УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
реклама
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК Федеральное государственное бюджетное учреждение науки государственный научный центр Российской Федерации – Институт медико-биологических проблем РАН На правах рукописи РУДИМОВ ЕВГЕНИЙ ГЕННАДЬЕВИЧ Секреторные и адгезивные свойства эндотелиальных клеток человека при моделировании эффектов микрогравитации in vitro 14.03.08 - авиационная, космическая и морская медицина 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН Буравкова Людмила Борисовна Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................................... 6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................. 15 1.1 Структурные белки цитоскелета и межклеточных контактов: структура, функции и участие в механической рецепции. ..................................................................................... 15 1.1.1 Актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток ................................................ 17 1.1.2 Микротрубочки эндотелиальных клеток .................................................................. 24 1.1.3 Кадгерин эндотелия сосудов ...................................................................................... 29 1.1.4 Механическое воздействие: возможные рецепторы и преобразователи сигнала . 32 1.2 Механизмы воздействия фактора некроза опухоли альфа на проницаемость эндотелиальных клеток ........................................................................................................... 36 1.2.1 Воздействие фактора некроза опухоли альфа на микротрубочки .......................... 38 эндотелиальных клеток ....................................................................................................... 38 1.2.2 Воздействие фактора некроза опухоли альфа на VE-кадгерин .............................. 41 эндотелиальных клеток ....................................................................................................... 41 1.3 Микрогравитация как механическая стимуляция эндотелиальных клеток ................. 42 1.4. Молекулы адгезии эндотелиальных клеток: участие в реакции воспаления и механизмах гравитационной чувствительности. .................................................................. 49 1.4.1 Роль молекул адгезии в рекрутировании лейкоцитов, строение, экспрессия и сайты связывания VCAM-1. ................................................................................................ 49 1.4.2 Строение ICAM-1, экспрессия и кластеризация ...................................................... 54 1.4.3 Строение Е-селектина, экспрессия и кластеризация ............................................... 57 1.5 Влияние микрогравитации на экспрессию молекул адгезии ........................................ 59 1.6 Влияние микрогравитации на секрецию интерлейкинов .............................................. 62 эндотелиальными клетками. ................................................................................................... 62 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................... 68 2.1 Используемое оборудование, материалы и реактивы .................................................... 68 2.1.1 Оборудование .............................................................................................................. 68 2.1.2 Химические реагенты ................................................................................................. 69 2.1.3 Моноклональные антитела ......................................................................................... 70 2.2 Приготовление сред для культивирования эндотелиальных клеток ............................ 70 2.2.1 Приготовление полной среды .................................................................................... 70 2.2.2 Приготовление среды для культивирования эндотелиальных клеток ................... 70 2.2.3 Приготовление среды для криоконсервации клеток ............................................... 70 2.3 Выделение и культивирование сосудистых эндотелиальных клеток ........................... 70 2 2.3.1 Получение первичной культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека ................................................................................................................................. 70 2.3.2 Пассирование первичной культуры эндотелиальных клеток ................................. 71 2.3.3 Криоконсервация культивируемых эндотелиальных клеток.................................. 72 2.4 Методы исследования ....................................................................................................... 72 2.4.1 Структура исследования эффектов моделируемой микрогравитации. Параметры экспериментальной установки ............................................................................................ 72 2.4.2 Принцип метода проточной цитофлуориметрии для анализа антигенов и морфологических характеристик клеток ........................................................................... 74 2.4.3 Оценка жизнеспособности культивируемых ЭК пупочной вены человека .......... 75 2.4.4 Оценка иммунофенотипа культивируемых ЭК пупочной вены человека ............ 75 2.4.5 Иммуноцитохимическое окрашивание клеток ......................................................... 76 2.4.6 Определение содержания цитокинов в среде культивирования ............................ 77 2.4.7 Анализ уровня экспрессии генов ............................................................................... 79 2.5 Статистическая обработка результатов ........................................................................... 80 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ..................................... 81 3.1. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на морфологию и цитоскелет эндотелиальных клеток человека in vitro .............................................................................. 81 3.1.1. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на актиновый цитоскелет ................................................................................................................................................ 82 3.1.2. Влияние моделирования эффектов микрогравитации ............................................ 92 на систему микротрубочек .................................................................................................. 92 3.2. Жизнеспособность культивируемых эндотелиальных клеток в условиях моделируемой микрогравитации............................................................................................ 98 3.3 Влияние моделируемой микрогравитации на экспрессию молекул клеточной адгезии эндотелиальных клеток .........................................................................................................100 3.3.1. Профиль поверхностных маркеров эндотелиальных клеток ..........................100 3.3.2. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на экспрессию ................103 молекул клеточной адгезии ...............................................................................................103 3.3.2. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на экспрессию ...........115 VE-кадгерина адгезионных контактов эндотелиальных клеток ...................................115 3.4. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на секрецию цитокинов эндотелиальными клетками ..................................................................................................122 ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................................130 ВЫВОДЫ ...................................................................................................................................132 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .........................................................................................................133 3 СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ АФК – Активные формы кислорода ГТФазы – семейство гидролаз, которые связывают и гидролизуют гуанозинтрифосфат МТ – Микротрубочки Р38 – группа стресс-активируемых протеинкиназ (семейство МАРК) ЦОМТ – центр организации микротрубочек ЭК – Эндотелиальные клетки µg (microgravity) – состояние невесомости CD – кластер дифференцировки ECM (extracellular matrix) – Внеклеточный матрикс Ena/VASP (вазодилататорно-стимулируемый фосфопротеин) – семейство белков, участвующих в клеточной подвижности у позвоночных и беспозвоночных животных ERK – киназа регулируемая внеклеточными сигналами FAK – Киназа фокальной адгезии FITC (Fluorescein Isothyocyanate) – флуоресцеина изотиоцианат HSP – белки теплового шока HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) – эндотелиальные клетки пупочной вены человека ICAM-1 – молекула межклеточной адгезии 1-го типа IL-1α – ИЛ-1α IL-6 – интерлейкин-6 IL-8 – интерлейкин-6 JNK – c-Jun N-концевая киназа (семейство МАРК) LPS (lipopolysaccharide) – липополисахарид, основной компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий MAPK – Митоген-активируемые протеинкиназы MLC – Легкие цепи миозина MLCK – Киназа легких цепей миозина NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) – универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла PE – фикоэретрин PECAM-1 – тромбоцитарно-эндотелиальными молекулами клеточной адгезии 1-го типа 4 Pi – остаток ортофосфорной кислоты PI3-kinases – фосфатидилинозитол-3-киназы PTK – протеин-тирозинкиназа RANTES - хемокин, выделяемый T-клетками при активации Rho, Ras, Rac, Cdc42 – Семейство малых ГТФаз (ферменты, связывающие и гидролизующие гуанозинтрифосфат) ROCK – Rho-ассоциированная протеинкиназа RPM – Random positioning machine RWV – Rotating Wall Vessel Shear stress - напряжение сдвига (тангенциальное давление кровотока на эндотелиальные клетки) SHP-2 – (SH2)-домен-содержащая тирозиновая фосфатаза 2 типа Src – тирозинкиназа, участвующая в процессах эмбрионального развития и клеточного роста TNF-α (Тumor necrosis factor-α) – Фактор некроза опухолей-альфа VCAM-1 – молекула адгезии сосудистого эндотелия 1-го типа VEGF (Vascular endothelial growth factor) – фактор роста эндотелия сосудов VEGFR2 – рецептор к фактору роста эндотелия сосудов 2 типа VE-кадгерин (CD144) – кадгерин сосудистого эндотелия или кадгерин 5-го типа 5 ВВЕДЕНИЕ Хорошо известно, что микрогравитация, как один из основных факторов космического полета, приводит к дисрегуляции сердечно-сосудистой системы (Газенко, Григорьев, Егоров, 1990; Charles, Lathers, 1994; Богомолов, Самарин, 2007; Котовская, Фомина, 2010). Важным функциональным элементом, вовлекаемым в эти процессы, является эндотелий, изменения которого регистрируются после космических полетов и в наземных модельных экспериментах (Григорьев, Котовская, Фомина, 2009; Moore, Thornton, 1987; Sofronova, Tarasova, Gaynullina et al., 2015). Действие факторов космического полета имеет множество эффектов на организм человека. Это происходит из-за того, что в ходе эволюции сформровались различные компенсаторные механизмы, противостоящие постоянному действию силы тяжести, работа которых нарушается в условиях невесомости (Газенко, Парфенов 1982). В первую очередь это касается жидких сред организма, поэтому у космонавтов наблюдается: перераспределение жидкости тела (Leach 1987) и, как следствие увеличение центрального венозного давления, увеличение фильтрации почек и выведение жидкости (Ларина, Баевский, Пастушкова и др., 2011), атрофия сердечно-сосудистой системы в паре с нарушениями синусового ритма и ортостатическая неустойчивость (Convertino 2009). Более длительное воздействие невесомости вызывает: потерю костной и мышечной массы (Григорьев, Оганов, Бакулин и др., 1998; Fitts, Riley, Widrick, 2001; Оганов, Богомолов, 2009), нарушение функций иммунитета (Sonnenfeld 2002), изменение функции вестибулярного аппарата (Young, Oman, Merfeld et al., 1993), сенсомоторные изменения и т.д. Для разработки мер противодействия и предупреждения негативных эффектов космического полета, связанных со здоровьем, необходимо понять, как микрогравитация индуцирует эти эффекты и выяснить, какие механизмы в этом участвуют. Следовательно, перед исследуемой клеточной моделью стоит основная задача – узнать, почему клетки не в состоянии выполнить свою естественную функцию в условиях микрогравитации, что приводит к нарушению здоровья, и как сохранить эту функцию. Полученные результаты могут помочь в поиске лекарственных или других средств поддержания клеток в нормальном физиологическом состоянии, так что ухудшения здоровья космонавтов можно будет избежать или вылечить в более короткие сроки. На начальных этапах изучения влияния микрогравитации было показано, что 6-ти суточный космический полет не вызывал явных изменений структуры и физиологии культивируемых клеток млекопитающих (Сушков, Португалов, Руднева и др., 1976). При 6 этом на первом пассаже после полета авторы обнаружили нарушения, связанные с процессом деления клеток. В связи с этим, авторы сделали вывод, что факторы космического полета не вызывают необратимых изменений в клетках млекопитающих, но проявляются при последующем культивировании в условиях земной гравитации (Сушков, Руднева, 1979). Поскольку результаты экспериментов с использованием клеточных культур являются ответом на комплекс изменяющихся параметров среды (перегрузки, вибрации, микрогравитация), а ожидания исследователей в большей мере связаны с попыткой понять роль гравитации, то до сих пор возникают дискуссии о правильности их трактовки (Пестов 1997). Тем не менее, создание аппаратуры, методов длительного культивирования и последующего морфофункционального исследования состояния клеток in vitro позволило выявить широкий спектр изменений, свидетельствующих о прямом влиянии гравитации на клеточные структуры (Буравкова, Гершович, Гершович и др., 2010; Grigoriev, Kalinin, Buravkova et al., 2002). В развитие направления клеточных моделей большой вклад внес М.Г. Таирбеков, предпринявший попытку обнаружить клеточные структуры, выступающие в роли гравичувствительных рецепторов. Автор анализировал и обсуждал возможные механизмы гравирецепции в растительных клетках, микроорганизмах и эукариотических клетках. Ему удалось показать нарушение роста и функциональной активности культивируемой монослойной культуры фибробластов в условиях микрогравитации из-за нарушения их адгезионных свойств (Таирбеков 1997). Кроме того, проанализировав результаты, полученные после орбитального полета спутника «Фотон-12», автор обнаружил диссоциацию белка цитоскелета виментина, фосфорилирование белков фокальных контактов и кортикальную локализацию F-актина в культивируемых клетках остеосаркомы (Таирбеков 2000). На основе полученных данных, М.Г. Таирбеков выделил основные органеллы клетки, способные к гравирецепции: цитоскелет, ядро и клеточная мембрана (Таирбеков 2002). К сожалению, реализацию экспериментальных моделей ограничивает не только сложность выявления эффектов именно микрогравитации из всего комплекса действующих факторов космического полета при анализе полученных данных. Существенную сложность составляет сама доставка экспериментального оборудования (лимитированная масса, объем и энергопотребление) и её длительность, а также продолжительность проведения эксперимента и возвращение биологического материала на Землю. В связи с этим, широкое распространение получило использование наземных моделей, основанных на принципе рандомизации положения культивируемых клеток относительно вектора гравитации: вращение 7 (клиностатирование) относительно горизонтальной оси (2D клиностат) - быстрое (90 об/мин) и медленное (6 - 10 об/мин); трехмерное клиностатирование (3D клиностат, Random positioning machine – RPM); биореактор в виде вращающихся сосудов для суспензионных культур (Rotating Wall Vessel - RWV) (Van Loon 2007). Для моделирования эффектов микгрогравитации в адгезивных культурах клеток наиболее подходящим считается использование RPM (Hemmersbach, Strauch, Seibt et al., 2006). Дискуссии о воспроизведении эффектов микрогравитации, в такого рода моделях, продолжаются по сей день, однако данных, отмечающих положительную корреляцию между реальной невесомостью и клиностатированием, становится все больше (Marco, Laván, van Loon et al., 2007; Ulbrich, Wehland, Pietsch et al., 2014). Обсуждая влияние микрогравитации на клетки необходимо помнить, что внутриклеточная система является не стационарной системой, а пребывает в состоянии термодинамического неравновесия, что и определяет ее восприимчивость к слабому гравитационному воздействию. Результаты как наземных, так и полетных экспериментов подтверждают это предположение, однако спектр наблюдаемых реакций различных клеточных культур на изменение гравитационного стимула достаточно широк и разнообразен. Хорошей моделью для изучения структурно-функциональных и молекулярноклеточных изменений деятельности сердечно-сосудистой системы при действии микрогравитации являются эндотелиальные клетки (ЭК), которые в условиях культивирования in vitro образуют монослой клеток, идентичный тому, что выстилает внутреннюю поверхность сосудов in vivo. Эндотелиальный монослой представляет собой функциональную составляющую сердечно-сосудистой системы, являясь основным барьером между кровью и подлежащими тканями, и функционируя как механически чувствительный интерфейс передачи сигнала (давление, растяжение, сокращение, воздействие напряжения сдвига /shear stress/ жидкости) (Michiels 2003; Tzima, IraniTehrani, Kiosses et al., 2005). Кроме того, исследования показали, что ЭК очень чувствительны к изменению гравитационного стимула, демонстрируя как ранние, так и отсроченные ответы (Sangha, Han, Purdy 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005; Infanger, Ulbrich, Baatout et al., 2007). Описанные выше послеполетные нарушения сердечно-сосудистой системы и одутловатость лица космонавтов во время полета могут быть вызваны эндотелиальной дисфункцией регуляции проницаемости сосудов. На первичных культивируемых ЭК было показано, что 2D клиностатирование приводит к ремоделированию актинового цитоскелета и усилению миграционной активности (Романов, Кабаева, Буравкова 2001). 8 Длительное воздействие измененной гравитации модулировало экспрессию молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), Е-селектина и молекулы адгезии сосудистого эндотелия-1 (VCAM-1), на поверхности культивируемых ЭК. Кроме того, экспозиция на RPM не только приводила к ремоделированию актинового цитоскелета, но и сокращала общее количество актина, в то время как гипергравитация (3 g) не влияла на рост ЭК, однако заметно стимулировала миграцию и усиливала синтез NО (Versari, Villa, Bradamante et al., 2007). В ЭК культивируемых в условиях RWV Carlsson и соавторы обнаружили оверэкспрессию белка теплового шока HSP 70 и снижение экспрессии IL-1α, который является мощным ингибитором роста ЭК, а также играет роль в развитии старения. К тому же, авторы отметили быстрое ремоделирование цитоскелета ЭК и значительное подавление экспрессии актина спустя несколько дней (Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003). Снижение количества актина в ответ на действие моделируемой микрогравитации, возможно, представляет собой адаптивный механизм, направленный на предотвращение накопления избыточных актиновых фибрилл. После воздействия микрогравитации, моделируемой с помощью RWV, в течение 6 дней, Cotrupi и соавторы (Cotrupi, Ranzani, Maier 2005), показали снижение уровня IL-6, что может способствовать задержке роста ЭК, а также повышению синтеза NO. Grimm и соавторы исследовали гравичувствительные молекулярные механизмы ЭК, чтобы определить биологический сенсор силы тяжести в этих клетках. Длительное экспонирование клеток на RPM увеличивало уровень белков внеклеточного матрикса, молекул клеточной адгезии и индуцировало высвобождение цитокинов ЭК (Grimm, Infanger, Westphal et al., 2009). Эти наблюдения подтвердили ранее выдвинутое предположение, что некоторые из мембранных белков, являются механическими сенсорами клетки. Возможными регуляторными сенсорами могут быть механочувствительные кальциевые каналы, сайты фокальной адгезии, цитоскелет, а также известные рецепторы факторов роста и цитокинов. Вторичные сигналы могут индуцировать различные киназы, такие как ERK, (киназа, регулируемая внеклеточными сигналами) Р38 и JNK (c-Jun N-терминальной киназы) МАРК сигнального пути (Hughes-Fulford 2002). Тем не менее, слабоизученными из-за лежащие в основе противоречивых молекулярные механизмы данных, полученных с остаются использованием различных наземных моделей. Серьезной помехой к созданию четкой картины механизмов влияния микрогравитации на функции ЭК является использование в качестве объекта исследования разных клеточных культур ЭК: первичной или иммортализованной. Кроме того, большинство функций ЭК сильно зависят от микроокружения. Появление 9 провоспалительных стимулов в корне меняет фенотип и функциональное состояние ЭК (Schiffrin 1994). Точные молекулярные механизмы гравичувствительности ЭК остаются не выясненными в силу наличия у них многоуровневой системы регуляции провоспалительной активности и механочувствительности. В связи с этим, изучение секреторных и адгезивных свойств интактного и активированного эндотелия, в условиях моделируемой микрогравитации позволит приблизиться к пониманию процессов, происходящих в условиях реального космического полета. 10 ЦЕЛЬ РАБОТЫ: исследовать влияние моделирования эффектов микрогравитации (3D клиностатирования) на архитектонику цитоскелета, синтез молекул адгезии, белков адгезионных межклеточных контактов и растворимых медиаторов воспаления в интактных и TNF-α-активированных эндотелиальных клетках пупочной вены человека. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 1) Сравнить эффект провоспалительной активации, 3D клиностатирования и их совместного действия на жизнеспособность первичных эндотелиальных клеток из пупочной вены человека; 2) Исследовать воздействие 3D клиностатирования на экспрессию генов и организацию основных белков актинового и тубулинового цитоскелета ЭК, находящихся в различных функциональных состояниях (в норме и при провоспалительной активации); 3) Провести анализ экспрессии молекул клеточной адгезии (E-селектин, PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1) и основного белка клеточных контактов (VE-кадгерин) на поверхности интактных и TNF-α-активированных ЭК в условиях моделирования эффектов микрогравитации; 4) Изучить влияние 3D клиностатирования на секреторную активность интактных и TNF-α-активированных ЭК; 5) Оценить уровень экспрессии генов основного белка адгезионных контактов, молекул клеточной адгезии и цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в условиях провоспалительной активации, экспозиции на RPM и их совместного действия. НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые проанализировано влияние моделирования эффектов микрогравитации, с помощью уникального устройства для рандомизации положения объекта относительно вектора гравитации (RPM), на основные характеристики интактных и TNF-αактивированных первичных ЭК. Впервые культивируемых показаны различия эндотелиальных в функциональной клеток человека, активности характеризующие первичных не только продукцию поверхностных маркеров, но и транскрипцию генов, ответственных за синтез данных маркеров в норме и при провоспалительной активации. Впервые установлено, что моделирование эффектов микрогравитации вызывает реорганизацию актинового и тубулинового цитоскелета первичных ЭК уже после 1 часа 11 воздействия, а 24-часовая экспозиция на RPM приводит к нарушению сборки микротрубочек и появлению двуядерных клеток в первичной культуре ЭК. Получены новые данные, свидетельствующие о сопутствующем ремоделированию актинового цитоскелета увеличении экспрессии гена ACTB после 24-часов экспозиции на RPM. Впервые выявлено потенцирование эффектов провоспалительной активации на транскрипцию генов ICAM1 и IL8 в условиях 3D клиностатирования, что в совокупности с увеличением экспрессии рецептора Е-селектина на поверхности ЭК, может способствовать увеличению адгезионных свойств этих клеток. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Результаты исследования подтверждают возможность использования эндотелиальных клеток человека в качестве наиболее подходящей экспериментальной модели для изучения механизмов гравичувствительности и трансдукции гравитационного стимула во внутриклеточные биохимические сигналы. Обнаруженные в работе взаимосвязанные изменения архитектоники цитоскелета, экспрессии поверхностных маркеров, белка межклеточных контактов и секреции цитокинов подтверждают существование и значительно дополняют имеющиеся теоретические представления о гравитационно-зависимых внутриклеточных механизмах. Продемонстрированные в работе функциональные различия между эндотелиальными клетками, полученными от разных доноров, позволяют предполагать необходимость более тщательного подхода к оценке результатов, с учетом индивидуальных особенностей первичных культур. Полученные в работе результаты могут являться основанием для разработки проекта технического задания на проведение космического эксперимента в Российском сегменте МКС с целью дальнейшего изучения барьерных, адгезивных и секреторных свойств эндотелиальных клеток в условиях реальной микрогравитации. 12 ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 1. Реорганизация актиновых микрофиламентов в местах клеточных контактов и нарушение сборки микротрубочек наблюдается уже на ранних этапах культивирования ЭК на RPM (1 час) и сохраняется на протяжении 24 часов, приводя к трехкратному увеличению экспрессии гена АСТВ, а также нарушению пролиферации и накоплению двуядерных клеток. 2. Рандомизации положения культивируемых ЭК относительно вектора гравитации не является сильным воспалительным стимулом, так как не стимулирует транскрипцию генов и экспрессию кодируемых ими индуцибельных молекул E-селектина и VCAM-1 на поверхности клеток, однако, достаточна для того, чтобы способствовать увеличению экспрессии ICAM-1 интактных и TNF-α-активированных ЭК. 3. 3D клиностатирование не влияет на экспрессию генов и секрецию молекул ИЛ-6 и ИЛ-8 в интактных эндотелиальных клетках. Экспозиция на RPM не отменяет TNF-αиндуцированное увеличение экспрессии и секреции данных цитокинов, а в случае с ИЛ-8 даже потенцирует транскрипцию гена этого цитокина. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на: 10-й, 11й Конференциях молодых ученых, специалистов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2011, 2012); 12-й Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН (Москва, 2013); 13-й Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию полета первого в мире врача-космонавта Егорова Б.Б. (Москва, 2014); 35-х и 37-х Академических чтениях по космонавтике, посвященных памяти академика С.П.Королева и других выдающихся отечественных ученых – пионеров освоения космического пространства «Актуальные проблемы Российской космонавтики» (Москва, 2011, 2013); 14-ой Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине c международным участием, посвященной 50-летию создания ИМБП (Москва, 2013); 22-ом Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013); 12-й Объединенной конференции Европейского космического агентства и Международного общества гравитационной физиологии «Life in Space for Life on Earth» (Великобритания, Абердин, 2012); 40-й Научной ассамблее Международного комитета по исследованию космического пространства (COSPAR) «COSMOS» (Москва, 2014); 6-ом Международном конгрессе «Медицина в космосе и экстремальных условиях» (ICMS) (Германия, Берлин, 2014). 13 По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 из них в периодических изданиях из Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (грант № 12-04-31763 мол_а) и гранта «Ведущие научные школы» НШ – 371.2014.4. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 166 страницах машинописного текста, сопровождается 24 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 464 источника, из них 37 на русском и 427 на иностранном языке. 14 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Структурные белки цитоскелета и межклеточных контактов: структура, функции и участие в механической рецепции. Эндотелиальная выстилка интимы сосудов имеет множество функций, включая регуляцию тонуса сосудистых гладкомышечных клеток, иммунных защитных реакций, ангиогенеза и гемостаза тканевой жидкости. Поддерживаемый эндотелием полупроницаемый барьер особенно важен в обеспечении контроля прохождения органических макромолекул и жидкости между кровью и интерстициальным пространством. Известно, что потеря этой функции приводит как к воспалению, например при синдроме острой дыхательной недостаточности, так и отеку подлежащих тканей, при различных патологических состояниях, одним из которых является действие микрогравитации. Проницаемость транспортируемых макромолекул зависит от их молекулярных радиусов, а также от барьерных свойств эндотелия в конкретном участке сосудистого русла. Эта избирательная природа барьера для белков плазмы является ключевым фактором в создании градиента концентрации белков (особенно в случае альбумина), необходимого для баланса жидкости в тканях. Эндотелиальный транспорт осуществляется с помощью парацеллюлярного и трансцеллюлярного путей. Целостный эндотелиальный монослой выступает в роли ограничителя, поскольку растворенные вещества с молекулярным радиусом до 3 нм двигаются пассивно через барьер с помощью парацеллюлярного пути. Трансцеллюлярный везикулярный путь отвечает за активный транспорт макромолекул, как показано для альбумина (Milici, Watrous, Stukenbrok et al., 1987). Парацеллюлярная проницаемость регулируется сложным взаимодействием клеточных адгезионных взаимодействий, и противостоящим им контр адгезионных сил, генерируемых актомиозиновыми молекулярными моторами (Тихонов 1999). Интактный эндотелиальный барьер имеет ограничивающие свойства, которые обусловлены в первую очередь плотно закрытыми межэндотелиальными контактами. В настоящее время имеются данные показывающие, что рецепторы интегринов, связываясь с внеклеточным матриксом (ECM) также могут вносить свой вклад в барьерную функцию путем стабилизации закрытой конфигурации контактов. Такие медиаторы воспаления как тромбин, брадикинин, гистамин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), и др., при связывании со своими рецепторами, способны нарушать организацию контактов и интегрин-ЕСМ комплексов, тем самым открывая барьер (Dudek, Garcia 2001). Таким 15 образом, формирование мельчайших межклеточных «щелей» позволяет белкам плазмы и жидкости проходить через эндотелиальный барьер неограниченным образом. Относительно недавно было показано, что барьерную функцию эндотелия могут модулировать не только медиаторы воспаления, но и механические стимулы (Tzima, Del Pozo, Shattil et. al 2001). И в этом нет ничего удивительного. Из-за ритмичных сокращений сердца, кровь циркулирует по сосудистому руслу в пульсирующей манере, вызывая механические воздействия на сосудистую стенку. Сосудистое древо неоднородно, что вызывает различие в величине механического воздействия циркулирующей крови на определенных участках. В прямых сосудах наблюдается ламинарный поток крови, что производит стабильное напряжение сдвига на ЭК, однако при изгибах или бифуркации, ток крови изменяется, вплоть до возникновения турбулентного движения. Было показано, что подобные изменения силы напряжения сдвига способны вызывать изменение архитектоники цитоскелета ЭК (Tzima, Del Pozo, Kiosses et. al 2002). Взаимосвязь актинового цитоскелета и молекул межклеточных контактов наталкивала на мысль, что адгезионные комплексы могут служить в качестве механосенсоров. Последние исследования подтвердили эту гипотезу. Было показано, что прямое механическое воздействие на ЭК приводит к сокращению миозина и регуляции величины межклеточного контакта, опосредованного VE-кадгерином (Liu, Tan, Cohen et. al 2010). Полученные данные говорят о том, что механические стимулы влияют на барьерную функцию ЭК. Таким образом, регуляция барьерной функции сосудистого эндотелия хорошо изучена в условиях действия земной гравитации. В условиях микрогравитации, как отмечалось ранее, происходит снижение и перераспределение объема циркулирующей крови, что может изменить значения её механического воздействия в некоторых участках сосудистого русла. В результате, у космонавтов наблюдается отечность лица и шеи. Вопрос о том, являются ли данные процессы следствием нарушения барьерной функции ЭК, вследствие нарушения ее регуляции, остается малоизученным. Поскольку реорганизация цитоскелета и последующее изменение формы клетки, перераспределение белков межклеточной адгезии, обеспечивают структурную основу увеличения сосудистой проницаемости ЭК, то целесообразно начинать изучение воздействия микрогравитации именно на эти компоненты. 16 1.1.1 Актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток Еще несколько веков назад ученые представляли себе, что клетки заполнены жидкой «протоплазмой», однако в наше время уже хорошо известно, что эукариотические клетки содержат сложную молекулярную структуру, составляющую их каркас, состоящую из взаимосвязанных микрофиламентов, микротрубочек и промежуточных филаментов, заключенную в вязком цитозоле (Heuser, Kirschner, 1980; Fey, Wan, Penman, 1984). Филаменты цитоскелета противостоят механическим нагрузкам и, в значительной степени, ответственны за способность клетки к сохранению своей формы. Эти каркасы также функционируют в качестве рельсов для движения органелл, они ориентируют многие ферменты и субстраты, которые участвуют в биохимических реакциях, опосредующих важнейшие клеточные функции (Ingber, 1993; Janmey, 1998). Кроме того, взаимосвязь компонентов цитоскелета, белков клеточных контактов и белков сайтов фокальной адгезии обеспечивает целостность эндотелиального монослоя и его барьерную функцию. Актин является основным компонентом цитоскелета почти всех эукариотических клеток. Динамическая природа нитей актина позволяет клеткам реагировать на внеклеточные сигналы перемещением, изменением формы и транслокацией внутриклеточных органелл. Такие процессы имеют важное значение для развития и функционирования многоклеточного организма, но также принципиальны при патологических состояниях, например, способность опухолевой клетки становится метастатической. Актин существует либо в мономерной форме, G-актин, или в виде тонких нитей (филаментов), F-актин, и каждая субъединица актина связывается с АТФ либо с АДФ. Минимальная концентрация актина, необходимая для сборки (т.е. критическая концентрация (CC)) ниже для АТФ-актина, чем для АДФ-актина (Carlier, Pantaloni 1997). Полимеризация актина состоит из двух последовательных стадий, "нуклеации", то есть создания затравки (сайта нуклеации) из первых трех мономеров G-актина, и элонгации (удлинение нити F-актина) (Клячко 2000). Процесс полимеризации происходит тогда, когда концентрация G-актина становится выше критической, в обратном же случае происходит его деполимеризация. Основное различие между АТФ-актином и АДФактином это то, как ведет себя полимер. В отсутствие гидролиза нуклеотидов, полимеры ведут себя как равновесные, с одинаковым показателем СС на обоих концах. Однако, в действительности, актиновые филаменты являются неравновесными полимерами, потому что происходит гидролиз нуклеотидов уже образованной нити. Кроме того, этот гидролиз 17 отстает от процесса сборки. Вследствие этого, филаменты представляют собой поляризованную закрученную нить, которая имеет заостренный конец (в виде наконечника стрелы, минус конец), характеризующийся медленным ростом и высоким значением CC (CC-), и быстрорастущий оперенный конец (плюс конец), с более низким значением CC (CC+). F-актин имеет спиральную закрутку, с поворотом нити каждые 35 нм. В устойчивом состоянии (рис. 1а), концентрация G-актина такова, что чистая сборка субъединиц на плюс конце равна чистой разборке на минус конце, этот процесс называется treadmilling (бесконечная, монотонная механическая работа) (Wegner 1982; Ченцов 2004). Длина филамента и их количество в таких условиях относительно постоянны. Цикл сборки филамента, как полагают, в дальнейшем состоит из присоединения АТФ-мономера к оперенному концу, гидролиза АТФ в объединенной субъединице, высвобождение Pi (остаток фофорной кислоты) в раствор, диссоциации АДФ-мономера от заостренного конца, и обмена АДФ до АТФ мономера. а б Рис 1. Полимеризация актиновых филаментов (а) и микротрубочек (б). Однако, в физиологических условиях наблюдается иная картина, АТФ-актин является преобладающей формой пула мономеров, в то время как АДФ-актин, а в условиях быстрой сборки возможно и AДФ-Pi-актин, является основным компонентом Fактина (Rosenblatt, Peluso, Mitchison, 1995). При этом, подвижность немышечных клеток требует активную, более точно контролируемую реорганизацию сети актиновых филаментов. Цикл сборки филамента в живых клетках в 100-200 раз быстрее, чем для чистого актина в пробирке. Такая скорость не может быть достигнута без белков, регулирующих сборку актина. Некоторые белки изолируют мономеры актина с целью предотвращения самопроизвольного зарождения 18 филаментов (β-тимозины) или взаимодействуют с мономерами актина для повышения нуклеотидного обмена (профилины). Другие белки разрывают F-актин, чтобы увеличить количество филаментов с заостренными и оперенными концами (кофилины, гельзолин). Третьи белки, блокируют плюс или минус концы филаментов, регулируя добавление или потерю актиновых субъединиц (кэп-белки, гельзолин, комплекс Arp2/3), увеличивая тем самым рост или диссоциацию филаментов (Клячко 2000). Аминокислотная последовательность белка актина очень консервативна и сходна у эукариотических организмов разных таксономических групп. По-видимому, это связано с тем, что филаменты собираются из глобулярных субъединиц и это накладывает жесткие рамки на их изменчивость. Любое нарушение конформации субъединицы, вызванного изменением заряда при смене той или иной аминокислоты могут нарушить процесс полимеризации. Однако, все же существуют вариабельные участки, одним из которых является N-концевой сегмент молекулы актина, богатый отрицательно заряженными остатками аминокислот. На основании анализа этого сегмента выделяют 3 изотипа актина: α-, β- и γ-актин (Whalen, Butler-Browne, Gros 1976; Rubenstein, Spudich 1977). Оказалось, что изотипы актина экспрессируются в клетке в зависимости от ее функции и степени дифференцировки. Кроме того, изоактины локализованы в различных компартментах клетки и не могут замещать друг друга, так, например, немышечные клетки содержат в своей цитоплазме β- и γ-актин (Rubenstein, Spudich, 1977). В экспериментах, с использованием модели мигрирующего края ЭК и фибробластов, было показано, что локализация β-актина ограничивалась раффлами и ламеллоподиями. При этом филаменты, меченные фаллоидином не окрашивались антителами к β-актину, что говорит о наличии γ-актина в них. Наличие β-актина в переднем крае мигрирующих клеток сопровождалось увеличением уровня его мРНК, которая также локализовалась по периферии клетки (Hoock, Newcomb, Herman 1991; Herman 1993; Хайтлина 2007). Таким образом, в эндотелиальных клетках β-актин локализуется в кортикальном слое в области подвижного переднего края и отвечает за локомоцию, в свою очередь, γ-актин является основной составляющей стресс-фибрилл. Ползающие движения клеток многоклеточных организмов являются результатом координированных и поляризованных изменений формы клеток, в основе которых лежит непрерывное ремоделирование актинового цитоскелета. Сигнальные пути которые ведут к ремоделированию связаны с Rho-семейством малых ГТФаз, которые по отдельности индуцируют ассоциацию актиновых филаментов в различные структуры, такие как ламеллиподии, филоподии, стресс-волокна и арки (дугообразные пучки актиновых филаментов) (Small 1988). 19 Одной из основных функций актинового цитоскелета является обеспечение клеточной подвижности. Будь то нейросекреция, выпячивание ламеллоподии или любой другой клеточный процесс, зависящий от сборки актиновых филаментов, в конечном итоге необходимо понять, точную временную и пространственную координацию реорганизации F-актина. В настоящее время, ламеллоподиальное движение, кажется, наиболее понятным процессом (Svitkina, Borisy 1999). Предполагается, что следующие три функции могут эффективно интегрировать деятельность многочисленных актинсвязывающих белков, необходимых для координированного движения клеток: (1) локализация белка, (2) сигнализация, которая модулирует несколько белков, и (3) лимитирующая стадия, которая изменяется при различных клеточных условиях. Молекулы, участвующие в сборке актиновых филаментов строго локализованы или пространственно сегрегированны в переднем крае клетки. Это позволяет актину проходить циклы сборки спереди и разборки в задней части ламеллоподии, что генерирует силу для ее вытягивания (Welch, Mallavarapu, Rosenblatt et. al 1997). Препараты, которые ингибируют полимеризацию актина, блокируют перемещение клетки вперед, так как оперенные концы филаментов, обращены к переднему краю, где преимущественно собирается актин (Schafer, Welch, Machesky et. al 1998). Электронно-микроскопические исследования ламеллоподий кератиноцитов и фибробластов (Svitkina, Borisy, 1999) показали широко разветвленную сеть нитей актина (так называемые дендритные щетки) на переднем крае клетки. Как и при полимеризации актиновых мономеров, так и для сборки сети актиновых филаментов, была предложена treadmilling модель (Machesky, Way, 1998), включающая в себя следующие этапы: зарождение (нуклеация) на заостренном конце филамента, заблокированном кэп-белком; удлинение (элонгация) свободного оперенного конца на переднем крае; АТФ-гидролиз и высвобождение Pi; блокирование оперенного конца по мере удаления сети филаментов от переднего края; диссоциация кэп-белка с заостренного конца и его дезорганизация. Сборка актина происходит преимущественно на переднем крае, поскольку концентрация свободных оперенных концов высока в этом регионе и может быть ограничением скорости полимеризации. Свободные оперенные концы могут быть получены в ходе нуклеации de novo, разрезания существующих филаментов или диссоциации блокирующих оперенный конец белков. При дальнейшем выпячивании ламеллоподии необходимо поддержание пула мономеров актина на переднем крае клетки. Для этого в задней части ламеллоподии реализуются механизмы, способствующие быстрой деполимеризации и поставке G-актина, необходимого для сборки на переднем крае (Schafer, Cooper, 1995; Bamburg 1999). 20 Для первоначального контакта, мигрирующие клетки также образуют филоподии, часто происходящие из ламеллоподий (Svitkina, Bulanova, Chaga et al., 2003), которые представляют собой пальцевидные выступы, состоящие из тонких пучков длинных актиновых филаментов, уложенных параллельно и ориентированных своими оперенными концами по направлению к переднему краю филоподии (Small 1988). Для описания процесса формирования филоподий из ламеллоподий была предложена следующая модель. Главную роль здесь играют Ena/VASP (вазодилататорно-стимулируемый фосфопротеин) белки, регулирующие полимеризацию актина и локализующиеся в верхних частях филоподий (Bear, Gertler, 2009). Эти белки связываются с оперенными концами филаментов, препятствуя их кэпированию и стимулируя элонгацию (Gupton, Gertler, 2007). Для формирования и поддержания структуры филоподий необходим белок фасцин, который связывает актиновые филаменты в пучки. Благодаря своей функции, фасцин считается ключевым маркером филоподий (Svitkina, Bulanova, Chaga et al., 2003; Adams 2004). Однако, существует и другой механизм формирования филоподий, при котором ламеллоподия не является строительной платформой. Важную роль здесь играют формины, которые участвуют в полимеризации актина, связываясь с оперенным концом актиновых филаментов (Evangelista, Zigmond, Boone, 2003). Гиперэкспрессия белков этого семейства индуцировала формирование филоподий во многих типах клеток. Не вполне ясная роль в формировании филоподий принадлежит миозинам. Гиперэкспрессия миозина индуцировала формирование филоподий, при этом миозин располагался в их верхней части (Berg, Cheney, 2002). Предположительно он служит для транспортировки других белков, таких как Ena/VASP и интегринов, в верхнюю часть филоподий. В любой из этих моделей, на ранних стадиях формирования адгезионных контактов требуется обширная реорганизация цитоскелета, но специфическая архитектура актинового цитоскелета на этих этапах долгое время оставалась неясной. Лишь недавно проведенные исследования на культуре мигрирующих HUVEC показали, что после первичного контакта двух интердигитирующих ламеллоподий, у самой их кромки, образуются так называемые «мостики», внутри которых происходит слияние филоподиальных пучков актина соседних клеток (Hoelzle, Svitkina, 2012). Стоит отметить, что филаменты выходящие из каждой клетки, четко ориентированы оперенным концом по направлению друг к другу, в результате чего в центральной части «моста» находятся филаменты со смешенной полярностью (Hoelzle, Svitkina 2012). Кроме, характерного для филоподий расположения актиновых филаментов (Svitkina, Bulanova, Chaga et al., 2003), «мосты» содержат маркерный белок фасцин и совершенно свободны от микротрубочек. Эти данные указывают на то, что «мосты» образованны интердигитирующими 21 филоподиями соседних клеток. Кроме того, полученные в этой работе данные, свидетельствующие о перераспределении VE-кадгерина в области образующихся контактов, позволили авторам построить модель образования межклеточной адгезии в эндотелиальных клетках (рис. 2), которая состоит из четырех последовательных стадий. Первая стадия представляет собой первоначальный контакт двух клеток, посредством выступающих ламеллоподий, содержащих в переднем крае разветвленную сеть актиновых фибрилл и VASP. На следующем этапе, клеточная ретракция способствует кластеризации VE-кадгерина и образованию адгезионных контактов. Ламеллоподии начинают разрушаться с задней стороны, образуя «мост». Актиновые филаменты ассоциируются в прямые пучки, связанные фасцином и располагаются вдоль оси «моста», в то время как разветвленная сеть остается только на дистальном кончике – миниламеллоподии. На третьем этапе, миниламеллоподиальная сеть актиновых филаментов полностью разрушается, а фасцин постепенно рекрутируется в дистальную часть «моста». VASP перераспределяется от края миниламеллоподии, концентрируясь на кончике «моста». На заключительном этапе происходит непрерывная сборка миозина II типа в основании «моста», с последующим ретроградным током вдоль его оси. Накопление миозина II замещается фасцином, что постепенно превращает «мост» в стресс-волокно. Повидимому, подобная архитектура цитоскелета и перераспределение VE-кадгерина служит для укрепления первоначального контакта ЭК с одной стороны, а с другой стороны, обеспечивает возможность контроля проницаемости для белков плазмы крови и трансмиграции лейкоцитов. Наряду с двигательной функцией, актиновый цитоскелет является частью сократительного аппарата клетки. Основной деятельностью сократительного аппарата в ЭК является регулирование барьерной функции. Стресс-волокна, состоящие из пучков полимеризованного актина и миозиновых филаментов являются основными элементами сократительного аппарата эндотелиальных клеток, составляя около 16% от общего количества белка ЭК (Wong, Gottlieb, 1990). Формирование стресс-волокон, сопровождается увеличением фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина (MLC) и усиленным развитием сокращения. Ключевым регулятором сократительного аппарата ЭК играет Ca2+/кальмодулин (CаM)-зависимая MLC-киназа (MLCK), которая фосфорилирует MLC по остаткам серина (Goeckeler, Wysolmerski 1995). Кроме того, эндотелиальная форма MLCK имеет уникальный NH2-концевой домен, содержащий консенсусные последовательности, которые могут быть фосфорилированы большим количеством протеинкиназ: цAMФ-зависимой протеинкиназой A (PKA), 22 Рис. 2. Модель образования межклеточной адгезии в эндотелиальных клетках (Hoelzle, Svitkina, 2012). Описание в тексте. протеинкиназой С (PKC), Src, Ca2+/CaM - зависимой протеинкиназой II (CaMKII), а также МАР-киназой, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK-1/2) (Garcia, Lazar, GilbertMcClain et al., 1997; Verin, Gilbert-McClain, Patterson et al., 1998). Наличие такого широко спектра киназ указывает на широкий спектр возможных медиаторов, влияющих на сокращение ЭК. Рассмотрим действие двух полярных, с точки зрения вызываемых эффектов, медиаторов. Стимуляция эндотелиальных клеток тромбином увеличивает полимеризацию актиновых филаментов, путем конверсии G-актина в фибриллы F-актина, способствуя образованию стресс-фибрилл (Ehringer, Yamany, Steier et al., 1999), тогда как ингибирование полимеризации актина с помощью цитохалазина D, отменяет развитие сокращения (Goeckeler, Wysolmerski, 1995). Эти результаты подтверждают ключевую роль полимеризации актина в индукции эндотелиального сокращения. Так как, воздействие обоих медиаторов в конечном итоге приводило к повышению проницаемости, то можно говорить о взаимосвязи между полимеризацией актина и повышением проницаемости эндотелиального монослоя путем изменения формы клеток. Кроме того, актиновые стресс-волокна вступают в контакт с белками фокальных контактов, ассоциированных с интегринами (талином, винкулином, паксилином и FAK), а также белковыми компонентами адгезионных и плотных контактов. Из-за сложности взаимосвязей актина с белками межклеточных контактов, полимеризация актина происходит в определенных участках клетки и может влиять на функции как адгезионных, так и плотных контактов, действуя тем самым на проницаемость эндотелия. 23 1.1.2 Микротрубочки эндотелиальных клеток Микротрубочки (МТ) представляют собой одну из полимерных систем цитоскелета эукариотической клетки. Они имеют важное значение для широкого спектра клеточных функций, в том числе митоза, транспорта, клеточной подвижности, формы и полярности клеток. То, как происходит самоорганизация цитоскелета в динамические асимметричные массивы, необходимые для клеточных функций, является одним из самых сложных вопросов в области клеточной биологии. Строительными блоками МТ являются димеры белка тубулина, которые полимеризуются в трубку диаметром 25 нм путем образования 13 протофиламентов и с сопутствующим гидролизом ГТФ (рис.1б). МТ представляют собой ассиметричные, или так называемые «полярные» полимеры, поскольку каждый тубулиновый димер состоит из α- и β-субъединиц (только 50% идентичность), а также из-за равномерного полярного расположения этих гетеродимеров в решетке МТ. Эта полярность используется моторными белками (кинезины, динеины) для везикулярного транспорта. Энергия для движения транспортных белков происходит от гидролиза АТФ в сочетании с изменением конформации сайта связывания тубулина. Полярность сборки MT также приводит к наличию быстрорастущего (плюс) и медленнорастущего (минус) концов. Плюс конец простирается от центросомы, локализованной вблизи ядра, к периферии, а минус-конец часто ассоциирован с центросомой и защищен от деполимеризации (Kirschner, Mitchison, 1986). Чтобы понять сложный процесс ремоделирования МТ в ходе клеточного цикла, была принята модель «динамической неустойчивости» сборки МТ (Mitchison, Kirschner 1984). В модели «динамической неустойчивости», МТ полимеризуется с определенной «скоростью роста» и деполимеризуется с определенной «скоростью укорочения». Переход от роста к укорочению, называется «катастрофой» и происходит с определенной частотой. Противоположное событие, переход от стадии деполимеризации к стадии роста, называется «спасение», и происходит также с определенной частотой (рис. 1б). Регулирование величин этих четырех параметров, кажется достаточным для регулирования полимеризации МТ во время клеточного цикла (более комплексная модель будет включать в себя частоту зарождения новых MT, в качестве пятого параметра) (Walker, O’Brien, Pryer et al., 1988). Позднее обнаружили, что сборка МТ, как и актиновых филаментов, происходит непрерывно, следуя модели «treadmilling», когда тубулиновые субъединицы постоянно добавляются к одному концу МТ, претерпевая непрерывную деполимеризацию на другом 24 конце (Margolis, Wilson, 1998). Важно понимать, что изменения длины MT происходит со скоростью до 1 мкм/мин при treadmilling и до 20 мкм/мин при динамической неустойчивости. Поэтому «treadmilling» характеризует медленную пластичность МТ, в то время как «динамическая неустойчивость» необходима для более обширных и быстрых перестроек сети МТ, например, при переходе к клеточному делению. Отличительной чертой изменения динамики МТ, при переходе клетки в фазу деления, является увеличение частоты катастроф в 10 раз (Belmont, Hyman, Sawin et al., 1990). Кроме того были обнаружены факторы стабилизирующие и дестабилизирующие МТ в ходе клеточного цикла (Бураков, Надеждина, 2006). В связи с этим, в настоящее время ученые придерживаются мнения, что регуляция динамического состояния МТ во время фаз клеточного цикла, основана на модулировании соотношения между активностью доминирующих факторов стабилизации МТ и конститутивно активных дестабилизирующих факторов. Много лет считалось, что актиновые филаменты и микротрубочки составляют отдельные системы цитоскелета с различными функциями. Однако, все большее число наблюдений показало, что эти две системы филаментов функционально сотрудничают во множестве клеточных процессов (Gavin 1997). После многих тщетных попыток объяснения механического поведения клетки, математически обоснованную модель представил Дональд Ингбер (Ingber 1993; 2003). В основу модели он положил принцип «тенсегрити», применяемый Бакминстером Фуллером: в архитектуре стабильность и подробно формы при описанный Ричардом механической нагрузке обеспечивается действием постоянного напряжения, создаваемого сетью структурных элементов, и самостабилизации путем включения других элементов, которые сопротивляются этому сжатию (Fuller 1961). В клеточной модели, напряжение обеспечивают микрофиламенты и промежуточные филаменты цитоскелета, а уравновешивающие силы представлены взаимосвязанными структурными элементами, которые сопротивляются сжатию, МТ и сайтами фокальной адгезии. Тем не менее, отдельные филаменты могут иметь двойную функцию и, следовательно, обеспечивать растяжения или сжатия в различных структурных контекстах (например, стресс-фибриллы обеспечивают растяжение филоподий). Предварительное напряжение, которое стабилизирует всю клетку, порождается сократительной активностью актомиозинового аппарата (Тихонов, 1999). Дополнительный пассивный вклад в это предварительное напряжение вносят адгезионные контакты с ЕСМ и соседними клетками, а также осмотические силы, действующие на клеточную мембрану. Промежуточные филаменты, которые простираются по всей длине 25 микротрубочек, микрофиламенты и ядерная поверхность обеспечивают механическую жесткость всей клетке, благодаря своим свойствам. Кроме того, внутренний каркас соединяется с периферией клетки, с высоко упругой, кортикальной сетью микрофиламентов, находящейся непосредственно под плазматической мембраной. Данная трехмерная конструкция цитоскелета залита вязким цитозолем и ограничена дифференциально проницаемой плазмалеммой. К моменту принятия данной модели скопилось множество доказательств, ложащихся в её подтверждение. Диссоциация МТ в фибробластах сопровождается потерей клеточной полярности и снижением темпов миграции (Ivanova, Margolis, Vasiliev, 1976), а в нейритах к остановке роста (Bamburg, Bray, Chapman, 1986). Разрушение МТ также лишает лейкоциты направленного передвижения по хемотаксическому градиенту (Mareel, De Mets 1984). Таким образом, МТ имеют большое влияние на клеточную полярность и миграцию, процессы, которые прежде всего, зависят от системы актинового цитоскелета. Следует отметить, что полная диссоциация МТ не является необходимым условием, чтобы вызвать эти эффекты; для этого достаточно лишь ингибировать их динамическую нестабильность. При добавлении таких ингибиторов полимеризации МТ (нокодазол), продвижение переднего края фибробластов заметно снижается (Liao, Nagasaki, Gundersen, 1995). В то же время, увеличение формирования стресс-волокон и сократительной активности клетки сопровождается деполимеризацией МТ (Danowski 1989). С помощью иммортализованных мышиных фибробластов, в которых отсутствовали стресс-волокна, удалось изящно показать, что МТ осуществляют свое влияние путем модуляции образования фокальных контактов с субстратом. Разрушение МТ в этой модели вызвало массовое образование фокальных контактов и стресс-волокон (Bershadsky, Chausovsky, Becker et al., 1996). На основании этих данных возникло предположение, что изменение сборки МТ усиливает сокращение эндотелиальных клеток (индуцированное актин-миозиновым комплексом) и приводит к их «ошариванию». Подтверждением этой точки зрения явилось обнаружение корреляции между разрушением МТ, активацией сократительного аппарата (фосфорилирование MLC, формирование стресс-фибрилл) и увеличением проницаемости ЭК (Verin, Birukova, Wang et al., 2001). Кроме того, в работе продемонстрировано, что увеличение фосфорилирования MLC опосредовано через активацию малых Rho ГТФ-аз, а не по MLCK-зависимому пути. Одновременно, другая группа исследователей показала активацию RhoA, индуцированную дестабилизацией МТ, с помощью малых Rho ГТФ-аз и p38 митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) (Van Horck, Ahmadian, Haeusler et al., 26 2001). Накопилось большое количество доказательств того, что белки семейства Rho ассоциированы с полимеризованными МТ и колокализованны вместе в переднем крае мигрирующих клеток (Lee, Gotlieb, 2003). Другое направление исследований, позволило обнаружить общую колокализацию между концами МТ и, содержащих винкулин, сайтов клеточных контактов, образованных на переднем крае клетки (Rinnerthaler, Geiger, Small, 1988). Позднее, эти результаты были подкреплены путем изучения живых клеток, с введенными флуоресцентно меченных тубулина и винкулина. В этих исследованиях удалось четко продемонстрировать, что такая колокализация присутствует отнюдь не случайно, а отражает прямое взаимодействие новых сайтов контактов с концами МТ (Kaverina, Rottner, Small, 1998). Клеточные контакты могут повлиять на динамику находящихся над ними концов МТ, путем захвата и стабилизации их от деполимеризации после воздействия нокодазола (Kaverina, Rottner , Small, 1998). Выбор в качестве целей вновь образованных сайтов клеточных контактов не может управляться одними МТ. Напротив, данный феномен, представляет собой результат перекрестных путей сигналлинга между МТ и актиновым цитоскелетом. Соответственно, было высказано предположение, что одиночные актиновые филаменты, исходящие из ранних сайтов клеточных контактов в цитоплазму могут оказаться связанными с ближайшей МТ с помощью сшивающего белка, который бы связывал их параллельно. Несколько кандидатов подобных белков уже описаны (Gavin 1997). Так называемые MAPs (белки, ассоциированные с микротрубочками) способны образовывать поперечные связи между актиновыми филаментами и МТ in vitro, что указывает на физическую и функциональную связь компонентов цитоскелета (Fuchs, Yang, 1999). В продолжение рассуждения о связи компонентов цитоскелета, сайтов фокальной адгезии и клеточных контактов, подразумевается, что МТ могут быть важны в транспорте кадгеринов и других компонентов межклеточных и адгезионных контактов (Vincent, Xiao, Buckley et al., 2004), и таким образом регулируют их проницаемость. Более того, кадгерины, взаимодействуя с МТ, способствуют стабилизации их плюс-концов, образуя, основу для последующего транспорта необходимых молекул к местам межклеточных контактов (Stehbens, Paterson, Crampton et al., 2006). То же самое отмечено и для белка фокальной адгезии кинезина-1, чье взаимодействие с МТ, может быть определяющим при адгезии ЭК друг к другу и к ECM (Krylyshkina, Kaverina, Kranewitter et al., 2002). Показано, что в ЭК система МТ организована, как было описано выше, радиально, с закреплением минус-концов МТ на центросоме. При этом, плотность МТ неоднородна: максимальна во внутренней цитоплазме в районе центросомы, не позволяя выявить 27 отдельные МТ; постепенно убывает в направлении кортикального слоя цитоплазмы, позволяя идентифицировать отдельные МТ (Смурова, Бирюкова, Верин и др., 2008). Кроме того, популяция МТ в ЭК неоднородна и распадается на два подтипа: стабильные ацетилированные МТ с «нормальным» темпом роста и более динамичные «быстрые» МТ, скорость полимеризации которых в три раза выше. По-видимому «быстрые» МТ необходимы для клеточного движения, а стабильные МТ более устойчивы к различным воздействиям, влияющим на барьерную функцию ЭК (Смурова, Бирюкова, Гарсиа и др. 2004; Alieva, Zemscov, Kireev et al., 2010). В дополнение к этому, авторы обнаружили, что скорость роста плюс-концов в одиночных ЭК значительно выше, чем в контактирующих клетках, что говорит о наличие механизма контактной регуляции полимеризации МТ. Этот же авторский коллектив показал, что МТ не только вовлекаются в развитие барьерной дисфункции наравне с актиновыми филаментами, но и ответственны за ранние этапы этого процесса (Alieva, Zemscov, Smurova et al., 2013; Алиева 2014). Например, увеличение проницаемости в ответ на действие тромбина, ранее характеризовалось ремоделированием исключительно актинового цитоскелета (Ehringer, Yamany, Steier et al., 1999). Однако, максимальное накопление стресс-фибрилл было показано спустя 30 минут после добавления медиатора, тогда как деполимеризация микротрубочек отмечалась уже после 5 минут воздействия тромбина (Alieva, Zemscov, Smurova et al., 2013). При этом, наиболее подвержена реорганизации периферическая сеть более динамичных МТ. Эти наблюдения позволяют предположить, что действие медиаторов, повышающих проницаемость ЭК, в первую очередь направлено на ограничение роста плюс-концов МТ или на увеличение их деполимеризации. Суммируя результаты накопленных данных по изучению регуляции эндотелиальной барьерной функции, можно представить следующую рабочую модель (рис. 3). В физиологических условиях, существует баланс между актомиозиновым сокращением, полимеризацией МТ и клеточными адгезионными взаимодействиями. Когда сократительные силы преобладают, как при стимуляции тромбином (рис. 3, слева), деполимеризация МТ и формирование стресс-фибрилл вызывает сокращение ЭК, в результате чего клетки отодвигаются друг от друга с образованием парацеллюлярных разрывов, приводящих к нарушению барьерной функции. Когда преобладают адгезионные силы, как при действии сфингозин-1-фосфата (SPH-1-P), наблюдается густая сеть кортикального актина, МТ ассоциированы с кадгеринами и белками фокальной адгезии, а ЭК при этом, поддерживают тесные связи друг с другом и с внеклеточным матриксом, склоняя чашу весов в сторону повышения целостности барьера (Dudek, Garcia, 2001). Таким образом, в ЭК прослеживается четкая взаимосвязь компонентов цитоскелета, 28 белков клеточных контактов и сайтов фокальной адгезии, что обеспечивает высокий контроль подвижности и клеточной проницаемости. Рис. 3. Регуляция образования эндотелиальных парацеллюлярных разрывов. Слева: схематическое представление основных компонентов, участвующих в регуляции эндотелиального актомиозинового сокращения. Также изображены и другие регуляторные белки, чья деятельность способствует как повышению (зеленый фон), так и уменьшению (белый фон) напряжения в ЭК. Справа изображены взаимодействия между соседними клетками и внеклеточным матриксом, обеспечивающие ЭК функцию барьера между сосудистым руслом и подлежащими тканями, где ZO-1 – семейство белков плотных контактов; α- , β- , γ – cat – катенины, ассоциированные с VE-кадгерином; SHP2 - тирозинфосфатаза, стабилизирующая адгезионные контакты; комплекс белков сайтов фокальной адгезии: α-, β-интегрины, талин, паксиллин (Pax), винкулин (Vin), α-актинин (αA), киназа фокальной адгезии (FAK). PAR-1, рецептор, активируемый протеиназами первого типа; EDG, рецептор гена дифференцировки эндотелия (Dudek, Garcia, 2001). 1.1.3 Кадгерин эндотелия сосудов Адгезионные контакты повсеместно распределены по всему сосудистому руслу и экспрессированы как в кровеносных, так и лимфатических сосудах. Эти структуры образованы трансмембранными адгезионными белками семейства кадгеринов, которые опосредуют гомофильную адгезию и способны организовываться в многомерные комплексы на границах клеток (Aberle, Schwartz, Kemler, 1996; Angst, Marcozzi, Magee, 2001). ЭК экспрессируют специфический кадгерин, называемый кадгерином сосудистого эндотелия (VE-кадгерин) (Dejana, Corada, 29 Lampugnani, 1995). Этот белок не экспрессируется ни в каком другом типе клеток, включая клетки крови и гемопоэтические стволовые клетки (Lampugnani, Resnati, Raiteri et al., 1992). Являясь маркером эндотелия, он обнаруживается во время эмбрионального развития, когда клетки становятся комитированными в эндотелиальном направлении (Breier, Breviario, Caveda et al., 1996). VE-кадгерин присутствует в ЭК всех типов судов. На данный момент, структурная основа гомофильного взаимодействи кадгеринов широко проанализирована. Все кадгерины имеют пять последовательно компонованных внеклеточных домена (ЕС-домены) (Bork, Downing, Kieffer et al., 1996). На основании сравнения последовательностей ЕС-доменов кадгерины разделяются на два больших подсемейства. Те из них, что имеют консервативную аминокислотную последовательность HAV (His-Ala-Val) в ЕС1, относятся к «классическим кадгеринам» или кадгеринам I группы, это E, N, P и Cкадгерины (Nollet, Kools, van Roy, 2000). Другая часть кадгеринов имеет сходное строение ЕС1, но не имеет HAV мотива, и относятся к кадгеринам II группы, к которой и принадлежит VE-кадгерин (Shimoyama, Tsujimoto, Kitajima et al., 2000). В пределах Nконцевого домена EC1 имеется консервативная аминокислота триптофан (W2), с помощью которой происходит олигомеризация молекул кадгерина в цис-положении. В то же время, взаимодействие W2-остатков в гидрофобном кармане домена EC1 с Nконцевым ЕС2 в транс-положении требует наличия ионов Ca2+ и приводит к гомофильной адгезии между кадгеринами внутри клеточного контакта, напоминающего застежкумолнию (рис. 4) (Pertz, Bozic, Koch et al., 1999). Как выяснилось позже, для VE-кадгерина механизм гомофильной ассоциации оказался схож c E, N, P и C-кадгеринами, однако эктодомены при взаимодействии принимают изогнутую форму (Ahrens, Lambert , Pertz et al., 2003). Кадериновый цитоплазматический хвост состоит из двух функциональных доменов: проксимальный мембранный консервативный домен (MPCD) и СООН-концевой катенинсвязывающий домен (CBS). Эти домены взаимодействуют с тремя родственными белками, относящимися к семейству Armadillo, первоначально выявленных у дрозофилы: β-катенин, плактоглобин (γ-катенин) и p120-катенин (рис. 4). С проксимальным доменом VE-кадгерина связывается p120-катенин, в то время как CBS связывается с β-катенином или плактоглобином взаимоисключающим образом. β-катенин или плактоглобин затем связывается с α-катенином, который, в свою очередь, является связующим звеном кадерин-катенинового комплекса с цитоскелетом (Bazzoni, Dejana, 2004). Первая основная функция VE-кадгерина это обеспечение правильной сборки адгезивных контактов на начальных этапах развития сосудов и обеспечение нормального функционирования эндотелиального барьера. Это было показано на самых ранних стадиях 30 развития сосудов у эмбрионов мыши (Carmeliet, Lampugnani, Moons et al., 1999). Блокирование VE-кадгерина моноклональными антителами приводило к нарушению эндотелиальных контактов, а интраперитональное введение гибридом против мышиного VE-кадгерина, вызывало подкожное кровоизлияние и смерть животного (Matsuyoshi, Toda, Horiguchi et al., 1997). Кроме наличия гомофильной ассоциации кадгеринов в адгезионных контактах, необходимым условием для обеспечения барьерной функции является наличие ионов Са2+. Так, хелатирование внеклеточного Са2+ с использованием ЭДТА аналогичным образом повышало проницаемость микрососудов в легких и приводило к нарушению адгезии между клетками. Однако, проницаемость восстанавливалась после насыщения культуральной среды ионами Са2+ (Gao, Kouklis, Xu et al., 2000). Стоит отметить, что блокирование VE-кадгерина моноклональными антителами в дополнении к хелатированию внеклеточного Са2+ предотвращало позитивный эффект, наблюдаемый после насыщения среды культивирования ионами Са2+ (Gao, Kouklis, Xu et al., 2000). Эти исследования подтвердили, что избирательное блокирование молекул VE-кадгерина индуцирует необратимое увеличение проницаемости сосудов. Хотя точные механизмы регуляции сборки VE-кадгерина еще не полностью определены, актин-связывающие белки и Rho ГТФ-азы имеют решающее значение. В неэндотелиальных клетках Е-кадгерин, как было показано, взаимодействует с актинсвязывающим белком Arp2/3 (Kovacs, Goodwin, Ali et al., 2002), который, как известно, связывается с белком синдрома Вискотта - Олдрича (WASP), кортактином (Millard, Sharp, Machesky, 2004), а также винкулином (DeMali, Barlow, Burridge, 2002). WASP является нижестоящим эффектором после Rho ГТФ-азы и Cdc42 (Erickson, Cerione, 2001). Таким образом, адгезия, индуцированная гомофильным взаимодействием кадгеринов может активировать сигнальный путь «снаружи-внутрь», что приводит к увеличению полимеризации актина. Lampugnani и сотрудники показали, что трансфекция кДНК VEкадгерина в мутантные ЭК, не экспрессирующие данный кадгерин, приводила к реорганизации актинового цитоскелета и активации другой ГТФ-азы Rac (Lampugnani, Zanetti, Breviario et al., 2002). Позднее было также показано, что индукция VE-кадгеринзависимого сигнального пути приводит к активации Cdc42 и актин-зависимому формированию микрошипов в эндотелтальных клетках (Kouklis, Konstantoulaki, Malik, 2003). Таким образом, кроме обеспечения механической целостности клеточных контактов посредством гомотипической адгезии, VE-кадгерин может регулировать проницаемость путем модуляции ГТФ связывания и ГТФ гидролиза Cdc42, Rас и RhoA. Конечным результатом состояния активации этих Rho ГТФ-аз может быть управление 31 полимеризацией актина в местах клеточных контактов, и, таким образом, регулирование их проницаемости. Рис. 4. Строение молекулы VE-кадгерина, обеспечение межклеточной адгезии и связь с цитоскелетом. ЕС – внеклеточный домен, MPCD - проксимальный мембранный консервативный домен, CBS - СООН-концевой катенин-связывающий домен, p120-катенин (Nollet, Kools, van Roy, 2000). Помимо связи с актиновым цитоскелетом посредством β-катенина, есть основания полагать, что VE-кадгерин способен также взаимодействовать и с тубулиновой составляющей цитоскелета клетки при помощи р120-катенина. В эпителиальных клетках было показано, что р120-катенин связывается с тяжелой цепью кинезина (KHC), принадлежащего к семейству моторных белков микротрубочек (Yanagisawa, Kaverina, Wang et al., 2004). Вполне возможно, что так р120-катенин влияет на экспрессию кадгеринов на клеточной поверхности, модулируя траффик везикулярного пула кадгерина к межклеточным контактам. Кроме того, р120-катенин, связываясь с VE-кадгерином, регулирует сократительный аппарат эндотелиальных и эпителиальных клеток, отрицательно модулируя активность RhoA ГТФ-азы, помогая тем самым снижению проницаемости (Iyer, Ferreri, DeCocco et al., 2004). Таким образом, p120-катенин может быть ключевым регулятором стабильности адгезивных контактов. 1.1.4 Механическое воздействие: возможные рецепторы и преобразователи сигнала Механотрансдукция – это передача сигнала внутрь клетки в ответ на различные механические раздражители. Механические стимулы регулируют широкий спектр физиологических функций, начиная от узкоспециализированной чувствительности звука клетками внутреннего уха до детектирования напряжения сдвига жидкости, оказываемого на эндотелий током крови. Механические сигналы модулируют множество аспектов функционирования клеток, в том числе рост, дифференцировку, миграцию, экспрессию 32 генов, синтез белка и апоптоз. Механические силы также непосредственно влияют на форму и функцию тканей; эффекты сжатия на кость и хрящ, а также напряжение на мышцах и коже являются двумя известными примерами. Таким образом, раскрытие механизмов, с помощью которых живые клетки чувствуют механическое напряжение, лежит в основе понимания того, как они реагируют и адаптируются к своим физическим условиям. Традиционно, исследователи отличают механотрансдукцию от других типов передачи сигналов, поскольку предполагается, что она происходит независимо от лигандопосредованной активации рецепторов клеточной поверхности, а базируется на преобразовании механических стимулов в биохимические последовательные процессы при изменении клеточной мембраны. Это предположение привело к поиску мембранных преобразователей механических сигналов, компонентов клеточной поверхности, которые могут опосредовать этот тип механо-биохимического преобразования (Таирбеков, 2000). Действительно, такие преобразователи были идентифицированы, это повсеместно распространенные на клеточной мембране стресс-чувствительные ионные каналы. Эти каналы увеличивают или уменьшают поток ионов, когда мембрана подвергается механическому воздействию. Однако, такие датчики обычно не действуют в одиночку. Например, хотя бактериальные белки семейства Msc, составляющие каналы, чувствительные к натяжению, могут быть активированы с помощью механического растяжения при их выделении с помощью липосом, им не хватает регуляции, когда они экспонированы на бактериальной мембране в обычных условиях (Sukharev, Blount, Martinac et al., 1997). В яйцах Xenopus, стресс-чувствительные ионные каналы строго регулируются в интактных клетках, но становятся гиперреактивными, когда поверхность бислоя физически оторвана от основного коркового цитоскелета (Zhang, Hamill, 2000). В самом деле, среди механочувствительных сигнальных путей в большинстве клеток, в том числе специализированных сенсорных клеток, общим является тот факт, что, функционирование их молекул-механотрансдукторов зависит от связывания с цитоскелетом. Точные механизмы, посредством которых происходит преобразование механических стимулов в биохимические сигналы ЭК, недостаточно изучены. Тем не менее, сделано предложение, что воздействие напряжения сдвига передается от апикальной поверхности ЭК, с помощью цитоскелета, на сайты адгезии клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс (Davies 1997). Таким образом, сайты фокальной адгезии, плотные контакты и адгезионные контакты могут быть вовлечены в механотрансдукцию. В качестве предполагаемых механотрансдукторов, способных 33 чувствовать ток крови были предложены: гликокаликс, интегрины, окклюдины и VE-кадгерин (Tzima, del Pozo, Shattil et al., 2001; Hahn, Schwartz, 2009). Активация этих механотрансдукторов инициирует несколько сигнальных путей, влияющих на структуры цитоскелета. В частности, ламинарный поток инициирует Rho ГТФ-азный путь, что способствует полимеризации и выравниванию стресс-волокон актина вдоль оси потока и сборку адгезионных и плотных контактов (Tzima, 2006; Colgan, Ferguson, Collins et al., 2007). В то время как, возмущение тока крови приводит к реорганизации цитоскелета и разборке адгезионных контактов (Phelps, DePaola, 2000). Накопленные экспериментальные данные позволили разделить трансдукцию гемодинамического стимула на несколько последовательных стадий: во-первых, физическая деформация апикальной поверхности эндотелия; во-вторых, внутриклеточная передача напряжения сдвига; в-третьих, преобразование механических сил в биологические процессы; в-четвертых, внутриклеточная сигнализация (Davies, 2009). Поскольку напряжение сдвига действует на люминальную поверхность ЭК, то механотрансдукция инициируется локальными структурами, в частности гликокаликсом. Гликокаликс представляет собой длинные цепи протеогликанов, прикрепленных к плазмолемме, которые могут деформироваться при действии напряжения сдвига (Hahn, Schwartz, 2009). Вероятно, их отклонения деформируют плазматическую мембрану, способствуя передаче механического сигнала. Прямо доказать участие гликокаликса не удается, однако добавление фермента разрушающего протеогликаны (гепараназы) блокирует ответ клеток на «напряжение сдвига» (Weinbaum, Tarbell, Damiano, 2007). Следующей структурой передачи биохимического стимула, вызванного «напряжением сдвига» могут быть кадгерины. Как показал Le Duc и соавторы, с помощью наномеханических измерений, кадгериновые комплексы также функционируют в качестве механосенсоров, способных передавать физические стимулы (le Duc, Shi, Blonk et al., 2010). Таким образом, кадгерины передают прилегающим клеткам стимул, эквивалентный силе клеточной сократимости, генерируемой актомиозиновым мотором (Ganz, Lambert, Saez et al., 2006). Другая группа исследователей сосредоточилась на изучении сигнальных каскадов, запускаемых механическими стимулами. Было показано, что в эндотелиальных клетках, «напряжение сдвига», запускает множество каскадов, опосредуемых активацией ERK киназы, JNK, Src-киназы, VEGFR2 (рецептора к фактору роста эндотелия сосудов - 2) и AKT (v-akt гомолога вирусного онкогена тимомы мыши) и индукцией ядерного транскрипционного фактора NF-κB (Davies 1997). Кроме того, было обнаружено, что функция основного маркера ЭК PECAM-1 больше, чем роль пассивного игрока в 34 адгезионных взаимодействиях, наблюдаемых при трансмиграции лимфоцитов. Данный рецептор активно участвует в передаче сигнала внутрь клетки. Биохимическая, и, что еще более интересно, механическая стимуляция вызывали фосфорилирование РЕСАМ-1 по тирозину (Jackson, Ward, Wang et al., 1997; Osawa, Masuda, Harada et al., 1997). Основной тирозин-активируемый мотив иммунорецептора (ITAM) был идентифицирован практически в то же время, в цитоплазматическом хвосте молекулы РЕСАМ-1 (Lu, Barreuther, Davis et al., 1997). Фосфорилирование специфических остатков тирозина в домене ITAM, выступающих в роли посредников, приводило к избирательному рекрутированию адаптерных и сигнальных молекул. Среди внутриклеточных медиаторов PECAM-1, лучше других изучены SHP-2 и βкатенин (Jackson, Ward, Wang et al., 1997; Ilan, Cheung, Pinter et al., 2000). Фосфорилирование SHP-2 может приводить к активации сигнального каскада, запускаемого Ras ГТФ-азой (Ilan, Madri, 2003). Фосфорилированый по тирозину PECAM-1 связывается с β-катенином, что является связующим звеном при взаимодействии с цитоскелетом ЭК и обеспечивает сходную биологическую функцию с кадгеринами. Позднее, была показана связь между фосфорилированием PECAM-1 и активацией ERK, в условиях напряжения сдвига жидкости (Osawa, Masuda, Kusano et al., 2002). Osawa и соавторы предположили, что в результате механических воздействий, тирозин в молекуле PECAM-1 находившийся в закрытом состоянии, становится доступным для фосфорилирования, в это же время происходит рекрутирование и ассоциация SHP-2, с ее последующей активацией и инициацией пути трансдукции сигнала, связанного с активацией ERK. Позднее, удалось определить, возможные структуры, обеспечивающие направленность передачи «напряжения сдвига», это механосенсорный комплекс, состоящий из PECAM-1, VE-кадгерина и VEGFR2 (Tzima, Irani-Tehrani, Kiosses et al., 2005). В этой работе с использованием нокаутных по PECAM-1 и VE-кадгерину линий ЭК было показано, что для передачи сигнала «напряжения сдвига» от интегринов и далее необходимо наличие обеих молекул. Кроме того, в нокаунтных клетках не происходило активации VEGFR2 в ответ на напряжение сдвига. Это свидетельствует о том, что VEGFR2 находится ниже PECAM-1 и VE-кадгерина в пути сигналлинга напряжения сдвига. В свою очередь, только в клетках, экспрессирующих VE-кадгерин, активированный VEGFR2 взаимодействует непосредственно с PI3-киназой, способствуя тем самым активации интегринов. Кроме того, напряжение сдвига опосредует ассоциацию PECAM-1 и β-катенина с р85 субъединицей PI3-киназы VE-кадгерин-зависимым образом. При этом, появление связи между VE-кадгерином и VEGFR2, вероятно, косвенно 35 опосредовано β-катенином. Это коррелирует с тем, что β-катенин-нокаутные ЭК не инициируют активацию интегринов при действии «напряжения сдвига». Можно заключить, что РЕСАМ-1, VE-кадгерин/β-катенин и VEGFR2 представляют собой эндотелий-специфичные элементы механотрансдукции, необходимые для опосредованной PI3K-активации интегринов и выравниванию эндотелиальных клеток в соответствии с направлением потока. Основываясь на полученных данных, была принята точка зрения, что в условиях ламинарного тока крови, происходит адаптация ЭК сосудов к постоянной величине напряжения сдвига таким образом, чтобы после первоначальной стимуляции описанные события подавлялись. В противоположность этому, при изменении напряжения сдвига, когда величина и направление потока постоянно меняется, эти сигнальные пути будут активированы конститутивно (Mohan, Mohan, Sprague, 1997). 1.2 Механизмы воздействия фактора некроза опухоли альфа на проницаемость эндотелиальных клеток Фактор некроза опухоли (TNF-α) – это цитокин с плейотропным действием, преимущественно продуцируемый активированными макрофагами и моноцитами, что обуславливает его участие в иммунных реакциях и воспалении. Известно, TNF-α увеличивает проницаемость эндотелия к макромолекулам в условиях in vitro и in vivo (Goldblum, Hennig, Jay et al., 1989). Однако, динамика развития TNF-α-индуцированной проницаемости, как правило, гораздо медленнее, чем при действии других вазоактивных веществ, таких как тромбин, который индуцирует повышенную проницаемость в течение нескольких минут (Богачева, Гарсия Дж., Верин, 2002). Это предполагает участие иного TNF-α-активируемого сигнального механизма, идентифицировать который долгое время не удавалось. В одной из первых работ было показано, что TNF-α индуцирует реорганизацию цитоскелета в ЭК, образуя мембранные «раффлы», выпячивания филоподий и актиновые стресс-волокна (Wojciak-Stothard, Entwistle, Garg et al., 1998). Было показано, что изменения пространственной координации актинового цитоскелета в TNF-α- стимулированных ЭК сопровождались активацией малых ГТФ-аз Rho, Rac и Cdc42. Хотя каждая из этих ГТФ-аз оказывает специфическое влияние на динамику актина, считалось, что RhoA является основным регулятором индуцированного актин-миозиновым взаимодействием сокращения в эндотелиальных клетках, и таким образом представляет собой ключевой фактор, определяющий повышенную проницаемость эндотелия (Carbajal, Schaeffer, 1999). Следовательно, действие TNF-α и тромбина приводят к активации одного 36 и того же эффектора, запускающего следующий сигнальный путь. RhoA, с помощью нижестоящего эффектора, Rho-киназы (ROCK), стимулирует фосфорилирование регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина (MLCP или РР1), ослабляя активность этой фосфатазы (Essler, Amano, Kruse et al., 1998). Такое ингибирование дефосфорилирования MLC (в первую очередь в присутствии MLCK) приводит к увеличению фосфорилирования MLC (Essler, Amano, Kruse et al., 1998). Однако, коллективом других авторов было показано, что TNF-α-индуцированное фосфорилирование MLC может быть опосредовано активацией в равной степени как MLCK, так и ROCK (Petrache, Verin, Crow et al., 2001). Добавление ингибиторов MLCК и ROCK полностью отменяло TNF-α-индуцированную реорганизацию актинового цитоскелета, что отражает центральную роль данных киназ и MLC фосфорилирования в TNF-α-опосредованной перестройке микрофиламентов. Тем не менее, ранний ответ ЭК на TNF-а наблюдался после 4–5 ч воздействия, тогда как тромбин вызывал быстрое накопление стресс-волокон, образование межклеточных щелей и четырехкратное увеличение проницаемости за 30 минут (Davies, Reddy, Caivano et al., 2000). Кроме того, не наблюдалось значительного увеличения проницаемости ЭК в этой временной точке в ответ на TNF-α, что свидетельствует о том, что ранние изменения в организации цитоскелета не являются достаточными, чтобы влиять на проницаемость (McKenzie, Ridley, 2007). Чтобы понять динамику TNF-α-индуцированной реорганизации актинового цитоскелета, необходимо изучить механизм действия MLCK и ROCK. Было показано, что эти киназы фосфорилируют обе аминокислоты Thr-18 и Ser-19 MLC (Amano, Ito, Kimura et al., 1996). Несмотря на этот факт, именно ингибитор ROCK, а не MLCK, отменяет TNF-αиндуцированное фосфорилирование Ser-19 (McKenzie, Ridley, 2007). Поскольку MLCK активируется Са2+, а увеличение цитозольного кальция не обнаружено при действии TNFα, возможно, что базальная активность MLCK требуется для формирования базальных стресс-волокон в не стимулированных клетках (Tiruppathi, Naqvi, Sandoval et al., 2001). Кроме того, MLCK не способствует поздней реорганизации стресс-волокон, морфологическим изменениям или увеличению проницаемости, так как уровень белка MLC снижается на поздних временных точках, в соответствии с чем, снижается уровень мРНК регуляторной легкой цепи миозина-2 через 2 ч после TNF-α стимуляции ЭК (Zhou, Jin, Gao et al., 2002). В отличие от MLCK, активность Rho необходима для поддержания поздних TNF-α-индуцированных изменений в организации стресс-волокон, хотя активность RhoA не была увеличена после 24 ч по сравнению с нестимулированными клетками (McKenzie, Ridley 2007). Ингибирование ROCK элиминирует позднюю TNF-α37 индуцированную реорганизацию стресс-волокон, однако строение актинового цитоскелета в ЭК, обработанных селективным блокатором ROCK было различным, по сравнению с ЭК, обработанными блокатором RhoA. Вполне вероятно, что другой Rho эффектор способствует образованию TNF-α-индуцированных стресс-фибрилл в дополнение к ROCK. ROCK-независимый ответ на TNF-α может обеспечиваться форминами, такими как Dia1, которые являются мишенями для Rho, стимулируют полимеризацию актина и способствуют образованию стресс-фибрилл (Pruyne, Evangelista, Yang et al., 2002). Эти данные показывают, что острая стимуляция и длительное воздействие TNF-а изменяет морфологию ЭК и структуру актинового цитоскелета поразному. Ранний ответ предполагает Rho активацию, MLC фосфорилирование, но не значительное увеличение проницаемости. С другой стороны, длительное воздействие TNF-α приводит к Rho/ROCK зависимой реорганизации стресс-волокон, которая не зависит от повышенной проницаемости. Таким образом, хотя точные механизмы TNF-α-индуцированной эндотелиальной барьерной дисфункции еще до конца не выяснены, можно говорить о том, что перестройка актинового цитоскелета не является решающим фактором, определяющим данное патологическое состояние как это имеет место для конкретных, биологически активных агонистов, таких как тромбин. MLC фосфорилирование происходит в ответ на TNF-α в сочетании с изменениями цитоскелета и во времени до наступления эндотелиальной барьерной дисфункции. Тем не менее, ингибирование MLC фосфорилирования путем угнетения MLCK или Rho-киназы не ослабляют TNF-αиндуцированную эндотелиальную проницаемость клеток, указывая на то, что активации одной MLCK недостаточно, чтобы вызвать барьерную дисфункцию. С другой стороны, механизмы, с помощью которых, TNF-α индуцирует эндотелиальную барьерную дисфункцию, могут не быть связаны, прежде всего, с MLCK-регулируемым актинмиозиновым взаимодействием, но включать и другие компоненты цитоскелета, такие как промежуточные филаменты, МТ и белки адгезионных контактов, которые также могут играть определенную роль в TNF-α-индуцированной сосудистой барьерной дисфункции. 1.2.1 Воздействие фактора некроза опухоли альфа на микротрубочки эндотелиальных клеток Роль микротрубочек в TNF-α-индуцированной барьерной дисфункции также долгое время оставалась не ясной, хотя их деполимеризация в ответ на действие этого цитокина была продемонстрирована еще 1991 году (Molony, Armstrong, 1991). Существует, однако, множество доказательств того, что сеть МТ может быть важным модулятором барьерной 38 функции ЭК в ответ на добавление других агонистов, таких как нокодазол (Verin, Birukova, Wang et al., 2001), свето-экспозиция (Sporn, Foster, 1992) и перекись водорода (Hinshaw, Burger, Armstrong et al., 1989). Как уже было отмечено, TNF-α индуцирует перестройку актиновых микрофиламентов за счет MLCK- и Rho- зависимых механизмов, ингибирование которых не влияет на эндотелиальную проницаемость (Petrache, Verin, Crow et al., 2001). Следовательно, ключевую роль в развитии барьерной дисфункции ЭК могут играть микротрубочки. В исследовании Petrache и соавторов было обнаружено, что добавление TNF-α к культуре ЭК индуцирует образование актиновых стресс-волокон, клеточное сокращение, образование межклеточных разрывов и разрушение межклеточных контактов с потерей окрашивания VE-кадгерина на периферии клетки (Petrache, Birukova, Ramirez et al., 2003). Стабилизация микротрубочек перед добавлением TNF-α приводила к резкому торможению TNF-α-индуцированного изменения цитоскелета, с заметным сокращением количества стресс-волокон и сохранением клеточной формы, межклеточных контактов, и паттерна окрашивания VE-кадгерина на периферии клетки. Эти результаты предпологают важную взаимосвязь МТ, актинового цитоскедета и белков адгезионных контактов. Кроме того, авторы показали, что TNF-α-индуцированная дестабилизация сети эндотелиальных МТ, одновременно сопровождалась постепенным увеличением проницаемости ЭК. Данные эффекты TNF-α также блокировались при стабилизация сборки МТ, что указывает на ведущию роль этого компонента цитоскелета в сопротивлении клеточному сокращению и поддержании барьерной функции. Поскольку TNF-α-индуцированное увеличение проницаемости не зависит от активации Rho/ROCK (Petrache, Verin, Crow et al., 2001), механизмы, с помощью которых деполимеризация МТ приводит к барьерной дисфункции могут включать дополнительные пути. Один из механизмов может быть связан с VE-кадгерином, потому что стабилизация МТ предотвращает нарушение распределения VE-кадгерина в ЭК. Также, интактная сеть МТ, необходима для поддержания устойчивого состояния рецептора TNF-α (Galeotti, Boscoboinik, Azzi, 1993), следовательно, её разрушение приводит к подавлению ответа клетки на действие данного цитокина. Не стоит забывать и о том, что воздействие высоких концентраций TNF-α может вызывать апоптоз в ЭК. Однако в экспериментах по изучению эндотелиальной проницаемости было показано, что индуцированная данным цитокином барьерная дисфункция развивается не зависимо от апоптоза (Petrache, Verin, Crow et al., 2001; Petrache, Birukova, Ramirez et al., 2003). По-видимому, в некоторых условиях, TNF-α активирует анти-апоптотический PI3-киназа/Akt путь в ЭК человека 39 (Madge, Pober, 2000), не зависимый от классического NFκB пути, объясняя пониженные уровни апоптоза по сравнению с контролем. Еще одним механизмом, который активируется при связывании TNF-α со своим рецептором, является МАРК путь внутриклеточной сигнализации. Каждый компонент MAPK пути дифференциально рекрутируется определенным стимулом, что приводит к киниза-специфичной сигнализации и регуляции клеточного роста, дифференцировки и апоптоза. Petrache и соавторы показали, что p38 МАРК является обязательным медиатором TNF-α-индуцированной разборки МТ, реорганизации актиновых микрофиламентов и проницаемости эндотелия. МАРК р38 относится к семейству стрессактивируемых МАРК, которое состоит из четырех изоформ: p38-α, p38-β, p38-γ и p38-δ. Как p38 МАРК регулирует динамику микротрубочек изучено не полностью, однако может включать прямое фосфорилирование белков, ассоциированных с МТ. Например, таубелок является субстратом для р38, и его фосфорилирование приводит к заметному снижению способности стабилизировать сборку микротрубочек (Goedert, Hasegawa, Jakes et al., 1997). Статмин (окопротеин 18), цитоплазматический белок, связанный с регулированием динамики микротрубочек, является субстратом для p38-δ (Parker, Hunt, Diener et al., 1998). Важная роль р38 МАРК в эндотелиальной проницаемости была показана ранее, при действии TNF-α на ЭК пупочной вены человека (Kiemer, Weber, Fürst et al., 2002), а также в ответ на VEGF (Clauss, Sunderkötter, Sveinbjörnsson et al., 2001) и перекись водорода (Kevil, Oshima, Alexander, 2001), но точные механизмы, с помощью которых данный медиатор приводит к барьерной дисфункции не известны. С учетом накопленных данных, вполне вероятно, что активация р38 МАРК может охватывать несколько путей клеточной сигнализации, помимо тубулинового цитоскелета (рис. 5). Функционирование актинового цитоскелета может регулироваться р38 МАРК с помощью прямой активации МАРКактивированной протеин киназы-2 (MAPKAP киназы-2), которая, в свою очередь, фосфорилирует актин-связывающий белок HSP 27. Нефосфорилированная форма HSP-27, как правило, существует в виде больших мультимерных комплексов которые служат в качестве шаперонов. Фосфорилирование серина HSP-27 приводит к его диссоциации до мономеров и димеров, которые перемещаются к цитоскелету и способствуют последующей реорганизации актина в стресс-волокна (Lavoie, Lambert, Hickey et al., 1995; Guay, Lambert, Gingras-Breton et al., 1997). Таким образом, дестабилизация МТ ЭК лежит в основе двух, TNF-α- индуцированных процессов: реорганизации актинового цитоскелета и развитии барьерной дисфункции. В то время как, возможным ключевым событием, регулирующим 40 ремоделирование цитоскелета ЭК при действии данного цитокина, является активация p38 МАРК. Рис. 5. Пути внутриклеточной сигнализации, запускаемые TNF-α (по Petrache, Birukova, Ramirez et al., 2003). 1.2.2 Воздействие фактора некроза опухоли альфа на VE-кадгерин эндотелиальных клеток Как было показано, на ранних стадиях формирования будущего монослоя ЭК начинают образовывать фосфорилируется по постконфлюентного клеточные тирозину. монослоя, На контакты, более в результате поздних фосфорилирование стадиях, тирозина чего VE-кадгерин при образовании VE-кадгерина резко уменьшается (Lampugnani, Corada, Andriopoulou et al., 1997). В связи с этим был изучен ряд агонистов, способных вызывать фосфорилирование тирозина белков адгезивных контактов, формирование внутриклеточных разрывов и открытие парацеллюлярного пути. Этими агонистами являются эндогенные медиаторы, такие как тромбоспондин-1 (TSP1) (Goldblum, Young, Wang et al., 1999), секретируемый кислый белок богатый цистеином (SPARC) (Young, Wang, Goldblum, 1998), гистамин, а также экзогенные факторы, такие как бактериальный липополисахарид (LPS) (Bannerman, Goldblum, 1997). То, что TNF-α, активирует множество сигнальных каскадов в ЭК на тот момент было хорошо известно, однако о его способности индуцировать фосфорилирование тирозина сведений практически не было. Возник вопрос, может ли TNF-α увеличить проницаемость эндотелия сосудов действуя на нерецепторную протеин-тирозинкиназу (PTK), которая управляет фосфорилированием тирозина белков адгезионных контактов. TNF-α активирует несколько PTK (Perez, Donato, 1996), включая членов семейства Src киназ. Нерецепторные Src РТК (c-Src, Fyn, Yes) локолизованы в субклеточных компартментах в непосредственной близости от адгезионных контактов, и способны фосфорилировать тирозин белков, входящих в их состав (например p120) (Thomas, Soriano, Imamoto, 1995). 41 Кроме того, в трансформированных клетках, с конститутивно активированой v-Src наблюдалось увеличение фосфорилирования тирозина адгезионных контактов, снижение межклеточной адгезии и измененнение морфологии клеток (Hamaguchi, Matsuyoshi, Ohnishi et al., 1993). В работе Nwariakau и др. с использованием HUVEC, было установлено, что добавление Src-специфического фармакологического ингибитора PP2 защищает против TNF-α-индуцированного фосфорилирования тирозина VE-кадгерина и открытия парацеллюлярного пути (Nwariaku, Liu, Zhu et al., 2002). Используя микрососудистые и легочные ЭК, удалось выяснить, что TNF-α индуцированное увеличение фосфорилирования тирозина VE-кадгерина и открыте парацеллюлярного пути вызвано активацией Fyn. Однако, стоит отметить, что применение специфических ингибиторов снижает эффект TNF-α на 60%, но не блокирует его полностью (Angelini, Hyun, Grigoryev et al., 2006). Кроме описанного механизма TNF-α-индуцированного увеличения проницаемости эндотелиального монослоя и формирования межклеточных разрывов существует и другой, так называемый, ранний путь. Было показано, что кратковременное воздействие TNF-α приводит к ранней активации МАРК р38 и снижению экспрессии VE-кадгерина на поверхности HUVEC (Nwariaku, Chang, Zhu et al., 2002). Как и все антигенпрезентирующие клетки, ЭК способны экспрессировать NADPH оксидазу фагоцитарного типа (Li, Shah, 2002). Было показано, что NADPH оксидаза может играть ключевую роль в клеточном сигналлинге в ответ на провоспалительную активацию ЭК TNF-α (Fan, Frey, Rahman et al., 2002). В результате активации NADPH оксидазы происходит высвобождение больших колличеств внутриклеточных окислителей, которые способствуют фосфорилированию тирозина VE-кадгерина и образованию межклеточных разрывовов в HUVEC. Необходимо отметить, что JNK киназа также способна фосфорилировать VE-кадгерин, однако ее роль остается не ясной: либо JNK киназа непосредственно фосфорилирует VE-кадгерин, либо действует на NADPH оксидазу (Nwariaku, Liu, Zhu et al., 2004). 1.3 Микрогравитация как механическая стимуляция эндотелиальных клеток Описанные выше гемодинамические взаимодействия потока крови, с выстилающими сосудистую стенку ЭК, сформировались в ходе эволюции при действии постоянного вектора гравитации. Изменение гравитационной нагрузки может повлиять как на эти взаимодействия, так и на функционирование всей сердечно-сосудистой системы в целом. В этих условиях у космонавтов развиваются патофизиологические состояния: ортостатическая неустойчивость (Buckey, Lane, Levine et al., 1996; Газенко, 42 Григорьев, Егоров, 1997), изменение ритма сердечных сокращений, ведущее к желудочковой аритмии (Fritsch-Yelle, Leuenberger, D'Aunno et al., 1998), а также снижение сердечной мышечной массы и ухудшение сердечной функции (Levine, Zuckerman, Pawelczyk, 1997). При этом механизмы восприятия ЭК гравитационного стимула до сих пор остается предметом дискуссий. К настоящему времени существует два подхода к механизму восприятия вектора гравитации на клеточном уровне: прямой и косвенный эффекты. Прямой эффект возникает в результате взаимодействия гравитации с клеточными структурами и органеллами: мембраной, цитоскелетом, ядром или ядрышком. Прямые эффекты совместимы со «статолитной» гипотезой для растений (Sack 1991), то есть с наличием в клетке компонентов, способных выступать в качестве грависенсоров. Косвенный эффект связан с изменениями окружающей среды за пределами клетки, которые имеют значение для ее метаболизма (изменение конвекции, седиментации, нарушение межклеточных контактов или адгезии к субстрату). В этом случае грависенсор не требуется (Cogoli 1992). Если рассматривать биохимические реакции в клетке с точки зрения неравновесной термодинамики, то процесс протекания таких реакций зависит от множества условий: температура, давление, наличие субстрата и продукта реакции. Реакция может хаотически флуктуировать в сторону образования новых веществ или распада до исходных соединений, однако существуют точки бифуркации, в которых любое слабое воздействие может усилить реакцию в том или ином направлении. Согласно теории, выдвинутой Месландом (Mesland 1992) , небольшой гравитационный эффект в точке бифуркации может оказывать значительные воздействия на клеточные процессы. Наиболее очевидным доводом в пользу прямого действия гравитационного стимула является распластывание клетки по субстрату под действием собственного веса. За поддержание клеточной формы отвечает цитоскелет. Кроме того, процессы сборки/разборки элементов цитоскелета являются примерами самопроизвольных неравновесных биохимических реакций, что предполагает воздействие гравитационного стимула именно на эти структуры. Следовательно, отсутствие гравитационной нагрузки, возможно, будет приводить к изменению архитектоники цитоскелета, которые могут быть критичны для функционирования клеток, тканей и даже органов. Моделирование условий микрогравитации (sµg) на наземных экспериментальных установках, позволяющих изучать эффекты гравитационной разгрузки на клеточном уровне, базируется на двух основных принципах. Первый принцип направлен на снижение процесса седиментации: условия микрогравитации моделируются при помощи вращения заполненного сосуда вокруг горизонтальной оси, что характеризуется 43 колокализацией клеток и их микроокружения, уменьшением напряжения сдвига и турбулентности жидкости. В биореактор (Rotating Wall Vessel – RWV), работающий по такому принципу, помещаются суспензионная или адгезированная на микроносителях культуры клеток, сосуд заполняется культуральной средой без образования пузырьков воздуха, после чего клетки культивируются в условиях гравитационной разгрузки (Hammond, Hammond, 2001). Другой принцип sµg основан на создании условий, при которых объект исследования непрерывно переориентируется по отношению к вектору гравитации (клиностатирование). Модификацией этого метода является трехмерное клиностатирование, при котором увеличивается число направлений (рандомизация) вектора (Random Positioning Machine – RPM) (van Loon 2007). На космической станции или на космическом корабле, значения силы тяжести примерно равны 10-4 - 10-6g. Биореакторы RWV и RPM ослабляют гравитационную нагрузку на клетки примерно до 10-2 - 10-3g (Unsworth, Lelkes, 1998). Тем не менее, эти устройства имеют важное значение для изучения гравитационной биологии клетки и необходимы для выбора правильного направления и планирования исследований во время орбитального полета. Стоит отметить, что результаты, полученные при культивировании клеток в RWV и в RPM сопоставимы не только между собой, но и схожи с результатами, полученными в условиях истинной микрогравитации (Hatton, Gaubert, Lewis et al., 1999; Villa, Versari1, Maier et al., 2005). Это свидетельствует о пригодности использования данных наземных систем для исследования условий микрогравитации. Первые данные о том, что структуры цитоскелета очень чувствительны к изменениям гравитации, появились еще на исходе прошлого столетия. После полета на борту космического шаттла морфология актинового цитоскелета остеобластов мыши была значительно изменена по сравнению с наземным синхронным контролем (Hughes-Fulford, Lewis, 1996). В клетках, подвергавшихся микрогравитации, обнаруживались стрессволокна актина, появление которых объяснили возможным снижением адгезии за счет интегринов. Кроме того, замедлялся рост клеток. Продолжая эти исследования, HughesFulford и сотрудники отмечали удлинение актиновых фибрилл и уменьшение площади, занимаемой актиновым цитоскелетом у клеточной поверхности, по сравнению с полетным 1g и наземным контролем (Hughes-Fulford 2001). Более детально этот эффект микрогравитации удалось изучить в наземных условиях при 2D-клиностатирования. В клетках остеосаркомы ROS 17/2,8, актиновый цитоскелет был дезорганизован, изменилось распределение β1-интегрина на поверхности клеток, а также сами клетки отделялись от подложки и подвергались апоптозу (Sarkar, Nagaya, Koga et al., 2000). 44 Кроме микрофиламентов, от действия микрогравитации страдает и тубулиновый цитоскелет. В 1988 году Moos и соавторами была опубликована работа, описывающая их предварительное исследование, проведенное на суспензии очищенного тубулина, в котором были выявлены значительные различия в строении МТ, собранных в течение 30 с в условиях гравитационной разгрузки, и МТ, полимеризовавшихся в условиях гипергравитации 2g, при параболическом полете на самолете KC-135 (Moos, Graff, Edwards et al., 1988). Этот предварительный ранний результат, показавший, что изменение гравитации влияет на полимеризацию МТ, был подтвержден при запуске метеорологической ракеты (Papaseit, Pochon, Tabony, 2000). Позже изменения в строении МТ были показаны и на культуре клеток. В миоцитах Xenopus laevis, культивируемых в 2D-клиностате были обнаружены дезорганизованные, сконденсированные МТ (Hoeger, Gruener, 1990). Guignandon и коллеги обнаружили, что прохождение через каждую фазу 1g, 2g и µg в течение 15-30 параболы вызывает уменьшение площади клеток и реорганизацию фокальных контактов в клетках остеосаркомы ROS 17/2,8 (Guignandon, Usson, Laroche et al., 1997). Это исследование подтверждает чувствительность адгезионных культур клеток к изменению силы тяжести. Адаптация этих клеток к изменениям силы тяжести, по-видимому, зависит от функции микротрубочек модулировать образование контактов с субстратом, описанных выше (Kaverina, Rottner, Small, 1998). Из-за прямого действия микрогравитации также изменяется строение центра организации микротрубочек (ЦОМТ) во время космического полета. Schatten и соавторы обнаружили, что 4% делящихся клеток эмбрионов морских ежей имели нарушения центриолей в районе центросомы (Schatten, Chakrabarti, Taylor et al., 1999). Более подробно влияние микрогравитации на тубулиновый цитоскелет было изучено в ходе космического эксперимента на борту шаттла на клетках лимфобластомы человека (Jurkat) (Lewis, Reynolds, Cubano et al., 1998). Спустя 20 ч от начала полета МТ были укороченными, образовывали менее разветвленную в цитоплазме сеть, по сравнению с контрольными клетками, строение ЦОМТ было нарушено. Кроме того, было показано снижение пролиферации Jurkat в условиях микрогравитации, клетки оставались в G2M периоде клеточного цикла. Авторы предположили, что обнаруженные аномалии могли быть вызваны реорганизацией микротрубочек. Схожие данные были получены в ходе космического полета и на адгезивных культурах клеток. В раковых клетках молочной железы (MCF-7) уже после 1,5 ч полета спутника Фотон наблюдалось резкое увеличение деполимеризованных, коротких МТ, в то время как в 1g контрольных образцах наблюдались хорошо организованные МТ. Также как и в клетках Jurkat, в MCF-7 наблюдалось снижение пролиферации и блокада клеточного цикла на стадии G2M спустя 45 первые сутки полета. Интересно отметить, что после 48 ч полета наблюдалась обратная реорганизация МТ, близкая к таковой в контрольных клетках, однако в некоторых клетках обнаруженные ранее изменения МТ сохранялись (Vassy, Portet, Beil et al., 2001). Обнаруженное снижение пролиферации и блокада клеточного цикла позволяет предположить, что динамика цикличной деполимеризации/полимеризации МТ была нарушена действием микрогравитации, также как это было продемонстрировано в бесклеточных экспериментах Papaseit и соавторов (Papaseit, Pochon, Tabony, 2000), которые показали зависимость самоорганизации МТ от гравитации. Авторы постулировали, что самоорганизация МТ не возникает, если в течение первых 13 мин на них не действует сила тяжести. Поскольку цикл сборки/разборки МТ во время митоза в 10 раз быстрее, чем в интерфазном периоде, то нарушение процесса сборки МТ имеет большое значение при делении клеток (Saxton, Stemple, Leslie et al., 1984). Этот ускоренный оборот МТ соответствует флуктуации плотности субъединиц тубулина, и представляет собой окно, в течение которого реакционно-диффузная система подвергается бифуркации, запускаемой силой тяжести (Papaseit, Pochon, Tabony, 2000). Таким образом, каждый раз, когда клетка вступает в митоз в условиях микрогравитации, происходят аномалии организации МТ. Обнаруженные подтвердились и в во время наземных космического полета экспериментах с изменения строения использованием RPM. МТ Так, клиностатирование глиальных клеток в течение 20 ч вызывало потерю радиального расположения МТ и концентрацию их вокруг ядер клеток. После 32 ч клиностатирования происходила обратная реорганизация МТ в хорошо разветвленную радиальную сеть и сформированные ЦОМТ (Uva, Masini, Sturla et al., 2002). Позднее появились данные о действии микрогравитации на тубулиновый цитоскелет EA.hy926 клеток (Infanger, Kossmehl, Shakibaei et al., 2006). В работе показано, что моделируемая в течение 24 часов микрогравитация, приводила к утолщению МТ (α-тубулин) и компактизации вокруг клеточного ядра. Наблюдаемая деполимеризация МТ приводила к нарушению взаимодействия структур цитоскелета с клеточной мембраной, подтверждая давно сформированное мнение о том, что даже очень небольшие изменения объема клеток в результате гидростатического воздействия давления при низких значениях гравитации могут повлиять на ассоциацию мембраны и цитоскелета (Todd 1989). Нарушение нормальной ассоциации мембраны и цитоскелета вызывало блеббинг, потерю рецепторов на клеточной поверхности, потерю целостности клеток и нарушение рецепторопосредованной сигнальной трансдукции (Kaplan, Keough, 1982; Ingber 1993). 46 Возвращаясь к обсуждению механочувствительности ЭК необходимо отметить, что одно из первых исследований по изучению влияния микрогравитации на основные свойства этих клеток проводились в нашей лаборатории. Было показано, что в условиях длительного клиностатирования снижалась пролиферативная активность первичных ЭК, доказывая гравичувствительность этих клеток (Romanov, Kabaeva, Buravkova, 2000). В то же время, клиностатирование способствовало увеличению миграционной активности и распространению ЭК в модели экспериментальной раны. Кроме того, наблюдалась реорганизация актинового цитоскелета, которая характеризовалась смещением Fактиновых фибрилл к периферии клетки и образованием «волнистого края», что также указывает на увеличение подвижности ЭК (Buravkova, Romanov, 2001). В этой же работе была продемонстрирована обратимость наблюдаемых изменений архитектоники актинового цитоскелета при возвращении в статические условия (Буравкова, Мерзликина 2004). Таким образом, авторы считают увеличение клеточной подвижности и изменение функциональной активности адаптивным механизмом ЭК к условиям микрогравитации. Однако, другая группа авторов показала противоположные эффекты микрогравитации на ЭК. Carlsson и коллеги утверждают, что условия микрогравитации обратимо стимулируют рост ЭК, что коррелирует с повышенной экспрессией белка теплового шока hsp70 и понижающей регуляции интерлейкина 1 альфа (IL-1a), который является мощным ингибитором роста эндотелиальных клеток. Кроме того, авторы показали уменьшение фибрилл F-актина в условиях гравитационной разгрузки (96-144 ч), что сопровождалось значительным уменьшением количества этого белка в ЭК (Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003). В следующей работе для моделирования микрогравитации были использованы оба прибора RWV и RPM. Результаты оказались схожими и, как в предыдущем исследовании, показали, что микрогравитация стимулирует рост ЭК, не влияет на миграцию и продукцию оксида азота и снижает содержание актина в ЭК (Versari, Villa, Bradamante et al., 2007). При этом авторы отметили, что ремоделирование актинового цитоскелета – это достаточно раннее событие, которое наблюдается в течение нескольких часов (до 48 ч) в условиях гипогравитации, в то время как снижение уровня актина становится возможным для обнаружения лишь спустя 96 ч воздействия. Интересно, что данное утверждение частично согласуется с ранее полученными данными, где также отмечалось, что перестройка актинового цитоскелета заканчивается к 24 ч и сохраняется на протяжении 6 дней (Буравкова, Мерзликина 2004). Более того, большинство последующих исследований показало схожие результаты. Экспозиция конфлюэнтного монослоя ЭК на RPM в течение 24 ч вызывала дезорганизацию и перераспределение актиновых фибрилл внутри клеток 47 (Grenon, Jeanne, Aguado-Zuniga et al., 2013). Возможным последствием этого, авторы считают нарушение транспортировки молекул в направлении из клетки, например кавеолинов к кавеолам на плазматической мембране. Даже в микрососудистых ЭК легкого была отмечена дезорганизация F-актина после 72 ч 3D-клиностатирования (Kang, Zou, Yuan et al., 2011). Актиновые фибриллы были вытянуты и сконцентрированы вблизи клеточных контактов, образуя «звездчатые структуры». Таким образом, показано, что на начальном этапе микрогравитация вызывает реорганизацию всех важных компонентов цитоскелета, которые кроме структурной, выполняют целый ряд важнейших клеточных функций. Известно, что регулирование пролиферации клеток зависит от интеграции систем трансдукции сигнала, которые активируются посредством внешних сигнальных молекул, таких как факторы роста и компоненты внеклеточного матрикса. В зависимости от этих сетей сигнальной трансдукции, клетки решают переходить ли им в фазу G1 для продолжения пролиферации или, остановить клеточный цикл и подвергнуться апоптозу, дифференцировке или состоянию покоя. В качестве промежуточного фактора в сигнальной трансдукции, актин, вероятно, будет участвовать в регуляции клеточного цикла, вызванного внешним стимулом (Boonstra, Moes, 2005). Следовательно, микрогравитация может модулировать пролиферативную активность клетки путем реорганизации актинового цитоскелета (Romanov, Kabaeva, Buravkova, 2000; Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003). Протеинкиназа С (PKC) является ключевой молекулой в сигнальной трансдукции в лимфоцитах и тесно связана с цитоскелетом (Murti, Kaur, Goorha, 1992). В случае кардиомиоцитов, изозим РКС транслоцируется по стресс-волокнам актина, которые таким образом, демонстрируют функцию «магистрали» для транспортировки сигнальной молекулы (Mochly-Rosen, Henrich, Cheever et al., 1990). Молекулы, необходимые для связывания и активации PKC также связаны с этими элементами цитоскелета. Показано участие актиновых микрофиламентов в рецептор-опосредованной сигнальной трансдукции EGF и их роль в передаче сигнала через G-белки (подсемейства Rас, Rho и Cdc42) (Boonstra 1999). Ingber и соавторы в своей работе указывают на то, что многие из ферментов и субстратов, ответственных за синтез ДНК и белка, процессинга РНК и гликолиза связаны и иммобилизованы на цитоплазматических и ядерных элементах цитоскелета (Ingber 1993). Поэтому, если микрогравитация приводит к дезорганизации или неправильной реорганизации компонентов цитоскелета, то любая функция, следующая за ним в цепи сигнального каскада, будет поставлена под угрозу. 48 1.4. Молекулы адгезии эндотелиальных клеток: участие в реакции воспаления и механизмах гравитационной чувствительности. 1.4.1 Роль молекул адгезии в рекрутировании лейкоцитов, строение, экспрессия и сайты связывания VCAM-1. Эндотелий кровеносных сосудов играет важную роль во многих физиологических процессах: регуляции сосудистого тонуса, избирательной проницаемости, ангиогенеза, гемостаза и, конечно, поддержания антивоспалительного фенотипа в норме и развитии воспалительной реакции при патологии (Cines, Pollak, Buck et al., 1998; Романов, Кабаева, Буравкова, 2001; Michiels 2003). В ходе развития физиологической реакции воспаления, лейкоциты мигрируют из кровеносного русла в прилежащие ткани, благодаря участию молекул адгезии и хемокинов. Специфичность хоминга лейкоцитов в тканях регулируется комбинацией хемокинов в микроокружении, молекул адгезии на ЭК и наличием рецепторов лейкоцитов для этих хемокинов и молекул адгезии (Lalor, Shields, Grant et. al 2002; Старикова, Соколов, Сельков и др., 2010). Кроме того, комплекс сосудистых молекул адгезии, который экспрессируют ЭК, зависит от стимулятора, вызывающего активацию эндотелия. ЭК периферических лимфоузлов конститутивно экспрессируют молекулы адгезии, так как они постоянно активированы (Hendriks, Korn, Duijvestijn et al., 1988). В отличие от них, ЭК на участках с воспалением требуется индукция экспрессии молекул адгезии. Экспрессия молекул адгезии стимулируется некоторыми медиаторами, включая цитокины, синтезируемые в тканях, высоким уровнем внутриклеточных АФК, турбулентным током крови в местах бифуркации сосудов и микробной стимуляцией Толл-подобных рецепторов (TLRs) ЭК (Korenaga, Ando, Kosaki et al., 1997; Cassie, Masterson, Polukoshko et al., 2004; O'Keeffe, Muir, Piterina et al., 2009; Hortelano, LópezFontal, Través et al., 2010). Таким образом, стимулы микроокружения регулируют специфичность рекрутирования лейкоцитов. Рекрутирование лейкоцитов представляет собой трехступенчатый процесс, включающий качение («роллинг») лейкоцитов по поверхности эндотелия с последующей задержкой («арест»), обеспечиваемой высокоаффинной адгезией, и последующей трансмиграцией лейкоцита через эндотелиальный монослой. Роллинг лейкоцитов по люминальной мембране ЭК опосредуется низкоаффинными рецепторами: селектинами и адрессинами (McEver 2002; Vestweber 2003). Этот процесс начинается с захвата лейкоцита из потока крови, путем связывания L-селектина (CD62L), конструктивно экспрессирующегося на лейкоцитах, со своими гликопротеиновыми лигандами, которые экспрессируют ЭК (Abbassi, Lane, Krater et al., 1991). За «роллинг» лейкоцитов также 49 отвечают Е-селектин и P-селектин ЭК (CD62E и CD62P), путем связывания с гликопротеиновым лигандом P-селектина-1 (PSGL-1), который относится к тетрасахаридам сиалил-Льюис Х и экспонирован на поверхности лейкоцитов (Jones, Abbassi, McIntire et al., 1993; Lawrence, Springer, 1993). Второй шаг, характеризуется переходом от роллинга к аресту и обусловлен усилением экспрессии молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1 или CD54) на поверхности активированного эндотелия (Albelda, Smith, Ward, 1994) и активацией его контр-рецептора β2-интегрина, LFA-1 (α Lβ2 или CD11a/CD18), Mac-1 (α Mβ2 или CD11b/CD18) на поверхности лейкоцита (Dustin, Springer, 1988; Diamond, Staunton, de Fougerolles et al., 1990). Взаимодействие ICAM-1 с активированными β2-интегринами гарантирует стабильную, резистентную к напряжению сдвига, адгезию лейкоцита к ЭК сосудов (Smith, Marlin, Rothlein et al., 1989), и тем самым дает им возможность мигрировать через эндотелиальные клетки в прилежащие ткани. Кроме того, роллинг также может быть опосредован через взаимодействие α4β1-интегрина (VLA-4 или CD49d/CD29) лейкоцитов с его низкоафинным рецептором на ЭК - молекулой адгезии сосудистого эндотелия-1 (VCAM-1 или CD106) (Alon, Kassner, Carr et al., 1995). В условиях in vitro было показано, что после кластеризации молекул адгезии образуется «чашеподобная» структура, в условиях которой происходят два пути миграции лейкоцитов: пара- и трансцеллюлярный (Carman, Springer, 2004). Эта стыковочная структура включает в себя не только белки адгезии, но и компоненты цитоскелета, образуя выступы наподобие микроворсинок, которые окружают мигрирующие лейкоциты. Было показано, что данные структуры образуются при миграции лейкоцитов в условиях in vivo (Fujita, Puri, Yu et al., 1991). Афинность связывания лейкоцитарных интегринов с сосудистыми молекулами адгезии также резко возрастает при ассоциации хемокиновых рецепторов со своими агонистами (Carr, Alon, Springer, 1996). Поэтому, Т-клетки, В-клетки, тучные клетки, эозинофилы, моноциты и стволовые клетки мигрируют к VCAM-1, но их активация для связывания с этой молекулой зависит от присутствия специфичных к данным типам клеток хемокинов в микроокружении (Abonia, Austen, Rollins et al., 2005). VCAM-1 принадлежит семейству иммуноглобулинов и состоит из нескольких внеклеточных Ig-подобных доменов, содержащих дисульфидные связи и образующих петли одного трансмембранного домена и карбоксильного цитоплазматического домена, состоящего из 19 аминокислот (Osborn, Hession, Tizard et al., 1989). Внеклеточная область полноразмерной формы VCAM-1 состоит из 7-и, реже 6-ти, Ig-подобных доменов 50 (Cybulsky, Fries, Williams et al., 1991), с 1-м и 4-м из них связывается интегрин VLA-4 (Osborn, Hession, Tizard et al., 1989). Молекулы VCAM-1, играя столь важную роль в адгезии и миграции лейкоцитов, располагаются на мембране упорядоченно. Было обнаружено, что на активированных ЭК VCAM-1 располагается на так называемых «липидных рафтах», содержащих ICAM-1 и тетраспанины CD9, CD81 и CD151 (Barreiro, Zamai, Yáñez-Mó et al., 2008). Когда Т-клетки адгезируют на активированном монослое HUVEC, то VCAM-1, ICAM-1, CD9, CD81 и CD151 колокализуются кольцом вокруг лимфоцита (Barreiro, Yáñez-Mó, Sala-Valdés et al., 2005). С помощью ко-иммунопрецпитации также обнаружили, что VCAM-1 ассоциирована с CD151, а ICAM-1 – с CD9. В статичных условиях связывания, редукция CD151 или CD9 в HUVEC, с использованием siRNA, не изменяла уровень адгезии лимфоцитов в сравнении с контрольными образцами. И наоборот, при воздействии напряжения сдвига физиологической величины (5-15 дин/см2) редукция CD151 или CD9 значительно снижала адгезию и миграцию лимфоцитов через HUVEC (Barreiro, Yáñez-Mó, Sala-Valdés et al., 2005). Поэтому тетраспанины CD9 и CD151 очень важны для экспрессии и функционирования VCAM-1 в условиях непрерывного тока крови. Рис. 6. Модель сигнального каскада, активируемого связыванием агониста с рецептором VCAM- (а) (Cook-Mills, Marchese, Abdala-Valencia, 2011); сигнальный каскад, опосредующий TNF-α-индуцированную экспрессию ICAM-1 эндотелиальными клетками (б) (Rahman, Fazal 2009). Экспрессия VCAM-1 ЭК индуцируется в ответ на действие цитокинов или турбулентного напряжения сдвига. Воздействие этих индукторов приводит к увеличению АФК, которые в свою очередь активируют NFκB (Marui, Offermann, Swerlick et al., 1993; 51 Khan, Harrison, Olbrych et al., 1996; Min, Kim, Kim et al. 2005; Sung, Yee, Eskin et al., 2007). После чего синтез белка VCAM-1 занимает несколько часов. Затем, связывание лиганда с VCAM-1 индуцирует быструю активацию сигнального каскада, опосредованного низкими уровнями АФК, что приводит к инициированию трансэндотелиальной миграции. Было показано, что активация VCAM-1 стимулирует верапамил-чувствительные кальциевые каналы, высвобождение внутриклеточного кальция и активацию «малого» G-белка Rac1 (Matheny, Deem, Cook-Mills, 2000; Cook-Mills J.M., Johnson J.D., Deem T.L. et al., 2004) (рис. 6). Поток ионов кальция и Rac1 активируют NADPH-оксидазный комплекс (NOX2), специфичный для ЭК (Jones, O'Donnell, Wood et al., 1996). Активированная NOX2 продуцирует супероксидный радикал, который затем вступает в реакцию дисмутации с образованием перекиси водорода (Н2О2) в количестве 1 мкМ (Cook-Mills J.M., Johnson J.D., Deem T.L. et al., 2004). Кроме того, активность эндотелиальной NADPH-оксидазы опосредует изменения актинового цитоскелета ЭК при образовании «чашеподобной» структуры (Matheny, Deem, Cook-Mills, 2000). Затем, в процессе VCAM-1-опосредованного сигнального пути, Н2О2 окисляет продомен матриксной металлопротеиназы (MMPs), тем самым вызывая его аутокаталитическое расщепление и активацию. Активированные с помощью АФК ММРs деградируют внеклеточный матрикс и могут расщеплять молекулы клеточных контактов, таких как VE-кадгерин (Herren, Levkau, Raines et al., 1998). Эта деградация с участием ММРs, возможно, участвует в открывании межклеточных адгезивных контактов для формирования «канала», через который может мигрировать лейкоцит. В это же время, 1 мкл Н2О2 также диффундирует через клеточную мембрану со скоростью 100 мкм/с и активирует р38 МАРК, регулирующую образование межклеточных «разрывов» в монослое ЭК (van Wetering, van den Berk, van Buul et al., 2003). Н2О2 также, напрямую, окисляет и активирует внутриклеточную протеин киназу Сα (РКСα) в ЭК (AbdalaValencia, Cook-Mills, 2006). Активированная РКСα, в свою очередь, индуцирует фосфорилирование протеин тирозин фосфатазы 1В (РТР1В) (Deem, Abdala-Valencia, Cook-Mills, 2007). В конечном итоге, сигнал от фосфорилированной формы РТР1В, которая отвечает за регуляцию клеточных контактов, передается на другие посредники. Необходимо отметить, что некоторые переносчики сигнала характерны не только для VCAM-1. Например, ICAM-1 сигнальный путь также активируется потоком ионов кальция и задействует РКС и р38 МАРК. Кроме того, благодаря наличию общего посредника - р38 МАРК, сигнальный каскад обеих молекул может запускаться изменениями строения цитоскелета в ЭК (Etienne-Manneville, Manneville, Adamson et al., 2000; Wang, Doerschuk, 2001). 52 VCAM-1 функционирует в сочетании с другими молекулами, регулируя иммунный надзор и воспаление. Экспрессию VCAM-1 вызывают цитокины, синтезируемые в тканях, высокие уровни АФК, окисленные липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), 25гидроксихолистерин, турбулентное напряжение сдвига (turbulent shear stress), высокое содержание глюкозы и микробная стимуляция TLRs ЭК (Marui, Offermann, Swerlick et al., 1993; Reinhardt, Kubes, 1998; Cassie, Masterson, Polukoshko et al., 2004; Hortelano, LópezFontal, Través et al., 2010). Активация экспрессии гена VCAM-1 регулируется универсальными ядерными факторами транскрипции NF-κB, SP-1, Ap-1 и фактором регуляции интерферона-1 (Lechleitner, Gille, Johnson et al., 1998; Tummala, Chen, Sundell et al., 1999; Costanzo, Moretti, Burgio et al., 2003; Piga, Naito, Kokura et al., 2007). Поэтому экспрессию VCAM-1 вызывают такие цитокины, как фактор некроза опухолей (TNF-α) и интерлейкин-1β (ИЛ-1β), адипокин висфатин, проатерогенная аминокислота гомоцистеин и проатерогенная гипергликемия (Min, Kim, Kim et al., 2005; Carluccio, Ancora, Massaro et al., 2007). Механизм действия этих стимуляторов опосредован через увеличение синтеза АФК и стимуляцию NF-κB. Однако, концентрация, синтезируемых ЭК АФК в ответ на эти стимуляторы, до сих пор не известна. Активируемая TNF-α экспрессия VCAM-1 блокируется супероксидом, полученным при оверэкспрессии супероксиддисмутазы, но не блокируется пероксидом водорода, полученным при оверэкспрессии каталазы в ЭК (Chen, Zhang, Zhao et al., 2003). В соответствии с этими данными, связывание NF-κB с промотером гена VCAM1, экспрессия которого была индуцирована TNF-α, может блокироваться оксидом азота, который, как известно, может быть окислен до супероксида. Именно поэтому турбулентный поток может индуцировать экспрессию VCAM-1, при этом напряжение сдвига, циклично деформируя ЭК, индуцирует формирование АФК в этих клетках, которые затем активируют экспрессию гена VCAM1 (Sung, Yee, Eskin et al., 2007). Кроме основной формы мембранного рецептора,VCAM-1 присутствует в плазме крови в растворимой форме (sVCAM-1) и может быть использован как прогностический биомаркер заболеваний (Arora, Gunther, Wennerblom et al., 2010). Уровень sVCAM-1 в плазме увеличивается при активации ЭК при патогенезе множества заболеваний (Fernvik, Halldén, Lundahl et al., 1999; Campbell, Woodward, Chalmers et al., 2006; Cheung, Tomic, Chen et al., 2009). Этот sVCAM-1 либо обеспечивает предельное связывание лейкоцитарного интегрина и эндотелиального VCAM-1 путем предварительного связывания с лейкоцитами, либо стимулирует лейкоцитарный хемотаксис (Kitani, Nakashima, Izumihara et al., 1998; Tokuhira, Hosaka, Volin et al., 2000). 53 Таким образом, знание механизмов активации экспрессии VCAM-1 помогает понимать основы клеточного иммунного ответа. Кроме того, в сигнальный каскад, запускаемый лиганд-специфичным связыванием VCAM-1, входит посредник, участвующий в ремоделировании цитоскелета и TNF-α-индуцированном сигналинге. Знание этих механизмов необходимо при изучении развития воспалительной реакции в ЭК в условиях микрогравитации и последующей интерпретации выявленных эффектов. 1.4.2 Строение ICAM-1, экспрессия и кластеризация Молекула ICAM-1 представляет собой гликопротеин, состоящий из 505 остатков аминокислот с молекулярной массой в пределах от 76 до 114 кДа, зависящей от степени тканеспецифического гликозилирования (Staunton, Marlin, Stratowa et al., 1988). Вместе с VCAM-1 является членом надсемейства иммуноглобулинов (IgSF) молекул адгезии и характеризуется наличием пяти внеклеточных Ig-подобных доменов (D1-5), гидрофобного трансмембранного домена и короткого цитоплазматического домена, состоящего из 28 аминокислот (Staunton, Marlin, Stratowa et al., 1988; Staunton, Merluzzi, Rothlein et. al 1989). Сайт связывания LFA-1 присутствует в домене D1, тогда как сайт связывания Mac-1 расположен в D3 молекулы ICAM-1 (Diamond, Staunton, de Fougerolles et al., 1990). Внеклеточные домены ICAM-1 необходимы и достаточны для того, чтобы опосредовать прочную адгезию лейкоцитов к эндотелию. В соответствии с этим, как показали исследования, экспрессируемая на поверхности клетки мутантная ICAM-1, лишенная цитоплазматического домена, была способна поддерживать прочную адгезию Тлимфоцитов к эндотелиальным клеткам (Engelhardt, Wolburg, 2004). Цитоплазматический домен ICAM-1 взаимодействует с актиновым цитоскелетом с помощью α-актинина, эзрина и моэзина, локализующихся у клеточной поверхности микроворсинок (Carpen, Pallai, Staunton et al., 1992; Heiska, Alfthan, Gronholm et al., 1998). Накопленные данные свидетельствуют, что цитоплазматический домен ICAM-1 играет ключевую роль в обеспечении трансэндотелиальной миграции лейкоцитов (Lyck, Reiss, Gerwin et al., 2003; Yang, Froio, Sciuto et al., 2005). Экспрессия гена ICAM-1 в ЭК может быть вызвана различными посредниками, в том числе тромбином, TNF-α, ИЛ-1β, липополисахаридом (LPS), форболовыми эфирами (РМА), сосудистым фактором роста эндотелия (VEGF), напряжением сдвига, антиоксидантами, инфекционными агентами и высоким уровнем глюкозы (Burns, Pooley, Walsh et al., 1999; Minami, Aird, 2005; Quagliaro, Piconi, Assaloni et al., 2005). Анализ строения ICAM1 показал, что экспрессия гена регулируется, главным образом, на уровне транскрипции, так как промотор содержит 54 сайты связывания для нескольких транскрипционных факторов: два сайта связывания для NF-κВ и три для АР-1 (Voraberger, Schafer, Stratowa, 1991). Транскрипцию ICAM1 в ЭК, опосредованную через повышение внутриклеточного уровня АФК, могут вызывать цитокины, ЛПС, ангиотензин II (Ag-II), циклические деформации и напряжение сдвига, высокое содержанием глюкозы, гомоцистеин, и железо (Arai, Kelly, Brengman et al., 1998; Chiu, Wung, Shyy et al., 1997; Papatheodorou, Weiss, 2007). Недавно полученные данные показали, что NADPH-оксидаза является основным источником генерации АФК в ЭК (Alom-Ruiz, Anilkumar, Shah, 2008; Watson, Goon, Lip, 2008) и, таким образом, имеет решающее значение в экспрессии ICAM1. Следовательно, перечисленные активаторы экспрессии ICAM-1 могут действовать через NADPH-оксидазу. В частности, было установлено, что связывание TNF-α со своим рецептором на ЭК вызывает активацию NADPH-оксидазы, что приводит к деградации комплекса NF-κВ c его ингибиторным белком IκBα, активации NF-κВ и впоследствии, экспрессию гена и рецептора ICAM-1 (Fan, Frey, Rahman et. al 2002; Li, Fan, Christie et. al 2005). Огромную роль в регуляции TNF-α опосредованной активации NADPH-оксидазы играет протеинкиназа С дзета типа (PKCζ) (Frey, Rahman, Kefer et al., 2002) (рис. 6 б). Помимо этой важной функции, PKCζ осуществляет контроль активации NF-κВ, содействуя связыванию ДНК с этим транскрипционным фактором. Исследования Anrather и соавт. (Anrather, Csizmadia, Soares et al., 1999) показали, что PKCζ регулирует транскрипционную активность NF-κВ с помощью механизма, включающего фосфорилирование RelA/p65, что повышает его активность (рис. 6 б). Естественно, что для различных индукторов экспрессии ICAM-1 существуют и другие сигнальные пути, например, МАР-киназный путь с активацией JNK или РI3K/Akt каскада. Огромное значение для адгезии и последующей миграции лейкоцитов играет кластеризация рецепторов ICAM-1 на поверхности ЭК, которая происходит после взаимодействия с лейкоцитарными β2-интегринами (Wojciak–Stothard, Williams, Ridley, 1999; Cernuda-Morollón, Ridley, 2006). В поддержку кластеризации ICAM-1 как определяющего фактора «адгезивности» эндотелия, было показано, что димеризованная молекула ICAM-1 имеет, примерно в 1,5 - 3 раза, более высокое сродство к I-домену LFA1, чем мономер ICAM-1 (Jun, Carman, Redick et al., 2001). В этом исследовании авторы также предположили, что димеры и W-образные тетрамеры образуют олигомеры ICAM-1, что может иметь важные последствия для регулирования адгезии лейкоцитов. Совсем недавно, Milan и соавторы (Millan, Hewlett, Glyn et al., 2006) показали, что кластеризация ICAM-1 вызывает перемещение апикальных молекул ICAM-1 в кавеолин-1-богатые районы, расположенные близко к концам актиновых стресс-волокон. В этих F-актин богатых районах, ICAM-1 интернализуется и путем трансцитоза проникает к базальной 55 мембране внутри кавеолы (Millan, Hewlett, Glyn et al., 2006). Затем следует слияние кавеол, содержащих ICAM-1, в мультивезикулярные структуры, что приводит к образованию трансцеллюлярных пор, характеризующихся кольцом F-актина и кавеолина1, с помощью которых лейкоциты сжимаются и пересекают тело эндотелиальной клетки. Индукция экспрессии генов ЭК представляет еще одно важное следствие взаимодействия ICAM-1 с лигандом. Связывание ICAM-1 приводит к активации ERK-1 и транскрипционного фактора AP-1, напрямую не вызывая увеличения активности NF-κB и транскрипции гена VCAM1 в HUVEC (Lawson, Ainsworth, Yacoub et al., 1999). Предварительная обработка клеток ингибитором МЕК PD98059 ингибирует экспрессию VCAM-1 в ответ на связывание ICAM-1 с лигандом, свидетельствуя о том, что сигнальный путь ERK участвует в ICAM-1-опосредованной экспрессии VCAM-1. Активация ERK1/2 также необходима для синтеза IL-8 и RANTES (Sano, Nakagawa, Chiba et al., 1998) и экспрессии ICAM-1 (Clayton, Evans, Pettit et al., 1998) в ответ на связывание ICAM-1 с лигандом. Кроме того, связывание ICAM-1 индуцирует транскрипцию с-fos и rhoA в ЭК (Thompson, Randi, Ridley, 2002). Учитывая, что RhoA играет важную роль в опосредовании экспрессии ICAM-1 в ЭК, эти результаты предполагают возможность положительной обратной связи между RhoA и ICAM-1, которая, может служить для усиления их экспрессии, и тем самым, содействовать устойчивой адгезии и трансмиграции лейкоцитов к месту воспаления. В дополнение к регуляции динамики цитоскелета, клеточной адгезии и миграции Rho ГТФазы также могут влиять на экспрессию генов (Cammarano, Minden, 2001). Действительно, было показано, что ГТФазы могут быть определяющими детерминантами экспрессии ICAM-1 в ЭК. Chen и соавторы (Chen, He, Wang et al., 2003) использовали экспрессию доминантно негативного мутанта Rac1 (N17Rac1) для рассмотрения вопроса о роли ГТФаз в опосредовании экспресси гена ICAM в ЭК. В описанной модели, экспрессия N17Rac1 ингибировала TNF-α-индуцированную экспрессию ICAM-1 путем подавления транскрипционной активности NF-κB. Кроме того, экспрессия N17Rac1 также эффективно предотвращала экспрессию ICAM-1, вызванную добавлением ИЛ-6 (Wung, Ni, Wang 2005). В другом исследовании было обнаружено, что активация Rac1 от действия напряжения сдвига имеет решающее значение для NF-κB-зависимой экспрессии ICAM-1 (Tzima, Del Pozo, Kiosses et. al 2002). И наконец, ингибирование RhoA значительно снижало LPS-индуцированную экспрессию ICAM-1 в ЭК (Takeuchi, Kawashima, Rikitake et al., 2000). Следовательно, считается, что RhoA и Rac1 регулируют экспрессию ICAM-1 в основном в ответ на действие различных стимуляторов. Однако, точный сигнальный каскад, запускаемый ГТФазами, остается предметом многочисленных споров. Одни 56 исследования показали, что TNF-α-индуцированная экспрессия ICAM-1 происходит независимо от активации RhoA/ROCK пути (Cernuda-Morollon, Ridley, 2006). В других, наоборот, показано, что посредником TNF-α-индуцированной реорганизации цитоскелета и апоптоза ЭК является RhoA/ROCK (Wojciak–Stothard, Entwistle, Garg et al., 1998; Petrache, Crow, Neuss et al., 2003). Причины различных эффектов RhoA/ROCK на экспрессию ICAM-1 не ясны. Возможное объяснение заключается в том, что в клетках из разных источников и при использовании различных количеств TNF-α, сигнальный каскад опосредуется специализированным набором нижестоящих эффекторов. Совокупность всех данных подтверждает мнение, что каждая система рецепторов использует определенный набор молекул адаптера и сигнальных ферментов, чтобы построить уникальный сигнальный путь активации экспрессии ICAM-1, в зависимости от агониста и типа клеток. 1.4.3 Строение Е-селектина, экспрессия и кластеризация Семейство молекул адгезии селектинов включает в себя Е-селектин, L-селектин и Pселектин и опосредует взаимодействие циркулирующих лейкоцитов с сосудистым эндотелием в различных физиологических и патологических условиях (Kansas 1996). Уникальный среди молекул своего семейства, Е-селектин, как правило, не обнаруживается в неактивированных эндотелиальных клетках, но быстро синтезируется в ответ на действие определенных цитокинов и других провоспалительных стимулов, что делает его маркером «активированного» эндотелиального фенотипа (Bevilacqua, Pober, Mendrick et al., 1987). Совместно с другими членами семейства селектинов, Е-селектин демонстрирует сложную мозаичную структуру: большая внеклеточная часть состоит из концевого лектинового домена, домена эпидермального фактора роста, и нескольких регуляторных повторов; цитоплазматический трансмембранный домен (Bevilacqua, домен Nelson, и 1993). относительно Безусловно, короткий PSGL-1 функционирует в качестве основного лиганда для обоих Е- и Р-селектинов (McEver, Cummings, 1997), но для Е-селектина существуют и другие лиганды (Yang, Furie, Furie 1999). Одной из основных функций Е-селектина является инициация «роллинга» лейкоцитов на поверхности активированного эндотелия, что было показано в различных in vitro и in vivo моделях (Bevilacqua, Nelson 1993; Jung, Norman, Scharffetter-Kochanek et al., 1998). В дополнение к своей основной функции, было показано, что селектины играют определенную роль в передаче сигнала во время лейкоцитарно-эндотелиального взаимодействия. Связывание лиганда с Е-селектином вызывает кластеризацию данного 57 рецептора в области контакта лейкоцита с ЭК. После чего, цитоплазматический домен данного рецептора оказывается связанным с актиновыми филаментами цитоскелета ЭК (Yoshida, Westlin, Wang et al., 1996). В той же работе авторы показали, что цитоплазматический домен Е-селектина также оказывается связан с целым комплексом белков цитоскелета - α-актинином, винкулином, филамином, паксиллином и регуляторным ферментом - киназой фокальной адгезии (FAK). Данные белковые комплексы опосредуют связь цитоскелета с интегрин-содержащими комплексами фокальной адгезии на базальной стороне ЭК (Pavalko, Otey, 1994). Следовательно, связывание кластеризованных рецепторов Е-селектина на люминальной поверхности ЭК с актиновыми филаментами выполняет функцию проводника сигнала внутрь клетки. По мнению авторов, именно через них может передаваться химический и механический сигнал при кластеризации Е-селектина на цитоскелет, что может повлиять на функционирование других молекул адгезии ICAM-1, VCAM-1 и PECAM-1 (Yoshida, Westlin, Wang et al., 1996). Lorenzon и сотрудники показали, что связывание Р-селектина или E-селектина с агонистом вызывало кратковременное повышение внутриклеточного кальция в ЭК, что дополнительно указывало на сигнальную функцию этих сосудистых селектинов (Lorenzon, Vecile, Nardon et al., 1998). Кроме того, с примененем блокирующих антител к E-селектину, удалось обнаружить следующее звено в сигнальном каскаде, запускаемом этой молекулой адгезии. Связывание E-селектина с лигандом на поверхности активированного эндотелия приводило к активации сигнального пути с участием МАРК, и последующим увеличением транскрипции раннего гена с-fos (Hu, Kiely, Szente et al., 2000). Причиной для новых исследований Е-селектин-опосредованного сигнального каскада стала работа Cinamon и соавторов, свидетельствующая об увеличении трансмиграции лейкоцитов в ответ на действие напряжения сдвига (Cinamon, Shinder, Alon, 2001). Оказалось, что в условиях ламинарного потока, адгезия лейкоцитов на поверхности цитокин-активированных ЭК, опосредованная Е-селектином, вызывает увеличение уровня внутриклеточного Ca2+ и фосфорилирование ERK2 (Cuvelier, Paul, Shariat et al., 2005). Авторы также показали, что нарушение полимеризации актиновых стресс-волокон в данной модели снижает фосфорилирование ERK2 и ингибирует весь последующий сигнальный каскад. Однако, подобный сигнальный каскад может быть запущен при связывании VCAM-1, причем уровень фосфо-ERK2 увеличивается в 2 раза сильнее, чем при Е-селектин-опосредованном связывании (Cuvelier, Paul, Shariat et al., 2005). Кроме того, связывание VCAM-1 или E-селектина по отдельности активирует 58 различные сигнальные пути, опосредованные Rho/ROCK или МАРК в ЭК (Hu, Szente, Kiely et al., 2001; Cook-Mills, Johnson, Deem et al., 2004) (рис. 7). Рис. 7. Модель механотрансдукции, вызванной адгезией лейкоцитов. Лейкоциты связываются с молекулами адгезии, экспрессированными на люминальной поверхности эндотелиальных клеток, в условиях кровотока, изменяя действие местных сил тока жидкости. Эти физические изменения могут быть переданы с помощью цитоскелета, на фокальные контакты на базолатеральной стороне ЭК. (3) Механочувствительные катионные каналы приводят к увеличению внутриклеточного кальция. (4) Интегринопосредованная передача сигналов приводит к фосфорилированию FAK и паксиллина (Pах). Эти события повышают активность ERK2 и ROCK. (5) Aктивации кальпаина приводит к деградации белков-мишеней, ответственных за трансмиграцию (Cuvelier et.al. 2005). Выбрать доминирующий путь в данный момент не возможно, однако, есть мнение, что эти сигнальные пути в одиночку не достаточны для индукции трансмиграции лейкоцитов, но они могут взаимодействовать в целях усиления трансмиграции (Cuvelier, Paul, Shariat et al., 2005). Таким образом, опираясь на данные, доказывающие чувствительность ЭК к гравитационному стимулу (Романов, Кабаева, Буравкова, 2000), можно предположить, что Е-селектин наравне с другими молекулами адгезии, может рассматриваться в качестве гравичувствительного рецептора. 1.5 Влияние микрогравитации на экспрессию молекул адгезии Среди исследований, посвященных физиологическим эффектам космического полета на организм человека, большее внимание уделяется иммунной системе (Levine, Greenleaf, 1998). Многочисленные исследования показали, что космический полет 59 приводит к некоторому снижению иммунных функций (Taylor, Janney, 1992; Stowe, Sams, Mehta et al., 1999; Meshkov, Rykova, 1995; Mehta, Kaur, Grimm et al., 2001). Как отмечалось выше, оборот лейкоцитов и миграция в очаги воспаления и инфекции зависит от поверхностной экспрессии различных клеточных молекул адгезии. В связи с этим, любые эффекты космического полета на молекулы адгезии лейкоцитов следует рассматривать с точки зрения потенциально соответствующим им эффектам на эндотелиальные молекулы адгезии, являющихся контр-рецепторами. Поэтому, Stowe и соавторы исследовали экспрессию L-селектина (CD62L) и LFA (CD11b) на нейтрофилах в условиях краткосрочного космического полета, и отметили, что в модели in vitro адгезия нейтрофилов к HUVEC была увеличена после приземления (Stowe, Sams, Mehta et al., 1999). Следующим шагом стала попытка оценить экспрессию молекул адгезии косвенно, по количеству циркулирующей в крови растворенной формы ICAM-1 (sICAM-1) (Mills, Perez, Adler et al., 2002). В исследовании были собраны образцы крови 22 космонавтов. Результаты исследования показали, что в условиях краткосрочного космического полета происходило снижение уровня sICAM-1, что, по мнению авторов, может свидетельствовать о снижении экспрессии данного рецептора и адгезии лейкоцитов к поверхности ЭК (Mills, Perez, Adler et al., 2002). Так как, уровни циркулирующих растворенных форм молекул адгезии не всегда коррелируют с экспрессией этих молекул на поверхности клеток при патогенезе некоторых заболеваний, то потребовались дальнейшие исследования по изучению адгезивной функции ЭК в условиях микрогравитации (Peter, Nawroth, Conradt et al., 1997). В силу невозможности прямого изучения экспрессии молекул клеточной адгезии ЭК человека, исследователи стали прибегать к использованию наземных экспериментальных моделей моделирующих условия космического полета. Одной из первых работ по изучению экспрессии молекул адгезии ЭК в условиях моделируемой микрогравитации in vitro было исследование, проведенное в нашей лаборатории (Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005). В качестве объекта исследования выступала первичная культура HUVEC, а моделирование условий микрогравитации проводилось на 2D клиностате. Кроме интактной культуры клиностатированию подвергались клетки, активированные низкими дозами TNF-α. В работе было показано, что клиностатирование HUVEC в течение 18 ч способствовало увеличению экспрессии ICAM-1 как интактных, так и TNF-α-активированных клеток. Также авторам удалось установить, что в условиях моделируемой микрогравтации адгезивные параметры эндотелия смещались в сторону преимущественного взаимодействия с активированными клетками крови. 60 Адекватной наземной моделью гравитационной разгрузки in vivo считается антиортостатическое вывешивание крыс (Woodman , Sebastian , Tipton 1995; Vaziri, Ding, Sangha, 2000). Jung и соавторы используя данную модель, показали, что 7-ми и 28-ми дневное вывешивание приводило к увеличению экспрессии ICAM-1 в сонной артерии и грудной аорте крыс (Jung, Chung, Lee, 2005). Однако, в бедренной артерии, которая является целевой в данной экспериментальной модели, не было выявлено изменений в экспрессии данного рецептора. Авторы заключили, что увеличение напряжения сдвига в сонной артерии и грудной аорте послужило индуктором экспрессии ICAM-1, в то время как снижение данной физической силы в бедренной артерии не влияло на адгезивные свойства ЭК. В это же время происходило усовершенствование наземных установок для моделирования условий микрогравитации. Применение 2D клиностатов подвергалось критике и все больший круг исследователей начинало использовать новый прибор, позволяющий наиболее точно имитировать условия микрогравитации за счет рандомизации положения объекта относительно вектора гравитации, RPM (Kraft, van Loon, Kiss, 2000). Grimm и сотрудники подвергали 7-ми и 28-ми дневной экспозиции на RPM иммортализованные линейные клетки сосудистого эндотелия человека (EA.hy926). Результаты показали, что уже на 7-й день экспозиции уровень sICAM-1 был ниже контрольных значений, а к 28-му – снижался еще сильнее и был на грани чувствительности метода его определения. sVCAM-1 обнаруживался в культуральной среде только после добавления основного фактора роста фибробластов (bFGF), и также снижался до базового уровня при 3D клиностатировании (Grimm, Bauer, Ulbrich et al., 2010). Однако, изучение транскрипции соответствующих секретируемых белков показало, что мРНК ICAM-1 присутствовала в равной концентрации как в 7-дневных контрольных ЭК, так и в культурах, подвергавшихся микрогравитации. Кроме того, уровень мРНК VCAM-1 был выше в ЭК, культивируемых в условиях микрогравитации, чем в контрольных клетках. В связи с этим, авторы сделали вывод, что нет никакой корреляции между уровнями растворимых форм рецепторов клеточной адгезии, содержащимися в культуральной среде, с соответствующими им уровнями мРНК. Продолжением работы Буравковой и соавторов, явился эксперимент американского коллектива ученых (Grenon, Jeanne, Aguado-Zuniga, 2013). Объект исследования и длительность клиностатирования остались прежними (HUVEC, 24 часа). Однако используемый ранее 2D клиностат заменили на RPM, а к измерениям добавилась вторая временная точка - 48 ч. Результаты исследования показали значительное снижение экспрессии генов ICAM1, VCAM1 и Е-селектина (SELE) после 24 ч 3D-клиностатирования. 61 Отражая снижение экспрессии генов, резко уменьшилось и число ICAM-1-, VCAM-1, Eселектин-положительных клеток в популяции. Описанные изменения сохранялись и после 48 ч клиностатирования. Интересно, что эти данные расходятся с результатами более ранней работы и авторы объясняют это различными условиями культивирования HUVEC. Совершенствование сконструировать научно-технической автономные или базы полуавтономные позволило миниатюрные инженерам устройства с возможностью культивирования различных типов клеток и микроорганизмов в условиях космического полета. Такие устройства работают по принципу биореакторов с возможностью смены культуральной среды, поддержанием необходимой газовой среды и температуры. Используя одно из подобных устройств (Fluid processing apparatus) и HUVEC, адгезированные на микроносителях, Muid и соавторы продемонстрировали, что 12-дневный космический полет вызывает увеличение уровня sICAM-1 в культуральной среде, а уровень sVCAM-1 остается неизменным (Muid, Froemming, Manaf et al., 2010). Кроме того, микрогравитация вызывала увеличение экспрессии генов ICAM1 и VCAM1, что позволило авторам заявить о корреляции между экспрессией гена и концентрацией растворимой формы рецептора ICAM-1. Однако, эти данные противоречат результатам исследования, проведенных на людях, в которых 10 – 12-дневный космический полет вызывал снижение уровня sICAM-1 (Mills, Perez, Adler et al., 2002). Такое несоответствие в результатах авторы объяснили различиями в экспериментальных моделях in vitro и in vivo. Не смотря на то, что на данный момент накоплено большое количество работ по изучению влияния микрогравитации на адгезивные свойства эндотелия, стоит очень осторожно сравнивать эффекты, выявленные в экспериментах, с применением различных моделей, клеточных линий и условий культивирования. Кроме того, ученый мир остается, по-прежнему, далек от понимания особенностей функционирования некоторых молекул клеточной адгезии, как этапа клеточного иммунитета в условиях микрогравитации, поскольку изучает их в нормальном эндотелии, в то время как провоспалительная активация коренным образом изменяет физиологию ЭК. 1.6 Влияние микрогравитации на секрецию интерлейкинов эндотелиальными клетками. Эндотелий кровеносных сосудов играет важную роль во многих физиологических процессах: регуляции сосудистого тонуса, изберательной проницаемости, ангиогенеза, текучести крови, гемостаза и, конечно, поддержания антивоспалительного фенотипа в норме и развитии воспалительной реакции при патологии (Cines, Pollak, Buck et al., 1998). 62 ЭК вовлекаются в инициацию и развитие физиологического клеточного иммунного ответа используя процессы рекрутирования лейкоцитов из кровеносного русла, их рециркуляции, хоуминга и адгезии, синтеза цитокинов, презентации антигена и др. (Hirschberg 1981; Pober, Cotran, 1990; Rose 1998; Pober 1999). Клеточный иммунный ответ представляет собой набор антигенспецифических иммунных реакций, которые могут быть адаптивно переданы от сенсибилизированного индивидуума к неиммунизированному посредством Т-лимфоцитов. Сосудистые ЭК играют две важные роли в эволюции реакций клеточного иммунитета: презентация антигена Т-клеткам и рекрутирование иммунных клеток (Butcher, Picker, 1996). Реакции клеточного иммунитета развиваются непосредственно в периферических тканях, в которых циркулируют Т-клетки памяти, которые активируются антигеном, представленным на поверхности резидентной клеточной популяции, в отличие от врожденного иммунитета, который начинается во вторичных лимфоидных органах, таких как лимфатические узлы и селезенка, где наивные Т-клетки сталкиваются с антигеном на поверхности специализированной антигенпрезентирующей клетки (АПК). После того, как эффекторные клетки и клетки памяти созревают во вторичных лимфоидных органах, они мигрируют в периферические ткани через кровоток, где возможна их реактивация при встрече с антигеном. Существует два типа клеток, которые могут презентировать антиген специфическим Т-клеткам в периферических тканях, это резидентные макрофаги и сосудистые ЭК. В условиях in vitro, культивируемые ЭК человека из различных участков сосудистого русла конститутивно экспрессируют молекулу главного комплекса гистосовместимости I типа (МНС I). В то же время, стимуляция IFN-γ индуцирует экспрессию молекул МНС II на поверхности ЭК. В условиях in vivo, сосудистые ЭК конструктивно экспрессируют молекулы MHC обоих классов, а уровни их экспрессии увеличиваются в ответ на действие IFN-γ (Cines, Pollak, Buck et al., 1998). Для активации наивных Т-клеток и Т-клеток памяти необходима экспрессия не только молекул МНС, но и поверхностных костимулирующих молекул, связывание с которыми повышает чувствительность Т-клеток к антигензависимому распознаванию (Pober, Orosz, Rose et al., 1996). В этом и кроется главное отличие «профессиональных» АПК от ЭК, которые экспрессируют только один тип костимулирующих молекул LFA-3 (CD58), связывающихся с CD2 Т-клеток памяти (Karmann, Pober, Hughes, 1994). Рекрутирование воспалительных клеток – это вторая роль ЭК в клеточном иммунитете. После того, как Т-клетки памяти активируются антигенами, они, в свою очередь, могут активировать различные 63 функции EC, которые способствуют рекрутированию воспалительных клеток. Т-клеточные активирующие ЭК сигналы могут быть контакт-зависимыми (например, Т-клеточный лиганд CD40 может участвовать EC CD40) или опосредованными цитокинами. В первом случае Т-клетки, несущие на своей поверхности CD40-лиганд, связываются с CD40 ЭК, что приводит к ее активации. Во втором случае Т-клетки секретируют TNF-α, IFN-γ и IL-4, которые связываются со своими рецепторами на поверхности ЭК и активируют их (Pober, Cotran 1990). Активированные ЭК изменяют свой фенотип на прокоагулянтный, вазоконстрикторный и провоспалительный, начиная синтезировать вазодилататоры и экспрессировать на своей поверхности молекулы клеточной адгезии, профиль которых измененяется с течением времени: в начальный момент времени для адгезии нейтрофилов экспрессируется Eселектин, а более поздняя фаза характеризуется адгезией остальных типов лейкоцитов за счет экспрессии VCAM-1. То же самое происходит и с секрецией хемокинов: первыми синтезируются СХСL хемокины, активирующие нейтрофилы, а уже после – CCL хемокины для остальных типов лейкоцитов (Cines, Pollak, Buck et al., 1998). Стоит отметить, что трансмиграция иммунокомпетентных клеток через ЭК, наблюдается и при отсутствии воспалительной реакции (Фрейдлин 2001). Было показано, что до половины моноцитов в следующие двое суток после трансэндотелиальной миграции, осуществляют обратную миграцию и приобретают фенотипические характеристики дендритных клеток. Вероятно, таким образом, происходит дифференцировка моноцитов при участии ЭК (Muller, Randolph, 1999). Как правило, в интактных ЭК присутствуют только мРНК цитокинов, тогда как секреции их белков не обнаруживается. Сигналом для запуска секреции эндотелиальных цитокинов, как было сказано выше, является связывание рецепторов ЭК с ранними медиаторами воспаления IL-1, TNF-α и IFN-γ (Cines, Pollak, Buck et al., 1998). При этом, индукторами активации ЭК могут быть не только цитокины, но и, эндотоксин, гипоксия, напряжение сдвига, окисленные липопротеины (Libby 1987). Действие этих агентов индуцирует ЭК к секреции следующих медиаторов: IL-1, IL-6, IL-8, MCP-1, M-CSF (Libby 1987). Такая обогащенная цитокинами среда, поддерживается до полной элиминации антигена (Фрейдлин 2006). Механизмы данных процессов хорошо изучены в нормальных условиях, однако, нельзя исключать, что в условиях микрогравитации они могут быть нарушены (Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005; Infanger, Ulbrich, Baatout et al., 2007; Ulbrich, Westphal, Baatout et al., 2008). В связи с этим, ряд исследований был посвящен анализу влияния микрогравитации на функциональное состояние ЭК, с использованием различных клеточных моделей (Uva, 64 Masini, Sturla et al., 2002; Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003). Следует отметить, что используемые в экспериментах ЭК очень геторегенны по морфологии, функциям, поразному отвечают на воздействие факторов роста и даже несут различные наборы молекул адгезии (Ribatti, Nico, Vacca et al., 2002). Вследствие этого, закономерности адаптации ЭК к условиям микрогравитации не просто установить. Тем не менее, было показано и теперь широко признано, что в ЭК, культивируемых в условиях микрогравитации, увеличивалась продукция оксида азота и происходила реорганизация цитоскелета, сопровождаемая снижением экспрессии β-актина (Buravkova, Romanov, 2001; Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003; Infanger, Ulbrich, Baatout et al., 2007; Versari, Villa, Bradamante et al., 2007). Если схожие изменения строения цитоскелета наблюдались в различных типах ЭК (ЭК микрососудов, ЭК из пупочного канатика человека (HUVEC) и ЭК аорты быка) (Spisni, Toni, Strillacci et al., 2006; Mariotti, Maier, 2008), то молекулярные механизмы, ответственные за увеличение секреции NO, по-видимому, были различны в разных типах клеток (Spisni, Toni, Strillacci et al., 2006; Mariotti, Maier, 2008; Balligand, Feron, Dessy 2009). Что касается воспалительных реакций, то секреция цитокинов также зависит от типа клеток. Было показано, что в HUVEC, культивируемых в течение 96 часов в условиях биореактора с вращающимися вокруг горизонтальной плоскости, заполненными жидкостью сосудами (Rotating Wall Vessel (RWV)), наблюдалось ингибирование синтеза ИЛ-1α (Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003). Однако, в микрососудистых эндотелиальных клетках мыши 1G11, культивируемых в течение 72 часов в схожих условиях, изменения продукции ИЛ-1α обнаружено не было, тогда как концентрация ИЛ-6 была значительно ниже контрольных значений (Cotrupi, Ranzani, Maier 2005). Интересно отметить, что в таких же условиях, в микрососудистых клетках кожи человека не было зафиксировано изменений продукции ни ИЛ-6, ни ИЛ-1α, но наблюдалось небольшое снижение синтеза ИЛ-8 (Mariotti, Maier, 2008). Другие исследователи изучали цитокиновый профиль ЭК, культивируемых при моделировании микрогравитации путем постоянной рандомизации положения объекта относительно вектора гравитации (Random Positioning Machine). Так, воздействие микрогравитации в течение 96 часов приводило к снижению секреции ИЛ-1α и ИЛ-8 в культивируемых HUVEC (Griffoni, Di Molfetta, Fantozzi et al., 2011). Эти данные согласуются с наблюдениями Carlsson и сотрудников (Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003). С другой стороны существует ряд работ, результаты которых говорят о снижении секреции антивоспалительных цитокинов ЭК в условиях микрогравитации. Infanger и соавторы обнаружили сниженную секрецию провоспалительного цитокина IL-10 в EA.hy926 в условиях экспозиции на RPM, и предположили, что клетки были в состоянии 65 повышенной реактивности (Infanger, Ulbrich, Baatout et al.,, 2007). Подобные выводы, были сделаны также Ulbrich и сотрудниками (Ulbrich, Westphal, Baatout. et al., 2008), обнаружившими повышенную секрецию провоспалительных IL-6 и IL-8 после культивирования клеток EA.hy926 в течение 24 ч на RPM. Если различие результатов, полученных на культуре человеческих ЭК и линейных EA.hy926 можно объяснить экспрессией последними, большего количество дополнительных генов, связаных с контролем клеточного цикла и апоптоза (Boerma, Burton, Wang et al., 2006). То объяснение различий результатов исследований, проведенных на культуре человеческих ЭК, лежит гораздо глубже. Фенотип ЭК нестабилен и может измениться при удалении из их микроокружения. Изолированные и культивируемые ЭК могут потерять свои тканеспецифические характеристики (Borsum, Hagen, Henriksten et al., 1982). В культуре ЭК наблюдалась потеря фенестраций (Milici, Furie, Carley 1985), функции гематоэнцефалического барьера, высокого электрического сопротивления, а также морфологических признаков высокого эндотелия (Ager 1987; Risau 1991). Это происходит потому, что гетерогенность ЭК развивается благодаря взаимодействию эндотелия с органами и тканями окружающей среды либо с помощью растворимых факторов, либо через межклеточные взаимодействия. Взаимодействие между различными клетками микрососудов и окружающих стромальных клеток играют важную роль в определении сосудистой структуры и функции. Так, микроокружение может непосредственно способствовать индукции и поддержанию ангиогенных факторов (Shing, Bucana, Gutman et al., 1994). В связи с этим, было высказано предположение, что растворимые факторы следует рассматривать как «Специализированные символы в языке межклеточной коммуникации, смысл которого контролируется контекстом" (Nathan, Sporn, 1991). Кроме того, при культивировании на ECM и добавлении определенных цитокинов, микрососудистый эндотелий в большей степени склонен к образованию капилляро-подобных структур, чем ЭК крупных сосудов (McCarthy, Kuzu, Gatter et al., 1991). Видимо по этой причине в работе Infanger и др. (Infanger, Ulbrich, Baatout. Et al., 2007) наблюдалось формирование капилляро-подобных структур, которых не было при использовании HUVEC (Spisni, Toni, Strillacci et al., 2006). Активация ЭК разного происхождения, также может приводить к разным эффектам. Воздействие TNF-α снижало экспрессию молекулы РЕСАМ-1 в культуре HUVEC, но увеличивало – в культуре ЭК микрососудов кожи человека (Lelkes, Manolopoulos, Silverman et.al 1996). Кроме того, было показано, что HUVEC, полученные от разных доноров, могут различаться по функциональной активности (Склянкина, Болдырева, Щегловитова, 2011). Авторы обнаружили, что ЭК от разных доноров различаются по базальному уровню 66 секреции измеряемых в кондиционированной среде цитокинов и молекул адгезии, что позволило им разделить культивируемые клетки на высоко – и низкопродуцирующие. Поэтому, для правильной интерпретации результатов, необходимо учитывать особенности изучаемых культур, особенности оборудования, используемого для моделирования микрогравитации и методов детекции, исследуемых параметров. Таким образом, при рассмотрении немногочисленных и достаточно противоречивых данных, полученных на разных клеточных моделях, вопрос о влиянии микрогравитации на синтез интерлейкинов эндотелиальными клетками остается открытым. Также остается малоизученным вопрос о том как микрогравитация может повлиять на синтез эндотелиальными клетками медиаторов провоспалительными цитокинами. 67 воспаления при активации их ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Используемое оборудование, материалы и реактивы 2.1.1 Оборудование В работе было использовано следующее оборудование: ламинарный шкаф (ВЛ22, Сампо, Россия), СО2-инкубатор (Sanyo, Япония), световой фазово-контрастный инвертированный микроскоп Leica DM IL (Германия), флуоресцентный фазовоконтрастный микроскоп Nikon Eclipse TiU (Nikon, Япония), оснащенный лампой Nikon Intensilight C-HGFI, наборами фильтров для анализа флуоресценции UV-2A (Ex 330-380, DM 400, BA420), DAPI (Ex 340-380, DM 400, BA 435-485), B-2A (ВР 450-490, DM 505, BA 520), FITC (ВР 465-495, DM 505, BA 515-555), Tex Red (ВР 540-580, DM 595, BA 600-660), камерой и системой анализа изображения NIS-elements (Nikon, Япония), конфокальный микроскоп LSM 780 (Zeiss, Германия), вортекс (Elmi, Латвия), центрифуга Eppendorf 5204R (Eppendorf, Германия), водяная баня (BioSan, Латвия), проточный цитофлуориметр Coulter Epics XL (Beckman Coulter, США) с системой для создания и анализа гистограмм System II (Beckman Coulter, США), проточный цитофлуориметр FACS Calibur (BD, США) планшетный спектрофотометр PR 2100 (Bio-Rad, США), биофотометр (Eppendorf, Германия), амплификатор Stratagene MX3000P (Stratagene, США), термостат (Смоленское СКТБ СПУ, Россия), миллипоровые фильтры (Millipore, США), автоматические пипетки (Eppendorf, Германия), гемоцитометр (Bright Line, США), аналитические весы Adventurer (OHAUS, Китай), дьюары с жидким азотом (НПО Гелиймаш, Россия), холодильник (Indesit, Россия) и низкотемпературный холодильник (Sanyo, Япония). Эндотелиальные клетки выращивали в чашках Петри диаметром 100 мм (Corning, США) и культуральных флаконах с площадью поверхности 9 и 25 см2 (NUNC, Дания). Для пассирования клеток, смены и сбора среды культивирования использовали серологические пипетки и центрифужные пробирки различного объема (Nunc, Дания или Corning, США), а также микропробирки и наконечники для автоматических пипеток (Eppendorf, Германия). Криоконсервацию клеток проводили в криопробирках (Corning, США). При анализе клеточных параметров с применением проточного цитофлуориметра использовали пробирки, рекомендуемые производителем прибора (Beckman Coulter, США). Для морфологических исследований были использованы покровные и предметные стёкла MENZEL-GLÄSER (Gerhard Menzel GmbH, Германия). 68 2.1.2 Химические реагенты В работе использовали следующие вещества и культуральные среды: глутамин (ПанЭко, Россия), раствор трипсина и ЭДТА с концентрациями веществ 0,5 г/л и 0,2 г/л соответственно, (Sigma, США), раствор антибиотиков, содержащий 5 000 ед/мл пенициллина и 5 000 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), диметилсульфоксид (ДМСО) (ICN), среды культивирования 199 (Gibco, Великобритания) и ДМЕМ с низким содержанием глюкозы (1 г/л) (Биолот, Россия), набор для определения жизнеспособности клеток ANNEXIN V-FITC Kit (Immunotech, Франция), Tween 20 (Merck, Германия), фосфатно-солевой буфер (ФБ) (Sigma, США), соляная кислота (Merck, Германия), эмбриональная телячья сыворотка (HyClone, США), фактор роста эндотелиальных клеток (ECGS) (BTI, США), ФНО-a (BD Biosciences, США), HEPES (MP Biomedicals, США), раствор гепарина с концентрацией 5000 МЕ/мл (Московский эндокринный завод, Россия), пируват натрия (Gibco, Великобритания), гидрокарбонат натрия (Sigma, США), желатин (Sigma, США), диспаза (Sigma, США), метанол (Merck, Германия); изопропанол (ТОО Компонент, Россия); параформальдегид (Merck, Германия), Flow-Check Fluorospheres (Beckman Coulter,США), глицерин (Реахим, Россия), Triton X100 (Sigma, США), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, США), TRITC-фаллоидин (Sigma, США), среда для заключения препаратов Fluoroshield with DAPI (Sigma, США), индикатор окислительного стресса хлорметил производная дихлордигидрофлуоресцеиндиацетата CM-H2DCFDA (Molecular Probes, США), катионный потенциал-зависимый краситель для выявления митохондрий MitoТracker Red FM (Molecular Probes, США),TRITC-фаллоидин (Sigma,США). Наборы для выделения РНК: лизирующий реагент QIAzol (Qiagen, США), набор для дополнительной гомогенизации образцов Qiashredder (Qiagen, США). наборы для обратной транскрипции: набор реагентов для синтеза кДНК на основе мРНК «QuantiTest Reverse Transcription Kit» (Qiagen, США). наборы для проведения ПЦР в реальном времени: «набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green 1» (ЗАО Синтол, Россия), набор для проведения реакции ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени «RT2-Real Time SYBR Green / ROX PCR master mix» (SAbioscience, США). Для определения уровня экспрессии исследуемых генов: (ICAM-1, VCAM-1, IL-8, ITGA-1, ACTB) и хаускиппинг – генов для нормализации результатов ПЦР с детекцией 69 продуктов в режиме реального времени (HPRT), применялись оптимизированные для метода ПЦР в реальном времени пары праймеров «QuantiTest Primer Assay» (Qiagen, США): HPRT – кат. № QT00059066, VCAM1 – кат. № QT00018347, ICAM1 – кат. № QT00074900, IL8 – кат. № QT00000322, ACTB – кат. № QT00095431, ITGA1 – кат. № QT00093723. 2.1.3 Моноклональные антитела Первичные антитела против иммуноглобулинов человека CD31, CD54, CD105, CD144, IgG (Immunotec, Франция), а также CD106 (BD Biosciences, США) , CD62E, CD62L (BioLegend, США), бета-тубулин (Santa Cruz, CША); вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с FITC (Dako, США). 2.2 Приготовление сред для культивирования эндотелиальных клеток Для 2.2.1 Приготовление полной среды культивирования эндотелиальных клеток использовали среду 199, содержащую L-глутамин и соли Эрла, в которую добавляли 1мМ пирувата натрия, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и раствор антибиотиков, содержащий пенициллин и стрептомицин в рабочей концентрации 50 ед/мл и 50 мг/мл соответственно. Постоянство pH среды обеспечивалось добавлением 25 мМ HEPES. 2.2.2 Приготовление среды для культивирования эндотелиальных клеток Для приготовления среды для культивирования эндотелиальных клеток в полную среду 199 добавляли 100 мкг/мл ECGS и 5 ед/мл гепарина. При приготовлении стокового раствора ECGS 50 мг лиофильно высушенного фактора роста растворяли в 10 мл среды 199, содержащий только раствор антибиотиков и добавляли по 2 мл в криопробирки, которые затем хранили при температуре – 30 °С. 2.2.3 Приготовление среды для криоконсервации клеток Для приготовления среды для замораживания ЭК в полную среду, содержащую 10% сыворотки, или в 100 % сыворотку добавляли 10% ДМСО. 2.3 Выделение и культивирование сосудистых эндотелиальных клеток 2.3.1 Получение первичной культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека Материалом для выделения клеток служили пупочные канатики, полученные во время нормальных своевременных родов. Для получения первичных культур ЭК пупочной вены человека использовали метод Gimbrone et al., (Gimbrone, Cotran, Folkman, 70 1974) в модификации Щегловитовой и соавторов (Scheglovitova, Romanov, Maksianina et al., 2002). Для этого пупочная вена была канюлирована с обеих сторон и промыта фосфатно-солевым буфером (ФБ) для удаления сгустков крови. Затем пупочную вену заполняли 0,15% раствором диспазы в среде 199 и пережимали канюли с двух сторон медицинскими зажимами. Пупочный канатик помещали в ФБ и инкубировали в течение 40 минут при 37 °С. Затем пупочную вену трижды промывали ФБ, клетки из собранного перфузионного раствора осаждали в течение 5 минут при 1500 об/мин. Осадок ресуспендировали в среде для культивирования и переносили в предварительно покрытые 0,2% раствором желатина чашки Петри. Клетки помещали в СО2-инкубатор (37 °С, 5% СО2, 95% воздуха, 100% влажность – стандартные условия культивирования). Через сутки производили смену среды культивирования, повторяющиеся в дальнейшем каждые 48 часов. 2.3.2 Пассирование первичной культуры эндотелиальных клеток При достижении 80 – 90% монослоя в островках клеток первичной культуры или последующих субкультур их пересевали. Для этого из чашки Петри удаляли среду культивирования и промывали культуру ЭК средой ДМЕМ с низким содержанием глюкозы. Для снятия клеток с поверхности пластика в чашку Петри добавляли раствор трипсина-ЭДТА из расчета 500 мкл на 25 см2. Клетки инкубировали с трипсином при 37°С, периодически встряхивая чашку в горизонтальной плоскости для перемешивания раствора трипсина и контролируя отлипание клеток от поверхности пластика под микроскопом. После отлипания клеток трипсин инактивировали большим объемом полной среды, производили промывку чашки средой ДМЕМ, медленно ресуспендируя ее содержимое, и отбирали суспензию клеток в пробирку. Затем производили подсчет клеток в гемоцитометре. Аликвоту, содержащую необходимое количество клеток переносили в пробирку с необходимым объемом полной среды, суспензию осторожно ресуспендировали и переносили в культуральный флакон. Флакон перемещали в горизонтальной плоскости для распределения суспензии клеток по поверхности пластика, контролировали прикрепление клеток под микроскопом и помещали в инкубатор. Среду во флаконах с культивируемыми клетками меняли каждые 2 дня. Культивирование проводили при 37°С в атмосфере 5% СО2. Плотность посадки клеток составляла 500 – 1500 клеток/см2. 71 2.3.3 Криоконсервация культивируемых эндотелиальных клеток Для замораживания ЭК промывали средой ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, снимали с поверхности пластика раствором трипсина-ЭДТА, инактивировали трипсин полной средой, клетки ресуспендировали, переносили в пробирку, центрифугировали (5 минут, 1500 об/мин), супернатант сливали. Клетки (около 1 млн.) помещали в 1 мл среды для замораживания, осторожно ресуспендировали и переносили в пробирки для криоконсервации. Пробирки с суспензией клеток выдерживали при температуре - 20°С в течение часа, затем хранили при - 80°С. Длительное хранение клеток осуществляли в дьюарах с жидким азотом. При размораживании клеток криопробирки помещали на водяную баню, оттаивали в течение нескольких минут, среду для замораживания отбирали пипеткой, постепенно помещали в большой объем полной среды, центрифугировали (5 минут, 1500 об/мин), отбирали супернатант. Добавляли к клеточному осадку необходимый объем полной среды, осторожно ресуспендировали и помещали на чашку Петри. 2.4 Методы исследования 2.4.1 Структура исследования эффектов моделируемой микрогравитации. Параметры экспериментальной установки Эксперименты проводили на ЭК 2-4 пассажей. При достижении около 80% монослоя культуры ЭК из флаконов удаляли среду для культивирования. После чего часть флаконов заполняли смесью из среды 199 содержащей только антибиотик и полную среду для культивирования клеток в соотношении 4:1. Вторая часть флаконов заполнялась смесью для провосполительной активации: среда 199, содержащая антибиотик и ФНО-а в концентрации 2 нг/мл и полная среда для культивирования клеток в соотношении 4:1. Для исключения механических повреждений клеток в процессе клиностатирования все флаконы заполнялись средой полностью, без образования пузырьков воздуха. Для экспериментов по оценке жизнеспособности, выявления поверхностных молекул адгезии и анализа экспрессии их генов, а также оценке секреторной активности ЭК культивировали в культуральных флаконах, с площадью поверхности 25 см2. Для иммуногистохимического выявления белков цитоскелета и молекул клеточной адгезии ЭК культивировали в слайд-флаконах с площадью поверхности 9 см2. Контрольные образцы помещались в СО2 – инкубатор, соответствующие им опытные образцы подвергались моделированию эффектов микрогравитации в тех же температурных условиях. Моделирование микрогравитации осуществляли в течение 24 часов на Random Positioning Machine (RPM, Dutch Space, Leiden, Нидерланды) при скорости вращения 100 рад/мин для внешней рамки и 80 - для внутренней (Гершовнч, Гершович, Буравкова, 2009). В процессе 72 работы RPM происходит рандомизация положения объекта относительно вектора гравитации за счет разнонаправленного вращения двух взаимно перпендикулярных рамок, к которым крепится платформа с экспериментальными образцами. Само направление вектора гравитации при этом не изменяется, имитируется только лишь эффект снижения влияния силы тяжести на культуру клеток до 10-3 g (Van Loon, 2007). В состав экспериментальной установки для моделирования эффектов микрогравитации на культуру ЭК входили: прибор «Desktop RPM» и персональный компьютер (Pentium D 2.66 ГГц, 1024 Mb оперативной памяти, 320 Gb жесткий диск, видео-ускоритель ATI 9600 256 Mb) под управлением Windows XP с установленным программным обеспечением «RPM Desktop Controller», поставляемым вместе с RPM. Прибор был установлен в термостат (Рис.) и подключен к программируемому контроллеру (DMC). Контроллер был подключен к блоку питания и соединен с персональным компьютером с помощью кабеля RS232. Управление параметрами симуляции микрогравитации осуществлялось через прилагаемое программное обеспечение. Экспериментальные культуральные флаконы крепились к платформе RPM с помощью резиновых жгутов. После клиностатирования культуральную среду отбирали из 25 см 2 флаконов, центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин., полученный супернатант аликвотили по микропробиркам и хранили при -30°С для последующего определения концентрации растворимых факторов. Монослой ЭК промывали и снимали 0,05% раствором трипсина – ЭДТА. Затем оценивали жизнеспособность, экспрессию молекул адгезии на поверхности клеток, образование АФК, разность потенциала на мембранах митохондрий с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter EPICS XL, а также экспрессию целевых генов с использованием метода ПЦР в реальном времени. Устройство для рандомизации положения объекта относительно вектора силы тяжести – Random Positioning Machine 73 2.4.2 Принцип метода проточной цитофлуориметрии для анализа антигенов и морфологических характеристик клеток Метод проточной цитофлуориметрии основан на пропускании суспензии клеток по капилляру по одной через зону чувствительности прибора. Скорость прохождения клеток через капилляр высокая (около 1000 клеток/ сек.), однако в зоне чувствительности прибора находится не более одной клетки. При этом клетки поочередно пересекают сфокусированный луч света, который используется для возбуждения флуоресценции. При помощи светочувствительных датчиков (фотодиодов и фотоэлектронных умножителей) регистрируются поглощение и рассеивание света (прямое светорассеяние под углом 0,5-2° и угловое светорассеяние под углом 90°) клеткой, а также флуоресценция связанных с клеткой красителей. Собранная информация представляется в виде частотной гистограммы распределения, где по оси абсцисс располагается шкала интенсивности значения измеряемого параметра, по оси ординат располагается число клеток с данным значением измеряемого параметра. Если анализируется два параметра, совместные данные представляются в двумерной системе координат, где по обеим осям располагаются интенсивности значения измеряемых параметров. При оценке распределения клеток по ряду морфологических характеристик используется детекция рассеянного света. Светорассеяние обусловлено размером, формой, плотностью клетки, а также гранулярностью внутриклеточных структур. Рассеянный свет от клеток и частиц состоит из дифракционных, рефракционных и отражающих компонентов. При малых углах рассеяния преобладает дифракция, и дифракционное изображение используется для измерения размера клеток. С возрастанием угла рассеяния увеличивается значение рефракции, рефракционное изображение используется для оценки внутриклеточной структуры клеток, поскольку рефракционные лучи проходят через внутренность клетки. При иммунофенотипировании используется детекция флуоресценции различных флуоресцентных красителей, возникающая при возбуждении их светом определенной длины волны при прохождении клеток через капилляр. Флуоресцентные красители могут быть связаны с моноклональными антителами против определенных клеточных структур, например, поверхностных антигенов – кластеров дифференцировки (CD). В качестве красителей, применяемых как метки для антител, используются флуоресцеинизотиоционат (FITC) и фикоэритрин (PE). При ДНК-цитометрии в качестве флуорохромов, связывающихся с ДНК, используются бромид этидия и иодид пропидия (Шмаров, Козинец, 2004). 74 2.4.3 Оценка жизнеспособности культивируемых ЭК пупочной вены человека Жизнеспособность ЭК оценивали по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии с помощью набора ANNEXIN V-FITC Kit согласно инструкции производителя. Апоптотические клетки определялись за счет высокоаффинного связывания аннексина V, меченого FITC, с фосфолипидом фосфатидилсерином, который в норме находится во внутреннем слое фосфолипидного бислоя мембран клеток, а при апоптозе, когда клетка теряет способность поддерживать ассиметричность локализации мембранных фосфолипидов, перемещается во внешний монослой. Долю некротических клеток определяли за счет детекции флуоресценции йодида пропидия (PI), который не способен проникать через мембрану нативной клетки, поэтому накапливается только в погибших клетках, имеющих мембранные дефекты, и связывается там с нуклеиновыми кислотами. Пропидий встраивается между основаниями ДНК в пропорции одна молекула на 4-6 пар оснований. Он также способен связываться с РНК. После связывания с нуклеиновыми кислотами его флуоресценция возрастает в 20-30 и более раз. Для определения жизнеспособности ЭК из культурального флакона сливали всю среду в центрифужную пробирку, которую затем центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин., после чего супернатант удаляли. Одновременно с этим, ЭК во флаконе отмывали от среды культивирования фосфатным буфером, снимали с поверхности пластика раствором трипсина с ЭДТА, инактивировали трипсин полной средой, ресуспендировали клетки и переносили в пробирку. Затем клетки центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин., супернатант удаляли. Клетки собранные из культуральной среды и клетки собранные с поверхности флакона осторожно ресуспендировали и помещали в предварительно разведенный дистиллированной водой в 10 раз охлажденный при 4°С связывающий буфер из расчета не менее 500 тысяч клеток на 100 μл буфера в каждой пробе. В каждую пробу вносили 5μл йодида пропидия и 1 μл аннексина, после чего их ресуспендировали на вортексе. Приготовленные таким образом пробы инкубировали в течение 10 минут при 4°С, а затем добавляли в каждую пробу 400 μл связывающего буфера, ресуспендировали и анализировали количество поврежденных клеток на проточном цитофлуориметре. 2.4.4 Оценка иммунофенотипа культивируемых ЭК пупочной вены человека Иммунофенотип ЭК оценивали по экспрессии ряда поверхностных маркеров с помощью меченых FITC и PE моноклональных антител к ним с применением проточного цитофлуориметра. Использовали антитела к маркерам CD31 (анти CD31-PE), CD54 (анти 75 CD54-FITC), CD105 (анти CD105-FITC), CD144 (анти CD144-PE), CD106 (анти CD106PE), CD62L (анти CD62L-PE), CD62Е (анти CD62Е-PE). Для получения суспензии клеток при анализе фенотипа исследуемую культуру отмывали от среды культивирования в ФБ, снимали с поверхности пластика раствором трипсина с ЭДТА, инактивировали трипсин полной средой, ресуспендировали клетки и переносили в пробирку. Затем клетки центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин., супернатант удаляли, а клетки, осторожно ресуспендируя, помещали в ФБ из расчета не менее 100 тысяч клеток на 100 μл буфера в каждой пробе. В каждую пробу добавляли 10 μл меченых PE/FITC антител, затем пробы инкубировали в течение 30 минут при 25°С, добавляли в каждую пробу 400 μл буфера, ресуспендировали и анализировали на проточном цитофлуориметре. В качестве контроля использовали пробы с добавлением неиммунных меченых FITC и PE моноклональных антител того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера. 2.4.5 Иммуноцитохимическое окрашивание клеток Для иммуноцитохимического выявления белков цитоскелета ЭК культивировали в специальных культуральных флаконах площадью 9 см2 предназначенных для микроскопии (Slide Flask). После различной длительности клиностатирования (1 час, 24 часа) из флакона сливали среду культивирования, клетки трижды промывали средой ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, затем фиксировали в течение 15 минут 4% раствором параформальдегида в ФБ. После фиксации дважды промывали средой ДМЕМ с низким содержанием глюкозы и инкубировали в течение 15 минут в 0,1% растворе Triton X-100 для солюбилизации мембранных белков. Для предотвращения неспецифического связывания антител, перед окрашиванием клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в 1% растворе БСА. Далее клетки трижды промывали средой ДМЕМ с низким содержанием глюкозы и наносили первые моноклональные антигенспецифичные антитела к бета-тубулину в разведении 1:50 и инкубировали в течение ночи при 4°С. На следующий день клетки дважды отмывали средой ДМЕМ с низким содержанием глюкозы и наносили вторичные антитела, конъюгированные с флуоресцентным красителем FITC, специфические к IgG первых антител, в разведении 1:20. После 30 минут инкубации при комнатной температуре клетки трижды отмывали ФБ. Для заключения препаратов использовали специальную среду, полимеризующуюся при комнатной температуре и содержащую флуоресцентный краситель ядерной ДНК DAPI. В качестве негативного контроля использовали клетки, к которым не добавляли первичные антитела. 76 Для визуализации фибриллярных структур актинового цитоскелета ЭК инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с флуоресцентным красителем TRITC-фаллоидин (рабочая концентрация 50 мкг/мл), после чего трижды отмывали ФБ. Данный краситель является токсином грибов, способный связываться напрямую с F-актиновыми фибриллами, стабилизируя их. Препараты изучали при помощи микроскопа Nikon Eclipse TiU, оснащенном цифровой фотокамерой и системой для анализа изображения. 2.4.6 Определение содержания цитокинов в среде культивирования Цитокины в кондиционированной среде определяли с помощью набора FlowCytomix human Th1/Th2 11 Plex (Bender MedSystems, Австрия), который позволяет измерить концентрацию 11 цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α, TNF-β) одновременно. Метод основан на «сэндвич»-методе твердофазного иммуноферментного анализа. В данном случае в роли твердой фазы выступают полистироловые гранулы диаметром 5,5 мкм, конъюгированные с соответствующими анти-цитокиновыми антителами. Для определения цитокинов полученные после клиностатирования образцы кондиционированной среды размораживали непосредственно перед измерением при комнатной температуре. Исследуемые образцы и контрольные растворы смешивали с буфером, содержащим полистировые гранулы. После специфического связывания гранул с цитокинами, содержащимися в пробах, в реакционную смесь добавляли биотинилированные анти-цитокиновые антитела и инкубировали 2 часа при комнатной температуре. Далее пробы центрифугировали (5 минут при 500g) удаляли супернатант, добавляли стрептавидин, меченный фикоэритрином (PE), и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Затем образцы снова центрифугировали, ресуспендировали в буфере и анализировали на цитофлуориметре FACS Calibur. Для определения содержания цитокинов в пробах использовали калибровочные растворы, содержащие известные концентрации цитокинов. Концентрация каждого цитокина являлась функцией интенсивности флуоресценции и вычислялась с помощью программы FlowCytomix Pro. Чувствительность метода представлена в таблице 1. Для более подробной оценки концентрации ИЛ-6 и ИЛ-8 в кондиционированной среде были использованы наборы для иммуноферментного анализа Human IL-6 ELISA Set и Human IL-8 ELISA Set (табл. 2). 77 Таблица 1. Чувствительность метода определения цитокинового профиля с использованием проточной цитофлуориметрии Исследуемый Чувствительность Исследуемый Чувствительность цитокин ИЛ-1 (пг/мл) 4,2 цитокин ИЛ-10 (пг/мл) 1,9 ИЛ-2 16,4 ИЛ-12p70 1,5 ИЛ-4 20,8 ИФН-гамма 1,6 ИЛ-6 1,2 ФНО-альфа 3,2 ИЛ-8 0,5 ФНО-бета 2,4 ИЛ-5 1,6 - - На пластик 96-луночного планшета сорбировали антитела специфичные к целевым хемокинам в соотношении 1:250 по 100 мкл, растворенных в 0,1 М Na2CO3 буфере (рН 9,5), после чего инкубировали в течение ночи при +4оС. Затем каждую лунку трижды промывали фосфатным буфером, содержащим 0,05 % Tween 20 (промывочный буфер), после чего вносили по 200 мкл 10% раствора БСА для предотвращения неспецифического связывания и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Далее планшет трижды отмывали промывочным буфером и наносили 100 мкл стандарта исследуемого цитокина в нескольких разведениях (300 пг/мл, 150 пг/мл, 75 пг/мл, 37,5 пг/мл, 18,8 пг/мл, 9,4 пг/мл и 4,7 пг/мл), а также образцы отобранной кондиционированной среды. После 2-х часовой инкубации при комнатной температуре, каждую лунку отмывали пять раз промывочным буфером. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора кроличьих моноклональных биотинилированных антител против иммуноглобулинов мыши, комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена, разведении 1:250 в фосфатном буфере с 10% БСА. Инкубировали 1 час при комнатной температуре и семикратно отмывали промывочным буфером. Затем, для развития цветной реакции в каждую лунку вносили субстрат для пероксидазы хрена - смесь 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина с перекисью водорода. Реакцию проводили в течение 30 минут в темноте и останавливали добавлением 2 N H2SO4. Результаты количественного содержания цитокинов оценивали, измеряя оптическую плотность при длине волны 450 нм на планшетном спектрофотометре. Для определения концентрации цитокинов в исследуемых пробах строилась калибровочная кривая: ось абсцисс – концентрация цитокина (пг/мл); ось ординат – значение оптической плотности образца (ОП). Значение ОП, соответствующее концентрации цитокина в каждом стандартном растворе, откладывалось на графике в электронной таблице Excel. По полученным данным строилась калибровочная кривая, 78 которая использовалась для определения концентрации цитокина в анализируемых пробах. Таблица 2. Характеристика используемых реагентов в иммуноферментном анализе Антиген Иммобилизованные Детектирующие Стандарт антитела ИЛ-6 (Человек) ИЛ-8 (Человек) антитела АТ к человеческому ИЛ-6 Биотинилированные АТ к BD Biosciences 51-26451E человеческому ИЛ-6 (from ELISA Set 555220) BD Biosciences 51-26452E (from ELISA Set 555220) АТ к человеческому ИЛ-6 Биотинилированные АТ к BD Biosciences 51-26541E человеческому ИЛ-6 (from ELISA Set 555244) BD Biosciences 51-26542E (from ELISA Set 555244) Рекомбинантный человеческий ИЛ-6 BD Biosciences 51-26456E (from ELISA Set 555220) Рекомбинантный человеческий ИЛ-6 BD Biosciences 51-26546E (from ELISA Set 555244) 2.4.7 Анализ уровня экспрессии генов После 24 часов клиностатирования из культуральных флаконов (25 см2) отбирали кондиционированную среду, а клетки трижды отмывали ФБ от ее остатков. Далее проводили выделение тотальной РНК с использованием лизирующего реагента QIAzol, согласно инструкции производителя. Концентрацию выделенной РНК измеряли на биофотометре, отношение A260/280 было в пределах от 1,8 до 2,1. Полученные образцы РНК замораживали и хранили при -30°С. Реакцию обратной транскрипции и получение кДНК на основе выделенной РНК производили с помощью набора QuantiTect Reverce Transcription Kit. На первом этапе элиминировалась геномная ДНК путем добавления 2 мкл gDNA Wipeout buffer и инкубированием при температуре 42°С в течение 5 минут. Затем в смесь добавляли 1 мкл смеси праймеров RT Primer mix, 4 мкл QuantyScript RT Buffer и 1 мкл QuantyScript Reverse Transcriptase для проведения реакции обратной транскрипции. Обратную транскрипцию проводили при температуре 42°С в течение 30 минут, после чего инактивировали фермент обратную транскриптазу при 95°С в течение 4 минут. Таблица 3. Стадии полимеразной цепной реакции в реальном времени. Количество циклов Стадия Продолжительность Температура 1 Денатурация 5 мин 95°С Денатурация 20 сек 95°С Отжиг праймеров 30 сек 60°С Элонгация 30 сек 72°С 40 79 Для определения уровня экспрессии генов применяли набор реактивов для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, в который входят: смесь дезоксирибонуклеотидов, флуоресцентный краситель SYBR Green 1, рекомбинантная ДНК-полимераза HotStarTaq, MgCl2 и кДНК, количество которой для одной реакции составляло 0,5 мкг. Конечный объем смеси, согласно инструкции производителя, составлял 25 мкл. Для определения уровня экспрессии исследуемых генов (ICAM-1, VCAM-1, IL-8, ITGA-1, ACTB) применяли оптимизированные для метода ПЦР-РВ пары праймеров QuantiTest Primer Assay. В качестве хаускиппинг-генов для определения относительного значения изменения уровня экспрессии изучаемых генов, был использован ген гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), так как его значение остается высококонсервативным для ЭК из пупочной вены человека при различных условиях (Chen, Zhao, Feng et al., 2013). Стадии ПЦР-РВ приведены в таблице 3. Специфичность проводимой реакции определялась с помощью анализа кривой плавления продуктов амплификации в диапазоне от 55°С до 95°С с шагом 1 градус. Для оценки относительного уровня экспрессии исследуемых генов использовали метод 2-∆∆Ct (Livak, Schmittgen, 2001). 2.5 Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ “Excel” и “Statistica 7.0” для WinXP. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение, медиану, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа при выбранном уровне значимости p < 0,05. 80 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на морфологию и цитоскелет эндотелиальных клеток человека in vitro Эндотелиальные клетки из пупочной вены человека представляют собой небольшие клетки округлой формы, прикрепившиеся к подложке и сформировавшие небольшие «островки», в первые 3-5 часов культивирования. Эти «островки» увеличивались в размерах и постепенно объединялись в предмонослой на 3-5 сутки после выделения. На этапе предконфлюэнтного монослоя клетки становились более вытянутыми (около 40-50 мкм в ширину и 70-90 мкм в длину), c одиночными овальными ядрами, содержащими 2 или 3 ядрышка, окруженными перинуклеарной гранулированной областью и широкой прозрачной цитоплазмой с нечеткими границами. На 7-ой день ЭК формировали конфлюэнтный монослой, состоящий из удлиненных и полигональных клеток (ширина 50 мкм) (рис. 8 а). Достижение стадии конфлюэнтного монослоя характеризовалось наличием контактного торможения пролиферации клеток, плотность ЭК при этом составляла примерно 4×104 клеток на см2. При 24 часовой инкубации ЭК с TNF-α (2 нг/мл) не происходило значимого изменения морфологии клеток, по сравнению с контрольными образцами. Лишь отдельные клетки начинали втягиваться, образуя небольшие межклеточные «разрывы» (рис. 8 б). Экспозиция ЭК на RPM в течение 24 часов приводила к нарушению целостности эндотелиального монослоя и изменению формы изучаемых клеток. Они становились менее распластанными, снижалась их площадь, появлялись отростки «ламеллы» (рис. 8 в). Кроме того, стали появляться двуядерные клетки. Совместное действие моделируемой микрогравитации и провоспалительной активации приводило к увеличению степени выраженности изменений, наблюдаемых при экспозиции на RPM: клетки приобретали различную форму (часть клеток приобретала веретеновидную форму, часть сильно распластывалась по подложке), у большинства ЭК наблюдались отростки «ламеллы», при этом целостность монослоя значительно нарушалась (рис. 8 г). В культуре TNF-α активированных ЭК, экспонированных на RPM, также отмечалось появление двуядерных клеток, лежащих отдельными кластерами. Изменения происходили и в цитозоле – появлялась четко выраженная зернистость цитоплазмы в перинуклеарной области, а также визуализировались структуры, напоминающие вакуоли. Подобные изменения в цитоплазме могут свидетельствовать об увеличении синтетической активности изучаемых ЭК. 81 а б в г Рис.8. Морфологические особенности эндотелиального монослоя in vitro в статических условиях и после воздействия моделируемой микрогравитации. а – статический контроль; б – 24 ч активация эндотелия TNF-a (2 нг/мл). в – экспозиция на RPM в течение 24 ч (стрелками показаны клеточные отростки); г – экспозиция на RPM и TNF-a-активация в течение 24 ч (стрелками показаны клеточные «разрывы», звездочками – двуядерные клетки). Фазово-контрастная микроскопия, масштабный отрезок100 мкм. 3.1.1. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на актиновый цитоскелет Поддержание формы клетки обеспечивается динамической природой актиновых филаментов. В ряде исследований показано, что в эндотелиальных клетках они также выступают в роли преобразователя механических сил во внутриклеточные биохимические сигналы (Davies, Tripathi, 1993; Lewis, Cubano, Zhao et al., 2001; Crawford-Young 2006). Кроме того, согласно литературным данным, действие провоспалительных цитокинов индуцирует перестройку актиновых микрофиламентов и формирование межклеточных разрывов ЭК, что определяет развитие трансэндотелиальной проницаемости (Goldblum, Sun, 1990; Petrache, Verin, Crow et al., 2001). В нашем исследовании мы попытались ответить на вопрос, существует ли взаимное влияние этих эффектов. 82 Для выявления фибриллярных волокон актина мы использовали краситель TRITCфаллоидин, который фиксирует F-актин в полимерной форме и препятствует его обратной деполимеризации до мономеров (Cooper, 1987). В контрольных образцах ЭК, не подвергавшихся воздействиям, клетки сохраняли свою полигональную форму, волокна Fактина были сосредоточены по периферии клетки и в виде тонких фибрилл пересекали центр клетки (рис. 9 а). В активированных TNF-α ЭК уже спустя 1 час с момента инкубации в некоторых клетках наблюдались небольшие изменения архитектоники Fактина: утолщение актиновых фибрилл и формирование стресс-волокон. Это сопровождалось клеточным сокращением и формированием ламеллоподий и филоподий, ограничивающихся, главным образом, в местах межклеточных контактов (рис. 9 б). Воздействие моделируемой микрогравитации в течение 1 часа приводило к перераспределению стрессовых волокон актина из центральной части к периферии клетки. Стресс-волокна объединялись в пучки, число их возрастало, по сравнению с TNFα-активированными клетками. В большинстве клеток стресс-волокна F-актина тянулись параллельно основной (длинной) оси клетки. Кроме того, в области межклеточных контактов появлялись отдельные «звездоподобные» структуры, по-видимому, представляющие собой участки связывания стресс-волокон соседних клеток. В условиях гравитационной разгрузки ЭК формировали ламеллоподии и филоподии, которые сравнимы с таковыми в TNF-α-активированных клетках (рис. 9 в). Совместное действие микрогравитации и провоспалительной активации той же длительности вызывало более выраженные изменения в организации актинового цитоскелета, чем при клиностатировании интактных клеток или инкубации с TNF-α. При этом, большее количество стресс-волокон актина объединялось в пучки, увеличивалась частота появления «звездоподобных» структур. Некоторые клетки в области клеточных контактов формировали так называемый «волнистый край» (раффлы) (рис. 9 г). Иммунофлуоресцентный анализ показал, что к 24 часам инкубации с TNF-α интенсивность флуоресценции F-актина в клетках значительно возрастала по сравнению с контрольными клетками (рис. 10 г) и клетками, инкубированными с TNF- α в течение 1 часа (рис. 9 б). Это свидетельствует о том, что практически весь актин клеток перешел в фибриллярное состояние. Необходимо отметить, что изменения архитектоники актинового цитоскелета, наблюдаемые в клетках, подвергавшихся воздействию TNF-α в течение 1 часа, многократно усиливались. Практически все клетки в местах клеточных контактов имели «звездчатые структуры», стресс-волокна были собраны пучки, по периферии сжатых клеток образовывались «микрошипы» актина. 83 в толстые 60 мин 60 мин а б в г Рис. 9. Динамика изменения строения актинового цитоскелета ЭК: а – статический контроль; б – активация TNF-α (2 нг/мл), стрелками показано образование ламелло- и филоподий; в – экспозиция на RPM, стрелками показано образование ламелло- и филоподий; г – экспозиция на RPM активированных TNF-α ЭК, стрелками показано образование волнистого края «раффл» и пучков F-актина. Флуоресцентная конфокальная микроскопия, масштабный отрезок 20 мкм. 84 При этом в перинуклеарном пространстве выявлялись шарообразные глыбки F-актина (рис. 10 а). Под действием эндотелиальные клетки моделируемой становились микрогравитации менее в распластанными, течение что 24 часов, приводило к образованию клеточных разрывов и нарушению целостности монослоя. В местах межклеточных контактов наблюдалось образование «мостов» – участков взаимодействия стресс-фибрилл соседних ЭК. В отличие от TNF-активированных клеток, ЭК, культивируемые в условиях микрогравитации, практически не образовывали филоподий, а стресс-волокна, в большей мере, обнаруживались в местах межклеточных контактов, освобождая перенуклеарное пространство (рис. 10 б). Стоит отметить, что экспозиция на RPM значительно снижала интенсивность флуоресценции, по сравнению с TNF-αактивированными клетками, оставаясь выше контрольных значений (рис. 10 г). В это же время, в культуральной среде было зафиксировано появление открепившихся от подложки клеток, что подтверждалось характерными «пустотами» на микрофотографиях (рис. 10 б). Совместное действие моделируемой микрогравитации и провоспалительной активации характеризовалось более выраженной деполимеризацией актиновых фибрилл, о чем свидетельствует появление шарообразных глыбок из разрушенных актиновых волокон (рис. 10 в). Клетки были более сжаты, по сравнению с клетками, экспонированными на RPM, снижалось число актиновых волокон в местах клеточных контактов. Интересно отметить, что как в интактных, так и в активированных ЭК, подвергавшихся клиностатированию появлялись так называемые вогнутые клеточные края (рис. 10 д). Это неподвижный край одиночных клеток, для которого характерно наличие четко очерченного вогнутого пучка нитей актина. Подобная картина наблюдается в тех случаях, когда клетка не образует филоподий и, либо иммобилизована, либо переходит на другой тип движения (Small, Rottner, Kaverina et al., 1998). Кроме того, интенсивность флуоресценции F-актина, при сочетанном действии изучаемых факторов, снижалась до контрольных значений. Обнаружив индуцированное микрогравитацией ремоделирование актинового цитоскелета, мы измерили уровень экспрессии гена ACTB, напрямую связанного с данным компонентом цитоскелета ЭК. Так, в результате 24 часовой инкубации с TNF-α, уровень экспрессии исследуемого гена несколько увеличивался (в 1,8 раза, по сравнению с контролем) (рис. 11). Клиностатирование TNF-α-активированных клеток, за это же время, вызывало увеличение уровня экспрессии ACTB более чем в 2 раза, по сравнению с контрольными клетками. 85 24 часа 24 часа а б в г д Рис. 10. Динамика изменения строения актинового цитоскелета: а – активация TNF-α (2 нг/мл), стрелками показаны «звездчатые структуры» и «микрошипы»; б – экспозиция на RPM, стрелками показано образование вогнутого края (д) и утрата клеточных контактов; в – экспозиция на RPM активированных TNF-α ЭК, стрелками показано образование «глыб» Fактина; г – средняя интенсивность флуоресценции F-актина в ЭК, при различных воздействиях, приведены средние значения (N=3), M+SD, *– p<0,05, различия достоверны по сравнению с контролем, # - p<0,05 различия достоверны по сравнению с RPM+TNF-α, ** - p<0,05 достоверные различия между группами. Масштабный отрезок 20 мкм. 86 Однако наиболее выраженное изменение экспрессии гена β-актина выявлено при 24 часовой экспозиции на RPM. Моделирование эффектов микрогравитации приводило к трехкратному увеличению экспрессии АСТВ (рис. 11). Можно предположить, что именно микрогравитация вносит основной вклад в увеличение экспрессии изучаемого гена в ЭК, подвергавшихся совместному действию исследуемых факторов. Рис. 11. Изменение относительного уровня экспрессии гена β-актина в ЭК после 24 часовой инкубации с TNF-α, экспозиции на RPM и совместном воздействии. (M±SD),*p<0,05- по сравнению со статическим контролем, #p<0,05- по сравнению с TNFα-активированными ЭК,**p<0,05. Таким образом, нами было показано, что моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM вызывает реорганизацию актинового цитоскелета ЭК уже на ранних этапах культивирования (1 час), которая сохраняется на протяжении 24 часов. При этом фибриллы актина образуют мощные стресс-фибриллы, которые соединяются в местах клеточных контактов, образуя «звездоподобные» пучки. Клетки практически перестают образовывать филоподии, а наличие вогнутого края говорит о возможной смене механизма движения. Описанная перестройка цитоскелета сопровождается трехкратным увеличением экспрессии гена АСТВ к 24 часам экспозиции на RPM. Этот ген кодирует белок β-актин, который является структурным элементом G- и F- актина. Совместное действие провоспалительной активации и микрогравитации приводит к более пагубным последствиям для ЭК, вызывая разрушение стресс-фибрилл, деполимеризацию микрофиламентов, увеличение клеточных «разрывов» и, как следствие, открепление клеток от подложки. Предположение, что нарушение целостности цитоскелета выступает в качестве механизма гравичувствительности в одиночных клетках, было высказано в начале 90-х годов (Gruener, Hoeger, 1990; Davies, Tripathi, 1993; Buravkova, Romanov, 2001; HughesFulford, 2002). Однако, до настоящего момента не утихают споры о том, какие именно структуры цитоскелета в большей мере участвуют в механотрансдукции. В ряде работ 87 было описано изменение пространственной организации микрофиламентов, промежуточных филаментов и микротрубочек в условиях космического полета и в наземных экспериментах с моделированием микрогравитации. Некоторые данные указывают на то, что F-актиновые микрофиламенты являются основной структурой передачи сигнала в разных типах клеток. Так, например, в остеобласто-подобных клетках ROS 17/2.8, культивируемых во вращающемся клиностате 24 часа, наблюдалась дезорганизация актинового цитоскелета, потеря нитевидного распределения фибрилл актина и открепление некоторых клеток от подложки (Sarkar, Nagaya, Koga, 2000). В условиях микрогравитации в клетках эпидермоидной карциномы A431 увеличивалось содержание F-актина и наблюдалось ремоделирование системы микрофиломентов, что, предположительно, указывало на передачу сигнала (Boonstra 1999). В условиях реального космического полета было показано, что актиновые филаменты мышиных остеобластов концентрировались в более удлиненные, занимающие меньшую площадь по сравнению с наземным контролем, стресс-фибриллы (Hughes-Fulford, Lewis, 1996; Hughes-Fulford, 2001). Перераспределение сети F-актинового цитоскелета в кортикальный слой клеток ROS 17/2.8, которое было показано в эксперименте, проводимом на спускаемой капсуле Фотон, подтвердило результаты экспериментов на клиностате (Guignandon, Lafage-Proust, Usson, 2001). Основываясь на этих первичных данных, можно говорить о том, что адгезивные культуры клеток реагируют на условия микрогравитации ремоделированием актинового цитоскелета. Следовательно, может F-актин быть ответственен и за гравичувствительность эндотелия, которая была показана в условиях моделируемой микрогравитации (Романов, Кабаева, Буравкова, 2000). В частности, при экспозиции культуры первичных ЭК на 2D-клиностате происходило истончение фибриллярных актиновых волокон и перераспределение их из центральной части к периферии клетки, в область межклеточных контактов (Романов, Кабаева, Буравкова, 2000). При использовании методики моделирования микрогравитации с помощью биореактора с вращающимися стенками (Rotating Wall Vessel – RWV), были получены схожие результаты. Актиновые филаменты были дезорганизованы, образовывали кластеры и концентрировались в основном в перинуклеарном пространстве. Данные изменения были заметны после 4 ч от начала эксперимента и сохранялись в течение нескольких суток. Интересно, что после 144 ч эксперимента наблюдалось снижение количества стресс-волокон, что свидетельствует об адаптации (Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003). Результаты этой работы были подтверждены коллективом нашей лаборатории. После 24 ч культивирования первичных ЭК на 2D-клиностате наблюдалось 88 перестройка актинового цитоскелета со смещением фибрилл к периферии клетки. Полное восстановление правильной архитектоники F-актина наблюдалось после 144 ч клиностатирования и последующего возвращения ЭК в статические условия на 24 ч (Буравкова, Мерзликина, 2004). Наконец, схожие результаты были представлены в работе Versari и соавторов, где моделирование эффектов микрогравитации проводилось на RPM. Было показано, что 96 ч экспозиция на RPM, также приводила к дезорганизации и перераспределению фибрилл актина (Versari, Villa, Bradamante et al., 2007). Авторы отметили, что воздействие микрогравитации обладает быстрым эффектом на актиновый цитоскелет, изменения в строении которого, заметны уже через несколько часов после начала эксперимента. В нашей работе ремоделирование фибрилл актина наблюдалось уже спустя 1 ч экспозиции клеток на RPM, что подтверждает быструю реакцию ЭК на изменение силы тяжести. Такие быстрые эффекты могут быть опосредованы через активацию путей внутриклеточной сигнализации с участием малых Rho ГТФаз, что было продемонстрировано на ЭК микрососудов головного мозга коровы (Higashibata, ImamizoSato, Seki et al., 2006). Эти данные подтвердили результаты, полученные на мезенхимальных стволовых клетках, культивируемых в условиях микрогравитации (Meyers, Zayzafoon, Douglas et al., 2005). Интересен тот факт, что при оверэкспрессии активных компонентов Rho наблюдалась обратная элиминация стресс-фибрилл. Кроме того, увеличение экспрессии RhoA в данной культуре клеток было продемонстрировано коллективом авторов из нашей лаборатории (Gershovich, Gershovich, Zhambalova et al., 2012). Представленные данные указывают на то, что в разных клеточных культурах трансдукция гравитационного стимула опосредуется одними и теми же посредниками – малыми Rho ГТФазами. Следовательно, можно предположить, что для адгезивных культур клеток рецепция изменения действия силы тяжести осуществляется по одному механизму. В то же время хорошо известно, что в ЭК TNF-α индуцирует активацию различных внутриклеточных путей передачи сигнала, в том числе, опосредованных NF-B, c-JNK и других MAPK (Hall 1998). Однако, TNF-α индуцированное увеличение проницаемости ЭК для различных макромолекул (Goldblum, Sun, 1990) оказалось вызвано реорганизацией Fактина, с последующим формированием стресс-волокон и филоподий, изменением формы клеток и появлением межклеточных «разрывов» (Wójciak-Stothard, Entwistle, Garg et al., 1998). Важными компонентами, лежащими в основе данных изменений, авторы назвали белки Cdc42, Rac и Rho. Именно Rho опосредованно увеличивает фосфорилирование легких цепей миозина (MLC) в немышечных клетках с помощью Rho-киназ (ROCKs), приводя к их сокращению (Ridley 2001). Кроме того, оказалось, что данный механизм 89 увеличения проницаемости ЭК характерен не только для действия цитокинов, но и для других вазоактивных агентов, таких как тромбин (Bogatcheva, Garcia, Verin 2002). Наряду с описанным механизмом с участием Rho-киназы, в TNF-α индуцированном увеличении фосфорилирования легких цепей миозина участвует MLC – киназа (MLCK), причем, независимо от Rho (Petrache, Verin, Crow et al., 2001). Наличие нескольких путей внутриклеточного сигналлинга наводит на мысль о возможном объяснении временного различия увеличения проницаемости ЭК после воздействия TNF – α и тромбина. Максимальный эффект провоспалительного цитокина достигается к 24 часам после воздействия (Goldblum, Hennig, Jay et al., 1989), тогда как тромбина – всего несколько минут (Bogatcheva, Garcia, Verin 2002). Однако, в работе Mckenzie и Ridley было наглядно продемонстрировано, что 24 ч TNF-стимуляция вызывает удлинение HUVEC и накопление стрессовых волокон по всему телу клетки, перераспределение белков плотных контактов и увеличение проницаемости. При этом, Rho/ROCK, но не MLCK способствует этим поздним морфологическим изменениям и в то же время никак не влияет на проницаемость. Ранняя реакция (около 30 минут) вызывает Rho активацию и MLC фосфорилирование, но не увеличивает проницаемость. Авторы делают вывод, что TNFиндуцированное повышение проницаемости может быть связано с потерей белков плотных контактов, а не изменений в сократимости актинового цитоскелета клетки (Mckenzie, Ridley, 2007). Таким образом, резюмируя литературные данные, можно предположить, что изучаемое в нашей работе совместное действие моделируемой микрогравитации и провоспалительной TNF-α-стимуляции на ЭК человека может обеспечиваться активацией сигнальных путей, общей мишенью которых являются белки семейства Rho ГТФаз, регулирующие организацию цитоскелета. Основываясь на этих выводах и учитывая, что актиновые филаменты являются динамической структурой, необходимо понять, происходит ли наблюдаемое в нашем исследовании ремоделирование микрофиламентов в условиях микрогравитации из-за деполимеризации/полимеризации актиновых фибрилл. А также встает вопрос о синтезе актина de novo или использованием клеткой синтезированного ранее микрогравитации. Показано, актинового цитоскелета пула в что ЭК G-актина в ответ на TNF-α-индуцированное вызвано простым условия изменение динамическим моделируемой архитектуры сдвигом уже полимеризованных фибрилл F-актина вследствие изменения формы клетки (Stroka, Vaitkus, Aranda-Espinoza, 2012). Вполне возможно, что и микрогравитация вызывает динамический сдвиг актиновых фибрилл. В то же время, увеличение интенсивности флуоресценции F-актина, наблюдаемое в нашей работе как при инкубации ЭК с TNF-α, 90 так и при экспозиции на RPM, хоть и согласуется с более ранними литературными данными (Kiemer, Weber, Fürst et al., 2002), но говорит лишь о полимеризации G-актина в его фибриллярную форму и не проливает свет на интересующий нас вопрос. Известно, что β – актин в ЭК локализован в области подвижной цитоплазмы (раффлах, филоподиях и ламеллах), а также в местах прикрепления стресс-фибрилл к плазматической мембране. Более того, даже мРНК данного белка локализована в основном по периферии клетки, так как именно этот белок содержится в цитоплазматической фракции немышечных клеток (Rubenstein, Spudich, 1977; Herman 1993; Хайтлина 2007). Так, методом вестерн-блоттинга было показано, что после 28 дней культивирования на RPM, в ЭК увеличивался уровень содержания актина. При этом использовались антитела к широкому спектру изоформ актинов, поэтому результаты показывают суммарное увеличение содержания этого белка (Grimm, Infanger, Westphal et al., 2009). Возможно, что эффект микрогравитации на экспрессию гена актина может развиваться за более короткие сроки. Действительно, на клетках фолликулярной карциномы щитовидной железы, культивируемых в условиях параболического полета, было показано увеличение дифференциального уровня транскриптов гена ACTB. Кроме того, проведенный количественный анализ при помощи ОТ – ПЦР в реальном времени доказал увеличение экспрессии данного гена в условиях моделируемой микрогравитации (Ulbrich, Pietsch, Grosse et al., 2011). Однако подтвердить эти данные на эндотелиальных клетках не удавалось. В работе Grosse J. и соавторов используя линейную иммортализованную культуру культуру ЭК EA.hy926, не удалось обнаружить изменения экспрессии ACTB в условиях параболического полета (Grosse, Wehland, Pietsch et al., 2012). При этом было показано увеличение экспрессии ABL2, кодирующего F-актин связывающий белок, который предположительно напрямую регулирует структуру цитоскелета (Miller, Wang, Mooseker et al., 2001). Позже была опубликована работа с использованием тех же клеток и сходных условий параболического полета, в которой исследователям удалось зафиксировать тенденцию к увеличению экспрессии ACTB в EA.hy926 уже после первой параболы, однако данные оказались статистически не достоверны (Wehland, Ma, Braun et al., 2013). Интересно, что гипергравитация и вибрация вызывали обратный эффект и значительно снижали экспрессию ACTB. В нашей работе, с использованием первичной культуры ЭК, было показано трехкратное увеличение экспрессии ACTB при моделировании эффектов микрогравитации на RPM в течение 24 часов. Таким образом, можно предположить, что моделируемая микрогравитация через активацию 91 сигнального пути вторичных мессенджеров, включающих семейство Rho-киназ, влияет на структурные гены, связанные с актиновым цитоскелетом ЭК. 3.1.2. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на систему микротрубочек Основную роль структурных компонентов для обеспечения митоза, цитокенеза и везикулярного транспорта практически во всех эукариотических клетках играют микротрубочки (МТ). Кроме этого, было показано их влияние на клеточную полярность и миграцию многих типов клеток, в том числе и эндотелиальных (Gotlieb, Subrahmanyan, Kalnins, 1983). За счет своей механической нестабильности МТ могут быть потенциальными участниками механотрансдукции. В контрольных образцах эндотелиальных клеток, микротрубочки образовывали густую решетчатую сеть, которая охватывала всю цитоплазму, распространяясь от центра клетки к ее периферии (рис. 12 а). На переднем крае клетки микротрубочки были четко окрашены (рис. 12 д). В это же время инкубация с TNF-α вызывала деполимеризацию периферической сети микротрубочек (рис. 12 б). Интенсивность флуоресценции βтубулина снижалась на периферии клеток, по сравнению с контрольными образацами, что сопровождалось снижением плотности МТ в этом регионе клетки. Отдельные МТ иногда теряли свою направленность, извивались и образовывали петли (рис. 12 е). Если провоспалительная активация не вызывала значительных изменений в архитектонике МТ, то 1 часовая экспозиция ЭК на RPM приводила к их значительной модификации (рис. 12 в). Вместо длинных, яркоокрашенных МТ, тянущихся по всей цитоплазме, наблюдалось только несколько нитей, доходящих до края клетки. Остальные МТ объединялись в крупные пучки и концентрировались вокруг клеточного ядра, оставляя периферию свободной. В то же время, в некоторых клетках наблюдались окрашенные ламеллоподии (рис. 12 в). Цитоплазма ЭК имела диффузную окраску, что может быть вызвано меченными свободными тубулиновыми субъединицами (рис. 12 ж). Наряду с этим, на переднем крае клеток обнаруживались короткие МТ, которые свидетельствуют о деполимеризации тубулинового цитоскелета, являясь остатками от некогда развтвленной мощной сети МТ (рис. 12 ж). Эти короткие МТ не имели предпочтительной ориентации в отличие от контрольных образцов, в которых они были преимущественно направлены к периферии клетки. Анализ микрофотографий показал, что совместное действие моделируемой микрогравитации и TNF-α активации в течение 1 часа приводило к усилению изменений 92 60 мин 60 мин а д б е в ж г з а Рис. 12. Динамика изменения строения тубулинового цитоскелета ЭК: а, д – статический контроль; б, е – активация TNF-α (2 нг/мл); в, ж – экспозиция на RPM; г, з – экспозиция на RPM активированных TNF-α ЭК. Флуоресцентная конфокальная микроскопия. Масштабный отрезок 20 мкм. 93 тубулинового цитоскелета, наблюдаемых при экспозиции интактных ЭК на RPM. Интенсивность флуоресценции диффузной окраски вокруг ядра значительно увеличивалась, что говорит о сильной деполимеризации МТ (рис. 12 г). Кроме того, появилась зернистость окраски перинуклеарной области, возможно, свидетельствующая о агрегации тубулиновых субъединиц. Количество коротких МТ на периферии клеток значительно увеличилось (рис. 12 з). Их ориентация также была хаотичной. Наряду с этим, оставшиеся в периферическом пространстве плотность микротрубочек была выше, чем в клетках, подвергавшихся клиностатированию. Однако такая толщина МТ может объясняться ассоциацией МТ, идущих от центра клетки, с короткими остатками МТ цитоплазмы. Изменения организации тубулинового цитоскелета, индуцированные TNF-α, сохранялись на протяжении 24 часов инкубации. На данном сроке инкубации большая часть β-тубулина ЭК находилась в виде деполимеризованных тубулиновых единиц, сконцентрированных, главным образом, вокруг ядра. Однако, МТ, обнаруживаемые на периферии клетки, хотя и оставались все еще укороченными, но приобретали правильную ориентацию, от центра к краю клетки, и не образовывали петель. Возможно, с этого момента начиналось восстановление нормальной организации МТ (рис. 13 б). Диффузная окраска β-тубулина вокруг ядра наблюдалась и в ЭК, подвергавшихся 24-часовому воздействию микрогравитации. На периферии клетки обнаруживались МТ, которых не наблюдалось в ЭК, экспонировавшихся на RPM в течение часа. Однако эти МТ не имели четкой направленности, образовывали хаотичную сеть по краям клеток (рис. 13 в). Хотя мы не проводили количественный анализ, даже беглого взгляда на микрофотографии достаточно, чтобы увидеть резкое увеличение числа двуядерных клеток. Эти клетки образовывали кластеры и находились рядом друг с другом в общей массе одноядерных клеток (рис. 13 в). Стоит отметить, что в культуре TNF-αактивированных ЭК, экспонированных на RPM, двуядерные клетки встречались значительно реже. Совместное действие изучаемых факторов приводило к интересному сочетанию особенностей измененной архитектоники МТ. С одной стороны, ЭК образовывали большое количество ламеллоподий, в которых МТ ассоциированы в плотные ярко флуоресцирующие пучки. С другой стороны, в клетках, не образующих ламелоподий, МТ сконцентрированы вокруг ядра и располагались в виде тонких нитей по периферии (рис. 13 д). Кроме того, наблюдаемые МТ были либо фрагментированы (указано стрелками), либо полностью потеряли свою нормальную ориентацию, вплоть до образования спиралей (рис. 13 д). 94 24 часа а б в г д Рис. 13. Динамика изменения строения тубулинового цитоскелета ЭК, спустя 24 ч от начала эксперимента: а-статический контроль, б-активация TNF-α (2 нг/мл); в–экспозиция на RPM; г, д – экспозиция на RPM активированных TNFα ЭК, детальное строение МТ. Флуоресцентная конфокальная микроскопия. Масштабный отрезок 20 мкм. 95 Таким образом, в ходе проведенного иммунофлуоресцентного исследования архитектоники тубулинового цитоскелета ЭК удалось установить, что МТ этих клеток являются очень чувствительными к условиям микрогравитации, моделируемым с помощью RPM. Ярко выраженные изменения архитектоники МТ после 1 часа экспозиции на RPM приводили к нарушению пролиферации ЭК, появлению двуядерных клеток, уже к 24 часам от начала эксперимента. Совместное действие провоспалительной активации и моделируемой микрогравитации характеризовалось не только наличием двуядерных клеток, но и усилением деполимеризации, изменением ориентации и ассоциации отдельных МТ. О том, что микрогравитация вызывает нарушения сборки МТ, ученые впервые узнали более 20 лет назад. В миоцитах Xenopus laevis, культивируемых в 2D-клиностате были обнаружены дезорганизованные, сконденсированные МТ (Gruener, Hoeger, 1990). Более подробно влияние микрогравитации на тубулиновый цитоскелет было изучено в ходе космического эксперимента на борту шаттла на клетках лимфобластомы человека (Jurkat) (Lewis, Reynolds, Cubano et al., 1998). Спустя 20 ч от начала полета МТ были укороченными, образовывали менее разветвленную в цитоплазме сеть, по сравнению с контрольными клетками, строение центров организации микротрубочек (ЦОМТ) было нарушено. Кроме того, было показано снижение пролиферации Jurkat в условиях микрогравитации, клетки оставались в G2M периоде клеточного цикла. Авторы предположили, что обнаруженные аномалии могли быть вызваны реорганизацией микротрубочек. Схожие данные были получены в ходе космического полета и на адгезивных культурах клеток. В раковых клетках молочной железы (MCF-7) уже после 1,5 ч полета наблюдалось резкое увеличение деполимеризованных, коротких МТ. Также как и в клетках Jurkat в MCF-7 наблюдалось снижение пролиферации и блокада клеточного цикла на стадии G2M спустя первые сутки полета. Интересно отметить, что после 48 ч полета наблюдалась обратная реорганизация МТ, близкая к таковой в контрольных клетках, однако в некоторых клетка обнаруженные ранее изменения МТ сохранялись (Vassy, Portet , Beil et al., 2001). Обнаруженные подтвердились и в во время наземных космического экспериментах полета с изменения использованием строения RPM. МТ Так, клиностатирование глиальных клеток в течение 20 ч вызывало потерю радиального расположения МТ и концентрацию их вокруг ядер клеток. После 32 ч клиностатирования происходила обратная реорганизация МТ в хорошо разветвленную радиальную сеть, с хорошо обнаруживаемым ЦОМТ (Uva, Masini, Sturla et al., 2002). Позднее появились данные о действии микрогравитации на тубулиновый цитоскелет EA.hy926 клеток 96 (Infanger, Kossmehl, Shakibaei et al., 2006). В работе показано, что моделируемая в течение 24 часов микрогравитация, приводит к утолщению МТ (α-тубулин) и компактизации вокруг клеточного ядра. Данные, полученные в нашей работе на первичной культуре ЭК человека, о реорганизации МТ в ответ на действие моделируемой микрогравитации полностью согласуются с результатами более ранних работ (Lewis, Reynolds, Cubano et al., 1998; Vassy, Portet , Beil et al., 2001; Uva, Masini, Sturla et al., 2002). Увеличение доли двуядерных клеток говорит об увеличении длительности митоза и нарушении пролиферации, обнаруженных в Jurkat в MCF-7 (Lewis, Reynolds, Cubano et al., 1998; Vassy, Portet , Beil et al., 2001). Можно предположить, что вызванные микрогравитацией нарушения организации МТ приводят к снижению клеточной пролиферации как адгезивных, так и суспензионных клеточных культур. Как и в MCF-7 клетках, в ЭК наблюдались изменения строения МТ в течение часа от начала эксперимента, которые характеризовались наличием меченных свободных тубулиновых единиц и коротких МТ, потерявших свою предпочтительную ориентацию к периферии клетки. Тем не менее, в зависимости от типа клеток изменения МТ все же отличаются. В ЭК, так же как и в EA.hy926 клетках МТ компактизованны вокруг ядра, наличие меченых тубулиновых единиц невелико, тогда как в MCF-7 практически все МТ деполимеризованы и вокруг ядра не выявлены. В отличие от MCF-7, в которых восстановление организации МТ наступало спустя 48 ч, в ЭК некую тенденцию к реорганизации МТ мы наблюдали после 24 ч. Однако, измененные МТ наблюдались в некоторых одиночных и в кластерах двуядерных клеток. Это позволяет деполимеризации/полимеризации МТ предположить, этих клеток что динамика цикличной была нарушена действием микрогравитации, также как это было продемонстрировано in vitro в экспериментах Tabony и соав. (Papaseit, Pochon, Tabony 2000), которые показали зависимость самоорганизации МТ от гравитации. Авторы постулировали, что самоорганизация МТ не возникает, если в течение первых 13 мин на них не действует сила тяжести. Поскольку цикл сборки/разборки МТ во время митоза в 10 раз быстрее, чем в интерфазном периоде, то нарушение процесса сборки МТ имеет большое значение при делении клеток (Saxton, Stemple, Leslie et al., 1984). Этот ускоренный оборот МТ соответствует флуктуации плотности субъединиц тубулина, и представляет собой окно, в течение которого реакционно-диффузная система подвергается бифуркации, запускаемой силой тяжести (Papaseit, Pochon, Tabony 2000). Таким образом, каждый раз, когда клетка вступает в митоз в условиях микрогравитации, происходят аномалии организации МТ. Поскольку 97 дочерние клетки зачастую образую кластеры, то и двуядерные клетки, наблюдаемые в нашей работе, расположены кластерами. Инкубация с TNF-α вызывает отличные от микрогравитации изменения организации МТ в ЭК. Показано, что в первичной культуре ЭК человека после 24 ч инкубации с TNF-α привычная разветвленная сеть МТ реорганизуется в отдельные пучки. Причем эти пучки состоят из уже образованных МТ, так как не было обнаружено изменения экспрессии тубулина (Molony, Armstrong, 1991). Спустя 10 лет удалось пролить свет на механизм действия провоспалительного цитокина. В ЭК легочной артерии человека трехчасовая инкубация с TNF-α индуцирует разборку периферической сети МТ, а через 16 ч происходит деполимеризация общей большей части сети МТ, что совпадает с максимальным TNF-α-индуцированным увеличением проницаемости и сопровождается изменением формы клетки. Интересно, что предварительная обработка ЭК стабилизирующим агентом – паклитакселом приводит к отчетливому снижению TNF-αиндуцированной проницаемости (Petrache, Birukova, Ramirez et al., 2003). Точный механизм действия TNF-α на организацию МТ остается не до канца изученным. Известно только, что p38 МАРК является ключевым агентом в данном процессе и, вполне возможно участвует в прямом фосфорилировании белков ассоциированных с микротрубочками (Petrache, Birukova, Ramirez et al., 2003). Вследствие этого можно предположить, что совместное действие провоспалительной активации и моделируемой микрогравитации на ЭК, изучаемое в нашей работе, опосредуется двумя разными механизмами. Причем, нарушение самоорганизации МТ под действием микрогравитации происходит в первую очередь, и лишь потом активируется p38 МАРК. 3.2. Жизнеспособность культивируемых эндотелиальных клеток в условиях моделируемой микрогравитации В качестве медиатора воспаления в нашей работе выступал цитокин широкого плеотропного действия TNF-α. Зная, что высокие концентрации TNF-α индуцируют апоптоз (Li, Young, Mehta, 1999), мы использовали минимальную концентрацию цитокина, способную вызвать дисфункцию эндотелия (Makó, Czúcz, Weiszhár et al., 2010). Но, поскольку в работе ЭК подвергались комбинированному воздействию двух факторов микрогравитации и провоспалительной активации - возникла необходимость провести анализ жизнеспособности культивиремых ЭК. С помощью специфических флуоресцентных красителей и метода проточной цитометрии удалось выявить процентное соотношение живых ЭК, культивируемых в 98 условиях индукции TNF-α, экспозиции на RPM и в условиях совместного действия этих стимулов (табл. 4). Двойное положительное окрашивание анализируемых ЭК на йодид пропидия и аннексин V, характерно для клеток находящихся на поздней стадии апоптоза (Хаитов, Пинегин, Ярилин, 2009). Таблица 4. Жизнеспособность ЭК после 24 ч культивирования с добавлением TNFα (2нг/мл), в условиях моделируемой микрогравитации и их совместном действии. Представленные данные отражают: среднее количество живых (PI-/AnnV-), апоптотических (AnnV+), некротических (PI+) и на поздней стадии апоптоза (PI+/AnnV+), ЭК (данные 5-ти независимых экспериментов). Статический TNF-α контроль (2 нг/мл) 0,4 ± 0,09 RPM RPM+ TNF-α 0,9 ± 0,34 0,4±0,13 0,5±0,10 2,1 ± 0,81 6,4 ± 3,12 1,3±0,35 1,5±0,70 90,8 ± 2,97 89,3 ± 5,11 94,9±0,93 94,2±1,90 6,8 ± 2,20 3,4 ± 1,60 3,4±0,72 3,7±1,10 PI+-клетки,% + + PI /AnnV -клетки,% PI-/AnnV--клетки,% + AnnV -клетки,% Проведенный анализ жизнеспособности показал, что, как и ожидалось, провоспалительная активация с примененеием малых доз TNF-α не вызывает снижения доли живых клеток, по отношению к контрольным образцам (89,3% против 90,8%) (табл. 4). Кроме того, экспозиця на RPM интактных и TNF-α-индуцированных (94,9% и 94,2%) не приводила к возникновению достоверных отличий от контрольных образцов (табл. 4). На данный момент существоет сформировавшаяся точка зрения, что длительное воздействие микрогравитации увеличивает гибель ЭК путем апоптоза. Так, 72 ч экспозиция на RPM вызывает увеличение апоптотических телец и снижение жизнеспособности EA.hy926 клеток. В то же время, остается не совсем ясным, обнаруженное этими исследователями увеличение уровня как проапоптотических (Каспаза-3, FAS и Bax), так и антиапоптотического (Bcl-2) белков (Infanger, Kossmehl, Shakibaei et al., 2006). В другом исследовании авторы использовали 2D клиностат, а в качестве предмета исследования выбрали ЭК микрососудов легких человека (HPMECs). Результаты показали, что 72 ч культивирования ЭК в условиях моделируемой микрогравитации приводят к увеличению экспрессии проапоптотических генов BAX, CASP3 и снижению экспрессии антиапоптотического гена BCL2 (Kang, Zou, Yuan et al., 2011). В отличие от длительных, краткосрочные эффекты микрогравитации на жизнеспособность ЭК остаются малопонятными. После 22 с параболического полета в клетках EA.hy926 было выявлено увеличение уровня мРНК гена SPHK1, ответственного за пролиферацию и жизнеспособность, а также снижение уровня мРНК гена CARD8, 99 кодирующего белок, который играет ключевую роль в активации каспаз, регулирующих апоптоз (Grosse, Wehland, Pietsch et al., 2012). Авторы предположили, что снижение экспрессии данного гена не только свидетельствует о снижении апоптоза, но о ранней адаптации ЭК к условиям микрогравитации. Однако, годом позже, в подобном эксперименте были получены противоположные результаты. Параболический полет длительностью 22 с вызывал увеличение экспресси проапоптотических генов CASP3 и CASP8, что, по мнению авторов, является доказательством увеличения апоптоза (Wehland, Ma, Braun et al., 2013). Опираясь на эти данные нельзя четко определить краткосрочные эффекты микрогравитации на жизнеспособность ЭК. Как нельзя утверждать правильность изучения механизмов клеточной гибели, объектом которого являются иммортализованные линейные клетки EA.hy926 (Boerma, Burton, Wang et al., 2006). Таким образом, в нашей работе выделенные из пупочной вены человека и культивируемые ЭК характеризовались высоким уровнем жизнеспособности не только в статических условиях, но и при коротких сроках экспозиции на RPM. Кроме того, применяемая в работе модель провоспалительной активации ЭК in vitro не снижала их жизнеспособность. 3.3 Влияние моделируемой микрогравитации на экспрессию молекул клеточной адгезии эндотелиальных клеток 3.3.1. Профиль поверхностных маркеров эндотелиальных клеток Основной набор изучаемых в нашей работе функций, выполняемых ЭК можно охарактеризовать как обеспечение межклеточных взаимодействий. Взаимодействие ЭК между собой лежит в основе ангиогенной и барьерной функций, а с другими клетками крови – иммунной. Именно по конститутивной экспрессии определенных поверхностных мембранных белков, ргулирующих взаимодействия клеток, и возможно идентифицировать ЭК: PECAM-1 (Albelda, Muller, Buck et al., 1991), VE-кадгерин (Risau, Flamme, 1995), Е-селектин (Bevilacqua, Stengelin, Gimbrone et al., 1989), эндоглин (Barbara, Wrana, Letarte, 1999) и ICAM-1 (Dustin, Springer, 1988). Наличие данного спектра молекул, низкий уровень экспрессии Е-селектина и ICAM-1 характеризует нормальный или антивоспалительный фенотип эндотелия. Однако воздействие медиаторов воспаления приводит к изменению фенотипа ЭК на провоспалительный, который характеризуется увеличением проницаемости эндотелия (Henning, Goldblum, McClain, 1987), резкому увеличению уровня экспрессии молекул Е-селектина, ICAM-1 (Pober, Lapierre, Stolpen et 100 al., 1987) и появлением на поверхности ЭК индуцибельной молекулы VCAM-1 (Osborn, Hession, Tizard, 1989). В нашей работе все интактные ЭК несли на своей поверхности PECAM-1, тогда как доля VE-кадгерин – позитивных клеток составляла 55 – 73% (рис. 14 а). Одновременное наличие этих маркеров позволяет ЭК образовывать непрерывный монослой клеток и обеспечивает контактное торможение. Инкубация с TNF-α в течение 24 часов не вызывала изменения числа PECAM-1- и VE-кадгерин – позитивных клеток (рис.14 а). Уровнь экспрессии этих молекул, оцениваемый по показателю средней интенсивности флуоресценции на клетку, был низким, и также не изменялся в ответ на провоспалительную активацию. Популяция интактных ЭК также характеризовалась наличием ICAM-1 – и E-селектин – положительных клеток (24,9% и 34,2% соответственно) и полным отсутствием VCAM-1 экспрессирующих клеток (1,17 %) (рис. 14 а, б, в). Добавление в среду культивирования TNF-α приводило к резкому увеличению экспрессии ICAM-1, что характиризовалоль практически трехкратным увеличением доли клеток, несущих на мембране данный маркер, в исследуемой популяции (92%) (рис. 14 а, г). Также, происходило увеличение доли E-селектин – положительных клеток (46,7%). Кроме того, провоспалительная активация приводила к экспресии индуцибельной молекулы VCAM-1, доля клеток, несущих данный маркер составляла 46% (рис. 14 а, д). Полученные данные хорошо согласуются с результатами более ранних работ, в которых показано, что увеличение экспрессии ICAM-1 на 50% выше контрольных значений наступает в течение 6-10 ч после добавления TNF-α, а к 24 ч достигает максимальных значений (Pober, Gimbrone, Lapierre et al., 1986). Для молекулы VCAM-1 максимальное увеличение экспрессии в ответ на TNF-α-опосредованную активацию отмечалось после 68 часов инкубации, однако после 24 ч инкубации эффект все еще был статистически достоверен (Carlos, Schwartz, Kovach et al., 1990). Таким образом, культивируемые эндотелиальные клетки пупочной вены характеризовались экспрессией всех поверхностных маркеров, необходимых как для осуществления межклеточных взаимодействий, так и обеспечения барьерной и иммунной функции эндотелиального монослоя. Добавление провоспалительного цитокина TNF-a сопровождалось сменой антивоспалительного фенотипа ЭК на провоспалительный, что также было показано в более ранних работах других исследователей (Mackay, Loetscher, Stueber et al., 1993; Makó, Czúcz, Weiszhár et al., 2010). 101 а * Статический контроль TNF-α Доля клеток, % 90 * 60 30 0 PECAM-1 VE-кадгерин ICAM-1 E-селектин VCAM-1 б г в д Рис. 14. Экспрессия PECAM-1, VE-кадгерина, Е-селектина (а), а также ICAM -1 и VCAM-1 в интактных (б, в) и TNF-α-активированных ЭК человека (инкубация 24 часа) (г, д). а – данные проточной цитометрии, для PECAM-1, VE-кадгерина, Е-селектина и VCAM-1 n = 5, для ICAM-1 n = 10 (m±SEM,* - p≤0,05, различия достоверны по отношению к интактным клеткам, т-тест); б, г - двойное иммуноцитохимическое выявление ICAM-1 с использованием набора DAB Peroxidase kit; в, д – непрямое иммуноцитохимическое окрашивание с помощью флуоресцентно-меченых антител к VICAM-1. 102 3.3.2. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на экспрессию молекул клеточной адгезии Известно, что ЭК играют ключевую роль в рекрутировании лейкоцитов из непрерывного тока крови, синтезируя различные молекулы клеточной адгезии. Однако, в нормальных физиологических условиях лишь моноциты способны к трансмиграции через эндотелиальный монослой, доля которых от общего числа лейкоцитов составляет 1-8% (Thomas-Ecker, Lindecke, Hatzmann, et al., 2007). В связи с этим, в норме сосудистый эндотелий экспрессирует низкие уровни ICAM-1, а воспалительные стимулы резко и значительно увеличивают экспрессию этой молекулы адгезии на поверхности ЭК (Dustin, Springer, 1988). Экспрессия же VCAM-1 на поверхности ЭК происходит только при активирующих стимулах, что и определяет данную молекулу, как индуцибельную (Osborn, Hession, Tizard et al., 1989; Carlos, Schwartz, Kovach et al., 1990). Кроме того, экспрессия молекулы Е-селектина (CD62E), играющего ключевую роль в адгезии нейтрофилов (Bevilacqua, Pober, Mendrick et al., 1987), также значительно увеличивается при действии медиаторов воспаления, что приводит к резкому увеличению её растворенных форм (sE-селектин) в крови и является индикатором воспалительной реакции (Leeuwenberg, Smeets, Neefjes et al., 1992; Keelan, Harrison, Chapman et al., 1994). Следовательно, основную функцию ЭК по иммунному надзору и обеспечению клеточной адгезии в условиях измененной гравитации необходимо изучать как в норме, так и при воспалении. Если в норме эффектам микрогравитации посвящено достаточное количество работ, то при воспалении их единицы. Стоит при этом отметить, что молекулы адгезии напрямую или опосредованно связаны с белками цитоскелета ЭК (Vogetseder, Dierich, 1991), что может указывать на их участие в механорецепции. Для исследования влияния моделируемой микрогравитации на профиль экспрессии молекул адгезии на поверхности ЭК, мы измеряли уровни экспрессии ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина после 24-часовой экспозиции интактных и TNF-α-активированных клеток на RPM, с помощью метода проточной цитометрии. Анализ полученных данных показал, что в нормальных условиях доля CD62E-положительных клеток составляла около 24% от всей популяции интактных ЭК (рис. 15 а). Изучаемые в работе воздействия вызывали постепенное увеличение экспрессии Е-селектина. Так, спустя 24 часа после добавления в среду культивирования TNF-α доля CD62E+-клеток увеличилась практически вдвое, до 42% (рис. 15 а). Экспозиция на RPM той же длительности приводила более чем к двукратному увеличению экспрессии E-селектина, по сравнению с контролем, достигая 53%. Этот эффект подтверждался и увеличением интенсивности флуоресценции данного 103 рецептора в отдельных экспериментах (рис. 15 б), однако суммарный анализ данных не выявил статистической достоверности. Наиболее значимое увеличение доли CD62E+клеток наблюдалось при экспозиции на RPM TNF-α-активированных клеток (рис. 15 а), около 66,5% (р = 0,0409), что почти в 3 раза больше, чем в контрольных образцах. Необходимо отметить, что только в условиях совместного действия микрогравитации и провоспалительной активации наблюдаемый эффект был статистически достоверным. В связи с этим, можно предположить, что экспозиция на RPM не способствует увеличению базовой экспрессии Е-селектина, однако потенцирует индуцированную цитокином экспрессию данного рецептора. Как уже было показано, используемая в нашей работе культура ЭК характеризовалась отсутствием экспрессии индуцибельной молекулы VCAM-1 (рис. 14 а). Всего 1,5 % клеток в популяции несли на своей поверхности данный рецептор, что находится в диапазоне ошибки метода проточной цитометрии. Добавление TNF-α приводило к достоверному тридцатикратному увеличению доли CD106+-ЭК (р = 0,0431, 46%) после 24 часов культивирования в статических условиях (рис. 15 в). Под влиянием моделируемой микрогравитации той же длительности, экспрессия VCAM-1 на поверхности интактных ЭК не отличалась от контрольных значений и была низкой (р = 0,2249, 2,35%). Кроме того, при клиностатировании TNF-α-активированных ЭК, доля CD106+- клеток не отличалась от значений в образцах, культивируемых в статических условиях с добавлением провоспалительного цитокина (р = 0,5001, 48,6%) (рис. 15 в). Интересно, что в нескольких отдельных экспериментах, средняя интенсивность флуоресценции в клиностатируемых TNF-α-активированных образцах была выше, чем в статичных (рис. 15 г). Однако, проанализировав все данные, следует отметить, что моделируемая микрогравитация не влияет на экспрессию рецептора VCAM-1 на поверхности ЭК как в норме, так и при воспалении. Анализ полученных данных по экспрессии ICAM-1 ЭК не выявил однонаправленных изменений. С одной стороны, все используемые в работе культуры ЭК адекватно реагировали на добавление TNF-α увеличением экспрессии ICAM-1. С другой стороны, базальный уровень экспрессии данного рецептора сильно варьировал в зависимости от донора. В связи с этим, положив в основу исходный уровень и степень увеличения экспрессии ICAM-1 в ответ на добавление TNF-α, мы разделили данные на две клеточные линии: высокоэкспрессирующие (1 группа) и низкоэкспрессирующие (2 группа). Так, популяция интактных клеток 1-ой группы характеризовалась достоверно большей долей CD54+- ЭК, чем во 2-ой группе (р = 0,0034, 62,3% против 9,9%) (рис. 16 а). 24-часовая инкубация с TNF-α способствовала тому, что практически вся популяция ЭК 104 несла на своей поверхности ICAM-1 в обеих группах (рис. 17 а). Однако степень выраженности провоспалительного эффекта была разной: если для 1 группы доля CD54+ ЭК выросла в 1,6 раза (98,7%), то для 2 группы - в 9,6 раза (94,9%). Кроме этого, относительная интенсивность флуоресценции 2 группы клеток была выше, чем у 1-ой (28,5 против 12) (рис. 17 в). Таким образом, активация TNF-α приводила к увеличению экспрессии ICAM-1 в обеих группах, однако во 2-ой группе этот эффект, более выраженный. а б в г Рис. 15. Экспрессия Е-селектина (а) и VCAM-1 (в) на поверхности ЭК после 24 ч культивирования с добавлением TNF-α (2 нг/мл), в условиях моделируемой микрогравитации и их совместном действии. Данные представлены М±SD,*- р≤0,05 достоверные отличия от статического контроля (критерий Манна-Уитни). Гистограммы, отражающие изменение интенсивности флуоресценции Е-селектина (б) и VCAM-1 (г), данные репрезентативного эксперимента. Экспозиция на RPM в течение 24 часов не вызывала достоверных изменений средней интенсивности флуоресценции ICAM-1 в обеих группах интактных клеток (рис. 17 в). Однако, в некоторых экспериментах, прослеживалась тенденция к увеличению данного показателя для 2-ой группы клеток (рис. 17 б). Эта тенденция подтверждалась 105 Статический контроль RPM а + + CD54 -клетки, % CD54 -клетки, % б Группа Группа Рис. 16. Уровни экспрессии ICAM-1 в различных клеточных линиях в условиях статического контроля (а) и моделируемой микрогравитации (б). *- р≤0,05- достоверные отличия (критерий Манна-Уитни). а ** б * в г Рис. 17. Экспрессия ICAM-1 на поверхности ЭК (а) и средняя интенсивность флуоресценции (в) ICAM-1 после 24 ч культивирования с добавлением TNF-α (2 нг/мл), в условиях моделируемой микрогравитации и их совместном действии. Данные представлены М±SD, достоверные отличия: *- р≤0,05 - от статического контроля внутри 1-ой группы, **- р≤0,05 - от статического контроля внутри 2-ой группы, # - р≤0,05 между группами (t-критерий). Гистограммы, отражающие изменение интенсивности флуоресценции ICAM-1 при активации TNF-α (б) и экспозиции на RPM (г), данные репрезентативного эксперимента (черный - изотипический контроль, зеленый статический контроль, фиолетовый - экспозиция на RPM, красный - активация TNF-α). 106 а б в г Рис. 18. Относительный уровень экспрессии генов VCAM1(а) и ICAM1(в) в ЭК после 24-часового воздействия моделируемой микрогравитации, активации TNF-α и их совместном действии (б и г, соответственно). Данные представлены как М±SD, в относительных единицах по отношению к контролю, принятому за 1 (черная линия). Достоверные отличия: * - р≤0,05 - внутри одной группы; # - р≤0,05 - между группами; ** - р≤0,01 - между группами. количественным анализом экспрессии CD54 на поверхности ЭК. Так, 3D- клиностатирование способствовало увеличению доли CD54+-клеток 2-ой группы (в 2 раза, сравнению с контролем, р = 0,0117) (рис. 17 а). В то же время, обратный эффект микрогравитации наблюдался на клетках 1-ой группы, доля CD54+-ЭК достоверно снижалась (р = 0,0431, 42,9 %). Кроме того, различия в исходном уровне экспрессии ICAM-1 между ЭК разных групп, оставались достоверно отличимыми (р = 0,0192) и в условиях моделируемой микрогравитации (рис. 16 б). Если моделируемая микрогравитация вызывает значительные изменения экспрессии ICAM-1 на поверхности интактных ЭК обеих групп, то для TNF-α-активированных ЭК подобных изменений отмечено не было (рис. 17 а), так как доля CD54+-клеток была близка к 100%. Причем различий между группами также не наблюдалось. Однако результаты анализа средней флуоресценции на клетку говорят о том, что во 2-ой группе величина этого показателя была значительно выше, чем в 1-ой (рис 17 в). Эти данные подтверждают обоснованность 107 разделения получаемых первичных клеточных линий от разных доноров на группы. Так, тенденция к более выраженному ответу клеток 2-ой группы на индукцию TNF-α, сопровождалась достоверными изменениями (р = 0,0186) в условиях моделируемой микрогравитации. Таким образом, мы показали, что при моделировании эффектов микрогравитации не происходит экспрессии индуцибельной молекулы VCAM-1 и не увеличивается базальная экспрессия Е-селектина на поверхности ЭК. Но при этом, в зависимости от базального уровня экспрессии ICAM-1, наблюдается разнонаправленный эффект на долю CD54+клеток. В «предактивированных» клетках 1-ой группы, экспозиция на RPM снижала исходно высокий уровень экспрессии ICAM-1, а в «нормальных» клетках 2-ой группы увеличивала изначально низкий уровень экспрессии данного рецептора. В условиях провоспалительной активации ЭК, 3D-клиностатирование не влияло на увеличение экспрессии VCAM-1 и ICAM-1, но потенцировало экспрессию Е-селектина на поверхности ЭК. Обнаружив изменения экспрессии поверхностных молекул клеточной адгезии ЭК в ответ на действие моделируемой микрогравитации, мы провели исследование влияния этих условий на экспрессию генов ICAM1 и VCAM1. В данной серии исследований экспрессии гена VCAM1 были использованы те же первичные клеточные линии, что и при определении уровня экспрессии ICAM-1 на поверхности ЭК. Результаты усредненных данных показали, что 24-часовая экспозиция на RPM достоверно не изменяет экспрессию гена VCAM1 в ЭК (рис. 18 а). 24-часовая инкубация с цитокином TNF-α приводила к наиболее выраженному увеличению уровня экспрессии VCAM1, особенно в 1-ой группе клеток. Уровень экспрессии в этой группе в 600 раз превышал контрольные значения и был достоверно выше значений относительного уровня экспрессии для 2-ой группы (рис. 18 б). Экспозиция на RPM той же длительности TNF-α-активированных ЭК отменяла характерную для статических условий разницу в уровнях экспрессии VCAM1 между высоко- и низкоэкспрессирующими клетками (рис. 18 б). Моделируемая микрогравитация одновременно потенцировала эффект индуцированный TNF-α во 2-ой группе и снижала в 1-ой группе клеток. Очевидно, что наблюдаемое увеличение уровня экспрессии гена VCAM1 во 2-й группе клеток согласуется с наблюдаемым ранее увеличением уровня поверхностной экспрессии, кодируемой этим геном молекулы VCAM-1, в данной группе клеток (рис. 15 г). Наблюдаемая направленность изменения экспрессии гена VCAM1 сохранялась и для другой молекулы адгезии - ICAM1. Так, 24-часовая экспозиция на RPM выявляла 108 достоверные различия уровня экспрессии гена ICAM1 между высоко- и низкопродуцирующими клетками (рис. 18 в), что подтверждает, наблюдаемые при 3Dклиностатировании, различия количества CD54+-ЭК между 1-ой и 2-ой группой (рис. 17 а). Кроме того, провоспалительная активация вызывала достоверно большее увеличение уровня экспрессии ICAM1 в клетках 2-ой группы (рис. 18 г), как это отмечалось при анализе уровня экспрессии поверхностного рецептора ICAM-1 (рис. 17 в). Необходимо также отметить, что экспозиция на RPM TNF-α-активированных ЭК не изменяла влияние провоспалительной индукции на экспрессию ICAM1 в 1-ой группе клеток и потенцировала во 2-ой (рис. 18 г). Этот факт, также подтверждает данные, полученные методом проточной цитометрии (рис. 17 в). Таким образом, в результате проведенных исследований, нам удалось найти соответствие между уровнем поверхностной экспрессии изучаемых молекул клеточной адгезии и транскрипцией генов при провоспалительной активации и моделировании эффектов микрогравитации. Кроме того, мы показали, что и действие моделируемой микрогравитации в норме и при воспалении сильнее всего влияет на клетки с низким базовым уровнем экспрессии молекул клеточной адгезии, потенцируя при этом эффект активации ЭК медиаторами воспаления. Количество работ, в которых изучалось действие микрогравитации на экспрессию Еселектина в ЭК, немногочисленно, а данные, полученные в них, противоречивы. Так, в нашей лаборатории, показано, что 2D-клиностатирование в течение 18 ч не влияет на экспрессию Е-селектина на поверхности интактных, но приводит к снижению экспрессии данного рецептора на поверхности TNF-α-индуцированных ЭК (Romanov, Buravkova, Rikova et al., 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005). При использовании другого способа моделирования эффектов микрогравитации (RPM) получены иные результаты. Экспозиция на RPM в течение 24 и 48 часов вызывала снижение доли Е-селектинположительных клеток в популяции, что подтверждалось снижением уровня экспрессии гена этой молекулы адгезии (Grenon, Jeanne, Aguado-Zuniga et al., 2013). Различия в результатах можно объяснить тем, что в анализируемых работах были использованы клеточные культуры разных пассажей. Романов и соавторы (Romanov, Buravkova, Rikova et al., 2001) использовали HUVEC ранних пассажей, в то время как в работе Grenon и соавт. (Grenon, Jeanne, Aguado-Zuniga. et al., 2013) клетки культивировали до 12 пассажа. Наряду с этими работами имеются исследования, проведенные на той же культуре клеток, но в условиях реального космического полета. Культивирование HUVEC в биореакторе в условиях 12-дневного космического полета не выявило изменений как в содержании растворимой формы Е-селектина в культуральной среде, так и в уровне экспрессии гена 109 этого рецептора (Muid, Froemming, Manaf et al., 2010). Интересно, что в эксперименте in vivo с применением сухой иммерсии в качестве моделирования воздействия условий микрогравитации на организм человека в течение 7 дней, уровень растворимой формы Еселектина в сыворотке крови волонтеров также оставался неизменным (Navasiolava, Dignat-George, Sabatier et al., 2010). В то же время в условиях реального космического полета наблюдался противоположный эффект. Так, космический полет продолжительностью около 10 дней способствовал снижению уровня sE-селектина в плазме крови космонавтов (Mills, Perez, Adler et al., 2002), что не соответствует результатам с применением сухой иммерсии. Наконец, в одной из последних работ было показано увеличение экспрессии Е-селектина в районе общей сонной артерии крыс, подвергавшихся антиортостатическому вывешиванию. Авторам удалось показать, что моделируемая микрогравитация вызывала воспалительную активацию ЭК сонной артерии крыс, что характеризовалось увеличением экспрессии генов и синтеза белка индуцибельных молекул адгезии Е-селектина и VCAM-1 (Liu, Wang, Yue et al., 2014). Различия в результатах экспериментальных исследований эффектов микрогравитации можно объяснить временной динамикой экспрессии Е-селектина. Дело в том, что в условиях in vitro экспрессия Е-селектина на поверхности ЭК достигает своего пика через 4 часа после стимуляции TNF-α и возвращается к своему базальному уровню к 24 часам (Bevilacqua, Pober, Mendrick et al., 1987; Leeuwenberg, Jeunhomme, Buurman 1989). Кроме того, растворимая форма данного рецептора достигает максимальной концентрации к 9 часам после провоспалительной активации и резко снижается к 24 часам (Leeuwenberg, Smeets, Neefjes et al., 1992). Что касается исследований in vivo, то было показано, что в данных условиях уровень экспрессии Е-селектина может сохраняться на протяжении 24 часов (Cotran, Gimbrone, Bevilacqua et al., 1986; Munro, Pober, Cotran 1989). Следовательно, существуют факторы, которые могут определять продолжительность экспрессии Е-селектина и, вполне возможно, действовать они могут в зависимости от индивидуальных особенностей донора. Именно поэтому, данные, касающиеся влияния микрогравитации на экспрессию Е-селектина в ЭК остаются весьма противоречивыми и не позволяют в настоящий момент понять роль данного рецептора в восприятии условий измененной гравитации. Другой молекулой, экспрессия которой зависит от провоспалительной активации, обнаруженной на эндотелии пупочной вены человека, является VCAM-1 (Osborn, Hession, Tizard et al., 1989; Carlos, Schwartz, Kovach et.al., 1990). Основная функция данного рецептора заключается в связывании VLA-4 на поверхности лейкоцитов, что обеспечивает роллинг лейкоцита по поверхности активированных ЭК (Alon, Kassner, Carr et al., 1995). 110 Кроме того, показано, что в условиях физиологического «напряжения сдвига», наблюдалась прочная адгезия лейкоцитов, в то время как без потока адгезия была более слабой. Серьезной поддержкой данного наблюдения, было открытие семейства ERM белков (эзрин, радиксин и моэзин), играющих роль проводника между молекулами адгезии и актиновым цитоскелетом (Heiska, Alfthan, Gronholm et al., 1998). Кроме этого, они играют ключевую роль в формировании выпячиваемых мембранных структур, таких как филоподии, микрошипы, или микроворсинки (Mangeat, Roy, Martin, 1999). Предполагалось, что ERM белки связаны лишь с ICAM-1, так как именно эта молекула играет ключевую роль в транэндотелиальной миграции лейкоцитов (Heiska, Alfthan, Gronholm et al., 1998). Однако, позднее удалось показать, что моэзин и эзрин взаимодействуют с VCAM-1 в процессе адгезии лейкоцитов к поверхности активированных ЭК (Barreiro, Yanez-Mo, Serrador et al., 2002). Эти данные стали первым шагом к осознанию возможного участия VCAM-1 в механочувствительности. Затем было показано, что наряду с Е-селектином, связывание VCAM-1 со своим лигандом способствует фосфорилированию ERK1/2, FAK и паксиллина (Cuvelier, Paul, Shariat et al., 2005). В частности, уровень фосфо-ERK2 увеличивался в 2 раза больше при связывании VCAM-1, чем при связывании Е-селектина. В данной работе хорошо показано, что в передаче сигнала от VCAM-1 внутрь клетки участвует актиновый цитоскелет. Опираясь на данные, доказывающие чувствительность ЭК к гравитационному стимулу (Романов, Кабаева, Буравкова 2000), можно предположить, что VCAM-1, также как и Е-селектин, может рассматриваться в качестве гравичувствительного рецептора. К настоящему времени накопилось не так много данных, подтверждающих влияние микрогравитации на экспрессию VCAM-1 и они весьма противоречивы. Как отмечено выше, коллективом нашей лаборатории был опубликован ряд работ, в которых изучалось действие измененной силы тяжести на экспрессию Е-селектина, VCAM-1 и ICAM-1. После 12-24 ч 2-D-клиностатирования, как и в контрольных образцах, экспрессии VCAM1 не наблюдалось. В то же время, моделируемая микрогравитация снижала TNF-αиндуцированную экспрессию этого рецептора (Romanov, Buravkova, Rikova et al., 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005). Увеличение длительности клиностатирования до 7 дней и применение другого прибора для моделирования микрогравитации (RPM), также не выявили изменений уровня sVCAM-1 в среде культивирования (Grimm, Bauer, Ulbrich et al., 2010). Более того, даже реальный 12-дневный космический полет не выявил изменений уровня sVCAM-1 (Muid, Froemming, Manaf et al., 2010). Интересно отметить, что, несмотря на отсутствие изменений в уровнях белка в последних двух работах 111 отмечалось увеличение экспрессии гена VCAM1. Следовательно, уровень sVCAM-1 в среде культивирования не совпадает с экспрессией гена этой молекулы. В других работах, наоборот, показано, что микрогравитация снижает экспрессию VCAM-1. Так, Grenon и соавт. показали снижение доли CD106+-клеток в популяции после 24 и 48 ч культивирования на RPM (Grenon, Jeanne, Aguado-Zuniga et al., 2013). Кроме того, авторы показали, что экспрессия гена VCAM1 так же снижается за те же временные промежутки. Эти данные отличаются от всех приведенных ранее. Одно из объяснений этих отличий уже приводилось выше - это использование поздних пассажей HUVEC. Кроме того, в описании работы не говорится о провоспалительной активации изучаемых клеток, однако в результатах четко видно, что в контрольных образцах после суток культивирования присутствует 40% клеток, несущих на своей поверхности VCAM-1. После 48 ч культивирования в статических условиях уже практически все клетки экспрессируют данный рецептор на своей поверхности. Следовательно, в работе использовались пред-активированные, а не интактные клетки (Carlos, Schwartz, Kovach et al., 1990). Существует также третья точка зрения на экспрессию VCAM-1 в условиях микрогравитации. Результаты антиортостатического вывешивания крыс, в течение 3 недель, показали увеличение экспрессии данного рецептора на поверхности эндотелия, выстилающего мозговые и общие сонные артерии (Zhang, Jia, Bao et al., 2008). Эти данные нашли подтверждение в недавнем исследовании Liu и соавт. В этой работе увеличение экспрессии белка VCAM-1 подтверждалось увеличением экспрессии его гена в общей сонной артерии крыс после 4-х недель антиортостатического вывешивания (Liu, Wang, Yue et al., 2014). То есть, в условиях in vivo моделирование эффектов микрогравитации приводит к увеличению экспрессии VCAM-1 как на транскрипционном уровне, так и на уровне рецептора. Результаты, представленные в нашей работе, согласуются с ранее полученными данными коллектива нашей лаборатории (Romanov, Buravkova, Rikova et al., 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005) и зарубежных коллег (Grenon, Jeanne, AguadoZuniga et al., 2013) относительно экспрессии VCAM-1 на поверхности интактных ЭК в условиях моделируемой микрогравитации. Нами показано отсутствие изменений экспрессии данного рецептора в условиях 3D-клиностатирования, как на уровне белка, так и на уровне гена. Важно отметить, что в отличие от исследования Grenon и соавт., контрольные образцы характеризовались крайне низкой долей CD106+-клеток, что согласуется с общепринятой точкой зрения (Osborn, Hession, Tizard et al., 1989; Carlos, Schwartz, Kovach et al., 1990). В нашей работе не было выявлено изменения экспрессии 112 VCAM-1 на поверхности TNF-α-индуцированных ЭК в условиях моделируемой микрогравитации, что противоречит более ранним данным коллектива нашей лаборатории. Однако, проанализировав результаты экспрессии гена VCAM1, можно попытаться объяснить это противоречие. Мы показали, что ЭК могут отвечать на индукцию TNF-α разной степенью увеличения экспрессии VCAM1, зависящей, повидимому, от индивидуальных особенностей донора. В свою очередь, моделируемая микрогравитация потенцирует «низкоэкспрессирующую» группу эффект и, провоспалительной наоборот, снижает индукции данный эффект на у «высокоэкспрессирующей». В связи с этим, в работах Буравковой и соавторов могли быть использованы «высокоэкспрессирующие» ЭК, совместная TNF-α-индукция и клиностатирование которых приводило к снижению экспрессии гена и измеряемой экспрессии самого рецептора. Сравнивать наши результаты с данными, полученными с использованием моделей in vivo (Zhang, Jia, Bao et al., 2008; Liu, Wang, Yue et al., 2014) весьма затруднительно, так как при использовании последних необходимо учитывать физиологию всего организма животного. В указанных работах, показано увеличение экспрессии VCAM-1 в мозговых и сонных артериях, тогда как целевой в модели антиортостатического вывешивания является бедренная артерия. В этой артерии изменений экспрессии VCAM-1 обнаружено не было. Что указывает на прямую зависимость экспрессии изучаемого рецептора от величины кровотока (Roer, Dillaman, 1985). Таким образом, суммируя результаты приведенных работ можно сделать вывод, что моделируемая микрогравитация сама по себе не является воспалительным стимулом и не вызывает экспрессию индуцибельных молекул на поверхности ЭК. Начиная анализ третьей молекулы клеточной адгезии, необходимо отметить, что ICAM-1 является весьма мобильным антигеном, так как уровень его экспрессии на клеточной поверхности повышается уже через 4 - 6 ч после провоспалительной индукции (Leeuwenberg, Smeets, Neefjes et al., 1992; Фрейдлин 2006). Кроме того, было показано, что экспрессия данного рецептора зависит от функционального статуса клеток на ранних и более поздних пассажах ММСК (Гершович, Гершович, Буравкова, 2009). Наряду с мобильностью экспрессии ICAM-1 было известно, что первичные культуры ЭК обладают выраженной морфологической гетерогенностью в зависимости от своего тканевого происхождения (Ribatti, Nico, Vacca et al., 2002). Однако, недавние исследования показали, что эндотелий, полученный от разных доноров, может различаться по функциональной активности, в частности, по уровню синтезируемых цитокинов (Склянкина, Болдырева, Щегловитова, 2011). В нашем исследовании удалось показать 113 достоверное (p = 0,019) различие первичных ЭК, полученных от разных доноров и по уровню экспрессии ICAM-1 (рис. 16). Зная о том, что связывание ICAM-1 с лигандом вызывает активацию сигнального пути, опопсредующего активацию тирозинкиназы p60Src с последующим фосфорилированием ассоциированных с актиновым цитоскелетом белков: кортактином (Durieu-Trautmann, Chaverot, Cazaubon et al., 1994), киназы фокальной адгезии и паксиллином (Etienne-Manneville, Manneville, Adamson et al., 2000), можно предположить, что ответы ЭК от разных доноров на механические стимулы будут различны. Интересно отметить, что увеличение уровня внутриклеточного кальция характерно не только для связывания E-селектина и VCAM-1 (Cuvelier, Paul, Shariat et al., 2005), но и для молекулы ICAM-1 (Etienne-Manneville, Manneville, Adamson et al., 2000), что говорит об общности пути внутриклеточного каскада, запускаемого этими молекулами. Единой точки зрения на то, каким образом микрогравитация влияет на экспрессию ICAM-1, как и для молекул, описанных выше, не существует. Целый ряд работ с использованием in vitro моделей, поддерживает мнение об увеличении экспрессии ICAM1 на поверхности ЭК в условиях микрогравитации (Romanov, Buravkova, Rikova et al., 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005; Muid, Froemming, Manaf et al., 2010). Наши данные частично подтверждают эти результаты. Нами было показано, что 24-часовая экспозиция на RPM вызывает увеличение экспрессии гена и белка ICAM-1 на поверхности ЭК 2-ой группы (рис. 17 а, 18). Стоит напомнить, что именно эта группа клеток имела низкий базальный уровень экспрессии данного рецептора в нормальных физиологических условиях (Dustin, Springer, 1988). Тогда, как ЭК с изначально высоким базальным уровнем экспрессии отреагировали на 3D-клиностатирование иначе. В 1-ой группе ЭК, моделируемая микрогравитация снижала экспрессию гена и белка ICAM-1 (рис. 17 а, 18). В связи с этим, можно предположить, что предактивированные ЭК отвечают на микрогравитацию снижением экспрессии данного рецептора. Эти результаты косвенно подтверждают данные Grenon и соавторов, в которых контрольные значения доли CD54+-клеток в среднем составляли 80% от всей популяции после 24 ч культивирования (Grenon, Jeanne, Aguado-Zuniga et al., 2013). Так как в нашей работе за то же время культивирования в контрольных образцах 1-ой группы насчитывалось примерно 60% CD54+-клеток, то можно предположить, что Grenon и соавторы использовали предактивированные ЭК. Полученные в нашей работе данные относительно совместного действия моделируемой микрогравитации и активации TNF-α на экспрессию ICAM-1 ЭК, подтвердили более ранние результаты Буравковой и соавт. (Romanov, Buravkova, Rikova et 114 al., 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005). Результаты анализа экспрессии гена ICAM1 и интенсивности флуоресценции этого рецептора полностью совпали. Оказалось, что моделируемая микрогравитация потенцирует эффект провоспалительной активации, вызывая увеличение анализируемых параметров в ЭК, имеющих изначально низкий уровень базальной экспрессии ICAM-1. В то же время, 3D-клиностатирование TNF-αактивированных клеток 1-ой группы, оставляет анализируемые параметры без изменений относительно TNF-α-активированных клеток той же группы, находящихся в статических условиях. Кроме исследований, проведенных на культивируемых ЭК, есть работы, в которых изучение экспрессии ICAM-1 в условиях микрогравитации проводилось in vivo. Так, 7дневное ортостатическое вывешивание увеличивало экспрессию этой молекулы на поверхности ЭК, выстилающих сонную артерию и грудную аорту (Jung, Chung, Lee et al., 2005). Противоположные результаты были получены при исследовании сыворотки крови 22 космонавтов после 10-дневного космического полета (Mills, Perez, Adler et al., 2002). Уровень sICAM после космического полета снижался по сравнению с предполетными образцами сыворотки. Таким образом, суммируя результаты представленных работ, следует отметить, что на клеточном уровне микрогравитация способствует увеличению экспрессии ICAM-1 интактных и TNF-α-активированных ЭК. Для остальных молекул клеточной адгезии VCAM-1 и Е-селектина подобные выводы сделать, пока, не удается. 3.3.2. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на экспрессию VE-кадгерина адгезионных контактов эндотелиальных клеток Эндотелиальные клетки представляют собой особый случай с точки зрения регулирования межклеточной адгезии. С одной стороны, целостность межклеточной адгезии эндотелиального монослоя должна поддерживаться на уровне, способном осуществлять барьерную функцию, необходимую для регуляции обмена растворов и жидкостей между кровью и тканями. С другой стороны, межклеточная адгезия должна быть достаточно пластична, чтобы позволить прохождение лейкоцитов, а также рост и развитие кровеносных сосудов. Главным регулятором свойств адгезивных контактов ЭК являются молекулы VE-кадгерина (CD144) (Lampugnani, Resnati, Raiteri et al., 1992), которые создают структуры, наподобие застежки-молнии (Shapiro, Fannon, Kwong et al., 1995). Через адаптерные молекулы VE-кадгерин связан с актиновым цитоскелетом ЭК (Weis, Nelson, 2006), который, как уже отмечалось, обладает механочувствительностью, что представляет наибольший интерес с точки зрения гравитационной биологии. 115 Для того, чтобы определить, как микрогравитация влияет на целостность эндотелиального монослоя, а также для того, чтобы соотнести изменения структуры цитоскелета с экспрессией молекулы VE-кадгерина, мы использовали метод проточной цитофлуориметрии и иммуноцитохимического окрашивания после 24-часовой экспозиции интактных и TNF-α-активированных ЭК на RPM. Поскольку в серии исследований экспрессии VE-кадгерина были использованы те же первичные ЭК, что и при определении уровней экспрессии молекул клеточной адгезии, для анализа этих данных мы применили ранее принятое разделение на группы. Так, интактные ЭК 1-ой группы несли на своей поверхности нативную форму молекулы VEкадгерина, с которой происходило связывание специфических антител, в результате чего доля CD144+ - клеток составляла около 78,8% (рис. 19). Контрольные образцы 2-ой группы, напротив характеризовались достоверно более низким содержанием CD144+-ЭК (41,2%, р = 0,0223) (рис. 19). После 24 часов инкубации с провоспалительным цитокином TNF-α, не было выявлено изменения доли CD144+-клеток в обеих группах клеток, различия между группами оставались достоверными (р = 0,0202) (рис. 19). Экспозиция ЭК 1-ой группы на RPM в течение 24 часов не вызывала изменения доли CD144+-клеток (рис. 19), однако наблюдалась некоторая тенденция к снижению этого показателя в отдельных экспериментах. Кроме того, кажущееся на первый взгляд, снижение доли CD144+-ЭК, вызванное 3D-клиностатированием TNF-α-активированных клеток этой группы, оказалось не достоверным (60,9 %, р = 0,3946) (рис. 19). Во 2-ой группе первичных ЭК, 24-часовая экспозиция на RPM, напротив, приводила к достоверному увеличению CD144+-клеток (72,2%, р = 0,0202), по сравнению с контрольными образцами (рис. 19). Интересно также отметить, что количество TNF-αактивированных CD144+-клеток, экспонированных на RPM, не отличалось как от нативных ЭК, находящихся в этих условиях (p = 0,7728, так и от TNF-α-активированных клеток, находящихся в статических условиях (р = 0,0814) (рис. 19). 116 Рис. 19. Экспрессия VE-кадгерина на поверхности ЭК после 24 ч культивирования в условиях провоспалительной активации TNF-α (2 нг/мл), моделируемой микрогравитации и их совместном действии; данные представлены mean ± SD, достоверные отличия: # - p < 0,05 - между группами; * - р < 0,05 - от статического контроля. Кроме измерения доли CD144+-клеток, мы также проводили иммуноцитохимические исследования для изучения влияния моделируемой микрогравитации на экспрессию VEкадгерина интактных клеток. Было показано, что в контрольных образцах, находящихся на стадии предконфлюэнтного монослоя, интенсивность флуоресценции VE-кадгерина была наиболее высокой в области межклеточных контактов и в местах фокальной адгезии (показано стрелкой) (рис. 20 а). После экспозиции предконфлюэнтных образцов ЭК на RPM наблюдалось некоторое снижение интенсивности флуоресценции в области наиболее плотно прилегающих клеток (рис. 20 б). Стоит отметить, что в отдельных экспериментах, с использованием образцов клеток 1-ой группы, иммуноцитохимический анализ показал, что в культуре, достигшей состояния плотного монослоя, паттерн экспрессии VE-кадгерина был равномерно распределен по всему периметру каждой клетки (рис. 20 в). Однако, моделируемая микрогравитация (24 ч) приводила к снижению флуоресценции VE-кадгерина в ЭК этой группы, и, в состоянии плотного монослоя, вызывала формирование межклеточных «разрывов» (показано стрелками) (рис. 20 г), что подтверждает низкую долю CD144+-ЭК первой группы после 3D-клиностатирования, в отдельных экспериментах (рис. 19). 117 Рис. 20. Экспрессия VE-кадгерина в норме (а, в) и после 6- (б) и 24-часовой (г) экспозиции на RPM. Представлены данные непрямого иммуно цитохимического флуоресцентного окрашивания молекул VE-кадгерина (а, б) (конфокальная микроскопия) и непрямого иммуноцитохимического окрашивания с использованием набора DAB Peroxidase kit (в, г) (световая микроскопия). Масштабный отрезок 50 мкм. Таким образом, полученные с помощью проточной цитометрии данные говорят о том, что на экспрессию VE-кадгерина в ЭК не оказывает влияния провоспалительная активация, а моделируемая микрогравитация вызывает разнонаправленные эффекты в зависимости от индивидуальных особенностей донора. При этом, экспозиция на RPM вызывает снижение экспрессии VE-кадгерина и нарушение целостности эндотелиального монослоя (появление «разрывов» клеточных контактов) в некоторых экспериментах, с использованием 1-ой группы ЭК. 118 Статический контроль RPM+TNF-α (24 ч) б Уровень экспрессии CDH5 Уровень экспрессии CDH5 а Группа Группа Рис. 21. Уровни экспрессии гена VE-кадгерина (CDH5) в зависимости от клеточной линии в условиях статического контроля (а) и совместного действия провоспалительной индукции и микрогравитации (б), данные представлены median, достоверные отличия с вероятностью 99%. а б Рис. 22. Экспрессия гена VE-кадгерина (CDH5) в ЭК после 24-часового воздействия моделируемой микрогравитации (а), активации TNF-α и их совместном действии (б). Данные представлены как mean ± SE, в относительных единицах по отношению к контролю, принятому за 1 (черная линия). Достоверные отличия: * - р < 0,05 – относительно статического контроля; # - р < 0,05 - между группами ЭК. Следующим этапом изучения влияния микрогравитации на экспрессию VEкадгерина в ЭК стал анализ экспрессии гена CDH5, кодирующего этот белок. Было показано, что выявленные ранее различия базального уровня экспрессии молекулы VEкадгерина, между двумя группами ЭК, подтвердились и на уровне транскрипции гена. Так, ЭК 1-ой группы характеризовались достоверно более высоким уровнем экспрессии CDH5 (р = 0,00001) (рис. 21 а). Кроме того, ни одно из изучаемых в работе воздействий не вызывало значительных изменений экспрессии гена CDH5 в клетках 1-ой группы (рис. 22 а, б). Эти данные полностью подтверждают отсутствие изменений доли CD144+-ЭК этой 119 группы (рис. 19). Во 2-ой группе клеток 24-часовая экспозиция на RPM вызывала более чем двукратное увеличение экспрессии CDH5 (р = 0,0345) (рис. 22 а). Однако, инкубация ЭК этой же группы с TNF-α длительностью 24 ч, также вызывала достоверное увеличение экспрессии гена (р = 0,015), кодирующего VE-кадгерин, причем во столько же раз, что и после 3D-клиностатирования (рис. 22 б). В связи с этим было крайне интересно проанализировать совместное действие этих факторов. При экспозиции на RPM TNF-αактивированных клеток 2-ой группы не удалось обнаружить отличий экспрессии CDH5 как относительно TNF-α-активированных клеток, находящихся в статических условиях, так и относительно 3D-клиностатируемых интактных ЭК (рис. 21 в). Сохранялась лишь небольшая тенденция к увеличению экспрессии гена и белка VE-кадгерина при совместном действии этих двух факторов. Следует отметить, что как бы сильно не увеличивалась экспрессия CDH5 в ЭК 2-ой группы, она все равно остается достоверно ниже (р = 0,025) экспрессии этого гена в ЭК 1-ой группы (рис. 21 б). В связи с этим, можно предположить, что клетки 1-ой группы находились в предактивированном состоянии и слабо реагировали на действие изучаемых в нашей работе факторов, в то время как клетки 2-ой группы адекватно отвечали на воздействие микрогравитации и провоспалительной активации. Найти объяснение отсутствию эффектов в ЭК 1-ой группы можно в работе Nwariaku и соавторов, которые предположили, что увеличение проницаемости эндотелиального монослоя при провоспалительной активации вызвано не столько изменением экспрессии VE-кадгерина, сколько образованием специфических «разрывов» межклеточных соединений из-за TNFa-опосредованного фосфорилирования этого гликопротеина (Nwariaku, Liu, Zhu et al., 2002). Кроме того, в недавней работе было показано, что в TNFактивированных HUVEC, не происходит ни снижения экспрессии гена VE-кадгерина, ни снижения уровня белка, кодируемого этим геном. Авторы постулировали, что при TNF-αопосредованном фосфорилировании VE-кадгерина происходит релокализация молекул этого белка на уровне межклеточных контактов, стимулируя изменения проницаемости (Seynhaeve, Rens, Schipper et al., 2014). В своей работе, Seynhaeve и соавторы использовали TNF-α в концентрации 1 мкг/мл, в то время как в нашей работе концентрация данного цитокина была в 500 раз ниже (2 нг/мл). В связи с этим, проводимая нами провоспалительная индукция клеток 1-ой группы не оказала видимого эффекта, так как уровень их активации, очевидно, изначально был более высоким и не сопровождался изменением экспрессии гена CDH5 и доли CD144+- клеток. Тогда как во 2-ой группе интактных клеток наблюдался выраженный ответ на предъявление данного стимула. 120 Фосфорилирование VE-кадгерина происходит не только в условиях провоспалительной активации, как описывалось ранее, но и в нормальных условиях под действием гемодинамических сил. Более того, фосфорилирование VE-кадгерина по тирозину в положениях 658 и 685 происходит в условиях in vivo именно в венах, но не в артериях. Этот факт объясняется тем, что напряжения сдвига определенного значения (в венах равно 0,8–8 дин/см2) модулирует активность Src-киназы в адгезивных контактах ЭК (Orsenigo, Giampietro, Ferrari et al., 2012). Так как в нашей работе были использованы ЭК из пупочной вены человека, то регулирование фосфорилирования тирозина VE-кадгерина в них, также может происходить с помощью активации Src-киназы. Кроме того, доля СD144+-клеток в первичной культуре ЭК 2-ой группы составляла 41,2%, что подтверждает наше предположение. Кроме того, недавние исследования показали, что высокая степень фосфорилирования тирозина VE-кадгерина, в результате активности конститутивной Srcкиназы, воздействует на организацию цитоскелета в ЭК микрососудов кожи человека (Adam, Sharenko, Pumiglia et al., 2010). При этом наблюдалось образование толстых пучков актина, что поддерживает гипотезу о пути механотрансдукции , опосредованного через фосфорилирование VE-кадгерина и передачи сигнала ( через активацию Src-киназы) на актомиозиновый комплекс. При этом блокирование передачи сигнала от VE-кадгерина к его адаптерным белкам может привести к ремоделированию актинового цитоскелета (Gulino-Debrac 2013). Полученные нами данные, свидетельствующие о влиянии моделируемой микрогравитации на распределение и экспрессию VE-кадгерина, также находят подтверждение в литературе. Так, с помощью наномеханических измерений, было доказано, что кадгериновые комплексы ассоциированы с F-актином и способны функционировать как механосенсоры (Ganz, Lambert, Saez et al., 2006; Le Duc, Shi, Blonk et al., 2010). Было показано, что в эндотелиальных клетках, «напряжение сдвига», запускает множество каскадов, опосредуемых активацией не только Src-киназы, но и ERK (внеклеточной регулируемой киназы), JNK, AKT (v-akt гомолога вирусного онкогена тимомы мыши) и VEGFR2 (рецептора к фактору роста эндотелия сосудов - 2), с последующей индукцией ядерного транскрипционного фактора NF-κB (Davies 1997). Кроме того, удалось определить, что направление сигнального пути «напряжения сдвига» идет от апикальной поверхности эндотелиальных клеток, через цитоскелет к сайтам адгезии: клетка-соединительный матрикс и клетка-клетка, и обеспечивается механосенсорным комплексом, состоящим из PECAM-1, VE-кадгерина и VEGFR2, которые представляют собой эндотелий-специфичные элементы механотрансдукции, 121 необходимые для опосредованной PI3K-активации интегринов и выравниванию эндотелиальных клеток в соответствии с направлением потока (Tzima, Irani-Tehrani, Kiosses et al., 2005). Суммируя результаты приведенных работ, следует отметить, что полученные нами данные свидетельствуют о возможной взаимосвязи изменений в архитектуре актинового цитоскелета, распределением VE-кадгерина в мембране клеток и уровнем экспрессии гена CDH5, под влиянием моделируемой микрогравитации. Кроме того, можно предположить, что в условиях микрогравитации происходит изменение значений напряжения сдвига, что и приводит к ремоделированию цитоскелета и перераспределению VE-кадгерина в ЭК человека. 3.4. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на секрецию цитокинов эндотелиальными клетками Помимо обеспечения инициации иммунного ответа, путем рекрутирования и трансмиграции лейкоцитов к очагу инфекции, ЭК способны к презентации антигенов (Rose 1998) и активно участвуют в клеточном и гуморальном иммунном ответе (Biedermann 2001). Синтезируемые при этом цитокины и хемокины выполняют функцию межклеточных медиаторов, регулирующих афинность рецепторов, активацию и дифференцировку мононуклеаров крови (Фрейдлин 2006). Как правило, в интактных ЭК присутствуют только мРНК цитокинов, тогда как секреции их белков не обнаруживалось. Сигналом для запуска секреции эндотелиальных цитокинов является связывание рецепторов ЭК с ранними медиаторами воспаления IL-1, TNF-α и IFN-γ, которые синтезируются макрофагами (Cines, Pollak, Buck et al., 1998). Механизмы и временная динамика данных процессов хорошо изучены в нормальных условиях, однако, нельзя исключать, что в условиях микрогравитации они могут быть изменены. Чтобы оценить уровень провоспалительных цитокинов, секретируемых ЭК, был проведен мультиплексный иммуноферментный анализ кондиционированной среды ЭК. Скрининг показал, что уровни секреции большинства цитокинов были либо очень низкими, либо они совсем не детектировались (IL-1, IL-12p70, TNF-β, IFN-γ) (табл. 5). Провоспалительная активация ЭК при 24-часовой инкубации с TNF-α увеличивала секрецию IL-4, IL-6, IL-8. За тот же промежуток времени моделируемая микрогравитация приводила к уменьшению синтеза IL-2, увеличивала IL-4 и не влияла на уровень остальных исследуемых цитокинов (табл. 5). В кондиционированной среде TNF-αактивированных клеток, экспонированных на RPM, наблюдалось увеличение уровня всех детектируемых цитокинов и усиление эффекта, наблюдаемого в активированных клетках, 122 находящихся в стандартных условиях. Для более глубокого анализа были выбраны 2 цитокина: IL-6 и IL-8. Их уровень в среде культивирования в дальнейшем измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. В данной серии исследований уровня секреции цитокинов были использованы те же первичные клеточные линии, что и при определении уровня экспрессии молекул клеточной адгезии. Содержание IL-8 в кондиционированной среде культивируемых ЭК, оказалось довольно высоким, и позволяло увидеть разницу между изучаемыми группами (1 группа – 1095±173 пг/мл, 2 группа – 345±127 пг/мл; р = 0,01298). По исходному уровню секреции IL-6 после 24 часов культивирования различий между изучаемыми группами практически не наблюдалось (р = 0,18289) из-за невысоких значений концентрации данного цитокина: в 1-ой группе он составлял около 55±9 пг/мл, а во 2-ой – 36±7 пг/мл. Таблица 5. Концентрация цитокинов (пг/мл) в кондиционированной среде ЭК после 24 часов культивирования в стандартных условиях, при активации TNF-α, при моделировании микрогравитации и сочетании активации TNF-α и микрогравитации (данные репрезентативного эксперимента). Исследуемый цитокин Чувствительность Статический контроль TNF-α 2 нг/мл RPM RPM + TNF-α 2 нг/мл ИЛ-2 6,4 48 41 29 72 ИЛ-4 4,2 7 20 17 9 ИЛ-5 1,6 29 0 34 40 ИЛ-6 1,2 0 37 0 67 ИЛ-8 0,5 145 1448 149 1608 ИЛ-10 1,9 14 16 15 16 ФНО-альфа 3,2 0 246 0 274 Провоспалительная активация ЭК TNF-α приводила к повышению секреции IL-8 в разной степени. В кондиционированной среде 1-ой группы концентрация этого цитокина была в 3,2 раза выше контрольных значений (p = 0,00000009), тогда как в среде культивирования 2-ой группы клеток содержание этого цитокина увеличивалось в 12,6 разa (p = 0,000125) (рис. 23 а). Моделирование эффектов микрогравитации в течение 24 часов практически не влияло на синтез IL-8 в обеих группах, содержание которого оставалось на уровне контрольных значений. В клетках 1-ой группы моделируемая микрогравитация не отменяла эффект провоспалительной активации TNF-α, оставляя уровень секреции IL-8 выше контрольных значений (р = 0,00000012). Во 2-ой группе, 123 наблюдалась тенденция к увеличению секреции IL-8 активированными клетками, экспонированными на RPM, по отношению к TNF-α-активированным ЭК, находившимся в статических условиях. Однако достоверного отличия выявить не удалось (р = 0,333883). Стоит отметить, что моделируемая микрогравитация не изменяла уровень секреции IL-8: наблюдаемая разница между двумя группами после индукции TNF-α сохранялась (p = 0,000050) (рис. 23 а). Рис. 23. Уровень секреции IL-8 (а) и IL-6 (б) в ЭК после 24 часов культивирования в стандартных условиях, при добавлении TNF-α (2 нг/мл), моделировании эффектов микрогравитации и их сочетанном действии. Данные представлены в условных единицах по отношению к контрольным значениям, принятым за 1, M±SE. Достоверные отличия: * р ≤ 0,01 от статического контроля; # - р ≤ 0,01 - между группами. Схожие закономерности наблюдались и для секреции IL-6. В кондиционированной среде TNF-α-активированных клеток отмечалось увеличение содержания IL-6 в 2,9 раза (р = 0,000043) в 1-ой группе и в 7,1 раза (р = 0,000495) во 2-ой группе, относительно 124 контрольных значений (рис. 23 б). Интересно, что ЭК 2-ой группы отвечали на провоспалительную активацию значительно сильнее (р = 0,000673), хотя базальный уровень секреции IL-6 был практически не различим. Моделируемая микрогравитация не влияла на уровень секреции данного цитокина в обеих группах, сохраняя значения на уровне контроля. 24 часовая экспозиция на RPM совместно с провоспалительной активацией приводила к увеличению секреции IL-6, по отношению к интактным клеткам (р = 0,0000001; р = 0,000088 для 1-ой и 2-ой группы соответственно), но не отличалась (р ≈ 0,3 для обеих групп) от уровня, детектируемого в TNF-α-активированных клетках обеих групп (рис. 23 б). Рис. 24. Относительный уровень экспрессии генов IL8 (а) и IL6 (в) в ЭК после 24часового воздействия моделируемой микрогравитации, активации TNF-α и их совместном действии (б и г, соответственно). Данные представлены как М±SE, в относительных единицах по отношению к контролю, принятому за 1 (черная линия). Достоверные отличия: * - р ≤ 0,05 – по отношению к статическому контролю; # - р≤ 0,05 - между группами; ** - р≤ 0,01 – внутри одной группы. Обнаружив изменения уровня секреции провоспалительных цитокинов ЭК в ответ на изучаемые воздействия, мы провели исследование влияния провоспалительной активации и моделируемой микрогравитации на экспрессию генов IL8 и IL6. В качестве 125 предмета исследования были использованы те же первичные клеточные линии, что и при определении уровней секреции IL-8 и IL-6 в среде культивирования. Результаты показали, что 24-часовая инкубация с TNF-α вызывала резкое увеличение экспрессии генов IL8 и IL6, причем изменения были однонаправленны для обеих клеточных линий (рис 24 а, б). Под действием провоспалительной активации экспрессия гена IL8 в 1-ой группе увеличилась в 12,8 раза (р = 0,00014), тогда как во 2-ой – в 59,6 раза (р = 0,00017). Отмеченный провоспалительный эффект TNF-α на экспрессию гена IL6 был менее выражен, чем для IL8. В 1-ой группе наблюдалось лишь незначительное достоверное увеличение уровня мРНК IL6 (1,5 раза, р = 0,00001), тогда как во 2-ой группе наблюдалось пятикратное увеличение данного показателя (р = 0,0453) по сравнению с интактными клетками (рис. 24 г). Эти данные согласуются с наблюдаемым нами увеличением содержания IL-6 и IL-8 в кондиционированной среде ЭК в условиях провоспалительной активации (рис. 16 а, б), а также согласуются с результатами других работ (Vanden Berghe, Vermeulen, De Wilde et al., 2000; Фрейдлин, Шейкин 2001; Zhao, Chen, Yao et al., 2005; Склянкина, Болдырева, Щегловитова, 2011). 24-часовая экспозиция на RPM достоверно не изменяла экспрессию гена IL8 (р = 0,2549 для 1-ой группы, р = 0,141 для 2-ой группы) и незначительно снижала экспрессию гена IL6 (р = 0,0013) во 2-ой группе ЭК (рис. 24 а, в). Однако, выбранный нами уровень значимости изменения экспрессии генов (более чем в 2 раза), позволяет нам заключить, что микрогравитация не изменяет экспрессии генов исследуемых цитокинов. Экспозиция на RPM той же длительности TNF-α-активированных ЭК не отменяла эффектов провоспалительной активации на транскрипцию изучаемых генов, а экспрессия IL8 в 1-ой группе оставалась на уровне (р = 0,292) TNF-α-индуцированных клеток, находящихся в условиях статического контроля (рис. 24 б). В то же время совместное действие моделируемой микрогравитации и провоспалительной активации вызывало трехкратное увеличение уровня мРНК IL8 во 2-ой группе клеток (р = 0,000431) по отношению к TNFα-индуцированным образцам (рис. 24 б). При анализе экспрессии IL6 в TNF-αиндуцированных ЭК обеих групп, находящихся в условиях экспозиции на RPM, подобного эффекта отметить не удалось. Транскрипция гена IL6 в таких клетках не отличалась TNF-α-активированных ЭК в статических условиях (р = 0,2606 для обеих групп) (рис. 24 г). Интересно отметить, что значения исходного уровня экспрессии генов рассматриваемых цитокинов в разных первичных клеточных линиях значительно не отличались, как это было отмечено для CDH5 (рис. 21). Следовательно, паракринная 126 активность активированных ЭК зависит от индивидуальных особенностей первичных культур. Таким образом, мы показали, что моделируемая микрогравитация не влияет на экспрессию генов и секрецию молекул IL-6 и IL-8 в интактных эндотелиальных клетках. Кроме того, экспозиция на RPM не отменяет TNF-α-инуцированное увеличение экспрессии и секреции данных цитокинов, а в случае с IL-8 даже потенцирует транскрипцию гена этого цитокина. Уровень продукции IL-6 и IL-8, выявленный в среде культивирования эндотелиальных клеток в нашей работе, сравним с уровнем данных цитокинов, описанных в работе Склянкиной и соавторов (Склянкина, Болдырева, Щегловитова, 2011), также установивших различие в функциональной активности ЭК в зависимости от доноров. В своей работе коллектив авторов не объясняет причину описанных различий. Анализ представленного в нашей работе цитокинового профиля, а также экспрессии молекул адгезии и строению актинового цитоскелета, позволяет предположить, что ЭК 1-ой группы находятся в предактивированном состоянии и/или в состоянии повышенной реактивности. Кроме того, исходное функциональное состояние ЭК и уровень секреции цитокинов IL-6, IL-8 находятся в обратной зависимости: чем ниже исходный уровень секреции цитокина, тем больше его увеличение в ответ на провоспалительную активацию, и наоборот. Однако, на уровне транскрипции генов такой четкой зависимости обнаружить не удалось, что вполне можно объяснить наличием посттрансляционных изменений. Из литературных данных известно, что IL-6 представляет собой цитокин с плейотропным действием, который участвует в острой и хронической фазе реакции воспаления (Barton 1997). Ранее было показано участие IL-6 в патогенезе поздней фазы аллергических реакций, васкулитов и атерогенеза (Vanden, Berghe, Vermeulen, De Wilde et al., 2000). Наряду с основными источниками этого цитокина: макрофагами и Тлимфоцитами, транскрипты этого цитокина обнаруживались и в нестимулированных ЭК коронарных артерий. Как отмечалось в более раннем исследовании, провоспалительная активация ЭК TNF-α приводит не только к активации транскрипции гена IL-6, но к его трансляции и секреции (Фрейдлин 2006). Связывание мембранного рецептора с молекулой TNF-α инициирует активацию фактора транскрипции NF-в и нескольких МАРкенафных путей (p38, ERK и c-Jun N-терминальной киназы) (Heyninck, De Valck, Vanden Berghe et al., 1999), что в конечном итоге способствует активации транскрипции промотора гена IL-6 (Beyaert, Cuenda, Vanden Berghe еt al., 1996). Помимо иммунной функции IL-6 является стимулятором пролиферативной активности ЭК, являясь для них аутокринным фактором роста, что способствует прогрессированию сосудистых опухолей 127 (Giraudo, Arese, Toniatti et al., 1996). Кроме того, продукция IL-6 индуцирует экспрессию эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF) - мощного ангиогенного агента (Cohen, Nahari, Cerem et al., 1996). IL-8 также продуцируется ЭК в ответ на воспалительные агенты и является аутокринным фактором роста, который регулирует пролиферацию, жизнеспособность, миграцию и синтез матриксных металлопротеиназ (MMP) в эндотелиальных клетках, что, предположительно, приводит к деградации внеклеточного матрикса, миграции эндотелиальных клеток и образованию сети капилляров in vitro, а также ангиогенезу кровеносных сосудов in vivo (Koch, Polverini, Kunkel et al., 1992; Li, Varney, Valasek et al., 2005). Аутокринное действие данного цитокина обеспечивается благодаря конститутивной экспрессии CXCR1 и CXCR2 на поверхности ЭК (Li, Dubey, Varney et al., 2003). Кроме того, IL-8 играет важную роль в процессах адгезии и трансмиграции лейкоцитов, путем изменения конформации интегринов CD11a/CD18 (Meager 1999; Фрейдлин 2001). Сравнивая полученные нами результаты содержания двух провоспалительных хемокинов (IL-6 и IL-8) в среде культивирования первичных ЭК, с данными, полученными другими исследователями необходимо отметить, что большинство работ указывает на отсутствие провоспалительных эффектов при кратковременном моделировании эффектов микрогравитации (Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003; Mariotti, Maier, 2008; Griffoni, Di Molfetta, Fantozzi et al., 2011). Так, в ЭК, культивируемых в течение 96 ч в условиях биореактора с вращающимися стенками (Rotating Wall Vessel, RWV), наблюдалось ингибирование синтеза IL-1α (Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003). Авторы объяснили данный эффект увеличением уровня белка теплового шока hsp70, который способен ингибировать экспрессию IL-1α (Yokoo, Kitamura, 1997). В нашей работе скрининг цитокинов не выявил изменения уровня секреции этого цитокина в ответ на моделируемую микрогравитацию, потому как его содержание в кондиционированной среде было крайне низким. В другой работе, экспозиция ЭК на RPM в течение 96 ч вызывала снижение не только секреции IL-1α, но и IL-8 (Griffoni, Di Molfetta, Fantozzi et al., 2011). Стоит отметить, что концентрация IL-8 в контрольных образцах была порядка 8000 пг/мл. Подобные значения в нашей работе наблюдались только после активации TNF-α, что говорит о возможном использовании предактивированных ЭК в работе Griffoni и соавторов. А отмечаемое авторами небольшое снижение уровня секреции IL-8, может объясняться временной динамикой его секреции, максимум которой приходится на 24 часа культивирования (Склянкина, Болдырева, Щегловитова, 2011). 128 С другой стороны существует ряд работ, результаты которых говорят о снижении секреции антивоспалительных цитокинов ЭК в условиях микрогравитации. Infanger и сотрудники обнаружили сниженную секрецию провоспалительного цитокина IL-10 в EA.hy926 в условиях экспозиции на RPM, и предположили, что клетки были в состоянии повышенной реактивности (Infanger, Ulbrich, Baatout еt al., 2007). Однако, уровни измеряемых цитокинов находились на нижнем пределе чувствительности метода. Подобные выводы, были сделаны также Ulbrich и соавторами (Ulbrich, Westphal, Baatout et al., 2008), обнаружившими повышенную секрецию провоспалительных IL-6 и IL-8 после культивирования клеток EA.hy926 в течение 24 ч на RPM. Известно, что EA.hy926 конститутивно экспрессируют большое количество дополнительных генов, многие из которых связаны с контролем клеточного цикла и апоптоза. В связи с чем, предлагается тщательно проверять экспрессию генов, которым посвящено то или иное исследование, при использовании EA.hy926 (Boerma, Burton, Wang et al., 2006). Для правильной интерпретации результатов, необходимо учитывать особенности изучаемых культур, особенности оборудования, используемого для моделирования микрогравитации и методов детекции, исследуемых параметров. Полученные нами данные не только подтвердили гипотезу Griffoni и соавторов (Griffoni, Di Molfetta, Fantozzi et al., 2011) о том, что микрогравитация сама по себе не является провоспалительным стимулом для ЭК, и, по крайней мере, не повышает секрецию цитокинов в этих клетках, но при этом и не отменяет TNF-α-индуцированное увеличение секреции этих цитокинов. Однако, моделируемая микрогравитация на фоне провоспалительной активации может способствовать увеличению адгезии и трансмиграции лейкоцитов, тем самым модулируя клеточный иммунитет. Таким образом, наши результаты показали, что моделируемая микрогравитация не увеличивает секрецию и экспрессию гена IL-6 и не нарушает, тем самым, регуляцию острой фазы воспаления. Показанный нами уровень секреции IL-8 в среде культивирования первичной культуры эндотелиальных клеток, после 24 часовой экспозиции на RPM сохранялся как в 1-ой группе, так и во 2-ой. Однако, необходимо отметить, что моделируемая микрогравитация потенцировала TNF-α-индуцированную экспрессию гена IL-8. В совокупности с полученными ранее данными об увеличении экспрессии молекулы ICAM-1 в этих условиях, можно предположить микрогравитация на фоне воспалительной реакции может приводить к усиленной инфильтрации лейкоцитами подлежащих тканей. 129 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изучение влияния невесомости на сердечно-сосудистую систему началось с первого полета человека в космос, однако более широкомасштабные исследования стали возможны начиная с 70-х годов прошлого века. В ходе полетных экспериментов выяснилось, что на первых этапах космического полета у человека происходит перемещение жидкости в краниальном направлении, повышение давления крови в грудной клетке и голове, увеличение венозного возврата и наполнения сердца. Одним из возможных нормального механизмов сердечно-сосудистой функционирования слоя дисфункции эндотелиальных считается клеток, нарушение выстилающего внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Ранее в нашей лаборатории было показано, что культивирование первичных ЭК на 2D-клиностате приводит к ремоделированию актинового цитоскелета и усилению миграционной активности. Кроме того, с помощью иммуноцитохимического окрашивания было показано, что воздействие измененной гравитации модулирует экспрессию молекул ICAM-1, VCAM-1 и Е-селектина на поверхности культивируемых ЭК. Эти исследования были одними из первых, демонстрирующих высокую гравичувствительность эндотелия. Данные исследования были проведены с использованием одного из наиболее современного прибора для моделирования эффектов микрогравитации – RPM. Показано, что, клеточные изменения, вызванные экспозицией на этом приборе сравнимы с результатами космических экспериментов (Villa, Versari, Maier et al., 2005). С помощью представленной наземной модели, мы подтвердили, что моделируемая микрогравитация уже на ранних этапах приводит к реорганизации актинового цитоскелета и сохраняется на протяжении 24 часов. При этом, стресс-фибриллы соседних ЭК связываются между собой в местах контактов интердигитирующих филоподий, образуя «мосты». Одновременно, с образованием «мостов» происходит перераспределение молекул VE-кадгерина, что говорит об увеличении подвижности ЭК и образовании новых адгезионных контактов. На фоне выявленных морфофункциональных изменений в культурах ЭК, экспонированных на RPM в течение 24 ч, наблюдается трехкратное увеличение экспрессии гена структурного белка β-актина (АСТВ), отвечающего за локомоцию. Мы показали, что ремоделирование актинового цитоскелета, сопровождается изменением организации системы микротрубочек. На ранних этапах моделирования эффектов микрогравитации (1 час), происходит полная деполимеризация периферической сети «быстрых» МТ и компактизация стабильных ацетилированных МТ вокруг клеточного ядра. По-видимому, данные изменения в строении МТ приводят к нарушению 130 пролиферации клеток и на более поздних этапах воздействия (24 ч) отмечается резкое увеличение числа двуядерных клеток, образующих кластеры в общей массе одноядерных клеток. Стоит отметить, что инкубация с TNF-α в течение 1 ч, вызывает лишь уменьшение плотности периферической сети МТ. Данный факт говорит о высокой скорости воздействия моделируемой микрогравитации и, возможно, наличии другого механизма действия. Проведенные нами исследования показали, что моделируемая микрогравитация в течение 24 ч не изменяет адгезионные свойства ЭК, характеризующиеся изменением экспрессии некоторых поверхностных маркеров, необходимых как для осуществления межклеточных взаимодействий, так и обеспечения барьерной функции (ICAM-1, VCAM1, Е-селектин, VE-кадгерин). Наряду с этим, экспозиция на RPM не изменяет уровни секреции провоспалительных цитокинов, тем самым, не нарушая регуляцию острой фазы воспаления. Тем не менее, оказалось, что сосудистые эндотелиальные клетки в первичной культуре могут отличаться по базальному и TNF-α-индуцированному уровню экспрессии этих молекул адгезии, ИЛ-6 и ИЛ-8 («предактивированные» и «неактивированные» ЭК). При этом, моделируемая микрогравитация вызывает наиболее выраженный ответ «неактивированных» ЭК, что сопровождается увеличением транскрипции гена и экспрессии молекул ICAM-1 и VE-кадгерина на поверхности клетки. А в условиях провоспалительной активации происходит потенцирование TNF-α-индуцированной экспрессии генов молекул межклеточной адгезии, молекулы адгезивных контактов (ICAM1, VCAM1, CDH5,IL8) и ИЛ-8. Таким образом, увеличение актомиозинового сокращения, вызванного накоплением стресс-фибрилл, и деполимеризация сети МТ уже на ранних этапах моделирования эффектов микрогравитации приводит к нарушению целостности и увеличению проницаемости эндотелиального монослоя, а в условиях провоспалительного микроокружения – к увеличению адгезионных свойств ЭК и усилению инфильтрации подлежащих тканей. В заключение следует отметить, что в условиях реального космического полета наблюдается дисрегуляция системы иммунитета, характеризующаяся увеличением содержания регуляторных цитокинов в плазме крови космонавтов, таких как TNF-α и ИЛ8 (Crucian, Zwart, Mehta et. al., 2014). Поэтому, представленная в работе модель провоспалительной активации эндотелия в условиях моделируемой микрогравитации, позволяет предположить вовлеченность барьерной эндотелиальной дисфункции одним из возможных механизмов десрегуляции сердечно-сосудистой системы в ходе реального космического полета. 131 ВЫВОДЫ 1) Применяемая в работе модель провоспалительной активации эндотелиальных клеток in vitro, моделирование эффектов микрогравитация и совместное действие данных факторов в течение 24 ч не снижает жизнеспособность первичных эндотелиальных клеток из пупочной вены человека. 2) Рандомизация положения культивируемых ЭК относительно вектора гравитации (24 часа) приводит к изменению морфологии и нарушению целостности монослоя интактных эндотелиальных клеток вследствие ремоделирования тубулинового и актинового цитоскелета, которое характеризуется деполимеризацией и изменением ориентации микротрубочек, образованием «звездоподобных» пучков стресс-фибрилл в области межклеточных контактов и увеличением экспрессии гена АСТВ. В TNF-α-активированных и экспонированных на RPM ЭК наблюдаются более выраженные изменения исследуемых компонентов цитоскелета. 3) Культивируемые эндотелиальные клетки не отличаются по исходному уровню экспрессии молекул PECAM-1 и Е-селектина. Экспозиция на RPM не изменяет экспрессию молекулы PECAM-1 на поверхности интактных и TNF-α-активированных клеток. В то же время, после экспериментального воздействия наблюдается тенденция к увеличению экспрессии Е-селектина на поверхности интактных клеток, а доля TNF-α-активированных клеток, несущих данный маркер, достоверно увеличивается. 4) Сосудистые эндотелиальные клетки в первичной культуре могут быть «предактивированными» («высокоэкспрессирующая» группа) и «неактивированными» («низкоэкспрессирующая» группа), отличающимися по базальному и TNF-α- индуцированному уровню экспрессии молекул ICAM-1, VCAM-1 и VE-кадгерина. 5) Моделирование эффектов микрогравитация вызывает увеличение адгезивных свойств эндотелиальных клеток «низкоэкспрессирующей» группы, что сопровождается увеличением транскрипции гена и экспрессии молекул ICAM-1 и VE-кадгерина на поверхности интактных клеток. При этом происходит потенцирование TNF-α-индуцированной экспрессии генов молекул межклеточной адгезии и молекулы адгезивных контактов. 6) в Экспозиция на RPM не вызывает синтеза провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 культивируемых эндотелиальных клетках, не отменяет TNF-α-индуцированную экспрессию генов и секрецию данных цитокинов, однако, в TNF-α-активированных клетках «низкоэкспрессирующей» группы вызывает достоверное увеличение транскрипции IL8. 7) Краткосрочное моделирование эффектов микрогравитации само по себе не является для ЭК провоспалительным стимулом, в отличие от TNF-α. 132 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алиева И.Б. Роль микротрубочек цитоскелета в регуляции барьерной функции эндотелия. // Биохимия. – 2014. – Том. 79. - №9. – С. 1188–1200. 2. Богачева Н.В., Гарсия Дж. Г.Н., Верин А.Д. Молекулярные механизмы индуцированной тромбином проницаемости эндотелия. // Биохимия. – 2002. – Том. 67. - №1. – С. 88–98. 3. Богомолов В.В., Самарин Г.И. Совершенствование системы медицинского обеспечения здоровья и работоспособности экипажей международной космической станции. // Космонавтика и ракетостроение. – 2007. – №4(49). – С. 48–53. 4. Буравкова JI. Б., Мерзликина Н. В., Романов Ю. А. Первичные эффекты, наблюдаемые при клиностатировании культивируемых мезенхимальных стволовых клеток. // Цитология. – 2004. – Том. 46. - №10. – С. 900–901. 5. Буравкова Л.Б., Гершович П.М., Гершович Ю.Г. И др. Механизмы гравитационной чувствительности остеогенных клеток-предшественников. // Acta Naturae. - 2010. - Том. 2. №1 (4). - С. 30-39. 6. Буравкова Л.Б., Мерзликина Н.В. Ремоделирование актинового цитоскелета культивируемых эндотелиальных клеток человека в условиях клиностатирования. // Авиакосм. и эколог. медицина. – 2004. – Том.38. - №6. – С. 56–61. 7. Бураков А.В., Надеждина Е.С. Динеин и динактин как системы клеточных микротрубочек. // Онтогенез. – 2006. – Том. 37. - №5. – С. 1-17. 8. Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д. Медицинские исследования по программе длительных пилотируемых полетов на орбитальном комплексе "Салют-7" "Союз-Т". // Космич. биология и авиакосмич. медицина. - 1990. – Том. 24. - №2. – С. 9–15. 9. Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д. Физиологические эффекты действия невесомости на человека в условиях космического полета. // Физиология человека. – 1997. – Том. 23. - №2. – С. 138–146. 10. Газенко О.Г., Парфенов Г.П. Космическая биология в третьем десятилетии. // Косм. биол. и авиакосм. мед. – 1982. – Том. 16. - №2. – С. 4-12. 11. Гершович П.М., Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б. Цитоскелет и адгезия культивируемых стромальных клеток-предшественников костного мозга человека при моделировании эффектов микрогравитации. // Цитология. – 2009. – Том. 51. - №11. – С. 896-904. 12. Григорьев А.И., Котовская А.Р., Фомина Г.А. Особенности функционирования сердечно-сосудистой системы человека в условиях космического полета. // «Сердечнососудистая патология. Современное состояние проблемы». Сборник трудов. Media Medica. 2009. С. 38–52. 133 13. Григорьев А.И., Оганов В.С., Бакулин А.В. и др. Клинико-физиологическая оценка изменений костной ткани у космонавтов после длительных космических полетов. // Авиакосм. и эколог. медицина. – 1998. – Том. 32. – С. 21-25. 14. Клячко Н.Л. Биологическая подвижность и полимеризация актина. // Соросовский образовательный журнал. – 2000. - №10. - С. 5–9. 15. Котовская А.Р., Фомина Г.А. Особенности адаптации и дезадаптации сердечно- сосудистой системы человека в условиях космического полета. // Физиология человека. – 2010. – Том. 36. - №2. – С . 78–86. 16. Ларина И.М., баевский Р.М., Пастушкова Л.Х. и др. Взаимосвязь между изменениями водно-электролитного баланса и реакциями сердечно-сосудистой системы в эксперименте с 7суточной “сухой” иммерсией. // Физиология человека. – 2011. – Том. 37. - №5. – С. 100–107. 17. Оганов В.С., Богомолов В.В. Костная система человека в условиях невесомости. Обзор результатов исследований, гипотезы и возможность прогноза состояний в длительных (межпланетных) экспедициях. // Авиакосм. и эколог. медицина. - 2009. - №1. – С. 3-11. 18. Пестов И. Д. Основы гравитационной биологии. // Косм. биол. и мед. – 1997. – Том. 3. – Кн. 1. – С. 9-57. 19. Романов Ю.А., Кабаева Н.В., Буравкова Л.Б. Гравичувствительность эндотелия человека. // Авиакосм. и эколог. медицина. – 2000. – Т. 34. - № 4. – С. 23–26. 20. Романов Ю.А., Кабаева Н.В., Буравкова Л.Б. Изменение актинового цитоскелета и скорости репарации механически поврежденного монослоя эндотелия человека в условиях клиностатирования. // Авиакосм. и эколог. медицина. – 2001. - Том. 35. - №1. – С. 37–40. 21. Романов Ю.А., Кабаева Н.В., Буравкова Л.Б. Морфологические и функциональные особенности ответа эндотелия человека на гипертермию in vitro. // Авиакосм. и эколог. медицина. – 2001. – Том.35. - №5 – С. 40–46. 22. Склянкина Н.Н., Болдырева Н.В., Щегловитова О.Н. Различия в функциональной активности культивируемых клеток эндотелия кровеносных сосудов человека, полученных от разных доноров. // Цитология. – 2011. – Том. 53. - №4. – С. 341–346. 23. Смурова К.М., Бирюкова А.А., Верин А.Д. и др. Система микротрубочек при барьерной дисфункции эндотелия: деполимеризация на краю клетки и реорганизация во внутренней цитоплазме. // Цитология. – 2008. – Том. 50. - №1. – С. 49–55. 24. Смурова К.М., Бирюкова А.А., Гарсиа Дж. и др. Реорганизация системы микротрубочек в клетках легочного эндотелия в ответ на воздействие тромбина. // Цитология. – 2004. – Том. 46. - №8. – С. 695–703. 25. Старикова Э.А., Соколов Д.И., Сельков С.А. и др. Изменения профиля секретируемых хемокинов эндотелиальных клеток и моноцитов при разных условиях кокультивирования. // БЭБиМ. – 2010. – Том.150. - №10. – С. 420–423. 134 26. Сушков Ф.В., Португалов В.В., Руднева С.В. и др. Результаты экспонирования культуры клеток млекопитающих на искусственном спутнике Земли. // Косм. биол. и авиакосм. мед. – 1976. – Том. 10. - №2. – С. 58-63. 27. Сушков Ф.В., Руднева С.В. Эксперименты с культурами клеток млекопитающих. // Биологические исследования на биоспутниках «Космос». М., - 1979. – С. 199-213. 28. Таирбеков М.Г. Гравитационная бология клетки (теория и эксперимент). // М., - 1997. – 128 с. 29. Таирбеков М.Г. Клетка как гравичувствительная биомеханическая система. // Авиакосм. и эколог. медицина. – 2000. – Том. 34. - №2. – С. 3–17. 30. Таирбеков М.Г. Молекулярные и клеточные основы гравитационной чувствительности. // М., - 2002. – 104 с. 31. Тихонов А.Н. Молекулярные моторы. Часть 2. Молекулярные основы биологической подвижности // Соросовский образовательный журнал. – 1999. - №6. – С. 17–24. 32. Фрейдлин И.С. Иммунофизиология эндотелиальных клеток. // Физиология Человека. – 2006. – Том. 32. - №3. – С. 124–135. 33. Фрейдлин И.С. Участие эндотелиальных клеток в иммунорегуляции. // Аллергология и иммунология. – 2001. – Том. 2. - №2. – С. 11. 34. Фрейдлин И.С., Шейкин Ю.А. Эндотелиальные клетки в качестве мишеней и продуцентов цитокинов. // Мед.иммунология. – 2001. – Том. 3. - №4. – С. 499–514. 35. Хайтлина С.Ю. Механизмы сегрегации изоформ актина в клетке. // Цитология. – 2007. – Том. 49. – С. 345–354. 36. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы. Руководство для врачей. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 345с. 37. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию. 4-е изд., перераб. и доп.- М.: ИКЦ Академкнига, 2004. - 495 с. 38. Abbassi O., Lane C.L., Krater S. et al. Canine neutrophil margination mediated by lectin adhesion molecule-1 in vitro. // J Immunol. – 1991. – Vol. 147. - №7. – Р. 2107–2115. 39. Abdala-Valencia H., Cook-Mills J.M. VCAM-1 signals activate endothelial cell protein kinase Calpha via oxidation. // J Immunol. – 2006. – Vol. 177. - №9. – Р. 6379–6387. 40. Abdala-Valencia H., Earwood J., Bansal S. et al. Nonhematopoietic NADPH oxidase regulation of lung eosinophilia and airway hyperresponsiveness in experimentally induced asthma. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2007. – Vol. 292. - №5. – Р. 1111–1125. 41. Aberle H., Schwartz H., Kemler R. Cadherin-catenin complex: protein interactions and their implications for cadherin function. // J Cell Biochem. – 1996. - Vol. 61. - №4. – Р. 514–523. 135 42. Abonia J.P., Austen K.F., Rollins B.J. et al. Constitutive homing of mast cell progenitors to the intestine depends on autologous expression of the chemokine receptor CXCR2. // Blood. – 2005. – Vol. 105. - №11. – Р. 4308–4313. 43. Adam A.P., Sharenko A.L, Pumiglia K. et al. Src-induced tyrosine phosphorylation of VE- cadherin is not sufficient to decrease barrier function of endothelial monolayers. // J Biol Chem. – 2010. – Vol. 285. - №10. – Р. 7045–7055. 44. Adams J.C. Roles of fascin in cell adhesion and motility. // Curr Opin Cell Biol. – 2004. - Vol.16. - №5. – Р. 590–596. 45. Ager A. Isolation and culture of high endothelial cells from rat lymph nodes. // J Cell Sci. – 1987. – Vol. 87. – Р. 133–144. 46. Ahrens T., Lambert M., Pertz O. et al. Homoassociation of VE-cadherin follows a mechanism common to "classical" cadherins. // J Mol Biol. – 2003. - Vol. 325. - №4. – Р. 733–742. 47. Albelda S.M., Muller W.A., Buck C.A. et al. Molecular and cellular properties of PECAM-1 (endoCAM/CD31): a novel vascular cell-cell adhesion molecule. // J Cell Biol. – 1991. – Vol. 114. №5. – Р. 1059–1068. 48. Albelda S.M., Smith C.W., Ward P.A. Adhesion molecules and inflammatory injury. // FASEB J. – 1994. – Vol. 8. - №8. – Р. 504–512. 49. Alieva I.B., Zemskov E.A., Kireev I.I. et al. Microtubules growth rate alteration in human endothelial cells. // J Biomed Biotechnol. – 2010. - Vol. 2010. – Р. 10. 50. Alieva I.B., Zemskov E.A., Smurova K.M. et al. The leading role of microtubules in endothelial barrier dysfunction: disassembly of peripheral microtubules leaves behind the cytoskeletal reorganization. // J Cell Biochem. – 2013. - Vol. 114. - №10. – Р. 2258–2272. 51. Alom-Ruiz S.P., Anilkumar N., Shah A.M. Reactive oxygen species and endothelial activation. // Antioxid Redox Signal. – 2008. – Vol. 10. - №6. – Р. 1089–1100. 52. Alon R., Feigelson S. From rolling to arrest on blood vessels: leukocyte tap dancing on endothelial integrin ligands and chemokines at sub-second contacts. // Semin Immunol. – 2002. – Vol. 14. - №2. – Р. 93–104. 53. Alon R., Kassner P.D., Carr M.W. et al. The integrin VLA-4 supports tethering and rolling in flow on VCAM-1. // J Cell Biol. – 1995. – Vol. 128. - №6. – Р. 1243–1253. 54. Amano M., Ito M., Kimura K. et al. Phosphorylation and activation of myosin by Rho- associated kinase (Rho-kinase). // J Biol Chem. – 1996. – Vol. 271. - №34. – Р. 20246–20249. 55. Angelini D.J., Hyun S.W., Grigoryev D.N. et al. TNF-alpha increases tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and opens the paracellular pathway through fyn activation in human lung endothelia. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2006. – Vol. 291. №6. – Р. 1232–1245. 136 56. Angst B.D., Marcozzi C., Magee A.I. The cadherin superfamily: diversity in form and function. // J Cell Sci. – 2001. - Vol. 114. - №4. – Р. 629–641. 57. Annu Rev Physiol. 1997;59:633-57. 58. Anrather J., Csizmadia V., Soares M.P. et al. Regulation of NF-kappaB RelA phosphorylation and transcriptional activity by p21(ras) and protein kinase Czeta in primary endothelial cells. // J Biol Chem. – 1999. – Vol. 274. - №19. – Р. 13594–13603. 59. Aplin A.E., Howe A.K., Juliano R.L. Cell adhesion molecules, signal transduction and cell growth. // Curr Opin Cell Biol. – 1999. – Vol. 11. - №6. – Р. 737–744. 60. Arai T., Kelly S.A., Brengman M.L. et al. Ambient but not incremental oxidant generation effects intercellular adhesion molecule 1 induction by tumour necrosis factor alpha in endothelium. // Biochem J. – 1998. – Vol. 331. – Р. 853–861. 61. Arora S., Gunther A., Wennerblom B. et al. Systemic markers of inflammation are associated with cardiac allograft vasculopathy and an increased intimal inflammatory component. // Am J Transplant. – 2010. – Vol. 10. - №6. – Р. 1428–1436. 62. Balligand J.L., Feron O., Dessy C. eNOS activation by physical forces: from short-term regulation of contraction to chronic remodeling of cardiovascular tissues. // Physiol Rev. – 2009. – Vol. 89. - №2. – Р. 481–534. 63. Bamburg J.R. Proteins of the ADF/Cofilin family: essential regulators of actin dynamics. // Annu. Rev. Cell Dev. – 1999. - Vol. 15. – Р. 185–230. 64. Bamburg J.R., Bray D., Chapman K. Assembly of microtubules at the tip of growing axons. // Nature. – 1986. - Vol. 321. - №6072. – Р. 788–790. 65. Bannerman D.D., Goldblum S.E. Endotoxin induces endothelial barrier dysfunction through protein tyrosine phosphorylation. // Am J Physiol. – 1997. – Vol. 273. - №1. – Р. 217–226. 66. Banning A., Schnurr K., Böl G.F. et al. Inhibition of basal and interleukin-1-induced VCAM- 1 expression by phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase and 15-lipoxygenase in rabbit aortic smooth muscle cells. // Free Radic Biol Med. – 2004. – Vol. 36. - №2. – Р. 135–144. 67. Barbara N.P., Wrana J.L., Letarte M. Endoglin is an accessory protein that interacts with the signaling receptor complex of multiple members of the transforming growth factor-beta superfamily. // J Biol Chem. – 1999. – Vol. 274. - №2. – Р. 584–594. 68. Bargatze R.F., Kurk S., Butcher E.C. et al. Neutrophils roll on adherent neutrophils bound to cytokine-induced endothelial cells via L-selectin on the rolling cells. // J Exp Med. – 1994. – Vol. 180. - №5. – Р. 1785–1792. 69. Barreiro O., Yáñez-Mó M., Sala-Valdés M. et al. Endothelial tetraspanin microdomains regulate leukocyte firm adhesion during extravasation. // Blood. – 2005. – Vol. 105. - №7. – Р. 2852 – 2861. 137 70. Barreiro O., Yanez-Mo M., Serrador J.M. et al. Dynamic interaction of VCAM-1 and ICAM- 1 with moesin and ezrin in a novel endothelial docking structure for adherent leukocytes. // J Cell Biol. – 2002. – Vol. 157. - №7. – Р. 1233–1245. 71. Barreiro O., Zamai M., Yáñez-Mó M. et al. Endothelial adhesion receptors are recruited to adherent leukocytes by inclusion in preformed tetraspanin nanoplatforms. // J Cell Biol. – 2008. – Vol. 183. - №3. – Р. 527–542. 72. Barton B.E. IL-6: insights into novel biological activities // Clin. Immunol. Immunopathol. – 1997. – Vol. 85. - №1. – P. 16–20. 73. Bazzoni G., Dejana E. Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis. // Physiol Rev. – 2004. - Vol. 84. - №3. – Р. 869 –901. 74. Bear J.E., Gertler F.B. Ena/VASP: towards resolving a pointed controversy at the barbed end. // J Cell Sci. – 2009. - Vol. 122. – P. 1947–1953. 75. Belmont L.D., Hyman A.A., Sawin K.E. et al. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. // Cell. – 1990. - Vol. 62. - №3. – Р. 579– 589. 76. Berg J.S., Cheney R.E. Myosin-X is an unconventional myosin that undergoes intrafilopodial motility. // Nat Cell Biol. – 2002. - Vol. 4. - №3. – Р. 246–250. 77. Bershadsky A., Chausovsky A., Becker E. et al. Involvement of microtubules in the control of adhesion-dependent signal transduction. // Curr Biol. – 1996. - Vol. 6. - №10. – Р. 1279–1289. 78. Bevilacqua M.P., Nelson R.M. Selectins. // J Clin Invest. – 1993. – Vol. 91. - №2. – Р. 379– 387. 79. Bevilacqua M.P., Pober J.S., Mendrick D.L. et al. Identification of an inducible endothelial- leukocyte adhesion molecule. // Proc Natl Acad Sci USA. – 1987. – Vol. 84. - №24. – Р. 9238–9242. 80. Bevilacqua M.P., Stengelin S., Gimbrone M.A. et al. Endothelial leukocyte adhesion molecule 1: an inducible receptor for neutrophils related to complement regulatory proteins and lectins. // Science. – 1989. – Vol. 243. - №4895. – Р. 1160–1165. 81. Beyaert R., Cuenda A., Vanden Berghe W. et al. The p38/RK mitogen-activated protein kinase pathway regulates interleukin-6 synthesis response to tumor necrosis factor. // EMBO J. – 1996. – Vol. 15. - №8. – Р. 1914–1923. 82. Biedermann B.C. Vascular endothelium: checkpoint for inflammation and immunity // News Physiol Sci. – 2001. – Vol. 16. – P. 84–88. 83. Bochner B.S., Luscinskas F.W., Gimbrone M.A.Jr. et al. Adhesion of human basophils, eosinophils, and neutrophils to interleukin 1-activated human vascular endothelial cells: contributions of endothelial cell adhesion molecules. // J Exp Med. – 1991. – Vol. 173. - №6. – Р. 1553–1557. 138 84. Boerma M., Burton G.R., Wang J. et al. Comparative expression profiling in primary and immortalized endothelial cells: changes in gene expression in response to hydroxy methylglutarylcoenzyme A reductase inhibition. // Blood Coagul Fibrinolysis. – 2006. – Vol. 17. - №3. – Р. 173– 180. 85. Bogatcheva N.V., Garcia J.G., Verin A.D. Molecular mechanisms of thrombin-induced endothelial cell permeability. // Biochemistry (Mosc). – 2002. – Vol. 67. - №1. – Р. 75–84. 86. Boonstra J. Growth factor-induced signal transduction in adherent mammalian cells is sensitive to gravity. // FASEB J. – 1999. – Vol. 13. – Р. 35–42. 87. Boonstra J., Moes M.J. Signal transduction and actin in the regulation of G1-phase progression. // Crit Rev Eukaryot Gene Expr. – 2005. – Vol. 15. - №3. – Р. 255–276. 88. Bork P., Downing A.K., Kieffer B. et al. Structure and distribution of modules in extracellular proteins. // Q Rev Biophys. – 1996. - Vol. 29. – №2. – Р. 119–167. 89. Breier G., Breviario F., Caveda L. et al. Molecular cloning and expression of murine vascular endothelial-cadherin in early stage development of cardiovascular system. // Blood. – 1996. - Vol. 87. - №2. – Р. 630–641. 90. Buckey J.C., Lane L.D., Levine B.D. et al. Orthostatic intolerance after spaceflight. // J Appl Physiol. – 1996. – Vol. 81. - №1. – Р. 7–18. 91. Buravkova L., Romanov Y., Rykova M. et al. Cell-to-cell interactions in changed gravity: Ground-based and flight experiments. // Acta Astronaut. – 2005. - Vol. 57. – Р. 67–74. 92. Buravkova L.B., Romanov Y.A. The role of cytoskeleton in cell changes under condition of simulated microgravity. // Acta Astronaut. – 2001. – Vol. 48. – Р. 647–650. 93. Burns L.J., Pooley J.C., Walsh D.J. et al. Intercellular adhesion molecule-1 expression in endothelial cells is activated by cytomegalovirus immediate early proteins. // Transplantation. -1999. – Vol. 67. - №1. – Р. 137–144. 94. Bоrsum T., Hagen I., Henriksen T. et al. Alterations in the protein composition and surface structure of human endothelial cells during growth in primary culture. // Atherosclerosis. – 1982. – Vol. 44. - №3. – Р. 367–378. 95. Cammarano M.S., Minden A. Dbl and the Rho GTPases activate NF kappa B by I kappa B kinase (IKK)-dependent and IKK-independent pathways. // J Biol Chem. – 2001. – Vol. 276. - №28. – Р. 25876–25882. 96. Campbell D.J., Woodward M., Chalmers J.P. et al. Soluble vascular cell adhesion molecule 1 and N-terminal pro-B-type natriuretic peptide in predicting ischemic stroke in patients with cerebrovascular disease. // Arch Neurol. – 2006. – Vol. 63. - №1. – Р. 60–65. 97. Carbajal J.M., Schaeffer R.C. Jr. RhoA inactivation enhances endothelial barrier function. // Am J Physiol. – 1999. - Vol. 277. - №5. – Р. 955–964. 139 98. Carlier M.F., Pantaloni D. Control of actin dynamics in cell motility. // J Mol Biol. – 1997. - Vol. 269. - №4 – Р. 459–467. 99. Carlos T.M., Schwartz B.R., Kovach N.L. et al. Vascular cell adhesion molecule-1 mediates lymphocyte adherence to cytokine-activated cultured human endothelial cells. // Blood. – 1990. – Vol. 76. - №5. – Р. 965–970. 100. Carlsson S.I., Bertilaccio M.T., Ballabio E. et al. Endothelial stress by gravitational unloading: effects on cell growth and cytoskeletal organization. // Biochim Biophys Acta. – 2003. Vol. 1642. - №3. – Р. 173-179. 101. Carlsson S.I., Bertilaccio M.T., Ballabio E. et al. Endothelial stress by gravitational unloading: effects on cell growth and cytoskeletal organization. // Biochim Biophys Acta. – 2003. – Vol. 1642. - №3. – Р. 173–179. 102. Carluccio MA1, Ancora MA, Massaro M. et al. Homocysteine induces VCAM-1 gene expression through NF-kappaB and NAD(P)H oxidase activation: protective role of Mediterranean diet polyphenolic antioxidants. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. – 2007. – Vol. 293. -№4. – Р. 2344–2354. 103. Carman C.V., Springer T.A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. // J Cell Biol. – 2004. – Vol. 167. - №2. – Р. 377–388. 104. Carmeliet P, Lampugnani MG, Moons L. et al. Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-cadherin gene in mice impairs VEGF-mediated endothelial survival and angiogenesis. // Cell. – 1999. - Vol. 98. - №2. – Р. 147–157. 105. Carpén O., Pallai P., Staunton D.E. et al. Association of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) with actin-containing cytoskeleton and alpha-actinin. // J Cell Biol. – 1992. – Vol. 118. №5. – Р. 1223–1234. 106. Carr M.W., Alon R., Springer T.A. The C-C chemokine MCP-1 differentially modulates the avidity of beta 1 and beta 2 integrins on T lymphocytes. // Immunity. – 1996. – Vol. 4. - №2. – Р. 179–187. 107. Cassie S., Masterson M.F., Polukoshko A. et al. Ischemia/reperfusion induces the recruitment of leukocytes from whole blood under flow conditions. // Free Radic Biol Med. – 2004. – Vol. 36. №9. – Р. 1102–1111. 108. Cassie S., Masterson M.F., Polukoshko A. et al. Ischemia/reperfusion induces the recruitment of leukocytes from whole blood under flow conditions. // Free Radic Biol Med. – 2004. – Vol. 36. №9. – Р. 1102–1111. 109. Cernuda-Morollón E., Ridley A.J. Rho GTPases and leukocyte adhesion receptor expression and function in endothelial cells. // Circ Res. – 2006. – Vol. 98. - №6. – Р. 757–767. 140 110. Cernuda-Morollón E., Ridley A.J. Rho GTPases and leukocyte adhesion receptor expression and function in endothelial cells. // Circ Res. – 2006. – Vol. 98. - №6. – Р. 757–767. 111. Cernuda-Morollón E., Ridley A.J. Rho GTPases and leukocyte adhesion receptor expression and function in endothelial cells. // Circ Res. – 2006. – Vol. 98. - №6. – Р. 757–767. 112. Charles J.B., Lathers C.M. Summary of lower body negative pressure experiments during space flight. // J Clin Pharmacol. – 1994. – Vol. 34. - №6. – Р. 571–583. 113. Chen G., Zhao L., Feng J. et al. Validation of reliable reference genes for real-time PCR in human umbilical vein endothelial cells on substrates with different stiffness. // PLoS One. – 2013. – Vol. 8. - №6. – e67360. 114. Chen X., Kojima S., Borisy G.G. et al. p120 catenin associates with kinesin and facilitates the transport of cadherincatenin complexes to intercellular junctions. // J Cell Biol. – 2003. - Vol. 163. №3. – Р. 547–557. 115. Chen X.L., Zhang Q., Zhao R. et al. Rac1 and superoxide are required for the expression of cell adhesion molecules induced by tumor necrosis factor-alpha in endothelial cells. // J Pharmacol Exp Ther. – 2003. – Vol. 305. - №2. – Р. 573–580. 116. Chen X.P., He S.Q., Wang H.P. et al. Expression of TNF-related apoptosis-inducing Ligand receptors and antitumor tumor effects of TNF-related apoptosis-inducing Ligand in human hepatocellular carcinoma. // World J Gastroenterol. – 2003. – Vol. 9. - №11. – Р. 2433–2440. 117. Cheung A.T., Tomic M.M., Chen P.C. et al. Correlation of microvascular abnormalities and endothelial dysfunction in Type-1 Diabetes Mellitus (T1DM): a real-time intravital microscopy study. // Clin Hemorheol Microcirc. – 2009. – Vol. 42. - №4. – Р. 285–295. 118. Chiba R., Nakagawa N., Kurasawa K. et al. Ligation of CD31 (PECAM-1) on endothelial cells increases adhesive function of alphavbeta3 integrin and enhances beta1 integrin-mediated adhesion of eosinophils to endothelial cells. // Blood. – 1999. – Vol. 94. - №4. – Р. 1319–1329. 119. Chiu J.J., Wung B.S., Shyy J.Y. et al. Reactive oxygen species are involved in shear stress- induced intercellular adhesion molecule-1 expression in endothelial cells. // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 1997. – Vol. 17. - №12. – Р. 3570–3577. 120. Cinamon G., Shinder V., Alon R. Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines. // Nat Immunol. – 2001. – Vol. 2. - №6. – Р. 515– 522. 121. Cines D.B., Pollak E.S., Buck C.A. et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. // Blood. – 1998. – Vol. 91. - №10. – Р. 3527–3561. 122. Clauss M., Sunderkötter C., Sveinbjörnsson B. et al. A permissive role for tumor necrosis factor in vascular endothelial growth factor-induced vascular permeability. // Blood. – 2001. – Vol. 97. - №5. – Р. 1321–1329. 141 123. Clayton A., Evans R.A., Pettit E. et al. Cellular activation through the ligation of intercellular adhesion molecule-1. // J Cell Sci. – 1998. – Vol. 111. – Р. 443–453. 124. Cogoli A. Theories and models of biological response to gravity: an introduction. // Adv Space Res. – 1992. – Vol. 12. - №1. – Р. 5–6. 125. Cohen T., Nahari D., Cerem L.W. et al. Interleukin-6 induces the expression of vascular endothelial growth factor. // J. Biol. Chem. – 1996. –Vol. 271. - № 2. – P. 736–741. 126. Colgan O.C., Ferguson G., Collins N.T. et al. Regulation of bovine brain microvascular endothelial tight junction assembly and barrier function by laminar shear stress. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. – 2007. - Vol. 292. - №6. – Р. 3190–3197. 127. Convertino V.A. Status of cardiovascular issues related to space flight: Implications for future research directions. // Respir Physiol Neurobiol. – 2009. – Vol. 169. – P. 34-37. 128. Cook-Mills J.M., Johnson J.D., Deem T.L. et al. Calcium mobilization and Rac1 activation are required for VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) stimulation of NADPH oxidase activity. // Biochem J. – 2004. – Vol. 378. -№2. – Р. 539–547. 129. Cook-Mills J.M., Marchese M.E., Abdala-Valencia H. Vascular cell adhesion molecule-1 expression and signaling during disease: regulation by reactive oxygen species and antioxidants. // Antioxid Redox Signal. – 2011. – Vol. 15. - №6. – Р. 1607–1638. 130. Cooper J.A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. // J Cell Biol. – 1987. – Vol. 105. - №4. – Р. 1473–1478. 131. Costanzo A., Moretti F., Burgio V.L. et al. Endothelial activation by angiotensin II through NFkappaB and p38 pathways: Involvement of NFkappaB-inducible kinase (NIK), free oxygen radicals, and selective inhibition by aspirin. // J Cell Physiol. – 2003. – Vol. 195. - №3. – Р. 402–410. 132. Cotran R.S., Gimbrone M.A.Jr., Bevilacqua M.P. et al. Induction and detection of a human endothelial activation antigen in vivo. // J Exp Med. – 1986. – Vol. 164. - №2. – Р. 661–666. 133. Cotrupi S., Ranzani D., Maier J.A. Impact of modeled microgravity on microvascular endothelial cells. // Biochim Biophys Acta. – 2005. - Vol. 1746. - №2. – Р. 163-168. 134. Crawford-Young S.J. Effects of microgravity on cell cytoskeleton and embryogenesis. // Int J Dev Biol. – 2006. – Vol. 50. – Р. 183–191. 135. Cuvelier S.L., Paul S., Shariat N. et al. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. // J Exp Med. – 2005. – Vol. 202. №6. – Р. 865–876. 136. Cybulsky M.I., Fries J.W., Williams A.J. et al. Alternative splicing of human VCAM-1 in activated vascular endothelium. // Am J Pathol. – 1991. – Vol. 138. - №4. – Р. 815–820. 137. Danowski B.A. Fibroblast contractility and actin organization are stimulated by microtubule inhibitors. // J Cell Sci. – 1989. - Vol. 93. - №2. – Р. 255–266. 142 138. Davies P.F. Hemodynamic shear stress and the endothelium in cardiovascular pathophysiology. // Nat Clin Pract Cardiovasc Med. – 2009. - Vol. 6. - №1. – Р. 16–26. 139. Davies P.F. Overview: temporal and spatial relationships in shear stress-mediated endothelial signalling. // J Vasc Res. – 1997. - Vol. 34. - №3. – Р. 208–211. 140. Davies P.F., Tripathi S.C. Mechanical stress mechanisms and the cell. An endothelial paradigm. // Circ Res. – 1993. – Vol. 72. - №2. – Р. 239–245. 141. Davies S.P., Reddy H., Caivano M. et al. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. // Biochem J. – 2000. – Vol. 351. – Р. 95–105. 142. Deem T.L., Abdala-Valencia H., Cook-Mills J.M. VCAM-1 activation of endothelial cell protein tyrosine phosphatase 1B. // J Immunol. – 2007. – Vol. 178. - №6. – Р. 3865–3873. 143. Dejana E., Corada M., Lampugnani M.G. Endothelial cell-to-cell junctions. // FASEB J. - 1995. - Vol. 9. - №10. – Р. 910–918. 144. DeLeo F.R., Quinn M.T. Assembly of the phagocyte NADPH oxidase: molecular interaction of oxidase proteins. // J Leukoc Biol. – 1996. – Vol. 60. - №6. – Р. 677–691. 145. DeMali K.A., Barlow C.A., Burridge K. Recruitment of the Arp2/3 complex to vinculin: coupling membrane protrusion to matrix adhesion. // J Cell Biol. – 2002. - Vol. 159. - №5. – Р. 881– 891. 146. Diamond M.S., Staunton D.E., de Fougerolles A.R. et al. ICAM-1 (CD54): a counter- receptor for Mac-1 (CD11b/CD18). // J Cell Biol. – 1990. – Vol. 111. - №6. – Р. 3129–3139. 147. Dillaman R.M., Roer R.D. Correlated light and electron microscopy of the vasculature of cortical bone in rat femora and tibiae. // Physiologist. – 1985. – Vol. 28. - №6. – Р. 65–66. 148. doi: 10.1089/ars.2007.1998. 149. Dudek S.M., Garcia J.G. Cytoskeletal regulation of pulmonary vascular permeability. // J Appl Physiol. – 2001. - Vol.91. - №4. – Р. 1487–1500. 150. Dudek S.M., Garcia J.G. Cytoskeletal regulation of pulmonary vascular permeability. // J Appl Physiol. – 2001. - Vol. 91. - №4. – Р. 1487–1500. 151. Durieu-Trautmann O., Chaverot N., Cazaubon S. et al. Intercellular adhesion molecule 1 activation induces tyrosine phosphorylation of the cytoskeleton-associated protein cortactin in brain microvessel endothelial cells. // J Biol Chem. – 1994. – Vol. 269. - №17. – Р. 12536–12540. 152. Dustin M.L., Springer T.A. Lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) interaction with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is one of at least three mechanisms for lymphocyte adhesion to cultured endothelial cells. // J Cell Biol. – 1988. – Vol. 107. - №1. – Р. 321–331. 153. Ehringer W.D., Yamany S., Steier K. et al. Quantitative image analysis of F-actin in endothelial cells. // Microcirculation. – 1999. - Vol.6. - №4. – Р. 291–303. 154. Ehringer W.D., Yamany S., Steier K. et al. Quantitative image analysis of F-actin in endothelial cells. // Microcirculation. – 1999. - Vol. 6. - №4. – Р. 291–303. 143 155. Elices M.J., Osborn L., Takada Y. et al. VCAM-1 on activated endothelium interacts with the leukocyte integrin VLA-4 at a site distinct from the VLA-4/fibronectin binding site. // Cell. – 1990. – Vol. 60. - №4. – Р. 577–584. 156. Engelhardt B., Wolburg H. Mini-review: Transendothelial migration of leukocytes: through the front door or around the side of the house? // Eur J Immunol. – 2004. – Vol. 34. - №11. – Р. 2955–2963. 157. Erickson J.W., Cerione R.A. Multiple roles for Cdc42 in cell regulation. // Curr Opin Cell Biol. – 2001. - Vol. 13. - №2. – Р. 153–157. 158. Essler M., Amano M., Kruse H.J. et al. Thrombin inactivates myosin light chain phosphatase via Rho and its target Rho kinase in human endothelial cells. // J Biol Chem. – 1998. – Vol. 273. №34. – Р. 21867–21874. 159. Etienne-Manneville S., Manneville J.B., Adamson P. et al. ICAM-1-coupled cytoskeletal rearrangements and transendothelial lymphocyte migration involve intracellular calcium signaling in brain endothelial cell lines. // J Immunol. – 2000. – Vol.165. - №6. – Р. 3375–3383. 160. Evangelista M., Zigmond S., Boone C. Formins: signaling effectors for assembly and polarization of actin filaments. // J Cell Sci. – 2003. - Vol. 116. – Р. 2603–2611. 161. Fan J., Frey R.S., Rahman A. et al. Role of neutrophil NADPH oxidase in the mechanism of tumor necrosis factor-alpha -induced NF-kappa B activation and intercellular adhesion molecule-1 expression in endothelial cells. // J Biol Chem. – 2002. – Vol. 277. - №5. – Р. 3404–3411. 162. Fernvik E., Halldén G., Lundahl J. et al. Allergen-induced accumulation of eosinophils and lymphocytes in skin chambers is associated with increased levels of interleukin-4 and sVCAM-1. // Allergy. – 1999. – Vol. 54. - №5. – Р. 455–463. 163. Fey E.G., Wan K.M., Penman S. Epithelial cytoskeletal framework and nuclear matrix- intermediate filament scaffold: three-dimensional organization and protein composition. // J Cell Biol. – 1984. - Vol. 98. - №6. – Р. 1973–1984. 164. Fitts R.H., Riley D.R., Widrick J.J. Functional and structural adaptations of skeletal muscle to microgravity. // J Exp Biol. – 2001. Vol. 204. – P. 3201-3208. 165. Frey R.S., Rahman A., Kefer J.C. et al. PKCzeta regulates TNF-alpha-induced activation of NADPH oxidase in endothelial cells. // Circ Res. – 2002. – Vol. 90. - №9. – Р. 1012–1019. 166. Fritsch-Yelle J.M., Leuenberger U.A., D'Aunno D.S. et al. An episode of ventricular tachycardia during long-duration spaceflight. // Am J Cardiol. – 1998. – Vol. 81. - №11. – Р. 1391– 1392. 167. Fuchs E., Yang Y. Crossroads on cytoskeletal highways. // Cell. – 1999. - Vol. 98. - №5. – Р. 547–550. 144 168. Fujita S., Puri R.K., Yu Z.X. et al. An ultrastructural study of in vivo interactions between lymphocytes and endothelial cells in the pathogenesis of the vascular leak syndrome induced by interleukin-2. // Cancer. – 1991. – Vol. 68. - №10. – Р. 2169–2174. 169. Fuller B. Tensegrity. // Portfolio Artnews Annual. – 1961. - Vol. 4. – Р. 112–127. 170. Galeotti T., Boscoboinik D., Azzi A. Regulation of the TNF-alpha receptor in human osteosarcoma cells: role of microtubules and of protein kinase C. // Arch Biochem Biophys. – 1993. – Vol. 300. - №1. – Р. 287–292. 171. Ganz A., Lambert M., Saez A. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. // Biol Cell. – 2006. - Vol. 98. - №12. – Р. 721–730. 172. Gao X., Kouklis P., Xu N. et al. Reversibility of increased microvessel permeability in response to VE-cadherin disassembly. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2000. - Vol. 279. №6. – Р. 1218–1225. 173. Garcia J.G., Lazar V., Gilbert-McClain L.I. et al. Myosin light chain kinase in endothelium: molecular cloning and regulation. // Am J Respir Cell Mol Biol. – 1997. - Vol. 16. - №5. – Р. 489– 494. 174. Gavin R.H. Microtubule-microfilament synergy in the cytoskeleton. // Int Rev Cytol. – 1997. - Vol. 173. – Р. 207–242. 175. Gershovich P.M., Gershovich J.G., Zhambalova A.P. et al. Cytoske letal proteins and stem cell markers gene expression in human bone marrow mesenchymal strom al cells after differe nt pe riods of simulated microgravity. // Acta Astronautica. – 2012. – Vol. 70. – Р. 36–42. 176. Gimbrone MA Jr, Cotran RS, Folkman J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. // J Cell Biol. – 1974. – Vol. 60. - №3. – Р. 673–684. 177. Giraudo E., Arese M., Toniatti C. et al. IL-6 is an in vitro and in vivo autocrine growth factor for middle T antigentransformed endothelial cells. // J. Immunol. – 1996. – Vol. 157. - №6. – P. 2618–2623. 178. Goeckeler Z.M., Wysolmerski R.B. Myosin light chain kinase-regulated endothelial cell contraction: the relationship between isometric tension, actin polymerization, and myosin phosphorylation. // J Cell Biol. – 1995. - Vol. 130. - №3. – Р. 613–627. 179. Goeckeler Z.M., Wysolmerski R.B. Myosin light chain kinase-regulated endothelial cell contraction: the relationship between isometric tension, actin polymerization, and myosin phosphorylation. // J Cell Biol. – 1995. - Vol. 130. - №3. – Р. 613–627. 180. Goedert M., Hasegawa M., Jakes R. et al. Phosphorylation of microtubule-associated protein tau by stress-activated protein kinases. // FEBS Lett. – 1997. - Vol. 409. - №1. – Р. 57–62. 181. Goldblum S.E., Hennig B., Jay M. et al. Tumor necrosis factor alpha-induced pulmonary vascular endothelial injury. // Infect Immun. – 1989. - Vol. 57. - №4. – Р. 1218–1226. 145 182. Goldblum S.E., Sun W.L. Tumor necrosis factor-alpha augments pulmonary arterial transendothelial albumin flux in vitro. // Am J Physiol. – 1990. – Vol. 258. - №2. – Р. 57–67. 183. Goldblum S.E., Young B.A., Wang P. et al. Thrombospondin-1 induces tyrosine phosphorylation of adherens junction proteins and regulates an endothelial paracellular pathway. // Mol Biol Cell. – 1999. – Vol. 10. - №5. – Р. 1537–1551. 184. Gotlieb A.I., Subrahmanyan L., Kalnins V.I. Microtubule-organizing centers and cell migration: effect of inhibition of migration and microtubule disruption in endothelial cells. // J Cell Biol. – 1983. – Vol. 96. - №5. – Р. 1266–1272. 185. Grenon S.M., Jeanne M., Aguado-Zuniga J. et al. Effects of gravitational mechanical unloading in endothelial cells: association between caveolins, inflammation and adhesion molecules. // Sci Rep. – 2013. – Vol. 3. - №1494. 186. Griffoni C., Di Molfetta S., Fantozzi L. et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. // J. Cell. Biochem. – 2011. – Vol. 112. №1. – P. 265–272. 187. Grigoriev A.I., Kalinin Y.T., Buravkova L.B. et al. Space cell physiology and space biotechnology in Russia. // Adv Space Biol Med. – 2002. - Vol. 8. – Р. 215-236. 188. Grimm D., Bauer J., Ulbrich C. et al. Different responsiveness of endothelial cells to vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor added to culture media under gravity and simulated microgravity. // Tissue Eng Part A. – 2010. – Vol. 16. - №5. – Р. 1559–1573. 189. Grimm D., Infanger M., Westphal K. et al. A delayed type of three-dimensional growth of human endothelial cells under simulated weightlessness. // Tissue Eng Part A. – 2009. - Vol. 15. №8. – Р. 2267-2275. 190. Grosse J., Wehland M., Pietsch J. et al. Short-term weightlessness produced by parabolic flight maneuvers altered gene expression patterns in human endothelial cells. // FASEB J. – 2012. – Vol. 26. - №2. – Р. 639–655. 191. Gruener R., Hoeger G. Vector-free gravity disrupts synapse formation in cell culture. // Am J Physiol. – 1990. – Vol. 258. - №3. – Р. 489–494. 192. Gruener R., Roberts R., Reitstetter R. Exposure to microgravity alters properties of cultured muscle cells. // ASGSB Bulletin. – 1993. – Vol. 7. – Р. 65. 193. Guay J., Lambert H., Gingras-Breton G. et al. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. // J Cell Sci. – 1997. – Vol. 110. – Р. 357–368. 194. Guignandon A., Lafage-Proust M.H., Usson Y. et al. Cell cycling determines integrin- mediated adhesion in osteoblastic ROS 17/2.8 cells exposed to space-related conditions. // FASEB J. – 2001. - Vol. 15. - №11. – Р. 2036 – 2038. 146 195. Guignandon A., Usson Y., Laroche N. et al. Effects of intermittent or continuous gravitational stresses on cell-matrix adhesion: quantitative analysis of focal contacts in osteoblastic ROS 17/2.8 cells. // Exp Cell Res. – 1997. – Vol. 236. - №1. – Р. 66–75. 196. Gulino-Debrac D. Mechanotransduction at the basis of endothelial barrier function. // Tissue Barriers. – 2013. – Vol. 1. - №2. – Р. 1–10. 197. Gupton S.L., Gertler F.B. Filopodia: the fingers that do the walking. // Sci STKE. – 2007. - Vol. 2007. - №400. – Р. 5. 198. Hahn C., Schwartz M.A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. // - 2009. - Vol. 10. - №1. – Р. 53–62. 199. Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton. // Science. – 1998. – Vol. 279. - №5350. – Р. 509–514. 200. Hamaguchi M., Matsuyoshi N., Ohnishi Y. et al. p60v-src causes tyrosine phosphorylation and inactivation of the N-cadherin-catenin cell adhesion system. // EMBO J. - 1993. – Vol. 12. - №1. – Р. 307–314. 201. Hammond T.G., Hammond J.M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. // Am J Physiol Renal Physiol. – 2001. – Vol. 281. - №1. – Р.12–25. 202. Hatton J.P., Gaubert F., Lewis M.L. et al. The kinetics of translocation and cellular quantity of protein kinase C in human leukocytes are modified during spaceflight. // FASEB J. – 1999. – Vol. 13. - №9001. – Р. 23–33. 203. Heiska L., Alfthan K., Grönholm M. et al. Association of ezrin with intercellular adhesion molecule-1 and -2 (ICAM-1 and ICAM-2). Regulation by phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate. // J Biol Chem. – 1998. – Vol. 273. - №34. – Р. 21893–21900. 204. Hendriks H.R., Korn C., Duijvestijn A.M. et al. Changes in lymphocyte binding and expression of His 22 of high endothelial venules in rat lymph nodes after occlusion of afferent lymph flow. // Adv Exp Med Biol. – 1988. – Vol. 237. – Р. 485–490. 205. Henning B., Goldblum S.E., McClain C.J. Interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor/cachectin (TNF) increase endothelial permeability in vitro. // J. Leukocyte Biol. – 1987. – Vol. 42. – Р. 551. 206. Herman I.M. Actin isoforms. // Curr Opin Cell Biol. – 1993. – Vol. 5. - №1. – Р. 48–55. 207. Herren B., Levkau B., Raines E.W. et al. Cleavage of beta-catenin and plakoglobin and shedding of VE-cadherin during endothelial apoptosis: evidence for a role for caspases and metalloproteinases. // Mol Biol Cell. – 1998. – Vol. 9. - №6. – Р. 1589–1601. 208. Hession C., Moy P., Tizard R. et al. Cloning of murine and rat vascular cell adhesion molecule-1. // Biochem Biophys Res Commun. – 1992. – Vol. 183. - №1. – Р. 163–169. 209. Heuser J.E., Kirschner M.W. Filament organization revealed in platinum replicas of freeze- dried cytoskeletons. // J Cell Biol. – 1980. - Vol. 86. - №1 – Р. 212–234. 147 210. Heyninck K., De Valck D., Vanden Berghe W. et al. The zinc finger protein A20 inhibits TNF-induced NF-kappaB-dependent gene expression by interfering with an RIP- or TRAF2mediated transactivation signal and directly binds to a novel NF-kappaB-inhibiting protein ABIN. // J Cell Biol. – 1999. – Vol. 145. - №7. – Р. 1471–1482. 211. Higashibata A, Imamizo-Sato M, Seki M. et al. Influence of simulated microgravity on the activation of the small GTPase Rho involved in cytoskeletal formation--molecular cloning and sequencing of bovine leukemia-associated guanine nucleotide exchange factor. // BMC Biochem. – 2006. – Vol. 7. - №19. – Р. 1–9. 212. Hinshaw D.B., Burger J.M. et al. Armstrong B.C. Mechanism of endothelial cell shape change in oxidant injury. // J Surg Res. – 1989. – Vol. 46. - №4. – Р. 339–349. 213. Hoelzle M.K., Svitkina T. The cytoskeletal mechanisms of cell-cell junction formation in endothelial cells. // Mol Biol Cell. – 2012. - Vol. 23. - №2. – Р. 310–323. 214. Hoock T.C., Newcomb P.M., Herman I. Beta actin and its mRNA are localized at the plasma membrane and the regions of moving cytoplasm during the cellular response to injury. // J Cell Biol. – 1991. - Vol. 112. - №4. – Р. 653–664. 215. Hortelano S., López-Fontal R., Través P.G. et al. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. // Cardiovasc Res. – 2010. – Vol. 86. - №2. – Р. 283–292. 216. Hortelano S., López-Fontal R., Través P.G. et al. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. // Cardiovasc Res. – 2010. – Vol. 86. - №2. – Р. 283–292. 217. Hu Y., Kiely J.M., Szente B.E. et al. E-selectin-dependent signaling via the mitogen- activated protein kinase pathway in vascular endothelial cells. // J Immunol. – 2000. – Vol. 165. №4. – Р. 2142–2148. 218. Hubbard A.K., Rothlein R. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression and cell signaling cascades. // Free Radic Biol Med. – 2000. – Vol. 28. - №9. – Р. 1379–1386. 219. Hughes-Fulford M. Changes in gene expression and signal transduction in microgravity. // J Gravit Physiol. – 2001. – Vol. 8. - №1. – Р. 1–4. 220. Hughes-Fulford M. The role of signaling pathways in osteoblast gravity perception. // J. Gravit. Physiol. – 2002. - Vol. 9. - №1. – P. 257–260. 221. Hughes-Fulford M., Lewis M.L. Effects of microgravity on osteoblast growth activation. // Exp Cell Res. – 1996. – Vol. 224. - №1. – Р. 103–109. 222. Ilan N., Cheung L., Pinter E. et al. Platelet-endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31), a scaffolding molecule for selected catenin family members whose binding is mediated by different tyrosine and serine/threonine phosphorylation. // J Biol Chem. – 2000. - Vol. 275. - №28. – Р. 21435–21443. 148 223. Ilan N., Madri J.A. PECAM-1: old friend, new partners. // Curr Opin Cell Biol. – 2003. - Vol. 15. - №5. – Р. 515 – 524. 224. Infanger M., Kossmehl P., Shakibaei M. et al. Induction of three-dimensional assembly and increase in apoptosis of human endothelial cells by simulated microgravity: impact of vascular endothelial growth factor. // Apoptosis. – 2006. – Vol. 11. - №5. – Р. 749–764. 225. Infanger M., Ulbrich, C., Baatout S. et al. Modeled gravitational unloading induced downregulation of endothelin-1 in human endothelial cells. // J. Cell. Biochem. – 2007. - Vol. 101. №6. – Р. 1439 –1455. 226. Ingber D.E. Cellular tensegrity: defining new rules of biological design that govern the cytoskeleton. // J Cell Sci. – 1993. - Vol. 104. – Р. 613–627. 227. Ingber D.E. Tensegrity I. Cell structure and hierarchical systems biology. // J Cell Sci. – 2003. - Vol. 116. - №7. – Р. 1157–1173. 228. Ivanova O.Y., Margolis L.B., Vasiliev J.M. Effect of colcemid on the spreading of fibroblasts in culture. // Exp Cell Res. – 1976. - Vol. 101. - №1. – Р. 207–219. 229. Iyer S., Ferreri D.M., DeCocco N.C. et al. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2004. - Vol. 286. - №6. – Р. 1143–1153. 230. J Biol Chem. 2001 Aug 3;276(31):29019-27. 231. Jackson D.E., Ward C.M., Wang R. et al. The protein-tyrosine phosphatase SHP-2 binds platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) and forms a distinct signaling complex during platelet aggregation. Evidence for a mechanistic link between PECAM-1- and integrinmediated cellular signaling. // J Biol Chem. – 1997. - Vol. 272. - №11. – Р. 6986–6993. 232. Janmey P.A. The cytoskeleton and cell signaling: component localization and mechanical coupling. // Physiol Rev. – 1998. - Vol. 78. - №3. – Р. 763–781. 233. Johnston B., Butcher E.C. Chemokines in rapid leukocyte adhesion triggering and migration. // Semin Immunol. – 2002. – Vol. 14. - №2. – Р. 83–92. 234. Jones D.A., Abbassi O., McIntire L.V. et al. P-selectin mediates neutrophil rolling on histamine-stimulated endothelial cells. // Biophys J. – 1993. – Vol. 65. - №4. – Р. 1560–1569. 235. Jones S.A., O'Donnell V.B., Wood J.D. et al. Expression of phagocyte NADPH oxidase components in human endothelial cells. // Am J Physiol. – 1996. – Vol. 271. - №4. – Р. 626–634. 236. Jun C.D., Carman C.V., Redick S.D. et al. Ultrastructure and function of dimeric, soluble intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). // J Biol Chem. – 2001. – Vol. 276. - №31. – Р. 29019– 29027. 237. Jun C.D., Carman C.V., Redick S.D. et al. Ultrastructure and function of dimeric, soluble intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). // J Biol Chem. – 2001. – Vol. 276. - №31. – Р. 29019– 29027. 149 238. Jung C.K., Chung S., Lee Y.Y. et al. Monocyte adhesion to endothelial cells increases with hind-limb unloading in rats. // Aviat Space Environ Med. – 2005. – Vol. 76. - №8. – Р. 720–725. 239. Jung U., Norman K.E., Scharffetter-Kochanek K. et al. Transit time of leukocytes rolling through venules controls cytokine-induced inflammatory cell recruitment in vivo. // J Clin Invest. – 1998. – Vol. 102. - №8. – Р. 1526–1533. 240. Kang C.Y., Zou L., Yuan M. et al. Impact of simulated microgravity on microvascular endothelial cell apoptosis. // Eur J Appl Physiol. – 2011. – Vol. 111. - №9. – Р. 213 –2138. 241. Kansas G.S. Selectins and their ligands: current concepts and controversies. // Blood. – 1996. – Vol. 88. - №9. – Р. 3259–3287. 242. Kaplan J., Keogh E.A. Temperature shifts induce the selective loss of alveolar-macrophage plasma membrane components. // J Cell Biol. – 1982. – Vol. 94. - №1. – Р. 12–19. 243. Kaverina I., Rottner K., Small J.V. Targeting, capture, and stabilization of microtubules at early focal adhesions. // J Cell Biol. – 1998. - Vol. 142. - №1. – Р. 181–190. 244. Kaverina I., Rottner K., Small J.V. Targeting, capture, and stabilization of microtubules at early focal adhesions. // J Cell Biol. – 1998. – Vol. 142. - №1. – Р. 181–190. 245. Keelan E.T., Harrison A.A., Chapman P.T. et al. Imaging vascular endothelial activation: an approach using radiolabeled monoclonal antibodies against the endothelial cell adhesion molecule Eselectin. // J Nucl Med. – 1994. – Vol. 35. - №2. – Р. 276–281. 246. Kevil C.G., Oshima T., Alexander J.S. The role of p38 MAP kinase in hydrogen peroxide mediated endothelial solute permeability. // Endothelium. – 2001. – Vol. 8. - №2. – Р. 107–116. 247. Khan B.V., Harrison D.G., Olbrych M.T. et al. Nitric oxide regulates vascular cell adhesion molecule 1 gene expression and redox-sensitive transcriptional events in human vascular endothelial cells. // Proc Natl Acad Sci USA. – 1996. – Vol. 93. - №17. – Р. 9114–9119. 248. Kiemer A.K., Weber N.C., Fürst R. et al. Inhibition of p38 MAPK activation via induction of MKP-1: atrial natriuretic peptide reduces TNF-alpha-induced actin polymerization and endothelial permeability. // Circ Res. – 2002. – Vol. 90. - №8. – Р. 874–881. 249. Kilger G., Needham L.A., Nielsen P.J. et al. Differential regulation of alpha 4 integrin- dependent binding to domains 1 and 4 of vascular cell adhesion molecule-1. // J Biol Chem. – 1995. – Vol. 270. - №11. – Р. 5979–5984. 250. Kirschner M., Mitchison T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. // Cell. – 1986. - Vol. 45. - №3. – Р. 329–342. 251. Kitani A., Nakashima N., Izumihara T. et al. Soluble VCAM-1 induces chemotaxis of Jurkat and synovial fluid T cells bearing high affinity very late antigen-4. // J Immunol. – 1998. – Vol. 161. - №9. – Р. 4931–4938. 252. Koch A.E., Polverini P.J., Kunkel S.L. et al. Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. // Science. – 1992. –Vol. 258. - №5089. – P. 1798–1801. 150 253. Korenaga R., Ando J., Kosaki K. et al. Negative transcriptional regulation of the VCAM-1 gene by fluid shear stress in murine endothelial cells. // Am J Physiol. – 1997. – Vol. 273. - №5. – Р. 1506–1515. 254. Kouklis P., Konstantoulaki M., Malik A.B.VE-cadherin-induced Cdc42 signaling regulates formation of membrane protrusions in endothelial cells. // J Biol Chem. – 2003. - Vol. 278. - №18. – Р. 16230–16236. 255. Kovacs E.M., Goodwin M., Ali R.G. et al. Cadherin-directed actin assembly: E-cadherin physically associates with the Arp2/3 complex to direct actin assembly in nascent adhesive contacts. // Curr Biol. – 2002. - Vol. 12. - №5. – Р. 379–382. 256. Kraft T.F., van Loon J.J, Kiss J.Z. Plastid position in Arabidopsis columella cells is similar in microgravity and on a random-positioning machine. // Planta. – 2000. – Vol. 211. - №3. – Р. 415– 422. 257. Krylyshkina O., Kaverina I., Kranewitter W. et al. Modulation of substrate adhesion dynamics via microtubule targeting requires kinesin-1. // J Cell Biol. – 2002. - Vol. 156. - №2. – Р. 349–359. 258. Lampugnani M.G., Corada M., Andriopoulou P. et al. Cell confluence regulates tyrosine phosphorylation of adherens junction components in endothelial cells. // J Cell Sci. – 1997. – Vol. 110. – Р. 2065–2077. 259. Lampugnani M.G., Resnati M., Raiteri M. et al. A novel endothelial-specific membrane protein is a marker of cell-cell contacts. // J Cell Biol. – 1992. - Vol. 118. - №6. – Р. 1511–1522. 260. Lampugnani M.G., Zanetti A., Breviario F. et al. VE-cadherin regulates endothelial actin activating Rac and increasing membrane association of Tiam. // Mol Biol Cell. – 2002. - Vol. 13. №4. – Р. 1175–1189. 261. Laudanna C., Kim J.Y., Constantin G. et al. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. // Immunol Rev. – 2002. – Vol. 186. – Р. 37–46. 262. Lavoie J.N., Lambert H., Hickey E. et al. Modulation of cellular thermoresistance and actin filament stability accompanies phosphorylation-induced changes in the oligomeric structure of heat shock protein 27. // Mol Cell Biol. – 1995. – Vol. 15. - №1. – Р. 505–516. 263. Lawrence M.B., Springer T.A. Neutrophils roll on E-selectin. // J Immunol. – 1993. – Vol. 151. - №11. – Р. 6338–6346. 264. Lawson C., Ainsworth M., Yacoub M. et al. Ligation of ICAM-1 on endothelial cells leads to expression of VCAM-1 via a nuclear factor-kappaB-independent mechanism. // J Immunol. – 1999. – Vol. 162. - №5. – Р. 2990–2996. 265. Le Duc Q., Shi Q., Blonk I. et al. Vinculin potentiates E-cadherin mechanosensing and is recruited to actin-anchored sites within adherens junctions in a myosin II-dependent manner. // J Cell Biol. – 2010. - Vol. 189. - №7. – Р. 1107–1115. 151 266. Leach C.S. Fluid control mechanisms in weightlessness. // Aviat Space Environ Med. – 1987. – Vol. 58. - №9. – Р. 74–79. 267. Lechleitner S., Gille J., Johnson D.R. et al. Interferon enhances tumor necrosis factor-induced vascular cell adhesion molecule 1 (CD106) expression in human endothelial cells by an interferonrelated factor 1-dependent pathway. // J Exp Med. – 1998. – Vol. 187. - №12. – Р. 2023–2030. 268. Lee T.Y., Gotlieb A.I. Microfilaments and microtubules maintain endothelial integrity. // Microsc Res Tech. – 2003. - Vol. 60. - №1. – Р. 115–127. 269. Leeuwenberg J.F., Jeunhomme T.M., Buurman W.A. Induction of an activation antigen on human endothelial cells in vitro. // Eur J Immunol. – 1989. – Vol. 19. - №4. – Р. 715–720. 270. Leeuwenberg J.F., Smeets E.F., Neefjes J.J. et al. E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 are released by activated human endothelial cells in vitro. // Immunology. – 1992. – Vol. 77. - №4. – Р. 543–549. 271. Levine B.D., Zuckerman J.H., Pawelczyk J.A. Cardiac atrophy after bed-rest deconditioning: a nonneural mechanism for orthostatic intolerance. // Circulation. – 1997. – Vol. 96. - №2. – Р. 517– 525. 272. Levine D.S., Greenleaf J.E. Immunosuppression during spaceflight deconditioning. // Aviat Space Environ Med. – 1998. – Vol. 69. - №2. – Р. 172–177. 273. Lewis M.L., Cubano L.A., Zhao B. et al. cDNA microarray reveals altered cytoskeletal gene expression in space-flown leukemic T lymphocytes (Jurkat). // FASEB J. – 2001. – Vol. 15. - №10. – Р. 1783–1785. 274. Lewis M.L., Reynolds J.L., Cubano L.A. et al. Spaceflight alters microtubules and increases apoptosis in human lymphocytes (Jurkat). // FASEB J. – 1998. – Vol. 12. - №11. – Р. 1007–1018. 275. Li A., Varney M.L., Valasek J. et al. Autocrine role of interleukin-8 in induction of endothelial cell proliferation, survival, migration and MMP-2 production and angiogenesis. // Angiogenesis. – 2005. –Vol. 8. - №1. – P. 63–71. 276. Li A., Dubey S., Varney M.L. et al. IL-8 directly enhanced endothelial cell survival, proliferation, and matrix metalloproteinases production and regulated angiogenesis. // J Immunol. – 2003. – Vol. 170. - №6. – Р. 3369–3376. 277. Li D., Yang B., Mehta J.L. Tumor necrosis factor-alpha enhances hypoxia-reoxygenation- mediated apoptosis in cultured human coronary artery endothelial cells: critical role of protein kinase C. // Cardiovasc Res. – 1999. – Vol. 42. - №3. – Р. 805–813. 278. Li J.M., Shah A.M. Intracellular localization and preassembly of the NADPH oxidase complex in cultured endothelial cells. // J Biol Chem. – 2002. – Vol. 277. - №22. – Р. 19952–19960. 279. Liao G., Nagasaki T., Gundersen G.G. Low concentrations of nocodazole interfere with fibroblast locomotion without significantly affecting microtubule level: implications for the role of dynamic microtubules in cell locomotion. // J Cell Sci. – 1995. - Vol. 108. - №11. – Р. 3473 – 3483. 152 280. Libby P. The active roles of cells of the blood vessel wall in health and disease. // Mol Aspects Med. – 1987. – Vol. 9. - №6. –Р. 499–567. 281. Liu H., Wang Z.C., Yue Y. et al. Simulated microgravity induces an inflammatory response in the common carotid artery of rats. // Can J Physiol Pharmacol. – 2014. – Vol. 92. - №8. – Р. 661– 668. 282. Liu Z., Tan J.L., Cohen D.M. et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2010. - Vol. 107. - №22. – Р. 9944–9949. 283. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. // Methods. – 2001. – Vol. 25. - №4. – Р. 402–408. 284. Lorenzon P., Vecile E., Nardon E. et al. Endothelial cell E- and P-selectin and vascular cell adhesion molecule-1 function as signaling receptors. // J Cell Biol. – 1998. – Vol. 142. - №5. – Р. 1381–1391. 285. Lu T.T., Barreuther M., Davis S. et al. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 is phosphorylatable by c-Src, binds Src-Src homology 2 domain, and exhibits immunoreceptor tyrosine-based activation motif-like properties. // J Biol Chem. – 1997. - Vol. 272. - №22. – Р. 14442–14446. 286. Lum H., Roebuck K.A. Oxidant stress and endothelial cell dysfunction. // Am J Physiol Cell Physiol. – 2001. – Vol. 280. - №4. – Р. 719–41. 287. Lyck R., Reiss Y., Gerwin N. et al. T-cell interaction with ICAM-1/ICAM-2 double-deficient brain endothelium in vitro: the cytoplasmic tail of endothelial ICAM-1 is necessary for transendothelial migration of T cells. // Blood. – 2003. – Vol. 102. - №10. – Р. 3675–3683. 288. Machesky L.M., Mullins R.D., Higgs H.N. et al. Scar, a WASp-related protein, activates nucleation of actin filaments by the Arp2/3 complex. // Proc Natl Acad Sci USA. – 1999. - Vol. 96. №7. – Р. 3739–3744. 289. Machesky L.M., Way M. Actin branches out. // Nature. – 1998. - Vol. 394. - №6689. – Р. 125–126. 290. Mackay F., Loetscher H., Stueber D. et al. Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha)-induced cell adhesion to human endothelial cells is under dominant control of one TNF receptor type, TNFR55. // J Exp Med. – 1993. – Vol. 177. - №5. – Р. 1277–1286. 291. Madge L.A., Pober J.S. A phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway, activated by tumor necrosis factor or interleukin-1, inhibits apoptosis but does not activate NFkappaB in human endothelial cells. // J Biol Chem. – 2000. – Vol. 275. - №20. – Р. 15458–15465. 292. Makó V., Czúcz J., Weiszhár Z. et al. Proinflammatory activation pattern of human umbilical vein endothelial cells induced by IL-1β, TNF-α, and LPS. // Cytometry A. – 2010. – Vol. 77. - №10. – Р. 962–970. 153 293. Mamdouh Z., Mikhailov A., Muller W.A. Transcellular migration of leukocytes is mediated by the endothelial lateral border recycling compartment. // J Exp Med. – 2009. – Vol. 206. - №12. – Р. 2795–2808. 294. Mangeat P., Roy C., Martin M. ERM proteins in cell adhesion and membrane dynamics. // Trends Cell Biol. – 1999. – Vol. 9. - №5. – Р. 187–192. 295. Marco R., Laván D.A., van Loon J.J. et al. Drosophila melanogaster, a model system for comparative studies on the responses to real and simulated microgravity. // J Gravit Physiol. – 2007. - Vol. 14. - №1. – P. 125-126. 296. Mareel M.M., De Mets M. Effect of microtubule inhibitors on invasion and on related activities of tumor cells. // Int Rev Cytol. – 1984. - Vol. 90. – Р. 125–168. 297. Margolis R.L., Wilson L. Microtubule treadmilling: what goes around comes around. // Bioеssays. – 1998. - Vol. 20. - №10. – Р. 830–836. 298. Mariotti M., Maier J.A. Gravitational unloading induces an antiangiogenic phenotype in human microvascular endothelial cells. // J. Cell. Biochem. – 2008. – Vol. 104. - №1. – P. 129– 135. 299. Marui N., Offermann M.K., Swerlick R. et al. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) gene transcription and expression are regulated through an antioxidant-sensitive mechanism in human vascular endothelial cells. // J Clin Invest. – 1993. – Vol. 92. - №4. – Р. 1866–1874. 300. Marui N., Offermann M.K., Swerlick R. et al. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) gene transcription and expression are regulated through an antioxidant-sensitive mechanism in human vascular endothelial cells. // J Clin Invest. – 1993. – Vol. 92. - №4. – Р. 1866–1874. 301. Matheny H.E., Deem T.L., Cook-Mills J.M. Lymphocyte migration through monolayers of endothelial cell lines involves VCAM-1 signaling via endothelial cell NADPH oxidase. // J Immunol. – 2000. – Vol. 164. - №12. – Р. 6550–6559. 302. Matheny H.E., Deem T.L., Cook-Mills J.M. Lymphocyte migration through monolayers of endothelial cell lines involves VCAM-1 signaling via endothelial cell NADPH oxidase. // J Immunol. – 2000. – Vol. 164. - №12. – Р. 6550–6559. 303. Matsuyoshi N., Toda K., Horiguchi Y. et al. In vivo evidence of the critical role of cadherin-5 in murine vascular integrity. // Proc Assoc Am Physicians. – 1997. - Vol. 109. - №4. – Р. 362–371. 304. McCarthy S.A., Kuzu I., Gatter K.C. et al. Heterogeneity of the endothelial cell and its role in organ preference of tumour metastasis. // Trends Pharmacol Sci. – 1991. – Vol. 12. - №12. – Р. 462– 467. 305. McEver R.P. Selectins: lectins that initiate cell adhesion under flow. // Curr Opin Cell Biol. – 2002. – Vol. 14. - №5. – Р. 581–586. 154 306. McEver R.P., Cummings R.D. Perspectives series: cell adhesion in vascular biology. Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte recruitment. // J Clin Invest. – 1997. – Vol. 100. - №3. – Р. 485–491. 307. McKenzie J.A., Ridley A.J. Roles of Rho/ROCK and MLCK in TNF-alpha-induced changes in endothelial morphology and permeability. // J Cell Physiol. – 2007. – Vol. 213. - №1. – Р. 221– 228. 308. Meager A. Cytokine regulation of cellular adhesion molecule expression in inflammation. // Cytokine Growth Factor Rev. – 1999. – Vol. 10. - № 1. – P. 27–39. 309. Meshkov D., Rykova M. The natural cytotoxicity in cosmonauts on board space stations. // Acta Astronaut. – 1995. – Vol. 36. - №8. – Р. 719–726. 310. Mesland D.A. Possible actions of gravity on the cellular machinery. // Adv Space Res. – 1992. – Vol. 12. - №1. – Р. 15–25. 311. Meyers V.E., Zayzafoon M., Douglas J.T. et al. RhoA and cytoskeletal disruption mediate reduced osteoblastogenesis and enhanced adipogenesis of human mesenchymal stem cells in modeled microgravity. // J Bone Miner Res. – 2005. – Vol. 20. - №10. – Р. 1858–1866. 312. Michiels C. Endothelial cell functions. // J Cell Physiol. – 2003. - Vol. 196. – №3. - Р. 430- 443. 313. Michiels C. Endothelial cell functions. // J Cell Physiol. – 2003. – Vol. 196. - №3. – Р. 430– 443. 314. Middleton J., Patterson A.M., Gardner L. et al. Leukocyte extravasation: chemokine transport and presentation by the endothelium. // Blood. – 2002. – Vol. 100. - №12. – Р. 3853–3860. 315. Milici A.J., Furie M.B., Carley W.W. The formation of fenestrations and channels by capillary endothelium in vitro. // Proc Natl Acad Sci USA. – 1985. – Vol. 82. - №18. – Р. 6181– 6185. 316. Milici A.J., Watrous N.E., Stukenbrok H. et al. Transcytosis of albumin in capillary endothelium. // J Cell Biol. – 1987. - Vol. 105. - №6. – Р. 2603–2612. 317. Millán J., Hewlett L., Glyn M. et al. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains. // Nat Cell Biol. – 2006. – Vol. 8. - №2. – Р. 113–123. 318. Millán J., Hewlett L., Glyn M. et al. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains. // Nat Cell Biol. – 2006. – Vol. 8. - №2. – Р. 113–123. 319. Millard T.H., Sharp S.J., Machesky L.M. Signalling to actin assembly via the WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein)-family proteins and the Arp2/3 complex. // Biochem J. – 2004. Vol. 380. - №1. – Р. 1–17. 155 320. Mills P.J., Perez C.J., Adler K.A. et al. The effects of spaceflight on adrenergic receptors and agonists and cell adhesion molecule expression. // J Neuroimmunol. – 2002. – Vol. 132. - №1. – Р. 173–179. 321. Min J.K., Kim Y.M., Kim S.W. et al. TNF-related activation-induced cytokine enhances leukocyte adhesiveness: induction of ICAM-1 and VCAM-1 via TNF receptor-associated factor and protein kinase C-dependent NF-kappaB activation in endothelial cells. // J Immunol. – 2005. – Vol. 175. - №1. – Р. 531–540. 322. Min J.K., Kim Y.M., Kim S.W. et al. TNF-related activation-induced cytokine enhances leukocyte adhesiveness: induction of ICAM-1 and VCAM-1 via TNF receptor-associated factor and protein kinase C-dependent NF-kappaB activation in endothelial cells. // J Immunol. – 2005. – Vol. 175. - №1. – Р. 531–540. 323. Minami T., Aird W.C. Endothelial cell gene regulation. // Trends Cardiovasc Med. – 2005. – Vol. 15. - №5. – Р. 174–184. 324. Mitchison T.J., Kirschner M.W. Dynamic instability of microtubule growth. // Nature. – 1984. -Vol. 312. - №5991. – Р. 237–242. 325. Mochly-Rosen D., Henrich C.J., Cheever L. et al. A protein kinase C isozyme is translocated to cytoskeletal elements on activation. // Cell Regul. – 1990. – Vol. 1. - №9. – Р. 693–706. 326. Mohan S., Mohan N., Sprague E.A. Differential activation of NF-kappa B in human aortic endothelial cells conditioned to specific flow environments. // Am J Physiol. – 1997. - Vol. 273. №2. – Р. 572–578. 327. Molony L., Armstrong L. Cytoskeletal reorganizations in human umbilical vein endothelial cells as a result of cytokine exposure. // Exp Cell Res. – 1991. – Vol. 196. - №1. – Р. 40–48. 328. Moore T.P., Thornton W.E. Space shuttle inflight and postflight fluid shifts measured by leg volume changes. // Aviat Space Environ Med. – 1987. – Vol. 58. - №9. – Р. 91–96. 329. Moos P.J., Graft K., Edwards M. et al. Gravity-inducedchanges in microtubule formation. // ASGSB Bulletin. – 1988. – Vol. 2. – Р. 55. 330. Muid S., Froemming G.R.A., Manaf A. et al. Сhanges in protein and gene expression of adhesion molecules and cytokines of endothelial cells immediately following short-term spaceflight travel. // Gravitational and Space Biology. – 2010. – Vol. 23. - №2. – Р. 1–11. 331. Munro J.M., Pober J.S., Cotran R.S. Tumor necrosis factor and interferon-gamma induce distinct patterns of endothelial activation and associated leukocyte accumulation in skin of Papio anubis. // Am J Pathol. – 1989. – Vol. 135. - №1. – Р. 121–133. 332. Murti K.G., Kaur K., Goorha R.M. Protein kinase C associates with intermediate filaments and stress fibers. // Exp Cell Res. – 1992. – Vol. 202. - №1. – Р. 36–44. 333. Nathan C., Sporn M. Cytokines in context. // J Cell Biol. – 1991. – Vol. 113. - №5. – Р. 981– 986. 156 334. Navasiolava N.M., Dignat-George F., Sabatier F. et al. Enforced physical inactivity increases endothelial microparticle levels in healthy volunteers. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. – 2010. – Vol. 299. - №2. – Р. 248–256. 335. Nollet F., Kools P., van Roy F. Phylogenetic analysis of the cadherin superfamily allows identification of six major subfamilies besides several solitary members. // J Mol Biol. – 2000. - Vol. 299. - №3. – Р. 551–572. 336. Noren N.K., Niessen C.M., Gumbiner B.M. et al. Cadherin engagement regulates Rho family GTPases. // J Biol Chem. – 2001. - Vol. 276. - №36. – Р. 33305–33308. 337. Nwariaku F.E., Chang J., Zhu X. et al. The role of p38 map kinase in tumor necrosis factor- induced redistribution of vascular endothelial cadherin and increased endothelial permeability. // Shock. – 2002. – Vol. 18. - №1. – Р. 82–85. 338. Nwariaku F.E., Liu Z., Zhu X. et al. NADPH oxidase mediates vascular endothelial cadherin phosphorylation and endothelial dysfunction. // Blood. – 2004. – Vol. 104. - №10. – Р. 3214–3220. 339. Nwariaku F.E., Liu Z., Zhu X. et al. Tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and the regulation of microvascular permeability. // Surgery. – 2002. – Vol. 132. - №2. – Р. 180–185. 340. O'Keeffe L.M., Muir G., Piterina A.V. et al. Vascular cell adhesion molecule-1 expression in endothelial cells exposed to physiological coronary wall shear stresses. // J Biomech Eng. – 2009. – Vol. 131. - №8. 341. Orsenigo F., Giampietro C., Ferrari A. et al. Phosphorylation of VE-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo. // Nat Commun. – 2012. – Vol. 3. - №1208. – Р. 1–15. 342. Osawa M., Masuda M., Harada N. et al. Tyrosine phosphorylation of platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1, CD31) in mechanically stimulated vascular endothelial cells. // Eur J Cell Biol. – 1997. - Vol. 72. - №3. – Р. 229–237 343. Osawa M., Masuda M., Kusano K. et al. Evidence for a role of platelet endothelial cell adhesion molecule-1 in endothelial cell mechanosignal transduction: is it a mechanoresponsive molecule? // J Cell Biol. – 2002. - Vol. 158. - №4. – Р. 773–785. 344. Osborn L., Hession C., Tizard R. et al. Direct expression cloning of vascular cell adhesion molecule 1, a cytokine-induced endothelial protein that binds to lymphocytes. // Cell. – 1989. – Vol. 59. - №6. – Р. 1203–1211. 345. Osborn L., Vassallo C., Benjamin C.D. Activated endothelium binds lymphocytes through a novel binding site in the alternately spliced domain of vascular cell adhesion molecule-1. // J Exp Med. – 1992. –Vol. 176. - №1. – Р. 99–107. 346. Papaseit C., Pochon N., Tabony J. Microtubule self-organization is gravity-dependent. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2000. – Vol. 97. - №15. – Р. 8364–8368. 157 347. Papatheodorou L., Weiss N. Vascular oxidant stress and inflammation in hyperhomocysteinemia. // Antioxid Redox Signal. – 2007. – Vol. 9. - №11. – Р. 1941–1958. 348. Parker C.G., Hunt J., Diener K. et al. Identification of stathmin as a novel substrate for p38 delta. Biochem Biophys Res Commun. – 1998. – Vol. 249. - №3. – Р. 791–796. 349. Pavalko F.M., Otey C.A. Role of adhesion molecule cytoplasmic domains in mediating interactions with the cytoskeleton. // Proc Soc Exp Biol Med. – 1994. – Vol. 205. - №4. – Р. 282– 293. 350. Perez M., Donato N.J. Activation of epidermal growth factor receptor tyrosine phosphorylation by tumor necrosis factor correlates with loss of cytotoxic activity. // J Interferon Cytokine Res. – 1996. – Vol. 16. - №4. – Р. 307–314. 351. Pertz O., Bozic D., Koch A.W. et al. A new crystal structure, Ca2+ dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin homoassociation. // EMBO J. – 1999. Vol. 18. - №7. – Р. 1738–1747. 352. Peter K., Nawroth P., Conradt C. et al. Circulating vascular cell adhesion molecule-1 correlates with the extent of human atherosclerosis in contrast to circulating intercellular adhesion molecule-1, E-selectin, P-selectin, and thrombomodulin. // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 1997. – Vol. 17. -№3. – Р. 505–512. 353. Petrache I., Birukova A., Ramirez S.I. et al. The role of the microtubules in tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial cell permeability. // Am J Respir Cell Mol Biol. – 2003. – Vol. 28. №5. – Р. 574–581. 354. Petrache I., Crow M.T., Neuss M. et al. Central involvement of Rho family GTPases in TNF- alpha-mediated bovine pulmonary endothelial cell apoptosis. // Biochem Biophys Res Commun. – 2003. – Vol. 306. - №1. – Р. 244–249. 355. Petrache I., Verin A.D., Crow M.T. et al. Differential effect of MLC kinase in TNF-alpha- induced endothelial cell apoptosis and barrier dysfunction. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2001. – Vol. 280. - №6. – Р. 1168–1178. 356. Phelps J.E., DePaola N. Spatial variations in endothelial barrier function in disturbed flows in vitro. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. – 2000. - Vol. 278. - №2. – Р. 469–476. 357. Piga R., Naito Y., Kokura S. et al. Short-term high glucose exposure induces monocyte- endothelial cells adhesion and transmigration by increasing VCAM-1 and MCP-1 expression in human aortic endothelial cells. // Atherosclerosis. – 2007. – Vol. 193. - №2. – Р. 328–334. 358. Pober J.S., Gimbrone M.A. Jr., Lapierre L.A. et al. Overlapping patterns of activation of human endothelial cells by interleukin 1, tumor necrosis factor, and immune interferon. // J Immunol. – 1986. – Vol. 137. - №6. – Р. 1893–1896. 158 359. Pober J.S., Lapierre L.A., Stolpen A.H. et al. Activation of cultured human endothelial cells by recombinant lymphotoxin: comparison with tumor necrosis factor and interleukin 1 species. // J Immunol. – 1987. – Vol. 138. - №10. – Р. 3319–3324. 360. Polte T., Newman W., Raghunathan G. et al. Structural and functional studies of full-length vascular cell adhesion molecule-1: internal duplication and homology to several adhesion proteins. // DNA Cell Biol. – 1991. – Vol. 10. - №5. – Р. 349–357. 361. Pruyne D., Evangelista M., Yang C. et al. Role of formins in actin assembly: nucleation and barbed-end association. // Science. – 2002. – Vol. 297. - №5581. – Р. 612–615. 362. Quagliaro L., Piconi L., Assaloni R. et al. Intermittent high glucose enhances ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin expression in human umbilical vein endothelial cells in culture: the distinct role of protein kinase C and mitochondrial superoxide production. // Atherosclerosis. – 2005. – Vol. 183. - №2. – Р. 259–267. 363. Reinhardt P.H., Kubes P. Differential leukocyte recruitment from whole blood via endothelial adhesion molecules under shear conditions. // Blood. – 1998. – Vol. 92. - №12. – Р. 4691–4699. 364. Ribatti D., Nico B., Vacca A. et al. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. // J Hematother Stem Cell Res. – 2002. – Vol. 11. - №1. – Р. 81–90. 365. Ridley A.J.Rho family proteins: coordinating cell responses. // Trends Cell Biol. – 2001. – Vol. 11. - №12. – Р. 471–477. 366. Rijken P.J., de Groot R.P., Kruijer W. et al. Altered gravity conditions affect early EGF- induced signal transduction in human epidermal A431 cells. // ASGSB Bull. – 1992. – Vol. 5. - №2. – Р. 77–82. 367. Rinnerthaler G., Geiger B., Small J.V. Contact formation during fibroblast locomotion: involvement of membrane ruffles and microtubules. // J Cell Biol. – 1988. -Vol. 106. - №3. – Р. 747– 760. 368. Risau W. Induction of blood-brain barrier endothelial cell differentiation. // Ann NY Acad Sci. – 1991. – Vol. 633. – Р. 405–419. 369. Risau W., Flamme I. Vasculogenesis. // Annu Rev Cell Dev Biol. – 1995. – Vol. 11. – Р. 73– 91. 370. Roebuck K.A., Finnegan A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. // J Leukoc Biol. – 1999. – Vol. 66. - №6. – Р. 876–888. 371. Romanov Y., Kabaeva N., Buravkova L. Simulated hypogravity stimulates cell spreading and wound healing in cultured human vascular endothelial cells. // J Gravit Physiol. – 2000. – Vol. 7. №2. – P. 77–78. 372. Romanov Y.A., Buravkova L.B., Rikova M.P. et al. Expression of cell adhesion molecules and lymphocyte-endothelium interaction under simulated hypogravity in vitro. // J Gravit Physiol. – 2001. – Vol. 8. - №1. – P. 5–8. 159 373. Rose M.L. Endothelial cells as antigen-presenting cells: role in human transplant rejection. // Cell Mol Life Sci. – 1998. – Vol. 54. - №9. – Р. 965–978. 374. Rosenblatt J., Peluso P., Mitchison T.J. The bulk of unpolymerized actin in Xenopus egg extracts is ATP-bound. // Mol Biol Cell. – 1995. - Vol. 6. - №2. – Р. 227–236. 375. Rubenstein P.A., Spudich J.A. Actin microheterogeneity in chick embryo fibroblasts. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1977. - Vol. 74. - №1. – Р. 120–123. 376. Rubenstein P.A., Spudich J.A. Actin microheterogeneity in chick embryo fibroblasts. // Proc Natl Acad Sci USA. – 1977. – Vol. 74. - №1. – Р. 120–123. 377. Sack F.D. Plant gravity sensing. // Int Rev Cytol. – 1991. – Vol. 127. – Р. 193–252. 378. Sangha D.S., Han S., Purdy R.E. Simulated microgravity upregulates an endothelial vasoconstrictor prostaglandin. // J. Appl. Physiol. – 2001. - Vol. 91. – №2. – Р. 789 –796. 379. Sano H., Nakagawa N., Chiba R. et al. Cross-linking of intercellular adhesion molecule-1 induces interleukin-8 and RANTES production through the activation of MAP kinases in human vascular endothelial cells. // Biochem Biophys Res Commun. – 1998. – Vol. 250. - №3. – Р. 694– 698. 380. Sarkar D., Nagaya T., Koga K. et al. Culture in vector-averaged gravity under clinostat rotation results in apoptosis of osteoblastic ROS 17/2.8 cells. // J Bone Miner Res. – 2000. – Vol. 15. - №3. – Р. 489–498. 381. Saxton W.M., Stemple D.L., Leslie R.J. et al. Tubulin dynamics in cultured mammalian cells. // J Cell Biol. – 1984. – Vol. 99. - №6. – Р. 2175–2186. 382. Schafer D.A., Cooper J.A. Control of actin assembly at filament ends. // Annu. Rev. Cell Dev. – 1995. - Vol. 11. – Р. 497–518. 383. Schafer D.A., Welch M.D., Machesky L.M. et al. Visualization and molecular analysis of actin assembly in living cells. // J Cell Biol. – 1998. - Vol. 143. - №7. – Р. 1919–1930. 384. Schatten H., Chakrabarti A., Taylor M. et al. Effects of spaceflight conditions on fertilization and embryogenesis in the sea urchin Lytechinus pictus. // Cell Biol Int. – 1999. – Vol. 23. - №6. – Р. 407–415. 385. Scheglovitova O.N., Romanov Y.A., Maksianina E.V. et al. Herpes simplex type I virus infected human vascular endothelial cells induce the production of anti-viral and proinflammatory factors by peripheral blood leukocytes in vitro. // Russ J Immunol. – 2002. – Vol. 7. - №2. – Р. 115– 122. 386. Schiffrin E.L. The endothelium and control of blood vessel function in health and disease. // Clin. Invest. Med. – 1994. - Vol. 17. - №6. – Р. 602– 620. 387. Seynhaeve A.L., Rens J.A., Schipper D. et al. Exposing endothelial cells to tumor necrosis factor-α and peripheral blood mononuclear cells damage endothelial integrity via interleukin-1ß by degradation of vascular endothelial-cadherin. // Surgery. – 2014. – Vol. 155. - №3. – Р. 545–553. 160 388. Shapiro L., Fannon A.M., Kwong PD. et al. Structural basis of cell-cell adhesion by cadherins. // Nature. – 1995. – Vol. 374. - №6520. – Р. 327–337. 389. Shimoyama Y., Tsujimoto G., Kitajima M. et al. Identification of three human type-II classic cadherins and frequent heterophilic interactions between different subclasses of type-II classic cadherins. // Biochem J. – 2000. - Vol. 349. – Р. 159–167. 390. Singh R.K., Bucana C.D., Gutman M. et al. Organ site-dependent expression of basic fibroblast growth factor in human renal cell carcinoma cells. // Am J Pathol. – 1994. – Vol. 145. №2. – Р. 365–374. 391. Small J.V. The actin cytoskeleton. // Electron Microsc Rev. – 1988. - Vol. 1. - №1. – Р. 155– 174. 392. Small J.V., Rottner K., Kaverina I. et al. Assembling an actin cytoskeleton for cell attachment and movement. // Biochim Biophys Acta. – 1998. – Vol. 1404. - №3. – Р. 271–281. 393. Smith C.W., Marlin S.D., Rothlein R. et al. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J Clin Invest. – 1989. – Vol. 83. - №6. – Р. 2008–2017. 394. Sofronova S.I., Tarasova O.S., Gaynullina D. et al. Spaceflight on the Bion-M1 biosatellite alters cerebral artery vasomotor and mechanical properties in mice. // J Appl Physiol. – 2015. – Vol. 118. - №7. – Р. 830–838. 395. Spisni E., Toni M., Strillacci A. et al. Caveolae and caveolae constituents in mechanosensing: effect of modeled microgravity on cultured human endothelial cells. // Cell Biochem Biophys. – 2006. – Vol. 46. - №2. – Р. 155–164. 396. Sporn L.A., Foster T.H. Photofrin and light induces microtubule depolymerization in cultured human endothelial cells. // Cancer Res. – 1992. – Vol. 52. - №12. – Р. 3443–3448. 397. Staunton D.E., Marlin S.D., Stratowa C. et al. Primary structure of ICAM-1 demonstrates interaction between members of the immunoglobulin and integrin supergene families. // Cell. – 1988. – Vol. 52. - №6. – Р. 925–933. 398. Staunton D.E., Merluzzi V.J., Rothlein R. et al. A cell adhesion molecule, ICAM-1, is the major surface receptor for rhinoviruses. // Cell. – 1989. – Vol. 56. - №5. – Р. 849–853. 399. Stehbens S.J., Paterson A.D., Crampton M.S. et al. Dynamic microtubules regulate the local concentration of E-cadherin at cell-cell contacts. // J Cell Sci. – 2006. - Vol. 119. - №9. – Р. 1801– 1811. 400. Stowe R.P., Sams C.F., Mehta S.K. et al. Leukocyte subsets and neutrophil function after short-term spaceflight. // J Leukoc Biol. – 1999. – Vol. 65. - №2. – Р. 179–186. 401. Stroka K.M., Vaitkus J.A., Aranda-Espinoza H. Endothelial cells undergo morphological, biomechanical, and dynamic changes in response to tumor necrosis factor-α. // Eur Biophys J. – 2012. – Vol. 41. - №11. – Р. 939–947. 161 402. Sukharev S.I., Blount P., Martinac B. et al. Mechanosensitive channels of Escherichia coli: the MscL gene, protein, and activities. // Annu Rev Physiol. – 1997. - Vol. 59. – Р. 633–657. 403. Sung H.J., Yee A., Eskin S.G. et al. Cyclic strain and motion control produce opposite oxidative responses in two human endothelial cell types. // Am J Physiol Cell Physiol. – 2007. – Vol. 293. - №1. – Р. 87–94. 404. Sung H.J., Yee A., Eskin S.G. et al. Cyclic strain and motion control produce opposite oxidative responses in two human endothelial cell types. // Am J Physiol Cell Physiol. – 2007. – Vol. 293. - №1. – Р. 87–94. 405. Svitkina T.M., Borisy G.G. Progress in protrusion: the tell-tale scar. // Trends Biochem. Sci. – 1999. - Vol. 24. - №11. – Р. 432–436. 406. Svitkina T.M., Bulanova E.A., Chaga O.Y. et al. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network. // J Cell Biol. – 2003. - Vol.160. - №3. – Р. 409–421. 407. Takeuchi S., Kawashima S., Rikitake Y. et al. Cerivastatin suppresses lipopolysaccharide- induced ICAM-1 expression through inhibition of Rho GTPase in BAEC. // Biochem Biophys Res Commun. – 2000. – Vol. 269. - №1. – Р. 97–102. 408. Taylor G.R., Janney R.P. In vivo testing confirms a blunting of the human cell-mediated immune mechanism during space flight. // J Leukoc Biol. – 1992. – Vol. 51. - №2. –Р. 129–132. 409. Thomas S.M., Soriano P., Imamoto A. Specific and redundant roles of Src and Fyn in organizing the cytoskeleton. // Nature. – 1995. – Vol. 376. - №6537. – Р. 267–271. 410. Thomas-Ecker S., Lindecke A., Hatzmann W. et al. Alteration in the gene expression pattern of primary monocytes after adhesion to endothelial cells. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2007. – Vol. 104. - №13. – Р. 5539–5544. 411. Thompson P.W., Randi A.M., Ridley A.J. Intercellular adhesion molecule (ICAM)-1, but not ICAM-2, activates RhoA and stimulates c-fos and rhoA transcription in endothelial cells. // J Immunol. – 2002. – Vol. 169. - №2. – Р. 1007–1013. 412. Tiruppathi C., Naqvi T., Sandoval R. et al. Synergistic effects of tumor necrosis factor-alpha and thrombin in increasing endothelial permeability. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2001. – Vol. 281. - №4. – Р. 958–968. 413. Todd P. Gravity-dependent phenomena at the scale of the single cell. // ASGSB Bull. – 1989. – Vol. 2. – Р. 95–113. 414. Tummala P.E., Chen X.L., Sundell C.L. et al. Angiotensin II induces vascular cell adhesion molecule-1 expression in rat vasculature: A potential link between the renin-angiotensin system and atherosclerosis. // Circulation. – 1999. – Vol. 100. -№11. – Р. 1223–1229. 415. Tzima E. Role of small GTPases in endothelial cytoskeletal dynamics and the shear stress response. // Circ Res. – 2006. - Vol. 98. - №2. – Р. 176–185. 162 416. Tzima E., Del Pozo M.A., Kiosses W.B. et al. Activation of Rac1 by shear stress in endothelial cells mediates both cytoskeletal reorganization and effects on gene expression. // EMBO J. – 2002. - Vol. 21. - №24. – Р. 6791–6800. 417. Tzima E., Del Pozo M.A., Shattil S.J. et al. Activation of integrins in endothelial cells by fluid shear stress mediates Rho-dependent cytoskeletal alignment. // EMBO J. – 2001. - Vol. 20. №17. – Р. 4639–4647. 418. Tzima E., Irani-Tehrani M., Kiosses W.B. et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. // Nature. – 2005. - Vol. 437. - №7057. – Р. 426431. 419. Ulbrich C., Westphal K., Baatout S. et al. Effects of basic fibroblast growth factor on endothelial cells under conditions of simulated microgravity. // J. Cell. Biochem. – 2008. – Vol. 104. - №4. – P. 1324–1341. 420. Ulbrich C., Pietsch J., Grosse J. et al. Differential gene regulation under altered gravity conditions in follicular thyroid cancer cells: relationship between the extracellular matrix and the cytoskeleton. // Cell Physiol Biochem. – 2011. – Vol. 28. - №2. – Р. 185–198. 421. Ulbrich C., Wehland M., Pietsch J. et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. // Biomed Res Int. – 2014. - Vol. 2014. – 15 р. 422. Unsworth B.R., Lelkes P.I. Growing tissues in microgravity. // Nat Med. – 1998. – Vol. 4. - №8. – Р. 901–907. 423. Uva B.M., Masini M.A., Sturla M. et al. Clinorotation-induced weightlessness influences the cytoskeleton of glial cells in culture. // Brain Res. – 2002. – Vol. 934. - №2. – Р. 132–139. 424. Van Horck F.P., Ahmadian M.R., Haeusler L.C. et al. Characterization of p190RhoGEF, a RhoA specific guanine nucleotide exchange factor that interacts with microtubules. // J Biol Chem. – 2001. - Vol. 276. - №7. – Р. 4948–4956. 425. Van Loon J.J.W.A. Some history and use of the random positioning machine, RPM, in gravity related research. // Adv. in Space Res. - 2007. - Vol. 39. - P. 1161–1165. 426. van Wetering S., van den Berk N., van Buul J.D. et al. VCAM-1-mediated Rac signaling controls endothelial cell-cell contacts and leukocyte transmigration. // Am J Physiol Cell Physiol. – 2003. – Vol. 285. - №2. – Р. 343–352. 427. Vanden Berghe W., Vermeulen L., De Wilde G. et al. Signal transduction by tumor necrosis factor and gene regulation of the inflammatory cytokine interleukin-6. Biochem Pharmacol. – 2000. – Vol. 60. - №8. – Р. 1185–1195. 428. Vassy J., Portet S., Beil M. et al. The effect of weightlessness on cytoskeleton architecture and proliferation of human breast cancer cell line MCF-7. // FASEB J. – 2001. – Vol. 15. - №6. – Р. 1104–1116. 163 429. Verin A.D., Birukova A., Wang P. et al. Microtubule disassembly increases endothelial cell barrier dysfunction: role of MLC phosphorylation. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2001. Vol. 281. №3. – Р. 565–574. 430. Verin A.D., Gilbert-McClain L.I., Patterson C.E. et al. Biochemical regulation of the nonmuscle myosin light chain kinase isoform in bovine endothelium. // Am J Respir Cell Mol Biol. – 1998. - Vol. 19. - №5. – Р. 767–776. 431. Versari S., Villa A., Bradamante S. et al. Alterations of the actin cytoskeleton and increased nitric oxide synthesis are common features in human primary endothelial cell response to changes in gravity. // Biochim. Biophys. Acta – 2007. - Vol. 1773. - №11. – Р. 1645–1652. 432. Versari S., Villa A., Bradamante S. et al. Alterations of the actin cytoskeleton and increased nitric oxide synthesis are common features in human primary endothelial cell response to changes in gravity. // Biochim Biophys Acta. – 2007. – Vol. 1773. - №11. – Р. 1645–1652. 433. Vestweber D. Lymphocyte trafficking through blood and lymphatic vessels: more than just selectins, chemokines and integrins. // Eur J Immunol. – 2003. – Vol. 33. - №5. – Р. 1361–1364. 434. Villa A., Versari S., Maier J.A. et al. Cell behavior in simulated microgravity: a comparison of results obtained with RWV and RPM. // Gravit Space Biol Bull. – 2005. – Vol. 18. - №2. – Р. 89– 90. 435. Vincent P.A., Xiao K., Buckley K.M. et al. VEcadherin: adhesion at arm’s length. // Am J Physiol Cell Physiol. – 2004. - Vol. 286. - №5. – Р. 987–997. 436. Vogetseder W., Dierich M.P. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1, CD 54) is associated with actin-filaments. // Immunobiology. – 1991. – Vol. 182. - №2. – Р. 143–151. 437. Voraberger G., Schäfer R., Stratowa C. Cloning of the human gene for intercellular adhesion molecule 1 and analysis of its 5'-regulatory region. Induction by cytokines and phorbol ester. // J Immunol. – 1991. – Vol. 147. - №8. – Р. 2777–2786. 438. Walker R.A., O’Brien E.T., Pryer N.K. et al. Dynamic instability of individual microtubules analysed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. // J Cell Biol. – 1988. Vol. 107. - №4. – Р.1437–1448. 439. Wang Q., Doerschuk C.M. The p38 mitogen-activated protein kinase mediates cytoskeletal remodeling in pulmonary microvascular endothelial cells upon intracellular adhesion molecule-1 ligation. // J Immunol. – 2001. – Vol. 166. - №11. – Р. 6877–6884. 440. Wang Y., Miller A.L., Mooseker M.S. et al. The Abl-related gene (Arg) nonreceptor tyrosine kinase uses two F-actin-binding domains to bundle F-actin. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2001. – Vol. 98. - №26. – Р. 14865–1470. 441. Watson T., Goon P.K., Lip G.Y. Endothelial progenitor cells, endothelial dysfunction, inflammation, and oxidative stress in hypertension. // Antioxid Redox Signal. – 2008. – Vol. 10. №6. – Р. 1079–1088. 164 442. Wegner A. Treadmilling of actin at physiological salt concentrations. An analysis of the critical concentrations of actin filaments. // J Mol Biol. – 1982. - Vol. 161. - №4. – Р. 607–615. 443. Wehland M., Ma X., Braun M. et al. The impact of altered gravity and vibration on endothelial cells during a parabolic flight. // Cell Physiol Biochem. – 2013. – Vol. 31. – Р. 432–451. 444. Weinbaum S., Tarbell J.M., Damiano E.R. The structure and function of the endothelial glycocalyx layer. // Annu Rev Biomed Eng. – 2007. - Vol. 9. – Р. 121–167. 445. Weis W.I., Nelson W.J. Re-solving the cadherin-catenin-actin conundrum. // J Biol Chem. – 2006. – Vol. 281. - №47. – Р. 35593–35597. 446. Welch M.D., Mallavarapu A., Rosenblatt J. et al. Actin dynamics in vivo. // Curr Opin Cell Biol. – 1997. - Vol. 9. - №1. – Р. 54–61. 447. Whalen R.G., Butler-Browne G.S., Gros F. Protein synthesis and actin heterogeneity in calf muscle cells in culture. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1976. - Vol. 73. - №6. –Р. 2018—2022. 448. Wójciak-Stothard B., Entwistle A., Garg R. et al. Regulation of TNF-alpha-induced reorganization of the actin cytoskeleton and cell-cell junctions by Rho, Rac, and Cdc42 in human endothelial cells. // J Cell Physiol. – 1998. – Vol. 176. - №1. – Р. 150–165. 449. Wójciak-Stothard B., Entwistle A., Garg R. et al. Regulation of TNF-alpha-induced reorganization of the actin cytoskeleton and cell-cell junctions by Rho, Rac, and Cdc42 in human endothelial cells. // J Cell Physiol. – 1998. – Vol. 176. - №1. – Р. 150–165. 450. Wójciak-Stothard B., Williams L., Ridley A.J. Monocyte adhesion and spreading on human endothelial cells is dependent on Rho-regulated receptor clustering. // J Cell Biol. – 1999. – Vol. 145. - №6. – Р. 1293–1307. 451. Wong M.K., Gottlieb A.I. Endothelial monolayer integrity. Perturbation of F actin filaments and the dense peripheral band-vinculin network. // Arteriosclerosis. – 1990. - Vol. 10. - №1. – Р. 76– 84. 452. Woodman C.R., Sebastian L.A., Tipton C.M. Influence of simulated microgravity on cardiac output and blood flow distribution during exercise. // J Appl Physiol. – 1985. – Vol. 79. - №5. – Р. 1762–1768. 453. Wung B.S., Ni C.W., Wang D.L. ICAM-1 induction by TNFalpha and IL-6 is mediated by distinct pathways via Rac in endothelial cells. // J Biomed Sci. – 2005. – Vol. 12. - №1. – Р. 91–101. 454. Yanagisawa M., Kaverina I.N., Wang A. et al. A novel interaction between kinesin and p120 modulates p120 localization and function. // J Biol Chem. – 2004. - Vol. 279. - №10. – Р. 9512– 9521. 455. Yang J., Furie B.C., Furie B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. // Thromb Haemost. – 1999. – Vol. 81. - №1. – Р. 1–7. 165 456. Yang L., Froio R.M., Sciuto T.E. et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. // Blood. – 2005. – Vol. 106. - №2. – Р. 584–592. 457. Yokoo T., Kitamura M. IL-1beta depresses expression of the 70-kilodalton heat shock protein and sensitizes glomerular cells to oxidantinitiated apoptosis. // J. Immunol. – 1997. – Vol. 159. – Р. 2886–2892. 458. Yoshida M., Westlin W.F., Wang N. et al. Leukocyte adhesion to vascular endothelium induces E-selectin linkage to the actin cytoskeleton. // J Cell Biol. – 1996. – Vol. 133. - №2. – Р. 445–455. 459. Young B.A., Wang P., Goldblum S.E. The counteradhesive protein SPARC regulates an endothelial paracellular pathway through protein tyrosine phosphorylation. // Biochem Biophys Res Commun. – 1998. – Vol. 251. - №1. – Р. 320–327. 460. Young L.R., Oman C.M., Merfeld D. et al. Spatial orientation and posture during and following weightlessness: human experiments on Spacelab Life Sciences 1. // J Vestib Res. – 1993. Vol. 3. – Р. 231-239. 461. Zhang R., Jia G., Bao J. et al. Increased vascular cell adhesion molecule-1 was associated with impaired endothelium-dependent relaxation of cerebral and carotid arteries in simulated microgravity rats. // J Physiol Sci. – 2008. – Vol. 58. - №1. – Р. 67–73. 462. Zhang Y., Hamill O.P. On the discrepancy between whole-cell and membrane patch mechanosensitivity in Xenopus oocytes. // J Physiol. – 2000. - Vol. 523. - №1. – Р. 101–115. 463. Zhao R.Z., Chen X., Yao Q. et al. TNF-alpha induces interleukin-8 and endothelin-1 expression in human endothelial cells with different redox pathways. // Biochem Biophys Res Commun. – 2005. – Vol. 327. - №4. – Р. 985–992. 464. Zhou J., Jin Y., Gao Y. et al. Genomic-scale analysis of gene expression profiles in TNF- alpha treated human umbilical vein endothelial cells. // Inflamm Res. – 2002. – Vol. 51. - №7. – Р. 332–341. 166
