У И.В. Горончаровская*, М.С. Макаров , В.А. Колесников.
advertisement
Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 3 УДК 543.554 И.В. Горончаровская*, М.С. Макаров1, В.А. Колесников. Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125047, Москва, Миусская площадь, дом 9 1 ГБУЗ г. Москвы НИИ СП им. Н.В. Склифосковского ДЗ г. Москвы 129010, Москва, Большая Сухаревская площадь, дом 3 * e-mail: goririna22@gmail.com РЕДОКС-ПОТЕНЦИАЛ КАК ХАРАКТЕРИСТИКА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ Аннотация Исследована возможность оценки биологической полноценности тромбоцитов путем измерения редокс-потенциала платинового электрода в обогащенной тромбоцитами плазме крови человека. Было установлено, что сдвиг потенциала обусловлен высвобождением содержимого гранул наиболее жизнеспособных тромбоцитов при их разрушении. Выведена зависимость сдвига редокс-потенциала от исходного содержания в плазме тромбоцитов, богатых гранулами. Сделан вывод о том, что данный метод исследования может быть использован для оценки качества тромбоцитов при их заготовке для криоконсервирования, а также для диагностики заболеваний, связанных с тромбообразованием. Ключевые слова: редокс-потенциал, тромбоциты Любая живая клетка представляет собой сложную стационарную систему из множества подсистем, которые включают как органические, так и неорганические компоненты. Взаимодействие между этими компонентами определяют строение компартментов клетки, ее жизнеспособность, динамику и биологическую полноценность [1]. В связи с ростом прикладных биотехнологий резко возросла важность оценки биологической полноценности клеток. Сложная молекулярная организация клеток значительно расширяет методологию исследования их биологической полноценности, позволяя решать эту проблему как с помощью биологических, так и с помощью физикохимических подходов. Распространенным вариантом оценки биологической полноценности клеток является автоматический (аппаратный) анализ биологических сред, в которых они находятся. Чаще всего в клинической лабораторной диагностике в качестве такой среды выступает кровь или плазма, и, как правило, такой анализ направлен на выявление дефектных клеток, маркеров поврежденных клеток и продуктов клеточного распада. Такой подход весьма эффективен для анализа патологий клеток крови, но он не позволяет адекватно охарактеризовать популяцию клеток в норме. В частности, большую трудность для аппаратного анализа представляют тромбоциты человека. Известно, что при изменении активности и биологической полноценности клеток происходит изменение их редокс-потенциала (РП) - как внутриклеточных компартментов, так и во всей клетке в целом. Это обусловлено тем, что в клетке имеется большое количество компонентов, способных как к окислению, так и к восстановлению, а также биологические регуляторы РП (цистеиновая, глутатионовая, тиреоредоксиновые и др. системы). В тромбоцитах основными компонентами, которые способны влиять на РП среды являются секреторные гранулы. Гранулы составляют порядка 30-40% всего объема нормального тромбоцита и содержат большое количество факторов, влияющих на РП (ионы Н+, Ca2+, фосфаты, нуклеотиды, кислые белки и т.д.). Ранее было показано, что биологическая полноценность тромбоцитов напрямую зависит от наличия в них гранул, которые могут быть выявлены путем витального окрашивания [2]. Таким образом, можно предположить, что при массовом разрушении биологически полноценных тромбоцитов и выходе содержимого гранул за пределы клетки, должно происходить изменение редокс-потенциала среды (плазмы), а при разрушении биологически неполноценных тромбоцитов этого изменения происходить не должно. Таким образом, целью работы является исследование изменения редокспотенциала при разрушении тромбоцитов в зависимости от их исходной биологической полноценности. В качестве объекта исследования были выбраны: обогащенная тромбоцитами плазма, которую получают путем центрифугирования цельной крови на центрифуге CR 3.12 (Jouan) со скоростью вращения 1200 об/мин при температуре 22°С в течение 5 минут, и тромбоциты из концентрата тромбоцитов (КТ). Для анализа тромбоцитов был использован метод оценки морфофункционального статуса тромбоцитов, который основан на окрашивании тромбоцитов витальным флуорохромным красителем с последующей оценкой их морфофункциональных параметров с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse 80i. Анализируемые параметры включали: концентрацию тромбоцитов (тыс/мкл), содержание тромбоцитов с 35 Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 3 гранулами, Cтр.гр. (тыс/мкл) и Dтр.гр (%), содержание тромбоцитов богатых гранулами (ТБГ), DТБГ (%), адгезивную активность тромбоцитов на стекле, ААТ (баллы). Измерение редокс-потенциала платинового электрода в обогащенной тромбоцитами плазме (ОТП) и концентрате тромбоцитов проводилось на гладком поликристаллическом платиновом электроде площадью 3.3∙10-2 см2 при помощи потенциостата IPC-compact (НПО «Вольта»), насыщенный хлорид серебряный электрод служил электродом сравнения. Величина редокс-потенциала определялась согласно [3] как потенциал электрода при разомкнутой цепи через 15 минут. Перед каждым измерением платиновый электрод подвергался предварительной электрохимической обработке в растворе 0,14 М Na2SO3, с целью стандартизации его поверхности. Сдвиг редокс-потенциала ΔРП оценивался под действием холодового (-17°С− -20°С) разрушения тромбоцитов, поскольку холодовое разрушение является неинвазивным и не связано с введением в систему веществ, которые могли бы дополнительно влиять на РП плазмы. Также сдвиг РП характеризовался как разность РП плазмы до и после разморозки. заморозки Морфофункциональный анализ показал, что после заморозки плазмы при -20°С вся популяция тромбоцитов представлена клетками, не содержащими гранул, с пониженной интенсивностью свечения (рис.1). Таким образом, заморозка приводит к тотальной криодеструкции тромбоцитов, которая сопровождается выходом содержимого гранул за пределы клеток. Рис.1.Витальное окрашивание тромбоцитов до заморозки (слева) и после заморозки (справа) В ходе исследования было обнаружено заметное изменение величины редокс-потенциала до и после заморозки плазмы, обогащенной тромбоцитами. Была выявлена тесная корреляционная связь между ΔРП и DТБГ (r=-0.882), в то время как между ΔРП и Dтр.гр. выраженная корреляционная связь отсутствовала (r=0.172). Таким образом, на сдвиг РП плазмы под действием криодеструкции влияет содержание в ней именно тромбоцитов, богатых гранулами, а не общее содержание биологически полноценных клеток. Стоит отметить, что ΔРП не зависит от абсолютного содержания ТБГ в пробе – так, в образцах плазмы с концентрацией ТБГ 1500 тыс/мкл (КТ донора тромбоцитов), 150 тыс/мкл (плазма крови донора) и 15 тыс/мкл (пациент с тромбоцитопенией) после заморозки были отмечены сходные значения ΔРП. По всей видимости, такой эффект обусловлен не общим объемом материала тромбоцитарных гранул в плазме, а соотношением среди них окисленных и восстановленных соединений. В результате была получена зависимость сдвига редокс-потенциала от содержания в плазме тромбоцитов, богатых гранулами (рис.1). Из зависимости видно, что по мере увеличения содержания ТБГ ΔРП растет в сторону положительных областей, а при низком содержании ТБГ или их отсутствии в плазме ΔРП приближается к 0 мВ или даже становится отрицательным. Наибольшие положительные значения ΔРП были получены в плазме пациентов с тромбозами, где содержание ТБГ резко повышено (DТБГ= 60-80%) по сравнению с нормой (8-40%). Если в свежих КТ, полученных от доноров, значения ΔРП варьировали от +15 мВ до +45 мВ, то в плазме пациентов с тромбозами – от +50 мВ до +100 мВ. Таким образом, диапазон от +15 мВ до +45 мВ можно рассматривать в качестве референтных значений нормы ΔРП в плазме. Поскольку при разрушении тромбоцитов в образцах с низким содержанием ТБГ или вообще без ТБГ в плазме, независимо от общей концентрации клеток, было выявлено смещение РП в отрицательную область, можно сделать вывод о том, что наличие тромбоцитов остальных субпопуляций, не являющихся ТБГ, не может быть выявлено с помощью анализа редокс-потенциала. Однако было отмечено существенное изменение РП в образцах КТ до заморозки при их хранении. РП становился более положительным, вместе с тем, как убывала доля ТБГ в образце концентрата тромбоцитов, в то время как общее содержание тромбоцитов с гранулами снижалось незначительно. То есть, редокс-потенциал плазмы позволяет оценить не всю популяцию функционально пригодных тромбоцитов, а лишь содержание среди них наиболее жизнеспособных клеток. 36 Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 3 Рис.2. Зависимость сдвига редокс-потенциала от содержания в плазме тромбоцитов, богатых гранулами путем криоконсервирования, а также основой для диагностики заболеваний, связанных с тромбообразованием. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда (проект № 14-29-00194); Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что имеет место линейная зависимость между исходной биологической полноценностью тромбоцитов и изменением редокс-потенциала в плазме при их разрушении. Данный метод измерения редокс-потенциала в плазме, содержащей тромбоциты, может служить критерием оценки качества тромбоцитов при их заготовке для хранения Горончаровская Ирина Викторовна аспирант кафедры ТЭП РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва Макаров Максим Сергеевич к.б.н., научный сотрудник НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, Россия, Москва Колесников Владимир Александрович, д.т.н., профессор, ректор РХТУ им. Д.И. Менделеева, Россия, Москва Литература 1. Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов. — М.: Литерра, 2011. 2. Макаров М.С., Боровкова Н.В., Высочин И.В. и др. Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека и его применение в клинической практике // Современная лаборатория. — 2012. — №. 3. — C. 32-34. 3. Хубутия М.Ш., Евсеев А.К., Колесников В.А. Измерения потенциала платинового электрода в крови, плазме и сыворотке крови // Электрохимия. — 2010 — Т. 46, №. 5. — С. 569-573. Goroncharovskaya Irina Viktorovna*, Makarov Maxim Sergeevich1, Kolesnikov Vladimir Alexandrovich. D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. 1 N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine, Moscow, Russia. * e-mail: goririna22@gmail.com REDOX POTENTIAL AS CHARACTERISTIC OF THE PLATELETS VIABILITY Abstract The possibility of estimating the biologically valuable platelets by measuring of the redox potential of platinum electrode in platelets enriched plasma was investigated. It was founded that the shift of the redox potential might be attributed to release of the most viable platelets granule secretion. So this method of investigation can be use to estimate the quality of platelets for cryoconservation, as well as in the diagnostics of diseases associated with thrombosis. Key words: platelets, redox potential 37
