Автореферат - - Казанский государственный
реклама
На правах рукописи ЩЕГЛОВА НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА МикроРНК И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ИХ БИОГЕНЕЗА В ПАТОГЕНЕЗЕ АТЕРОСКЛЕРОЗА 14.03.03 - Патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Казань – 2015 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тверской государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Калинкин Михаил Николаевич Официальные оппоненты: Галагудза Михаил Михайлович, доктор медицинских наук, директор Института экспериментальной медицины Федерального государственного бюджетного учреждения «Северо-западный федеральный медицинский исследовательский центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Дунаев Павел Дмитриевич, кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры общей патологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Защита состоится «___» _________ 2015 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 б и на сайте www.kgmu.kcn.ru. Автореферат разослан «___» ________ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Зубаирова Л.Д. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) лидируют в структуре причин смертности населения экономически развитых стран. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, во всем мире от этой патологии ежегодно умирает более 17 млн. человек (World health statistics, 2014). В Российской Федерации болезни системы кровообращения обусловливают около половины всех смертельных исходов. По официальной статистике смертность от ССЗ остается одной из самых высоких в нашей стране, так за 2012 год она составила 737,1 случая на 100 тыс. населения (Здравоохранение в России, 2013). Основные типы цереброваскулярные гипертоническую болезней заболевания, болезнь (ГБ). системы кровообращения ишемическую Процессы болезнь включают сердца атеросклероза, (ИБС), тромбоза и артериальной гипертензии составляют патоморфологическую основу заболеваний сердечно-сосудистой системы, а нарушение мозгового кровообращения и ИБС – наиболее частые причины летальных исходов (Корягина Н.А., 2012; Торшин И.Ю., 2008). В конце XX века на основе результатов ряда значительных эпидемиологических исследований была разработана концепция факторов риска развития атеросклероза и ИБС. Дальнейшее развитие этих представлений позволило признать, что болезни системы кровообращения являются результатом взаимодействия наследственных (генетических) факторов и внешних воздействий, реализующих генетическую предрасположенность (Оганов Р.Г., 2008). Последнее десятилетие XX века стало временем активного внедрения молекулярно-генетических методов исследования в кардиологию. Это связано с тем, что знание генотипических характеристик пациента позволяет не только оценить риск жизнеугрожающих состояний, но и правильно определить тактику их профилактики. Кроме того, многочисленные исследования показали, что 4 изменение генной экспрессии играет важную патофизиологическую роль в развитии и прогрессировании ССЗ (Companioni O., 2011; Roberts R., 2014; Sivapalaratnam S., 2011). Особый интерес в молекулярно-генетических исследованиях уделяется вопросам, связанным с участием в биологических и патологических процессах микрорибонуклеиновых кислот (микроРНК). В настоящее время известно, что микроРНК могут участвовать в таких патологических процессах, как онкогенез, ангиогенез, гипертрофия миокарда (Meola N., 2009; Thum T., 2011). МикроРНК – это малые некодирующие молекулы рибонуклеиновых кислот (РНК), обычно длиной 19-24 нуклеотида, образуемые из более длинных РНКпредшественников, действие которых опосредовано их неполной гибридизацией с 3'-нетранслируемой области целевой матричной РНК (Мглинцев В.А., 2012; Рогаев Е.И., 2008; Shah A.A., 2010). Разработка и внедрение в лабораторную практику методов, позволяющих определять уровень специфических микроРНК в физиологических жидкостях, позволяет исследовать и использовать потенциал циркулирующих микроРНК в качестве новых маркеров заболеваний (Федоров А.В., 2012). Степень разработанности темы В настоящее время проводятся многочисленные исследования с целью изучения роли микроРНК в молекулярно-генетических механизмах развития ССЗ. Появляются новые данные о различных биологических эффектах микроРНК на компоненты сердечно-сосудистой системы. Согласно литературным источникам, нарушение функционирования определенных микроРНК может способствовать развитию таких патологических состояний как ИБС, постинфарктное ремоделирование миокарда и его сократительная дисфункция, хроническая сердечная недостаточность (Fasarano P., 2010; Stather P.W., 2013; Stefano V.D., 2011). Вместе с тем, следует указать, что количественные и качественные характеристики экспрессии микроРНК в различные периоды развития 5 атеросклероза в литературе отсутствуют. В связи с этим проведение подобных исследований представляется, безусловно, актуальным, особенно с учетом распространенности атеросклероза и его осложнений в популяции и необходимости разработки эффективных методов их терапии и профилактики. Цель исследования - выяснить в условиях выраженного атеросклероза состояние экспрессии особенности проангиогенных полиморфизмов генов и их антиангиогенных биогенеза и микроРНК, представить патофизиологический анализ значения полученных данных. Задачи исследования: 1) Определить уровень микроРНК в плазме крови у больных ГБ и ИБС постинфарктным кардиосклерозом (ИБС ПИКС). 2) Изучить характер изменения проангиогенных (miR-126, miR-155) и антиангиогенных (miR-221, miR-222) микроРНК в плазме крови у человека в условиях атерогенеза. 3) Изучить качественные характеристики плазменных микроРНК у больных ГБ и ИБС ПИКС. 4) Определить существование взаимосвязи между частотой встречаемости полиморфизмов генов биогенеза микроРНК AGO1, DGCR8, GEMIN3, GEMIN4, DROSHA и частотой случаев ГБ и ИБС ПИКС. 5) Представить обоснование патофизиологической значимости выявленных изменений молекулярно-генетического аппарата в развитии атеросклероза и его осложнений. Научная новизна 1) Впервые изучены количественные и качественные характеристики плазменных микроРНК в условиях прогрессирующего атерогенеза у человека. 2) Впервые исследованы особенности полиморфизмов генов, регулирующих биогенез микроРНК, при осложненном развитии атеросклероза у человека. 3) Впервые обосновано представление об одном из вариантов конкретного участия микроРНК в патогенезе атеросклероза у человека. 6 Теоретическая и практическая значимость работы Результаты настоящего исследования вносят вклад в учение о молекулярногенетических механизмах ССЗ. Полученные данные расширяют представление о роли микроРНК в атерогенезе и его последствиях. Анализ результатов работы позволяет признать возможность их использования для поиска генетических предикторов осложненного течения атеросклероза и формирования новых представлений о патогенетической терапии ГБ и ИБС. Методология и методы исследования Для решения поставленных задач проведено лабораторное и молекулярногенетическое обследование 65 мужчин. Объект исследования – здоровые мужчины и пациенты кардиологического отделения ГБУЗ Областной клинической больницы города Тверь. Предмет исследования – особенности участия микроРНК и генов их биогенеза в молекулярно-генетических механизмах развития атеросклероза. Достоверность полученных данных подтверждена методами математической статистики. Положения, выносимые на защиту: 1) Длительное и осложненное развитие атеросклероза у человека сопровождается повышением в плазме крови содержания проангиогенной miR-126 и доминирующим нарастанием концентрации антиангиогенных miR-221 и miR-222. 2) Среди полиморфизмов генов AGO1, DGCR8, GEMIN3, GEMIN4 и DROSHA, регулирующих биогенез микроРНК у человека, только генотип АА гена GEMIN4 коррелирует с частотой ГБ - ведущего фактора развития атеросклероза. Личный вклад диссертанта Участие автора в диссертационном исследовании выразилось в планировании исследования, наборе материала, проведении молекулярногенетических исследований, обобщении и статистическом анализе полученных 7 данных. Лично автором выполнены все молекулярно-генетические тесты, включая выделение микроРНК, проведение обратной транскрипции и полимеразно-цепной реакции. Автором подготовлены статьи, опубликованные в изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов для опубликования научных результатов диссертаций. Этический комитет заключил, что проведение настоящей работы соответствует этическим нормам, принятым для данного типа исследований. Степень достоверности и апробация результатов исследования О достоверности представленных результатов диссертационного исследования свидетельствуют электронная база исходных данных (65 человек), современные молекулярно-генетические методы исследования, корректные методы статистической обработки полученных данных. Основные материалы работы доложены и обсуждены на расширенном заседании кафедры патологической физиологии Государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Тверской государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 11 от 01.06.2015) Результаты исследования представлены на V Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых «Симбиоз-Россия 2012» (Тверь, 2012); V Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2013» (СанктПетербург, 2013); I межвузовской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и медицинская наука» (Тверь, 2013); IX международной научно-практической конференции «Внезапная смерть: от критериев риска к профилактике» практической (Санкт-Петербург, конференции 2014); «Внезапная IX смерть: Международной от критериев научнориска к профилактике» (Санкт-Петербург, 2014); IV съезде физиологов СНГ (Сочи Дагомыс, 2014). Публикации: по теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских 8 рецензируемых научных журналов для опубликования основных результатов диссертационных исследований на соискание ученой степени доктора и кандидата наук. Объем и структура диссертации: работа изложена на 91 странице машинописного текста, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и списка иллюстративного материала. Работа содержит 25 таблиц и 8 рисунков. Список литературы включает 151 источник (51 отечественный и 100 зарубежных). ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В исследование были включены 65 мужчин, 50 из которых находились на стационарном лечении в кардиологическом отделении ГБУЗ Областной клинической больницы города Твери, и 15 здоровых мужчин. Сформированы выборки из трех групп сравнения. В I группу (группа контроля) включили 15 здоровых мужчин от 29 до 47 лет (средний возраст 33,93±1,14 лет). II группа состояла из 30 пациентов, страдающих ГБ в возрасте от 29 до 65 лет (средний возраст 47,73±1,97 лет). Критерии групповой принадлежности: мужской пол и наличие ГБ I-II стадии с артериальной гипертензией 2 степени (максимальные цифры артериального давления 179/109 мм рт. ст.) без систолической дисфункции миокарда левого желудочка (Чазова И.Е., 2010) и отсутствие на момент обследования диагноза ИБС. В III группу были включены 20 мужчин, имеющих в анамнезе подтвержденный клинически и лабораторно инфаркт миокарда в возрасте от 46 до 84 лет (средний возраст 60,4±1,9 лет). Критерии включения в данную группу больных: наличие верифицированного диагноза ИБС ПИКС. Все больные на момент исследования получали сходную терапию, определяемую стандартами лечения Всероссийского научного общества кардиологов (Оганов Р.Г., 2009). Критерии исключения: лица, страдающие сахарным диабетом и другими эндокринопатиями, сопутствующими заболеваниями почек, легких, желудочно- 9 кишечного тракта, печени, заболеваниями крови, наследственными болезнями и нарушениями обмена веществ, отягощенным аллергологическим анамнезом, аллергическими заболеваниями и имеющие профессиональные вредности. Все обследуемые клинически характеризовались следующими параметрами: возраст, вес, рост, показатели общего холестерина (ОХС) и холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП). Используя антропометрические данные, рассчитывали индекс массы тела (ИМТ) по классической формуле: ИМТ = m тела (кг)/ рост2 (м). Для оценки атерогенности липидного обмена использовали коэффициент атерогенности (КА), который рассчитывали по классической формуле (1): КА = (ОХС – ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП (1) Молекулярно-генетические методы Генетические исследования были проведены на базе молекулярногенетической лаборатории ГБОУ ВПО Тверской ГМУ Минздрава России (руководитель – профессор Калинкин М.Н.). Из цельной крови выделяли геномную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) с последующим генотипированием. Всем больным в плазме крови определяли следующие микроРНК: проангиогенные miR-126 и miR-155; антиангиогенные miR-221 и miR-222. Тотальная РНК, включая микроРНК, была получена комбинированным методом из плазмы крови с помощью набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) и лизирующего реагента TRIzol® LS Reagent (Invitrogen, США), описанным в англоязычной литературе (Keller A., 2011; Shah A.A.; 2012). Для образцов тотальной микроРНК с концентрациями от 25 нг/мкл проводили обратную транскрипцию на четырехканальном амплификаторе «Veriti» («Applied Biosystems», США) для получения комплементарной ДНК (кДНК) с использованием набора TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit 10 («Applied Biosystems», США) по стандартной схеме, представленной производителем. Далее проводили ПЦР в режиме реального времени по стандартному протоколу, предложенному производителем, с помощью набора Taq Man Small RNA Assays («Applied Biosystems», США) с применением полученной кДНК и праймеров miR-126, 155, 221, 222. В качестве эндогенного контроля использовали праймер RNU6B, результаты амплификации которого использовали для нормировки (Lamba V., 2014; Song J., 2012). Тотальную геномную ДНК выделяли из цельной венозной крови сорбентным методом с использованием набора «Diatom DNA Prep 100» («Лаборатория «Изоген», Россия). В ходе генотипирования определяли однонуклеотидные полиморфизмы генов, участвующих в биогенезе микроРНК, AGO1, DGCR8, GEMIN3, GEMIN4, DROSHA с помощью ПЦР с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора праймеров и аллель-специфических гибридизационных зондов («Applied Biosystems», США). В качестве детектирующего амплификатора использовали систему регистрации ПЦР «ABI Prism 7500» («Applied Biosystems», США). Методы статистической обработки Математико-статистическая обработка результатов исследования, их отображение и визуализация проводились на персональном компьютере IBM PC с использованием табличного процессора Microsoft Excel, системы компьютерной математики и моделирования MATLAB с пакетами расширения Statistics Toolbox и Bioinformatics Toolbox фирмы Math Works и пакета «SPSS 19.0» (Безруков Н.С., 2006). Расчет частот встречаемости гомозигот и гетерозигот проводился путем построения таблицы сопряженности с последующим применением закона ХардиВайнберга и использованием метода χ2 с помощью программы DeFinetti, размещенной в свободном доступе на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия). Оценку риска проводили с помощью показателя отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (ДИ). 11 Для расчета количественного изменения микроРНК использовали метод 2 ∆∆Сt - , предложенный K.J. Livak и T.D. Schmittgen (Livak K., 2001). ΔΔCt рассчитывается по формуле (2): ΔΔCt = (CtmiR – CtRNU6B)опытный образец – (CtmiR – CtRNU6B)контрольный образец (2) Ct – пороговое значение цикла, полученное в ходе проведения ПЦР, где флуоресценция впервые фиксируется достоверно выше порогового уровня (Liu Z.R., 2009; Navidshad B., 2012). Достоверным считали повышение или понижение уровня экспрессии исследуемой микроРНК в пять и более раз по отношению к контрольному образцу (Шевченко С. П., 2012). Для оценки статистической значимости разности средних в двух группах при нормальном распределении признака для независимых переменных использовался t-критерий Стьюдента. При распределении, отличающемся от нормального, проводили попарное сравнение с помощью непараметрического Uкритерия Манна-Уитни. За уровень статистической значимости принимали p<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Характеристика некоторых показателей липидного метаболизма При анализе показателей ИМТ для больных ГБ и ИБС ПИКС у 96% данных пациентов была обнаружена избыточная массы тела по сравнению со здоровыми людьми. Средние показатели ИМТ были достоверно выше в группах ГБ и ИБС ПИКС в сравнении с группой контроля (р<0,001). Уровни концентрации плазменного ОХС в группах ГБ и ИБС ПИКС статистически значимо превышали (р<0,001) его количество в крови здоровых людей (рисунок 1). Одновременно с этим, в группе ИБС ПИКС определялось достоверное снижение ХС ЛПВП по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы (р<0,001). ОХС, ммоль/л 12 7 6 5 4 3 2 1 0 5,83** 5,67* Группа контроля 3,74 Больные ГБ Больные ИБС ПИКС Группы исследования * - статистическая значимость различий (р<0,001) между группой больных ГБ и контрольной, ** - статистическая значимость различий (р<0,001) между группой больных ИБС ПИКС и контрольной Рисунок 1 – Сравнительные показатели концентрации ОХС у здоровых людей и в группах больных ГБ и ИБС ПИКС Как в группе ГБ, так и в группе ИБС ПИКС наблюдалось статистически достоверное повышение КА по сравнению с его величиной у здоровых людей (р<0,001). Обобщая вышеизложенное, можно сделать заключение о наличии выраженного манифестирующего атеросклероза у обследованных пациентов, что подтверждается существованием атерогенных расстройств липидного обмена, таких как гиперхолестеринемия, гипоальфалипопротеинемия, высокий показатель КА, избыточная масса тела, а также сформированной артериальной гипертензией и хронической сердечной недостаточностью, возникшей вследствие расстройств коронарного кровоснабжения. Изучение полиморфизмов генов AGO1, DGCR8, GEMIN3, GEMIN4, DROSHA у больных ГБ и ИБС ПИКС В проведенном исследовании распределение частот генотипов вышеперечисленных генов в исследуемых выборках соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Статистического различия между частотой встречаемости полиморфизмов генов AGO1, DGCR8, GEMIN3, DROSHA и частотой случаев ГБ и ИБС ПИКС у мужчин получено не было. 13 Обнаружена ассоциация между частотой распределения генотипов и аллелей полиморфизма гена GEMIN4 и частотой развития ГБ. Данные представлены в таблице 1. Таблица 1 – Частота генотипов и аллелей полиморфизма гена GEMIN4, ассоциированных с ГБ Распределение генотипов, n (%) Ген Генотип Группа контроля, Больные ГБ, n = 30 n = 15 Генотип AA Генотип GG GEMIN4 Генотип AG Критерий n % n % 3 20,0 17 56,7 5 33,3 5 16,7 7 46,7 8 26,6 Аллель А 0,433 0,700 Аллель G 0,567 0,300 различий OR (95% при df=1, CI) χ2 (p) 5,23 (1,22 – 2,45) 4,21 0,40 (0,040) * (0,09-1,69) 0,42 (0,11-1,52) 3,05 5,98 (1,23 – 7,57) (0,014) * 0,33 (0,13 – 0,81) Примечание: OR – отношение шансов, CI – 95% доверительный интервал, * - статистическая значимость различий (р<0,05). Так, носительство аллеля А и генотипа АА в настоящем исследовании увеличивает частоту случаев ГБ в 3,05 и 5,23 раз. В тоже время носители генотипов AG и GG имеют пониженный риск развития ГБ (OR=0,42 и 0,4), также как и носители аллеля G (OR=0,33). В связи с этим, генотип АА гена GEMIN4 можно представить в качестве генотипа риска развития ГБ. Связь между полиморфизмом гена GEMIN4 и риском развития ИБС ПИКС не установлена. 14 Таким образом, только частота гомозиготного носительства мажорного аллеля А гена GEMIN4 в настоящем исследовании коррелирует с частотой случаев развития ГБ. Обобщая вышеизложенное, можно заключить, что анализ комбинации неблагоприятных генотипов по генам биогенеза микроРНК позволяет выделить среди больных группы с низким, средним и высоким риском развития различных проявлений выраженного атеросклероза. Показатели уровня экспрессии miR-126, miR-155, miR-221, miR-222 у больных ГБ и ИБС ПИКС Согласно современным представлениям, изменение уровня экспрессии только одной микроРНК не может быть надежным индикатором развития патологического состояния организма. Только изменение уровня экспрессии сразу нескольких микроРНК может иметь значение в диагностике заболеваний (Шевченко С. П., 2012). В таблице 2 показано, что у больных ГБ уровень экспрессии проангиогенной miR-126 оказался в 256 раз выше по сравнению с контрольной группой, а у больных ИБС ПИКС этот показатель оказался выше почти в 267 раз. Таблица 2 – Показатели уровня экспрессии miR-126 у больных ГБ и ИБС ПИКС Исследуемая группа ΔCt (M±m) ΔΔCt 2-∆∆Ct Больные ГБ (n = 30) Больные ИБС ПИКС (n = 20) -9,71±0,74 -8,00 256,00 -9,77±0,92 -8,06 266,87 Примечание: ΔCt = (CtmiR-126 – CtRNU6B), ΔΔCt - разность между значениями ΔCt исследуемого образца и контрольного, 2-∆∆Ct – формула для подсчета уровня экспрессии исследуемой микроРНК. Прямые доказательства участия данной микроРНК в патогенезе ССЗ в литературе отсутствуют, хотя по данным некоторых авторов miR-126 может играть важную роль в сосудистой патологии и процессах внутрисосудистого ремоделирования (Hu J., 2015; Hulsmans M., 2013; Jiang Y., 2014). 15 Анализ таблицы 3 показывает, что уровень проангиогенной miR-155 в плазме крови остается неизменным как в группе ГБ, так и у больных ИБС ПИКС. Таблица 3 – Показатели уровня экспрессии miR-155 у больных ГБ и ИБС ПИКС Исследуемая группа ΔCt (M±m) ΔΔCt 2-∆∆Ct Больные ГБ (n = 30) Больные ИБС ПИКС (n = 20) -4,23±0,61 -1,20 2,29 -5,02±0,94 -1,90 3,73 Примечание: ΔCt = (CtmiR-155 – CtRNU6B), ΔΔCt - разность между значениями ΔCt исследуемого образца и контрольного, 2-∆∆Ct – формула для подсчета уровня экспрессии исследуемой микроРНК. В тоже время, было установлено, что уровень экспрессии антиангиогенной miR-221 оказался в 195 раз выше у больных ГБ и в 261 раз выше у больных ИБС ПИКС по сравнению с аналогичными показателями контрольной группой (таблица 4). Таблица 4 – Показатели уровня экспрессии miR-221 у больных ГБ и ИБС ПИКС Исследуемая группа ΔCt (M±m) ΔΔCt 2-∆∆Ct Больные ГБ (n = 30) Больные ИБС ПИКС (n = 20) -8,54±0,98 -7,61 195,36 -8,96±1,13 -8,03 261,38 Примечание: ΔCt = (CtmiR-221 – CtRNU6B), ΔΔCt - разность между значениями ΔCt исследуемого образца и контрольного, 2-∆∆Ct – формула для подсчета уровня экспрессии исследуемой микроРНК. Достоверность оценки результатов данного исследования согласуется с рядом литературных данных, указывающих, что уровень miR-221 повышается в интиме после повреждения стенки сосуда, а также участвует в подавлении пролиферации эндотелиальных клеток и процессах ангиогенеза (Leung A., 2013; Staszel T., 2011). 16 Как показано в таблице 5, уровень экспрессии антиангиогенной miR-222 увеличивается в 213 раз у больных ГБ и в 196 раз у больных ИБС ПИКС по сравнению с используемыми нами контрольными данными. Таблица 5 – Показатели уровня экспрессии miR-222 у больных ГБ и ИБС ПИКС Исследуемая группа ΔCt (M±m) ΔΔCt 2-∆∆Ct Больные ГБ (n = 30) Больные ИБС ПИКС (n = 20) -7,81±0,59 -7,74 213,78 -7,69±0,81 -7,62 196,72 Примечание: ΔCt = (CtmiR-222 – CtRNU6B), ΔΔCt - разность между значениями ΔCt исследуемого образца и контрольного, 2-∆∆Ct – формула для подсчета уровня экспрессии исследуемой микроРНК. Следует отметить, что роль miR-222 в патологии сердечно-сосудистой системы в литературе не обозначена. Соответствующей информации в доступной нами литературе обнаружено не было. Проведение попарного сравнения показателей ΔCt контрольной группы с группами ГБ и ИБС ПИКС с помощью U-критерия Манна-Уитни подтверждает правильность сделанных выводов о значимой роли miR-126, miR-221, miR-222 в патогенезе атеросклероза и его осложнений (таблица 6). Таблица 6 – Сравнение показателей ΔCt в контрольной группе, у больных ГБ и ИБС ПИКС с помощью U-критерия Манна-Уитни (M±δ) Показатель Группа контроля Больные ГБ Больные ИБС ПИКС (n = 15) (n = 30) (n = 20) ΔCt miR-126 -1,71±3,37 -9,71±4,03* -9,77±4,10** ΔCt miR-155 -3,12±1,33 -4,23±3,36 -5,02±4,22 ΔCt miR-221 -0,93±2,47 -8,54±5,36* -8,96±5,07** ΔCt miR-222 -0,07±2,73 -7,81±3,24 * -7,69±3,63** Примечание: * – статистическая значимость различий (р<0,001) между группой больных ГБ и контрольной, ** – статистическая значимость различий (р<0,001) между группой больных ИБС ПИКС и контрольной. 17 Так, согласно данным проведенных нами исследований обнаружено, что уровни экспрессии miR-126, miR-221, miR-222 у больных ГБ и ИБС ПИКС достоверно превышают аналогичные показатели контрольной группы здоровых людей. С другой стороны, достоверного изменения уровня экспрессии miR-155 в настоящем исследовании получено не было. Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют заключить, что уровни экспрессии проангиогенных miR-126, и антиангиогенных miR-221, miR-222 у больных ГБ и ИБС ПИКС достоверно превышают аналогичные показатели контрольной группы здоровых людей. С другой стороны, изменение уровня экспрессии miR-155 не удалось ассоциировать с изученными нами заболеваниями, что, возможно, указывает на отсутствие выраженной роли miR-155 в патогенезе атеросклероза. Качественные характеристики miR-126, miR-155, miR-221, miR-222 у больных ГБ и ИБС ПИКС Для определения взаимосвязей между изучаемыми микроРНК в исследуемых группах был проведен корреляционный анализ Спирмена и рассчитан коэффициент ковариации (Сошникова Л.А., 1999). В качестве специфического интегрального портрета исследуемых групп, отражающего взаимосвязи микроРНК в пределах выборки, использовалась ковариационная матрица, полученная при сведении в единую таблицу коэффициентов ковариации. Ниже приведены интегральные портреты исследуемых групп (рисунки 3 – 5). Анализ интегрального портрета контрольной группы здоровых людей, изображенного на рисунке 2, позволяет заключить, что доминирующая роль в этой группе отводится экспрессии проангиогенной miR-126. 18 а) б) Рисунок 2 – Портрет группы контроля: а) объёмная визуализация ковариационной матрицы микроРНК; б) линии одинакового уровня На рисунке 3 изображен интегральный портрет группы больных ГБ, при анализе которого можно сделать вывод, что в изучаемой группе доминирующее положение занимает антиангиогенная miR-221. а) б) Рисунок 3 – Портрет группы больных ГБ: а) объёмная визуализация ковариационной матрицы микроРНК; б) линии одинакового уровня При анализе рисунка 4, отражающего интегральный портрет группы больных ИБС ПИКС, можно заключить, что в этой группе в спектре изучаемых микроРНК, доминирует антиангиогенная miR-221. 19 а) б) Рисунок 4 – Портрет группы больных ИБС ПИКС: а) объёмная визуализация ковариационной матрицы микроРНК; б) линии одинакового уровня Таким образом, сравнение интегральных портретов исследуемых групп, изображенных на рисунках 2, 3 и 4, отражающих взаимосвязи микроРНК, позволяет сделать вывод о доминировании в контрольной группе проангиогенной miR-126, а в группах больных ГБ и ИБС ПИКС – антиангиогенной miR-221. Для подтверждения характера изменчивости спектра микроРНК, входящих в состав выборки группы пациентов, была рассчитана дисперсия. При сведении в единую таблицу дисперсий микроРНК, в порядке их убывания, были получены аналогичные данные о превалировании miR-126 в группе здоровых людей и miR-221 в группах ГБ и ИБС ПИКС (таблица 7). Таблица 7 – Дисперсии микроРНК главных диагоналей ковариационных матриц исследуемых групп пациентов Группа Группа контроля Больные ГБ Больные ИБС ПИКС МикроРНК (дисперсия) miR-126 miR-222 miR-221 miR-155 (11,38) (7,46) (6,13) ( 1,78) miR-221 miR-126 miR-155 miR-222 ( 28,7) (20,79) (13,26) (9,97) miR-221 miR-126 miR-155 miR-222 (27,02) (18,36) (17,82) (8,09) 20 На рисунке 5 в обобщенном виде показано распределение дисперсии микроРНК по группам пациентов. 35 30 25 miR-126 Дисперсия 20 miR-155 15 miR-221 10 miR-222 5 0 Группа контроля Больные ГБ Больные ИБС ПИКС Рисунок 5 – Распределение дисперсии микроРНК в группе контрольной группе и у больных ГБ и ИБС ПИКС Можно предположить, что преобладание экспрессии miR-126 в группе здоровых людей связано с ее постоянным и стабильным влиянием в физиологических условиях на процесс пролиферации эндотелиоцитов (Hu J., 2015; Hulsmans M., 2013). Доминирование антиангиогенной miR-221 у больных ГБ и ИБС ПИКС, по-видимому, может рассматриваться как ответная реакция в ответ на атероматозную альтерацию интимы артерий при ГБ и ИБС ПИКС. На данный факт указывают и другие авторы (Leung A., 2013; Staszel T., 2011). В тоже время антиангиогенная занимает miR-222 последнее место в спектре доминирования исследуемых микроРНК у больных ГБ и ИБС ПИКС, что вступает в определенное противоречие с проведенными нами рассуждениями патофизиологического характера. Тем не менее, выявление в настоящем исследовании различий в экспрессионной иерархии различных микроРНК в норме и в условиях атерогенеза имеет, безусловно, патофизиологическую перспективу в изучении молекулярных основ развития атеросклероза и его осложнений. 21 ВЫВОДЫ 1) В условиях прогрессирующего развития атеросклероза у человека существенно изменяются количественные и качественные параметры соотношения микроРНК в плазме крови. 2) При изучении проангиогенных микроРНК в плазме крови при ГБ и ИБС ПИКС повышается уровень miR-126. При этом значительно возрастает содержание и антиангиогенных плазменных микроРНК - miR-221 и miR222, что свидетельствует о проявлении одного из компенсаторноприспособительных механизмов при атеросклерозе у человека. 3) В группе здоровых людей установлено преобладание среди плазменных микроРНК проангиогенной miR-126. В тоже время в условиях атерогенеза у человека выявлено доминирование антиангиогенной miR-221, что подтверждает долговременное включение защитных сосудистых реакций при атеросклерозе. 4) При изучении полиморфизмов генов, регулирующих биогенез микроРНК, выявлено существование достоверных ассоциаций между частотой гомозиготного носительства мажорного аллеля А гена GEMIN4 и частотой встречаемости ГБ, ведущего фактора развития атеросклероза. Достоверной корреляции между полиморфизмами других генов биогенеза микроРНК, а именно AGO1, DGCR8, GEMIN3, DROSHA и частотой ГБ и ИБС ПИКС не установлено. 5) Полученные результаты обосновывают представление о патофизиологической роли ряда компонентов молекулярно-генетического аппарата человека, а, именно, miR-126, miR-221, miR-222 и полиморфизма гена их биогенеза GEMIN4 в выраженной стадии атерогенеза. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1) В плазме крови больных ГБ и ИБС ПИКС обнаружено выраженное изменение экспрессии ряда микроРНК, а именно miR-126, miR-221 и miR222. Данные результаты настоящего исследования обосновывают 22 целесообразность клинической проверки возможного использования определения плазменных микроРНК в качестве маркеров осложненного развития атеросклероза. 2) Установление существования корреляции между частотой гомозиготного носительства аллеля А гена GEMIN4 и частотой встречаемости ГБ может быть использовано в области поиска доказательного генотипирования риска развития ГБ и ИБС. Список работ по теме диссертации 1) Щеглова, Н.Е. Влияние полиморфизма гена AGO1 на уровень холестерина крови / Н.Е. Всероссийского Щеглова с // Симбиоз-Россия международным участием 2012: Материалы V медико-биологического конгресса молодых ученых. – Тверь: Заповедник времени, 2012. – С. 283284. 2) Щеглова, Н.Е. Влияние экспрессии микроРНК 221/222 на уровень холестерина крови / Н.Е. Щеглова // Тезисы V Международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения – 2013». – Санкт-Петербург, 2013. – С. 223-224. 3) Щеглова, Н.Е Влияние полиморфизма гена DROSHA на уровень холестерина крови / Н.Е. Щеглова // Материалы I межвузовской научнопрактической конференции молодых ученых «Молодежь и медицинская наука». – Тверь: Ред.-изд. Центр Твер. гос. Мед. акад., 2013. – С.122-123. 4) Щеглова, Н.Е Особенности полиморфизмов генов AGO1, DGCR8, GEMIN4, DROSHA у больных с гипертонической болезнью и постинфарктным кардиосклерозом / Н.Е. Щеглова, М.Н. Калинкин // Российский медико-биологический вестник. – 2014. - №2. – С. 7-11. 5) Щеглова, Н.Е. Особенности содержания миРНК-126, 155, 221, 222 в плазме крови у мужчин с гипертонической болезнью и постинфарктным кардиосклерозом/ Н.Е. Щеглова, М.Н. Калинкин // Трансляционная медицина: тезисы 9-й международной научно-практической конференции 23 «Внезапная смерть: от критериев риска к профилактике». – СПб., 2014. – Приложение 2. – С. 26. 6) Щеглова, Н.Е Особенности содержания микроРНК в сыворотке крови у больных гипертонической болезнью и постинфарктным кардиосклерозом / Н.Е. Щеглова, М.Н. Калинкин / Научные труды IV Съезда физиологов СНГ. – М.:Медицина – Здоровье, 2014. – С.87-88. 7) Щеглова, Н.Е Особенности экспрессии проангиогенных miR-126 и miR155 у больных с гипертонической болезнью и постинфарктным кардиосклерозом / Н.Е. Щеглова, М.Н. Калинкин // Врач – аспирант. – 2015. - №2. – С. 104-108. 8) Щеглова, Н.Е. Качественные характеристики miR-126, miR-155, miR221, miR-222 у больных гипертонической болезнью и постинфарктным кардиосклерозом / Н.Е. Щеглова, М.Н. Калинкин // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 2. - Режим доступа: http://www.science-education.ru/122-19412 (дата обращения: 29.05.2015). СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ГБ гипертоническая болезнь ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота ИБС ишемическая болезнь сердца ИМТ индекс массы тела КА коэффициент атерогенности кДНК комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота микроРНК микрорибонуклеиновая кислота ОХС общий холестерин ПИКС постинфарктный кардиосклероз РНК рибонуклеиновая кислота ССЗ сердечно-сосудистые заболевания ХС ЛПВП холестерин липопротеинов высокой плотности