РОМАНОВА НИНА ВЛАДИМИРОВНА ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ СЕКРЕЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА

РОМАНОВА НИНА ВЛАДИМИРОВНА
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ СЕКРЕЦИИ
РЕКОМБИНАНТНОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА
УРОКИНАЗНОГО ТИПА КЛЕТКАМИ ДРОЖЖЕЙ
03.00.02. - биофизика
автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Москва 2004
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института
экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ на кафедре молекулярной
биофизики ФМБФ МФТИ (ГУ).
Научный руководитель:
кандидат биологических наук
Михаил Олегович Агафонов
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук
Татьяна Сергеевна Калебина
кандидат физико-математических наук
Роберт Шавлович Бибилашвили
Ведущая организация:
ФГУП
ГосНИИ
«Генетика»
(Государственный
научно-исследовательский
институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов)
Защита состоится
2004 г. в
час. 00 мин. на заседании диссертационного
совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700,
Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.
Автореферат разослан «
»
2004 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат физико-математических наук
В.Е. Брагин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Введение.
Актуальность
проблемы.
Дрожжи
являются
удобным
модельным объектом для изучения секреторного аппарата эукариотической
клетки, поскольку позволяют эффективно использовать весь арсенал методов
классической и молекулярной генетики. Сходство организации секреторного
пути у разных эукариот позволяет использовать дрожжи в качестве организма
хозяина
для
экспрессии
секреторных
белков
других
эукариотических
организмов. При этом белок должен приобрести правильную конформацию и
различные модификации. Для достижения более высоких выходов чужеродных
белков исследователи стали использовать в качестве организмов-хозяев не
только традиционный
объект молекулярно-генетических
Saccharomyces cerevisiae, но и другие
исследований
виды дрожжей,
в том
-
числе
метилотрофные дрожжи Hansenula polymorpha. Однако, многие процессы,
происходящие
в секреторном
пути, не консервативны
и
существенно
дивергировали у разных организмов в ходе эволюции. Очевидно, что с этим
связано то, что многие белки высших эукариот неспособны эффективно
секретироваться
клетками дрожжей.
Одним
из таких
белков
является
человеческий активатор плазминогена урокиназного типа (иРА). Изучение
факторов, влияющих на эффективность секреции рекомбинантных белков
клетками
дрожжей,
может
дать
ключ
к
пониманию
эволюционных
особенностей организации дрожжевого секреторного аппарата, что, в свою
очередь, позволит направленно менять свойства реципиентных штаммов и
делать
их
пригодными
для
получения
активных
и
правильно
модифицированных белковых продуктов.
Цели и задачи исследования. Данная работа была направлена на
изучение эволюционных особенностей дрожжевого секреторного аппарата,
обуславливающих низкую эффективность секреции белков высших эукариот
клетками
дрожжей.
В
экспериментальные задачи:
связи
с
этим
были
поставлены
следующие
1) Выяснить причины неэффективной секреции иРА клетками дрожжей.
2) Определить, какие домены иРА определяют низкую эффективность
секреции.
3) Изучить механизмы, приводящие к увеличению эффективности секреции
иРА в клетках мутантов ори24, ret 1-27 wpmtl H. polymorpha.
Научная новизна. Несмотря на то, что ранее предпринимались попытки
получить дрожжевые штаммы продуценты секретируемого иРА, высокого
уровня секреции этого белка клетками дрожжей достичь не удавалось. В
данной работе впервые было показано, что это ограничение уровня секреции
связано не с недостаточным уровнем синтеза иРА, а с тем, что лишь небольшая
часть синтезирующегося белка преодолевает дрожжевой секреторный аппарат
и секретируется. Было показано, что uРА плохо секретируется клетками
дрожжей по причине неэффективного сворачивания в эндоплазматическом
ретикулуме, что
при
определенных условиях приводит к образованию
высокомолекулярных агрегатов этого белка. Было показано, что соотношение
белка в агрегированной и растворимой форме в клеточных лизатах зависит от
его способности приобретать правильную конформацию и секретироваться.
Это наблюдение было использовано для изучения причин увеличения уровня
секреции иРА у ряда мутантных штаммов и было продемонстрировано, что
мутации в генах OPU24, RET1 и PMTJ H. polymorpha приводят к улучшению
условий для правильного сворачивания иРА в дрожжевом ЭР, за счет чего
увеличивается эффективности секреции иРА.
Практическое значение работы. В диссертации были разработаны
подходы, позволяющие увеличить продукцию рекомбинантного активатора
плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей. Эти подходы могут быть
также использованы для увеличения продуктивности дрожжевых продуцентов
других рекомбинантных белков.
Апробация работы. Основные результаты, изложенные в диссертации,
докладывались и обсуждались на III съезде Вавиловского общества генетиков и
селекционеров (ВОГиС) (Москва, 2004), 8-ой Международной Пущинской
школе-конференции молодых ученых (Москва, 2004), III съезде Российского
Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), 2-ой Международной
конференции сообщества по изучению Hansemtlapolymorpha (Tenerife, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5
тезисных сообщений.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из разделов:
«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты»,
«Обсуждение»,
изложена на
«Заключение»,
«Выводы»,
страницах и включает
цитируемой литературы, содержащий
«Список
литературы».
рисунка,
Работа
таблиц и список
ссылок.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе применяли стандартные методы генетики дрожжей (Sherman et
al., 1986) и молекулярного клонирования (Sambrook et al., 1989); биохимические
методы, такие как электрофорез белков и иммуноблоттинг (Laemmli, 1970;
Towbin et al., 1979). В работе использовали штаммы дрожжей Н. polymorpha, из
коллекции лаборатории молекулярной генетики ИЭК РКНПК МЗ РФ и штамм
дрожжей S. cerevisiae YPH499 (МАТа Ieu2 his3 Iys2 ade2 trpl игаЗ) (Yoshida et
al., 1995). Активность uPA определяли фибринолитическим методом (Astrup et
al., 1952).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Зависимость эффективности секреции uPA от уровня экспрессии в
клетках Н.polymorpha
Для того чтобы обеспечить экспрессию и секрецию человеческого белка
uPA клетками дрожжей Н. polymorpha, использовали экспрессионную кассету
МОХ:иРА, которая включала в себя ORF, кодирующую uPA с дрожжевым
сигналом секреции, а также промотор гена МОХ и терминатор транскрипции.
При помощи подходов, разработанных ранее в лаборатории молекулярной
3
генетики РКНПК (Agaphonov et al., 1995; Agaphonov et al., 1999), был получен
набор штаммов, которые отличались друг от друга местом интеграции и
копийностью экспрессионной кассеты МОХ.иРА (таблица 1). Способность
штаммов продуцировать uРА оценивали по активности uРА в культуральной
среде и клеточных лизатах. В дополнение, количество иРА в клеточных лизатах
определяли методом иммуноблоттинга.
Анализ
штаммов,
несущих одну копию экспрессионной
кассеты,
интегрированную в различные локусы показал, что эффективность экспрессии
гибридного гена зависит от его положения в геноме. Способность штаммов
продуцировать иРА в случае интеграции экспрессионной кассеты МОХ.иРА в
локусы генов МОХ и LEU2 была практически одинакова. У штамма с
экспрессионной кассетой, интегрированной в теломерную область, активность
иРА в культуральной среде и в клеточных лизатах была заметно ниже по
сравнению со штаммами, несущими этот гибридный ген в локусах гена МОХ и
LEU2. Также было заметно снижено количество иРА в клеточных лизатах,
выявляемое
иммунологически.
Это
говорило
об
уменьшенном
уровне
экспрессии иРА при интеграции кассеты в теломерную область по сравнению с
уровнем экспрессии иРА в случае интеграции кассеты в локусы генов МОХ или
LEU2.
При анализе штаммов с разной копийностью интеграции наблюдалась
положительная корреляция количества иРА в клеточных лизатах с количеством
копий экспрессионной кассеты. Это свидетельствовало о том, что уровень
экспрессии гибридного гена увеличивается с увеличением количества его
копий в геноме. Одновременно с этим, увеличение копийности приводило к
снижению активности иРА как в культуральной среде, так и в клеточных
лизатах. Таким образом, увеличение уровня экспрессии с определенного
момента
приводило
к
значительному
накоплению
неактивного
белка
внутриклеточно и ингибированию его секреции. Такая тенденция наблюдалась
во всех штаммах, независимо от локуса интеграции.
4
2. Свойства секретируемого и внутриклеточного uРА
uPA,
обнаруживаемый
в
культуральной
среде,
мигрировал
при
электрофорезе в присутствии SDS в виде диффузного пятна (рисунок 1). После
обработки
эндогликозидазой
Н
(EndoH),
ферментом,
отщепляющим
N-
гликозидные цепи, это диффузное пятно конвертировалось в четкую полосу.
Это говорило о том, что N-гликозид в составе молекулы uРА при прохождении
аппарата Гольджи модифицируется добавлением «внешних» цепей, которые
могут сильно варьировать по размеру.
Таблица 1. Зависимость уровня секреции uРА от количества копий и локуса
интеграции экспрессионной кассеты МОХ:uРА.
* Данные сравнения фибринолитической активности в серии разведений. За 100%
принималась активность в препаратах штамма DLU/L, которая, исходя из сравнения с
препаратом uРА человека, составляла в расчете на мг клеточного белка примерно 10 ед в
случае препарата культуральной среды и 7 ед в случае препарата клеточного лизата
** Вычисление путем сравнения интенсивностей полосы 50кДА на иммуноблоттинге в
серии разведений. За 100% принималось количество белка в штамме DLU/L, которое по
результатам сравнения со стандартным препаратом рекомбинантного uРА. выделенного из
Е. coli, равнялось примерно 1,6 мкг на мг общего клеточного белка
5
uPA синтезируется в виде предшественника с м.в. 48кДа, который
состоит
из
трех
доменов
-
двух
N-концевых,
несущественных
для
энзиматической активности, и С-концевого, каталитического домена. Полоса
uPA
из
культуральной среды, обработанного EndoH,
мигрировала при
электрофорезе на уровне ЗОкДа. Концентрация белка в культуральной среде,
вычисленная по интенсивности этой полосы на иммуноблоте, составляла
примерно 0,15 мкг/мл, а активность около 14 ед/мл. Поскольку удельная
активность очищенного человеческого uPA составляет около 1,7x105 ед/мг, а
дрожжевая
N-гликозидная
цепь
в
некоторой
степени
ингибирует
фибринолитическую активность uPA (Wang et al., 2000), можно было
утверждать,
что
белок,
соответствующий
полосе
ЗОкДа,
обладает
фибринолитической активностью и образуется в результате отщепления Nконцевых доменов.
Анализ uPA, обнаруживаемого
внутриклеточно у штамма DLU/L,
показал, что этот белок образовывал высокомолекулярные агрегаты, поскольку
большая его часть оказывалась в осадке после центрифугирования осветленных
клеточных лизатов при 10 000 g в течение 10 минут (см. пункт 4). В отличие от
секретируемой формы, uPA, обнаруживаемый внутриклеточно, мигрировал при
электрофорезе четкой полосой, и его электрофоретическая подвижность лишь
ненамного возросла после обработки EndoH (рисунок 1). Это означало, что Nсвязанные гликозидные цепи молекул uPA, обнаруживаемого внутри клеток, не
получают модификаций, характерных для аппарата Гольджи, а значит, агрегаты
uPA образуются в ЭР. Однако это не означало, что они постоянно
локализованы в этом компартменте. Нельзя исключить, что в агрегированном
виде uPA проходит через аппарат Гольджи, а модификации гликозидов не
происходит из-за их экранирования в агрегатах. Более того, мы наблюдали
наличие продуктов протеолиза uPA в составе агрегатов, что указывало на то,
что агрегаты проходят компартменты, содержащие протеазы. ЭР, по-видимому,
содержит единственный протеолитический фермент - сигнальную пептидазу,
которая вряд ли может принимать участие в протеолизе агрегированной uPA.
6
Возможно, агрегаты в какой-то момент попадают в вакуоль - органеллу,
содержащую целый комплекс протеолитических ферментов.
Рисунок 1. Анализ методом иммуноблоттинга
с антителами к иРА культуральной среды и
осадочной фракции клеточного лизата
штамма DLU/L {Ieu2 mox::uPA TEL:[LEU2J).
1 - культуральная среда
2 - культуральная среда, обработанная EndoH
3 - осадочная фракция клеточного лизата
4 - осадочная фракция клеточного лизата,
обработанного EndoH.
3. Эффективность секреции uРА зависит от наличия в составе молекулы
N-концевых доменов и участка N-гликозилирования
В секреторном пути иРА модифицируется присоединением гликозидной
цепи к аспарагиновому остатку в 302 положении (рисунок 2). Замена этого
остатка
на
другой
приводит
к
нарушению
N-гликозилирования.
Мы
экспрессировали в клетках дрожжей Н. polymorpha под контролем промотора
МОХ варианты иРА, отличающиеся наличием участка N-гликозилирования и
N-концевых доменов. Вариант uPA-Q отличался от белка дикого типа (иРА)
аминокислотной заменой аспарагинового остатка на глутаминовый в 302
положении. Вариант uPA-С и uPA-CQ были лишены N-концевых доменов, при
этом вариант uPA-CQ также имел нарушенный участок N-гликозилирования.
Экспрессионные кассеты этих белков были интегрированы в одной копии в
локус МОХ. Количество uPA, uPA-Q, uPA-C и uPA-CQ в культуральной среде
сравнивали по активности и при помощи иммуноблоттинга (таблица 2).
Оказалось,
что
отсутствие
N-концевых
доменов
(вариант
uPA-C)
приводит к значительному увеличению секреции по сравнению с белком
дикого
типа.
Отсутствие
же
N-гликозилирования
наоборот
уменьшило
количество секретируемого белка - приблизительно в 3 раза при анализе
активности вариантов в культуральной среде. И эта разница оказалась даже
больше (примерно 7 раз) при сравнении вариантов uРА и uPA-Q в
культуральных средах
методом
7
анализа активности и иммунологического тестирования в жидкой среде могли
определяться тем, что дрожжевая N-гликозидная цепь способна снижать
удельную активность uРА в отношении высокомолекулярных субстратов
(Wang et al., 2000). Это должно приводить к занижению результатов оценки
количества гликозилированного варианта по активности. Поэтому можно
заключить, что для сравнения эффективности секреции гликозилированного и
негликозилированного
варианта
метод
иммуноблоттинга
является
более
адекватным.
Рисунок 2. Схематическое изображение вариантов uРА.
Обозначения: - участок активации иРА,
- N-гликозид,
аминокислотная замена, которая привела к нарушению N - гликозилирования uРА.
Таблица 2. Сравнение эффективности секреции различных вариантов uРА при
экспрессии в клетках дрожжей Н. polymorpha.
*Оценено сравнением интенсивности полос, соответствующих 30 кДа, на
иммуноблоте в серии разведений препаратов культуральной среды.
иРА, находящийся в культуральной среде, был обработан EndoH перед нанесением
на полиакриламидный гель.
8
Нарушение N-гликозилирования в варианте без N- концевых доменов
(uPA-CQ) также приводило к снижению секреции. В то же время уровень
секреции uPA-CQ был заметно выше уровня секреции нормального белка uРА.
Природа
негативного
влияния
нарушения
N-гликозилирования
на
эффективность секреции uРА, очевидно связана с важностью N-гликозидной
цепи в процессе укладки белка и распознавании неправильно свернутых
молекул.
Относительно негативного влияния N-концевых доменов на укладку
молекулы иРА можно делать разные предположения. Например, оно может
быть обусловлено свойствами N-концевых доменов самих по себе. То есть,
можно предположить, что С-концевой домен способен относительно легко
приобрести правильную конформацию, а N-концевые домены - нет, при этом
вся молекула будет детектироваться системой контроля качества сворачивания
белков в ЭР (ERQC) как неправильно свернувшаяся. С другой стороны,
мультидоменные секреторные белки не характерны для дрожжей и, возможно,
низкая эффективность сворачивания молекул иРА в дрожжах связана с тем, что
взаимодействие полипептидных цепей соседних доменов мешает их укладке.
4. Низкая эффективность секреции иРА коррелирует с его агрегацией в
путях секреции
Степень агрегации четырех вариантов uPA, uPA-Q, uPA-C и uPA-CQ в
клетках дрожжей Н. polymorpha оценивали методом иммуноблоттинга по
соотношению интенсивности сигнала в растворимой и нерастворимой фракции
клеточных
лизатов.
Растворимую
центрифугированием
осветленных
и
нерастворимую
клеточных
фракции
лизатов,
получали
которые
для
предотвращения связывания белка с мембранными фракциями получали в
присутствии детергента ( 1 % Triton-X100).
Анализ степени внутриклеточной агрегации различных вариантов uРА
показал, что соотношение белка в растворимой и нерастворимой фракции
клеточных лизатов коррелирует с эффективностью секреции изучаемого
9
варианта белка. Т. е. чем лучше белок секретируется, тем больше его
обнаруживается в растворимой фракции и меньше в агрегатах: при экспрессии
варианта uPA-С, который обладает самой высокой эффективностью секреции,
доля белка в растворимом состоянии была максимальной; наименьшая доля
растворимого белка обнаруживалась в клетках штамма с вариантом uPA-Q варианта с самым низким уровнем секреции (рисунок 3).
Рисунок 3. Анализ методом иммуноблоттинга с антителами к uРА клеточных
лизатов штаммов DLU, DLC, DLQ и DLCQ, экспрессирующих варианты uPA, uPA-C,
uPA-Q и uPA-CQ соответственно.
О - нерастворимая фракция, С - растворимая фракция.
Осадочные фракции были разведены в 2- кратном объеме исходного осветленного
лизата.
Поскольку in vitro uPA самопроизвольно не агрегирует даже в высокой
концентрации, наиболее логичным объяснением природы агрегации является
слипание неправильно уложенных молекул. При высоком уровне экспрессии
uPA мы наблюдали значительное снижение секреции этого белка и увеличение
его количества внутри клеток в неактивном виде. Объяснением этого эффекта
может являться
то,
что
при
высоком
концентрация неуложенных молекул uPA,
уровне
синтеза
увеличивается
которые мешают друг другу
приобрести правильную конформацию и слипаются в агрегаты. Количество
uPA в растворимой фракции должно зависеть от того, как эффективно белок
получает правильную укладку, что предотвращает агрегацию, и от скорости
выхода белка из ЭР, после чего он получает модификации, меняющие его
подвижность и секретируется. Очевидно, что скорость, с которой хорошо
секретируемые варианты uPA покидают ЭР, не может быть ниже, чем у плохо
10
секретируемых, а значит равновесная концентрация растворимого иРА внутри
клеток определяется эффективностью укладки его молекулы. То есть белок в
растворимой фракции - это, по крайней мере, в существенной степени тот
белок, который приобрел правильную конформацию и, в конце концов,
секретируется. В то же время, агрегаты формируются из неправильно
уложенного белка и их количество будет тем больше, чем ниже эффективность
укладки.
5. Влияние температуры инкубации при экспрессии uРА в клетках
дрожжей H.polynwrpha
Известным фактом является то, что понижение температуры инкубации
при экспрессии в клетках бактерий E.coli гетерологичных белков, которые
образуют тела включения, приводит к улучшению их сворачивания
увеличению
доли
этих
белков
в
растворимой
форме.
Поэтому
и
мы
предположили, что снижение температуры инкубации в процессе индукции
экспрессии иРА в клетках Н. polymorpha также может привести к улучшению
эффективности сворачивания этого белка.
В предыдущих экспериментах индукцию экспрессии иРА проводили при
температуре 37°С, которая является оптимальной для выращивания дрожжей Н.
polymorpha (Levine and Cooney, 1973). Чтобы проверить является ли эта
температура оптимальной для секреции иРА мы сравнили эффективность
секреции этого белка при температурах инкубации 30°С и 37°С и обнаружили
существенное увеличение количества секретируемого продукта при понижении
температуры (рисунок 4А). Одновременно с увеличением секреции понижение
температуры инкубации снижало количество uРА внутри клеток (рисунок 4Б).
Это подтверждало наше предположение, что низкая эффективность секреции
uРА и внутриклеточное накопление белка в виде высокомолекулярных
агрегатов обусловлено его неэффективной укладкой в дрожжевом секреторном
пути.
11
Рисунок 4. Анализ методом иммуноблоттинга с антителами к uРА
культуральной среды и клеточного лизата штамма
DLQ/L (Ieu2 mox::uPA-Q TEL:[LEU2]) после индукции в нем экспрессии uРА
при 30°С и 37°С.
А. - культуральные среды.
Б. - клеточные лизаты.
6. Роль вакуолярной деградации в секреции иРА
Известно, что некоторые рекомбинантные белки, проходя секреторный
путь, могут направляться из поздних компартментов аппарата Гольджи в
вакуоль для деградации (Hong et al., 1996; Holkeri and Makarow, 1998). Поэтому
мы не могли исключать, что иРА также может направляться в вакуоль на
деградацию. Чтобы это проверить мы исследовали влияние мутаций в генах
VPS10
и
РЕР4
на
секрецию
иРА.
Ген
VPS10
кодирует
рецептор,
транспортирующий белки из аппарата Гольджи в вакуоль, а ген РЕР4 вакуолярную протеиназу А, активирующую другие вакуолярные протеазы.
6.1. Нарушение гена VPS10 не увеличивает эффективность секреции иРА
Для того чтобы проверить, сопровождается ли нарушение сортировки в
вакуоль в клетках дрожжей увеличением секреции иРА, была получена делеция
гена VPS10 в штамме с экспрессионной кассетой uPA-Q. Это нарушение
действительно привело к секреции вакуолярного белка CPY в культуральную
среду (данные не приведены).
Биологическая функция uРА - это инициация лизиса фибриновых
сгустков путем протеолитической активации плазминогена. Поэтому вокруг
колоний, секретирующих uРА, при росте на специальной среде, содержащей
фибрин, в результате его лизиса образуются зоны просветления. При росте на
такой среде мутант
образовывал зоны лизиса значительно большего
12
размера, чем штамм дикого типа (рисунок 5). Однако это было связано не с
увеличением секреции uРА, а с протеолитическим процессингом uРА,
поскольку при выращивании в жидкой среде мутантный штамм секретировал
не больше uРА, чем штамм дикого типа, однако в случае мутанта иРА
обнаруживался
исключительно
в виде
протеолитического
фрагмента
с
молекулярной массой 30 кДа (рисунок 6). uРА синтезируется в виде
неактивного предшественника, который активируется в результате протеолиза с
образованием полипептидной цепи размером 30кДа. Очевидно, что нарушение
гена VPS10 по каким-то причинам привело к тому, что секретированный белок
был полностью процессирован в этой области и поэтому был более активным.
6.2. Мутация рер4Л не влияет на эффективность секреции иРА
Ген
РЕР4
кодирует
предшественник
протеазы,
обеспечивающей
каскадную активацию вакуолярных протеаз, которые участвуют в деградации
белков (Jones et al., 1982). Для того чтобы проверить, повлияет ли нарушение
вакуолярной деградации на эффективность секреции uРА, была получена
делеция этого гена в штамме с экспрессионной кассетой uPA-Q.
При помощи метода иммуноблоттинга было обнаружено, что количество
секретируемого uPA-Q, как клетками дикого типа, так и клетками штамма
Арер4, практически одинаково (рисунок 7). При этом в результате мутации
принципиально не изменился набор протеолитических фрагментов uPA-Q в
культуральной среде.
Полученные
данные
позволили
нам
утверждать,
что
нарушение
вакуолярной деградации не может являться причиной «сверхсекреции» uPA, a
вакуолярные протеазы, активируемые продуктом гена РЕР4, не вносит
существенного вклада в протеолиз секретируемого uРА.
Рисунок 5. Влияние делеции гена VPS10 на размер
зоны лизиса при росте штамма на среде, содержащей
фибрин.
7. Мутации, увеличивающие секрецию uРА
В лаборатории молекулярной генетики ранее была получена коллекция
мутантов Н polymorpha, с увеличенной способностью к секреции uРА. В ряде
случаев были идентифицированы гены, в которых произошли мутации. В
данной работе мы анализировали проявления мутаций retl-27, ори24, pmtl и
polymorpha с точки зрения их влияния на секрецию иРА. Мутация
pmtl снижает степень О-гликозилирования секретируемых белков, поскольку
нарушает
один
из
белков
семейства
протеин-О-маннозилтрансфераз,
осуществляющих перенос первого маннозного остатка О-гликозидных цепей на
сериновые и треониновые аминокислотные остатки белков, синтезирующихся в
ЭР.
Ген
OPU24
кодирует
пирофосфорилазу
ГДФ-маннозы
-
фермент,
обеспечивающий синтез соединения, которое используется в качестве донора
остатков маннозы для синтеза гликозидных цепей белков. С этим связано то,
что мутация ори24 приводит к нарушению гликозилирования белков. Ген PMR1
кодирует мембранную
АТФазу, которая обеспечивает транспорт
против градиента концентрации из цитозоля в средние цистерны аппарата
Гольджи.
Инактивация
этого
гена
приводит
к
сильному
снижению
концентрации ионов кальция в компартментах секреторного пути. Мутация
14
retl-27 нарушает С-концевой домен a-субъединицы белкового комплекса COPI,
который
обеспечивает
везикулярный
транспорт
между
компартментами
секреторного пути. COPI-зависимый транспорт, в частности, обеспечивает
возвращение в ЭР резидентных и неправильно уложенных белков из
промежуточного компартмента.
7.1.
Агрегация
uРА
в
мутантах
ори24,
pmtl
и
retl-27,
«сверхсекретирующих» uРА
Чтобы
проверить
влияют
ли
«сверхсекреторные»
мутации
на
эффективность сворачивания иРА, мы интегрировали экспрессионную кассету
МОХ:иРА в геном мутантных штаммов и штаммов, несущих аллели изучаемых
генов дикого типа. В полученных трансформантах индуцировали экспрессию
этого белка и исследовали степень его агрегации.
Оказалось,
что
в
клетках
исследуемых
мутантов
количество
агрегированного иРА было ниже, а количество растворимого выше, чем в
клетках штамма дикого типа (рисунок 8). Это свидетельствовало о том, что в
результате этих мутаций эффективность секреции иРА увеличивается за счет
улучшения условий для укладки молекулы этого белка в эндоплазматическом
ретикулуме.
Однако для
разных мутаций
можно предполагать разные
механизмы их влияния на секрецию uРА.
Мутация ори24, помимо нарушения гликозилирования, приводит к
дефекту элиминации неправильно свернутых белков в ЭР (Agaphonov et al.,
2000). Поскольку гликозилирование существенно для эффективной укладки
белковых молекул, можно ожидать, что в результате этой мутации больше
белков, синтезируемых клеткой, будут неспособны принять правильную
конформацию, а дефект их элиминации приведет к накоплению большого
количества неправильно свернутого белка в ЭР. Это должно активировать
механизм ответа клетки на накопление в ЭР неправильно свернутых белков
(unfolded protein response, UPR). Активация этого сигнального пути приводит,
например, к увеличению синтеза шаперонов ЭР, что может способствовать
15
правильной укладке таких белков как uРА, таким образом, увеличивая
эффективность секреции.
Мутация ори24 влияет на все типы гликозилирования секретируемых
белков
и
изучение
этого
мутанта
не
позволяло
связать
улучшение
эффективности секреции uРА с дефектом какого-то конкретного типа
гликозилирования. В отличие от мутации ори24, мутация в гене РМТ1 приводит
к нарушению исключительно О-гликозилирования белков и этого уже
достаточно для увеличения эффективности секреции иРА.
С точки
зрения
анализа возможных
причин
«сверхсекреторного»
фенотипа мутанта РМТ1 важно знать, не модифицируется ли иРА в
секреторном пути дрожжей присоединением О-гликозидных цепей при участии
белка Pmtlp. В наших экспериментах uPA-Q секретированный дрожжами
мигрировал при SDS-электрофорезе четкой полосой, подвижность которой
соответствовала подвижности белка выделенного из Е. coli и заведомо
несодержащего модификаций. Более того, мы не выявили разницы в
электрофоретической подвижности uPA-Q, секретируемого мутантом pmtl и
клетками дикого типа (данные не приведены). Несмотря на это, мы не можем
исключить, что, например, один или два остатка серина или треонина в
молекуле иРА модифицируются присоединением О-гликозидной цепи при
помощи Pmtlp, не приводя к заметному изменению эпектрофоретической
подвижности.
Известно, что О-гликозилирование неправильно свернутых белков может
препятствовать их выходу из ЭР в цитозоль для утилизации посредством
деградации (Harty et al., 2001). Если бы это было верно для uРА, который может
содержать О-гликозидную цепь, накопление uРА в ЭР клеток дикого типа
должно быть намного большим чем
в
клетках
мутанта, обладающего
нарушением О-гликозилирования белков. Так как накопление uРА в клетках
дикого типа может мешать укладке синтезирующегося иРА в ЭР, то будет, в
итоге, «отравлять» секрецию. Поэтому можно было предположить, что мутация
pmtl
увеличивает
эффективность
секреции
16
uРА
благодаря
снижению
накопления в ЭР неправильно свернутого uРА. Однако, при низком уровне
экспрессии uРА, когда не происходит его внутриклеточного накопления,
мутация pmtl также приводила к увеличенной секреции uРА (данные не
приведены). Следовательно, «сверхсекреция» uРА мутантом pmtl, скорее всего,
не может определяться усилением элиминации неправильно свернутого белка.
Можно
предложить
«сверхсекреции»
uРА
еще
две
мутантом pmtl.
гипотезы,
Первая
объясняющие
также
феномен
основывается
на
предположении, что uРА О-гликозилируется. И если эта модификация может
каким-то образом мешать сворачиванию uРА в ЭР, то отсутствие 0гликозилирования uРА будет увеличивать секрецию этого белка. Однако нам не
известны данные, указывающие на то, что О-гликозиды могут мешать укладке
белков. Напротив, известно, что в некоторых случаях это необходимо для
стабильности некоторых секреторных белков в дрожжах S. cerevisiae (Sanders et
al., 1999; Strahl-Bolsinger et al., 1999), а инактивация гена РМТ1 в дрожжах Н.
polymorpha приводила к снижению количества О-гликозилированных белков, к
примеру - хитиназы (Соколов С.С., не опубликовано). О-гликозилирование
может быть необходимо для стабильности не только хитиназы, но и возможно,
других О-гликозилированных белков Н. polymorpha. Роль О-гликозилирования
в укладке белков и их стабильности в дрожжах подтверждается также тем, что
О-гликозидные цепи присоединяются, по-видимому, к еще несвернутым
молекулам белков (Strahl-Bolsinger et al., 1999; Harty et al., 2001). Поэтому
вторая гипотеза совпадает с предположением, сделанным для мутации ори24.
То есть дефект О-гликозилирования приводит к появлению неправильно
свернутых
белков,
что
активирует
UPR,
увеличивая
синтез
белков,
способствующих сворачиванию белков в ЭР, и, таким образом, увеличивается
эффективность секреции иРА.
Мутация retl-27 приводила к неспособности клеток расти при недостатке
ионов кальция в среде и снижению количества Pmrlp в клетке- белка,
обеспечивающего транспорт кальция в цистерны аппарата Гольджи. Было
также обнаружено, что мутация retl-27 приводит к секреции аберрантных форм
17
uPA с аномальной электрофоретической подвижностью, обладающих при этом
фибринолитической активностью. Оценки количества этих аберрантных форм
позволяли
предполагать,
что
они
вносят
существенный
вклад
в
«сверхсекреторный» фенотип мутанта (данные М. Б. Чеченовой). Секрецию
аберрантных форм uPA мутантом ret 1-27 можно объяснить нарушенным COPIзависимым транспортом, который, в частности, обеспечивает возвращение в ЭР
неправильно свернутых белков, которые по каким-либо причинам смогли
попасть из ЭР в следующий компартмент секреторного пути.
При увеличении экспрессии гена PMR1 в клетках мутанта ret 1-27 степень
агрегации усилилась даже по сравнению со штаммом дикого типа (рисунок 8),
хотя сверхсекреторный фенотип был подавлен не полностью (данные не
приведены). По-видимому, «сверхсекреторный» фенотип этого мутанта имел
двоякое происхождение. С одной стороны нарушение баланса ионов кальция
каким-то образом привело к улучшению условий для укладки молекул uPA в
дрожжевом ЭР, а с другой - секреция «недоуложенных» молекул также вносила
свой вклад в «сверхсекреторный» фенотип мутанта. Увеличение экспрессии
гена PMR1 в клетках мутанта приводило к ухудшению эффективности укладки
uPA и, возможно, даже снижению количества «недоуложенных» молекул этого
белка, способных в мутантных клетках покинуть ЭР и секретироваться.
В связи с этим интересно было понять, как влияет нарушение гена PMR1
И. polymorpha на процесс секреции uPA. Действительно, штамм с мутацией в
этом гене образовывал существенно большие зоны лизиса на твердой среде,
содержащей фибрин, чем штамм дикого типа, что свидетельствовало об
увеличении эффективности секреции
(рисунок 9). Однако,
количество
секретированного uPA при росте мутанта в жидкой среде в расчете на
клеточный белок было сопоставимо со штаммом дикого типа (данные не
приведены). Мы сталкивались с похожим несоответствием при изучении
штамма с нарушенным рецептором транспортировки белков в вакуоль. В том
случае несоответствие объяснялось массовой протеолитической активацией
uPA в процессе секреции, в результате чего мутант секретировал не больше
18
белка, чем штамм дикого типа, но этот белок был полностью активирован.
Несмотря на то, что мутация в гене PMR1 приводит к нарушению сортировки
белков в вакуоль (Плотникова Т.А., не опубликовано), это объяснение в данном
случае не годится, поскольку мы не обнаружили увеличения количества
активированной формы uРА у мутанта по сравнению со штаммом дикого типа
(рисунок 10). Скорее всего, мутация действительно увеличивает эффективность
секреции uРА, а несоответствие между результатами, полученными при
выращивании на чашке и в жидкой среде, связано с тем, что штамм очень
плохо рос в жидкой среде и, возможно, экспрессия иРА была очень низкой. На
это указывал и результат анализа внутриклеточной аккумуляции иРА - у
мутанта белок фактически не накапливался (рисунок 11). Этот факт вместе с
невысоким уровнем секреции свидетельствовал о том, что у мутанта улучшение
эффективности секреции компенсируется снижением уровня экспрессии гена
иРА в жидкой среде.
19
20
выводы
1. Человеческий активатор плазминогена урокиназного типа (uРА) плохо
секретируется клетками дрожжей по причине неэффективного сворачивания в
эндоплазматическом ретикулуме.
2. Дефект укладки uРА в дрожжевом эндоплазматическом ретикулуме в
существенной степени определяется N-концевыми доменами этого белка.
3. При высоком уровне синтеза uРА происходит его внутриклеточное
накопление в виде высокомолекулярных агрегатов. Агрегаты формируются в
эндоплазматическом ретикулуме. Количество белка в агрегированной форме
зависит от эффективности его укладки в эндоплазматическом ретикулуме.
4. Мутации ори24, retl-27 и pmtl, увеличивающие эффективность секреции
uРА,
снижают
степень
агрегации
этого
белка
в
эндоплазматическом
ретикулуме, что свидетельствует об улучшении условий для правильного
сворачивания этого белка.
5. Улучшение укладки uРА у мутанта retl-27 связано с нарушением баланса
кальция в секреторном пути.
6. Нарушение транспортировки белков из поздних компартментов аппарата
Гольджи в вакуоль не увеличивает эффективность секреции иРА, но
увеличивает протеолитический процессии г этого белка.
7. Протеолитический процессинг uРА в существенной степени не зависит от
вакуолярных протеаз, активируемых продуктом гена РЕР4, протеиназой А.
21
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ
1. Chechenova M.B., Romanova N.V., Deev A.V, Packeiser A.N., Smirnov V.N., Agaphonov
M.O. and Ter-Avanesyan M.D. C-terminal truncation of a-COP affects functioning oj secretory
organelles and calcium homeostasis in Hansenulapolymorpha. Eukaryotic Cell 2004; V.3, p.52-60.
2. Agaphonov M.O., Romanova N.V., Trushkina P.M., Smirnov V.N. and Ter-Avanesyan M.D.
Aggregation and retention of human urokinase type plasminogen activator in the yeast endoplasmic
reticulum. BMC Mol Biol. 2002; V.3, p. 15.
3. Ill съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) «Генетика в XXI
веке: современное состояние и перспективы развития». 6-12 июня 2004, Москва. Чеченова
М.Б., Романова Н.В., Агафонов М.О. Механизмы, обуславливающие «сверхсекреторный»
фенотип у мутантов дрожжей. Сборник тезисов, т.1., стр. 346.
4. 8-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука
XXI века». 17-21 мая 2004, Пущино. Романова Н.В. Влияние нарушении транспорта белков
в
вакуоль
на
секрецию урокиназы
человека
клетками
дрожжей
Hansenula polymorpha.
Сборник тезисов, стр. 29.
5. 2 n d Hansenula polymorpha worldwide network conference. 26-29 September, 2002, University
La Laguna Tenerife, Canary Islands. Agaphonov M.O., Romanova N.V., Chechenova M.B. and
Ter-Avanesyan M.D. Heterologous protein secretion in Hansenula polymorpha as a model /or
study of eukaryotic secretory pathway. Program and Abstracts, p. 17.
6. Ill съезд Российского Биохимического общества. 26 июня - 1 июля 2002, СанктПетербург, Россия. Чеченова М.Б. Романова Н.В. Агафонов М.О. Урокиназа человека как
модель для изучения механизмов секреции у дрожжей. Тезисы научных докладов, стр. 124.
7. 21 s 1 International specialized symposium on yeasts: "Biochemistry, genetics, biotechnology and
ecology of non-conventional yeasts". 21-25 August, 2001, Lviv, Ukraine. Agaphonov M.O..
Romanova N.V., Chechenova M.B. and Ter-Avanesyan M.D. Secretion of the human urokinase by
yeasts Saccharomyces cerevisiae and Hansenula polymorpha. Book of Abstracts, p. 109.
22
РОМАНОВА НИНА ВЛАДИМИРОВНА
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ СЕКРЕЦИИ
РЕКОМБИНАНТНОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА
УРОКИНАЗНОГО ТИПА КЛЕТКАМИ ДРОЖЖЕЙ
03.00.02.-биофизика