количество фибробластов дермы на 1 мм2 среза ткани 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет 61-85 лет Рисунок 35 – Численность фибробластов в дерме людей различного возраста (М±m). p<0,001 – однофакторный дисперсионный анализ В группе 4 (41-60 лет) фибробласты так же, как в группе 3 (21-40 лет), располагаются равномерно в обоих слоях дермы. Мы отметили незначительное снижение численности клеток в дерме и увеличение содержания межклеточного вещества (рисунок 36, Б). В возрасте от 41 до 60 лет выявлено изменение 95 морфологии фибробластов: их ядра уменьшаются в размерах и приобретают угловатую форму. Подсчет численности фибробластов показал, что на 1 мм2 среза ткани дермы приходится 2296,726 ± 72,13885 клеток. А Б В Рисунок 36 – Фибробласты дермы человека в возрасте 28 лет (А), 55 лет (Б), 78 лет (В). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 40х В возрасте от 61 до 85 лет (группа 5) подсчет численности фибробластов показал, что на 1 мм2 среза ткани дермы содержится 2103,689 ± 61,65836 клеток. Клетки располагаются компактно под эпидермисом и рядом с сосудами дермы. В глубоких слоях количество фибробластов значительно уменьшается, а в непосредственной близости к гиподерме они практически отсутствуют (см. рисунок 36, В). В то время как количество межклеточного вещества по мере приближения к гиподерме увеличивается. Изменяется и морфология 96 фибробластов: ядра становятся меньшего размера и приобретают еще более угловатую форму. Таким образом, в исследовании мы выявили постепенное и планомерное снижение численности фибробластов в дерме с увеличением возраста (см. рисунок 35). Наиболее значительное снижение числа фибробластов отмечено на протяжении от пренатального периода до 11-20 лет. В последующих возрастных группах практически не наблюдалось дальнейшего уменьшения числа фибробластов в дерме. Мы проводили корреляционный анализ между изменениями возраста и количества фибробластов в дерме человека. Он показал наличие достоверной высокой отрицательной взаимосвязи (r=-0,61; p<0,05). Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния возраста на численность фибробластов в дерме (p<0,001). В исследовании мы использовали образцы кожи, полученные от плодов мужского и женского пола, мужчин и женщин. Роль половой принадлежности в возрастных изменениях численности фибробластов в дерме мы оценили с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не выявили достоверного (р<0,05) влияния пола на изменения общего числа фибробластов в дерме. 3.8. Исследование CTGF в фибробластах и сосудах дермы человека в различные возрастные периоды В исследовании в коже человека во все возрастные периоды мы выявили фибробласты и кровеносные сосуды, имеющие положительную окраску на CTGF. Для исследования экспрессии CTGF в сосудах и фибробластах дермы использовали 97 кусочков кожи (47 женщин и 50 мужчин). 97 Мы проводили подсчет процента фибробластов, имеющих положительное окрашивание на CTGF по отношению к общему числу фибробластов. Исследование показало, что в группе 1 (20-40 недель беременности) 73,94±4,95% (M±m) фибробластов дермы имели положительную окраску на CTGF (рисунок 37). Процент фибробластов 100 80 60 40 20 0 20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет 61-85 лет Рисунок 37 – Процент фибробластов дермы с положительным окрашиванием на CTGF (М±m). p<0,001 – однофакторный дисперсионный анализ Фибробласты с позитивным окрашиванием на CTGF встречаются во всех слоях дермы, распределены практически равномерно (рисунок 38, А). В возрастном периоде от 0 до 20 лет (группа 2) мы отметили незначительное увеличение процента иммуно-позитивных фибробластов к CTGF по сравнению с группой 1, что составило 85,12±4,71% (см. рисунок 37). Фибробласты, позитивные к CTGF, в возрасте от 0 до 20 лет встречались во всех слоях дермы, но преимущественно под эпидермисом. Они имели цитоплазму светло-коричневого цвета и вытянутое ядро (рисунок 38, Б). В группе 3 (21-40 лет) процент фибробластов с положительной окраской на CTGF составил 90,42±3,24% (см. рисунок 37). 98 А Б Рисунок 38 – CТGF-положительные фибробласты и кровеносные сосуды дермы плода на 28-й неделе беременности (А) и человека в возрасте 1 год (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на CTGF. Увеличение 40х В возрастном периоде от 41 до 60 лет (группа 4) было выявлено 93,06±2,07% фибробластов с позитивным окрашиванием на CTGF (см. рисунок 37). В коже людей группы 4 (41-60 лет) мы отметили, что происходит изменение морфологии фибробластов. Они увеличиваются в размерах, их цитоплазма приобретает более интенсивное коричневое окрашивание, а ядра угловатую форму (рисунок 39, А; рисунок 41, Б). В группе 5, объединяющей образцы кожи людей в возрастном периоде от 61 до 85 лет, процент фибробластов с положительной окраской на CTGF составил 91,37±1,62% (см. рисунок 37). В коже людей пожилого возраста CTGFпозитивные фибробласты встречались во всех слоях дермы, распределяясь практически равномерно. Клетки имели четкий контур с темно-коричневым цветом цитоплазмы (рисунок 39, Б). Таким образом, в коже человека от 20 недель беременности до 85 лет мы наблюдали увеличение процента фибробластов дермы, имеющих положительную окраску на CTGF на 17,43%. 99 А Б Рисунок 39 – CTGF-положительные фибробласты и кровеносные сосуды дермы человека в возрасте 50 лет (А) и 76 лет (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на CTGF. Увеличение 40х Корреляционный анализ между изменениями общего числа фибробластов и фибробластов с положительной окраской на CTGF показал наличие достоверной высокой отрицательной взаимосвязи (r=-0.45; p<0,05). Корреляционный анализ показал наличие положительной достоверной взаимосвязи между возрастом и процентом иммуно-позитивных к CTGF фибробластов (r=0,39; p<0,05). Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния (р<0,001) возраста на изменение процента фибробластов, положительно окрашенных на CTGF в дерме. Кровеносные сосуды, имеющие положительное окрашивание составляющих их клеток на CTGF, мы выявили в коже человека во всех возрастных группах. В составе оболочки сосудов дермы положительно окрашивались преимущественно эндотелиоциты. При изучении кровоснабжения дермы мы подсчитывали процент кровеносных сосудов, имеющих в своем составе клетки с положительным окрашиванием на CTGF. Исследование показало, что у плодов на сроке беременности 20-40 недель (группа 1) 74,73±2,11% кровеносных сосудов дермы имели позитивное 100 окрашивание к CTGF (рисунок 40). Кровеносные сосуды мы встречали во всех слоях дермы. Цитоплазма эндотелиальных клеток, выстилающих сосуды, была окрашена в светло-коричневый цвет, контур клеток размытый (см. рисунок 38, А). Процент кровеносных сосудов 100 80 60 40 20 0 20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет 61-85 лет Рисунок 40 – Процент кровеносных сосудов дермы, содержащих клетки с положительным окрашиванием на CTGF (М±m). p<0,001 – однофакторный дисперсионный анализ В группе 2 (0-20 лет) процент сосудов с положительным окрашиванием на CTGF составил 81,85±1,83, что было выше по сравнению с группой 1 (20-40 недель беременности) (см. рисунок 40). Кровеносные сосуды с позитивным окрашиванием на CTGF в возрасте от 0 до 20 лет мы встречали также во всех слоях дермы, но с преимущественной локализацией ближе к эпидермису. Эндотелиальные клетки сосудов в группе 2 (0-20 лет) имели более четкий контур и более темный цвет цитоплазмы, чем сосуды в дерме плодов (см. рисунок 38, Б). В группе 3 (21-40 лет) и группе 4 (41-60 лет) мы наблюдали равное содержание сосудов с позитивным окрашиванием на CTGF, что составило 87,67±2,77% в группе 3 и 87,25±3,02 в группе 4 (см. рисунок 40). 101 Кровеносные сосуды с положительным окрашиванием на CTGF в группе 3 (21-40 лет) были несколько крупнее, чем в предыдущих возрастных периодах, встречались преимущественно под эпидермисом, в глубоких слоях дермы их количество было незначительным. Мы отметили, что эндотелиальные клетки сосудов имели темно-коричневое окрашивание цитоплазмы с четким ровным контуром (рисунок 41, А). В дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет нами отмечено увеличение размера сосудов с позитивным окрашиванием на CTGF. Сосуды также располагались в непосредственной близости к эпидермису. Выстилающие их эндотелиоциты в группе 4 имели более насыщенное темно-коричневое окрашивание цитоплазмы по сравнению с предыдущими возрастными периодами (см. рисунок 39, А; рисунок 41, Б). А Б Рисунок 41 – CTGF-положительные фибробласты и кровеносные сосуды дермы человека в возрасте 35 лет (А) и 57 лет (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на CTGF. Увеличение 40х В возрастном периоде от 61 до 85 лет (группа 5) процент кровеносных сосудов с положительной окраской на CTGF превышал значения в группах 1-4 и составлял 91,13±1,67 (см. рисунок 40). В возрасте от 61 до 85 лет мы отметили, 102 что сосуды располагались небольшими группами преимущественно под эпидермисом. Эндотелиальные клетки сосудов имели четкий контур и темнокоричневое окрашивание цитоплазмы (см. рисунок 39, Б). Таким образом, в период от 20 недель беременности до 85 лет мы наблюдали увеличение процента кровеносных сосудов дермы с положительной окраской на CTGF на 16,39%. Корреляционный анализ установил наличие положительной достоверной взаимосвязи между возрастом и процентом позитивных к CTGF кровеносных сосудов дермы (r=0,39; p<0,05). Однофакторный дисперсионный анализ выявил достоверное влияние (р<0,001) возраста на изменение процента кровеносных сосудов дермы, положительно окрашенных на CTGF. В исследовании мы использовали кусочки кожи плодов мужского и женского пола, мужчин и женщин. В связи с этим мы провели анализ половых различий для возрастных изменений параметров дермы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора выступала половая принадлежность. Результаты этого анализа не установили достоверного (р<0,05) влияния пола на изменения процента фибробластов и сосудов с положительной окраской на CTGF. 3.9. Исследование PCNA-положительных фибробластов в дерме в различные возрастные периоды Для подсчета процентного соотношения PCNA-положительных и общего числа фибробластов дермы в группе 1 (20-40 недель беременности) исследовали 25 образцов кожи (9 женщин и 16 мужчин). Результаты нашего исследования показали, что у плодов на сроке беременности 20-40 недель (группа 1) в дерме определяется большое количество PCNA-положительных клеток. При подсчете процентного соотношения PCNA-положительных клеток по отношению к общему 103 числу фибробластов дермы мы выявили 39,95±2,28% клеток с позитивным окрашиванием на PCNA (рисунок 42). Процент PCNA позитивных фибробластов 50 40 30 20 10 0 20-40 недель 0-20 лет 21-40 лет 41-60 лет 61-85 лет Рисунок 42 – Процентное соотношение PCNA–положительных фибробластов к общему числу фибробластов в дерме людей различного возраста (М±m). p<0,001 – однофакторный дисперсионный анализ Морфология PCNA-позитивных клеток схожа с фибробластами, ядра PCNA-положительных клеток имеют веретенообразную слегка угловатую форму (рисунок 43, А). Для анализа процентного отношения PCNA-положительных и общего числа фибробластов в группе 2 (0-20 лет) мы исследовали 33 препарата (11 препаратов от лиц женского пола и 22 от лиц мужского). В группе 2, объединяющей образцы кожи людей в возрасте от 0 до 20 лет, мы выявили, что процентное отношение PCNA-положительных клеток по отношению к общему числу фибробластов дермы составило 31,38±1,65% (см. рисунок 42, рисунок 43, Б). 104 А Б Рисунок 43 – PCNA-положительные фибробласты в дерме плода на сроке беременности 24 недели (А) и человека в возрасте 1 год (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на PCNA. Увеличение 40х Для подсчета процентного соотношения PCNA+ и общего числа фибробластов дермы в группе 3 (21-40 лет) исследовали 40 образцов кожи (9 женщин и 31 мужчина). В данном возрастном периоде процентное отношение PCNA+ клеток по отношению к общему числу фибробластов дермы было меньше, чем в группе 1-2, и составило 23,94±1,18% (см. рисунок 42). PCNA+ клетки были распределены равномерно во всех слоях дермы без образования скоплений (рисунок 44, А). В группе 4, объединяющей образцы кожи людей в возрасте от 41 до 65 лет, нами проанализировано 26 препаратов кожи (8 женщин и 18 мужчин). В данном возрастном периоде процентное отношение PCNA-позитивных клеток по отношению к общему числу фибробластов дермы было практически идентично данным группы 3 (21-40 лет), что составило 25,33±1,34% (см. рисунок 42, рисунок 44, Б). Для подсчета процентного соотношения PCNA+ и общего числа фибробластов дермы в возрастном периоде от 61 до 85 лет мы обработали 15 образцов кожи людей (8 женщин и 7 мужчин). В группе 5 отмечается умеренное снижение процента PCNA+ по отношению к общему числу фибробластов, что 105 равняется 18,44±1,10% по сравнению с группами 1-4 (см. рисунок 42). PCNAпозитивные клетки мы встречали во всех слоях дермы, но с преимущественной локализацией под эпидермисом (рисунок 44, В). Таким образом, в возрасте от 20 недель беременности до 85 лет мы отмечали прогрессивное снижение PCNA-положительных фибробластов по отношению к общему числу фибробластов. А Б В Рисунок 44 – PCNA-позитивные фибробласты в дерме человека в возрасте 35 лет (А), 53 года (Б), 80 лет (В). Непрямая иммуногистохимическая реакция на PCNA. Увеличение 40х Корреляционный анализ между изменениями возраста и количества PCNAпозитивных клеток в дерме человека показал наличие высокой отрицательной 106 достоверной взаимосвязи (r=-0,54; p<0,05). Мы также проводили корреляционный анализ между изменениями числа PCNA-положительных фибробластов и числа фибробластов с положительной окраской на CTGF. Он показал наличие достоверной высокой отрицательной взаимосвязи (r=-0,47; p<0,05). Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния возраста на изменения численности PCNA-положительных фибробластов в дерме (р<0,001). В исследовании мы использовали кусочки кожи плодов мужского и женского пола, мужчин и женщин. Был проведен анализ половых различий для возрастных изменений параметров дермы. Для этого был выполнен однофакторный дисперсионный анализ, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не установили достоверного (р<0,05) влияния пола на изменения процента фибробластов с положительной окраской на PCNA в дерме. 107 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Результаты нашего исследования демонстрируют, что с возрастом происходит прогрессивное снижение численности фибробластов дермы. Как известно, фибробласты играют ключевую роль в поддержании межклеточного вещества дермы и их дисфункция и снижение биосинтетической активности лежат в основе старения кожи [255]. С возрастом, с одной стороны, происходит уменьшение синтеза фибробластами гиалуроновой кислоты, коллагена и других компонентов внеклеточного матрикса, с другой – увеличение производства ферментов, участвующих в фрагментации коллагеновых волокон [56, 140]. Одной из возможных внеклеточного причин матрикса снижения дермы, численности возможно, основных является продуцентов уменьшение их пролиферативного потенциала и активация апоптоза [167]. Однако точные механизмы, лежащие в основе развития дисфункции стареющих фибробластов, остаются неизвестными [195]. Нами было показано, что уменьшение численности фибробластов дермы в зависимости от возраста носит нелинейный характер. Так, имеются критические возрастные периоды – 30-40 недель беременности и возраст между 11 и 20 годами, в которых мы отметили значительное снижение численности фибробластов дермы [5]. Результаты нашей работы показали неуклонное снижение PCNA-позитивных фибробластов от антенатального периода до 85 лет. PCNA представляет собой структурный компонент ДНК-полимеразы-δ, необходимой для синтеза и репарации ДНК. Учитывая тот факт, что PCNA присутствует во всех клетках, находящихся в клеточном цикле, его можно рассматривать как один из маркеров клеточной пролиферации [196]. Таким образом, снижение PCNA-позитивных фибробластов в данном исследовании отражает снижение пролиферативного потенциала фибробластов дермы в процессе старения. Возможно, именно 108 снижение доли фибробластов, находящихся в клеточном цикле, является одной из причин уменьшения их численности в онтогенезе. Кровоснабжение тканей и органов лежит в основе их нормального функционирования за счет развитой сети кровеносных сосудов. Исследование параметров кровоснабжения межклеточных контактов кожи CD31 в онтогенезе показало с помощью возраст-зависимое маркера уменьшение численности кровеносных сосудов дермы. Максимальное количество сосудов в дерме на единицу площади мы определили в антенатальном периоде, минимальное – в возрасте 85 лет. Корреляционный анализ между изменениями возраста и численностью кровеносных сосудов с положительной окраской эндотелия на CD31 в дерме показал наличие сильной отрицательной достоверной взаимосвязи. Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния возраста на изменения численности CD31 положительных кровеносных сосудов в дерме. Возможно ухудшение кровоснабжения кожи, а значит и поступление кислорода и питательных веществ в дерму, происходящее с возрастом, ведет к дисфункции стареющих фибробластов. Фундаментальная роль в кровоснабжении тканей и органов принадлежит хорошо развитой сосудистой сети. Формирование ее в эмбриогенезе происходит за счет васкулогенеза, в постнатальном периоде – за счет ангиогенеза [209]. Ангиогенез – сложный многоэтапный, многоступенчатый процесс, который включает в себя несколько эволюционно сформировавшихся регуляторных путей, контролируемых факторами ангиогенеза. Одним из наиболее консервативных путей является сигнальный путь Notch, включающий комплекс лигандов и рецепторов, среди которых Dll4 и Jag-1 [183]. Результаты нашего исследования демонстрируют, что в дерме плодов и людей в постнатальном периоде от 0 до 85 лет присутствуют иммунопозитивные к Dll4 сосуды микроциркуляторного русла. Мы выявили, что в период жизни от 20-40 недель беременности до 20 лет происходит увеличение содержания и распределения Dll4 в кровеносных сосудах дермы. Однако в дальнейшем с 109 увеличением возраста степень окрашивания кровеносных сосудов на Dll4 начинает снижаться, достигая своего минимума в период от 61 до 85 лет. В литературе имеются данные, что Dll4 играет особую роль именно в эмбриональный период развития [39]. Но низкий уровень этого компонента Notch пути во внутриутробный период, вероятно, недостаточен для стимулирования или блокирования ангиогенеза. Однако высокая экспрессия, выявленная нами в возрасте от 0 до 20 лет, скорей всего, способна индуцировать ингибирование ангиогенеза, происходящее с возрастом [80]. Предположение о роли тормозного сигнала Dll4 в процессе ангиогенеза в дерме коррелирует с нашими полученными данными о снижении количества кровеносных сосудов в дерме с возрастом [5]. Таким образом, в своей работе мы показали, что возраст 20 лет является критичным для кровоснабжения кожи, ввиду значительного уменьшения числа сосудов в дерме. В литературе имеются данные о взаимодействии регуляторного пути VEGF-VEGFR и Notch [173]. Исследователями установлено, что сигнальный путь Dll4-Notch играет роль ингибитора ангиогенеза за счет уменьшения чувствительности эндотелиальных клеток к VEGF [104]. Известно, что Notch лиганды Dll4 и Jag-1 синтезируются эндотелиоцитами. После связывания с соответствующими рецепторами они способны изменять транскрипцию в клетках, экспрессирующих лиганды. Высокий уровень содержания Dll4 и Jag-1 замедляет пролиферацию эндотелиальных клеток [180]. Этот факт объясняет полученные нами результаты. Увеличение экспрессии Jag-1 в кровеносных сосудах дермы, происходящее с возрастом, вероятно, блокирует пролиферацию эндотелиальных клеток и приводит к снижению числа кровеносных сосудов [5]. Самым сильным из всех известных факторов роста, регулирующих ангиогенез, является VEGF [257]. VEGF обеспечивает выход из сосудов плазменных белков, таких как фибронектин, витронектин, фибриноген, факторы коагуляции, и активирует экспрессию тканевого фактора (клеточный инициатор коагуляции крови), что ведет к формированию зацепок для мигрирующих 110 эндотелиальных и гладкомышечных клеток. После образования новых сосудов фактор VEGF выступает как фактор выживаемости, подавляет апоптоз эндотелиоцитов [164, 226]. Результаты нашей работы показывают наличие в дерме сосудов, имеющих позитивную иммунореактивность к VEGF во всех возрастных группах от антенатального периода до 85 лет. Мы выявили, что с возрастом происходит постепенное и планомерное увеличение содержания VEGF в сосудах микроциркуляторного русла, то есть, увеличение основного регулятора ангиогенеза должно приводить к усилению роста новых сосудов в возрастном аспекте. Однако, как показало наше исследование, с возрастом отмечается постепенное снижение числа кровеносных сосудов дермы [5]. Наблюдаемое увеличение VEGF в кровеносных сосудах дермы при одновременном уменьшении численности кровеносных сосудов в онтогенезе может быть также обусловлено снижением численности рецепторов к VEGF. Сходные изменения в содержании VEGF и его рецепторов 2-го типа были обнаружены при исследовании опухолевого ангиогенеза в условиях лечения антагонистами роста сосудов [145]. Уменьшение численности рецепторов VEGF было также выявлено при изучении редукции сосудистой сети в ишемизированном миокарде [173]. Возрастание экспрессии Jag-1, который является лигандом для Notch рецепторов, возможно, также приводит к нарушению действия VEGF. Было установлено, что активация регуляторного пути Notch, обусловленная воздействием Jag-1 на Notch-1 рецепторы, приводит к уменьшению численности рецепторов VEGF [103]. Кроме того, было показано, что увеличение уровня Dll4 также приводило к снижению экспрессии рецепторов 2-го типа для VEGF в эндотелиальных клетках [104]. Таким образом, увеличение содержания VEGF в кровеносных сосудах дермы, происходящее с течением жизни, можно рассматривать в качестве компенсаторной реакции в ответ на снижение численности рецепторов для получения возможности реализации собственных эффектов. Немаловажное значение в регуляции ангиогенеза имеет сигнальный Hippo путь, который представляет собой один из ключевых компонентов контроля таких 111 важных процессов, как апоптоз, контактное ингибирование роста клеток и связанного с ним определения размера внутренних органов. Ключевым моментом в реализации сигнала Hippo пути является киназа Yap, которая способна специфически взаимодействовать с белками семейства мотин, в частности с ангиомотином [259]. Результаты нашего исследования показали, что дерме людей присутствуют ангиомотин-позитивные кровеносные сосуды во всех возрастных периодах – от этапа эмбриогенеза до 85 лет. В более ранних исследованиях было показано наличие ангиомотина в клетках эндотелия капилляров плаценты человека [95]. Однако не было данных по распределению ангиомотина в дермальных сосудах. Активность ангиомотина в исследовании мы оценивали по интенсивности окрашивания кровеносных сосудов дермы. Нами было отмечено уменьшение содержание ангиомотина в кровеносных сосудах дермы в возрастном аспекте. Интересно, что наибольшее снижение интенсивности окрашивания сосудов на ангиомотин происходило преимущественно после 60 лет, т.е. в период выраженной морфологической инволюции органов. Данный протеин оказывает стимулирующее влияние на процессы миграции и пролиферации эндотелиоцитов. Как известно, именно эти процессы являются одними из ключевых в образования новых сосудов [25, 28, 29]. Учитывая эти факты, ангиомотин можно рассматривать как один из ангиогенных стимуляторов [172]. Установленное нами уменьшение числа CD31-позитивных кровеносных сосудов в дерме, происходящее с возрастом [5], и, как следствие, ухудшение кровоснабжения кожи может быть связано со снижением активности ангиомотина. Однако при этом выраженное снижение числа кровеносных сосудов мы отметили в возрастной период 21-40 лет. Вероятно, с 21 года до 60 лет стимулирующее влияние ангиомотина на процесс ангиогенеза подавляется, несмотря на его достаточно высокое содержание. Исследователями установлено, что имеется перекрестное взаимодействие пути Notch и регуляторного пути Hippo в опухолевом процессе [266]. Возможно выявленный нами высокий уровень лиганда Notch – Dll4 блокирует активацию киназы Yap сигнального пути Hippo, 112 являющейся кофактором ангиомотина. Возможно, именно подобное перекрестное взаимодействие двух консервативных сигнальных путей лежит в основе снижения активности ангиогенеза в возрастном аспекте. В настоящее время известно около 27 эндогенных молекул – ингибиторов ангиогенеза, многие из которых еще не изучены. Одним из установленных и хорошо изученных ингибиторов ангиогенеза является эндостатин [43]. Известно, что основная функция эндостатина заключается в подавлении миграции и пролиферации эндотелиальных клеток за счет индуцирования апоптоза [55, 253], в противоположность ангиомотину эндостатин тормозит рост и регенерацию кровеносных сосудов. Результаты нашего исследования демонстрируют постепенное увеличение содержания эндостатина в возрастной период от 41 до 60 лет, а значительный рост интенсивности данного ингибитора ангиогенеза приходится на период от 61 до 85 лет. Именно в этот возрастной период происходит максимальная инволюция внутренних органов. Вероятно, конкурентное взаимодействие между ангиомотином и эндостатином является одним из механизмов торможения ангиогенеза и, как следствие, уменьшение числа микрососудов в дерме кожи человека [5], происходящего с возрастом. По имеющимся данным, эндостатин подавляет активность эндотелиоцитов даже в присутствии стимулятора ангиогенеза VEGF [198]. Возможно, именно высокий уровень эндостатина в кровеносных сосудах дермы, начиная с 41 года, блокирует стимулирующее влияние VEGF на процесс ангиогенеза. Другим потенциальным регулятором ангиогенеза является CTGF, относящийся к семейству CCN белков. Известно, что основная его роль – синтез компонентов внеклеточного матрикса, в частности коллагена I типа [45]. Тем самым CTGF участвует в поддержании стурктуры экстрацеллюлярного матрикса. Исследование содержания CTGF мы проводили в дермальных фибробластах и кровеносных сосудах. Нами установлено увеличение процента фибробластов и кровеносных сосудов в дерме позитивных к CTGF в возрастном аспекте. Увеличение содержания в структурах дермы CTGF может быть обусловлено его 113 повышенным синтезом. В подтверждение этого предположения имеются данные в литературе, что фибробласты мышей, полученные на 17-19-й день эмбрионального периода, продуцировали в четыре раза меньше CTGF, чем фибробласты взрослых особей [109]. Кроме того, избыточный синтез CTGF был выявлен в культивируемых стареющих фибробластах и клетках печени старых крыс. В основе повышенного синтеза CTGF лежит стимуляция трансформирующего фактора роста-β и его рецепторов 1-го и 2-го типов, синтез и содержание которых в фибробластах увеличивается с возрастом [106]. Другой возможной причиной повышения уровня CTGF в структурных элементах дермы, происходящее с возрастом, может быть уменьшение скорости его распада и увеличение время жизни молекулы. Являясь клеточновнеклеточным протеином, CTGF связывает белки внеклеточного матрикса и интегрины, входящие в состав адгезионных межклеточных контактов [68]. Вероятно, что в связанном состоянии CTGF не подвергается воздействию протеолитических ферментов, что приводит к его медленному разрушению и увеличению содержания в ткани. Наше исследование продемонстрировало возраст-зависимое снижение общего числа фибробластов, процента пролиферирующих фибробластов, числа кровеносных сосудов в дерме [5]. Мы выявили отрицательную корреляционную взаимосвязь между изменениями общего числа фибробластов, числа пролиферирующих фибробластов и количества фибробластов с положительной окраской на CTGF. Следовательно, можно предположить, что CTGF способствует уменьшению пролиферации фибробластов и снижению их общей численности. Мы так же выявили наличие отрицательной корреляционной взаимосвязи между изменениями числа сосудов и процента сосудов с положительной окраской на CTGF в дерме в возрастном аспекте. Таким образом, можно сделать вывод о негативном влиянии CTGF на рост и регенерацию кровеносных сосудов в дерме с возрастом. 114 В литературе имеются противоречивые данные о влиянии CTGF на пролиферацию фибробластов и ангиогенез [57]. Кроме общеизвестного стимулирующего влияния на пролиферацию, CTGF способен запускать апоптоз фибробластов [57]. Другой представитель семейства молекул CCN – Cyr61 оказывает ингибирующее влияние на пролиферацию малодифференцированных клеток мышечной ткани за счет повышения экспрессии протеинов, замедляющих прохождения клеток по клеточному циклу, в частности, протеины p53, p16, pRP. Установлено, что синтез Cyr61 в мышцах напрямую связан с активностью протеина Wnt-3a, концентрация которого увеличивается в организме с возрастом [161]. В свою очередь протеин Wnt-3a усиливает синтез CTGF в культуре фибробластов [245]. Существует мнение о тканевой и клеточной специфичности действия CTGF [57]. Опираясь на это предположение, можно сделать вывод, что в коже человека CTGF оказывает ингибирующее влияние на пролиферацию фибробластов и ангиогенез. Наше предположение подтверждается исследованием, в котором показано, что глюкокортикоиды, обладающие блокирующим эффектом на пролиферацию фибробластов и культивируемыми ангиогенез, фибробластами наоборот, и стимулируют фибробластами синтез дермы в CTGF процессе регенерации раны, увеличение содержания CTGF связано с угнетением пролиферации фибробластов и ангиогенеза [83]. В литературе имеются данные о способности CTGF связываться с VEGF. В результате этого взаимодействия происходит ингибирование ангиогенеза, индуцируемого VEGF [68]. Возможно, поэтому высокий уровень содержания VEGF в сосудах дермы не способен индуцировать ангиогенез в возрастном аспекте. Одним из стимуляторов секреции CTGF является трансформирующий фактор роста-β. Однако затем, наоборот, CTGF замедляет синтез трансформирующего фактора роста-β, что в конечном счете приводит к снижению функциональной активности фибробластов и угнетению синтеза компонентов матрикса соединительной ткани [69]. Предыдущие исследования продемонстрировали, что эффекты CTGF напрямую 115 зависят от его концентрации. Так, показано, что в низких концентрациях CTGF усиливает пролиферативную активность остеобластов в культуре. Однако его гиперэкспрессия тормозит работу остеобластов и приводит к развитию остеопении у мышей [107]. Следовательно, можно предположить, что повышенное содержание CTGF в дерме, наблюдаемое нами в процессе физиологического старения, оказывает ингибирующее влияние на пролиферацию фибробластов и ангиогенез. Так как в исследовании мы использовали кусочки кожи плодов и людей мужского и женского пола, то нам было интересно узнать о влиянии пола на активность регуляторов ангиогенеза. Однако проведенный однофакторный дисперсионный анализ, где в качестве фактора использована половая принадлежность, не установил достоверного влияния пола на изменение процента фибробластов, сосудов с положительной окраской на CTGF, общего числа фибробластов и процента фибробластов с положительной окраской на PCNA в дерме, экспрессию ангиомотина, эндостатина, Dll4, Jag-1, VEGF. Таким образом, на основании результатов нашей работы можно сделать вывод, что снижение активности ангиогенеза, происходящее с возрастом, приводит к ухудшению кровоснабжения дермы, что в свою очередь ведет к снижению общей численности фибробластов и их пролиферативной активности. Следовательно, настоящая работа демонстрирует потенциально новый механизм, лежащий в основе возрастного снижения численности фибробластов дермы. Возможно, используя полученные знания, можно будет найти новый подход к лечению, а главное, к профилактике возрастных изменений кожи, так как именно адекватное кровоснабжение является залогом нормального регенераторного потенциала ткани. 116 ВЫВОДЫ 1. Содержание сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в кровеносных сосудах дермы человека увеличивается от 20-ти недель беременности до 85-ти лет, что подтверждается планомерным возрастным уменьшением числа случаев с отсутствием окрашивания кровеносных сосудов на VEGF на 35,17% и увеличением доли случаев с сильной и средней степенью окрашивания на 18,32% и 19,41% соответственно. 2. Содержание дельтаподобного лиганда 4 (Dll4) в кровеносных микрососудах дермы человека увеличивается от 20-ти недель беременности до 20ти лет (число объектов наблюдения со средней и сильной степенью окрашивания кровеносных сосудов на Dll4 на 20,94% и 9,76% соответственно), а затем неуклонно снижается к 85-ти годам жизни (число случаев со средней и сильной степенью окрашивания кровеносных сосудов на Dll4 на 14,46% и 6,05% соответственно). 3. Экспрессия Jagged-1 (Jag-1) в кровеносных сосудах дермы человека существенно возрастает от 20-ти недель беременности до 85-ти лет жизни, что подтверждается увеличением доли исследованных объектов с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на Jag-1 на 21,43% и 64,29% соответственно. 4. Содержание ангиомотина в кровеносных микрососудах дермы человека снижается от 20-ти недель беременности до 85-ти лет жизни, о чем свидетельствует уменьшение доли исследованных объектов с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на ангиомотин на 11,29% и 16,16% соответственно. 5. Содержание эндостатина в кровеносных микрососудах дермы человека увеличивается от антенатального периода до 85-ти лет (число случаев с 117 сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на эндостатин возрастает на 25,73% и 21,57% соответственно). 6. Количество фибробластов и кровеносных сосудов с положительной окраской на фактор роста соединительной ткани (CTGF) в дерме человека планомерно возрастает от 20-ти недель беременности до 85-ти лет жизни на 16,39% и 17,43% соответственно. Возрастное увеличение содержания GTGF в кровеносных сосудах корреляционную и фибробластах взаимосвязь с дермы возрастным имеет уменьшением кровеносных сосудов и фибробластов в дерме человека. отрицательную численности 118 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CTGF – фактор роста соединительной ткани (сonnective tissue growth factor) Dll4 – дельтаподобный лиганд 4 (delta like ligand 4) Jag-1 – Jagged-1 PCNA – ядерный антиген пролиферирующих клеток (proliferating cell nuclear antigen) TBS – трис-буферный раствор (tris buffered saline) VEGF – сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor) 119 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Ахтямов С.Н. Практическая дерматокосметология / С.Н. Ахтямов, Ю.С. Бутов. – М.: Медицина, 2003. – 400 c. 2. Быков В.Л. Гистология, цитология и эмбриология. Атлас: учеб. пособие / В.Л. Быков, С.И. Юшканцева. – М.: ГЭОТАР–МЕД, 2013. –296 с. 3. Горшунова Г.Н. Диабетические изменения сосудистого русла кожи: иммуногистохимическое исследование / Г.Н. Горшунова, А.М. Девятаев, В.В. Валиуллин // Астраханский медицинский журнал. – 2013. – Т. 8, № 4. – С. 57– 62. 4. Карамышева А.Ф. Механизмы ангиогенеза /А.Ф. Карамышева // Биохимия – 2008. – № 7. – С. 935-948. 5. Кровеносные сосуды в дерме человека в процессе старения /А.Г. Гунин, В.В. Петров, О.В. Васильева и др. // Успехи геронтологии. – 2014. – Т. 27, вып. 1.– С. 54-61. 6. Улумбеков Э.Г. Гистология / Э.Г. Улумбеков, Ю.А. Челышев. – М.: ГЭОТАР– МЕД, 2002. – 672 с. 7. Эндостатин: современные представления о его роли и механизмах действия / А.В. Дигтярь, Н.В. Позднякова, Н.Б. Фельдман и др. // Биохимия. – 2007. – Т. 72, вып. 3. – С. 291–305. 8. A tight junction-associated merlin-angiomotin complex mediates merlin’s regulation of mitogenic signaling and tumor suppressive functions / C. Yi, S. Troutman, D. Fera et al. // Cancer cell. – 2011. – Vol. 19, № 4. – P. 527–540. 9. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele / P. Carmeliet, V. Ferreira, G. Breier et al. // Nature. – 1996. – Vol. 380, № 6573. – P. 435–439. 120 10. Abraham. D. Connective tissue growth factor: growth factor, matricellular organizer, fibrotic biomarkeror molecular targetfor anti-fibrotic therapyin SSc? / D. Abraham // Rheumatology. – 2008. – Vol. 47. – P. 8–9. 11. Adipose tissue engineering: three different approaches to seed preadipocytes on a collagen-elastin matrix / M. Keck, D. Haluza, H. Selig et al. // Annals of plastic surgery. – 2011. – Vol. 67, № 5. – P. 484-488. 12. Age- and sun exposure-dependent differences in 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine and Nε-(carboxymethyl)lysine in human epidermis / S. Toyokuni, A.Hirao, T. Wada et al. // Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition. – 2011. – Vol. 49, № 2. – P. 121-124. 13. Age changes of immunological, morphological and biochemical indices of male reproductive system / O. Boĭko, A. Akhmineeva, N. Gudinskaia et al. // Advances in gerontology. – 2014. – Vol. 27, № 1. – P. 50-53. 14. Age-related changes inangiogenesis in human dermis / A. Gunin, V. Petrov, N. Golubtzova et al. //Experimental Gerontology. – 2014. –Vol. 55. – P. 143-151. 15. Aging impairs VEGF-mediated, androgen-dependent regulation of angiogenesis / L. Lecce, Y. Lam, L. Lindsay et al. // Molecular Endocrinology. – 2014. – Vol. 28, № 9. – P. 1487-1501. 16. Aging increases CCN1 expression leading to muscle senescence / J. Du, J. Klein, F. Hassounah et al. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. – 2014. – Vol. 306. – P. 28-36. 17. Alitalo K. Molecular mechanisms of lymphangiogenesis in health an disease / K. Alitalo, P. Carmeliet // Cancer cell. – 2002. – Vol. 1, № 3. – P.219–227. 18. Alpha2,6-sialic acid on platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM) regulates its homophilic interactions and downstream antiapoptotic signaling / S. Kitazume, R. Imamaki, K. Ogawa et al. // The Journal of biological chemistry. – 2010. – Vol. 285, № 9. – P. 6515-6521. 19. Analysis of the role of PCNA-DNA contacts during clamp loading / R. McNally, G. Bowman. E. Goedken et al. // BMC structural biology. – 2010. – Vol. 10. – P. 3. 121 20. Angiocrine factors deployed by tumor vascular niche induce B cell lymphoma invasiveness and chemoresistance / Z. Cao, B. Ding, P. Guo et al. // Cancer cell. – 2014. – Vol. 25, № 3. – P. 350–365. 21. Angiogenesis and lymphangiogenesis in inflammatory skin disorders / G. Varricchi, F. Granata, S. Loffredo et al. // Journal of the American Academy of Dermatology. – 2015. – Vol.73, № 1. – P. 144-153. 22. Angiogenesis is induced and wound size is reduced by electrical stimulation in an acute wound healing model in human skin / S. Ud-Din, A. Sebastian, P. Giddings et al. // PloS one. – 2015. – Vol. 10, № 4. – P. 500-502. 23. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes / M. Laschke, Y. Harder, M. Amon et al. // Tissue engineering. – 2006. – Vol. 12, № 8. – P. 2093-2104. 24. Angiomotin: an angiostatin binding protein that regulates endothelial cell migration and tube formation / B. Troyanovsky, T. Levchenko, G. Månsson et al. // The Journal of cell biology. – 2001. – Vol. 152, № 6. – P. 1247–1254. 25. Angiomotin belongs to a novel protein family with conserved coiled-coil and PDZ binding domains / A. Bratt, J. William, B. Troyanovsky et al. // Gene. – 2002. – Vol. 298, № 1. – P. 69–77. 26. Angiomotin functions in HIV-1 assembly and budding / G. Mercenne, S. Alam, J. Arii et al. // eLife. – 2015. – Vol. 4.–P. 70—73. 27. Angiomotin promotes breast cancer cell proliferation and invasion / M. Lv, L. Chen, T. Qin et al. // Oncology reports. – 2015. – Vol. 33, № 4. – P. 1938–1946. 28. Angiomotin regulates endothelial cell-cell junctions and cell motility / A. Bratt, O. Birot, I. Sinha et al. // The Journal of biological chemistry. – 2005. – Vol. 280, № 41. – P. 34859–34869. 29. Angiomotin regulates endothelial cell migration during embryonic angiogenesis / K. Aase, M. Ernkvist, L. Ebarasi et al. // Genes Dev. – 2007. – Vol. 21. – P. 2055– 2068. 122 30. Anti-angiogenic peptides for cancer therapeutics / E. Rosca, J. Koskimaki, C. Rivera et al. // Current pharmaceutical biotechnology. – 2011. – Vol. 12, № 8. – P. 1101– 1116. 31. Asadamongkol B. The development of hyperbaric oxygen therapy for skin rejuvenation and treatment of photoaging / B. Asadamongkol, J. Zhang // Medical gas research. – 2014. – Vol. 4, № 1. – P.7. 32. Assessment of microcirculation of the skin using Tissue Viability Imaging: a promising technique for detecting venous stasis in the skin / M. Bergkvist, J. Henricson, F. Iredahl, et al. // Microvascular research. – 2015. – Vol. 101. – Р. 2025. 33. Association between Maturation and Aging and Pulmonary Responses in Animal Models of Lung Injury: A Systematic Review / L. Schouten, M. Schultz, A. van Kaam et al. // Anesthesiology. – 2015. – Vol. 123, № 2. – P. 389-408. 34. Artificial skin in perspective: concepts and applications / Abdo Brohem Carla, Beatriz da Silva Cardeal Laura, Tiago Manoelaet al. // Pigment cell Melanoma Res. – 2011. – Vol. 24, № 1. – P. 35–50. 35. Autologous adipose stromal cells seeded on a human collagen matrix for dermal regeneration in chronic wounds: clinical proof of concept / A. Lafosse, C. Desmet, N. Aouassar et al. // Plastic and reconstructive surgery. – 2015. – Vol. 136, № 2. – Р. 279-295. 36. Baluk P. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis / P. Baluk, D. McDonald // Annals of the New York Academy of Sciences. – 2008. – Vol. 1131. – P 1-12. 37. Basilio-de-Oliveira R. Prognostic angiogenic markers (endoglin, VEGF, CD31) and tumor cell proliferation (Ki67) for gastrointestinal stromal tumors / R. Basilio-deOliveira, V. Nunes Pannain // World journal of gastroenterology: WJG. – 2015. – Vol. 21, № 22. – P. 6924-6930. 38. Baumann L. Skin ageing and its treatment / L. Baumann // The Journal of pathology. – 2007. – Vol. 211, № 2. – P. 241-251. 123 39. Benedito R. Expression of Dll4 during mouse embryogenesis suggests multiple developmental roles / R. Benedito, A. Duarte // Gene expression patterns: GEP. – 2005. – Vol. 5, № 6. – P. 750–755. 40. Biological roles of the delta family Notch ligand Dll4 in tumor and endothelial cells in ovarian cancer / W. Hu, C. Lu, H. Dong et al. // Cancer research. – 2011. – Vol. 71, № 18. – P. 6030–6039. 41. Biology of stem cells: the role of microenvironments / A. Zapata, D. Alfaro, J. García-Ceca et al. // Advances in experimental medicine and biology. – 2012. – Vol. 741. – P. 135-151. 42. Bonta M. The process of ageing reflected by histological changes in the skin / М. Bonta, L. Daina, G. Muţiu // Rom. J. Morphol. Embryol. – 2013. – Vol. 54, № 3. – P. 797–804. 43. Boosani C. Proteolytically derived endogenous angioinhibitors originating from the extracellular matrix / C. Boosani, Y. Sudhakar // Pharmaceuticals. – 2011. – Vol. 4, № 12. – P. 1551–1577. 44. Bridges E. The angiogenic process as a therapeutic target in cancer / E. Bridges, A. Harris // Biochemical pharmacology. – 2011. – Vol. 81, № 10. – P. 1183–1191. 45. Brigstock D. Connective tissue growth factor (CCN2, CTGF) and organ fibrosis: lessons from transgenic animals / D. Brigstock // Journal of cell communication and signaling. – 2010. – Vol. 4, № 1. – P. 1-4. 46. Bruckner-Tuderman L. Small-molecule therapies for genetic skin fragility / L. Bruckner-Tuderman // Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. – 2014. – Vol. 22, № 10. – P. 1724-1725. 47. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells / Z. Guo, C. Higgins, B. Gillette et al. // Stem cell research & therapy. – 2013. – Vol. 4 Suppl 1. – P. 2. 48. Cardiovascular failure in mouse embryos deficient in VEGF Receptor-3 / D. Dumont, L. Jussila, J. Taipale et al. // Science. – 1998. – Vol. 282, № 5390. – P. 946–949. 124 49. CCN2 (connective tissue growth factor) promotes fibroblast adhesion to fibronectin / Y. Chen, D. Abraham, X. Shi-Wen et al. // Molecular biology of the cell. – 2004. – Vol. 15, № 12. – P. 5635–5646. 50. CCN2/connective tissue growth factor is essential for pericyte adhesion and endothelial basement membrane formation during angiogenesis / F. Hall-Glenn, R. De Young, B. Huang et al. // PloS one. – 2012. – Vol. 7, № 2. – P. 34-41. 51. CCN2 is required for bleomycin-induced skin fibrosis in mice / S. Liu, X. Shi-wen, D. Abraham et al. // Arthritis and rheumatism. – 2011. – Vol. 63, № 1. – P. 239–246. 52. Cellular and molecular biology of aging endothelial cells / A. Donato, R. Morgan, A. Walker et al. // Journal of molecular and cellular cardiology. – 2015. – Vol. 78. – Р. 10-16. 53. Changes in glycosaminoglycans and related proteoglycans in intrinsically aged human skin in vivo / J. Oh, Y. Kim, J. Jung et al. // Experimental Dermatology. – 2011. – Vol. 20, № 5. – P. 454-456. 54. Changes of skin collagen orientation associated with chronological aging as probed by polarized–FTIR micro–imaging / C. Eklouh–Molinier, D. Sebiskveradze, T.T. Nguyen et al. // Analyst. – 2014. – Vol. 139, № 10. – P. 2482–2488. 55. Chavakis E. Regulation of endothelial cell survival and apoptosis during angiogenesis / Е. Chavakis, S. Dimmele // Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. – 2002. – Vol. 22, № 6. – P. 887-893. 56. Characteristics of the aging skin / M. Farage, K. Miller, P. Elsner et al. // Adv Wound Care (New Rochelle). – 2013. – Vol. 2, № 1. – P. 5–10. 57. Chen C. Functions and mechanisms of action of CCN matricellular proteins / C. Chen, L. Lau // The international journal of biochemistry & cell biology. – 2009. – Vol. 41, № 4. – P. 771–783. 58. Cheng R Angiogenesis in diabetes and obesity / R. Cheng, J. Ma // Reviews in endocrine & metabolic disorders. – 2015. – Vol. 16, № 1. – P. 67–75. 125 59. Chondroitinase injection improves keloid pathology by reorganizing the extracellular matrix with regenerated elastic fibers / T. Ishiko, M. Naitoh, H. Kubota et al. // The Journal of dermatology. – 2013. – Vol. 40, № 3. – P. 380-383. 60. Chung J. Angiogenesis in skin aging and photoaging / J. Chung, H. Eun // The Journal of dermatology. – 2007. – Vol. 3, № 9. – P. 593–600. 61. Cicha I. Connective tissue growth factor: context-dependent functions and mechanisms of regulation / I. Cicha, M. Goppelt-Struebe // BioFactors. – 2009. – Vol. 35, № 2. – P. 200–208. 62. Clinical Implication of p16, Ki-67, and Proliferating Cell Nuclear Antigen Expression in Cervical Neoplasia: Improvement of Diagnostic Accuracy for Highgrade Squamous Intraepithelial Lesion and Prediction of Resection Margin Involvement on Conization Spe / T. Kim, J. Han, E. Shin et al. // Journal of cancer prevention. – 2015. – Vol. 20, № 1. – P. 70-77. 63. Cohen A. / Physiological and comparative evidence fails to confirm an adaptive role for aging in evolution / A. Cohen // Current aging science. – 2015. – Vol. 8, № 1. – P. 14-23. 64. Collagen extracts derived from young and aged mice demonstrate different structural properties and cellular effects in three-dimensional gels / M. Damodarasamy, R. Vernon, N. Karres et al. // The journals of gerontology. Series A, Biological sciences and medical sciences. – 2010. – Vol. 65, № 3. – P. 209-218. 65. Collagen XVIII/endostatin structure and functional role in angiogenesis / U. Zatterstrom, U. Felbor, N. Fukai et al. // Cell structure and function. – 2000. – Vol. 25, № 2. – P. 97–101. 66. Comparison between human fetal and adult skin / N. Coolen, K. Schouten, E. Middelkoop et al // Archives of dermatological research. – 2010. – Vol. 302, № 1. – P. 47–55. 67. Connective tissue growth factor: a cysteine-rich mitogen secreted by human vascular endothelial cells is related to the SRC-induced immediate early gene 126 product CEF-10 / D. Bradham, A. Igarashi, R. Potter et al. // The Journal of cell biology. – 1991. – Vol. 114, № 6. – P. 1285–1294. 68. Connective tissue growth factor binds vascular endothelial growth factor (VEGF) and inhibits VEGF-induced angiogenesis / I. Inoki, T. Shiomi, G. Hashimoto et al // FASEB J. – 2002. – Vol. 16. – P. 219-221. 69. Connective tissue growth factor: expression in human skin in vivo and inhibition by ultraviolet irradiation / T. Quan, T. He, S. Kang et al. // J. Invest. Dermatol. – 2002. – Vol. 118. – P. 402–408. 70. Connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) mediates angiogenic effect of S1P in human dermal microvascular endothelial cells / M. Markiewicz, S. Nakerakanti, B. Kapanadze et al. // Microcirculation. – 2011. – Vol. 18, № 1. – P. 1–11. 71. Connective tissue growth factor promoter activity in normal and wounded skin / M. Kapoor, S. Liu, K. Huh et al. // Fibrogenesis & tissue repair. – 2008. – Vol. 1, № 1. – P. 3. 72. Coultas L. Endothelial cells and VEGF in vascular development / L. Coultas, K. Chawengsaksophak, J. Rossant // Nature. – 2005. – Vol. 438, № 7070. – P. 937– 945. 73. СTGF/Hcs24, hypertrophic chondrocyte-specific gene product, interacts with perlecan in regulating the proliferation and differentiation of chondrocytes / T. Nishida, S. Kubota, T. Fukunaga et al. // Journal of cellular physiology. – 2003. – Vol. 196, № 2. – P. 265–275. 74. Current biology of VEGF-B and VEGF-C / B. Olofsson, M. Jeltsch, U. Eriksson et al. // Current opinion in biotechnology. – 1999. – Vol. 10, № 6. – P. 528–535. 75. Current concepts on diagnosis and treatment of mastocytosis / D. Magliacane, R. Parente, M. Triggiani et al. // Translational medicine @ UniSa. – 2014. – Vol. 8 – P. 65-74. 76. Current understanding of molecular and cellular mechanisms in fibroplasia and angiogenesis during acute wound healing / N. Greaves, A. Ashcroft, M. Baguneid et al. // Journal of dermatological science. – 2013. –Vol. 72, № 3. – P. 206–217. 127 77. Decreased proliferative capacity of aged dermal fibroblasts in a three dimensional matrix is associated with reduced IGF1R expression and activation / I. Bentov, М. Damodarasamy, S. Plymate et al. // Biogerontology. – 2014. – Vol. 15, № 4. – P. 329-337. 78. Deleidi M. Immune aging, dysmetabolism, and inflammation in neurological diseases / M. Deleidi, M. Jäggle, G. Rubino // Frontiers in neuroscience. – 2015. – Vol. 9 – P. 172. 79. Delevoye C. Melanin transfer: the keratinocytes are more than gluttons / C. Delevoye // The Journal of investigative dermatology. – 2014. – Vol. 134, № 4. – P. 877-879. 80. Delta-like 4 inhibits choroidal neovascularization despite opposing effects on vascular endothelium and macrophages / S. Camelo, W. Raoul, S. Lavalette et al. // Angiogenesis. – 2012. – Vol.15. – P. 609-622. 81. Determination of the action spectrum of UVR-induced mitochondrial DNA damage in human skin cells / J. Latimer, J. Lloyd, B. Diffey et al. // Journal of Investigative Dermatology. – 2015. – Vol. 135, № 10. – Р. 2512-2518. 82. Development of full-thickness human skin equivalents with blood and lymph-like capillary networks by cell coating technology / M. Matsusaki, K. Fujimoto, Y. Shirakata et al. // Journal of biomedical materials research. Part A. – 2015. – Vol. 103, № 10. Р. 3386-3396. 83. Dexamethasone is a novel potent inducer of connective tissue growth factor expression. Implications for glucocorticoid therapy / J. Dammeier, H. Beer, M. Brauchle et al. // J. Biol. Chem. – 1998. – Vol. 273. – P. 18185-18190. 84. Differential regulation of vascular endothelial growth factors by promoter-targeted shRNAs / N. Laham-Karam, M. Lalli, N. Leinonen et al. // Molecular therapy. Nucleic acids. – 2015. – Vol. 4. – P. e243. 85. Dillehay K. Antitumor effects of a novel small molecule targeting PCNA chromatin association in prostate cancer / K. Dillehay, S. Lu, Z. Dong // Molecular cancer therapeutics. – 2014. – Vol. 13, № 12. – P. 2817-2826. 128 86. Dll4-Notch signaling in regulation of tumor angiogenesis / Z. Liu, F. Fan, A. Wang et al. // Journal of cancer research and clinical oncology. – 2014. – Vol. 140, № 4. – P. 525–536. 87. DLL4-Notch signaling mediates tumor resistance to anti-VEGF therapy in vivo / J. Li, R. Sainson, C. Oon et al. // Cancer research. – 2011. – Vol. 71, № 18. – P. 6073–6083. 88. Dvorak H. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a critical cytokine in tumor angiogenesis and a potential target for diagnosis and therapy / H. Dvorak // Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. – 2002. – Vol. 20, № 21. – P. 4368–4380. 89. Effects of human pericytes in a murine excision model of wound healing / S. Mills, L. Zhuang, P. Arandjelovic et al. // Experimental dermatology. – 2015. – Vol. 24, № 7. – Р. 485-488. 90. Effect of recombinant human endostatin on the expression of c-Myc and bFGF in mouse gastric cancer cells / Z. Guo, G. Yao, L. Fu et al. //Genetics and molecular research: GMR. – 2015. – Vol. 14, № 2. – P. 5258-5265. 91. Effects of peroxisome proliferator activated receptors α and γ agonists on estradiol– induced proliferation and hyperplasia formation in the mouse uterus / A.G. Gunin, A.D. Bitter, A.B. Demakov et al. // J. Endocrinol. – 2004. – Vol. 182. – P. 229–239. 92. Effects of platelet-rich plasma on proliferation and myofibroblastic differentiation in human dermal fibroblasts / S. Kushida, N. Kakudo, K. Suzuk et al. // Annals of plastic surgery. – 2013. – Vol. 71, № 2. – P. 219-224. 93. El Assar M. Oxidative stress and vascular inflammation in aging / M. El Assar, J. Angulo, L. Rodríguez-Mañas // Free radical biology & medicine. – 2013. – Vol. 65. – P. 380-401. 94. Endostar attenuates melanoma tumor growth via its interruption of b-FGF mediated angiogenesis / L. Xiao, S. Yang, J. Hao et al. // Cancer letters. – 2015. – Vol. 359, № 1. – P. 148–154. 129 95. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth / M. O’Reilly, T. Boehm, Y. Shing et al. // Cell. – 1997. – Vol. 88, № 2. – P. 277–285. 96. Endostatin blocks vascular endothelial growth factor-mediated signaling via direct interaction with KDR/Flk-1 / Y. Kim, S. Hwang, B. Pyun et al. // The Journal of biological chemistry. – 2002. – Vol. 277, № 31. – P. 27872–27879. 97. Endostatin gene transfer inhibits joint angiogenesis and pannus formation in inflammatory arthritis / G. Yin, W. Liu, P. An et al. // Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. – 2002. – Vol. 5, № 5. – P. 547–554. 98. Endostatin has ATPase activity, which mediates its antiangiogenic and antitumor activities / S. Wang, X. Lu, P. Liu et al. // Molecular cancer therapeutics. – 2015. – Vol. 14, № 5. – P. 1192–1201. 99. Endostatin induces proliferation of oral carcinoma cells but its effect on invasion is modified by the tumor microenvironment / I. Alahuhta, M. Aikio, O. Väyrynen et al. // Experimental cell research. – 2015. – Vol. 336, № 1. – Р. 130-140. 100. Endostatin inhibits hypertrophic scarring in a rabbit ear model / H. Ren, H. Hu, Y. Li et al. // Journal of Zhejiang University. Science. B. – 2013. – Vol. 14, № 3. – P. 224-230. 101. Endostatin regulates endothelial cell adhesion and cytoskeletal organization / J. Dixelius, M. Cross, T. Matsumoto et al. // Cancer research. – 2002. – Vol. 62, № 7. – P. 1944–1947. 102. Endosomal regulation of contact inhibition through the AMOT: YAP pathway / C. Cox, E. Mandell, L. Stewart et al. // Molecular biology of the cell. – 2015. – Vol. 26, № 14. – Р. 2673-2684. 103. Endothelial JAGGED1 antagonizes dll4 regulation of endothelial branching and promotes vascular maturation downstream of dll4/notch1 / A. Pedrosa, A. Trindade, A. Fernandes et al. // Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. – 2015. – Vol. 35, № 5. – P. 1134–1146. 130 104. Endothelial signalling by the Notch ligand Delta-like 4 restricts angiogenesis / J. Leslie, L. Ariza-McNaughton, A. Bermange et al. // Development. – 2007. – Vol. 134, № 5. – P. 839-844. 105. EpCAM induction functionally links to the Wnt-enhanced cell proliferation in human keratinocytes / C. Shen, H. Lee, Y. Kao et al. // Cell transplantation. – 2014. – Vol. 23, № 8. – P. 1031-1044. 106. Expression of connective tissue growth factor, a biomarker in senescence of human diploid fibroblasts, is up-regulated by a transforming growth factor-betamediated signaling pathway / K. Kim, G. Park, Y. Lim et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2004. – Vol. 318. – P. 819-825. 107. Expression of connective tissue growth factor in bone: its role in osteoblast proliferation and differentiation in vitro and bone formation in vivo /F. Safadi, J. Xu, S. Smock et al. // J. Cell. Physiol. – 2003. – Vol. 196. – P. 51-62. 108. Expression of cyr61, a growth factor-inducible immediate-early gene / T. O’Brien, G. Yang, L. Sanders et al. // Molecular and cellular biology. – 1990. – Vol. 10, № 7. – P. 3569–3577. 109. Fetal and adult fibroblasts have similar TGF-beta-mediated, Smad-dependent signaling pathways / A. Colwell, T. Krummel, M. Longaker et al. // Plast. Reconstr. Surg. – 2006. – Vol. 117.– P. 2277-2283. 110. Ferrara N. Angiogenesis as a therapeutic target / N. Ferrara, R. Kerbel // Nature. – 2005. – Vol. 438, № 7070. – P. 967–974. 111. Fetal and adult fibroblasts display intrinsic differences in tendon tissue engineering and regeneration / Q. Tang, J. Chen, W. Shen et al. // Scientific reports. – 2014. – Vol. 4. – P. 5515. 112. Fetal skin possesses the ability to regenerate completely: complete regeneration of skin / K. Kishi, K. Okabe, R. Shimizu et al. // The Keio journal of medicine. – 2012. – Vol. 61, № 4. – P. 101-108. 131 113. Fibrotic remodeling of tissue-engineered skin with deep dermal fibroblasts is reduced by keratinocytes / M. Varkey, J. Ding, E. Tredget et al. // Tissue engineering. Part A. – 2014. – Vol. 20. – P 716-727. 114. Fiúza U. Cell and molecular biology of Notch / U. Fiúza, A. Arias // The Journal of endocrinology. – 2007. – Vol. 194, № 3. – P. 459–474. 115. Flint W. Nail and skin disorders of the foot / W. Flint, J. Cain // The Medical clinics of North America. – 2014. – Vol. 98, № 2. – P. 213-225. 116. Flt-1 but not KDR/Flk-1 tyrosine kinase is a receptor for placenta growth factor, which is related to vascular endothelial growth factor / A. Sawano, T. Takahashi, S. Yamaguchi et al. // Cell growth & differentiation: the molecular biology journal of the American Association for Cancer Research. – 1996. – Vol. 7, № 2. – P. 213–221. 117. Frantz C. The extracellular matrix at a glance / C. Frantz, K. Stewart, V. Weaver // Journal of cell science. – 2010. – Vol. 123, № Pt 4. – P. 4195-4200. 118. Gao R. Connective tissue growth factor (CCN2) induces adhesion of rat activated hepatic stellate cells by binding of its C-terminal domain to integrin alpha(v)beta(3) and heparan sulfate proteoglycan / R. Gao, D. Brigstock // The Journal of biological chemistry. – 2004. – Vol. 279, № 10. – P. 8848–8855. 119. Gasque F. The immunology and inflammatory responses of human melanocytes in infectious diseases / F. Gasque, M. Jaffar Bandjee // The Journal of infection. – 2015. – Vol. 71. – Р. 413-421. 120. Gems D. Genetics of longevity in model organisms: debates and paradigm shifts / D. Gems, L. Partridge // Annual review of physiology. – 2013. – Vol. 75. –P. 621644. 121. Generation of 3D skin equivalents fully reconstituted from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) / M. Itoh, N. Umegaki-Arao, Z. Guo, et al. // PloS one. – 2013. – Vol. 8, № 10. – P. 673. 122. Geriatric Dermatology Review: Major Changes in Skin Function in Older Patients and Their Contribution to Common Clinical Challenges / A. Chang, 132 J. Wong, J. Endo et al. // Journal of the American Medical Directors Association. – 2013. – Vol. 14, № 10. – P. 724-730. 123. Gerhardt H. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis / H. Gerhardt, C. Betsholtz // Cell and tissue research. – 2003. – Vol. 314, № 1. – P. 15–23. 124. Gilchrest B. Skin aging and photoaging: an overview / B. Gilchrest // Journal of the American Academy of Dermatology. – 1989. – Vol. 21, № 3. – P. 610–613. 125. Gridley T. Notch signaling in the vasculature / T. Gridley // Current topics in developmental biology. – 2010. – Vol. 92. – P. 277–309. 126. Gunin A.G. Effects of histone deacetylase inhibitors on estradiol–induced proliferation and hyperplasia formation in the mouse uterus / A.G. Gunin, I.N. Kapitova, N.V. Suslonova // J. Endocrinol. – 2005. – Vol. 185. – P. 539–549. 127. Guruharsha K. The Notch signalling system: recent insights into the complexity of a conserved pathway / K. Guruharsha, M. Kankel, S. Artavanis-Tsakonas // Nature reviews. Genetics. – 2012. – Vol. 13, № 9. – P. 654–666. 128. Halper J. Basic components of connective tissues and extracellular matrix: elastin, fibrillin, fibulins, fibrinogen, fibronectin, laminin, tenascins and thrombospondins / J. Halper, М. Kjaer // Adv. Exp. Med. Biol. – 2014. – Vol. 802. – P. 31–47. 129. Hanahan D. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis / D. Hanahan, J Folkman // Cell. – 1996. – Vol. 86, № 3. – P. 353364. 130. Haploinsufficient lethality and formation of arteriovenous malformations in Notch pathway mutants / L. Krebs, J. Shutter, K. Tanigaki et al. // Genes & development. – 2004. – Vol. 18, № 20. – P. 2469–2473. 131. Harper S. VEGF-A splicing: the key to anti-angiogenic therapeutics / S. Harper, D. Bates // Nature reviews. Cancer. – 2008. – Vol. 8, № 11. – P. 880–887. 132. Hashimoto T. Hypoxia-inducible factor as an angiogenic master switch / T. Hashimoto, F. Shibasaki // Frontiers in pediatrics. – 2015. – Vol. 3. – P. 33. 133 133. HIF and VEGF relationships in response to hypoxia and sciatic nerve stimulation in rat gastrocnemius / K. Tang, E. Breen, H. Wagner et al. // Respiratory physiology & neurobiology. – 2004. – Vol. 144, № 1. – P. 71–80. 134. Hirudin promotes angiogenesis by modulating the cross-talk between p38 MAPK and ERK in rat ischemic skin flap tissue / X. Pan, L. Peng, Z. Han et al. // Tissue & cell. – 2015. – Vol. 47, № 3. – Р. 301-310. 135. Hippo pathway-independent restriction of TAZ and YAP by angiomotin / S. Chan, C. Lim, Y. Chong et al. // The Journal of biological chemistry. – 2011. – Vol. 286, № 9. – P. 7018–7026. 136. Hong W. Angiomotin’g YAP into the nucleus for cell proliferation and cancer development / W. Hong // Science signaling. – 2013. – Vol. 6, № 291. – P. 27. 137. Human skin stem cells and the aging process /C. C.Zouboulis, H.Akamatsu, J.Adjaye et al. // Exp. Geront. – 2008. – Vol. 43. – P. 986–997. 138. Human hypertrophic and keloid scar models: principles, limitations and future challenges from a tissue engineering perspective / L. van den Broek, V. Limandjaja, F. Niessen et al. // Experimental dermatology. – 2014. – Vol. 23, № 6. – P. 382-386. 139. Human umbilical cord mesenchymalsStem cell exosomes enhance angiogenesis through the Wnt4/β-catenin pathway / B. Zhang, X. Wu, X.Zhang et al. // Stem cells translational medicine. – 2015. – Vol. 4, № 5. – P. 513–522. 140. In the shadow of the wrinkle: experimental models / P. Humber, C. Viennet, K. Legagneux et al. //J Cosmet Dermatol. – 2012. – Vol. 11, № 1. – P. 79–83. 141. Inhibition of Dll4-mediated signaling induces proliferation of immature vessels and results in poor tissue perfusion / J. Scehnet, W. Jiang, S. Kumar et al. // Blood. – 2007. – Vol. 109, № 11. – P. 4753–4760. 142. Inhibition of the notch pathway promotes flap survival by inducing functional neoangiogenesis / O. Abbas, H. Borman, Y. Terzi et al. // Annals of plastic surgery. – 2014. – Vol. 75, № 4. – P. 455-462. 134 143. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo / K. Kim, B. Li, J. Winer et al. // Nature. – 1993. – Vol. 362, № 6423. – P. 841–844. 144. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis / A. Schmidt, D. Wenzel, I. Ferring et al. // Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. – 2004. – Vol. 230, № 3. – P. 468–480. 145. Interactions between VEGFR and Notch signaling pathways in endothelial and neural cells / J. Thomas, K. Baker, J. Han et al. // Cellular and molecular life sciences: CMLS. – 2013. – Vol. 70, № 10. – P. 1779-1792. 146. Interrelation of endothelial and myocardial dysfunction in persons of elderly age with arterial hypertension / N. Gorshunova, N. Medvedev, D. Ukraintseva et al. // Advances in gerontology. – 2011. – Vol. 24, № 3. – P. 478-484. 147. Investigating the relationship between changes in collagen fiber orientation during skin aging and collagen/water interactions by polarized-FTIR microimaging / C. Eklouh-Molinier, T.Happillon, N. Bouland et al. // The Analyst. – 2015. – Vol. 140, № 18. – P. 6260-6268. 148. Iturria-Medina Y. On the central role of brain connectivity in neurodegenerative disease progression / Y. Iturria-Medina, A. Evans // Frontiers in aging neuroscience. – 2015. – Vol. 7. – P. 90. 149. Ferguson J. Photodermatology / J. Ferguson, JS Dover. – London: Manson Publishing, 2006. – 160 p. 150. Jagged1expression regulated by Notch3 and Wnt/β-Catenin signaling pathways in ovarian cancer / X. Chen, A. Stoeck, S. Lee et al. // Oncotarget. – 2010. – Vol. 1, № 3. – P. 210–218. 151. Jagged1 is the pathological link between Wnt and Notch pathways in colorectal cancer / V. Rodilla, A. Villanueva, A. Obrador-Hevia et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2009. – Vol. 106, № 15. – P. 6315–6320. 135 152. Jee T. Skin viscoelasticity studied in vitro by microprobe–based techniques / T. Jee, K. Komvopoulos // J. Biomech. – 2014. – Vol. 47, № 2. – P. 553–559. 153. Jenkins G. Molecular mechanisms of skin ageing / G. Jenkins // Mechanisms of Ageing and Development. – 2002. – Vol. 123. – P. 801–810. 154. Kim J.H. Adipose-derived stem cells as a new therapeutic modality for ageing skin / J.H Kim, M. Jung // Exp. Dermatol. – 2011. – Vol. 20. – P. 383-387. 155. Knockdown of moesin expression accelerates cellular senescence of human dermal microvascular endothelial cells / J. Lee, J. Yoo, S. Oh et al. // Yonsei medical journal. – 2010. – Vol. 51, № 3. – P. 438–447. 156. Kopan R. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism / R. Kopan, M. Ilagan // Cell. – 2009. – Vol. 137, № 2. – P. 216–233. 157. Kroker A. p21 exploits residue Tyr151 as a tether for high affinity PCNA binding / A. Kroker, J. Bruning // Biochemistry. – 2015. – Vol. 54, № 22. – P. 3483-3493. 158. Ksiazek K. Mechanisms and medical implications of replicative senescence / K. Ksiazek, J. Trómińska-Starczyńska, J. Witowski // Polskie Archiwum Medycyny Wewnętrznej. – 2005. – Vol. 114, № 3. – P. 918-923. 159. Kubota S. CCN family proteins and angiogenesis: from embryo to adulthood / S. Kubota, M. Takigawa // Angiogenesis. – 2007. – Vol. 10, № 1. – P. 1–11. 160. Kular J. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering / J. Kular, S. Basu, R. Sharma // Journal of tissue engineering. – 2014. – Vol. 5. – P. 204 161. Kume T. Ligand-dependent Notch signaling in vascular formation / T. Kume // Advances in experimental medicine and biology. – 2012. – Vol. 727. – P. 210–222. 162. Langerhans cells favor skin flora tolerance through limited presentation of bacterial antigens and induction of regulatory T cells / A. van der Aar, D. Picavet, F. Muller et al. // The Journal of investigative dermatology. – 2013. – Vol. 133, № 3. – P. 1240-1249. 163. Libertini G. Non-programmed versus programmed aging paradigm / G. Libertini // Current aging science. – 2015. – Vol. 8, № 1. – P. 56-68. 136 164. LeBrasseur N. Two VEGFs for big or branchy vessels / N. LeBrasseur // The Journal of Cell Biology. – 2005. – Vol. 169, № 4. – P. 549. 165. Long-term results for children with high-risk neuroblastoma treated on a randomized trial of myeloablative therapy followed by 13-cis-retinoic acid: a children’s oncology group study / K. Matthay, C. Reynolds, R. Seeger et al. // Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. – 2009. – Vol. 27, № 7. – P. 1007–1013. 166. Maintenance of hormone responsiveness in luminal breast cancers by suppression of Notch / J. Haughian, M. Pinto, J. Harrell et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2012. – Vol. 109, № 8. – P. 2742–2747. 167. Mammone T. Apoptotic cell death increases with senescence in normal human dermal fibroblast cultures / T. Mammone, D. Gan, R. Foyouzi–Youssefi // Cell. Biol. Int. – 2006. – Vol. 30. – P. 903–909. 168. Matrix Metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model / J. Fang, Y.Shing, D. Wiederschain et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2000. – Vol. 97, № 8. – P. 3884–3889. 169. Merkel cell carcinoma experience in a reference medical center / F. RoeschDietlen, R. Devezé-Bocardi, I. Ruiz-Juárez et al. // Revista medica del Instituto Mexicano del Seguro Social. – 2013. – Vol. 51, № 6. – P. 696-699. 170. Mice lacking the vascular endothelial growth factor-B gene (Vegfb) have smaller hearts, dysfunctional coronary vasculature, and impaired recovery from cardiac ischemia / D. Bellomo, J. Headrick, G. Silins et al. // Circulation research. – 2000. – Vol. 86, № 2. – P. E29–E35. 171. Mineo A. Development of an artificial dermis composed of hyaluronic acid and collagen / A. Mineo, R. Suzuki, Y. Kuroyanagi // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. – 2013. – Vol. 24, № 6. – P. 726–740. 137 172. Moleirinho S. The angiomotins--from discovery to function / S. Moleirinho, W. Guerrant, J. Kissil // FEBS letters. – 2014. – Vol. 588, № 16.–P. 2693–2703. 173. Negative regulators of vessel patterning / S. Suchting, C. Freitas, F. le Noble et al. // Novartis Foundation symposium. – 2007. – Vol. 283. – P. 77–80; discussion P. 80–86, P. 238–241. 174. Neuronal FLT1 receptor and its selective ligand VEGF-B protect against retrograde degeneration of sensory neurons / J. Dhondt, E. Peeraer, A. Verheyen et al. // FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. – 2011. – Vol. 25, № 5. – P. 1461–1473. 175. Newman P. Signal transduction pathways mediated by PECAM-1: new roles for an old molecule in platelet and vascular cell biology / P. Newman, D. Newman // Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. – 2003. – Vol. 23, № 6. – P. 953964. 176. NF-κB non-cell-autonomously regulates cancer stem cell populations in the basal-like breast cancer subtype / M. Yamamoto, Y. Taguchi, T. Ito-Kureha et al. // Nature communications. – 2013. – Vol. 4. – P. 2299. 177. Niessen K. Notch signaling in the developing cardiovascular system / K. Niessen, A. Karsan // American journal of physiology. Cell physiology. – 2007. – Vol. 293, № 1. – P. 1–11. 178. Nikolakis G. Skin mirrors human aging / G. Nikolakis, E. Makrantonaki, C. Zouboulis // Hormone molecular biology and clinical investigation. – 2013. – Vol. 16, № 1. – P. 13-28. 179. Nkengne A. Aging and facial changes-documenting clinical signs, part 1: clinical changes of the aging face / A. Nkengne, C. Bertin // Skinmed. – 2012. – Vol. 5, № 1. – P. 284-289. 180. No evidence for a functional role of bi-directional Notch signaling during angiogenesis / S. Liebler, A. Feldner, M. Adam et al. //PLoS One. – 2012. – e53074. 138 181. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGFVEGFR2 signalling / R. Benedito, S. Rocha, M. Woeste et al. // Nature. – 2012. – Vol. 484, № 7392. – P.110–114. 182. Notch signaling and diseases: an evolutionary journey from a simple beginning to complex outcomes / C. Talora, A. Campese, D. Bellavia et al. // Biochimica et biophysica acta. – 2008. – Vol. 1782, № 9. – P. 489–497. 183. Notch signaling regulates the lifespan of vascular endothelial cells via a p16dependent pathway / Y. Yoshida, Y. Hayashi, M. Suda et al. // PloS one. – 2014. – Vol. 9, № 6. – P. e100359. 184. Novel pathogenic mutations and skin biopsy analysis in Knobloch syndrome / O. Suzuki, E. Kague, K. Bagatini et al. // Molecular vision. – 2009. – Vol. 15. – P. 801-809. 185. Nuclear and membrane expression of the angiogenesis regulator Delta-like ligand 4 (DLL4) in normal and malignant human tissues / J. Martinez, M. Müller, H. Turley et al. // Histopathology. – 2009. – Vol. 54, № 5. – P. 598–606. 186. Nucleolin is a receptor that mediates antiangiogenic and antitumor activity of endostatin / H. Shi,Y. Huang, H. Zhou et al. // Blood. – 2007. – Vol. 110, № 8. – P. 2899–2906. 187. Park D. Aging / D. Park, S. Yeo // Korean Journal of Audiology. – 2013. – Vol. 17, № 2. – P. 39. 188. Park S. PECAM-1 isoforms, eNOS and endoglin axis in regulation of angiogenesis / S. Park, C. Sorenson, N. Sheibani // Clinical science (London, England: 1979). – 2015. – Vol. 129, № 3. – P. 217-234. 189. Perbal B. The CCN3 protein and cancer / B. Perbal // Advances in experimental medicine and biology. – 2006. – Vol. 587. – P. 23–40. 190. Perch liver reaction to Triaenophorus nodulosus plerocercoids with an emphasis on piscidins 3, 4 and proliferative cell nuclear antigen (PCNA) expression / B. Dezfuli, L. Giari, M. Lorenzoni et al. // Veterinary parasitology. – 2014. – Vol. 200, № 1-2. – P. 104-110. 139 191. Phosphorylation of angiomotin by Lats1/2 kinases inhibits F-actin binding, cell migration, and angiogenesis / X. Dai, P. She, F. Chi et al. // The Journal of biological chemistry. – 2013. – Vol. 288, № 47. – P. 34041–34051. 192. Photoaging-associated changes in epidermal proliferative cell fractions in vivo / Oh Kwon, H. Yoo, J. Hyun et al. // Archives of dermatological research. – 2008. – Vol. 300, № 1. – P. 47-52. 193. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis / Sang Hun Lee, DongjunJeong, Yong-Seok Han et al. // Annals of surgical treatment and research. – 2015. – Vol. 89, № 1. – P. – 1-8. 194. Prabhakar N. Adaptive and maladaptive cardiorespiratory responses to continuous and intermittent hypoxia mediated by hypoxia-inducible factors 1 and 2 / N. Prabhakar, G. Semenza // Physiological reviews. – 2012. – Vol. 92, № 3. – P. 967–1003. 195. Prikhnenko S. Polycomponent mesotherapy formulations for the treatment of skin aging and improvement of skin quality / S. Prikhnenko // Clinical, cosmetic and investigational dermatology. – 2015. – Vol. 8. – P. 151-157. 196. Prives C. The p21 and PCNA partnership: a new twist for an old plot / C. Prives, V. Gottifredi // Cell Cycle. – 2008. – Vol. 7. – P. 3840–3846. 197. Privratsky J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity / J. Privratsky, P. Newman // Cell and tissue research. – 2014. – Vol. 355, № 3. – P. 607-619. 198. Prognostic values of VEGF and endostatin with malignant pleural effusions in patients with lung cancer / Y. Zhang, Li-Ke Yu, Guo-Jun Lu et al. // Asian Pacific journal of cancer prevention: APJCP. – 2014. – Vol. 15, № 19. – P. 8435-8440. 199. Proinflammatory cytokines, aging, and age-related diseases / M. Michaud, L. Balardy, G. Moulis et al. // Journal of the American Medical Directors Association. – 2013. Vol. 14, № 12. – P. 877-882. 140 200. Proliferation markers and survival in early breast cancer: a systematic review and meta-analysis of 85 studies in 32,825 patients / R. Stuart-Harris, C. Caldas, S. Pinder et al. // Breast (Edinburgh, Scotland). – 2008. – Vol. 17, № 4. – P. 323-334. 201. Proviral rearrangements and overexpression of a new cellular gene (nov) in myeloblastosis-associated virus type 1-induced nephroblastomas / V. Joliot, C. Martinerie, G. Dambrine et al. // Molecular and cellular biology. – 1992. – Vol. 1, № 1. – P. 10–21. 202. Quantitative changes of the capillary bed in aging human skin / D. Vybohova, K. Adamicova, Y. Mellova et al. // Histol. Histopathol. – 2012. – Vol. 27, № 7. – P. 961–967. 203. Quatresooz P. Immunohistochemical clues at aging of the skin microvascular unit / P. Quatresooz, G. E. Pierard // J. Cutan. Pathol. – 2009. – Vol. 36, № 1. – P. 39–43. 204. Radtke F. The role of Notch in tumorigenesis: oncogene or tumour suppressor? / F. Radtke, K. Raj // Nature reviews. Cancer. – 2003. – Vol. 3, № 10. – P. 756–767. 205. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain / F. Xing, A. Kobayashi, H. Okuda et al. // EMBO molecular medicine. – 2013. – Vol. 5, № 3. – P. 384–396. 206. Recombinant human endostatin inhibits adjuvant arthritis by down-regulating VEGF expression and suppression of TNF-α, IL-1β production / W. Hu, L. Xia, F. Chen et al. // Inflammation research: official journal of the European Histamine Research Society. – 2012. – Vol. 61, № 8. – P. 827-835. 207. Reed M. Impaired migration, integrin function, and actin cytoskeletal organization in dermal fibroblasts from a subset of aged human donors / M. Reed, N. Ferara, R. Vernon // Mechanisms of ageing and development. – 2001. – Vol. 122, № 11. – P. 1203-1220. 208. Regulatory mechanisms of anthrax toxin receptor 1-dependent vascular and connective tissue homeostasis / T. Besschetnova, T. Ichimura, N.Katebi et al. // Matrix biology: journal of the international Society for Matrix Biology. – 2015. – Vol. 42. – P. 56–73. 141 209. Risau W. Mechanisms of angiogenesis / W. Risau // Nature. – 1997. – Vol. 386, № 6626. – P. 671–674. 210. Role of estrogens in pathogenesis of age-related disease in women of menopausal age / L. Ratiani, G. Parkosadze, M. Cheishvili et al. // Georgian medical news. – 2012. – № 203. – P. 11-16. 211. Role of redox- and hormonal metabolism in the mechanisms of skin aging / K. Berianidze, A. Katsitadze, N. Jalaghania et al. // Georgian medical news. – 2014. – № 235. – P. 54-57. 212. Rolfe K. A review of fetal scarless healing / K. Rolfe, A. Grobbelaar // ISRN dermatology. – 2012. – Vol. 2012. – P. 698034. 213. Saito M. Induction of tube formation by angiopoietin-1 in endothelial cell/fibroblast co-culture is dependent on endogenous VEGF / M. Saito, M. Hamasaki, M. Shibuya // Cancer science. – 2003. – Vol. 94, № 9. – P. 782–790. 214. Sawane M. Ultraviolet light-induced changes of lymphatic and blood vasculature in skin and their molecular mechanisms / M. Sawane, K. Kajiya // Experimental dermatology. – 2012. – Vol. 21 Suppl 1. – P. 22–25. 215. Scovassi A. Analysis of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) associated with DNA / A. Scovassi, E. Prosperi // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). – 2006. – Vol. 314. – P. 457-475. 216. Seidal T. Interpretation and quantification of immunostains / Т. Seidal, A. Balaton, H. Battifora // Am J Surg Pathol. – 2001. – Vol. 25, № 9. – P. 1204-1207 217. Semenza G. Hypoxia-inducible factors: mediators of cancer progression and targets for cancer therapy / G. Semenza // Trends in pharmacological sciences. – 2012. – Vol. 33, № 4. – P. 207–214. 218. Senescent fibroblasts in melanoma initiation and progression: an integrated theoretical, experimental, and clinical approach / E. Kim, V. Rebecca, I. Rebecca et al. // Cancer research. – 2013. – Vol. 73, № 23. – P. 6874-6885. 142 219. Serum endostatin is a genetically determined predictor of survival in pulmonary arterial hypertension / R. Damico, T. Kolb, L. Valera et al. // American journal of respiratory and critical care medicine. – 2015. – Vol. 191, № 2. – P. 208–218. 220. Shibuya M. Involvement of Flt-1 (VEGF receptor-1) in cancer and preeclampsia / M. Shibuya // Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and biological sciences. – 2011. – Vol. 87, № 4. – P. 167–178. 221. Shibuya M. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis / M. Shibuya, L. Claesson-Welsh // Experimental cell research. – 2006. – Vol. 312, № 5. – P.549–560. 222. Shibuya M. Structure and dual function of vascular endothelial growth factor receptor-1 (Flt-1) / M. Shibuya // The international journal of biochemistry & cell biology. – 2001. – Vol. 33, № 4. – P. 409–420. 223. Shibuya M. Vascular endothelial growth factor and its receptor system: physiological functions in angiogenesis and pathological roles in various diseases / M. Shibuya // Journal of biochemistry. – 2013. – Vol. 153, № 1. – P. 13–19. 224. Shi-Wen X. Regulation and function of onnective tissue growth factor/CCN2 in tissue repair, scarring and fibrosis / X. Shi-Wen, A. Leask, D. Abraham // Cytokine & growth factor reviews. – 2008. – Vol. 19, № 2. – P. 133–144. 225. Shokhirev M. Effects of extrinsic mortality on the evolution of aging: a stochastic modeling approach / M. Shokhirev, A. Johnson // PloS one. – 2014. – Vol. 9, № 1. – P. e86602. 226. Short B. VEGF tips its hand in angiogenesis / B. Short // The Journal of cell biology. – 2015. – Vol. 209, № 4. – P. 474. 227. Signaling of vascular endothelial growth factor receptor-1 tyrosine kinase promotes rheumatoid arthritis through activation of monocytes/macrophages / M. Murakami, S. Iwai, S. Hiratsuka et al. // Blood. – 2006. – Vol. 108, № 6. – P. 1849–1856. 143 228. Small-molecule targeting of proliferating cell nuclear antigen chromatin association inhibits tumor cell growth / Z. Tan, M. Wortman, K. Dillehay et al. // Molecular pharmacology. – 2012. – Vol. 81, № 6. – P. 811-819. 229. Soluble Notch ligand and receptor peptides act antagonistically during angiogenesis / R. Klose, C. Berger, I. Mol et al. // Cardiovascular research. – 2015. – Vol. 107, № 1. – P. 153-163. 230. Starke R. Endothelial von Willebrand factor regulates angiogenesis / R. Starke, F. Ferraro, K. Paschalaki // Blood. – 2011. – Vol. 117, № 3. – P. 1071-1080. 231. Stiffening of human skin fibroblasts with age / C. Schulze, F. Wetzel, T. Kueper et al. // Biophysical journal. – 2010. – Vol. 99, № 8. – P. 2434-2442. 232. Structural and biochemical studies of human proliferating cell nuclear antigen complexes provide a rationale for cyclin association and inhibitor design / G. Kontopidis, S. Wu, D. Zheleva et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2005. – Vol. 102, № 6. – P. 1871-1876. 233. Strzalka W. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a key factor in DNA replication and cell cycle regulation / W. Strzalka, А. Ziemienowicz // Annals of botany. – 2011. – Vol. 107, № 7. – P. 1127-1140. 234. Suppression of colon cancer metastasis by aes through inhibition of Notch signaling / M. Sonoshita, M. Aoki, H. Fuwa et al. // Cancer cell. – 2011. – Vol. 19, № 1. – P. 125–137. 235. Takahashi H. The Vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGF receptor system and its role under physiological and pathological conditions / H. Takahashi, M. Shibuya // Clinical science. – 2005. – Vol. 109, № 3. – P. 227-241. 236. Targeting the Notch ligand JAGGED1 in both tumor cells and stroma in ovarian cancer / A. Steg, A. Katre, B. Goodman et al. // Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. – 2011. – Vol. 17, № 17. – P. 5674–5685. 144 237. The Aging Lung: Clinical and Imaging Findings and the Fringe of Physiological State / T. Schröder, B. Storbeck, K. Rabe et al. // RoFo: Fortschritte auf dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. – 2015. – Vol. 187, № 6. – P. 430-439. 238. The Amot/Patj/Syx signaling complex spatially controls RhoA GTPase activity in migrating endothelial cells / M. Ernkvist, N. Luna Persson, S. Audebert et al. // Blood. – 2009. – Vol. 113, № 1 – P. 244–253. 239. The CCN proteins: important signaling mediators in stem cell differentiation and tumorigenesis / G. Zuo, C. Kohl, B. He et al. // Histology and histopathology. – 2010. – Vol. 25, № 6. – P. 795–806. 240. The CD46-Jagged1 interaction is critical for human TH1 immunity / G. Le Friec, D. Sheppard, P. Whiteman et al. // Nature immunology. – 2012. – Vol. 13, № 12. – P. 1213–1221. 241. The complex mural cell: pericyte function in health and disease / C. Van Dijk, F. Nieuweboer, J. Pei et al. // International journal of cardiology. – 2015. – Vol. 190. – P. 75–89. 242. The effect of chronological age on the inflammatory response of human fibroblasts / J. Wolf, B. Weinberger, C. Arnold et al. // Experimental Gerontology. – 2012. – Vol. 47, № 9. – P. 749-753. 243. The hallmarks of aging / López–Otín Carlos, Partridge Linda, Serrano Manuelet al. // Cell. – 2013. – Vol. 6. – P. 153. 244. The hormonal peptide elabela guides angioblasts to the midline during vasculogenesis / C. Helker, A. Schuermann, C. Pollmann et al. // eLife. – 2015. – Vol. 4. – P. e06726. 245. The gene expression profile induced by Wnt 3a in NIH 3T3 fibroblasts / S. Chen, S. McLean, D. Carter et al // J. Cell. Commun. Signal. – 2007. – Vol. 1. – P. 175-183. 246. The Notch ligand Delta-like 4 (DLL4) as a target in angiogenesis-based cancer therapy? / M. Brzozowa, R. Wojnicz, G. Kowalczyk-Ziomek et al. // Contemporary oncology. – 2013. – Vol. 1, № 3. – P. 234–237. 145 247. The Notch ligand JAGGED1 as a target for anti-tumor therapy / D. Li, M. Masiero, A. Banham et al. // Frontiers in oncology. – 2014. – Vol. 4. – P. 254. 248. The Notch Pathway is a critical regulator of angiogenesis in a skin model of ischemia / O. Abbas, H. Borman, Y. Terzi et al. // Vascular medicine. – 2015. – Vol. 20, № 3. – P. 205–211. 249. The p130 isoform of angiomotin is required for Yap-mediated hepatic epithelial cell proliferation and tumorigenesis / C. Yi, Z. Shen, A. Stemmer-Rachamimov et al. // Science signaling. – 2013. – Vol. 6, № 291. – P. 77. 250. The role of Notch in the cardiovascular system: potential adverse effects of investigational Notch inhibitors / P. Rizzo, D. Mele, C. Caliceti et al. // Frontiers in oncology. – 2014. – Vol. 4. – P. 384. 251. Transient repetitive exposure to low level light therapy enhances collateral blood vessel growth in the ischemic hindlimb of the tight skin mouse / M. Zaidi, J. Krolikowki, D. Jones et al. // Photochemistry and photobiology. – 2013. – Vol. 89, № 3. – P. 709–713. 252. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging Notch signaling in bone cells / N. Sethi, X. Dai, C. Winter et al. // Cancer cell. – 2011. – Vol. 19, № 2. – P. 192–205. 253. Tumor refractoriness to endostatin anti-angiogenesis is associated with the recruitment of CD11b+Gr1+ myeloid cells and inflammatory cytokines / H. Zhang, Z. Wang, Q. Peng et al. // Tumori. – 2013. – Vol. 99. – P. 723-733. 254. Up-regulation of Delta-like 4 ligand in human tumor vasculature and the role of basal expression in endothelial cell function / N. Patel, J. Li, D. Generali et al. // Cancer research. – 2005. – Vol. 65, № 19 – P. 8690–8697. 255. Varani J. Fibroblast aging: intrinsic and extrinsic factors / J. Varani// Drug Discov Today Ther. Strateg. – 2010. – Vol. 7. – P. 65–70. 256. Vascular endothelial growth factor induces expression of connective tissue growth factor via KDR, Flt1, and phosphatidylinositol 3-kinase-Akt-dependent 146 pathways in retinal vascular cells / K. Suzuma, K. Naruse, I. Suzuma et al. // The Journal of biological chemistry. – 2000. – Vol. 275, № 52. – P. 40725–40731. 257. VEGFR3 does not sustain retinal angiogenesis without VEGFR2 / G. Zarkada, K. Heinolainen, T. Makinen et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2015. – Vol. 112, № 3. – P. 761–766. 258. Vereshchaka V. Age–dependent state of the skin blood vessels / V. Vereshchaka // Fiziol. Zh. – 2007. – Vol. 53, № 5. – P. 75–80. 259. Wang W. Angiomotin-like proteins associate with and negatively regulate YAP1 / W. Wang, J. Huang, J. Chen // The Journal of biological chemistry. – 2011. – Vol. 286, № 6. – P. 4364–4370. 260. White-Chu E. Dry skin in the elderly: complexities of a common problem / E. White-Chu, M. Reddy // Clinics in dermatology. – 2011. – Vol. 28, № 1. – P. 37-42. 261. Wickström S. Endostatin signaling and regulation of endothelial cell-matrix interactions / S. Wickström, K. Alitalo, J. Keski-Oja // Advances in cancer research. – 2005. – Vol. 94. – P. 197–229. 262. WISP genes are members of the connective tissue growth factor family that are up-regulated in Wnt-1-transformed cells and aberrantly expressed in human colon tumors / D. Pennica, T. Swanson, J. Welsh et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1998. – Vol. 95, № 25. – P. 14717–14722. 263. Woodfin A. PECAM-1: a multi-functional molecule in inflammation and vascular biology / A. Woodfin, M. Voisin, S. Nourshargh // Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. – 2007. – Vol. 27, № 12. – P. 2514-2523. 264. Yamaguchi Y. A peptide derived from endostatin ameliorates organ fibrosis / Y. Yamaguchi, T. Takihara, R. Chambers // Science translational medicine. – 2012. – Vol. 4, № 136. – P. 136. 265. Yamaguchi Y. Role of endostatin in fibroproliferative disorders.-as a candidate for anti-fibrosis therapy / Y. Yamaguchi, C. Feghali-Bostwick // Nihon Rinshō 147 Men'eki Gakkai kaishi = Japanese journal of clinical immunology. – 2013. – Vol. 36, № 6. – P. 452-458. 266. Yes-Associated Protein Up-regulates Jagged-1 and Activates the NOTCH Pathway in Human Hepatocellular Carcinoma / D. Tschaharganeh, X. Chen, P. Chen et al. // Gastroenterology. – 2013. – Vol. 144, № 7. – P. 1530-1542.e12. 267. Yoshida R. MHC class I recognition by monocyte-/macrophage-specific receptors // R. Yoshida // Advances in immunology. – 2014. – Vol. 124. – P. 207247. 268. Zeng Q. The emerging role of the hippo pathway in cell contact inhibition, organ size control, and cancer development in mammals / Q. Zeng, W. Hong // Cancer cell. – 2008. – Vol. 13, № 3. – P. 188–192. 148 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА Рисунок 1 – Кровеносные сосуды со слабой (А), средней (Б) и сильной (В) степенью окрашивания на VEGF в дерме плодов 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х. …………………………………………………………………………………………56 Рисунок 2 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на VEGF в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х. ………57 Рисунок 3 – Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на VEGF в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 1 и 2 – p<0,001; между группами 2 и 3 – p<0,01. Отличия между группами 3 и 4, группами 4 и 5 недостоверны (критерий χ2)……………………………………………………………………………………….58 Рисунок 4 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на VEGF в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х…………58 Рисунок 5 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и средней (Б) степенью окрашивания на VEGF в дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет (4-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х…….…...60 Рисунок 6 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на VEGF в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х…….…...61 Рисунок 7 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и средней (Б) степенью окрашивания на Dll4 в дерме плодов человека на сроке 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Dll4. Увеличение 40х. ………………………………………………………………………63 149 Рисунок 8 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и средней (Б) степенью окрашивания на Dll4 в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Dll4. Увеличение 40х……….…...64 Рисунок 9 – Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на Dll4 в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 1 и 2 – p<0,01; между группами 2 и 3 – p<0,01; между группами 3 и 4 – p<0,01 (критерий χ2). Отличия между группами 4 и 5 статистически недостоверны (критерий χ2)…………………………………………64 Рисунок 10 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Dll4 в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Dll4. Увеличение 40х……………65 Рисунок 11 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Dll4 в дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет (4-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Dll4. Увеличение 40х……….…...66 Рисунок 12 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Dll4 в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Dll4. Увеличение 40х………........67 Рисунок 13 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и средней (Б) степенью окрашивания на Jag-1 в дерме плодов на сроке 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Jag-1. Увеличение 40х……………………………………………………………………………………...69 Рисунок 14 – Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на Jag-1 в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 2 и 3 – p<0,01; между группами 3 и 4 – p<0,001. Отличия между группами 1 и 2, группами 4 и 5 статистически недостоверны (критерий χ2)……………………………………………………………………...……70 Рисунок 15 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Jag-1 в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Jag-1. Увеличение 40х…………..71 150 Рисунок 16 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Jag-1 в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Jag-1. Увеличение 40х…………72 Рисунок 17 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на Jag-1 в дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет (4-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Jag-1. Увеличение 40х………......73 Рисунок 18 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и средней (Б) степенью окрашивания на Jag-1 в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на Jag-1. Увеличение 40х………..…74 Рисунок 19 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на ангиомотин в дерме плодов на сроке 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на ангиомотин. Увеличение 40х………………………………………………………………………..76 Рисунок 20 – Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на ангиомотин в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 2 и 3 – p<0,01; между группами 4 и 5 – p<0,001 (критерий χ2). Отличия между группами 1 и 2, группами 3 и 4 статистически недостоверны (критерий χ2)………………………………………...77 Рисунок 21 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на ангиомотин в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на ангиомотин. Увеличение 40х……………………………………………………………………………..………78 Рисунок 22 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на ангиомотин в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на ангиомотин. Увеличение 40х……………………………………………………………………………………..78 Рисунок 23 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на ангиомотин в дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет (4-я 151 группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на ангиомотин. Увеличение 40х……………………………………………………………………………………...80 Рисунок 24 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на ангиомотин в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на ангиомотин. Увеличение 40х…………………………………………………………………………………….81 Рисунок 25 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме плодов 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х…………………………………………………………………………………….83 Рисунок 26 – Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на эндостатин в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Отличия между группами 1 и 2 статистически недостоверны (критерий χ 2). Достоверность отличий между группами 2 и 3 – p<0,001; между группами 3 и 4 – p<0,001; между группами 4 и 5 – p<0,01 (критерий χ2)…………………………….84 Рисунок 27 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х……………………………………………………………………………………...84 Рисунок 28 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х……………………………………………………………………………………...86 Рисунок 29 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме людей в возрасте от 41 до 60 лет (4-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х……………………………………………………………………………………...87 Рисунок 30 – Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). 152 Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х……………………………………………………………………………………..88 Рисунок 31 – Кровеносные сосуды дермы, позитивные к CD31 в коже плода на сроке беременности 24 недели (А) и человека в возрасте 3-х лет (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на CD31. Увеличение 40х……………………..90 Рисунок 32 – Кровеносные сосуды дермы, позитивные к CD31 в коже человека в возрасте 30 лет (А) и 58 лет (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на CD31. Увеличение 40х………………………………………………………………..91 Рисунок 33 – Численность CD31-позитивных кровеносных сосудов в дерме людей различного возраста (М±m). p<0,001 – однофакторный дисперсионный анализ………………………………………………………………………………….92 Рисунок 34 – Фибробласты дермы плода на 24-й неделе беременности (А) и человека в возрасте 20 лет (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 40х……………………………………………………………………………………..93 Рисунок 35 – Численность фибробластов в дерме людей различного возраста (М±m). p<0,001 – однофакторный дисперсионный анализ………………………..94 Рисунок 36 – Фибробласты дермы человека в возрасте 28 лет (А), 55 лет (Б) и 78 лет (В). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 40х..…………………..95 Рисунок 37 – Процент фибробластов дермы с положительным окрашиванием на CTGF (М±m). p<0,001 – однофакторный дисперсионный анализ…………………97 Рисунок 38 – CТGF-положительные фибробласты и кровеносные сосуды дермы плода на 28-й неделе беременности (А) и человека в возрасте 1 год (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на CTGF. Увеличение 40х……..……………..98 Рисунок 39 – CTGF-положительные фибробласты и кровеносные сосуды дермы человека в возрасте 50 лет (А) и 76 лет (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на CTGF. Увеличение 40х….....................................................................99 Рисунок 40 – Процент кровеносных сосудов дермы, содержащих клетки с положительным окрашиванием на CTGF (М±m). p<0,001 – однофакторный дисперсионный анализ………………………………………………………………100 153 Рисунок 41 – Рисунок 41 – CTGF-положительные фибробласты и кровеносные сосуды дермы человека в возрасте 35 лет (А) и 57 лет (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на CTGF. Увеличение 40х…………………....101 Рисунок 42 – Процентное соотношение PCNA–положительных фибробластов к общему числу фибробластов в дерме людей различного возраста (М±m). p<0,001 – однофакторный дисперсионный анализ………………………………………..103 Рисунок 43 – PCNA-положительные фибробласты в дерме плода на сроке беременности 24 недели (А) и человека в возрасте 1 год (Б). Непрямая иммуногистохимическая реакция на PCNA. Увеличение 40х…………………..104 Рисунок 44 – PCNA-положительные фибробласты в дерме человека в возрасте 35 лет (А), 53 года (Б) и 80 лет (В). Непрямая иммуногистохимическая реакция на PCNA. Увеличение 40х……………………………………………………………..105
