иммуногенетические и метаболические звенья патогенеза
advertisement
1 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранению Российской Федерации На правах рукописи Турмова Екатерина Павловна АТЕРОСКЛЕРОЗ: ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ЗВЕНЬЯ ПАТОГЕНЕЗА (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология 14.03.03 - Патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Маркелова Елена Владимировна доктор медицинских наук, профессор Владивосток– 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение………………………………………………………………...... Глава 1. Современное представление возникновения и о развития 4 механизмах атеросклероза (литературный обзор) ……………………………………… 15 1.1 Актуальность.………………………………………………… 15 1.2 Факторы риска атеросклероза ………………………………. 16 1.3 Теории атеросклероза ………………………………………... 20 1.4 Патогенез атеросклероза …………………………………….. 23 1.5 Роль цитокинов и матриксных металлопротеиназ в патогенезе атеросклероза ………………………………......... 31 1.6 Значение адипокинов в патогенезе атеросклероза ………… 43 1.7 Генетические маркеры атеросклероза ……………………… 48 1.8 Экспериментальная диагностика атеросклероза, подходы к патогенетической терапии…………………………………… 55 Глава 2. Направления, материалы и методы исследования……. 62 2.1 Методы клинических исследований, характеристика исследуемого материала…………………………………. 69 2.2 Контингент, материалы и методы экспериментального исследования………………………………………………… 71 Глава 3. Собственные исследования ……………………………….. 77 3.1. Цитокины – их роль в патогенезе атеросклероза…………… 77 3.1.1 Оценка цитокинового профиля сыворотке крови пациентов с атеросклерозом……………………………………………… 3.2 Роль биохимических маркеров 80 воспаления (металлопротеиназы-9 (ММР-9), тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 типа (TIMP-1), комплексов (ММР9/TIMP-1, ММР-9/TIMP-2) и адипокинов (лептина и адипонектина) в патогенезе атеросклероза ………………… 118 3 3.2.1 Оценка содержания ММР-9, TIMP-1, ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 в сыворотке крови при атеросклерозе … 3.2.2 Определение (лептина содержания и гормонов адипонектина) в жировой сыворотке ткани крови при атеросклерозе…….............................................................. 3.3. Оценка полиморфизма генов интерлейкинов: 120 133 TNF-α (-308G/A), IL-6 (-174G/C), TGFB1 (-509 C/T) и IL-10 (-1082 G/A) и гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) при атеросклерозе………………………………………………… 142 3.4. Экспериментальная модель атеросклероза………………… 157 3.4.1 Патогенетическое обоснование применения иммуномодулирующей терапии при экспериментальном атеросклерозе………………………………………………… 176 Заключение……………………………………………………………… 188 Выводы……………………………………………………………………. 236 Практические рекомендации ………………………………………. 239 Список сокращений и условных обозначений …………………….. 240 Список литературы…………………………………………………….. 242 4 Введение Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Проблема атеросклероза (АС) является одной из самых актуальных в современной медицине в связи с его широкой распространенностью, продолжительностью латентного периода течения и выраженностью неблагоприятных исходов. Согласно статистическим расчетам пропорция смертности в 1990 к 2020 году в мире от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), среди которых ведущее место занимает атеросклероз продолжает возрастать от 28 % до 31,5% [227]. По данным Минздрава России - смертность от ССЗ составляет 57%, причем, почти 20% из этого числа умирают в трудоспособном возрасте [50]. Мультифокальность атеросклеротического поражения проявляется разнообразной клинической симптоматикой, среди которой ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает 60%, системные поражения артерий регистрируются в 20%. Облитерирующий АС нижних конечностей, как правило, является проявлением распространенного поражения артерий и имеет высокий риск сердечно-сосудистых осложнений [70]. В течение последних десятилетий стало ясно, что АС характеризуется комплексом эндокринных, паракринных и юкстакринных перекрестных взаимосвязей между иммунными и васкулярными клетками практически во всех тканях и органах организма, включая мозг, печень, сердце, почки, жировую ткань, надпочечники, поджелудочную железу, и половые органы [322]. Согласно воспалительной теории АС, основным звеном его патогенеза является иммуноопосредованное повреждение артерий с аутоиммунным компонентом [10, 297, 384, 395, 432]. Важные механизмы патогенеза АС – активация лейкоцитов, их миграция в артериальную стенку, нарушение обмена липопротеидов, пролиферация и модификация макрофагов и гладкомышечных клеток, процессы ремоделирования и тромбообразования регулируются 5 цитокинами на всех этапах повреждения (от инициации до развития осложнений) как у человека, так и у животных [25, 47, 322]. Однако до настоящего времени сохраняется противоречивость мнений в отношении роли цитокиновой регуляции в атерогенезе и взаимосвязях системы цитокинов с показателями липидного метаболизма, оксидативной активности, с маркерами деградации межклеточного матрикса и адипокинами при различной локализации и степени активности атеросклеротического процесса. Цель исследования Выявить закономерности и особенности иммуногенетических и метаболических звеньев патогенеза при разных клинических вариантах атеросклероза и экспериментально обосновать применение амино-диоксотетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-α-D-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus. Задачи исследования: 1. Оценить значение изменений содержания провоспалительных (IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ), противовоспалительных (IL-10, TGF-β1, TGF-β2), иммунорегуляторных цитокинов (IL-2, IL-17) и растворимых рецепторов к цитокинам (IL-2R, IL-6R, TNF-α RI и TNF-α RII) в сыворотке крови пациентов с атеросклерозом, в зависимости от его распространенности и выраженности клинических проявлений. 2. Определить роль биохимических маркеров воспаления, отражающих деградацию межклеточного матрикса (MMP-9, MMP-9/TIMP-1, MMP-9/TIMP-2, TIMP-1) и адипокинов: (лептина и адипонектина) при различной локализации и клиническом течении атеросклероза. 3. Изучить полиморфизм генов: TNF-α (rs1800629), IL-6 (rs1800795), TGFB1 (rs1800469), IL-10 (rs1800896) и PTPN22 (rs2476601) при атеросклерозе, в зависимости от его локализации и клинических проявлений. 4. В эксперименте на животных создать модель атеросклероза, провести мониторинг липидного спектра, показателей оксидантной и антиоксидантной 6 активности, уровня оппозитных цитокинов (IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-10) и MMP-9 в крови и в стенке артерий. 5. На основе корреляционных взаимоотношений между лабораторными и инструментальными параметрами установить патогенетические механизмы атерогенеза в клинике и эксперименте. 6. Экспериментально фталазиндиона обосновать натрия применение: дигидрата амино-диоксо-тетрагидро- (галавита) и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-α-D-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus (митилана) при атеросклерозе. Методология и методы исследования: 1) Клинический раздел. Были обследованы 260 пациентов с атеросклерозом, из них 140 человек с атеросклеротическим поражением коронарных артерий, ишемической болезнью сердца (АКА (ИБС)) – находились на стационарном лечении в кардиохирургическом отделении ГБУЗ Приморской Краевой клинической больницы № 1 и 120 человек – с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей (ОАНК), без выраженных клинических проявлений ИБС – в отделении сосудистой хирургии Владивостокской клинической больницы № 2. Среди обследованных, мужчин было 220 чел. (84,6%) и женщин – 40 чел. (15,4%). Возраст обследуемых составлял от 45 до 89 лет. Группу контроля составляли 50 практически здоровых доноров (30-50 лет), сопоставимых по полу, без клинических проявлений атеросклероза, острых и хронических заболеваний в фазе обострения, не курящих, не употребляющих каких-либо лекарственных препаратов, не злоупотребляющих алкоголем. 2) Экспериментальный раздел. Эксперимент проводился на 55 белых крысах самцах линии Wistar, массой 250-350 грамм, в течение шести месяцев, при строгом соблюдении требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента с последующей утилизацией. В постановке опытов руководствовались 7 требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. Все животные были разделены на 5 групп: - 1-я группа – 15 животных находились на жировой диете (моделирование гиперлипидемии (ГЛ)) +гипотиреоз; - 2-я группа – 25 животных – (комплексная модель: гиперлипидемия, гипотиреоз и артериальная гипертензия); - 3 группа – 15 животных (здоровые крысы), питались обычным кормом в соответствии со стандартами рациона крысы. Через 2, 4 и 6 месяцев наблюдения по 5 животных из каждой группы выводили из эксперимента под эфирным наркозом, путем декапитации. В конце опыта, оставшимся 10 животным из группы 2-ой производилась патогенетическая терапия: введение амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата (галавита) – (4 группа – 5 крыс) и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-α-D-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus (митилана) – (5 группа – 5 крыс), с целью оценки их иммуно-патогенетической эффективности в комплексной модели атеросклероза. По окончании экспериментальной терапии производилось выведение животных из эксперимента. Для решения поставленных цели и задач проводилось комплексное (клинико-иммунологическое, биохимическое, функциональное) обследование пациентов с атеросклерозом. Наблюдение за животными включало: оценку их состояния, поведения, двигательной активности, измерение артериального давления. Метод ИФА использовался для определения цитокинов, рецепторов к цитокинам, маркеров деградации внеклеточного матрикса, адипокинов – у пациентов с атеросклерозом, и для определения цитокинов, ММР-9 – у животных. Оценку состояния сосудов (аорты и бедренных артерий) крыс проводили методом магниторезонансной томографии, гистохимическим и гистологическим методами. Морфологическая структура печени животных 8 оценивалась с помощью гистологического метода. Для определения показателей общей оксидантной и антиоксидантной активности сыворотки крови и артериальной спектрофотометрический стенки метод. животных Оценку общего использовался холестерина крови обследуемых пациентов и липидного профиля крови животных проводили с использованием колориметрического метода. Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Достаточное количество наблюдений и использование адекватных методов статистической обработки материала с помощью программы «Stat Plus 2010», регистрационный номер "3-b1WdC-7k32t обеспечило достоверность сформулированных положений, выводов и рекомендаций. Основные положения диссертации представлены на 13 научно- практических конференциях международного, Российского и регионального уровня: 14 Интернациональном конгрессе по иммунологии (Япония (Kobe), 2010); Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири», посвященной 35-летнему юбилею НИИ медицинских проблем севера СО РАМН и 30-летнему юбилею НИИ клинической иммунологии СО РАМН (Абакан, 2011); XI международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии иммунофармакологии» (Москва, 2011); XIV Всероссийском и форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» имени академика В.И. Иоффе (Санкт-Петербург, 2011); IX Региональной научнопрактической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии» (Владивосток, 2011); VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука в медицине» (Владивосток, 2011); Межрегиональном форуме «Клиническая иммунология и аллергология – междисциплинарные проблемы» (Казань 2012); XII Международном конгрессе «Современные 9 проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2013); Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013); V региональной конференции Приморского отделения Российского научного общества иммунологов (Владивосток, 2013); XI региональной научнопрактической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии» (Владивосток, 2013); XII региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики» (Владивосток, 2014) и научно-практическом обществе терапевтов Приморского края (Владивосток, 2014). Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, выразилось в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщении данных литературы по профилю диссертационного исследования. Соискатель принимал непосредственное участие в ведении пациентов, страдающих различными клиническими проявлениями атеросклероза АКА (ИБС) и ОАНК на стационарном этапе диагностики и лечения, контролировал выполнение всех исследований, на которых базируются заключение и выводы диссертации. Автором лично получены все первичные данные, самостоятельно произведена статистическая обработка материала, сформулированы положения, выносимые на защиту, выводы и практические рекомендации, написан текст диссертации. Положения, выносимые на защиту: 1. При атеросклерозе зарегистрированы различия системного содержания цитокинов, адипокинов и показателей деградации межклеточного матрикса, зависящие от распространенности и выраженности клинических проявлений заболевания. При атеросклерозе с преимущественным поражением артерий нижних конечностей – иммунный ответ реализуется за счет увеличения функциональной активности Th-1 лимфоцитов, при атеросклерозе коронарных артерий с клиническими проявлениями ИБС – клеток врожденного иммунитета и Th-17. 10 2. Мульфакторность генетической регуляции атерогенеза дополнена выявленной ассоциацией аллельных вариантов иммунорегуляторных генов (Т/T - TGFβ1 (rs1800469) (-509 C/T)), G/G и CC - IL-6 (rs1800795) (-174G/C), А/G и А/А - TNF-α (rs1800629) (–308G/A), G/A и G/G - PTPN22 (rs 2476601)) с механизмами развития заболевания: дисрегуляцией воспаления и нарушением обмена холестерина, что позволяет делать долгосрочный прогноз течения и распространения атеросклеротического процесса, проводить адекватные меры его профилактики и терапии. 3. Взаимосвязи между показателями цитокинов с уровнем общего холестерина крови, адипокинами и маркерами деградации межклеточного матрикса у пациентов с атеросклерозом характеризуют иммуноопосредованность атерогенного повреждения артерий. Высокое содержание комплекса ММР9/TIMP-2 и прямая корреляция ММР-9/TIMP-2 с ММР-9 отражает усиление продукции желатиназы В и ее преимущественное связывание с тканевым ингибитором 2 при атерогенном ремоделировании сосудистой стенки. 4. Разработанная проследить экспериментальная динамику модель иммуноопосредованного атеросклероза позволяет атерогенного поражения сосудов с учетом локализации и распространенности патологического процесса, может служить основой для дальнейшего изучения патогенеза заболевания и оценки эффективности средств его профилактики и терапии. Экспериментально обосновано применение амино-диоксо-тетрагидро- фталазиндиона натрия дигидрата и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-α-D-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus механизмов патогенеза grayanus к комплексной терапии атеросклероза. Научная новизна Выявлены закономерности иммунных атеросклероза на основе комплексного исследования системных цитокиновых и метаболических показателей и оценки их взаимосвязи. При атеросклерозе установлены: смешанный тип иммунного ответа (Th1/Th2) с дисбалансом продукции цитокинов про- и противовоспалительного профиля (увеличение 11 L-6, TGFβ2, растворимых рецепторов к цитокинам: TNF-α RI, TNF-α RII, IL-2R и снижение уровня IL-2 и IL-10 в сыворотке крови); активация процессов деградации межклеточного матрикса с усилением связывания желатиназы В ее тканевым ингибитором 2 типа; угнетение выработки адипонектина клетками жировой ткани. Определены особенности течения воспалительного процесса в зависимости от локализации и выраженности клинических проявлений атеросклероза. При атеросклерозе с преимущественным поражением артерий нижних конечностей определена поляризация иммунного ответа в сторону Th1 (увеличение продукции провоспалительных цитокинов: IFN-γ, IL-6, TNF-α, TNF-α RII и их высокая патогенетическая значимость, подтвержденная методом факторного анализа). При атеросклерозе коронарных артерий с клиническими проявлениями ишемической болезни сердца зарегистрировано превалирование функциональной активности клеток врожденного иммунитета, Th-17 и стимуляция продукции лептина адипоцитами (увеличение содержания в сыворотке крови IL-1β, IL-17 и лептина и высокая значимость их факторной нагрузки). Установлена связь развития атеросклероза и особенностей его течения с полиморфизмом иммунорегуляторных генов. Выявлена высокая частота встречаемости гомозиготного Т варианта гена TGFβ1 (-509 C/T) (rs1800469), что позволяет считать этот генотип дополнительным маркером заболевания. Впервые установлено, что активность системного воспаления при атеросклерозе - гиперпродукция цитокинов провоспалительного профиля: IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-2 ассоциируется с носительством геномных вариантов: G/G и C/C гена IL-6 (-174G/C), А/G варианта гена TNF-α (–308G/A), G/A варианта гена PTPN22 (rs 2476601), а гиперхолестеринемия > 6,2 ммоль/л - с генотипами: G/G - гена IL-6 (-174G/C),Т/Т- гена TGF-β1 (-509 C/T), А/G и А/А - гена TNF-α (–308G/A)). Выявлено влияние полиморфизма иммунорегуляторных генов на особенности иммунного ответа у пациентов с различной распространенностью 12 и локализацией АС. При атеросклерозе с преимущественным поражением артерий нижних конечностей - C/T вариант TGFβ1 (-509 C/T) сопряжен c высоким уровнем TGFβ 1, А/G вариант гена TNF-α (–308G/A) – с увеличением системного содержания TNF-α, G/G вариант гена PTPN22 (rs 2476601)) – с высоким уровнем IL-17 в сыворотке крови. При атеросклерозе коронарных артерий с клиническими проявлениями ИБС – G/A вариант гена PTPN22 (G/A) ассоциирован с высоким содержанием IFN-γ, G/G вариант гена PTPN22 (G/A) – с высокой концентрацией IL-1β, IL-6, IL-17 в сыворотке крови. Для изучения иммунных механизмов развития атеросклероза и оценки эффективности средств его профилактики и терапии – разработан способ моделирования атерогенного повреждения артерий, путем длительного сочетанного воздействия на организм крыс гиперлипидемии, угнетения обмена веществ и артериальной гипертензии, на основе которого построена концептуальная модель патогенеза заболевания. В динамике сочетанного воздействия на организм крыс факторов риска атеросклероза определены различия в локальной продукции цитокинов (IL-1β, IFN-γ, TNF-α и IL-10) в зависимости от морфологического строения сосудов (аорта, бедренные артерии). Установлена патогенетическая эффективность применения амино-диоксотетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-α-D-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus, заключающаяся: в нормализации показателей липидного обмена, оксидативной активности, модуляции локальной и системной продукции цитокинов, восстановлении функциональных и структурных свойств артериальной стенки и печени при воздействии на их организм животных основных факторов риска атеросклероза. Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая значимость работы заключается в том, что проведенное исследование уточняет и расширяет имеющиеся представления об иммунных механизмах патогенеза атеросклероза. 13 Практическая значимость работы заключается в следующем: для выявления предрасположенности к атеросклерозу и прогнозирования выраженности течения заболевания у пациентов с различной локализацией и распространенностью атеросклеротического процесса целесообразно оценивать: Т/Т генотип TGF-β1 (-509 C/T), G/G и C/C варианты гена IL-6 (174G/C), А/G и А/А - варианты гена TNF-α (–308G/A), G/A вариант гена PTPN22 (rs 2476601); для установления нестабильного характера течения стенокардии в качестве дополнительных диагностических критериев рекомендовано использовать: содержание уровень IL-6 > 5 пг/мл и лептина > 4 нг/мл в сыворотке крови; для изучения патогенеза атеросклероза и оценки эффективности средств его профилактики и терапии целесообразно использовать экспериментальную модель на основе сочетанного воздействия на организм животных гиперлипидемии, артериальной гипертензии и угнетения обмена веществ («Способ моделирования атеросклероза»: пат. 2500041, Российская Федерация; мпк: G09B; G09B23/28); для повышения качества терапии атеросклероза проведен этап исследования применения амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-α-D-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus. Экспериментально доказана эффективность амино-диоксо-тетрагидрофталазиндиона натрия дигидрата и 1,6-α-D-глюкана, заключающаяся в нормализации свободнорадикальных процессов, липидного обмена, коррекции иммунной дисфункции, восстановлении функциональных и структурных свойств артериальной стенки и печени, что подтверждает целесообразность проведения дальнейших этапов исследования по применению этих средств у пациентов с атеросклерозом в комплексном лечении заболевания. 14 Внедрение результатов исследования в практику Материалы диссертации внедрены в работу терапевтического центра и консультативной федерального поликлиники университета; Медицинского центра кардиологического Дальневосточного отделения краевой клинической больницы № 1 г. Хабаровска им. профессора С.И. Сергеева Министерства здравоохранения Хабаровского края; в лекционный курс кафедр: физиологии человека; клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии; госпитальной терапии и фтизиопульмонологии; терапии, функциональной и ультразвуковой диагностики ФПК и ППС; патологической анатомии, судебной медицины и права ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России и кафедры клинической лабораторной диагностики Краевого государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Института повышения квалификации специалистов здравоохранения» Хабаровского края. Публикации По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, в том числе 13 статей в журналах, включенных в «перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук, утвержденных ВАК, 1 патент на изобретение, 1 информационное письмо. Объем и структура диссертации Работа изложена на 295 страницах текста, проиллюстрирована 33 таблицами, 63 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования и раздела, содержащего заключения, результаты выводов, собственных рекомендаций исследований практическому (4 подраздела), здравоохранению и списка использованной литературы, содержащего 461 источник (их них – 160 источников отечественных и 301 – зарубежных авторов). 15 Глава 1. Современное представление о механизмах возникновения и развития атеросклероза 1.1 Актуальность Заболевания органов кровообращения занимают одно из главенствующих мест в общей структуре заболеваемости и смертности, не только в Российской Федерации (РФ), но и в мире в целом. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной нетрудоспособности и ухудшения качества жизни населения. По оценкам ВОЗ, в 2008 году - от ССЗ умерло 17,3 миллиона человек, что составило 30% всех случаев смерти в мире. Из этого числа - 7,3 миллиона человек умерло от ишемической болезни сердца (ИБС) и 6,2 миллиона человек - в результате инсульта. На территории РФ ишемической болезнью сердца страдают около 10 млн. трудоспособного населения, умирает ежегодно около 1 млн. 300 тыс. человек, а общая смертность от ССЗ превышает данный показатель во всех остальных странах мира [1, 25, 150]. По данным Минздрава России – смертность от ССЗ составляет 57%, причем, почти 20% из этого числа умирают в трудоспособном возрасте [50, 82]. Основным морфологическим субстратом для вышеназванных заболеваний является атеросклероз [93]. Половина случаев смертей в Европе и странах Европейского союза связана с АС [25]. По данным В.М. Кошкина и соавт. (2009), у 60-70 % больных зарегистрировано поражение коронарных артерий и сосудов головного мозга [60]. Облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей (ОАНК) является одним из частых проявлений генерализованного АС, встречается у 2-3 % населения и составляет 20 % от всех больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями [12, 13, 14, 15, 44, 118]. ОАНК часто сопровождают ИБС и АС брахицефального ствола. По данным популяционного исследования NHANES (The National Health and Nutrition Examination Survey) частота ОАНК достигает 4,3% среди лиц старше 40 лет и возрастает, практически, до 30 % в возрастной группе старше 70 лет [9, 60, 90]. В развитых 16 странах около 600 больных с ОАНК на 1 млн. человек нуждаются в оперативном лечении ежегодно. Однако, по данным мировой статистики, еще у 500 человек на 1 млн. населения выполняют ампутации нижних конечностей в течение года. Летальность после ампутаций остается достаточно высокой, на госпитальном этапе – 10%, а еще через год 20-30% [74]. Течение ОАНК часто утяжеляют гипертоническая болезнь и сахарный диабет [34]. Широкая распространенность АС в мире, его прогрессирующее течение, ранняя инвалидизация населения, значительный удельный вес в структуре летальности – требуют выработки алгоритмов диагностики и лечения заболевания. 1.2. Факторы риска атеросклероза Атеросклероз преимущественно – это хроническое поражающие средние воспалительное и заболевание, крупные артерии, характеризующееся аутоиммунным ответом на повреждение артериальной стенки с нарушением метаболизма липидов [73, 79, 133, 148, 153]. Согласно МКБ 10, выделяют: АС аорты, почечных артерий, нижних конечностей, генерализованный атеросклероз и АС других артерий. Многие факторы риска развития АС – это результат урбанизации - неотъемлемого процесса в нашей жизни [42, 48, 370]. При этом, модифицируемые факторы риска АС, такие как артериальная гипертензия, дислипидемия, курение, сахарный диабет, метаболический синдром, гиподинамия, чрезмерное употребление алкоголя, стресс – можно модулировать, влиять на них в рамках профилактических и лечебных мероприятий [327, 376]. Клинические исследования показывают, что модуляция факторов риска на 30-40% предотвращает развитие заболеваний сердца [394]. Немодифицируемыми факторами риска АС являются индивидуальный, семейный анамнез, возраст, пол [50, 76, 77, 146, 194]. У 17 родных братьев лиц, имеющих случаи преждевременной смерти от ССЗ - ее риск в 5,2 раза выше, чем в популяции без такой семейной истории [394]. Артериальная гипертензия (АГ) является одним из важнейших факторов риска АС, приводит к дисфункции эндотелия, утолщению комплекса – интимамедия артерий (КИМ), возникновению коронарной болезни сердца и инсульта [7, 35, 50]. Ремоделирование сердечно-сосудистой системы – неизменный атрибут гипертонической болезни, способствующий развитию осложнений АС. Изменение просвета сосудов может идти путем сочетания клеточной пролиферации и апоптоза, и также активации синтеза соединительнотканного матрикса или его деградации. Количественная и качественная модификация белков соединительной ткани может приводить к фенотипической трансформации гладкомышечных клеток (ГМК) в сосудистой стенке через систему адгезионных рецепторов [167]. Показана связь между повышением систолического пульсового и среднего АД с уровнем растворимых молекул адгезии и провоспалительных цитокинов (IL-6). Недавно было установлено, что ангиотензин II через АТ1 - и АТ2-рецепторы активирует ядерный фактор κB. Последний является универсальным повсеместным фактором транскрипции, вовлеченным в процесс воспаления. Ядерный фактор κB регулирует выработку различных провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-6, IL-8, хемокинов и молекул адгезии, что играет важную роль в процессах атерогенеза и ремоделирования сердечно-сосудистой системы [35, 170]. Гиперлипидемия (ГЛ) считается признанным фактором риска АС и ишемической болезни сердца (ИБС) [288, 306, 364, 375, 438]. Многими авторами установлена тесная связь между средней концентрацией холестерина (ХС) в плазме крови представителей населения различных стран и смертностью от коронарной недостаточности [234, 261, 264, 386, 436]. Определено, что оптимальным для связывания специфических рецепторов с частицами ЛПНП является уровень последних в пределах от 25 до 50 мг/дл. Этот уровень ЛПНП значительно ниже нормального для взрослого человека и соответствует величинам, наблюдаемым у новорожденных, вегетарианцев и травоядных 18 животных. Особая «напряженность» липидного обмена у человека связана с особенностями питания, недостаточной физической и усиленной умственной деятельности, гормональной и половой активностью. Гиперхолестеринемия не является единственным нарушением липидного обмена и фактором риска развития ИБС. Так, уменьшение в крови концентрации липропротеинов высокой плотности (ЛПВП) может играть существенную роль в развитии и прогрессировании АС. Как известно, частицы ЛПВП участвуют в переносе ХС из тканей обратно в печень и тем самым препятствуют развитию атеросклеротического поражения [50]. Получены убедительные данные, свидетельствующие о том, что гипертриглицеридемия (ГТ) является независимым и существенным фактором риска развития ИБС. Насыщенные триглицеридами, ЛПОНП и ЛППП ассоциируются с прогрессированием раннего АС [210]. Высокий уровень триглицеридов (ТГ) оказывает влияние на свертывающую систему крови, активирует фактор VII и коррелирует с повышенным уровнем ингибитора активатора плазминогена (PAI-1). При гипертриглицеридемии с высоким (более 5) индексом атерогенности распространенность ИБС возрастает более чем в 2 раза, по сравнению с лицами, имеющими нормальный уровень ТГ. При повышении уровня ТГ - риск развития ИБС у женщин в 1,5 раза выше, чем у мужчин [50]. В настоящее время выделяют группу больных, у которых отмечены увеличение ТГ (более 200 мг/дл), снижение ЛПВП (ниже 45 мг/дл), нормальный или несколько повышенный уровень общего ХС, избыток аполипопротеина Е4, увеличение маленьких плотных частиц ЛПНП, повышение активности ингибитора активатора плазминогена (РАI-1), уровня глюкозы, мочевой кислоты и фибриногена в крови, увеличение резистентности к инсулину, ожирение по мужскому типу, АГ, микроальбуминурия. Эта патология объединена в метаболический синдром (МС) [50, 70]. Доказано, что при метаболическом синдроме наблюдается уменьшение количества эндотелиальных клеток всего сосудистого русла, угнетение их клоногенетической активности [225, 250, 267, 414, 434]. 19 Активно обсуждается значение церамидов в атерогенезе [119, 185, 239, 262]. Представляя собой амиды сфингозина и жирных кислот с 16-28 атомами углерода, церамиды являются структурными предшественниками большого класса сфинголипидов, в который входят сфингомиелин и гликосфинголипиды. Отмечен ряд их эффектов в модуляции синтеза ДНК в эндотелиальных и гладкомышечных клетках, индукции апоптоза клеток сосудистой стенки, кардиомиоцитов и активируется макрофагов [119]. сфингомиелиназа, что Установлено, что может приводить при к ишемии накоплению церамидов, что приводит к эрозии бляшки с последующим тромбозом [185]. Окисленные ЛПНП, цитокины, такие как TNF-a и IL-1β, ростовые факторы, MMP-2, гомоцистеин – стимулируют гидролиз сфингомиелина и образование церамидов и сфингомиелинсинтазы в эндотелиальных клетках, что вызывает повышение адгезии к ним моноцитов [185]. ЛПНП, обогащенные синтетическим аналогом церамида с низкомолекулярной жирной кислотой интенсивнее захватываются эндотелиальными клетками и вызывают их апоптоз [185]. Некоторые авторы рассматривают специфичность атеросклеротического процесса, прежде всего, как следствие дефицита в клетках эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот [192, 204]. Исходя из вышеизложенного, следует, что не только гипрехолестеринемия, гипертриглицеридемия, но и изменение соотношения отдельных фракций липопротеинов крови играют существенную роль в процессе атерогенеза. Атерогенные классы липопротеинов (хиломикроны, ЛПОНП и, особенно, ЛПНП) являются потенциально провоспалительными факторами, тогда как ЛПВП проявляют противовоспалительные свойства. Однако в патогенезе эндотелиальной дисфункции при атерогенезе до конца не выясненными остаются вопросы взаимосвязей изменения липидного спектра с нарушениями цитокинового статуса на локальном и системном уровне. 20 1.3. Теории атеросклероза В зависимости от взгляда на то, что первоочередно вызывает развитие АС, рассматриваются следующие теории и концепции его возникновения. Инфильтрационная теория атерогенеза Н.Н. Аничкова на сегодня является одной из ведущих [5]. В основу патогенеза АС эта теория ставит нарушение липидного обмена, ведущее к локальному накоплению в стенке сосуда липидов, различных клеточных элементов крови, с дальнейшим склерозированием и образованием фиброзной ткани. Результатом этого становится частичная, или полная обтурация сосуда [10, 83]. Однако известны факты, подтверждающие наличие атеросклероза и ИБС у больных с нормальным уровнем общего ХС и ЛПНП (более 1/3 пациентов). При этом атерогенность плазмы повышена у всех пациентов и не имеет прямой зависимости от уровня ХС [37, 70]. Эти заключения ставят вопросы в происхождении АС. Некоторые авторы придают большое значение в возникновении и развитии АС гормональному дисбалансу. Так, например, показано, что избыток эстрадиола обладает проатерогенным влиянием, способствуя усилению дестабилизации атеросклеротической бляшки [237]. M. Tomaszewski с соавт. (2009) зарегистрировал прямые корреляционные связи содержания экстрадиола с уровнем общего холестерина и ЛПВП, эстрона с общим холестерином и ЛНПН у молодых мужчин [413]. Ученые сделали вывод, что повышенный уровень эстрогенов коррелирует с неблагоприятным липидным профилем и что такие ассоциации могут быть ранним проявлением кардиоваскулярной патологии [413]. В.А. Мясоедова с соавт. (2010) указывает на возможные противоатерогенные свойства андрогенов у мужчин [87]. Высказываются мнения об общности механизмов атерокальциноза и нарушением минерального обмена [178, 216, 228]. Показано, что процесс кальцификации, являющийся отражением нарушения обмена кальция в организме, повышения уровня 21 витамина Д3, ангиотензина II и гомоцистеина, способствует прогрессированию АС [83]. Однако J. Takasu c соавт. (2010) выявили сильную ассоциацию увеличения толщины каротидной интима/медиа (КИМ) и кальцинозом грудной аорты (КГА) у многоэтнических представителей без клинических проявлений сердечно-сосудистых заболеваний. Более чем у половины пациентов увеличение КИМ наблюдалось при отсутствии КГА, что указывает на независимость данных повреждений [400]. Учитывая наличие АС при нормальном содержании холестерина и липопротеинов, при отсутствии каких либо первоначальных обменных нарушений, другими исследователями выдвинуты теории, заключающие, что первоначально происходит повреждение сосудистой стенки и изменение эндотелия под действием каких либо повреждающих факторов - теория Rossa [51, 68, 362]. А.Н. Климовым обоснована концепция, позволяющая рассматривать АС с позиций иммунного ответа в сосуде на мЛПНП, белки теплового шока и другие антигены, приводящие к повреждению эндотелия. При этом АС стал расцениваться как вариант развития аутоиммунного воспаления [51, 52]. Согласно рецепторной теории - атерогенез инициируется реакциями после взаимодействия экзогенных и эндогенных микробных лигандов с Toll-подобными рецепторами иммунокомпетентных клеток [68]. Определенные инфекционные агенты, в связи с их белково-липидным составом, повышенным сродством к эндотелию сосудов, обладают способностью изменять липидный спектр крови, могут поддерживать в организме хроническое воспаление, на фоне которого атеросклеротический процесс и его клинические проявления реализуются наиболее выраженно [154, 198, 351]. Они действуют совместно с традиционными факторами риска, такими как артериальная гипертензия, курение, дислипидемия, наследственность и др., однако не являются основной и достаточной причиной для развития АС. Этим, по всей вероятности, и ограничивается неспецифическая роль при АС таких инфекционных агентов, как S. pneumoniae, цитомегаловирус, Helicobacter pylori. На фоне атерогенных факторов, таких как 22 гемодинамические особенности мЛПНП, происходит их перекрестная реакция с антимикробными антителами, которая приводит к воспалительной реакции в стенке сосуда и атерогенезу с участием комплемента и иммунокомпетентных клеток [1,16,104]. Инфицирование аденовирусами (Ad-36), цитомегаловирусом (CMV) и риносинцитиальным вирусом (RSV) приводит к повышению продукции IL-6, что имеет значение в прогрессировании АС [369]. Существует концепция, согласной которой АС – это своеобразная «плата» за иммунитет против бактериального (хламидийного белка теплового шока HSP65), наиболее схожего с HSP60 человека. Экспериментально зафиксировано, что у небольшой части людей нет реакции между антителами к микробному шаперону, белку теплового шока HSP60 и собственным белкам, что проявляется в отсутствии развития АС, даже при наличии его факторов риска [108]. Бактериальные ЛПС связываются с холестерином, который оказывает буферное действие на их токсичность [148]. Внедрение бактериальных факторов, таких как липополисахарид или липополипротеин (TLR2 и TLR4, соответственно) происходит посредством их взаимодействия с Toll-подобными рецепторами (TLR) [29, 68]. Активация TLR и их связывание с адаптерным белком MyD 88 ведет к повышению экспрессии провоспалительных цитокинов, как и в случае воздействия нитро и оксисоединения на эндотелий, что в итоге ведет к развитию воспалительной реакции [68]. Так, например, показано, что инактивация TLR2 снижает прогрессирование АС у самцов и самок мышей, дефицитных по Apoe−/−. Это достигается снижением липидной аккумуляции в стенке сосуда, уменьшением поступления циркулирующих макрофагов в стенку аорты и, снижением уровня моноцитарного хемотаксического протеина – 1(MCP-1) [301]. Усиленная активация TLR3 и TLR4 в ткани, подверженной АС изменениям, ведет к понижению экспрессии ABCA1 – одного из основных регуляторов фосфолипидного гомеостаза, что ведет к нарушению элиминации липидов из макрофагов и дальнейшей инфильтрации стенки сосуда [167]. Высказано мнение, что польза антибиотикотерапии при дестабилизации ИБС в таких случаях может быть связана с уменьшением воспалительной реакции и 23 реактивации персистирующей инфекции в ответ на стресс, каковым является острый коронарный синдром [70]. Учитывая вышеперечисленные теории, на сегодняшний день нет единого мнения об этиологии и патогенезе АС. Многие исследователи склоняются к позиции, рассматривающей АС – как патологический процесс, с ярко выраженными признаками хронического воспаления в интиме сосуда, реализацией аутоиммунных реакций, нарушением обмена кальция, липидов и развитием окислительного стресса [10, 297, 384, 430, 432]. При этом ключевым звеном в патогенезе АС считается эндотелиальная дисфункция (ЭД), которая представляет собой дисбаланс между основными функциями эндотелия: вазодилатацией и вазоконстрикцией, ингибированием и содействием пролиферации, антитромботической и протромботической, антиокислительной и проокислительной. Повреждение сосудистой стенки в результате воздействия каких-либо повреждающих факторов (инфекционных агентов; продуктов сгорания табака, свободно-радикального окисления липидов, нарушения обмена веществ, наследственных дефектах аутокринной и паракринной регуляции сосудистой стенки) приводит к изменению свойств эндотелия, в частности, к повышению его адгезивности и проницаемости для различных компонентов крови с последующим формированием аутоиммунных реакций, поддерживаемых изменением цитокиновой регуляции [22, 92, 96]. 1.4. Патогенез атеросклероза Известно, что в ответ на повреждение, клетки эндотелия и гладких мышц начинают продуцировать цитокины (IL-1-β и TNF-α), хемоаттрактанты: моноцитарный хемотаксический протеин (MCP-1), IL-8, белок-10, индуцируемый интерфероном и др. [324, 353, 354, 380]. Повышается адгезивность эндотелия. Так, например, показано, что в воспалительном 24 процессе сосудистой стенки принимают участие основные наборы молекул адгезии лейкоцитов (МАЛ): суперсемейство иммуноглобулиновых генов АКОС-1, молекулы 1 межклеточной адгезии (ММА-1), селектины Е и Р, (vascular adgesion molecule 1 (VCAM-1); intercellular adgesion molecule-1 – (ICAM-1)). МАЛ обеспечивают адгезию Т-лимфоцитов, моноцитов, и диапедез их в субинтимальные слои с последующей активацией и повреждением, захват и облегчение модификации частиц липопротеинов [41, 452]. Данный процесс результируется увеличением комплекса интима-медиа (КИМ) – одного из важнейших биомаркеров АС [88]. КИМ коррелирует с возрастом, уровнем Среактивного белка (СРБ), неоптерина [109, 274, 354, 356, 363,]. С-реактивный белок, E-селектин, эндотоксин, макрофагальный хемоаттрактантный протеин, лейкотриены, продукты неспецифическими деградации маркерами липоксигеназы системного являются - воспалительного ответа, предикторами неблагоприятного прогноза ишемической болезни сердца, прогрессирования АС. Их уровень отражает реактивность организма на повреждение артериальной стенки [70]. Активные кислородные радикалы (АКР), вырабатываемые активированными лейкоцитами, воздействуют на ЛПНП, вызывая их окислительную модификацию. У больных диабетом со стойкой гипергликемией происходит гликозилирование ЛПНП, в результате чего они приобретают антигенные свойства, провоцирующие воспаление [2, 97, 112, 160]. Попав в интиму, ЛПНП накапливаются в субэндотелиальном пространстве, связываясь с компонентами внеклеточного матрикса - протеогликанами. Такое «удержание» ЛПНП – увеличивает время их пребывания в сосудистой стенке [316, 341, 408]. Под действием моноцитарного колониестимулирующего колониестимулирующего (M-CSF), (GM-CSF), гранулоцитарно-моноцитарного моноцитарного хемотаксического протеина-1 (MCP-1) и других факторов, секретируемых эндотелиальными клетками, происходит преобразование моноцитов, проникнувших в эндотелий, там они подвергаются дифференциации и пролиферации [83]. D.M. Mosser и соавт., (2008) выделили 3 типа макрофагов: классические активированные 25 макрофаги (CAMs), альтернативно-активированные макрофаги (AAMs) и регуляторные макрофаги (RMs) [325]. Классические – индуцируются через продукцию вырабатываемого IFN-γ, лимфоцитами, Th1 посредством активации, через взаимосвязь Toll-like рецептора в ответ на лиганды, например, ЛПС бактерий [348]. Активация этих макрофагов проявляется высоким уровнем IL-12 и низким уровнем IL-10, широким микробицидным эффектом посредством активации индуцибельной NO-синтазы. Эти макрофаги эффективно защищают организм от различных патогенов, но чрезмерно длительная их активация может способствовать повреждению. Цитокины (IL-4, IL-13), продуцируемые гранулоцитами, мастоцитами и Th2-лимфоцитами, являются стимулами для AAMs. Альтернативные макрофаги, оппозитны классическим, характеризуются низкой продукцией IL-12 и высокой IL-10, обладают противовоспалительным эффектом, стимулируют фиброгенез. Регуляторные макрофаги – индуцируются широким спектром стимулов, включая иммунные комплексы, простагландины, G-протеин, глюкокортикоиды, апоптотические клетки и т.д. Основной ключевой цитокин регуляторных макрофагов – IL-10, контролирующий иммунный и воспалительный ответ. Нарушение регуляции системы макрофагов имеет одно из важнейших звеньев патогенеза атеросклероза [108, 170, 348, 354, 411]. Активированные макрофаги в стенке сосуда экспрессируют скевенжер-рецепторы (рецепторы «мусорщики»), обеспечивающие захват модифицированных липопротеинов и превращаются в пенистые клетки. При этом классические рецепторы к ЛПНП на макрофагах не узнают химически модифицированные (окисленные) ЛПНП (мЛПНП). Блокирование рецепторного поглощения мЛПНП может быть связано с гиперхолестеринемией (ГХ), дислипидемией или недостаточным количеством специфических наследственных дефектах рецепторов, как это апоВ-100-рецепторного наблюдают при взаимодействия, встречающихся при семейных ГХ [10, 70]. Усиление липидной аккумуляции в макрофагах и их превращение в пенистые клетки можно связать с изменением функционирования PPARγ и LXR сигнальных путей, обеспечивающих 26 экспрессию гена транспортера ABCA1 в клетках, в результате чего нарушается утечка липопротеинов из этих макрофагов. Также в макрофагах нарушается система гидролиза липидов, осуществляемая регуляторными генами SR-AI, SRBI и HSL [299, 422, 441]. Считают, что в патогенезе АС поглощение мЛПНП не контролируется по механизму отрицательной обратной связи [198, 211, 248, 276, 402, 447]. мЛНПН стимулируют активацию гуморального иммунитета и образование аутоантител, преимущественно Ig класса G [79, 428]. В результате соединения мЛНПН с антителами образуются иммунные комплексы (ИК), которые сильнее, чем мЛПНП в отдельности оказывают проатерогенный эффект, потенцируя усиленное образование пенистых клеток и продукцию провоспалительных цитокинов [428]. Показано, что избыток ИК коррелирует с утолщением стенки сосуда (системой медиа/интима). Однако некоторые авторы считают, что образование ИК является естественным процессом и, что, входящие в состав ИК IgG, реагируют с любыми липопротеинами, включая измененные [427, 428]. Данные многих исследователей показывают, что IgM, входящие в состав ИК, напротив, оказывают противовоспалительный ответ [208, 418, 427, 428,]. Вероятно, нарушение процессов образования и утилизации ИК обусловлено изменением работы Т-регуляторных клеток (CD4+ CD25(high) FOXP3+) [243, 405]. Дисбаланс механизмов элиминации мЛПНП, приводит к образованию видимых невооруженным глазом липидных полос, что характеризует стадию липоидоза. Артериальная гипертензия способствует накоплению протеогликанов в сосудистой стенке, потенцируя «удержание» ЛПНП. Ишемия, в результате АГ потенцирует развитие окислительного стресса, накопление в плазме крови свободных радикалов, что приводит к модификации ЛПНП и прогрессированию повреждения эндотелия. Окисленные ЛПНП индуцируют локальный иммунный ответ в бляшке. Модифицированные макрофаги начинают усиленно секретировать IL-1-β, TNF-α, TGF-β, IL-12, IL-18, хемоаттрактанты, как, например остеоптин, митогены, супероксидный тромбоцитарный фактор анион роста, (О2-), фактор металлопротеиназы роста фибробластов, матрикса, которые 27 стимулируют миграцию гладких мышц через эластическую мембрану [47, 124]. Кроме того, окисленные ЛПНП могут стимулировать клеточную смерть по типу апоптоза, что играет важную роль в процессах дестабилизации атеросклеротической бляшки. Клетки гладких мышц мигрируют в интиму из медуллярного слоя, увеличивая толщину интимы. Пролиферируя, ГМК образуют внеклеточный матрикс, обеспечивая его накопление в растущих атеросклеротических бляшках с формированием фиброзно-липидных образований. В результате пристеночного тромбообразования, пролиферации ГМК и фибринизации, липидные полосы могут преобразоваться в фиброзные бляшки через несколько месяцев. Формируются так называемые фиброзные капсулы, состоящие из небольшого количества клеток, окружающих богатое липидами ядро, содержащее нежизнеспособные клетки, IL-1, модифицированные ЛПНП. Данный разрушенные, процесс называется липосклерозом. На ранних стадиях бляшка растет по направлению вдоль стенки сосуда и может не обнаруживаться на ангиографии на этой стадии. Завершающая стадия – атерокальциноз, характеризуется отложением солей кальция, ростом бляшки и значительной обтурацией сосуда [21, 29, 31, 43, 135, 141]. Просвет сосуда сужается, кровоток нарушается, вызывая ишемию тканей. Прочность бляшки определяется внеклеточным матриксом, из которого состоит фиброзная оболочка, присутствующих в отделяющая крови тромбогенное субстратом коагуляции. содержимое Находящиеся от в микротромбах активированные тромбоциты выделяют мощные факторы, которые вызывают новую волну миграции и пролиферации гладкомышечных клеток. К числу таких факторов относится TGF-β и гепариназа. Последняя разрушает гепарансульфат - полисахарид внеклеточного матрикса (ВМ), который в нормальных условиях ингибирует миграцию и пролиферацию ГМК. Тромбоцитарный фактор роста и TGF-β - стимулируют образование интерстициального коллагена клетками гладких мышц, а IFN-γ ингибирует синтез коллагена этими клетками. Под действием матриксных металлопротеиназ (ММР), активно вырабатываемых пенистыми клетками, 28 происходит деградация коллагена и эластина. В результате прочность фиброзной оболочки снижается и увеличивается вероятность ее разрыва. При разрыве оболочки бляшки и выходе молекул, обладающих прокоагулянтными свойствами - образуется тромб, закрывающий просвет артерии. У пациентов с АС происходит изменение гиперкоагуляционное состояния состояние, системы снижается гемостаза, развивается фибринолитический и антикоагулянтный потенциалы. Причем наибольшая степень нарушений выявлена при прогрессирующем течении заболевания. В исследовании А.В. Казанцева и Е.А. Корымасова (2011) - у больных с ОАНК с поражением бедренно-подколенно-берцового сегмента - укорачивается активированное частичное тромбопластиновое время, снижается растворимых фибрин-мономерных комплексов, уровень фибриногена, D-димера, однако средние значения протромбинового времени, международного нормализированного отношения, характеризующие вторую фазу коагуляции, не выходят за пределы нормальных колебаний [44]. Одним из маркеров эндотелиальной дисфункции и АС может являться недостаточный синтез эндогенного вазодилататора – оксида азота и повышенная продукция вазоконстриктора – эндотелина-1 [91, 157]. Оксид азота (NO) осуществляет межклеточные взаимодействия и регулирует перекисное окисление липидов. В физиологических условиях NO выступает в роли антиоксиданта, тормозит радикальные окислительные реакции, связываясь со свободными ионами Fe2+, входящими в состав гема. В организме NO синтезируется путем окисления аргинина в цитруллин в присутствии катализатора из семейства NO-синтетаз (NOS). Оксид азота является ингибитором секреции, активации, адгезии и агрегации тромбоцитов, тормозит миграцию и пролиферацию ГМК. Многими исследователями показано, что подавление активности NOS и продукции NO происходит при различных факторах риска АС: курении, гипертонической болезни, метаболическом синдроме, гипергомоцистеинемии и др. [53, 91, 92]. Характер синтеза NO подвергается влиянию со стороны кровотока в сосуде. Так в местах 29 разветвления артерий, где изменяется ламинарность и возрастает турбулентность потока – его синтез снижается [126, 150]. В то же время зарегистрировано, что нарушение физиологических процессов биотрансформации молекулы NO, ведет к накоплению пероксинитрита (ONOO-) – первичного активного кислородного радикала, обладающего токсическими эффектами [46, 157]. Повышенная экскреция ONOO- и других окислительных радикалов, прооксидантных ферментов, образующихся в активированном эндотелии, в клетках гладких мышц, и в макрофагах, проникших в стенку сосуда, ведет к повышению реактивности и повреждению молекул белков, жиров, нуклеиновых кислот, потенцирует воспаление. Определенная роль в понижении активности NOS, также принадлежит мЛПНП, выявлена их положительная корреляция с обструкционным индексом коронарных артерий (ОИ) и уровнем анти мЛПНП [10]. В настоящее время считают, что окислительный стресс является универсальным механизмом клеточных повреждений, приводящий к развитию разнообразных патологических процессов [69]. Многими исследователями зарегистрировано, что в патогенезе АС и ИБС важную роль играет нарушение процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [2, 69, 113, 158]. При этом выявлено, что при переходе от стабильной стенокардии напряжения в нестабильную форму и далее в инфаркт миокарда (ИМ) наблюдается усиление прооксидантной активности и снижение функции антиоксидантной системы [69, 112, 113]. В группе больных с ИМ уровень общей оксидантной активности (ООА) выше, чем в группе больных со стенокардией напряжения 2 функционального класса (ФК), а уровень общей антиоксидантной активности (АОА) в 2 раза ниже [69]. Однако некоторыми исследователями, напротив, зафиксировано, что в сыворотке крови больных распространенным АС происходит нарастание уровня антиоксидантов, таких как витамин Е, нарушается состояние тиосульфидного равновесия белков с преобладанием SSгрупп, увеличивается уровень супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы [158]. Из этого следует, что свободнорадикальный сигнал 30 является своего рода индуктором синтеза множества защитных систем клетки [99]. О.А. Алуханяном и соавт. (2007) установлено, что у пациентов с ОАНК локализация поражения не оказывает влияния на степень биохимических отклонений в состоянии перекисного окисления липидов-антиоксидантной системы (ПОЛ-АОС) [3]. В зависимости от стадии ишемии авторами выявлены изменения уровня антиоксидантной системы и активности супероксиддисмутазы (СОД). Причем наиболее значительное их снижение было на IIA степени хронической артериальной недостаточности (ХАН). Также было установлено, что при ХАН II степени наблюдалось увеличение активности каталазы (КА), что свидетельствует о разбалансированности процессов образования и утилизации активных форм кислорода. Тогда как у больных с IV степенью ХАН было зафиксировано резкое снижение активности КА. Коэффициент СОД/КА при ОАНК резко снижался у пациентов с ХАН II A, а при усилении явлений ишемии он прогрессивно возрастал. При прогрессировании заболевания происходило нарастание антиоксиданта церулоплазмина в плазме крови и продуктов деградации оксида азота [3]. П.Г. Швальб и Р.Е. Калинин в (2009), напротив, установили, что атеросклеротические изменения сосудов нижних конечностей сопровождаются умеренным повышением активности супероксидисмутазы (СОД) в плазме крови, а уровень NO у пациентов с ОАНК был также установили, значительно выше показателей здоровых доноров. Авторы что операции по восстановлению кровотока статистически увеличивали содержание СОД, по сравнению, как с контрольной группой, так и с исходными данными. Было зарегистрировано снижение уровня NO относительно его уровня до операции [152]. Вероятно, в реализации антиоксидантного ответа необходимым является дозированность окислительного стресса, т.е. необходимость, с одной стороны – активации защитных систем, а с другой - препятствие истощению клеточных ресурсов, срыву адаптации к новым условиям среды и, в дальнейшем – повреждению артериальной стенки. Отсутствие однозначных заключений об изменениях системы ПОЛ/АОС в патогенезе АС в зависимости от стадии 31 заболевания и уровня поражения сосудов требует продолжения работ в этом направлении. Необходимо направленные на проводить изучение комплексные взаимодействия исследования, системы ПОЛ/АОС с регуляторными сигналами организма, какими являются белки межклеточного взаимодействия – цитокины. Одной из причин повышения окислительной активности, является гипергомоцистеинемия. Увеличение уровня гомоцистеина индуцирует процессы ПОЛ в эндотелиальных клетках, модификацию ЛПНП и ЛПОНП, индуцирует синтез пенистых клеток [158]. При избытке гомоцистеина происходит угнетение фибринолиза, активация тромбоцитарного звена гемостаза, усиление продукции противоспалительных цитокинов [157]. Несмотря на многообразие работ по изучению патогенеза заболевания, многие авторы изолированно рассматривают отдельные компоненты патогенеза атеросклеротического процесса. Для расширения представления о возникновении и развитии заболевания требуются дальнейшие исследования с комплексным анализом основных звеньев повреждения и защиты артериальной стенки. Изучение взаимодействия компонентов иммунного реагирования с показателями липидного спектра, системой гемостаза, оксидантной и антиоксидантной системами организма – позволит разработать четкие диагностические критерии заболевания и предотвратить формирование повреждения сосудов на ранних этапах. 1.5. Роль цитокинов и матриксных металлопротеиназ в патогенезе атеросклероза Возникновение патологии вносит определенный дисбаланс в функционирование цитокиновой сети. Цитокины индуцируют тканевые и плазменные события, ведущие к перестройке метаболизма липидов в печени 32 и кишечнике, и опосредованно вызывают атерогенные изменения циркулирующих липопротеинов и развитие эндотелиальной дисфункции [47, 222]. Сложность иммунного ответа при АС состоит в том, что секретируемые цитокины могут оказывать прямо противоположные эффекты – либо проатерогенный, следовательно, либо атеропротекторный. проатерогенными, являются: Провоспалительными фактор некроза и, опухоли, интерлейкины (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IL-18) [47, 143]. Однако, например, нет единого мнения о значении IL-1β в патогенезе АС, не совсем ясна его роль в дестабилизации атеросклеротической бляшки и ремоделировании сосудов. Е.И. Амчиславский и И.С. Фрейдлин (2005) экспериментально подтвердили, что IL-1β только в высоких концентрациях достоверно стимулирует Внутриклеточная форма миграцию естественного эндотелиальных ингибитора IL-1β клеток – [4]. IL-1-RА экспрессируется клетками эндотелия и ГМК человека, но роль его не ясна. Показано, что у мышей с повышенным уровнем IL-1-RA развивалось летальное хроническое воспаление артериальной стенки, ассоциированное с массовой трансмуральной инфильтрацией нейтрофилов, макрофагов и СD4+ лимфоцитов в аорте [111]. Работы некоторых авторов подтверждают, что при нестабильной стенокардии больных отмечается повышение IL-1-RA в сыворотке крови [45]. Однако исследования in vivo показали, что IL-1-RA оказывает защитное действие на сосуды. Так, лечение рекомбинантным IL-1-RA замедлило формирование жировых полосок у аро-Е-дефицитных мышей. Дополнительное подтверждение о протективной роли IL-1-RA было получено в исследовании связи между полиморфизмом генов IL-1-RA и заболеваниями коронарных артерий [47, 111]. Показано, что длительное выделение IL-6 потенцирует хронизацию воспалительного процесса [29, 88, 135, 151]. Зарегистрирована ассоциация IL-6 с кальцинозом коронарных артерий [367]. Выявлено, что у больных с нестабильной стенокардией (НС) и признаками разрушения атеросклеротической бляшки отмечено повышение уровня IL-6 по сравнению с 33 его уровнем при стабильной стенокардии. При этом концентрация IL-6 была выше у больных с ИМ в анамнезе, по сравнению с таковой – без ИМ [101]. K. Kempf с соавт. (2006) установили, что при ИМ левого желудочка, наблюдалось значительное увеличение уровня IL-6, тогда как уровень mRNA цитокина не отличался от референсных значений. При этом авторы обнаружили прямую корреляцию уровня IL-6 в сыворотке крови с дисфункцией миокарда левого желудочка и обратную – с сердечным выбросом [278]. Однако некоторыми авторами не установлено достоверных различий в содержании IL-6 у больных со стабильной стенокардией от уровня цитокина у здоровых доноров [6, 101]. В.В. Кухарчук с соавт. (2007) проводили исследование содержания IL-6 в плазме крови у пациентов со стенокардией напряжения на фоне атеросклероза коронарного русла в 1-й, 3-й и 21-й дни пребывания в стационаре и не зарегистрировали какой-либо отличительной динамики его уровня [65]. Р.М. Валитовой и соавт. (2008) было проведено исследование по выявлению иммунного воспаления у 60 больных со стабильной и нестабильной стенокардией. Авторы установили, что концентрация IL-6 в двух группах мало различалась и не превышала норму [19]. Следует отметить, что при наличии АГ и избыточной массе тела у пациентов с ИБС установлен достоверно более высокий уровень IL-6 [71]. Зафиксировано увеличение уровня IL-6 при метаболическом синдроме и многочисленные исследования, ожирении [378]. подтверждающие Однако, несмотря на проатеросклеротическое действие цитокина, его роль в патогенезе этого заболевания еще не до конца ясна. Так, M. Madan с соавт. (2008) проводила изучение роли IL-6 в воспалительном процессе и инфекционно-ассоциированном АС на 10-недельных ApoE+/−/IL-6+/− и ApoE+/−/IL-6−/− мышах, разделенных на группы; 1 группа животных находилась на высокожировой диете, 2-ая на обычной диете, последующие группы были аналогичные 1-ой и 2-ой, только с внутривенным введением 50µl живой бактерии - Porphyromonas gingivalis (P.g.) (107CFU) и солевого раствора 1 раз в неделю, в течение 14 недель, и в течение 24 недель. У ApoE+/−/IL-6−/− мышей было выявлено значительное 34 повреждение проксимальной аорты и всех ее ветвей, наблюдалось увеличение уровня сывороточного амилоида А, и уровня провоспалительных цитокинов, по сравнению с ApoE+/−/IL-6+/− мышами во всех исследуемых группах. Дефицит IL-6 способствовал повышению макрофагальной инфильтрации, апоптозу клеток, увеличению содержания липидов и снижению ГМК клеток в участках атероматозного повреждения сосудов. Авторы связали вышеперечисленные признаки с атеропротективными свойствами IL-6 [307]. Значительная роль в патогенезе АС отводится IFN-γ. Этот цитокин продуцируется активированными Т-клетками и естественными киллерами (NK), является локальным кофактором в направлении дифференцировки CD4+Th 0–клеток в Т-хелперы 1 типа (Th1) [125, 142]. Он является сильным активатором макрофагов, их деструктивных функций в отношении артериальной стенки (выделение кислородных радикалов, оксида азота, гидролитических ферментов) по типу реакции «гиперчувствительности замедленного типа» с формированием гранулематозного воспалительного очага [142, 167]. Кроме этого IFN-γ активирует NK клетки, индуцирует экспрессию на макрофагах и гладкомышечных клетках белков МНС-I и МНС-II, липопротеиновых рецепторов на гладкомышечных клетках, снижает экспрессию липопротеиновых рецепторов на макрофагах [167]. Показано, что IFN-γ индуцирует образование VCAM-1 эндотелием артериальной стенки. Известно, что при добавлении к нагруженным ХС макрофагам IFN-γ способен существенно влиять на соотношение ХС и его эфиров, в сторону накопления последних, тормозить захват и удаление ХС из клеток с помощью ЛПВП, что приводит к трансформации макрофагов в пенистые клетки [134, 167]. При добавлении к макрофагам рекомбинантного IFN-γ существенно уменьшается количество связывающих сайтов ацетилированных ЛПНП на их клеточной мембране, снижается скорость транспортировки липопротеинов в лизосомы без их деградации в самих лизосомах [134]. Т.С. Запорожец и соавт. (2011) оценивали взаимосвязи цитокинового статуса у пациентов с ОАНК. Они установили, что развитие ОАНК ассоциируется с увеличением в сыворотке 35 крови уровня проатерогенных цитокинов (IFNγ, IL-8, IL-6), снижением уровня IL-10 и IL-4. Авторами предложено использовать уровень сывороточного IFNγ, IL-8 в качестве маркера прогрессирования ОАНК [40]. Хронические инфекции изменяют липидный обмен, увеличивая концентрацию TNF-α, что может активизировать повышение экспрессии ЛПНП, увеличение клиренса липопротеина, преобразование вновь синтезированного холестерина в желчные кислоты и усиление эстерификации и хранения ХС [148]. Вероятно, это обусловлено тем, что хламидии, индуцируя, продукцию TNF-α, подавляют действие протеинлипазы, приводя к накоплению сывороточных ТГ и снижению ХС [148]. TNF-α может играть роль в развитии не только ангиопатии, но и нейропатии, причем это влияние оказывается больше на чувствительные, чем на двигательные волокна [147]. Зарегистрировано, что у больных с ГБ, являющейся фактором риска АС, характерна более высокая концентрация провоспалительных цитокинов (TNFα, IL-1β и IL-6) в сыворотке крови [65]. М.О. Казанцева с соавт. (2006) выявили, что при МС в сыворотке крови больных отмечается повышение уровня TNF-α, IFN-γ, и нормальное содержание IL-4 [45]. Н.С. Юбицкая с соавт. (2009) подтвердили, что уже на начальных стадиях метаболических изменений происходит повышение секреции TNF-α [159]. Данные проявления авторы связали с увеличением активности атероматозного процесса. Установленная исследователями положительная корреляционная связь TNF-α с содержанием ХС, ЛПНП и инсулинорезистентностью, позволила им рассматривать этот цитокин в качестве фактора риска МС и АС [159]. О взаимосвязи TNF-α с нарушением метаболизма триглицеридов (ТГ) и обмена холестерина, в своей работе указал Г.Е. Ройтберг, с соавт. (2010) [116]. Однако, Д.А. Могиленко и соавт. (2009) показали, что при действии TNF-α увеличивается уровень экспрессии и синтез аполипопротеина А-1 (апоА-1) – главного белкового компонента ЛПВП в клетках моноцитарно-макрофагальной линии человека, что позволяет судить о сложных регулирующих свойствах этого цитокина в атерогенезе [85]. 36 А.Т. Тепляков с соавт. (2008), в своем исследовании показал, что повышение уровней IL-1β, IL-6 и TNF-α может использоваться для стратификации риска коронарного рестеноза у больных ИБС [133]. Столов С.В., с соавт. (2006) подтвердили, что продукция мРНК TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6 и IL-8 коррелирует с тяжестью течения стенокардии, функциональным классом сердечной недостаточности, количеством пораженных коронарных артерий [130]. Высказано мнение, что в основе атероматоза лежит адаптивный иммунитет с интенсивной выработкой в атеросклеротических бляшках аорты и коронарных сосудов IL-2, в то время как в периферических лучевых артериях, где поражение стенки ограничивалось липоидозом, основными вырабатываемыми цитокинами были IL-1β и IL-6 [130]. Однако опубликованы результаты исследований, не подтверждающие это мнение. Авторы описывают, что при ИМ в крови снижается содержание TNF-α, IL-2 и повышаются уровни sIL-2R [115, 92]. Низкое содержание цитокинов у больных ИМ авторы объясняют повышенной экспрессией рецепторов эндотелиальными клетками, что способствует быстрой интернализации цитокинов и снижению их уровня в кровотоке [115]. А.М. Чернявский с соавт. (2010) связали изменение уровня различных биомаркеров при АС с количеством пораженных артерий и локализацией поражения [145]. Авторы установили, что при увеличении числа пораженных коронарных артерий от одной к трем, показатели TNF-α, ИЛ-1β, и IL-6 снижались, в то время как значения С-реактивного протеина и матриксной металлопростеиназы-3 (ММП3) – биомаркеров нестабильности атеросклеротической бляшки, напротив, возрастали [145]. Подтверждено, что через TNF-αRII типа, TNF-α стимулирует пролиферацию Т-клеток. В то же время растворимые рецепторы TNF-αRI и TNF-αRII связывают TNF-α и действуют как ингибиторы его биологической активности [89]. Отмечено влияние провоспалительных цитокинов на механизмы тромбообразования. Так, например, некоторыми авторами показано, что IL-1β и TNF-α значительно увеличивают стимулирующий эффект тромбина 37 и угнетают продукцию фактора Виллебранда, а INF-γ индуцирует способность макрофагов продуцировать активатор плазминогена – протеиназу [11]. Противовоспалительными и, соответственно, атеропротекторными, свойствами обладают: IL-4, IL-10, TGF-β и PDGF (platelet-derived growth factor) и др. цитокины [10, 25, 101]. Подтверждено, модифицированными что подавляет IL-10 (окисленными) стимуляцию липопротеинами и эндотелия высвобождение металлопротеиназ из макрофагов, а также стимулирует синтез тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 моноцитами [205]. Исследования показали, что IL-10 регулирует экспрессию IСАМ-1 и VCAM-1 в IL-1β–активированных эндотелиальных клетках, снижает выработку IL-8 и IL-6 в облученных эндотелиальных клетках, индуцированную ингибирует фактором роста TNF-α индуцированную фибробластов или пролиферацию гладкомышечных клеток аорты человека [47, 111]. Дополнительные механизмы защиты сосудов со стороны IL-10 включают: снижение продукции супероксиданионов в ответ на липополисахарид в кровеносных сосудах. При этом заслуживает внимания тот факт, что IL-10 оказывает эти противовоспалительные эффекты при локальной продукции в сосудистой стенке. Однако не удалось подтвердить какой-либо прямой противовоспалительный эффект IL-10 на экспрессию эндотелиальными клетками молекул адгезии, хемокинов, колониестимулирующих факторов, продукцию IL-6. Также показано, что IL-10 не оказывает эффекта на высвобождение гладкомышечными клетками аорты человека IL-8 и MCP-1 в ответ на IL-1 и TNF-α [111]. Отсутствие прямого эффекта IL-10 на клетки сосудов in vitro может быть объяснено отсутствием рецептора IL-10 или нарушением механизма действия IL-10 в клетке. Более того, эффект IL-10 в клетках сосудов может варьировать в зависимости от происхождения клеток и сигнального пути, вызванного воспалительными стимулами [111]. А. Баранов с соавт. (2007) выявили высокие уровни IL-1β, IL-6, TNF-α, CRP и низкий уровень IL-10 при ОАНК [9]. М.Р. Кузнецов и соавт. (2008) также обнаружили 38 низкий уровень IL-10 при ОАНК, его концентрация была равна 0 пг/мл, тогда как значительно повышенными были показатели TNFα, IFNγ, IL-8, TGFβ-1 [62]. Противоречивое значение в патогенезе АС придают и TGF-β. Большинство противовоспалительных эффектов TGF-β в клетках сосудов было исследовано in vitro и в опытах на животных. Так, например, установлено, что мышиные гетерозиготы с делецией гена TGF-β имеют высокий уровень молекул межклеточной адгезии эндотелия IСАМ-1 и VCAM-1 и более сильную инфильтрацию макрофагов, чем мыши дикого типа, после 12 дней холестеролобогащенной диеты [111]. Эти результаты показывают, что присутствие эндогенного TGF-β препятствует воспалению в сосудистой стенке. Выявлено, что противоатерогенное действие TGF-β выражается в подавлении воспалительной реакции через угнетение выработки провоспалительных цитокинов и стимулировании пролиферативных процессов [310]. Некоторыми исследователями показано, что ингибирование сигнальных путей TGF-β1 способствует развитию атеросклеротических повреждений стенки сосудов на фоне усиления воспаления и снижения содержания коллагена, ведущее к ослаблению атеромы [416]. Е.В. Шляхто, с соавт. (2008), выявили у трансгенных мышей с отсутствием нормально функционирующего рецептора к TGF-β - увеличение экспрессии генов IFN-γ и IL-1β и снижение экспрессии генов ферментов пролил-4-гидроксилазы и лизил-оксидазы, принимающих участие в посттрансляционной стабилизации коллагеновых волокон по сравнению с контрольной группой, что является подтверждением высокой степени активности воспаления и деструкции коллагена в атеромах этих животных [156]. Авторы показали, что в атеросклеротических бляшках этих мышей, экспрессия генов ММР-13 и катепсина S были в 3 и 2,9 раз выше, а экспрессия генов ММР-9 и цистатина C достоверно ниже, чем у животных контрольной группы [156]. Однако A.C. Doran (2008) в своем исследовании зарегистрировал наличие более стабильного фенотипа бляшки у пациентов с повышенным уровнем TGF-β1 [213]. Другими исследователями было показано, что у пациентов с ИБС уровни TGF-β1 в сыворотке крови достоверно выше, 39 чем у здоровых лиц [431]. И.В. Сергеенко с соавт. (2007) также показали, что ишемия миокарда сопровождается усилением продукции TGF-β1, а операция аорто-коронарного шунтирования (АКШ) не оказывает влияния на его содержание в раннем послеоперационном периоде [121]. К.В. Корженевская, с соавт. (2010), выявили ассоциацию между высоким содержанием TGF-β1 и развитием рецидива ишемии миокарда после АКШ [56]. По мнению исследователей, высокий уровень TGF-β1 после АКШ может являться фактором риска развития и возобновления симптоматики ИБС после хирургической реваскуляризации миокарда на фоне острого коронарного синдрома [56]. Некоторые исследователи отмечают, что повышенный уровень TGF-β ведет к усиленному связыванию ЛПНП сосудистой стенкой, а, следовательно, и к стимуляции повреждения эндотелия [448]. Таким образом, TGF-β1, вместе с другими цитокинами, такими как TNF-α и IL-1 вовлечен в процесс повреждения и ремоделирования сосудов. Вероятно положительная противовоспалительная проблематичной, в тот момент, роль когда степень TGF-β1 становится активации клеток, продуцирующих этот цитокин, перестает быть адекватной, и первоначально, защитный механизм перерастает в патологический процесс, результатом которого является гиперпродукция фибробластов, повышенный синтез коллагена, и как следствие, последующий фиброз тканей [56]. Важная роль в атерогенезе принадлежит недавно изученному семейству IL-17 [249, 335]. В то же время современные исследования дают неоднозначные результаты его роли в патогенезе заболевания. В ряде источников указано его провоспалительное и проатерогенное действие, однако, некоторые исследования показывают противовоспалительное действие данного цитокина [198, 401]. Зарегистрировано, что в атеросклеротической бляшке выделяется IL-17 Е, и IL-17А/F (+), а при увеличении уровня циркулирующих Th-17 и Th-17-ассоциированных цитокинов, таких как IL-6 и TNF-α усиливается тяжесть и прогрессия каротидного АС [303]. S. Chen с соавт. (2010) выполнял эксперимент на трансгенных мышах IL-17А (-/-), находящихся на диете с 40 высоким содержанием липидов, на фоне которой проводилось инфицирование животных Chlamydia pneumonia [198]. Исследователи подтвердили, что IL-17А (-/-) трансгенные мыши были менее подвержены атерогенным процессам. Подобный результат был получен и в других экспериментальных исследованиях [233, 384]. Y.H. Liao с соавт. (2012) экспериментально зарегистрировали, что IL-17А, продуцируемый γδ T-клетками, играет патогенетическую роль при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда, благодаря активации апоптоза кардиомиоцитов и нейтрофильной инфильтрации [296]. M. J. Butcher c соавт. (2012) на трансгенных, дефицитных (ApoЕ−/−), (IL17А−/−ApoЕ−/−), (IL17RA−/−ApoЕ−/−) мышах исследовали роль отношения IL-17A/IL-17 RA в поражении сосудистого русла, и установили, что IL-17A/IL-17RA играет важную роль в атерогенезе через индукцию хемокинов и усиление адгезии проникновения моноцитов и нейтрофилов в стенку дуги аорты [191]. U. Fumitake, с соавт. (2012) зарегистрировали, что у дефицитных по АpoE А/А−/−/IL-17 А/А−/− мышей область поражения сосудистого русла атеросклерозом была значительно ниже, чем у дефицитных по ApoE мышей. В то же время не было значительных отличий по липидному спектру плазмы между группами животных [230]. Количество инфильтрированных макрофагов в бляшках было значительно ниже у АpoE А/А−/−/IL-17 А/А−/− мышей по сравнению только с АpoE А/А−/− дефицитными мышами, в то время как количество ГМК в сосудах не было изменено при дефиците IL-17. Экспрессия провоспалительных цитокинов: (IL-1β, IL-6, IFN-γ, IL-12p40), MCP-1, и скевенджер-рецепторов (Msr-1, Scar β1 и Olr 1) была снижена у А/А−/−/IL-17 А/А−/− мышей. Более того, экспрессия индуцибельной NO-оксидазы (M1 маркер) и аргиназы (M2-маркер) были также ниже у А/А−/−/IL-17 А/А−/− мышей. Авторы заключили, что дефицит IL-17 приводит к снижению АС и воспаления в сосудах и, что модуляция IL-17 могла бы быть потенциальной целью для профилактики и лечения АС [230]. Опытным путем было установлено, что применение анти IL-17А – антител приводит к ослаблению атерогенеза [220]. 41 Однако некоторые авторы, напротив, выявили противовоспалительную активность у IL-17. Так, например, R.E. Eid, (2009) подтвердил, что IL-17 участвует в снижении экспрессии ICAM-1, уменьшает сосудистое воспаление Авторы [215]. показали, что на экспрессию IL-17 оказывает роль взаимодействие с интерфероном гамма, который замедляет синтез IL-17. В результате комплексного взаимодействия выше-обозначенных цитокинов происходит повышение экспрессии других провоспалительных цитокинов IL-6, хемокинов (CXCL-8 и CXCL-10) [215]. Протективную роль IL-17 в воспалительном процессе продемонстрировали и W.O’Connor c соавт. (2009) на модели колита у мышей. При дефиците выработки IL-17 Т-клетками животных происходила выраженная экспрессия генов провоспалительных цитокинов, вырабатываемых Th-1 типа, стимулирующих воспалительный процесс в толстом кишечнике животных, а дефицит T-клеток в отношении IL-17 R стимулировал более агрессивное течение колита с развитием кахексии кишечного происхождения [333]. S. Taleb с соавт. (2010), изучая роль IL-17, указал на возможность его опосредованного влияния на уровень провоспалительных цитокинов, через воздействие на Suppressor of cytokine signaling 3 protein (SOCS3), понижение экспрессии которого, ведет за собой увеличение уровня IL-17 и как следствие – ослабление воспалительной реакции, сопутствующей атеросклерозу [401]. Матриксные металлопротеиназы (ММP) – это семейство внеклеточных цинк-зависимых эндопептидаз, влияющих на внеклеточный матрикс, коллагеновые и эластические волокна. ММР принимают активное участие в процессах ангиогенеза, пролиферации и дифференциации элементов сосудистой стенки, ее ремоделировании [209, 235, 439, 450]. Было выявлено, что ММP – влияют не только на матрикс, но и на многие другие объекты, в том числе на хемокины и цитокины. P.V. Lint с соавт. (2007) показали роль ММP в регуляции деятельности IL-1β, TGF-β, TNF-α. Авторы установили, что MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-12, MMP-14, MMP-17 активируют TNF-α, тогда как активация IL-1β, зависит от содержания ММP-2, 3 и 9 [300]. Подтверждено, 42 что повышенный уровень ММP-9 связан с факторами риска кардиоваскулярной патологии, нестабильностью атеросклеротических бляшек и прямо коррелирует с систолическим ожирением, артериальным недостаточным давлением, курением, употреблением овощей дислипидемией, и фруктов, злоупотреблением алкоголя, уровнем CРБ [69]. Многими исследователями установлено, что ММP-9 и TIMP-1 являются независимыми предикторами ССЗ и сердечно-сосудистой смерти у пациентов с ИБС, отражают нестабильность атеросклеротической бляшки [20, 28, 55, 69, 137, 341]. Зафиксированная прямая связь уровня ММР-9 с объемом атеросклеротического поражения коронарного русла [28]. Отмечено, что значительное повышение атерогенных липидов: ХС, ЛПНП, ТГ при ИБС является одним из факторов, способствующих увеличению концентрации ММР-9 [20]. Н.М. Лупач с соавт. (2010) установили увеличение содержания комплекса ММP-9/TIMP-1 в сыворотке крови у пациентов с ИБС пропорционально тяжести ишемической болезни сердца, при этом наибольший уровень ММP-9/TIMP-1 был зафиксирован у больных ИМ [69]. Авторы зарегистрировали прямую корреляцию уровня ММP-9/TIMP-1 с содержанием метаболитов NO и показателями окислительного стресса у больных с атеросклеротическим поражением коронарных сосудов [69]. Однако некоторые исследователи не констатируют значимости MMP-9 в качестве фактора риска острого коронарного синдрома и ИМ [266]. E. Cavusoglu c соавт. (2006) оценивали уровень MMP-9 и TIMP-1 в плазме пациентов с сердечной недостаточностью и показали, что высокий уровень TIMP-1, а не ММP-9 является независимым предиктором смертности [195]. Имеют место данные подтверждающие, что противовоспалительное действие ММP-2,3,9,14 проявляется в активации TGF-β и IL-1R (ММP-9) [131]. L. Jonson с соавт. (2005) было показано, что ММР-9 и ММР-2 обладают способностью разрушать внутреннюю эластическую мембрану артерии и собственную базальную мембрану гладкомышечных клеток медии, тем самым, способствуя миграции гладкомышечных клеток в интиму, где они приобретают качественно новый синтетический фенотип и, таким образом, 43 стабилизируют атерому функционирующего гена [269]. Авторы ММР-9 у установили, мышей что развиваются при отсутствии более крупные атеросклеротические бляшки со значительной макрофагальной инфильтрацией [269]. В результате проведенных исследований, Е.В. Шляхто с соавт. (2008), было обнаружено, что в условиях экспериментально индуцированного воспаления в атеросклеротической бляшке мышей уровень металлопротеиназы-9 снижался. Вышеперечисленные данные подтверждают неоднозначность патогенетической роли желатиназ в атерогенезе, что требует дальнейшего изучения [156]. Таким образом, цитокины и система ММР играют ведущую роль на всех этапах атеросклеротического процесса, начиная с формирования атеросклеротической бляшки, и заканчивая нарушением структуры атеромы и развитием тромботических осложнений. Отсутствие четкого единого мнения в отношении участия цитокинов, их рецепторов и системы ММР в атерогенезе, проявлении их про-и противовоспалительных свойств в динамике заболевания требуют дальнейших комплексных исследований в этом направлении, что позволит расширить представления о патогенезе заболевания и найти дополнительные диагностические критерии повреждения артериального русла. 1.6. Значение адипокинов в патогенезе атеросклероза На современном этапе внимание ученых обращено к гормоноподобным веществам, продуцируемым жировой тканью – адипокинам (адипоцитокины, адипопродуцируемые гормоны). К ним относятся: резистин, лептин, адипонектин, грелин, ингибитор активатора плазминогена-1, ангиотензиноген, синтетаза окиси азота (NOS) и др. [147]. Кроме того в белой жировой ткани синтезируются цитокины: IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, TGF-β, растворимые рецепторы цитокинов, секретируются важные регуляторы метаболизма липопротеинов, такие как липопротеинлипаза (LPL), аполипопротеин Е (apoE) 44 и белок-переносчик эфира холестерина (CETP) [147]. Они принимают участие в цепи патогенеза нарушений углеводного и липидного обменов. Считают, что нарушение продукции адипокинов приводит к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, инсулинорезистентности, ожирения [389]. В.А. Шварц (2009) подтвердил роль воспаления жировой ткани (ВЖТ) в атерогенезе [153]. Автор показал, что при ВЖТ происходит активация экскреции хемокинов из адипоцитов, повышается продукция провоспалительных цитокинов: IL-6, IL-1β, TNF-α [153]. Лептин (от гр. leptos– тонкий) – гормон жировой ткани, так называемый гормон голода. Он оказывает влияние на центры голода и насыщения в гипоталамусе, участвует в мозговой регуляции энергетического гомеостаза, контролирует массу тела путем снижения синтеза и высвобождения нейропептида Y, вызывающего чувство голода. Выявлено прямое действие лептина на вкусовые клетки, приводящее к торможению пищевого поведения. Секреция лептина, как и других гормонов, непостоянна, ее пик приходится примерно на полдень, а минимальный уровень регистрируют в 22.00- 03.00 [64]. У женщин содержание лептина в сыворотке крови на 40 % больше, чем у мужчин (у женщин 4,1-25 нг/мл, у мужчин 1,2-9,5 нг/мл), что связано с регулирующим действием половых гормонов [147]. Гиперлептинемия может играть важную роль в развитии ожирения и АС [315]. При ожирении возникает компенсаторная резистентность гипоталамуса к центральному действию лептина, что в последующем по механизму отрицательной обратной связи приводит к гиперлептинемии [389]. В исследованиях как in vitro, так и in vivo было обнаружено, что лептин обладает свойствами фактора роста, а именно стимулирует ангиогенез, пролиферацию гемопоэтических клеток и β-клеток поджелудочной железы [84]. При избыточной массе тела происходит пролиферация и гипертрофия адипоцитов, их инфильтрация макрофагами с последующим развитием воспалительных реакций, вследствие чего изменяется метаболическая активность жировой ткани [147]. Показано, что лептин проявляет много атерогенных эффектов, таких как: индукция эндотелиальной 45 дисфункции; стимуляция воспалительных реакций, окислительного стресса; агрегации тромбоцитов; миграции и гипертрофии гладкомышечных клеток [147]. Мыши с генетическим блоком выработки лептина и его рецептора имеют высокую антитромботическую активность и защиту против гиперплазии клеток интимы в ответ на повреждение артериальной стенки [147]. По данным многочисленных исследований, высокий уровень лептина используется как диагностический критерий острых сердечно-сосудистых событий, рестеноза после коронарной антигиопластики и инсульта, независимо от традиционных факторов риска. Плазменный уровень лептина коррелирует с маркерами субклинического течения АС, такими как толщина каротидной интима/медиа и кальцификация коронарных артерий [84]. Зарегистрирована способность лептина стимулировать клеточный иммунный ответ и влиять на продукцию провоспалительных цитокинов [147, 163]. Установлено, что лептин стимулирует активацию симпатоадреналовой системы, а катехоламины, в свою очередь, подавляют продукцию лептина. При развитии МС – эти взаимодействия нарушаются, и повышенный уровень лептина в сочетании с хронической гиперактивацией нейрогуморальных систем, способствует возникновению АГ и эндотелиальной дисфункции [147]. Длительная гиперлептинемия ингибирует экспрессию мРНК инсулина. Однако при врожденной лептиновой недостаточности экзогенное введение лептина не устраняет гиперинсулинемию. Кроме того, у лиц с нормогликемией была отмечена положительная корреляция между концентрациями лептина и инсулина натощак независимо от массы тела или типа распределения жировой ткани [147]. Таким образом, с одной стороны, прослеживается связь лептина с развитием инсулинорезистентности и АС. Однако существует и иная точка зрения, свидетельствующая о том, что лептин защищает организм от развития инсулинорезистентности и обладает антиатерогенным эффектом [64, 201]. Было показано, что TNF-α вызывает быстрое высвобождение лептина из белой жировой ткани [147], Однако зафиксировано, что длительное воздействие TNF-α на культуру клеток адипоцитов человека приводит к снижению уровней мРНК лептина [236]. 46 Адипонектин гликопротеин, – сигнальный имеющий полипептид, различные по представляющий молекулярной собой массе и пространственной структуре фракции, необходимые для его биологической активности. Экспериментально подтверждено, что адипонектин тормозит дифференцировку преадипоцитов [147]. Показано, что экспрессия, секреция и плазменный уровень адипонектина снижаются при ожирении и/или абдоминальном распределении жировой ткани [329]. Установлено, что уровень адипонектина в плазме крови обратно пропорционален массе жировой ткани и индексу «объем талии/объем бедер» [147, 164]. Жировая ткань, вероятно, продуцирует ингибиторы экспрессии и/или секреции адипонектина. В частности, ингибитором адипонектина является TNF-α [308]. IL-6, глюкокортикоиды и катехоламины снижают экспрессию адипонектина [64]. Выявлена достоверная обратная связь адипонектина с уровнем артериального давления [164]. Адипонектин участвует в различных клеточных механизмах антиатерогенной защиты. При накоплении окисленных ЛПНП в эндотелии или механическом его повреждении происходит аккумуляция адипонектина в субэндотелиальном пространстве сосудистой стенки путем связывания с субэндотелиальным коллагеном, что подавляет связывание моноцитов с клетками эндотелия, и ингибирует экспрессию молекул адгезии VCAM-1, ICAM-1, Е-селектина (через ингибирование активации NF-kB) [64]. Зарегистрировано, что адипонектин уменьшает пролиферацию клеток гладкой мускулатуры сосудистой стенки, индуцированную факторами роста; подавляет формирование пенистых клеток путем ингибирования экспрессии рецептора скэвенджера класса А; стимулирует ангиогенез, в ответ на ишемический стресс, посредством активации АМФ-киназы; способствует ремоделированию кардиомиоцитов. Отмечено влияние адопонектина на снижение фагоцитарной активности макрофагов, снижение накопления измененных липопротеинов в стенке сосудов, угнетение секреции MCP-1, IL-6, TNF-α, и экспрессии TLR4 в эпикардиальной жировой ткани [299, 458]. Зарегистрирована обратная связь адипонектина с уровнем ТГ [164, 458]. 47 Гипоадипонектинемия может стать новым важным фактором риска развития АС и его осложнений. Выявлена взаимосвязь между высоким уровнем адипонектина плазмы и низким риском развития инфаркта миокарда у мужчин без ранее установленного диагноза ИБС [347]. В эксперименте установлено, что повышенная экспрессия человеческого адипонектина путем трансфекции аденовирусом приводила к снижению образования бляшек у мышей, нокаутированных по Аpo Е [336]. C. Espinola-Klein (2011) установил, что адипонектин стимулирует выработку оксида азота и уменьшает повреждение эндотелия сосудов [222]. M. Kumada с соавт. (2004) зафиксировали, что адипонектин селективно снижает экспрессию TIMP-1 через индукцию IL-10 [288]. Однако E.J. моноклональными способность Folco (2010) выявили, антителами не аннулирует адипонектина, в отношении что связывание IL-10 противовоспалительную повышения толерантности макрофагов к различным провоспалительным митогенным стимулам, таким как IL-6 и TNF-α [227]. Гипоадипонектинемия является фактором риска нарушений сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, усиления процессов тромбообразования [147]. A. Scuteri, с соавт. (2011) определили, что артериальная жесткость связана с высоким уровнем лептина и высоким содержанием СРБ, тогда как толщина сосудистой стенки ассоциирована с низким уровнем адипонектина и высоким уровнем IL-6 [374]. Отношение лептин/адипонектин является более значимым маркером метаболического синдрома и индивидуально. сердечно-сосудистых Показано, что повреждений, отношение чем адипоцитокины лептин/адипонектин прямо коррелирует с высокой концентрацией СРБ, с индексом массы тела, отрицательно коррелирует с ЛПВП, холестерином [344]. Изучение содержания адипокинов с учетом комплексного анализа их взаимодействия с содержанием цитокинов, липидным профилем, показателями системы металлопротеиназ у пациентов с АС, позволят выявить новые корреляционные связи между показателями и разработать дополнительные диагностические и прогностические критерии заболевания [116]. 48 1.7. Генетические маркеры атеросклероза Возникновение и течение воспаления в артериальной стенке, экспрессия в ней биологически активных веществ и молекул подвергаются влиянию со стороны генов, что характеризует наследственную предрасположенность к атеросклерозу [253, 286]. Эпидемиологические исследования подтверждают, что сердечно-сосудистая патология в 50% наследуется генетически. В 2007 году был идентифицирован первый общий ген, участвующий в предрасположенности к заболеваниям коронарных артерий и ИМ (9p21) [253, 320]. При этом риск предрасположенности к АС по гену (9p21) не зависит от других факторов риска, таких как дислипидемия гипертензия, ожирение или диабет [253]. Ассоциированность гена (9p21) с ССЗ была подтверждена в Китае [286], Корее, Японии [255], Западной Индии, Африке [175]. Локус гена (9p21) также предрасполагает к развитию аневризмы абдоминальной аорты [253]. Начиная с открытия гена (9p21) идентифицировано более 30 «кандидатных» генов, ассоциированных с сердечно-сосудистой патологией [197, 295, 349, 394]. Продукты «кандидатных» генов приводят к формированию атеросклеротической бляшки и к нарушению ее целостности. К «кандидатным» генам атерогенеза конвертирующего относят: энзима, гены рецептора ангиотензиногена, ангиотензина-II, ангиотензин-1фибриногена, аполипопротинов А, В, С и Е, матричных металлопротеиназ, цитокинов, при этом – большое количество генов, ассоциированных с АС, свидетельствует о сложности происхождения и развития этого заболевания [54]. Мета-анализ генотипа Apo-E выявил низкую предрасположенность к поражению сердечнососудистой системы у представителей E2 аллели и высокий кардиоваскулярный риск у представителей с наличием E4 аллели, имеющих высокий уровень ЛПНП и низкий ответ на терапию статинами [182]. Одним из генетических критериев оценки эффективности терапии статинами является определение полиморфизма гена kinesin-like protein 6 (KIF6), в котором аргинин заменяет 49 триптофан. Носители полиморфизма этого гена имеют большее число случаев осложнений сердечно-сосудистых заболеваний при терапии статинами, чем представители, не имеющие полиморфизма этого гена, не смотря на одинаковую терапию, уровень ЛПНП и СРБ [295]. Однако не все исследователи поддерживают это мнение. Некоторые авторы не отметили различий в эффективности терапии статинами у носителей и не носителей полиморфного гена (KIF6) [259]. В недавних исследованиях доказано, что полиморфизм гена, кодирующего липопротеин A (LPA-ген) связан с неэффективностью ежедневного употребления аспирина и высоким риском вреда от желудочнокишечных кровотечений при его употреблении [197]. Показано, что промоторные регионы гена СРБ: +1444C>T (rs3091244, rs3093058, rs3091244) ассоциированы с высоким содержанием СРБ в плазме [341, 354]. Гены интерлейкинов обладают чрезвычайно высокой степенью полиморфизма, причем количество участков этого полиморфизма в одном гене может достигать нескольких десятков. Располагаться они могут в кодирующих экзонах, в интронах и в промоторных регуляторных зонах структуры гена [383]. Эти участки ДНК содержат зоны связывания регуляторных факторов, которые определяют не структуру считывания, а интенсивность наработки клеткой конечного белкового продукта, т.е. самих молекул интерлейкина. Наличие аллельного полиморфизма в промоторных участках генов интерлейкинов обеспечивает разнообразие индивидов по степени продукции цитокинов при антигенной стимуляции, и формированию воспалительных клеточных реакций [54]. Вопрос, действительно ли вариации генов цитокинов могут повлиять на развитие АС, достиг пика изучения в научной среде разных стран с 1998 по 2006 годы и продолжает оставаться актуальным и дискутабельным по сегодняшний день. Выявлены изменения частоты встречаемости аллелей генов интерлейкинов, которые тесно ассоциированы с развитием АС среди лиц, проживающих в одинаковых экологических условиях, ведущих сходный нездоровый образ жизни и одинаковое воздействие общеизвестных факторов риска заболевания [8]. В.И. Коненков, с соавт. (2006) разработал алгоритм 50 расчета предрасположенности к развитию АС, рассчитанный на суммировании величин прогностических коэффициентов [54]. Показано, что ген TGFβ1, кодирующий данный белок, TGFβ1 находится у человека на 19-й хромосоме.TGFβ2 – ген, кодирующий TGF β-2, расположен в районе 41 полосы длинного плеча 1й хромосом (1q41), TGFβ3 – ген, кодирующий экспрессию TGF β-3, находится в районе 32, 33 полосы короткого плеча 1-й хромосомы (1p33-p32) [273]. A. Crivello и A. Giacalone (2006) исследовали частоту полиморфизма генов TGFβ1 (+869T/C и +915G/C) и IL-10 (-1082G/A) у пациентов с каротидным стенозом. Исследования показали отсутствие связи между полиморфизмом данных генов и восприимчивостью к АС [206]. Ген IL-10 находится на 1 хромосоме. S Kahraman и R. Yilmaz (2006) выявили, что у пациентов с гиперлипидемией уровень адгезионных молекул: ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина был высоким у представителей, имеющих генотип IL-10 - 1082/AA, тогда как при -1082/GG генотипе наблюдалось увеличение сывороточного альбумина и С-реактивного белка. Авторы также установили, что поражение атеросклерозом выше среди гомозигот по -1082/AA и -1082/GG генотипам, чем при гетерозиготных вариантах [272]. S. Trompet, с соавт. (2007) установили, что аллель IL-10 - 592A связана с риском острого коронарного синдрома, а аллель IL-10 - 2849AA – с частотой сердечных приступов в 95% случаев [415]. В.И. Коненков с соавт. (2006) исследовали полиморфизм генов цитокинов у 118 мужчин от 30 до 64 лет с диагнозом: атеросклероз коронарных артерий, инфаркт миокарда. Контролем в данном исследовании служили 100 здоровых мужчин 34-64 лет [54]. Авторы показали, что частоты генотипов цитокинов и аллелей пациентов России сопоставимы с частотами генотипов и аллелей в западноевропейских популяциях. Была зарегистрирована ассоциация генотипа G/G в позиции T-330G гена IL-2, генотипа C/T в позиции C-590T гена IL-4 с инфарктом миокарда, тогда как ассоциаций IL-10 в промоторной области C-592 A и инфарктом миокарда не 51 было обнаружено [54]. Некоторые авторы также не установили прямых ассоциаций полиморфизма генов IL-10 в модуляции риска ИБС [221, 277, 366]. K. Oda c соавт. (2007) в гериартрическом исследовании (JG-SNP) у 1503 умерших пожилых японских подданных определяли связь девяти общих однонуклеотидных полиморфизмов (SNP): TNF-α, IL-1β, TGF-β1, IL-10 и IL-4 в 10 различных артериях [334]. Ученые установили, что -1031 C-аллель TNF-α является важным защитным фактором при атеросклеротическом поражении сонных, бедренных и внутричерепных артерий, тогда как аллели (- 511T) IL-1β и (+29 Т) TGF-β1 были значительными факторами риска развития АС в подключичной и внутричерепных артериях. По мнению исследователей, общие однонуклеотидные полиморфизмы генов: TNF-α, IL-1β и TGF-β1, хотя и играют роль в развитии АС, однако их влияние менее выражено, чем у обычных факторов риска, таких как гипертензия или сахарный диабет и ограничивается повреждением конкретных артерий [334]. Ген IL-6 расположен на коротком плече 7 хромосомы в позиции 21. Доказана прямая корреляция между мРНК IL-6 с инсулинорезистентностью, ожирением, увеличенной толщиной интима/медиа, нарушением липидного метаболизма, риском заболеваний периферических артерий [298]. Генетический полиморфизм IL-6 174G/C зарегистрирован как фактор риска сердечнососудистой патологии, причем G и C аллели независимо связаны с АС и сопутствующими заболеваниями [378]. S.P.Marso с соавт. (2006) соотносили полиморфизм гена -174G->C IL-6 с уровнем IL-6 через 8 и 16 часов после проведения коронарного стентирования по поводу атеросклероза коронарных артерий, и установили, что у пациентов имеющих GC или CC аллели наблюдался высокий уровень IL-6 – по сравнению с пациентами с GGгенотипом [314]. Несколько иные ассоциации полиморфизма гена IL-6 с уровнем цитокина в сыворотке крови выявлены Y. Liu и Y. Berthier-Schaad (2006). Обследовав 775 пациентов с ИБС, авторы установили, что регион IL-6 174G/C, был строго связан с высоким сердечным риском и низкой концентрацией IL-6 в сыворотке крови, тогда как -174 C/С вариант был 52 ассоциирован с высоким уровнем IL-6 в сыворотке крови [302]. M. Weger с соавт. (2005), исследовав 182 пациента с каротидным атеросклерозом, отметили значительное снижение встречаемости у них 174C/C варианта гена IL-6, а результаты, проведенные in vitro, показали низкую экспрессию IL-6 при 174C/C его варианте [435]. M.P. Sie и F.A. Sayed-Tabatabaei (2006) обследовали 6434 жителей Роттердама в возрасте 55 лет и не установили ассоциации между генотипом IL-6 и сердечно-сосудистой патологией. Авторы выявили, что полиморфизм -174 G/C промотора не был связан с уровнем IL-6, однако C-аллель гена был связан с высоким содержанием в крови С-реактивного белка [381]. В исследовании, проведенном в Турции у 120 пациентов с ИБС и 105 здоровых доноров, также не зафиксировано, что полиморфизм гена IL-6 способствует стратификации риска ИМ [375]. H.S. Markus с соавт. (2006) установили связь 3 гаплотипов гена IL-6 (-572G, -174C, -597A), гена антагониста рецептора IL-1 [VNTR *2], и гена рецептора к эндотоксину CD-14 (-159C) с АС сонных артерий, увеличением толщины их стенки (интима/медия) [313]. Y. Yamada и N.Metoki (2006) зарегистрировали связь -572G->C варианта гена IL-6 с геморрагическим инсультом на фоне атеротромбоза церебральных сосудов, а полиморфизм гена TNF-α -863 C->A и G->A (Gly243Asp) – с суборахноидальным кровоизлиянием [446]. В корейских исследованиях выявлена взаимосвязь G/G варианта полиморфного гена 572C>G IL-6 с высоким уровнем IL-6, содержанием СРБ, фибриногена и окисленных ЛПНП в сыворотке крови у больных ИБС [188]. Зарегистрировано, что у носителей аллеля G гена IL-6 597G->A и-174G>A - стимуляция лейкоцитов ЛПС приводила к повышению базового уровня IL-6 [377]. A. Maitra с соавт. (2008) обнаружил у индийцев 5 полиморфных вариантов гена IL-6 (rs1800797, rs1800796, rs7802307, rs7802308, rs1800795) и установил, что, при GGAAG гаплотипе, наблюдалось увеличение риска возникновения ИБС на 21% [309]. Nain-Feng Chu с соавт. (2011) проанализировали возможные генетические ассоциации между полиморфными вариантами гена рецептора интерлейкина-6 (IL-6R) и липидным профилем у подростков в Тайване и определили, что rs 53 8192284 A/C и rs 2229238 С/Т варианты гена IL-6R связаны с дислипидемией у девочек, тогда как AAT гаплотип гена IL-6R (rs 4845617 G/A, rs 4845623 A/G, и rs 2229238 C/T) связан с дислипидемией у мальчиков [202]. Ген TNF-α расположен на шестой хромосоме (6p21.3) в локусе, кодирующем молекулы главного комплекса гистосовместимости первого (HLA-A, B, C) и второго классов (HLA-DP, DQ, DR). Расположение в средней части генома определяет большую вариабельность локуса, в частности, промоторная зона гена TNFA включает восемь полиморфных участков с единичными нуклеотидными заменами: -1031T/C, -863C/A, -857C/T, -575G/A, 376G/A, -308G/A, -244G/A, -238G/A [117]. Полиморфизм гена TNFα –308 G/A повышает транскрипционную активность гена и, соответственно, продукцию TNF-α. Показано, что у носителей гаплотипа гена TNFα –308A – cинтез белка происходит в 3 раза активнее, чем у лиц с генотипом –308G [117]. Степень повышения транскрипционной активности зависит от вещества, воздействующего на клетку, а также от типа самой клетки. Стимуляция клеток цельной крови липополисахаридом показала, что клетки с генотипом -238GA синтезируют в 1,5 раза меньше TNF-α, чем клетки с генотипом -238GG [117]. Причем при стимуляции моноцитарной фракции периферической крови суперантигеном стрептококка эта разница возросла до 2,8 раз. Нуклеотидные замены -308 (GRA) и -238 (GRA) оказывают противоположное действие на продукцию TNF-α: -308 повышает ее, а -238 снижает, при этом высокопродуцирующий аллель -308А в большинстве случаев наследуется вместе с нормальным аллелем -238G, а нормальный аллель -308G с низкопродуцирующим аллелем -238А [105, 117]. Согласно исследованию Г.Е. Ройтберга, (2010), у больных с генотипом TNFα GA+AA наблюдается достоверное повышение уровня ТГ, по сравнению с больными GG -генотипом. Автор зарегистрировал, что у больных мужчин с гетерозиготным (наиболее атерогенным вариантом) данного цитокина, в 9 раз увеличивается риск развития раннего АС [116]. Промоутерный вариант (rs3091256) -308 G> A гена TNF-α получил наибольшее внимание и показал противоречивые ассоциации в 54 популяции при различных заболеваниях сердечно-сосудистой системы [291, 323, 345, 369]. Отмечают связь полиморфизма гена TNF-α с ожирением, высоким систолическим АД, уровнем инсулина и СРБ в плазме крови, метаболическим синдромом [369]. Однако некоторые авторы не подтверждают эти связи. Так исследование В.Я. Плоткина, с соавт. (2007) показало отсутствие ассоциации между диморфизмом 308G–A в гене TNFα и склонностью к развитию инфаркта миокарда (ИМ) в популяции русских европеоидов. При этом не было выявлено различий в частоте аллелей –238G/A и –308G/A гена TNF-α, в зависимости от тяжести ИМ и развития его осложнений [105]. H. Berrahmoune с соавт. (2006) установили, что среди генов TNFА контролирующих экспрессию MCP-1, полиморфизм локуса LTA 252A>G более вероятен, чем полиморфизм -308G>A [183]. Установлено, что наличие IL-17 A (rs 8193037) G аллели является фактором риска, относительно ССЗ [453]. Исходя из вышеизложенного следует, что результаты проведенных исследований по полиморфизму генов цитокинов весьма разнообразны. Вариабельность данных, вероятно, связана со сложной физиологией интерлейкинов, с характером регуляции их транскрипции, клинической гетерогенностью пациентов (разнообразием сопутствующих заболеваний среди обследованных), влиянием соседних генетических вариантов, величиной выборки и временем проведения исследований. Перспективен дальнейший поиск индивидуальных генетических факторов риска развития атеросклеротического поражения сосудистого русла. Скрининг большого числа вариантных участков кандидатных генов позволит вывить достоверные ассоциативные связи между аллельными вариантами полиморфных участков ДНК с маркерами повреждения и защиты сосудистой стенки, клиническими проявлениями заболевания, позволит установить новые диагностические критерии предрасположенности к развитию сосудистых катастроф разработать современные патогенетические средства терапии заболевания. и 55 1.8. Экспериментальная диагностика атеросклероза, подходы к патогенетической терапии Экспериментальные модели на животных играют важную роль в исследовании заболеваний, в том числе и атеросклероза [63, 81, 94, 120, 340]. Большинство исследований по изучению АС, в настоящее время преимущественно проводятся на трансгенных животных: мышах, морских свинках, кроликах, накаутированных по гену аполипопротеина Е [220, 233, 335, 340, 443]. При дефиците ApoE после введения красителя – бромо-деоксиуридина наблюдается его накопление в местах атеросклеротического повреждения сосудов, тогда как у ApoE положительных животных сосудистая стенка не накапливает маркер, вследствие отсутствия сосудистого повреждения [281, 229]. Следует отметить, что кролики как биологический вид являются самой лучшей моделью для воспроизведения атеросклеротических повреждений и нарушений липопротеинового обмена, поэтому в настоящее время развиваются подходы по созданию трансгенных линий кроликов, которым переносятся те или иные гены человека, ответственные за метаболизм липидов [94]. Крысы также используются в моделировании гиперлипидемии и АС [63, 80, 81, 120, 139, 140, 340]. Их приобретение и содержание относительно недороги, животные просты в обращении, хорошо размножаются в неволе. Из всех экспериментальных животных у них лучше всего изучен метаболизм [61, 80, 139, 140]. Однако большинство исследователей ранее оценивали изменение липидного состава в течение небольшого срока наблюдения в моделях гиперлипидемии (от 16 дней до 3 месяцев) [61, 81, 120]. Соответственно отсутствуют данные о динамике изменений липидного профиля крыс и повреждения сосудов при длительном моделировании гиперлипидемии на протяжении 6 месяцев и более, что показывает необходимость проведения таких исследований. 56 Лечение АС может быть хирургическим и консервативным. Реваскуляризация осуществляется с помощью эндоваскулярных методов (баллонная ангиопластика со стентированием сосудов, эндартериоэктомия, лазерная ангиопластика) и хирургическим путем (аорто-коронарное, аортобедренное, бедренно-подколенное и другие виды шунтирования) [12, 13, 14, 15, 23, 151]. Среди патогенетически обоснованных оперативных пособий при ОАНК следует отметить поясничную симпатэктомию (удаление ганглиев L3– L4 симпатического ствола) – воздействие на тонус вегетативной нервной системы, увеличение кровотока на стопе. Поясничная симпатэктомия выполняется как дополнение к операции шунтирования или для ускорения заживления язв, когда другие виды вмешательств невозможны [15]. Консервативное лечение АС делится на немедикаментозную, направленную на устранение влияния факторов риска атеросклероза (ФРА), так и медикаментозную терапию [90]. В основе терапии лежит ряд воздействий, направленных на улучшение микроциркуляции, подавление гиперпродукции цитокинов и свободных радикалов, повышение антиоксидантной активности крови, иммунокоррекцию, нормализацию липидного обмена, стимуляцию развития коллатералей. Их реализация в настоящее время стала возможной благодаря появлению новых эффективных фармакологических средств, обладающих, как правило, многокомпонентным действием [90]. Обязательной является холестерин-снижающая терапия. Для этих целей применяют ингибиторы ГМГ КоА редуктазы, секвестранты желчных кислот, фибраты, препараты никотиновой кислоты, препараты, содержащие незамещенные жирные кислоты. Уделяют внимание нормализации артериального давления, применяя ингибиторы АПФ, β-блокаторы, блокаторы кальциевых каналов и диуретики [90]. При назначении статинов нивелируется эндотелиальная дисфункция и кардиоваскулярный риск, благодаря снижению уровня холестерина, увеличению эндотелий-зависимой вазодилатации, уменьшению уровня супероксидных радикалов, СРБ, провоспалительных цитокинов и проатерогенных ИК [146, 210, 258, 355]. Статины оказывают влияние на 57 уменьшение и стабилизацию антитромботический, атеросклеротической антиоксидантный, бляшки, проявляют противовоспалительный, антиишемический и антиангинальный эффекты [190, 292]. Отмечено влияние статинов на уменьшение содержания рецептора ангиотензина-1, что способствует нормализации артериального давления [432]. Однако, в большом исследовании, проведенном на 244000 пациентах в нескольких странах, показано, что использование статинов незначительно предотвращает все случаи смертности от заболеваний сердца на фоне атеросклероза [352]. И, хотя назначение статинов сокращает абсолютный риск смертности на 3,4 %, у многих пациентов сохраняется риск неблагоприятного прогноза, несмотря на проводимую терапию [393]. Антиатеросклеротический эффект каннабиноидной терапии в основном подтвержден в экспериментальных исследованиях на животных снижением риска развития заболевания и предотвращением ишемических осложнений. Использование селективных периферических блокаторов каннабиоидных рецепторов 1 типа (СB1R) и активаторов каннабиоидных рецепторов 2 типа является многообещающим в терапии АС. Однако, множество психических осложнений от назначения блокаторов СB1R существенно ограничили их применение [322, 421]. Доказана эффективность от ежедневного приема аспирина для предотвращения кардиоваскулярного риска. Однако, нельзя не учитывать развитие побочных эффектов и резистентности, связанными с применением аспирина [31]. Так, в 2009 г в США под руководством правительства в целевой профилактической программе были проведены исследования зависимости между приемом аспирина, сокращением риска смертности от ССЗ и с потенциальным риском от длительного употребления препарата. В ходе исследования было установлено, что снижение риска смертности имеет зависимость от возраста пациента и рода занятий, а потенциальная польза – (сокращение риска смертности) была сопоставима с частотой случаев развития желудочных кровотечений [174]. Одним из препаратов, которое финансируемом успешно Национальным зарекомендовало Институтом себя Здоровья в исследованиях, США, явилась 58 никотиновая кислота. Ее эффект заключался в снижении ТГ, ЛПНП, ЛП(а), повышении ЛПВП, однако ее масштабное применение в терапии АС было ограничено из-за раздражающего эффекта [193]. P. Gourdy с соавт. (2008) в изучении роли эстрадиола, как про и антиатерогенного гормона, показал роль заместительной гормональной терапии, как фактора уменьшающего риск развития атеросклероза у женщин в постменопаузальном периоде [237]. С целью коррекции нарушений системы свертывания крови и восстановления сосудистого тонуса при ОАНК применяют ангиопротекторы, дезагреганты и реологические препараты (ацетилсалициловую кислоту, никотиновую кислоту и ее производные, клопидогрел, пентоксифиллин (Трентал), простагландины Е1, тиклопедин, дипиридамол, экстракт Гинко Билоба, гепарин, низкомолекулярные гепарины, не требующие постоянного лабораторного мониторинга гепарин–сульфаты: ломопоран, сулодексид, реополиглюкин и др., спазмолитики (папаверин, но-шпу и др.) [23, 60, 90, 118]. Для уменьшения стрессорных реакций и болевого синдрома рекомендовано применение антидепрессантов. Пентоксифиллин (производное метилксантина) – улучшает реологические свойства крови (снижает агрегацию и адгезию тромбоцитов, эритроцитов, повышает содержание активного плазминогена, плазмина и антитромбина III в плазме крови, снижает уровень фибриногена), обладает выраженным венотонизирующим действием, высоким лимфодренирующим эффектом, предотвращает миграцию, адгезию и активацию лейкоцитов, улучшает пластические свойства эритроцитов за счет повышения в них АТФ [60, Противовоспалительный 90]. эффект пентоксифиллина связан с блокированием токсического действия фактора некроза опухоли на клетки эндотелия, подавлением активности фосфодиэстеразы, цитокин- опосредованной активации нейтрофилов, адгезии лейкоцитов к эндотелию, снижении выделения свободных радикалов кислорода [60]. Пентоксифиллин и простагландины используют, как правило, в лечении критической ишемии нижних конечностей и трофических язв, связанных с нарушением артериального кровообращения. Простагландины расширяют артерии малого 59 калибра, усиливают кровоток в капиллярах, повышают фибринолитическую активность крови, подавляют агрегацию и адгезию тромбоцитов и лейкоцитов [60]. Однако терапия простагландинами требует мониторинга ЭКГ. Активно ведется работа по изучению эффективности различных иммуномодуляторов в патогенезе иммунооппосредованного воспаления при атеросклерозе [58, 60, иммуномодулирующими 75, Препарат 79]. свойствами, так и «Галавит» обладает как противовоспалительными свойствами вследствие модуляции синтеза противовоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ) гиперактивированными клетками, влияет на синтез иммуноглобулинов, повышая их уровень и функциональную активность. Галавит ранее широко применялся в экспериментах на крысах при разной патологии [103, 149]. Показана эффективность галавита при эссенциальной артериальной гипертензии, одного из основных факторов риска развития атеросклероза [7]. S. Apostolakis с соавт. (2008) в своей работе упоминает об использовании синтетических пептидов – аналогов IL-1R; ингибиторов ГМК-КоА-редуктазы; олигодезоксинуклеотидов, в качестве ингибиторов синтеза цитокинов [171]. Влиять на активность цитокинов возможно путем воздействия на ММP. Использование тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ (TIMP) влияет на ММP профиль, а следовательно и на цитокины [112,114,359]. Основными терапевтическими мишенями вакцинации при атеросклерозе является окисленные ЛПНП, апопротеин В-100, β2-гликопротеин, провоспалительные цитокины. Эффективной считается вакцинация, ведущая к развитию толерантности к антигенам. Возможной терапевтической стратегией является блокирование собственных антител к HSP60 [194]. Таким образом, прогрессирующее нарастание развития АС во всем мире, его эпидемические масштабы требуют дальнейшего изучения патогенеза заболевания. Многочисленные экспериментальные клинические, исследования патологоанатомические свидетельствуют, что и поражение артериальной стенки обусловлено воспалительной реакцией. Изменения 60 реагирования эндотелия с клетками иммунной системы на уровне цитокинов является ранним проявлениями атерогенеза. Цитокиновый дисбаланс влияет на образование, рост атеросклеротической бляшки и вносит свой вклад в ее дестабилизацию с дальнейшим тромбообразованием. Однако аспекты цитокиновой регуляции атерогенеза остаются еще до конца не выясненными и, часто, противоречиво трактуются разными авторами. Изучение экспрессии цитокинов, их рецепции с позиций взаимодействия с показателями липидного спектра, ферментами, принимающими участие в ремоделировании сосудистой стенки, показателями системы ПОЛ/АОС, гормонами жировой ткани позволит расширить представления о патогенезе эндотелиальной дисфункции, разработать методы иммунопрофилактики и иммунореабилитации больных АС различных локализаций, что снизит вероятность развития осложнений, улучшит качество жизни больных, и уменьшит стоимость их послеоперационной реабилитации. До настоящего времени не получено убедительных данных о роли полиморфизма иммунорегуляторных генов: TNF-α (-308G/A), IL-6 (-174G/C), TGFβ1 (-509C/T), IL-10 (-1082G/A), PTPN22 rs 2476601 (G/A) в течении атеросклеротического процесса, малочисленными остаются результаты о взаимосвязях ММР-9, ее тканевых ингибиторов и комплексов ММP-9/TIMP-1 и ММP-9/TIMP-2 с показателями липидного метаболизма, гормонами жировой ткани, цитокинами, что предопределило проведение исследования в этом направлении. Результативность клинических исследований по изучению патогенеза АС часто ограничиваются неоднородностью выборки, наличием многочисленных сопутствующих заболеваний и разнообразием факторов риска у пациентов. Изучение патогенеза АС в эксперименте обеспечит чистоту его модели, за счет использования одной линии животных, строго определенных факторов риска, и одинакового времени их воздействия на организм. Разработка адекватной и недорогой экспериментальной модели повреждения эндотелия - является необходимым шагом в целях диагностики, профилактики 61 и лечения атеросклероза. Экспериментальная оценка атеросклеротического повреждения сосудов с позиций изучения местного и системного цитокинового дисбаланса, позволит четко выявить и доказательно обосновать эффективность применения иммуномодулирующих препаратов в терапии этого заболевания. 62 Глава 2. Направления, материалы и методы исследования Наблюдение за пациентами с АС проводилось в кардиохирургическом отделении ГБУЗ Приморской Краевой клинической больницы № 1 (главный врач Кузьмин А.В.) и в отделении сосудистой хирургии Владивостокской клинической больницы № 2 г. Владивостока (главный врач Глушко В.В.) за период с 2009-2013 годы. Среди всех пациентов с АС было 220 мужчин (84,6 %) и 40 женщин (15,8%) (рисунок 1). 15,40% 84,60% М Ж Рисунок 1 – Распределение пациентов с АС по полу При распределении пациентов с АС по возрасту, согласно классификации ВОЗ, зарегистрировано, что в возрастной группе 45-59 лет (средний возраст) было 109 человек (41,9 %), из них 95 мужчин (36,5%) и 14 женщин (5,4%), от 60 до 74 лет (пожилые) - 107 чел. (41,2 %), из них мужчин - 85 (32,7%) и 22 женщины (8,5 %), возрастную группу старческого возраста (75-89 лет) составляли 44 чел. (16,9%), среди них - 40 мужчин (15,4%) и 4 женщины (1,5%) (рисунок 2). 16,90% 41,90% 41,20% 45-59 лет 60-74 года 75-89 лет Рисунок 2 – Распределение пациентов с АС по возрасту 63 Распределение в группах пациентов с АКА (ИБС) и с ОАНК по половому признаку представлено в рисунке 3. Возрастная характеристика в группах пациентов с АКА (ИБС) и с ОАНК отражена в рисунке 4. Пациенты с АС – 260 человек Пациенты с АКА (ИБС)140 чел. Мужчины 115 чел. (82,1%) Женщины 25 чел. (17,9%) Пациенты с ОАНК -120 чел Мужчины 105 чел. (87,5%) Женщины 15 чел. (12,5%) Рисунок 3– Распределение пациентов с АКА (ИБС) и с СА (ОАНК+(ИБС)) по полу Пациенты с АКА (ИБС) 140 чел. 45-59 лет - 57 чел. (40,7 %) 50 м +7ж 60-74 г. 59 чел. (42,1 %) 42 м+17 ж 75-89 лет - 24 чел. (17,2%)23 м+1 ж Пациенты с ОАНК 120 чел 45-59 лет 52 чел. (43,3 %) 45 м+7ж 60-74 г. 48 чел. (40,0%) 43 м+5 ж 75-89 л 20 чел. (16,7%) 17м+3ж Рисунок 4 – Распределение пациентов с АКА (ИБС) и ОАНК по возрасту Проведено распределение пациентов с АКА (ИБС) на группы в зависимости от клинического течения ИБС. По результатам ЭКГ и клинических проявлений стабильная стенокардия (СС) напряжения регистрировалась у 121 чел. (86,4%), при этом СС напряжения II функционального класса (ФК) определялась у 31 пациента (22,1%), III ФК - у 61 пациента (43,6%), IV ФК - у 29 пациентов (20,7%) (согласно Российским рекомендациям по диагностике и лечению стабильной стенокардии, второй пересмотр, 2008 г.), нестабильная стенокардия отмечалась у 19 человек (13,6%) (рисунок 5). 64 50,00% 43,6% 40,00% 30,00% 22,2 % 20,7 % 20,00% 14% 10,00% 0,00% II ФК III ФК IV ФК стабильная стенокардия нестабильная стенокардия Рисунок 5 – Количество (%) пациентов с ИБС со стабильной стенокардией напряжения и нестабильной стенокардией У 109 (90,8%) пациентов регистрировался инфаркт миокарда (ИМ) в анамнезе, из них повторные ИМ в количестве 2 и 3- были у 6 чел (5%). У 22 пациентов после ИМ прошло времени - от 1 до 3 месяцев; у 24 пациентов - от 3 до 6 месяцев; у 27 человек от 6 до 12 месяцев, а у 36 – более 12 месяцев после ИМ (рисунок 6). ИМ в анамнезе От 1 до 3 мес. после ИМ От 3 до 6 мес. после ИМ От 6 до 12 мес. после ИМ Более 12 мес. после ИМ Рисунок 6 – Распределение (%) больных с АКА, ИБС по времени после перенесенного ИМ в анамнезе По данным ЭКГ и эхокардиографии у больных у 88 пациентов (62,8%) отмечен постинфарктный кардиосклероз. Аневризма левого желудочка обнаружена у 5 чел (3,57%) больных. По результатам коронарографии: у 59 пациентов (42,1%) выявлена обтурация от 1-ой до 2-ух артерий, у 81 чел. (57,9%) - от 3 до 6 артерий. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) I степени регистрировалась у 50 пациентов (35,7%), II А степени – у 61 пациента (43,6%), II Б – у 29 пациентов (20,7%). 65 При распределении пациентов в зависимости от нарушения сердечного ритма в клиническом течении ИБС, выявлено, что наличие аритмии было у 25 чел. (17,9 %) из 140 пациентов. Нарушение функции проводимости зафиксировано у 6 больных (4,28%) (атриовентрикулярная блокада 1 и 2 степени – у 4 пациентов, полная внутрижелудочковая блокада - у 1 пациента, блокада левой ножки пучка Гиса – у 1 пациента). У 19 больных (13,6%) наблюдалось нарушение автоматизма и возбудимости миокарда (фибрилляция предсердий – у 10 пациентов, желудочковая экстрасистолия - у 6 чел., суправентрикулярная экстрасистолия - у 2 чел., синдром слабости синусового узла – у 1 больного). Повторная реваскуляризация миокарда (транслюмбальная баллонная ангиопластика со стентированием) ранее проводилась 11 пациентам (7,8%). Практически у всех обследованных пациентов имелось от 1 до 3 сопутствующих заболеваний в стадии клинической ремиссии или медикаментозно контролируемых. Наиболее частой сопутствующей патологией была гипертоническая болезнь – у 116 пациентов (82,9%), хронический гастрит в стадии ремиссии регистрировался у 5 пациентов (3,6%), язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки в стадии ремиссии - у 6 пациентов (4,3%), аденома предстательной железы – у 6 пациентов (4,3%), ожирение 2-3 степени, метаболический синдром – у 1 пациента (0,7%). При распределении пациентов с ОАНК на группы в зависимости от клинического течения ОАНК выявлено, что по экстренным показаниям, с проявлениями критической ишемии НК, поступили 78 человек (64,7 %). По плановой госпитализации (с отсутствием острых проявлений ишемии НК) поступили 42 чел. (35,3%). По результатам осмотра, пальпации, аускультации, инструментальных методов исследования (дуплексного сканирования и ангиографии) у 33 чел. (27,2 %) был диагностирован синдром Лериша, у 21 чел.(17,9 %) – окклюзия бедренно-подколенного сегмента (БПС), у 66 чел. (54, 9 %) – периферическая 66 форма (окклюзия периферических артерий (ПА)), распространенная форма – у 27,5 % (рисунок 7). 60,00% 40,00% 54,90% 27,20% 17,90% 20,00% 0,00% Синдром Лериша Окклюзия БПС Окклюзия ПА Рисунок 7– Распределение (%) больных с ОАНК в зависимости от уровня поражения артерий нижних конечностей Распространенный ОАНК (окклюзии повздошно-бедренного, бедренноподколенного сегментов, и артерий тыла стопы) выявлен у 11 человек (9,4%). У 15 чел. (12,7 %) установлена аневризма аорты. По клинической классификации Fontaine-Покровского, хроническая ишемия НК II стадии регистрировалась у 39 пациентов (32,5 %), III – у 46 чел. (38,3%) и IV стадии – у 25 чел (20,8 %) (рисунок 8). 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% 32,50% 38,30% ишемия н/к II стадии ишемия н/к III стадии 20,80% ишемия н/к IV стадии Рисунок 8 – Распределение больных с ОАНК по стадии ишемии НК (классификация Fontaine-Покровского) Пациенты с ОАНК предъявляли жалобы, отражающие явления ишемии нижних конечностей (таблица 1). Признаки нарушения периферического кровообращения и микроциркуляции в НК были установлены по результатам осмотра (таблица 2). По результатам курильщиками. опроса, 94% пациентов являлись хроническими 67 Таблица 1 – Жалобы пациентов с ОАНК Жалобы пациентов при поступлении Изменение цвета кожи НК Повышенная утомляемость НК Зябкость, парастезии НК Повышенное выпадение волос на кожи НК Снижение эластичности кожи и подкожной клетчатки НК Oгрубение подошвенной поверхности стопы Боль в нижних конечностях при ходьбе Боль в нижних конечностях в покое Количество пациентов (%), с жалобами 94 % 100% 66 % 78% 100 % 44% 70,2 % %. 63,5% Таблица 2 – Результаты осмотра (Status localis) нижних конечностей у пациентов с ОАНК Данные осмотра (Status localis) Снижение температуры тканей НК Кожные изменения (снижение роста волос, эластичности кожи) Гиперкератоз Атрофия мышц, подкожной клетчатки Снижение пульсации магистральных артерий Трофические язвы и гангрена НК Количество пациентов (%) с выявленными признаками 77% 96% 86%, 76% 92%. 19,4 % По клиническим проявлениям и результатам ЭКГ у 114 пациентов с ОАНК (95%) регистрировался сопутствующий АКА – ИБС, стабильная стенокардия напряжения II-III ФК. У 93 (77,5%) пациентов с ОАНК была выявлена гипертоническая болезнь. Нарушения сердечного ритма (предсердная экстрасистолия, трепетание предсердий, желудочковая экстрасистолия, фибрилляция предсердий, мерцательная аритмия) регистрировались у 7 пациентов (5,8%). Сопутствующая патология была выявлена у 76 (63,5 %) пациентов с ОАНК. При этом заболевания желудочно-кишечного тракта (язвенная болезнь, хронический гастрит, желчнокаменная болезнь) в стадии ремиссии составляли 49,7%, хронический бронхит в стадии ремиссии - 13,8 %. 68 При распределении пациентов с АС, в зависимости от концентрации общего (ХС) крови выявлено, что содержание ХС менее 5,0 ммоль/л регистрировалось у 134 человек, от 5,1 до 6,1 ммоль/л - у 54 чел., более 6,2 ммоль/л - у 72 чел. По результатам биохимического анализа крови у пациентов с АКА (ИБС) отмечено, что уровень общего ХС крови менее 5,0 ммоль/л был у 81 пациентов, умеренное повышение общего ХС (от 5,1 ммоль/л до 6,1 ммоль/л) отмечалось у 35 пациентов, и высокий уровень общего ХС (более 6,2 ммоль/л) определялся у 24 пациентов (рисунок 9). Уровень общего ХС крови у пациентов с АКА Менее 5,0 ммоль/л у (57,8 %) От 5,1 ммоль/л до 6,1 моль/л у (25 %) пациентов Более 6,2 ммоль/л у (17,2%) пациентов Рисунок 9 – Распределение (%) больных с АКА, ИБС по содержанию общего ХС крови Оптимальный уровень общего ХС (меньше 5,0 ммоль/л) регистрировался у 53 чел (44%), умеренное повышение ХС (от 5,1 до 6,1 ммоль/л) - у 19 чел (16 %), высокое содержание (более 6,2 ммоль/л) - у 48 чел. (40%) пациентов с ОАНК (рисунок 10). Уровень общего ХС крови у пациентов с ОАНК Менее 5,0 ммоль/л у (44 %) От 5,1 ммоль/л до 6,1ммоль/л у (16 %) пациентов Более 6,2 ммоль/л у (40 %) пациентов Рисунок 10 – Распределение (%) больных с ОАНК по содержанию общего ХС крови Среди представителей контрольной группы (50 здоровых доноров 30-50 лет) у 17 чел. (34%) в анамнезе регистрировались следующие соматические 69 заболевания, такие как: хронический гастрит, дуоденит, дискинезия желчевыводящих путей, хронический тонзиллит, в стадии ремиссии. 2.1 Методы клинических исследований. Характеристика исследуемого материала В качестве материала исследования использовалась сыворотка крови пациентов. Забор крови осуществлялся за сутки перед проведением операции аортокоронарного шунтирования (АКШ) и стентирования коронарных артерий в отделении кардиохирургии и при поступлении пациентов с ОАНК в отделение сосудистой хирургии. Направления, методы и объем исследований представлены в таблице 3. Таблица 3 – Направления, методы и объѐм клинических исследований Направление исследования Клинические исследования Исследования цитокинового статуса Исследование полиморфизма генов Исследование показателей деградации межклеточного матрикса Методы исследования Объѐм работ Анкетирование пациентов. Осмотр, сбор анамнеза (жизни и заболевания), оценка объективного и локального статуса. Комплексное (клиникоиммунологическое, биохимическое, функциональное) обследование больных Определение содержания цитокинов: IL-1β, IL-6, IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-17, IL-10, TGF-β1, TGF-β2 и рецепторов к цитокинам (IL-2R, IL-6R, TNF-αRI, TNF-αRII) в сыворотке крови осуществляли методом сендвич варианта ИФА с использованием реактивов «RD Diagnostics Inc.», USA. 260 чел. Исследование генов: TNF-α (rs1800629), IL-6 (rs1800795), IL-10 (rs1800896), TGFB1 (rs1800469) и PTPN22 (rs2476601) осуществляли методом ПЦР в крови пациентов. Определение содержания металлопротеиназы-9 (MMP-9), ее тканевого ингибитора TIMP1 комплекса MMP-9 и ее тканевых ингибиторов (MMP-9/TIMP1, MMP-9/TIMP2) проводили методом ИФА в сыворотке крови пациентов. 260 чел. 310 чел. 4030 проб 310 проб 1550 проб 310 чел. 1240 проб 70 Определение адипокинов (гормонов жировой ткани) Статистическая обработка материала Определение содержания лептина и адипонектина крови осуществляли методом ИФА в сыворотке крови пациентов. 310 чел. 620 проб Для статистической обработки полученных данных использовали программу «Stat Plus 2010», регистрационный номер "3-b1WdC-7k32t". Результаты представляли в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей. Сравнение средних значений в выборках осуществляли с помощью непараметрического критерия Уилкоксона-МаннаУитни. Для изучения взаимосвязей между признаками использовали метод ранговой корреляции по Спирмену, факторный анализ (определение факторной нагрузки, метод главных компонент), критерий χ², ROC – анализ. Для определения риска заболевания или риска развития определенных клинических проявлений АС вычисляли отношение шансов (OШ) с доверительным интервалом=95%, достоверность различий (р) в распределении частот генотипов между группами оценивали с помощью критерия χ². Все показатели Определение цитокинов: IL-1β, IL-6, IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-17, IL-10, TGF-β1, TGF-β2; рецепторов к цитокинам: (IL-2R, IL-6R, TNF-αRI, TNFαRII); металлопротеиназы-9 (MMP-9); ее тканевого ингибитора 1 типа TIMP; комплексов: (адипонектина и MMP-9/TIMP1, лептина) MMP-9/TIMP2; проводили методом адипокинов сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа, согласно прилагаемой инструкции с использованием специфических реактивов фирмы ―R&D Diagnostics Inc.‖ (USA). Учет результатов производили с помощью иммуноферментного анализатора ―Multiscan‖ осуществляли путем (Финляндия). построения Расчеты количества калибровочной кривой показателей с помощью компьютерной программы, выражали в пг/мл или нг/мл Для определения полиморфизма генов TNF-α (rs1800629), IL-6 (rs1800795), IL-10 (rs1800896), TGFB1 (rs1800469) и PTPN22 (rs2476601) использовали образцы ДНК, выделенные из цельной венозной крови методом высаливания с использованием протеиназы К. Генотипирование аллельных вариантов осуществляли методом рестриктного анализа продуктов 71 амплификации специфических участков генома. Амплификацию осуществляли в пробирках типа «Эппендорф» путем полимеразной цепной реакции. Реакционная среда общим объемом 20 мкл состояла из буфера для проведения ПЦР («Сибэнзим», Новосибирск), включающего в себя следующие реагенты: 60 мМ Tрис-HCl (pH 8,5); 25 мМKCl; 1,5 мМ MgCl2; 10 мМ 0,1% меркаптоэтанола; Triton X-100; а также 30 пкмолей каждого олигонуклеотида; 125 мМ каждого d NTP («Сибэнзим», Новосибирск); 50-200 нг геномной ДНК и 1-2 ед. Taq полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск). 2.2 Контингент, материал и методы экспериментального исследования Эксперимент проводился на 55 белых крысах самцах линии Wistar, массой 250-350 грамм, в динамике, на протяжении 6 месяцев. Все животные были разделены на 5 групп (таблица 4). На 2, 4 и 6 месяцев наблюдения по 5 животных из каждой группы выводили из эксперимента под эфирным наркозом, путем декапитации. Таблица 4 – Группы животных, участвующих в экспериментальном исследовании группа количество 1 группа (ГЛ + гипотиреоз) 15 2 группа - комплексная модель 15 АС (ГЛ, гипотиреоз и АГ) 3-здоровые крысы (контроль) 15 4 группа - (комплексная модель 5 АС, с применением галавита) 5 группа - (комплексная модель 5 АС, с применением митилана) 2 месяц 5 5 4 месяц 5 5 6 месяц 5 5 5 - 5 - 5 5 - - 5 В конце опыта оставшимся животным 2-ой группы (ГЛ, гипотиреоз и АГ) производилось введение препаратов «галавит» - 5 крысам (4 группа) и «митилан» - 5 крысам (5 группа). 72 По окончании экспериментальной терапии производилось выведение животных из эксперимента и исследование биологического материала. Характеристика препаратов: 1. Галавит. Регистрационное удостоверение (Р № 000088/02-2000 МЗ РФ) Международное непатентованное фталазиндиона натрия название: дигидрат. Амино-диоксо-тетра-гидро- Фармацевтическая группа – иммуномодулятор. Состав: активное вещество - натриевая соль аминофталгидрозида. Применяемая форма выпуска: флаконы со 100 мг порошка для инъекций Животным 4 группы препарат Галавит (Гт) вводили в/м, в количестве – 1 мг на 1 кг веса, по схеме: 1 инъекция в день, в течение 10 дней, затем 1 инъекция в 3е суток. Общий курс лечения крыс галавитом составлял - 15 инъекций. 2. Митилан - полисахаридный гликогеноподобный 1,4; 1,6-α-D-глюкан, выделенный из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus, производства ТИБOX ДВО РАН. Обладает иммуномодулирующим, ранозаживляющим, гиполипидемическим, противовоспалительным, УФ- и радиопротекторным эффектами, не токсичен [128, 144]. Высокая физиологическая активность митилана и наличие сырьевой базы обеспечивает его практическое применение. Способ получения митилана из мидии защищен патентом РФ № 1624973. Фармакокинетика – в процессе изучения Используемая форма выпуска - белый порошок. Несовместимости с другими группами лекарственных препаратов не выявлено. Животным 5-ой группы осуществляли введение Митилана (Мт) per os, в количестве – 10 мг/кг, через день, в течение 1 месяца. Материалом для исследования явились: сыворотка крови, фрагменты аорты, бедренных артерий и печени крыс. Моделирование ГЛ и гипотиреоза проводили по методике К.А. Мещерской и Н.П. Королевой [81] в модификации: Диета заключалась в добавлении в корм животным порошка холестерина в количестве 1 %, 10 % маргарина, мерказолила - 10 мг/кг массы тела, и витамина D - 2,5 МЕ на 1 кг массы тела. Кормление животных осуществляли на 73 протяжении 6 месяцев (180 суток). Моделирование АГ проводилось по методике F. Helle (2006), в модификации: наложение лигатуры на почечную ножку левой почки нерассасывающимся шовным материалом и прошивание верхнего полюса правой почки, оставляя 2/3 органа. Гипертензия развивалась в течение 6 недель (реноваскуляторный и ренопривный механизмы развития АГ) [412]. Модель комплексного воздействия факторов риска: ГЛ, замедления метаболизма (гипотиреоз) и АГ заключалась в следующем: за 15 дней перед началом кормления аналогичным атерогенным рационом производится операция моделирования симптоматической реноваскулярной артериальной гипертензии по вышепредставленной методике. Направления, методы и объем исследований представлены в таблице 5. Таблица 5 – Направления, методы и объѐм экспериментального исследования Направление исследования Методы исследования Объѐм работ Экспериментальн ое исследование Наблюдение за животными (оценка состояния, поведения двигательной активности), измерение артериального давления. 55 крыс Исследование цитокинового статуса Магниторезонансная томография сосудистого русла крыс Гистохимическое (оценка NADPH-диафоразы), гистологическое исследование пораженных артерий (аорты и бедренных артерий) и ткани печени Определение содержания цитокинов: IL-1β, IFNγ, TNF-α, IL-10 в сыворотке крови, фрагментах аорты и бедренных артерий Исследование коллагеназной активности Определение содержания металлопротеиназы-9 (MMP-9) в сыворотке в сыворотке крови, фрагментах аорты и бедренных артерий Характеристика показателей окислительного метаболизма Определение показателей общей оксидантной активности ООА и общей антиоксидантной активности ОАА в сыворотке крови и ткани пораженных и непораженных артерий Оценка состояния сосудистого русла 12 крыс/ (фото) 55 крыс 275 проб 55 крыс 660 проб 55 крыс/ 165 проб 55 крыс/330 проб 74 Исследование липидного спектра сыворотки крови Определение содержания показателей липидного 55 крыс/220 профиля крови (содержание общего холестерина, проб. триглицеридов, холестерина ЛПНП, ЛПВП). Статистическая обработка материала. Для статистической обработки полученных данных использовали программу «Stat Plus 2010», регистрационный номер "3-b1WdC-7k32t". Результаты представляли в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей. Сравнение средних значений в выборках осуществляли с помощью непараметрического критерия Уилкоксона-Манна-Уитни. Для изучения взаимосвязей между признаками использовали метод ранговой корреляции по Спирмену. Все показатели Определение артериального давления у животных производили на хвостовой артерии с помощью анализатора MLU/ 4C 501 (MedLab КНР). Метод магниторезонансной томографии заключался в следующем: животных перед сканированием усыпляли растворами рометара (Xylazinum, SPORA, PRAHA) в концентрации 1 мг/мл и реланиума в концентрации 2 мг/мл, внутрибрюшинно. МРТ диагностика выполнена на томографе для экспериментальных исследований «PharmaScan US 70/16» (Bruker, Германия) с напряженностью магнитного поля 7,0 Тесла, частотой 300 MHz и катушкой типа BGA 09P. Для ангиографии использовали протокол Head-Angio со следующими параметрами: TR/TE=50.0/5.6; угол наклона 25,0; поле изображения 3,0/3,0/3,0; эффективная толщина среза 30 мм; перекрытие 30,0 мм; матрица 256/256/64 элементов; одно усреднение сигнала, время сканирования 14 мин. Гистологическое исследование пораженных артерий (аорты и бедренных артерий) осуществлялось путем фиксации фрагментов в 10% нейтральном формалине с дальнейшей заливкой в парафин. Использовали следующие методы окраски препаратов: гематоксилин и эозин Судан-4 (метод Окамото). Описание микропрепаратов проводилось на микроскопе Olympus BX 41. Снимки осуществляли с использованием электронной камеры Olympus ДР 12, 75 при постоянном увеличении на 100 и на 400. Морфометрия проводилась с применением окуляр-микрометра МОВ – 1-16×. Содержание NADPH-диафоразы определяли гистохимическим методом по стандартной прописи Hope, Vincent (1989): фрагменты сосудов животных выделяли с помощью лезвия и опускали в охлажденный, приготовленный на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) 4% параформальдегид, который из всего класса диафораз сохраняет активность только NADPH - диафоразы. Материал фиксировали в течение 2 часов при температуре 4 °С, сутки промывали при той же температуре в 15% растворе сахарозы, 7-8 раз меняя раствор. Из образцов ткани, замороженных в криостате, изготавливали срезы толщиной 10 мкм, монтировали на предметные стекла и помещали в инкубационную среду. Состав и конечная концентрация среды были следующими: 50 мМ Трис-буфер (рН 8,0), 1 мМ NADPH («Sigma»), 0,5 мМ нитросинего тетразолия («Sigma») и 0,2% Тритон Х-100 («Serva»). Инкубацию проводили в течение 60 минут в термостате при дистиллированной температуре воде, 37oС. обезвоживали Затем и срезы ополаскивали заключали в бальзам в по общепринятой в гистологии методике. Измерение активности фермента производили в эндотелии и гладких миоцитах аорты, бедренных артериях крыс. Активность фермента определяли при помощи программы ―Image J 1.37 v‖ и выражали в единицах оптической плотности. Определение уровня цитокинов: Rat (IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-10) и металлопротеиназы-9 Rat (MMP-9) – проводили в сыворотке крови животных и ткани пораженных и непораженных артерий. Для анализа использовали специфические реактивы фирмы ―R&D Diagnostics Inc.‖ (USA). Исследование показателей проводили иммуноферментного результатов методом анализа, производили с согласно помощью сэндвич-варианта прилагаемой твердофазного инструкции. иммуноферментного Учет анализатора ―Multiscan‖ (Финляндия). Расчеты количества цитокинов проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. 76 Определение липидного спектра (содержание общего холестерина (ОХ); ТГ; холестерина ЛПНП, ЛПВП) в сыворотке крови животных проводили с помощью стандартного колориметрического метода с использованием реагентов «Ольвекс диагностикум» (Россия). Определение общей оксидантной (ООА) и общей антиоксидантной (ОАА) активности сыворотки крови и фрагментов сосудов (аорты и бедренной артерии) крыс проводили спектрофотометрическим методом, разработанным в лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН с использованием индикатора – пигмента морского ежа Scaphe chinus mirabilis – гистохрома [69]. Для суждения о дисбалансе антиоксидантной и оксидантной систем определялся оксидантный индекс (ОИ). Формула расчета: ОИ = ООА/ОАА. Для статистической программу «StatPlus обработки 2010», Результаты представляли Сравнение средних непараметрического полученных регистрационный данных номер использовали "3-b1WdC-7k32t". в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей значений в выборках осуществляли критерия Уилкоксона-Манна-Уитни, с помощью сопряженность признаков оценивали с помощью факторного анализа и критерия χ 2. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции по Спирмену, значимость факторов оценивали методом факторного анализа. 77 Глава 3. Собственные исследования 3.1. Цитокины – их роль в патогенезе атеросклероза Воспалительная теория развития эндотелиальной дисфункции и АС рассматривается с позиций нарушения регуляторного дисбаланса цитокинов и их рецепторов, способствующих иммунооппосредованному повреждению артерий с аутоиммунным компонентом [10, 384, 395, 397, 432]. Цитокины, вырабатываемые в основном активированными клетками иммунной системы и эндотелиоцитами, играют важную роль в атерогенезе, регулируют амплитуду, продолжительность воспаления и иммунного ответа в артериальной стенке [159, 397]. Как было показано нами в обзоре литературы, по мнению большинства авторов, высокий уровень провоспалительных цитокинов: IL-1β, TNF-α, IL-6 и IFN-γ приводит к развитию и прогрессированию АС [30, 47, 96, 102, 125, 148]. Считают, что эти цитокины способствуют формированию атеромы за счет увеличения адгезивности сосудистой стенки, проникновению в нее иммунных клеток пролиферации ГМК, преобразованию макрофагов в пенистые клетки, отложению холестерина в сосуде, нарушению процессов ремоделирования артериальной стенки и другим проатерогенным эффектам [32, 37, 148, 237]. Эффект действия провоспалительных цитокинов зависит от продукции и активности их рецепторов. По данным литературы IL-6 реализует свое действие через рецептор IL-6R. Научные работы различных авторов свидетельствуют, что проатерогенные эффекты IL-6 опосредованы не самим цитокином, а транссигналингом – связью комплекса IL-6-IL-6Rна мембране клеток мишеней со вторичным протеином gp130 [89, 372]. Растворимая форма IL-6R служит фактором риска сердечно-сосудистой патологии и является мишенью для разработки его синтетических блокаторов [180, 360]. Растворимые рецепторы TNFα – TNFR1 (CD120a) и TNFR2 (CD120b), осуществляют связывание 78 цитокина, и, напротив, действуют как ингибиторы его биологической активности [73, 89, 94, 169]. При этом существуют неоднозначные мнения в отношении реализация действия провоспалительных цитокинов в атерогенезе. Согласно исследованиям Е.И. Амчиславского и И.С. Фрейдлин (2005), IL-1β только в высоких концентрациях способен стимулировать миграцию эндотелиальных клеток в артериальную стенку и способствовать образованию атеромы [4]. Другими авторами отмечено, что низкий уровень IL-1β приводит к нарушению сосудистого ремоделирования через MMP3-зависимые механизмы [166]. По мнению Ю.И. Рагино, с соавт. (2009); Н.С. Юбицкой с соавт. (2010) увеличение содержания TNF-α отмечается, преимущественно на ранних стадиях АС, когда еще нет выраженных клинических проявлений заболевания [112, 159]. Другие исследователи установили снижение локального и системного уровня цитокина при прогрессировании АС и при развитии его осложнений [43, 91, 115]. В некоторых работах показано, что TNF-α увеличивает экспрессию и синтез аполипопротеина А-1 (апоА-1) – главного белкового компонента ЛПВП в клетках моноцитарно-макрофагальной линии человека, что расширяет представление о его неоднозначной роли в развитии АС [85]. Существуют исследования, подтверждающие противовоспалительные эффекты IL-6, такие как – ингибирование стимулированной продукции IL-1β, TNF-α, отмена дифференцировки макрофагов под действием M-CSF, индукция синтеза TIMP, ингибирование обмена веществ при хронических воспалительных процессах [89, 307]. Экспериментальные исследования показывают, что системный дефицит IL-6 вызывает нежелательные эффекты в регуляции воспаления, липидного метаболизма, и гомеостаза в целом и приводит к потенцированию АС [372]. При этом классический сингалинг соединение IL-6 с его мембранным – IL-6 R необходим для осуществления регенеративной и антивоспалительной активности цитокина [360]. Некоторые исследователи указывают на противоатерогенный эффект INF-γ реализуется в уменьшении количества сайтов, связывающих 79 ацетилированные ЛПНП на клеточной мембране без изменения их аффинности, что приводит к ингибированию индуцированной ЛПНП аккумуляции ХС в макрофагах, как в свободной, так и в эстерифицированной формах [125]. INF-γ индуцирует способность макрофагов продуцировать активатор плазминогена, конвертирующего превращение плазминогена в плазмин, тем самым, нормализует реологические свойства крови и препятствует тромбообразованию [11]. Интерлейкину-17, IL-2 и его растворимому рецептору (IL-2R), в патогенезе АС отводится иммунорегуляторная роль. Их действие в основном опосредовано через Проатерогенные активацию свойства других цитокина пролиферации лимфоцитов и иммунокомпетентных IL-2 проявляются клеток. стимуляцией их миграции в артериальную стенку с активацией выработки ими провоспалительных медиаторов. Биологические эффекты от сигнала IL-2/IL-2R заключаются в стимуляции пролиферации T (CD4+ клеток) и NK-клеток [142]. IL-2 sR – представляет собой растворимую форму клеточного рецептора к IL-2, экспрессирующуюся на поверхности лимфоцитов и образующуюся в результате слущивания их поверхностных молекул с дальнейшей секрецией в межклеточное пространство и в кровь [73]. Однако физиологической функцией IL-2 является также поддержание дифференцировки потенцирование T-reg, Fas-оппосредованной индуцированной активации клеточной смерти лимфоцитов, терминация иммунного ответа и поддержание состояния толерантности, т.е. – иммуносупрессии [66, 142]. В эксперименте обнаружено, что у мышей с нокаутом по гену IL-2 в организме накапливается большое количество активированных лимфоцитов и развиваются системные аутоиммунные воспалительные процессы, практически во всех органах и тканях [142]. Большинство авторов характеризуют проатерогенные эффекты IL-17 – усиление продукции макрофагами провоспалительных цитокинов: TNF-α, IL1β, G-CSF, IL-12, однако показаны и противоатерогенные его свойства – увеличение выработки противовоспалительных - IL-10, IL-1RА [39], что 80 приводит к зависимому от IL-17 уменьшению повреждения и воспаления сосудов [200, 339, 401]. Неоднородность суждений о роли противовоспалительных цитокинов IL-10 и TGF β также инициирует дальнейшие исследования по изучению их роли в патогенезе АС. Работы некоторых авторов свидетельствуют о снижении уровня IL-10 в крови больных с АС [9, 62], тогда как другие исследователи ассоциируют увеличенный уровень IL-10 с высоким риском развития кардиоваскулярной патологии, нарастанием ЛПОНП и индексом атерогенности [148]. Известно, что эффекты TGF-β в патогенезе АС зависят от его концентрации, адекватной рецепции и согласованного действия всех изоформ [310]. Таким образом, противоречивость данных, полученных отечественными и зарубежными авторами о роли вышеперечисленных цитокинов в развитии воспаления и атерогенеза, определила выполнение настоящего раздела работы – исследовать значение: IL-1β, TNF-α, растворимых рецепторов к TNF-α (TNF-αRI и TNF-αRII), IFN-γ, IL-6, IL-6R, IL-2, IL2R, IL-17, IL-10, TGFβ1 и TGFβ2 при АС, в зависимости от его локализации, данных анамнеза и клинических проявлений. 3.1.1 Оценка цитокинового профиля у пациентов с атеросклерозом При исследовании содержания провоспалительных цитокинов у пациентов с АС нами выявлено достоверное увеличение значений IL-6 и растворимых рецепторов к TNF-α (TNF-αRI и TNF-αRII), регистрировалась тенденция увеличения уровня IL-1β, TNF-α и IFN-γ, по сравнению с показателями контроля (таблица 6). Таким образом, мы подтвердили результаты исследования авторов об участии IL-6 в повреждении сосудов и повышении его уровня при АС [101, 278, 367]. Повышение уровня растворимых рецепторов к TNF-α можно объяснить 81 как компенсаторный механизм, проявляющийся в связывании TNF-α его рецепторами, являющимися ингибиторами биологической активности цитокина [89]. Нами установлена корреляция между TNF-α и его растворимым рецептором TNFRII (r=0,42, p=0,03), свидетельствующая о прямой взаимосвязи лиганд-рецептор. С другой стороны, известно, что через TNFRII типа, TNF-α стимулирует пролиферацию Т-клеток и выработку ими других провоспалительных цитокинов, следовательно, увеличение уровня TNF-αRII в сыворотке крови может косвенно отражать повышение количества комплекса (цитокинрецептор) на клетках и, проявление в результате этого, иммуностимулирующего эффекта [89, 350]. В нашем исследовании у пациентов с АС концентрация TNF-α имеет тенденцию к повышению по сравнению с контролем, однако статистически значимых отличий не установлено (таблица 6). Полагают, что TNFRII связан с TNF-α в течение короткого промежутка времени, затем происходит разрушение комплекса лиганд-рецептор, с дальнейшим предоставлением места для связывания TNFRI [39]. Показано, что увеличение уровня TNF-αRI является сильным предиктором летальности и развития СН у больных ИМ на фоне АКА и может быть использовано для стратификации их риска [419]. C. Duerrschmid с соавт. (2013), подтвердили, что TNF-α усиливает ангиотензин-II индуцированную активацию и пролиферацию фибробластов в миокарде, и стимулирует развитие кардиального фиброза, через TNFRI [214]. Мы провели анализ содержания цитокинов в зависимости от преимущественной локализации атеросклеротического процесса. Первую группу наблюдения составляли 140 пациентов с АКА (ИБС). В ходе исследования было установлено увеличение уровня IL-1β в 5,4 раза, IL-6 - в 2,4 раза по сравнению с его показателями у здоровых доноров (таблица 6). Это подтверждает результаты других следователей об участии IL-1β и IL-6 в атерогенном повреждении коронарных артерий [70, 89, 148, 367]. При этом 82 выявлено, что содержание других провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IFN-γ и IL-6 R при АКА (ИБС) не отличалось от референсных значений (таблица 6). Таблица 6 – Содержание провоспалительных цитокинов у пациентов с АС, АКА (ИБС), ОАНК и у здоровых доноров Пока затель Пациенты с АС 1 4,6 (0,9-9,5) Пациенты с АКА (ИБС) 2 6,5 (1,1-10,8) Пациенты с ОАНК 3 1,4 (0,3-4,6) Здоровые доноры 4 1,2 (0,5-9,2) 7,0 (2,4-12) 4,4 (1,0-11,0) 9,1 (6,6-15,8) 4,8 (2,2-7,9) TNF-α RI пг/мл 983,1 (910,2-1051,0) 955,9 (889,2-1013,9) 1076,5 (1001,2 -1194,4) 712,3 (703,3-814,1) TNF-αRII пг/мл 3693,2 (3273,1-4315,7) 3553,2 (3181,2-4072,5) 4465,2 (4045,6-5295,7) 3000 (2895,23150,4) IL-6 пг/мл 5,2 (1,0-9,7) IL-1β пг/мл TNF-α пг/мл Уровень значимости (Р) р1- р4=0,09 р2- р4 = 0,04 р2- р3 =0, 001 р3- р4>0,05 р1- р4=0,08 р2- р3 = 0,05 р2- р4>0,05 р3- р4=0,04 р1- р4=0,03 р2- р4=0,04 р2- р3=0,06 р3- р4=0,01 р1,2- р4=0,04 р2- р3 = 0,05 р3- р4=0,01 р1- р4=0,02 р2- р4=0,04 р2- р3=0,04 р3- р4=0,001 IL-6R 8,5 8,4 8,5 8,5 р1- р4>0,05 нг/мл (8,2-8,8) (7,9-8,7) (8,2-8,9) (8,7-9.0) р2,3- р4>0,05 р2- р3>0,05 IFN-γ 8,4 6,5 12,0 5,0 р1- р4=0,07 пг/мл (1,4-16,8) (2,8-10,6) (4,1-24,8) (3,8-14,5) р2- р4>0,05 р2- р3 = 0,05 р3- р4=0,03 результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1- р4 достоверность различий между пациентами с АС и здоровыми донорами; р 2- р4 - достоверность различий между пациентами с АКА (ИБС) и здоровыми донорами; р 2- р3 - достоверность различий между пациентами с АКА (ИБС) и с ОАНК+АКА; р3- р4 - достоверность различий между пациентами с ОАНК и здоровыми донорами. 4,7 (1,4-5,8) 7,0 (4,9-13,6) 1,6 (0,4-2,8) Выявленные изменения можно объяснить снижением функциональной активности клеток-продуцентов цитокинов в результате повреждения тканей в условиях длительной системной циркуляторной гипоксии и метаболического ацидоза, возможным превалированием локальной секреции и потребления в месте поражения артериальной стенки, компенсаторным подавлением их 83 продукции естественными ингибиторами, такими как: TNF-αRI и TNF-αRII или противовоспалительными цитокинами, приемом статинов пациентами. Поскольку известно, что статины – ингибиторы HMG-CoA редуктазы, оказывают плеотропные противовоспалительные эффекты: ингибируют синтез провоспалительных цитокинов ГМК, Т-лимфоцитами и макрофагами [210, 297, 322]. Вторую группу наблюдения представляли 120 пациентов с системным атеросклерозом, характеризующимся преимущественной клинической манифестацией облитерирующего атеросклероза нижних конечностей и менее активными проявлениями атеросклероза коронарных артерий и ИБС. В этой группе пациентов зарегистрированы следующие особенности изменений провоспалительных цитокинов: значения IL-1β были наиболее низкими (в 4,6 раз), чем при АКА (ИБС), однако не выходили за пределы референсных показателей. Возможными причинами наиболее низкого уровня IL-1β при ОАНК могут являться: полиморфизм гена IL-1. гиперпродукция растворимого рецептора к IL-1, являющегося его антагонистом, снижение экспрессии цитокина клетками продуцентами с переключением на выботку других цитокинов про- и противовоспалительного профиля [33, 124]. При выраженных клинических проявлениях ОАНК снижение концентрации IL-1β можно расценить как неблагоприятный признак, отражающий нарушение MMP зависимых механизмов ремоделирования сосудов, что может способствовать развитию осложнений, таких как кровоизлияние в сосудистую стенку и тромбообразование [166]. Показатели TNF-α, IL-6 и IFN-γ при ОАНК, напротив, были повышены по сравнению с их значениями в группе пациентов с АКА (ИБС) и у здоровых доноров (таблица 6). Усиленная продукция данных провоспалительных цитокинов при ОАНК может проявляться активацией макрофагов, выделением ими кислородных радикалов, оксида азота и гидролитических ферментов в условиях ишемического повреждения тканей НК, что потенцирует прогрессирование хронического воспаления и повреждения по типу порочного круга [75, 142]. Повышение уровня IFN-γ у 84 пациентов с ОАНК может ингибировать экспрессию ММР-9 в культуре макрофагов и продукцию коллагенов I и III типа [156], что также нарушает ремоделирование сосудистой стенки и может способствовать развитию обструкции сосуда, прогрессированию ишемии и некроза тканей НК. В этом отношении IFN-γ, является антагонистом IL-1β, который, напротив, является индуктором синтеза коллагена [156]. Зарегистрировано достоверное увеличение содержания растворимых рецепторов TNF-αRI и TNF-αRII в сыворотке крови пациентов с АКА и ОАНК (таблица 6). При этом у пациентов с ОАНК концентрация TNF-αRII была статистически значимо выше, регистрировалась тенденция увеличения содержания TNF-αRI, по сравнению с пациентами с АКА (ИБС), что можно связать с более высоким уровнем TNF-α при ОАНК (таблица 6). Установлено, что содержание IL-6R не отличалось от референсных значений, как при АКА (ИБС), так и при ОАНК (таблица 6). При этом не выявлено корреляции между IL-6 и его сывороточным рецептором в группе пациентов с АКА (ИБС) (r=0,07, р=0,59), что, возможно, свидетельствует о нарушении взаимостимуляции – лиганд-рецептор в условиях ХСН и системной циркуляторной гипоксии в патогенезе ИБС. Однако, этот факт можно рассмотреть и с позиций компенсации, блокирующий передачу провоспалительного сигнала от комплекса IL-6 - IL-6R в клетку-мишень. При ОАНК зарегистрирована слабая корреляция между IL-6 и растворимого рецептора к IL-6 (r=0,31, p=0,04), что характеризует образование комплекса лиганд-рецептор с дальнейшим взаимодействием с мембранным протеином gp130, в результате чего проявляется выраженный провоспалительный эффект IL-6. При анализе содержания иммунорегуляторных цитокинов у пациентов с АС, выявлено, что уровень IL-2 был в 3 раза ниже, чем у здоровых доноров (таблица 7). Причинами снижения уровня IL-2 может являться сопутствующая АС циркуляторная гипоксия, а также, ингибирующий эффект статинов, принимаемых пациентами [461] (таблица7). Зарегистрировано статистически 85 значимое увеличение значений растворимого рецептора к IL-2 (IL-2R), что можно связать с относительной нехваткой IL-2, которая способствует развитию функционального иммунодефицита по клеточному типу у пациентов с АС [142]. Таблица 7– Содержание иммунорегуляторных цитокинов у пациентов с АС, АКА (ИБС), ОАНК и у здоровых доноров Показатель Пациенты с АС 1 2,9 (0,5-17,6) Пациенты с АКА (ИБС) 2 2,1 (0,7-18,4) Пациенты с ОАНК 3 3,4 (0,2-23,0) Здоровые доноры 4 9,0 (3,7-19,9) Уровень значимости (Р) IL-2 р1- р4=0,05 пг/мл р2,3- р4=0,05 р1,2- р3>0,05 IL-2 R 499,6 462,9 517,3 356,4 р1- р4=0,03 пг/мл (350,4-698,1) (420,5-698,1) (497,2-698,5) (207,3-464,1) р2- р3>0,05 р2- р4=0,05 р3- р4=0,04 IL-17 пг/мл 14,3 16,8 7,5 10,5 р1- р4=0,09 (6,8-22,9) (8,1-26,6) (6,4-18,6) (7,2-23,6) р2- р4=0,06 р3- р4>0,05 р2- р3=0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1- р4 - достоверность различий между пациентами с АС и здоровыми донорами; р2- р4 достоверность различий между пациентами с АКА (ИБС) и здоровыми донорами; р2- р3 достоверность различий между пациентами с АКА (ИБС) и с ОАНК; р3- р4 - достоверность различий между пациентами с ОАНК и здоровыми донорами . В зависимости от локализации и клинических проявлений АС, установлено, что и при АКА (ИБС) и при ОАНК уровень IL-2 был ниже, а значения растворимого рецептора IL-2 – выше показателей здоровых доноров, при этом не было выявлено различий между группами (таблица 7). Зарегистрирована тенденция к повышению показателей IL-17 в общей группе пациентов с АС и в группе пациентов с АКА (ИБС), что может свидетельствовать об активации нейтрофилов и потенцировании, в результате этого, воспалительного процесса в артериальной стенке у пациентов с ИБС (таблица 7). При ОАНК значения IL-17 были статистически значимо ниже, чем при АКА (ИБС), но при этом не отличались от контрольного уровня (р>0,05) (таблица 7). С одной стороны, это можно рассмотреть как угнетение функциональной активности Th-17 при ОАНК и расценить как компенсаторный 86 противовоспалительный эффект. Однако результатом этого может быть анергия нейтрофильного звена при ишемии и циркуляторной гипоксии и последующее нарушение процессов репарации тканей НК (таблица 7). При оценке содержания противовоспалительных цитокинов у пациентов с АС выявлено достоверное снижение в сыворотке крови уровня IL-10, что, вероятно, отражает угнетение противовоспалительной активности клеток продуцентов цитокина в условиях гипоксии и согласуется с данными литературы [9, 62] (таблица 8). Таблица 8– Содержание противовоспалительных цитокинов у пациентов с АС, АКА (ИБС), ОАНК и у здоровых доноров Показатель IL-10 пг/мл Пациенты с АС 1 12,8 (5,3-25,1) Пациенты с АКА (ИБС) 2 9,2 (5,1-21,1) Пациенты с ОАНК 3 17,3 (7,1-36,3) Здоровые доноры 4 36,7 (20,7-60,1) TGFβ1 нг/мл 23,4 (16,9-30,2) 22,5 (16,2-28,3) 23,3 (19,4-39,4) 15,1 (12,4-36,8) Уровень значимости (Р) р1- р4=0,04 р2- р3>0,05 р2- р4=0,02 р3- р4=0,05 р1,2,3- р4>0,05 р2- р3>0,05 TGF β2 150,4 151,5 147,2 112,2 р2- р3>0,05 пг/мл (127,6-201,2) (129,2-196,1) (124,6-196,6) (106,0-126,4) р1,2,3- р4=0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1р4 - достоверность различий между пациентами с АС и здоровыми донорами; р 2- р4 достоверность различий между пациентами с АКА (ИБС) и здоровыми донорами; р2- р3 достоверность различий между пациентами с АКА (ИБС) и с ОАНК; р3- р4 - достоверность различий между пациентами с ОАНК и здоровыми донорами. С другой стороны, это можно рассматривать, как механизм клеточной иммуносупрессии, анергии Th лимфоцитов и угнетения гуморального звена иммунитета, поскольку известно, что IL-10 усиливает функциональную активность В-лимфоцитов [142]. Зафиксировано, что уровень цитокина был низким, как при АКА (ИБС), так и при ОАНК (таблица 8). При ОАНК значения медианы IL-10 в сыворотке крови были несколько выше, чем при АКА (ИБС), однако статистической достоверности различий между группами не определялось (таблица 8). Зарегистрировано увеличение уровня TGF β2, как в 87 общей группе пациентов с АС, так и при разной его локализации (АКА (ИБС) и ОАНК, тогда как показатели TGFβ1 имели лишь тенденцию к повышению (таблица 8). Таким образом, мы не подтвердили результаты других авторов о повышении TGFβ1 при АС [128, 213, 431], однако выявили своеобразную особенность изменения реагирования TGFβ1 и TGFβ2 при этом заболевании. Можно предположить, посредством их что эффекты взаимодействия изоформ между TGFβ собой. осуществляются Согласно результатам исследования J.S. Holifield с соавт. (2004), эффект стимуляции ангиогенеза, например, реализуемый TGFβ2 осуществляется им только совместно с TGFβ1 [256]. Нами не установлено различий содержания TGFβ1 и TGFβ2 между группами пациентов с АКА (ИБС) и ОАНК (таблица 8). С целью уточнения изменений цитокинового профиля сыворотки крови при АС нами проведен анализ содержания провоспалительных, иммунорегуляторных и противовоспалительных цитокинов в процентах от общей суммы их значений. В результате данного анализа установлено, что провоспалительная активность при АС выражалась преимущественно в увеличении удельного веса IL-6 и IL-1β, тогда как содержание TNF-α и IFN-γ в профиле провоспалительных цитокинов было даже несколько ниже, чем у здоровых доноров (таблица 9). Изменения в профиле иммунорегуляторных цитокинов при АС заключались в снижении доли IL-2 (в 2,7 раз) и некотором увеличении удельного веса IL-17 (в 1,5 раза). Нарушение противовоспалительной активности у пациентов с АС выражалось низким удельным весом IL-10 (в 3,2 раз ниже, чем у здоровых доноров) и некоторым увеличением доли TGFβ1 и TGFβ2. Проанализировав цитокиновый профиль при АС с учетом локализации и распространенности атеросклеротического поражения и выраженности клинической картины заболевания, мы определили, что подобный вышеперечисленному дисбаланс в профиле про-, противо- и иммунорегуляторных цитокинов регистрировался преимущественно у пациентов с атеросклеротическим поражением коронарных артерий и манифестацией ИБС. У них отмечалось более выраженное снижение доли IL-2 88 и IL-10, чем при ОАНК. Особенностью же дисбаланса цитокинового профиля при ОАНК – был низкий удельный вес IL-1β (в 2 раза ниже, чем у здоровых доноров и в 6,2 раза ниже, чем у пациентов с АКА (ИБС), тогда как доля других провоспалительных цитокинов – IFN-γ, TNF-α, напротив, была несколько выше, чем при АКА (таблица 9). Таблица 9– Удельный вес цитокинов в сыворотке крови пациентов с АС, АКА (ИБС), ОАНК и у здоровых доноров Показатель IL-1β TNF-α IL-6 IFN-γ IL-2 IL-17 IL-10 TGF β1 TGF β2 АС - общая группа АКА (ИБС) % ОАНК Здоровые доноры % % % Провоспалительные цитокины – удельный вес показателей от 100% суммы 18,3 29,4 4,7 9,5 27,7 19,9 30,9 38,1 20,7 21,3 23,7 12,7 33,3 29,4 40,7 39,7 Иммунорегуляторные цитокины– удельный вес показателей от 100% суммы 16,9 11,1 31,2 46,2 83,1 88,9 68,8 53,8 Противовоспалительные цитокины– удельный вес показателей от 100% суммы 6,9 5,0 9,2 22,4 12,5 12,3 12,4 9,2 80,6 82,7 78,4 68,4 Не определялось различий удельного веса в профиле рецепторов к цитокинам при АС по сравнению со здоровыми донорами, при этом зафиксировано, что доля TNF-α RI и TNF-αRII и IL-2 R была несколько выше, а доля IL-6R - ниже, чем в контроле (таблица 10). Таблица 10 – Удельный вес рецепторов к цитокинам в сыворотке крови пациентов с АС, АКА (ИБС), ОАНК и у здоровых доноров Показатель TNF-α RI TNF-αRII IL-6R IL-2 R АС - общая группа % 7,2 27,0 62,2 3,6 АКА (ИБС) % 7,1 26,6 62,8 3,5 ОАНК % 7,4 30,6 58,4 3,6 Здоровые доноры % 5,7 23,9 67,6 2,8 89 При анализе особенностей изменений провоспалительных цитокинов при АС в зависимости от возраста установлено увеличение содержания IL-6, TNF-α (рисунок 11) и тенденция к нарастанию его растворимого рецептора к TNF-α II типа у пациентов 75-89 лет (4156,2 (3463,6-3906,5) пг/мл, по сравнению с пациентами 45-59 лет 3578,4 (3094,6-3967,2) пг/мл (р=0,08)). Рисунок 11– Уровень IL-6 и TNF-α у пациентов с АС разных возрастных групп При исследовании содержания иммунорегуляторных цитокинов в зависимости от возраста пациентов с АС зарегистрирован низкий уровень IL-2 у пациентов 75-89 лет, по сравнению с пациентами 45-59 лет (рисунок 12), при этом показатели IL-2 R и IL-17 – практически не изменялись. Рисунок 12 – Уровень IL-2 у пациентов с АС разных возрастных групп 90 При оценке значений противовоспалительных цитокинов в зависимости от возраста пациентов с АС выявлено, что показатели IL-10 были несколько ниже у пациентов 75-89 лет (7,7 (4,2-17,0) пг/мл), по сравнению с группой пациентов в возрасте 60-74 года (12,6 (6,5-27,2пг/мл), однако различия между группами не были статистически значимы (р=0,09). Не было установлено достоверных изменений и при анализе зависимости уровня провоспалительных, иммунорегуляторных и противовоспалительных цитокинов от пола пациентов с АС. Мы не подтвердили результаты о более высоком уровне TNF-αRII в сыворотке крови у мужчин, чем у женщин [341]. При определении концентрации провоспалительных цитокинов у пациентов с АС в зависимости от уровня общего ХС в крови зарегистрировано, что при высоком уровне общего ХС (более 6,2 ммоль/л) значения TNF-αRI и TNF-αRII в крови были достоверно ниже, чем при низком его содержании (менее 5,0 ммоль/л) (таблица 11). При этом выявлена тенденция к увеличению уровня TNF-α, значения цитокина были выше показателей контроля только при средней и высокой концентрации общего ХС в крови (таблица 11). Определена тенденция к снижению содержания IL-6 при увеличении уровня общего ХС (р=0,06). При этом показатели IL-6 были выше референсных значений только в группе с уровнем общего ХС менее 5,0 ммоль/л, тогда как при более высоком его содержании - статистически значимо не отличались от них (таблица 11). При исследовании содержания противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови пациентов с АС, в зависимости от концентрации общего ХС крови зафиксировано, что при уровне общего ХС более 6,2 ммоль/л значения IL-10 были выше, чем его уровне менее 5,0 ммоль/л (р=0,04). При анализе зависимости содержания иммунорегуляторных цитокинов от концентрации общего ХС крови выявлено относительное увеличение уровня IL-2 и тенденция к снижению его растворимого рецептора у пациентов с высоким уровнем общего ХС (таблица 12). 91 Таблица 11– Содержание провоспалительных цитокинов у пациентов с АС в зависимости от уровня общего холестерина в крови Показатель Уровень общего ХС в сыворотке крови (ммоль/л) Низкий Средний Высокий Здоровые уровень (менее уровень уровень (более доноры 5,0 ммоль/л) (от 5,1-6,1 6,2 ммоль/л) ммоль/л) 1 2 3 4 3,1 1,5 1,8 1,2 (0,5-3,5) (0,4-2,7) (0,5-8,6) (0,5-9,2) Уровень значимости (Р) р1- р2>0,05 р1- р3>0,05 р2- р3>0,05 р1,2,3- р4>0,05 TNF-α 6,6 8,3 9,4 4,8 р1- р2>0,05 пг/мл (3,8-12,6) (7,5-19,2) (7,0-18,3) (2,2-7,9) р1- р3=0,09 р2- р3>0,05 р1- р4>0,05 р2- р4=0,05 р3- р4=0,04 TNF-αRI 1135,4 1102,6 1007,8 712,3 р1- р2>0,05 пг/мл (1104,0-1226,7) (1075,2-1235,9) (875,0-1027,1) (703,3-814,1) р1- р3=0,04 р2- р3>0,05 р1- р4=0,001 р2- р4=0,002 р3- р4=0,04 TNF-αRII 4149,4 3722,8 3281,2 3000 р1- р2>0,05 пг/мл (3897,8-4423,6) (3539,7-4140,2) (3193,8-3747,5) (2895,2-3150,4) р2- р3>0,05 р1- р3=0,01 р1- р4=0,03 р2- р4=0,05 р3- р4>0,05 IL-6 4,3 3,8 1,6 1,6 р1- р2,3>0,05 пг/мл (2,6-8,5) (1,7-8,3) (1,0-9,8) (0,4-2,8) р2- р3>0,08 р2- р3>0,05 р1- р3=0,06 р1- р4=0,05 IL-6R 8,5 8,5 8,5 8,5 р1- р2,3>0,05 нг/мл (8,1-8,8) (7,9-9,2) (8,4-9,1) (8,3-8,8) р2- р3>0,05 р1,2,3- р4>0,05 IFN-γ 3,6 (2,0-8,0) 3,4 4,7 5,0 р1,2- р3>0,05 пг/мл (1,9-7,0) (2,7-27,6) (3,8-14,5) р1- р2>0,05 р1,2,3- р4>0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1- р2 достоверность различий между пациентами с низким и средним уровнем общего ХС в крови; р1- р3 - достоверность различий между пациентами с низким и высоким уровнем общего ХС в крови; р2- р3 - достоверность различий между пациентами со средним и высоким уровнем общего ХС в крови; р1,2,3- р4 - достоверность различий у пациентов 1,2 и 3 групп и здоровыми донорами IL-1β пг/мл 92 Таблица12 – Содержание иммунорегуляторных цитокинов у пациентов с ОАНК в зависимости от уровня общего холестерина крови Показатель Уровень общего ХС в сыворотке крови (ммоль/л) Общий ХС Общий ХС Общий ХС Здоровые <5,0 ммоль/л 5,1-6,1 >6,2 ммоль/л доноры ммоль/л 1 2 3 4 1,8 4,4 3, 8 9,0 (0,4-12,2) (0,2-11,0) (2,8-10,5) (3,7-19,9) Уровень значимости (Р) р1- р2=0,07 р2- р3>0,05 р1- р3=0,04 р1- р4=0,001 р2- р4=0,01 р3- р4=0,04 IL-2 R 403,9 409,4 265,9 356,4 р1,2- р3>0,05 пг/мл (330,6-541,5) (311,1-684,9) (209,7-375,4) (207,3-564,1) р1- р2>0,05 р2- р3=0,07 р1,2,3- р4>0,05 IL-17 12,2 12 16,9 10,5 р1,2- р3=0,06 пг/мл (5,2-20,7) (5,5-19,4) (6,9-19,4) (7,2-23,6) р2- р3>0,05 р1,2- р4>0,05 р3- р4=0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1- р2 - достоверность различий между пациентами с низким и средним уровнем общего ХС в крови; р1- р3 - достоверность различий между пациентами с низким и высоким уровнем общего ХС в крови; р2- р3 - достоверность различий между пациентами со средним и высоким уровнем общего ХС в крови; р1,2,3- р4 - достоверность различий между пациентами 1,2 и 3 групп и здоровыми донорами IL-2 пг/мл При этом показатели IL-2 были ниже контрольных значений при любом уровне общего ХС. Содержание IL-17 было статистически значимо выше показателей контроля только в группе пациентов с высоким содержанием общего ХС в крови (таблица 12). Показатели TGFβ1 были также выше контрольных значений только при высоком уровне общего ХС в крови (таблица 13). Не установлено статистически значимых различий по содержанию TGFβ2 в зависимости от уровня общего ХС в крови, он был выше значений здоровых доноров во всех исследуемых группах (таблица 13). Нами проведена комплексная оценка содержания цитокинов в группах пациентов в зависимости от локализации АС (АКА (ИБС) и ОАНК. В каждой 93 из данных групп исследовались подгруппы в зависимости от возраста, пола, данных анамнеза и клинических особенностей заболевания. Таблица13 – Содержание противовоспалительных цитокинов у пациентов с АС в зависимости от уровня общего холестерина в крови Показатель Уровень общего ХС в сыворотке крови (ммоль/л) Низкий уровень (менее 5,0 ммоль/л) 1 Средний уровень (от 5,16,1ммоль/л) 2 Высокий уровень (более 6,2 ммоль/л) 3 Здоровые доноры Уровень значимости (Р) 4 р1- р2>0,05 р1- р3=0,04 р2- р3>0,05 р1- р4=0,04 р2- р3=0,03 р3- р4=0,05 TGF β1 28,3 30,2 30,7 15,1 р1- р2,3>0,05 нг/мл (18,8-42,0) (24,2-33,6) (22,1-41,2) (12,4-36,8) р2- р3>0,05 р1,2- р4>0,05 р3- р4=0,05 TGF β2 155,0 174,1 137,7 112,2 р1- р2,3>0,05 пг/мл (138,0-216,6) (131,0-229,4) (122,1-245,8) (106,0-126,4) р2- р3>0,05 р1- р4=0,03 р2- р4=0,01 р3- р4=0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1р2 - достоверность различий между пациентами с низким и средним уровнем общего ХС в крови; р1- р3 - достоверность различий между пациентами с низким и высоким уровнем общего ХС в крови; р2- р3 - достоверность различий между пациентами со средним и высоким уровнем общего ХС в крови; р1,2,3- р4 – достоверность различий между пациентами 1, 2 и 3 групп и здоровыми донорами IL-10 пг/мл 7,7 (6,2-18,8) 10,3 (7,1-42,2) 15,8 (12-69,7) 36,7 (20,7-60,1) При распределении пациентов с АКА (ИБС) в зависимости от возраста, было установлено, что в группе пациентов 75-89 лет определялись наиболее высокие показатели провоспалительных цитокинов по сравнению с пациентами 45-59 лет (TNF-α 7,8 (5,1-16,6) пг/мл против 3,52 (0,5-8,3) пг/мл (р=0,04); TNFαRI 1011,9 (994,0-1029,9) пг/мл против 926,4 (876,3-968,5) пг/мл (р=0,03); TNFαRII 3811,3 (3463,6-4218,2) пг/мл против 3311,4 (3120,2-3978,8) пг/мл (р=0,05); IL-6 (5,3 (4,2-6,1) пг/мл против 1,2 (1,4-2,3) пг/мл (р=0,02) и IFN-γ 7,6 (3,2-16,7) пг/мл против 1,8 (1,0-4,2) пг/мл (р=0,02)). 94 Повышение вышеперечисленных цитокинов в сыворотке крови, вероятно, связаны с повышенной дегрануляцией СD4 + и СD8+ у пожилых людей [86]. Нами не зарегистрировано изменения содержания IL-6R в зависимости от возраста пациентов. У пациентов с АКА (ИБС) 75-89 лет уровень IL-2 был статистически значимо ниже = 0,9 (0,7-4,7) пг/мл, чем у пациентов 45-59 лет 2,3 (1,3-27,9) пг/мл (р=0,04). При этом значения IL-2R в данной группе имели тенденцию к повышению, по сравнению с пациентами 45-49 лет (р=0,06). Выявленные изменения характеризуют наиболее выраженное снижение Тклеточной пролиферации в результате инвалютивных процессов в тимусе и других тканях при старении. Это может способствовать развитию аутоиммунной патологии в результате ослабления активности Т-регуляторных клеток. Не было отмечено влияния возраста пациентов с АКА (ИБС) на содержание IL-17 в сыворотке крови. Наиболее низкие значения IL-10 регистрировались в старческом возрасте (75-89 лет) - 5,4 (1,85-8,55) пг/мл и были достоверно ниже, чем у пациентов в возрасте 60-74 лет 12,2 (6,2-28,4) пг/мл (р=0,04), тогда как содержание TGFβ1 и TGFβ2 практически не изменялось в зависимости от возраста пациентов с АКА (ИБС). Зарегистрировано, что у женщин с АКА (ИБС) уровень TNF-α был достоверно выше, чем у мужчин (р=0,05) (рисунок 13). Рисунок 13 – Содержание TNF-α в сыворотке крови пациентов с АКА (ИБС) в зависимости от пола. 95 Это, вероятно, обусловлено гормональным фоном (эстроген зависимой продукцией выработки TNF-α), и преобладанием жировой ткани у женщин одного из источников продукции TNF-α [45, 147]. Однако, в эксперименте А.М.Косырева с соавт. (2011) показали, что у самцов крыс линии Vistar уровень TNF-α достоверно выше, чем у самок [59] При этом содержание TNF-αRI и TNF-αRII, было практически на одном уровне, как у мужчин, так и у женщин (р>0,05). Нами не было установлено достоверной разницы в показателях иммунорегуляторных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови в зависимости от пола пациентов с АКА (ИБС). При наличии ИМ в анамнезе пациентов с АКА (ИБС) не зарегистрировано достоверных различий в содержании провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови пациентов. Это можно связать с вариабельностью временного интервала после перенесенного инфаркта на момент забора крови, разным клиническим течением и распространенностью ИМ, различной частотой эпизодов повторения ИМ и его последствиями. Однако, несмотря на относительную неоднородность представителей групп с наличием или отсутствием ИМ в анамнезе, были установлены изменения иммунорегуляторных цитокинов. Выявлено, что при наличии ИМ в анамнезе, значения IL-2 были в 3,3 раза ниже, чем у пациентов без ИМ (1,3 (0,2-7,9) пг/мл, против 4,3 (2,2-30,1) пг/мл (р=0,05)) и в 6,9 раз ниже, чем у здоровых доноров (р=0,001). В группе пациентов с наличием ИМ в анамнезе уровень IL-17 был выше референсных значений (18,4 (7,4-19,2) пг/мл против 10,5 (7,2-23,6) пг/мл (р=0,03)), тогда как у пациентов с отсутствием ИМ в анамнезе – не отличался от показателей контроля (7,3 (3,8-13,9) пг/мл, (р>0,05)). При анализе провоспалительных цитокинов в зависимости от интервала времени после перенесенного ИМ не было выявлено увеличения показателей IFN-γ, TNF-α, IL-6 и его рецептора (IL-6R) в период до 3 месяцев после ИМ. Это можно объяснить преимущественно локальной выработкой цитокинов, 96 действием естественных антагонистов, влиянием противовоспалительной терапии. Кроме того, в работах исследователей отмечено, что увеличение системной продукции провоспалительных цитокинов наблюдается с 1 по 14 сутки после ИМ, а затем прогрессивно снижается [7, 73, 148]. При этом, нами было зафиксировано, что уровень IL-1β был выше показателей контроля во всем исследуемом периоде после перенесенного ИМ. От 1 до 3 месяцев после ИМ определялся более высокий уровень TNF-α RII (4326,3 (3670,6-4496,3) пг/мл, что было статистически значимо выше, чем в периоде от 6-12 до месяцев после ИМ (3237,4 (3120,2-3680,2) пг/мл, р=0,04). Повышение растворимого рецептора II типа до 3 месяцев после ИМ можно связать с контролем уровня TNF-α. Это подтверждается наличием сильной корреляции между показателями TNF-α и TNF-α RII в период до 3 месяцев после ИМ (r=0,77, р<0,05) и в период от 3 до 6 месяцев (r=0,65, р<0,05) после ИМ. Представленные результаты согласуются с мнением других авторов, о том, что в ранние сроки после ИМ происходит быстрое связывание повышенного уровня TNF-α [91, 115]. По данным литературы ассоциируется известно, с альтерацией что повышенная сердечной мышцы, экспрессия TNF-α дисфункцией левого желудочка, деградацией матрикса и коллагена, повышенной активацией матриксных металлопротеиназ и апоптоза в клетках миокарда [105, 130], TNF-α также стимулирует опосредованную ангиотензинном II активацию фибробластов и выработку фибронектина в миокарде [263]. Однако нами определено, что в интервале от 6 до 12 месяцев после ИМ показатели естественных ингибиторов TNF-α (TNF-αRI и TNF-αRII) снизились, TNF-α RII стал достоверно ниже, чем в период от 1 до 3 месяцев после ИМ, отмечалось повышение значений IL-1β и IL-6. При этом уровень IL-1β стал в 1,9 раз выше, чем в периоде до 3 месяцев после ИМ и в 10,2 раза выше, чем в контроле, а показатель IL-6 – в 2,2 раза выше, чем в сроки до 3 мес., и в 3,7 раз выше контрольных значений. Известно, что IL-1β и IL-6 – являются индукторами реактантов острой фазы и отражают активацию воспалительного процесса [89]. Так, например, повышенный уровень IL-1β после перенесенного ИМ связывают 97 с нарушением ремоделирования сердечной мышцы, и некоторые исследователи показывают положительный эффект в этом отношении от назначения рекомбинантного антагониста рецептора IL-1β пациентам с ИМ [47, 161, 423]. Таким образом, можно считать, что период от 6 до 12 месяцев после ИМ характеризуется, как наиболее критичный в плане реактивации воспаления и повреждения тканей. Повышение воспалительной активности в данный период, вероятно, связанно с самостоятельным прерыванием или недобросовестным применением пациентами рекомендуемой постинфарктной терапии. Не было установлено зависимости IL-2 и его рецептора от времени после перенесенного ИМ. Зарегистрировано, что в период от 1 до 3 месяцев после ИМ, значения IL-17 были выше показателей в более позднем постинфарктном периоде. В интервале – от 6 до 12 месяцев после ИМ содержание IL-17, напротив, снизилось и стало в 6 раз ниже, чем, в первые, 3 месяца после ИМ (4,3 (2,3-6,5) пг/мл против 26,4 (8,9-21,4) пг/мл), в 4 раза ниже, чем в периоде от 3 до 6 месяцев после ИМ (4,3 (2,3-6,5) пг/мл против 16,8 (8,7-9,9) пг/мл) и 2,5 раза ниже показателей контроля (4,3 (2,3-6,5) пг/мл против 10,5 (7,2-23,6) пг/мл). Эти изменения, вероятно, объясняются системной межклеточной взаиморегуляцией после перенесенного ИМ – постепенным снижением активации нейтрофилов после ишемического повреждения сердечной мышцы. Не выявлено влияния интервала времени после ИМ на содержание противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови. При этом только на сроках до 6 месяцев после перенесенного ИМ уровень IL-10 был ниже показателей здоровых доноров (13,2 (5,1-31,8) пг/мл против 36,7 (20,7-60,1) пг/мл, р=0,03), а в более поздний период практически не отличался от референсных значений (р>0,05). Выявлено, что в период до 3 месяцев после перенесенного ИМ уровень TGFβ1 и TGFβ2 был несколько ниже, чем в более поздние сроки, однако статистически достоверной разницы содержания этих цитокинов в разные периоды после ИМ не было установлено (р>0.05). Зафиксировано, что только в периоде от 6 до 12 месяцев и более 12 месяцев после ИМ значения TGF β2 превышали показатели здоровых доноров (192,1 98 (156,1-243) пг/мл и 147,2 (138,4-185,2) пг/мл против 112,2 (106,0-126,4) пг/мл р<0,05). В зависимости от клинического течения стенокардии выявлено, что при НС уровень IL-6 был значительно выше, чем при стабильном течении (5,4 (1,68,9) пг/мл против 2,7 (0,2-1,5) пг/мл, р=0,03) и выше показателей здоровых доноров - против 1,6 (0,4-2,8) пг/мл, р=0,03), что согласуется с результатами проведенных исследований разных авторов [30, 73, 149, 410]. По данным литературы, высокий уровень IL-6 ассоциируется с повреждением сердечной мышцы и является фактором риска смертности [226]. При этом значения IL-6R не зависели от клинического течения стенокардии (р>0,05). Определено, что уровень TNF-α при НС был несколько выше, чем при СС и показателей здоровых доноров, статистической однако различия достоверности между (р>0,05). НС группами не достигали сопровождалась наиболее высокими значениями TNF-αRII, чем стабильное ее течение (3914,9 (3600,05725,4) пг/мл против 3283,3 (2796,4- 3941,2) пг/мл, р=0,005). При этом уровень растворимого рецептора TNF-α II типа при НС был достоверно выше показателей здоровых доноров (3914,9 (3600,0-5725,4) пг/мл против 3000 (2895,2-3150,4) пг/мл, соответственно, р=0,04). Повышение уровня TNF-αRII при НС подтверждает зарегистрировано результаты достоверности других различий исследователей содержания [410]. TNF-αRI Не между группами в зависимости от течения стенокардии (р>0,05). Зафиксирована тенденция более высокого уровня IL-1β при стабильной стенокардии, однако статистически значимых отличий не было установлено (р=0,08). Как при СС, так и при НС уровень IL-1β был выше показателей контроля (р<0,05). Течение стенокардии не влияло на содержание IFN-γ (р>0,05). Отсутствие различий уровня IFN-γ и IL-1β между двумя группами не подтвердили результаты других исследователей о повышении уровня этих цитокинов при НС и прогрессировании ишемии миокарда [149, 410]. Однако отмечено, что в группе пациентов с НС значения IFN-γ выше доверительного интервала показателей 99 контроля регистрировались у 18,2% пациентов, по сравнению с группой пациентов со СС, где высокий уровень IFN-γ составлял 9,2 %. Не было обнаружено различий содержания IL-2, IL-2R и IL-17 в сыворотке крови при различном течении стенокардии (р>0,05). При анализе зависимости содержания противовоспалительных цитокинов от течения стенокардии выявлено, что при НС уровень TGFβ1 был выше, чем при стабильном ее течении (29,7 (23,2-36,3) нг/мл против 21,7 (15,0-28,3) нг/мл, соответственно, р=0,04) и превышал значения уровня здоровых доноров (15,1 (12,4-36,8) нг/мл, р=0,05). Не было выявлено достоверной разницы в показателях TGFβ2 и IL-10 между группами в зависимости от характера течения стенокардии (р>0,05). При этом только при стабильном течении стенокардии содержание IL-10 было достоверно ниже показателей здоровых доноров (8,6 (4,5-19,2) пг/мл против 36,7 (20,7-60,1) пг/мл, р = 0,05), а при НС не имело от них достоверных отличий (р>0.05). Тогда как значения TGFβ2 были выше уровня здоровых доноров в обеих группах (р=0,03-0,04), но статистически не отличались между собой (р>0,05). При анализе провоспалительных цитокинов в зависимости от функционального класса стабильной стенокардии выявлено, что уровень TNF-α при II ФК был достоверно выше, чем при III и IV ФК и превышал показатели здоровых доноров (таблица 14). Зарегистрирована тенденция к увеличению растворимых рецепторов TNF-α I и II типа при IV ФК. При этом значения TNFαRII были выше его значений у здоровых доноров только при IV ФК. Контролирование содержания TNF-α в связи с повышением его растворимых рецепторов согласуется с данными литературы [91, 115, 145] и подтверждается выявленной обратной связью средней силы между TNF-α и TNF-α RI (r=-0,36, р<0,05) при стабильной стенокардии III ФК. При этом нами не было выявлено достоверных различий в показателях IL-1β, IFN-γ, IL-6 и его растворимого рецептора в зависимости от ФК стабильной стенокардии (таблица 14). Тем самым мы не подтвердили 100 результаты M.Testa с соавт. (1996) о повышении IL-6 при увеличении ФК стенокардии [410]. Таблица 14 – Содержание провоспалительных цитокинов в зависимости от функционального класса стенокардии Показатель Стабильная стенокардия - функциональный класс СС II ФК СС III ФК СС IV ФК Здоровые 1 2 3 4 6,7 7,1 7,1 1,2 (0,6-10,0) (0,5-11,7) (0,5-13,8) (0,5-9,2) Уровень значимости (Р) р1- р2,3>0,05 р2- р3>0,05 р1,2,3- р4=0,04 TNF-α 11,3 3,9 2,0 4,8 р1- р2=0,05 пг/мл (8,8- 31,5) (1,5- 10,8) (0,6- 9,4) (2,2-7,9) р1- р3=0,02 р2- р3>0,05 р1- р4=0,04 р2- р4>0,05 р3- р4>0,05 TNF-αRI 882,8 949,3 1015,6 712,3 р1- р2>0,05 пг/мл (865,3- 972,9) (874,8- 997,2) (959,7-1079,7) (703,3-814,1) р1- р3=0,09 р2- р3>0,05 р1- р4=0,05 р2- р4=0,05 р3- р4=0,03 TNF-αRII 3181,2 3390,9 3571,31 3000 р1- р2>0,05 пг/мл (2871,0- 3996,5) (3125,3- 3987,0) (3509,3-3935,6) (2895,2-3150,4) р1- р3=0,08 р2- р3>0,05 р1,2- р4>0,05 р3- р4=0,04 IL-6 5,1 5,3 4,9 1,6 р1- р2,3>0,05 пг/мл (1,4-9,9) (0,9-8,9) (0,9-9,4) (0,4-2,8) р2- р3>0,05 р1,2,3- р4=0,04 IL-6R 8,65 8,3 8,7 8,5 р1- р2,3>0,05 нг/мл (8,65-4,4) (7,7-8,8) (8,5-9) (8,7-9.0) р2- р3>0,05 р1,2,3- р4>0,05 IFN-γ 3,0 2,1 1,4 5,0 (3,8-14,5) р1- р2,3>0,05 пг/мл (1,7-109,2) (1,4-8,0) (1,3-11,9) р2- р3>0,05 р1,2,3- р4>0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1- р2 достоверность различий между пациентами со II и III ФК СС; р2- р3 - достоверность различий между пациентами с III и IV ФК СС; р1- р3 - достоверность различий между пациентами со II и IV ФК СС; р1,2,3- р4 - достоверность различий между пациентами со СС различных ФК и здоровыми донорами. IL-1β пг/мл Отсутствие различий в показателях IL-1β, IFN-γ, IL-6 в зависимости от ФК СС может свидетельствовать о том, что, у исследуемых пациентов продукция цитокинов осуществляется, преимущественно, на местном уровне, а высокая системная их концентрация возможна только при остром и распространенном повреждении сердечной мышцы в течение ограниченного периода времени. 101 При этом было установлено, что значения IL-1β и IL-6 превышали контрольные показатели вне зависимости от ФК СС (таблица 14). При исследовании иммунорегуляторных цитокинов зарегистрирована тенденция к снижению уровня IL-2 при увеличении ФК СС (таблица 15). Показатели IL-17 также были более низкими при увеличении ФК стенокардии. Зарегистрировано, что при IV ФК стенокардии уровень IL-17 был почти в 2 раза ниже, чем при II ФК и III ФК стенокардии (таблица 15). При этом при II ФК и III ФК показатели цитокина превышали контрольные значения, тогда как при IV ФК снижались до их пределов (таблица 15). Таблица 15– Содержание иммунорегуляторных цитокинов в зависимости от функционального класса стенокардии Показатель Стабильная стенокардия - функциональный класс СС II ФК СС III ФК СС IV ФК Здоровые доноры 1 2 3 4 5,3 3,3 1,3 9,0 (2,2-20,1) (2,0-24,0) (0,2-12,4) (3,7-19,9) Уровень значимости (Р) р1- р2>0,05 р1- р3=0,08 р2- р3>0,05 р1,2,3- р4>0,05 Il-2 R 460,1 484,1 426,0 356,4 р1- р2,3>0,05 пг/мл (376,8-690,0) (323,1-725,2) (346,9-547,9) (207,3-564,1) р2- р3>0,05 р1,2,3- р4>0,05 IL-17 16,9 17,1 8,4 10,5 р1- р2>0,05 пг/мл (8,5 -29,9) (8,3 – 24,4) (4,3 – 16,4) (7,2-23,6) р1- р3=0,04 р2- р3=0,05 р1,2,- р4=0,05 р3- р4>0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1- р2 достоверность различий между пациентами со II и III ФК СС; р2- р3 - достоверность различий между пациентами с III и IV ФК СС; р1- р3 - достоверность различий между пациентами со II и IV ФК СС; р1,2,3- р4 - достоверность различий между пациентами со СС различных ФК и здоровыми донорами. IL-2 пг/мл По нашему мнению, данные изменения отражают ингибирующее влияние нарастающей циркуляторной гипоксии при увеличении ФК стенокардии на функциональную активность иммунорегуляторных клеток-продуцентов IL-17. При определении противовоспалительных цитокинов в зависимости от ФК стенокардии выявлено, что при IV ФК возрастала доля пациентов с более 102 низкими значениями TGF β1 и TGF β2, однако статистической достоверности между группами не было выявлено (р>0,05). Не определялось достоверности различий уровня IL-10 в зависимости от ФК стенокардии, поскольку в группах присутствовали практически равнозначное количество человек с высокими и низкими значениями цитокина. При распределении пациентов в зависимости от степени хронической сердечной недостаточности (ХСН) не было зарегистрировано статистически значимых изменений провоспалительных цитокинов. При всех степенях ХСН значения IL-1β и IL-6 были выше контрольного уровня (р=0,04). Установлена тенденция нарастания TNF-α в зависимости от степени ХСН (6,5 (5,2-18,4) пг/мл – при ХСН II Б степени против 6,1(1,2-13,2) пг/мл-при ХСН I степени), однако различия не достигали статистически значимых величин и (р=0,08). Таким образом, мы не подтвердили результаты других исследователей, свидетельствующие о том, что продукция TNF-α коррелирует с увеличением степени ХСН [134]. Не установлено достоверных различий в показателях растворимых рецепторов к TNF-α в зависимости от степени ХСН, при этом содержание TNF-αRI и TNF-αRII были выше контрольного уровня во всех исследуемых группах пациентов с ХСН. При IIБ степени ХСН зафиксирована сильная обратная корреляция (r= - 0,8,р<0,05), между TNF-α и TNF-αRI, что расценено как активный контроль выработки TNF-α. При оценке зависимости содержания иммунорегуляторных цитокинов от степени ХСН зарегистрировано, что при I степени ХСН концентрация IL-2 была достоверно выше, а IL-2R – ниже, чем при IIА и II Б степенях (IL-2 =16,6 (7,2-56,3) пг/мл против 6,3 (0,2-10,8) пг/мл и против 4,1 (0,2-11,4) пг/мл, (р=0,02-0,05); IL-2R = 359,6 (246,9-451,8) пг/мл против 475,7 (438,9-768,3) пг/мл и против 536,7 (460,1-868,4) пг/мл (р=0,04-0,05), соответственно). Не определялось достоверных различий в содержании IL-17, при этом уровень цитокина был статистически значимо выше показателей контроля при всех степенях ХСН (р<0,05). 103 При анализе влияния степени ХСН на содержание противовоспалительных цитокинов выявлено, что при ХСН II Б степени содержание TGFβ2 достоверно превышало его уровень при ХСН I степени (180,5 (166-525,3) пг/мл против 129,6 (129,6-173,9) пг/мл, р=0,05). При этом значения цитокина были выше показателей здоровых доноров (180,5 (166525,3) пг/мл против 112,2 (106,0-126,4) пг/мл, р=0,04). Не отмечено влияния ХСН на уровень TGFβ1 и IL-10 в сыворотке крови (р>0,05). При этом значения IL-10 при ХСН I и II А степенях были статистически значимо ниже показателей здоровых доноров, тогда как при ХСН II Б степени - не отличались от них (р>0,05). При исследовании содержания провоспалительных цитокинов в зависимости от фракции выброса левого желудочка (ФВЛЖ) выявлено, что при ФВЛЖ менее 50%, показатели IL-6 и IL-1β в сыворотке крови были ниже, чем в группе пациентов с ФВЛЖ более 50% (рисунок 14). Рисунок 14 – Содержание IL-1β и IL-6 в сыворотке крови пациентов с АКА (ИБС) в зависимости от фракции выброса ЛЖ (ФВЛЖ менее или более 50%). При этом уровень IL-1β был выше контрольных показателей в двух исследуемых группах, тогда как уровень IL-6 статистически значимо превышал референсные значения только в группе пациентов с ФВЛЖ более 50 % (рисунок 14). Выявленные изменения, вероятно, свидетельствуют об участии 104 IL-1β и IL-6 в патогенезе нарушения процессов ремоделирования сердечной мышцы и сократительной способности миокарда. У пациентов с ФВЛЖ менее 50% медиана значений TNF-α была также несколько ниже, чем у пациентов с ФВЛЖ более 50%, однако различия между группами не достигали статистической достоверности (р>0,05). Выявлена обратная связь средней силы между TNF-α и TNF-αRI (r= -0,4, р<0,05) при ФВЛЖ менее 50%, что указывает на подавление биологической активности TNF-α его растворимым рецептором I типа. При этом зафиксировано, что уровень TNF-αRI в обеих группах был достоверно выше показателей контроля (р=0,04). Содержание TNF-αRII выше уровня здоровых доноров определялось только в группе пациентов с ФВЛЖ менее 50% (3720,6(3297,8- 4719,4)) пг/мл против 3000 (2895,2-3150,4) пг/мл, р=0,03), тогда как в группе пациентов в ФВЛЖ более 50% оно не выходило за пределы референсных значений. Не установлено различий в содержании иммунорегуляторных цитокинов: IL-2, IL-2R и IL-17 в сыворотке крови в зависимости от ФВЛЖ. При этом содержание IL-17 было достоверно выше уровня здоровых доноров в обеих группах пациентов (р=0,04-0,05). При анализе противовоспалительных цитокинов в зависимости от ФВЛЖ выявлено, что уровень IL-10 в сыворотке крови при ФВЛЖ менее 50% – был в 2,3 раза ниже, чем в группе пациентов с ФВЛЖ более 50% (5,1(4,0-7,4) пг/мл против 11,4 (6,2-26,4) пг/мл, р=0,001) и в 7,2 раза ниже уровня здоровых доноров (5,1(4,0-7,4) пг/мл против 36,7(20,7-60,1) пг/мл, соответственно (р=0,0001). Не было зафиксировано различий между группами в содержании TGFβ1 и TGFβ2 в зависимости от ФВЛЖ, при этом значения TGFβ2 превышали показатели здоровых доноров в обеих группах (р=0,02-0,04). При ранжировании пациентов с АКА (ИБС) в зависимости от наличия аритмии в течение ИБС не установлено влияния нарушения сердечного ритма на содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови. Значения IL-1β, IL-6 и TNF-αRI были выше показателей здоровых доноров как при 105 наличии аритмии в анамнезе, так и без нее, при этом уровень TNF-αRII превышал референсные значения только в группе пациентов с наличием аритмии (3846,8 (3324,3-4063,3) пг/мл против 3000 (2895,2-3150,4) пг/мл (р=0,03)). При оценке иммунорегуляторных цитокинов при АКА (ИБС) в зависимости от наличия или отсутствия аритмии в анамнезе определено, что значения IL-2 в сыворотке крови пациентов с аритмией были значительно ниже, чем в группе пациентов без аритмии (р=0,05) и у здоровых доноров (р=0,03) (рисунок 15). Установлено, что у пациентов с наличием аритмии значения медианы IL-17 были в 2,5 раза выше, чем у пациентов без нарушения сердечного ритма и в 1,7 раз выше показателей здоровых доноров (рисунок 15). Зарегистрирована тенденция увеличение IL-2R при нарушении сердечного ритма, однако статистической достоверности между группами не определялось (р>0,05). Рисунок 15 – Содержание IL-2 и IL-17 в зависимости от нарушения сердечного ритма При анализе влияния нарушения сердечного ритма в анамнезе АКА (ИБС) на уровень противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови зарегистрировано, что содержание как TGFβ1, так и TGFβ2 было достоверно ниже в группе пациентов с наличием аритмии, чем у пациентов без нарушения сердечного ритма (таблица 16). При этом значения TGFβ1 в обеих группах 106 практически не отличались от показателей контроля (р>0,05). Уровень TGFβ2 в группе с отсутствием аритмии превышал референсные значения в 1,5 раза (р=0,03), а у пациентов с аритмией практически не отличался от них. Не было достоверных отличий уровня IL-10 между двумя группами, при этом его значения в обеих группах пациентов были статистически значимо ниже показателей здоровых доноров (таблица 16). Таблица 16 – Содержание противовоспалительных цитокинов в зависимости от нарушения сердечного ритма Показатель Наличие аритмии в анамнезе Аритмия + Аритмии Здоровые доноры 1 2 3 7,9 9,8 36,7 (3,9-25,1) (5,1-21,1) (20,7-60,1) Уровень значимости (Р) р1- р2>0,05 р1- р3=0,05 р2- р3=0,04 TGF β1 нг/мл 15,7 23,3 15,1 р1- р2=0,01 (10,3-23,6) (18,5-30,5) (12,4-36,8) р1,2- р3>0,05 TGF β2 129,6 164,9 112,2 р1- р2=0,05 пг/мл (115,2-152,1) (148,6-204,3) (106,0-126,4) р1- р3>0,05 р2- р3=0,03 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75).р1р2 - достоверность различий между пациентами с наличием и отсутствием аритмии; р1- р3 достоверность различий между пациентами с наличием аритмии и здоровыми донорами; р2- р3 - достоверность различий между пациентами с отсутствием аритмии и здоровыми донорами IL-10 пг/мл При оценке провоспалительных цитокинов в зависимости от количества обтурированных коронарных артерий определялась тенденция снижения уровня IFN-γ (1,7 (1,0-5,5) пг/мл против 4,8 (2,1-12,1) пг/мл, р=0,08) и увеличения значений IL-1β в сыворотке крови при поражении от 3 до 6 сосудов (8,6 (0,5-12,7) пг/мл против 6,8 (0,4-10,5) пг/мл при обтурации 1-2 артерий, р=0,09). При этом показатели IFN-γ не выходили за пределы референсных значений (р>0,05), а уровень IL-1β был выше них в обеих группах (р=0,05). Тем самым мы не подтвердили результаты исследования А.М.Чернявского с соавт. (2010), что при увеличении числа пораженных 107 коронарных артерий происходит снижение продукции IL-1β [145]. Выявлено достоверное увеличение уровня TNF-α в зависимости от увеличения количества обтурированных коронарных артерий (р=0,04, рисунок 16). Рисунок 16 – Содержание TNF-α в сыворотке крови у пациентов с АКА (ИБС) в зависимости от количества обтурированных коронарных артерий Это подтверждает ранее проведенные исследования С.В. Столова с соавт. (2006), указывающие на то, что уровень TNF-α коррелирует с увеличением числа пораженных атеросклерозом коронарных артерий [130] и опровергает результаты исследований А.М. Чернявского с соавт. (2010), установивших, что при увеличении количества пораженных коронарных артерий, напротив, происходит снижение показателей TNF-α [145]. Содержание TNF-αRII и TNFαRI было достоверно выше показателей здоровых доноров, как в группе с 1-2 пораженными артериями, так и в группе, с поражением от 3 до 6 коронарных артерий, без статистически значимости различий показателей между группами (р>0,05). Не было выявлено изменений и показателей IL-6 и его растворимого рецептора – IL-6R в зависимости от количества пораженных коронарных артерий (р>0,05), IL-6 был выше контрольных значений в обеих группах (р=0,04). Содержание иммунорегуляторных (IL-2, IL-2R, IL-17) и противовоспалительных цитокинов (IL-10, TGF β1 и TGF β2) в сыворотке крови пациентов с ИБС также практически не изменялось в зависимости от 108 количества обтурированных коронарных артерий, (р>0,05). При этом зарегистрировано, что значения IL-17 и уровень TGFβ2 были достоверно выше показателей здоровых доноров в обеих группах пациентов (р<0,05). Содержание IL-10 было статистически значимо ниже уровня здоровых доноров только в группе пациентов с поражением 1-2 артерий (7,4 (5,1-16,6) пг/мл против 36,7 (20,7-60,1) пг/мл, р=0,02), а в группе с более множественными поражениями артерий уровень цитокина не отличался от референсных значений (19,8 (5,1-34,7) пг/мл против 36,7 (20,7-60,1) пг/мл, р>0,05). Проведен анализ содержания цитокинов у пациентов с ОАНК в зависимости от возраста и пола пациентов, показаний госпитализации, уровня окклюзии артерий нижних конечностей, степени ишемии НК, наличия или отсутствия синдрома Лериша, уровня общего ХС крови. При исследовании провоспалительных цитокинов в зависимости от возраста статистически значимых различий не было выявлено. Однако у пациентов 75-89 лет обнаруживалась тенденция к снижению уровня IL-1β и IFN-γ в сыворотке крови по сравнению с пациентами в возрасте 45-59 лет (IL1β 1,9 (0,2-3,0) пг/мл против 4,2 (0,5-6,2) пг/мл, соответственно, р=0,06); IFN-γ 6,9 (3,5- 4,3) пг/мл против 10,5 (4,8-11,0), р=0,09). При выявлении зависимости содержания иммунорегуляторных цитокинов от возраста пациентов с ОАНК зарегистрировано, что у пациентов 75-89 лет уровень IL-17 был статистически значимо ниже, чем в возрасте 45-59 лет и 60-74 года (рисунок 17). Выявлено, что в возрасте 75-89 лет значения IL-2 были несколько ниже, чем у пациентов 45-59 лет, однако статистической достоверности различий между группами не было установлено (р>0,05). Не определялось зависимости содержания IL-2 R от возраста пациентов с СА (р>0,05). 109 Рисунок 17 – Содержание IL-17 у пациентов с ОАНК разного возраста При определении показателей противовоспалительных цитокинов в зависимости от возраста пациентов с ОАНК выявлено, что у пациентов в возрасте 75-89 лет уровень TGFβ2 был статистически значимо ниже, чем у пациентов 45-59 лет (112,4 (108,2-158,4) пг/мл против 197,6 (160,3-209,3) пг/мл, р=0,05), при этом он находился в пределах референсных значений. Не определялось достоверной разницы показателей TGFβ1 и IL-10 у пациентов с СА (р>0,05). При оценке содержания противоспалительных цитокинов в зависимости от пола зарегистрировано, что у мужчин определялся более высокий уровень TNF-α, чем у женщин (рисунок 18). Рисунок 18 – Содержание TNF-α у пациентов с СА (ОАНК + ИБС) разного пола 110 Тогда как показатели TNF-αRI, TNF-αRII, IL-1β, IFN-γ, IL-6 и IL-6R не имели статистически значимых различий по половому признаку (р>0,05). Повышение содержания TNF-α в сыворотке мужчин, вероятно связано с их большей выборкой и преобладанием среди них курильщиков. Данные литературы свидетельствуют о влиянии курения на повышение уровня TNF-α в сыворотке крови при АС [258] Не было обнаружено достоверных различий в содержании иммунорегуляторных цитокинов (IL-2, его растворимого рецептора- IL-2 R и IL-17) в сыворотке крови у пациентов с СА в зависимости от пола (р>0,05). Среди мужчин были представители, как с низким уровнем IL-2 – менее 1 пг/мл (53,3%), так и с высоким - более 20 пг/мл его уровнем (46,7%), тогда как среди женщин низкие показатели цитокина регистрировались у 65,8%, а высокие у 34,2%. При оценке содержания противовоспалительных цитокинов у пациентов с СА в зависимости от пола выявлено, что уровень IL-10 и TGFβ1 у женщин был статистически значимо выше, чем у мужчин (IL-10 у женщин 21,9 (7,5-44,6) пг/мл против 11,1 (6,9-9,8) пг/мл у мужчин, р=0,04); TGFβ1 у женщин 29,3 (23,347,1) нг/мл против 18,1 (18,8-22,2) нг/мл у мужчин, р=0,05). Содержание TGFβ2 практически не различалось по половому признаку (р>0,05). Проведен анализ показателей провоспалительных цитокинов у пациентов с СА в зависимости от показаний госпитализации. Для экстренной госпитализации пациентов в отделение сосудистой хирургии (ОСХ) показаниями являлись проявления критической ишемии НК (боль в покое, повышенная утомляемость, зябкость, парестезии и видимые признаки резкого нарушение трофики тканей НК). При плановой госпитализации острые проявления критической ишемии НК не отмечались. Выявлено, что в группе пациентов поступивших экстренно содержание IL-1β было выше показателей пациентов поступивших планово и выше референсных значений (4,8(0,4-7,8) пг/мл – при экстренной госпитализации против 1,8 (0,1-4,3) пг/мл - при плановой госпитализации (р=0,05) и 1,2 (0,5-9,2) пг/мл – у здоровых доноров, 111 р<0,05). Не определялось различий показателей IL-6, IL-6R, IFN-γ, TNF-α и его растворимых рецепторов между двумя группами пациентов (р>0,05). Уровень IL-6 был достоверно выше показателей контроля в двух исследуемых группах, р=0,03). Зарегистрирована тенденция к более высокому содержанию в сыворотке крови TNF-α у пациентов, поступивших экстренно (7,7 (5,5-17,5) пг/мл против 5,0 (3,6-12,1) пг/мл, р=0,09). Значения TNF-αRI и TNF-αRII были выше уровня здоровых доноров, как у экстренных, так и у плановых пациентов, р<0,05, но не имели различий между группами). При анализе иммунорегуляторных цитокинов, выявлено, что у пациентов, поступивших в отделение экстренно, уровень IL-17 был в 2,8 раз выше, чем у пациентов, поступивших по плановым показаниям, при этом не было достоверных отличий показателей от контрольных значений (14,2 (7,6-18,4) пг/мл – при экстренной госпитализации против 7,1(4,3-10,8) пг/мл – при плановой госпитализации, р=0,01) и против 10,5 (7,2-23,6) пг/мл – у здоровых доноров (р>0,05). Достоверных различий содержания IL-2 и его IL-2R между группами по показаниям госпитализации не определялось (р>0,05). Не установлено различий в содержании противовоспалительных цитокинов в зависимости от показаний госпитализации пациентов с ОАНК (р>0,05). Уровень TGFβ2 был выше показателей здоровых доноров, как при экстренной, так и при плановой госпитализации (р=0,03). При анализе зависимости содержания провоспалительных цитокинов от уровня поражения артерий НК выявлено, что наиболее низкий уровень IFN-γ в сыворотке крови определялся при периферической форме ОАНК. При этом значения цитокина при этой форме не отличались от показателей здоровых доноров, тогда как при окклюзии БПС и распространенной форме ОАНК были значительно выше них (IFN-γ при периферической форме ОАНК 5,1 (2,8-14,1) пг/мл против 18,5 (41,7-163,8) пг/мл – при окклюзии БПС, р=0,001), против 19,6 (14,8-52,2) пг/мл – при распространенной форме ОАНК, р=0,002) и против 5,0 (3,8-14,5) пг/мл – у здоровых доноров, р>0,05). Содержание других изучаемых провоспалительных цитокинов не имели достоверных различий в зависимости 112 от уровня поражения артерий НК (р>0,05). Отмечалось при этом, что показатели IL-6, TNF-α,TNF-αRI и TNF-αRII были выше значений здоровых доноров при любой форме ОАНК (р<0,05). При исследовании зависимости уровня иммунорегуляторных цитокинов от формы поражения артерий НК, выявлено, что уровень IL-2 при периферической форме ОАНК был ниже, чем при других формах поражения НК и ниже, чем у здоровых доноров (1,2 (0,3-4,6) пг/мл – при периферической форме ОАНК против 6,6 (4,0-37,2) пг/мл – при окклюзии БПС, р =0,02) против 10,3 (9,2-42,4) пг/мл – при распространенной форме ОАНК, р=0,01) против 9,0 (3,7-19,9) пг/мл – у здоровых доноров, р=0,01). Тогда как при окклюзии БПС и распространенной форме ОАНК значения IL-2 не отличались от референсных показателей (р>0,05). Содержание IL-2R и IL-17 не имело статистически значимых отличий между группами с разной формой ОАНК и от показателей контроля (р>0,05). При исследовании значений противовоспалительных цитокинов в зависимости от формы поражения артерий не было установлено достоверной разницы показателей IL-10, TGFβ1 и TGFβ2 между группами пациентов (р>0,05). При определении зависимости содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови пациентов с ОАНК от степени ишемии НК выявлено, что при ишемии НК IV степени значения IL-1β были выше, чем при ишемии II степени (р=0,02). При этом установлено, что при ишемии НК IV степени показатели IL1β были выше контрольного уровня (р=0,04) (рисунок 19). Концентрация других провоспалительных цитокинов: IFN-γ, IL-6, его растворимого рецептора - IL-6R; TNF-α и рецепторов к TNF-α (TNF-αRI и TNF-αRII) статистически значимо не различалась в зависимости от степени ишемии НК (р>0,05). Зафиксировано, что при любой степени ишемии НК показатели IFN-γ, IL-6, TNF-αRI и TNF-αRII были выше показателей контроля (р<0,05), тогда как IL-6R– не отличались от них (р>0,05). 113 Рисунок 19 – Содержание IL-1β у пациентов с ОАНК с различной степенью ишемии НК При анализе иммунорегуляторных и противовоспалительных цитокинов в зависимости от степени ишемии НК также не было зарегистрировано статистически значимых отличий между группами (р>0,05). Значения IL-2 были ниже контрольных показателей при любой степени ишемии НК (р<0,05). При ишемии НК II степени показатели IL-17 и IL-10 был ниже уровня здоровых доноров (р=0,04 и р=0,03, соответственно), тогда как при III и IV ее степени не имели статистически значимых отличий от контрольных значений (р>0,05). Содержание и TGFβ2 были выше референсных значений только у пациентов с III и IV степенью ишемии (р=0,03-0,05), а TGFβ1 - только у пациентов с IV степенью ишемии НК (р=0,05). Выявлено, что при наличии синдрома Лериша уровень IL-1β в сыворотке крови был выше, чем при его отсутствии (4,9 (0,9-8,4) пг/мл – при наличии синдрома Лериша против 1,1 (0,2-2,5) пг/мл – при отсутствии синдрома Лериша, р=0,05). При этом уровень IL-1β при наличии синдрома Лериша имел тенденцию к превышению контрольных значений (IL-1β (4,9 (0,9-8,4) пг/мл – при наличии синдрома Лериша, против 1,2 (0,5-9,2) пг/мл – у здоровых доноров, р=0,06). Показатели других провоспалительных цитокинов: TNF-α, TNF-αRI, TNF-αRII, IL-6 и IL-6R статистически значимо не отличались между группами пациентов с наличием или отсутствием синдрома Лериша (р>0,05). Зафиксировано, что уровень IFN-γ, TNF-α, TNF-αRI и TNF-αRII и IL-6, были 114 выше показателей здоровых доноров, как в группе пациентов с синдромом Лериша, так и с его отсутствием (р<0,05). Не установлено достоверных различий в содержании иммунорегуляторных цитокинов: IL-17, IL-2 и его растворимого рецептора IL-2R и зависимости от наличия синдрома Лериша в течении ОАНК. При этом, значения IL-17 были ниже контрольных значений в обеих группах (р<0,05). При определении противовоспалительных цитокинов выявлено, что у пациентов с наличием синдрома Лериша значения IL-10 были выше, чем у пациентов с его отсутствием, и не отличались от контрольного уровня (IL-10 (27,4 (18,42-38,2) пг/мл – при наличии синдрома Лериша, против 13,0 (8,2-23,4) пг/мл –при отсутствии синдрома Лериша, р=0,05) и против 36,7 (20,7-60,1) пг/мл– у здоровых доноров, р>0,05). Регистрировалась тенденция к повышению уровня TGFβ1 у пациентов с синдромом Лериша, при этом не определялось статистической достоверности между группами пациентов (р=0,09). Значения TGFβ2 были выше уровня здоровых доноров в обеих группах пациентов (р<0,05), без статистически значимой разницы между группами (р>0,05). Для оценки клинической информативности системного цитокинового статуса проведен корреляционный анализ взаимосвязей между клиниколабораторными характеристиками АС с одной стороны, и концентрацией цитокинов в сыворотке крови с другой (таблица 17). Была обнаружена корреляция при достоверном уровне значимости между уровнем общего ХС и TNF-αRI, TNF-αRII (отрицательная связь) и IL-2 и 10 (положительная связь); между ФК СС и TNF-α (отрицательная связь), его рецептором TNF-αRII (положительная связь) и IL-17 (отрицательная связь); между степенью ХСН и IL-2 (отрицательная связь) и IL-2 R (положительная связь); между количеством пораженных артерий и TNF-α (положительная связь); между степенью ишемии НК и IL-1β, TNF-α, IL-17, IL-10, TGFβ1, TGFβ2. (положительная связь). 115 Таблица 17 – Коэффициенты корреляции (R) клинико-лабораторных параметров с уровнем содержания цитокинов в сыворотке крови пациентов с АС Показатели Уровень общего ХС Количество ФК СС пораженных артерий IL-1β 0,26 0,27 0,22 TNF-α 0,40 0,56* -0,76* TNF-αRI 0,09 0,17 -0,76* TNF-αRII 0,14 -0,36* 0,62* IL-6 0,34 0,3 0,2 IL-6 R 0,33 0,07 0,02 IFN-γ 0,38 0,4 0,3 IL-2 0,3 0,2 0,56* IL-2R 0,38 0,1 0,3 IL-17 -0,34 0,09 -0,64* IL-10 -0,19 -0,11 0,43* TGF β1 0,24 0,23 0,12 TGF β2 0,38 0,31 0,14 * - достоверность уровней значимости р<0,05 Степень ХСН Степень ишемии НК 0,34 0,07 0,3 0,3 0,18 0,12 0,4 -0,93* 0,47* -0,23 -0,16 0,18 0,16 0,88* 0,49* 0,32 0,36 0,24 0,11 0,32 0,17 0,14 0,43* 0,59* 0,48* 0,56* Таким образом: 1) При АС выявлен функциональный дисбаланс про- и противовоспалительных механизмов системного клеточного реагирования на уровне цитокинов, проявляющийся увеличением содержания в сыворотке крови IL-6, TGFβ2, растворимых рецепторов к TNF-α: (TNF-α RI и TNF-αRII), IL-2 R и снижением уровня IL-2 и IL-10. 2) У пациентов с АКА (ИБС) иммуноопосредованная провоспалительная активность представлена более высоким содержанием IL-1β и IL-17 по сравнению с пациентами с ОАНК. При СА выраженность провоспалительных механизмов характеризовалась более высокими показателями IFN-γ,TNF-α, TNF-α RI, TNF-αRII, IL-6 и IL-2R, чем при АКА (ИБС). 3) Дисбаланс соотношения удельного веса цитокинов при АС представлен увеличением доли IL-6, IL-1β, IL-17, TGFβ1, TGFβ2 и снижением процента IL-2 и IL-10. 4) В цитокиновом профиле при АКА (ИБС) определялось более выраженное снижение доли IL-2 и IL-10, чем при ОАНК, что указывает на угнетение иммунорегуляторной и противовоспалительной активности 116 иммунокомпетентных клеток в условиях системной циркуляторной гипоксии при манифестации ИБС. Особенностью изменения цитокинового профиля при ОАНК, являлась более высокая доля провоспалительных цитокинов: IFN-γ и TNF-α по сравнению с АКА (ИБС) и низкий удельный вес IL-1β, что указывает на цитокино-опосредованное нарушение механизмов ремоделирования тканей в условиях ишемии НК. 5) Определено влияние возраста на цитокиновый профиль сыворотки крови в общей группе пациентов с пациентов с АС: в возрасте 75-89 лет значения IL-6 и TNF-α были выше, а уровень IL-2 ниже, чем у пациентов 45-59 лет. Установлены особенности изменений содержания цитокинов в сыворотке крови пациентов разного возраста и половой принадлежности от локализации и распространенности АС. 6) Определены взаимосвязи содержания цитокинов в сыворотке крови при АС с клинико-лабораторными параметрами (концентрацией общего ХС крови, характером течения стенокардии, функциональным классом стабильной стенокардии, степенью ХСН, фракцией выброса ЛЖ, клиническими проявлениями, степенью ишемии НК) и данными анамнеза заболевания (наличием или отсутствием ИМ и аритмии в анамнезе, периодом времени после перенесенного ИМ). Публикации: 1. Маркелова, Е.В. Значение трансформирующего фактора роста - β и матриксной металлопротеиназы-9 в патогенезе атеросклероза / Е.В. Маркелова, Е.П. Турмова, А.А. Силаев, Н.И. Грачев, Е.А. Бычков, И.В. Чикаловец // Рос. иммунолог. журнал. – 2010. – T. 4 (13), № 3. – С. 261–266. 2. Турмова, Е.П. Особенности регуляторного влияния цитокинов в патогенезе коронарного атеросклероза / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, А.А. Силаев, Н.И. Грачев, Р.М. Громовой // Рос. аллергол. журнал. – 2010. – №5. – С. 295296. 3. Турмова, Е.П. Оценка уровня трансформирующего фактора роста β у пациентов с облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей / 117 Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, А.А. Левицкий // Вестн. уральской академ. науки. – 2010. – № 2 (29). – С. 213. 4. Турмова, Е.П. Патогенетические аспекты цитокиновой регуляции при атеросклерозе / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, А.А. Силаев, А.А. Левицкий, Е.А. Бычков // Рос. аллерголог. журнал. – 2010. – № 1. – С. 173-174. 5. Turmova, E.P. Estimation of cytokines (IL-6,IL-8, IL-10, IL-2), soluble receptors (SRIL-6, SRIL-2) and nitrogen oxide at atherosclerosis: : abstr. 14th intern. congr. of immunology, Kobe, Japan, Aug. 23, 2010 / E.P. Turmova, E.V. Markelova, A.A. Leevitskiy, E.A. Bichkov, A.A. Silaev, G. D Sim, R. M. Gromovoy , R. S. Pankratev, N. I Grachev, I. V. Chikalovets // International Immunology. – 2010. – Vol. 22, suppl. 1. – P. i142. 6. Турмова, Е.П. К вопросу о роли цитокинов в патогенезе ишемической болезни сердца на фоне коронарного атеросклероза / Е.П. Турмова, А.А. Силаев, Н.И. Грачев, Р.М. Громовой, И.Г. Домжалов // Дни иммунологии в Сибири: матер. Всерос. научно-практ. конф. с междун. участием. Абакан: Изд-во Хакасского гос. ун-та им. Н.Ф. Катанова, 2011. – С. 86-87. 7. Турмова, Е.П. К вопросу об иммунных механизмах патогенеза атеросклероза / Е.П. Турмова, А.А. Силаев, И.Г. Домжалов, Р.М. Громовой // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 4. – С. – 361–366. 8. Силаев, А.А. Анализ эффективности цитокинотерапии в послеоперационном периоде у пациентов с коронарным атеросклерозом / А.А. Силаев, Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, Р.М. Громовой, И.Е. Голуб, Е.В. Шкорик, А.А. Хелимский // Тихоокеан. мед. журнал. – 2013. – № 3. – С. 18–21. 9. Турмова, Е.П. послеоперационных Изменение продукции воспалительных цитокинов осложнений у при развитии пациентов с атеросклерозом коронарных артерий / Е.П. Турмова, А.А. Силаев, В.Г. Раповка, Е.В. Маркелова, И.Е. Голуб // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. –2013. –№ 1 (89) – С. 190–193. 118 10. Турмова, Е.П. Особенности цитокинового статуса у больных с атеросклерозом / Е. П. Турмова, Е. В. Маркелова, А.А. Силаев, П.А. Лукьянов, И.В. Чикаловец // Мед. иммунология. – 2014. –Т. 16, № 4. –С. 323-332. 3.2. Роль биохимических маркеров воспаления (металлопротеиназы-9 (ММР-9), тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 (TIMP-1), комплексов (ММР-9/TIMP-1, ММР-9/TIMP-2) и адипокинов (лептина и адипонектина) в патогенезе атеросклероза Как показано нами в обзоре литературы, присутствующая в атеросклеротических очагах деструктивная активность в существенной мере обусловлена секрецией активированными макрофагами, Т-лимфоцитами и пенистыми клетками деструктивных металлопротеиназ (ММР), повышенный уровень которых, выявлен в крови при АС и считается его новым биомаркером [112]. Гидролизуя компоненты матрикса: коллагены, желатин, ламинин, протеогликаны основные, эластин, адгезивные и другие белки соединительной ткани, ММР принимают участие в воспалении, ремоделировании ткани, репарации, мобилизации матрикссвязанных факторов роста и в процессинге цитокинов [235, 300, 359, 450]. Активность ММP в физиологических условиях регулируются специфическими тканевыми ингибиторами металлопротеиназ - ТIМP. В норме, выработка ММР и их ингибиторов уравновешена [69]. Большинство авторов считают увеличение уровня ММP-9 (желатиназы В), TIMP-1, комплекса ММP-9/TIMP-1 предикторами сердено-сосудистых заболеваний, и летальности пациентов с ИБС нестабильности атеросклеротической бляшки [20, 28, 55, 69, 137, 217, 341]. Однако ингибирующая активность TIMP-1 направлена и на ММР, играющую важную 119 роль в ремоделировании артериальной стенки и сердечной мышцы. Вероятно, по этой причине тканевой ингибитор ММР считают независимым фактором риска острого коронарного синдрома и ИМ [359]. Другие авторы не относят ММР-9 и TIMP-1 к значимым факторам риска острого коронарного синдрома, ИМ и смертности [195, 266, 328,]. В эксперименте C. Cuaz-Perolin с соавт. (2006) показали, что у аполипопротеин Е-дефицитных мышей повышение TIMP-1 в крови приводило к снижению аневризмы, но не уменьшало развития AC [207]. Существуют противовоспалительные работы, свойства которые ММР, описывают проявляющиеся только активацией металлопротеиназами-2,3,9,14 – TGF-β и рецептора к IL-1 [131, 300]. По мнению Ю.И. Рагино (2011), различная активность ММР зависит от типа атеросклеротических бляшек (липидный или дестрофическо-некротический тип) [112]. В научном мире активно ведутся работы по оценке взаимосвязи системы матриксных металлопротеиназ с показателями липидного метаболизма [187, 280, 284, 231]. Показано, что ММР-9 вовлечена в дифференцировку адипоцитов и регулирует выделение из них триглицеридов [187]. По данным S.Y. Kim с соавт. (2006), кофактор липопротеинлипазы – аполипопротеин C-II – энзим, вовлеченный в поглощение и метаболизм триглицеридов, расщепляется металлопротеиназами [280]. Из данных литературы следует, что матриксная металлопротеиназа-9 прямо коррелирует с ЛПНП и обратно коррелирует с ЛПВП [231, 283]. Большое значение в патогенезе АС придают гормонам жировой ткани (лептину и адипонектину) [147, 279]. Согласно научным исследованиям последних лет, гормон жировой ткани лептин прямо коррелирует с сердечнососудистыми нарушениями, ИМ, инсультом, гипертензией и АС и действует синергично с другими воспалительными медиаторами [242, 294, 368]. При этом некоторые авторы показали, что лептин защищает организм от развития инсулинорезистентности и в результате этого, опосредованно, обладает антиатерогенным эффектом [64, 201]. Адипонектин осуществляет, в основном противовоспалительные и атеропротективные эффекты, участвует в 120 обеспечении стабильности атеросклеротической бляшки, благодаря регулированию продукции TIMP-1 в макрофагах [288, 359]. Низкий уровень адипонектина способствует развитию ИБС, метаболического синдрома, и других сердечно-сосудистых нарушений. Секреция адипонектина ингибируется провоспалительными цитокинами IL-6, IL-8, макрофагальным воспалительным протеином (MIP) и макрофагальным хемоаттрактантным протеином (MCP) [242, 429]. Однако есть парадоксальные работы, свидетельствующие, что, напротив, повышенный уровень адипонектина связан с высокой смертностью пациентов от сердечнососудистой патологии [282, 359]. S.J. Hong с соавт. (2007) в своем исследовании показали, что пациенты, подвергавшиеся стентированию и получающие лечение термисартаном, значительно снижавшим уровень адипонектина, в последующем имели снижение просвета сосудов [257]. Таким образом, отсутствие единого представления о роли системы ММР9 и гормонов жировой ткани при различных клинических проявлениях АС, а также малочисленность результатов о взаимосвязях ММР-9, ее тканевых ингибиторов и комплексов ММP-9/TIMP-1 и ММP-9/TIMP-2 с показателями липидного метаболизма, гормонами жировой ткани, цитокинами, предопределило проведение исследования в этом направлении. 3.2.1. Оценка содержания ММР-9, TIMP-1, ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP2 в сыворотке крови при атеросклерозе При анализе содержания системы металлопротеиназы-9 у пациентов с АС выявлено, что уровень комплекса ММР-9/TIMP-2, был выше показателей здоровых доноров в 11,5 раз, при этом не было установлено достоверной разницы MMP-9 и комплекса ММР-9/TIMP1 с группой контроля. Регистрировалась тенденция увеличения TIMP-1 (р=0,06) (таблица 18). 121 Увеличение образования комплекса ММР-9/TIMP-2 можно расценить как компенсаторную активность TIMP2, реализуемую в связывании избыточной продукции ММР-9, что подтверждает данные литературы [246]. Однако результаты других исследований свидетельствуют, что ингибиторы металлопротеиназ также могут вовлекаться в их активацию через рецепторные комплексы, например, через комплекс TIMP2 с мембран-связанной коллагенолитической протеиназой – МТ1-ММР (ММР-14), в результате чего усиливается желатинолитическая активность pro-ММP-2 [247]. Таблица 18 – Содержание ММР-9, ее тканевого ингибитора TIMP-1, комплексов ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 у пациентов с атеросклерозом Показатели ММР-9 (нг/мл) Пациенты с АС - общая группа 1 288,6 (193,6-361,5) 2 327,7 (285,8-374,3) Пациенты с СА (ОАНК +АКА(ИБС)) 3 256,4 (136-356,4) TIMP-1 (нг/мл) 232,8 (196,2-275,1) 228,6 (191,5-256,0) 258,1 (198,7-321) 11,2 (9,7-12,3) 11,7 (10,9-12,6) 10,4 (8,3-11,2) 35,6 (17,8-123,9) 37,2 (17,8-150,9) 29,2 (15,1-40,2) ММР9/TIMP-1 (нг/мл) ММР9/TIMP-2 (пг/мл) Пациенты с АКА (ИБС) Здоровые доноры Уровень значимости (Р) 4 241,6 р2-р3>0,05 (195,6-391,1) р2-р4=0,08 р1,3-р4>0,05 200,9 р1-р4=0,06 (177,6-234,6) р2-р3>0,05 р2-р4>0,05 р3-р4=0,04 11,8 р1-р2>0,05 (7,4-13,1) р1-р3>0,05 р2-р3>0,05 3,1 р1-р2>0,05 (1,7-4,3) р2-р3=0,08 р1-р4=0,002 р2-р4=0,01 р3-р4=0,03 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1- р4 достоверность различий между пациентами с АС и здоровыми донорами; р2- р4 - достоверность различий между пациентами с АКА (ИБС) и здоровыми донорами; р2- р3 - достоверность различий между пациентами с АКА (ИБС) и с ОАНК; р3- р4 - достоверность различий между пациентами с ОАНК и здоровыми донорами Особенностью АКА (ИБС) являлось увеличение ММР-9 (таблица 18), что отражает ее участие в повреждении миокарда и манифестации течения ИБС. При этом нельзя не принимать во внимание зависимость показателей системы ММР-9 у пациентов с АС от терапии заболевания. Так, по данным A. Papazafiropoulou и N. Tentolouris (2009) прием нитоглицерина пацентами с ИБС способствует увеличению продукции ММР-9 и снижению уровня TIMP-1, 122 гепарин уменьшает уровень ММР-2, прием гормонов – снижает содержание ММР-9 в крови, антагонисты кальция, такие как амлодипин и дилтиазем – увеличивают активность ММР-1, ММР-2 и TIMP-1 в культуре эндотелиальных клеток человека, лозартан стимулирует продукцию и активность ММР-2 в гладко-мышечных клетках сосудов, тогда как статины снижают уровень ММР9 в плазме крови [343]. У пациентов с преимущественной клиникой повреждения артерий нижних конечностей и при невыраженной клинике ИБС (ОАНК уровень ММР9 был в пределах нормы, тогда как уровень TIMP-1, напротив, был статистически значимо выше показателей контроля (таблица 18). Выше перечисленные признаки, зарегистрированные при СА указывают на контроль выработки ММР-9 ее ингибитором, что можно расценить как компенсаторную активность TIMP-1, но с другой стороны усиленное связывание желатиназы-В может отражать нарушение процессов ремоделирования сосудов НК в ходе их длительной ишемии, способствовать развитию в них процессов фиброобразования и тромбоза. В обеих группах наблюдалось увеличение комплекса ММР-9/TIMP-2, при этом в группе пациентов с АКА (ИБС) зарегистрирована тенденция к увеличению комплекса, по сравнению с группой пациентов с СА (р=0,08). У пациентов с АС установлены корреляционные связи в системе ММР -9: слабая прямая - между ММР-9 и TIMP-1 (r=0,23, р=0,01); средняя прямая между ММР-9 и ММР-9/TIMP-1 (r=0,48, р=0,0001), между ММР-9 и ММР9/TIMP-2 (r=0,32,р=0,003); между ММР-9/TIMP-1 и TIMP-1 (r=0,34, р=0,003). Корреляцию между ММР-9 и TIMP-1 у пациентов с ИМ на фоне АС также подтвердили в своем исследовании J. Tan с соавт. (2008) [403], тогда как E. Elmas с соавт. (2007) не выявили связи между ММР-9 и TIMP-1, но выявили прямую корреляцию между ММР-9 и комплексом ММР-9/TIMP-1 и обратную между ММР-9/TIMP-1 и TIMP-1 при ИМ [218]. У здоровых доноров нами была выявлена сильная прямая корреляция между ММР-9 и ММР-9/TIMP-2 (r=0,94, р=0,05), тогда как между другими 123 показателями системы ММР-9 связи не было установлено. Это, вероятно, указывает на более высокую активность TIMP-2, по сравнению с TIMP-1 при оптимальном функционировании организма и отсутствии воспалительных изменений и клинических проявлений АС. При распределении пациентов с АС по полу выявлено, что уровень ММР9 был несколько выше у мужчин, чем у женщин, однако различия не достигали статистической значимости (р>0,05), что подтверждает данные литературы [391]. K. Koh с соавт. (2002) показали, что у женщин в постменопаузе наблюдается снижение ММР-9 в плазме крови [284]. Результаты проведенного нами исследования показали, что содержание комплекса ММР-9/TIMP-2 было значительно выше у мужчин, чем у женщин (52,2 (17,2-104,1) пг/мл против 27,6 (22,7-68,1) пг/мл, р=0,05) (рисунок 20 ). Рисунок 20 – Содержание комплекса ММР-9/TIMP-2 у пациентов с АС в зависимости от пола Повышение образования комплекса ММР-9/TIMP-2 у мужчин можно также связать с половой реактивностью или, возможно, с преобладанием среди мужчин курильщиков, у которых, по данным литературы, отмечается выраженная активность ММР-9 [305, 391]. Мы не подтвердили результаты исследования J. Sundström с соавт. (2004), что у мужчин с АС и кардиоваскулярным риском уровень TIMP-1 выше, чем у женшин [391]. При анализе показателей системы металлопротеиназы-9 в зависимости от возраста нами выявлена тенденция к снижению ММР-9 в сыворотке крови 124 пациентов 75-89 лет, по сравнению с пациентами 45-49 лет (288,6 (193,6-361,5) нг/мл, против 302,1 (259,3-339,2) нг/мл, р=0,06), тогда как показатели комплексов ММР-9/TIMP-1, ММР-9/TIMP-2 и TIMP-1 не имели отличительных особенностей между возрастными группами пациентов (р>0,05). Мы также не подтвердили данные литературы о повышении продукции ММР-9 [38, 424] и TIMP-1 [218, 328, 391] в связи с увеличением возраста пациентов с АС. В своем исследовании E. Elmas с соавт. (2007) не установили взаимосвязи ММР-9 и ММР-9/TIMP-1 с возрастом у пациентов с ИМ [218]. Наши данные не согласуются с результатами клинического исследования А.Ю. Ефименко (2011), которая обнаружила увеличение активности ММР-2 и ММР-9 в кондиционированной клеточной среде мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани только у пациентов старше 60 лет [38]. При этом в своем экспериментальном исследовании, автор выявила, повышение экспрессии мРНК генов ММР-2 и ММР-9 у мышей в возрасте 18 месяцев, что соответствует возрасту людей 50-70 лет с последующим резким снижением экспрессии мРНК генов ММР-2 и ММР-9 у мышей 24 месяцев, что соответствует возрасту людей старше 70 лет [38]. Таким образом, мы можем предположить, что отсутствие повышения и тенденция к снижению продукции желатиназы В, связаны с инволютивными процессами в стареющем организме у пациентов от 75 до 89 лет. При анализе системы ММР-9 в зависимости от концентрации общего ХС в крови выявлено, что при среднем и высоком уровне общего ХС показатели ММР-9, были выше, чем при низком его уровне, однако при этом они не превышали контрольные значения (таблица 19). Содержание TIMP-1 было выше показателей здоровых доноров только при высокой концентрации общего ХС крови (таблица 19). Это согласуется с данными литературы, что при АС увеличению концентрации ММР-9 и ТIМP-1 способствует усиление продукции атерогенных липидов: ХС, ЛПНП, ТГ [20, 46, 187, 231, 280, 231]. K. Koh с соавт. (2001), продемонстрировали, что 125 статины, через подавление концентрации ХС, влияют на уровень ММР-9 в плазме крови [283]. Нами не выявлено зависимости изменений показателей ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 от концентрации общего ХС в крови, при этом значения ММР9/TIMP-2 при любой концентрации общего ХС были выше контрольного уровня (таблица 19). Таблица 19 – Содержание ММР-9, ее тканевого ингибитора TIMP-1, комплексов ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 у пациентов с АС, в зависимости от уровня общего ХС крови Показатели Общий ХС <5,0 ммоль/л Медиана (М) 1 234,9 (161,4-318,9) Общий ХС 5,1-6,1 ммоль/л Медиана (М) 2 257,5 (184,2-269,5) TIMP-1 (нг/мл) 225,2 (153,4-379,5) 241,7 (223,4-356,2) ММР-9/TIMP-1 (нг/мл) 10,0 (4,7-12,9) 10,7 (6-11,4) ММР-9/TIMP-2 (нг/мл) 30,7 (12,6-73,3) 22,0 (17,6-85,3) ММР-9 (нг/мл) Общий ХС Здоровые Уровень >6,2 ммоль/л доноры значимости Медиана (Р) (М) 3 4 357,4 241,6 р1- р2>0,05 (337,3-386,9) (195,6-391,1) р1- р3=0,02 р2- р3=0,05 р1,2,3- р4>0,05 264,7 200,9 р1- р2,3>0,05 (242,7-329,9) (177,6-234,6) р2- р3>0,05 р1,2- р4>0,05 р3- р4=0,05 10,8 (9,211,8 р1- р2,3>0,05 12,6) (7,4-13,1) р2- р3>0,05 р1,2,4- р4>0,05 32(23,53,1 р1- р2,3>0,05 164,6) (1,7-4,3) р2- р3>0,05 р1- р4=0,002 р2- р4=0,001 р3- р4=0,0001 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1- р2 достоверность различий между пациентами с низким и средним уровнем общего ХС в крови; р 1- р3 достоверность различий между пациентами с низким и высоким уровнем общего ХС в крови; р2- р3 достоверность различий между пациентами со средним и высоким уровнем общего ХС в крови; р 1,2,3р4 - достоверность различий с различным уровнем общего ХС в крови и здоровыми донорами Проведена оценка зависимости показателей желатиназной активности от пола, возраста пациентов с АКА (ИБС), анамнеза заболевания и его клинических проявлений. При распределении пациентов с АКА (ИБС) по возрасту, нами выявлено снижение системного уровня ММР-9/TIMP-1 и тенденция к снижению 126 значений ММР-9 и ММР-9/TIMP-2 у пациентов 75-89 лет, по сравнению с пациентами 45-49 лет (ММР-9/TIMP-1 (10,2 (9,7-10,5) нг/мл против 12,2 (11,313,03) нг/мл, р=0,03); ММР-9 (298 (291,2-314,7) нг/мл против 350,4 (295,5380,6) нг/мл, р=0,09); ММР-9/TIMP-2 (38,9 (19,3-118,2) нг/мл против 53,4 (18,3155,4) нг/мл, р=0,08). При этом статистически значимой разницы по содержанию TIMP-1 в сыворотке крови у пациентов с АКА разного возраста не было зарегистрировано (р>0,05). У мужчин с АКА (ИБС) уровень ММР-9/TIMP-2 в сыворотке крови был значительно выше, чем у женщин (72,1 (19,4-160,1) нг/мл против (17,8 (17,289,3) нг/мл, р=0,04), тогда как содержание ММР-9, TIMP-1 и ММР-9/TIMP-1 не зависело от пола, р>0,05. Установлено, что у пациентов с перенесенным ИМ в анамнезе АКА (ИБС) значения ММР-9/TIMP-2 были достоверно выше, чем у пациентов без ИМ (р=0,04, рисунок 21). Рисунок 21 – Содержание комплекса ММР-9/TIMP-2 у пациентов с АКА (ИБС) в зависимости от наличия ИМ в анамнезе Из результатов А.А. Турна и Р.Т. Тогузова (2009) следует, что после ИМ наблюдается снижение активности MMР-2 и увеличение активности MMР-9, это связано с тем, что MMР-9 обладает более значительным количеством активирующих ее факторов: TNF-α, IL-1β, IL-6 и других цитокинов, по 127 сравнению с MMP-2 [137]. При этом, угнетение активности ММР-2, по мнению авторов, приводит к уменьшению миграции макрофагов, задержке фагоцитоза миоцитов в зоне некроза макрофагами и улучшению выживаемости в результате предотвращения разрыва миокарда [318]. Нами не отмечено связи ИМ в анамнезе с показателями ММР-9, ММР9/TIMP-1 и TIMP-1 в сыворотке крови пациентов с ИБС (р>0,05). Тем самым мы не подтвердили результаты других исследователей, что у пациентов с перенесенным ИМ в анамнезе наблюдается повышение ММР-9 [20, 137]. При определении показателей системы ММР-9 в зависимости от интервала времени после перенесенного ИМ нами обнаружены самые высокие значения ММР-9, TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 в период от 6 до 12 месяцев после ИМ. При этом уровень ММР-9, в этот период был выше, чем в интервале до 3 месяцев после ИМ (р=0,01), и выше, чем показатели контроля (р=0,05); содержание TIMP-1 через 6-12 месяцев после ИМ было выше, чем в период от 1 до 3 и от 3 до 6 месяцев после ИМ (р = 0,02-0,04), и выше, чем у здоровых доноров (р=0,05), а содержание ММР-9/TIMP-2 уже на 3-ем месяце и более после ИМ было выше, чем в период от 1 до 3 месяцев после ИМ (р=0,02-0,03). При этом значения комплекса ММР-9/TIMP-2 были выше контрольного уровня в течение всего периода после ИМ (р<0,05), что отражает активацию TIMP-2, направленную на связывание избытка ММР-9. Таким образом, мы не подтвердили разнонаправленные изменения показателей ММР-9 и TIMP-1 в периоде более 14 дней после ИМ (снижение уровня ММР-9 и повышение содержания TIMP-1), зарегистрированные другими авторами [244]. Нами установлено, что высокий уровень ММР-9 в сыворотке крови регистрируется не только в течение нескольких часов, максимум до 1 недели после ИМ, как было показано другими исследователями [224, 244, 271], но и может повышаться в более поздний период – от 6 до 12 месяцев после ИМ. Как было описано нами ранее в главе 3, период от 6 до 12 месяцев после ИМ характеризуется усилением провоспалительной активности, проявляющейся увеличением продукции провоспалительных цитокинов: IL-1β 128 и IL-6, и снижением естественных ингибиторов TNF-α – его растворимых рецепторов (TNF-αRI и TNF-αRII). Установленное нами увеличение уровня ММР-9, TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 в сыворотке крови пациентов в период от 6 до 12 месяцев после ИМ также служит подтверждением реактивации воспаления и повреждения миокарда. Не исключено, что это связанно с самостоятельным прерыванием пациентами рекомендуемой или недобросовестным применением постинфарктной терапии. Однако нами не выявлено достоверной зависимости изменения содержания комплекса ММР9/TIMP-1 с интервалом времени после ИМ (р>0,05) (таблица 20). Зарегистрировано, что с увеличением степени ХСН отмечалось нарастание уровня TIMP-1 (ХСН II Б степени (319 (286,9-372,1) нг/мл против ХСН II А степени (215,5 (187,7-238,2) нг/мл и против ХСН I степени (212,3 (231-236,8) нг/мл, р=0,02). При этом – при ХСН II Б степени показатели TIMP-1 превышали референсные величины (319 (286,9-372,1) нг/мл против 200,9 (177,6-234,6, р=0,02). Значения ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 при ХСН II Б степени были также достоверно выше, чем при ХСН I степени (ММР-9/TIMP-1 – (12,8 (12,6-13,7) нг/мл против 11,4 (10,2-12,5) нг/мл, р=0,04); ММР-9/TIMP-2 – (88,9 (19,7-186,7) нг/мл против 19,8 (17,4-106,7) нг/мл, р=0,05). При этом уровень ММР-9/TIMP-2 был выше референсных значений при ХСН I, IIА и II Б степени (р<0,05, таблица 20). При снижении ФВЛЖ менее 50% зарегистрировано нарастание уровня TIMP-1 (298,6 (246,2-358,9) против 225,12 (191,5-250,2) – при ФВЛЖ более 50%, р=0,05). Это подтверждает участие TIMP-1 в нарушении сократительной функции миокарда, что согласуется с данными E. Elmas с соавт. (2007), о том, что TIMP-1 может не только ингибировать, но и активировать синтез коллагена фибробластами и действовать как профибротический фактор, и тем самым, опосредованно способствовать снижению сократительной активности кардиомиоцитов [218]. Определена тенденция нарастания ММР-9/TIMP-2 при снижении ФВЛЖ менее 50% (71,13 (40,5-115,3) нг/мл, против (37,2 (17,8-160,1) 129 нг/мл, р<0,08), тогда как изменений содержания показателей ММР-9, ММР9/TIMP-1 от ФВЛЖ не было установлено. При наличии аритмии в клиническом течении ИБС выявлено, что значения ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 были несколько ниже, чем у пациентов без аритмии, однако изменения показателей носили лишь характер тенденции (р=0,06-0,08). Таблица 20 – Содержание ММР-9, ее тканевого ингибитора TIMP-1, комплексов ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 у пациентов с АКА (ИБС), в зависимости от интервала времени после случая ИМ в анамнезе Показатели ИМ до 3 месяцев 1 278,9 (267334,4) ИМ 3-6 месяцев 2 348,8 (293393,7) ИМ 6-12 ИМ >12 месяцев месяцев 3 4 365 334,9 (336,4-404,6) (288,7-381,2) Здоровые доноры 5 241,6 (195,6391,1) Уровень значимости (Р) ММР-9 р1-р2,4>0,05 (нг/мл) р1-р3=0,01 р2-р3,4>0,05 р3-р4>0,05 р1,2,4-р5>0,05 р3-р5=0,05 TIMP-1 212,8 176,2 308,3 221,8 200,9 р1-р2,4>0,05 (нг/мл) (201,5(170,5(254,8-358,9) (197,6-269,8) (177,6р1-р3=0,04 234) 243,9) 234,6) р2-р3=0,02 р1-р2,4>0,05 р3-р4=0,05 р1,2,4-р5>0,05 р3-р5=0,03 ММР10,8 12 11,9 11,8 11,8 р1-р2,3,4>0,05 9/TIMP(10,6(11,6(11,6-13,7) (10,3-12,6) (7,4-13,1) р2-р3,4>0,05 1(нг/мл) 3,75) 13,6) р3-р4>0,05 р1,2,3,4р5>0,05 ММР22,6 106,7 124,2 80,5 3,1 р1-р2=0,04 9/TIMP(19,3(48,9(39,3-204,5) (17,8-177,8) (1,7-4,3) р1-р3=0,03 2 (нг/мл) 53,3) 226,7) р1-р4=0,09 р2-р,3,4>0,05 р3-р4>0,05 р1,2,3,4р5<0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1р2 - достоверность различий между пациентами с ИМ до 3 мес. и ИМ 3-6 мес.; р2- р3 достоверность различий между ИМ 3-6 мес. и 6-12 мес.; р3- р4 - достоверность различий между ИМ 6-12 мес. и ИМ>12 мес.; р1- р4 - достоверность различий между ИМ до 3 мес. и ИМ 6-12 мес.; р2- р4 - достоверность различий между ИМ 3-6 мес. и ИМ >12 мес.; р1,2,3,4- р5 достоверность различий между пациентами с АКА с различными сроками после ИМ и здоровыми донорами 130 При этом зафиксировано, что содержание ММР-9/TIMP-2 было выше показателей контроля как у пациентов с аритмией, так и с ее отсутствием (30,7 (17,8-184,5) пг/мл и 53,3 (17,8-155,4) пг/мл против 3,1 (1,7-4,3) пг/мл, р<0,05). Мы не подтвердили данные E. Elmas с соавт. (2001) об увеличении уровня TIMP-1 при аритмии [218]. Нами также не было установлено зависимости показателей: ММР-9, TIMP-1, ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 от характера течения стенокардии (р>0,05). Тем самым, мы не подтвердили результаты других исследователей, об увеличении уровня ММP-9 при дестабилизации течения ИБС [20, 69]. Однако мы определили, что с увеличением функционального класса стабильной стенокардии происходило снижение уровня ММР-9/TIMP-2 (при СС II ФК 156,9 (148,1-417,9) нг/мл, при СС III ФК - 71,1 (17,8-160,1) нг/мл и при СС IV ФК- 53,4 (17,7-97,8) нг/мл, с достоверностью различий между группами (р<0,05). Известно, что увеличение функционального класса стабильной стенокардии служит отражением прогрессирования ишемии и гипоксии кардиомиоцитов. В своем экспериментальном исследовании А.Ю. Ефименко (2011) показала, что экспрессия генов ММP-2 и -9 снижается в гипоксических условиях [38]. Однако, нами было зафиксировано, что значения комплекса ММР-9/TIMP-2 при любом ФКСС все же оставались выше контрольного уровня (р<0,05), вероятно за счет увеличения продукции и высокой связывающей активности TIMP-2. Это согласуется с данными Vijay Nambi с соавт. (2008), показавшими, что содержание TIMP-2, но не TIMP-1 достоверно выше у пациентов со стабильной стенокардией по сравнению со здоровыми донорами [328]. При этом, нами не было установлено изменений содержания ММР-9, TIMP-1 икомплекса ММР-9/TIMP-1 в зависимости от ФКСС (р>0,05). Обнаружено значительное увеличение уровня ММР-9 и ММР-9/TIMP-2 при повышении числа пораженных коронарных артерий - от 3 до 6 (ММР-9 348,79 (302,4-396,4) нг/мл – при обтурации 3-6 артерий против 302,1 (273,6363,5) нг/мл – при обтурации 1-2 артерий, р=0,005); ММР-9/TIMP-2 62,2 (27,2160,0) – при обтурации 3-6 артерий против 26,8 (17,8-153,9)–при обтурации 1-2 131 артерий, р=0,05). При этом, статистически значимых изменений концентрации содержания ММР-9/TIMP-1 и TIMP-1 не было выявлено (р>0,05). Повышение уровня ММР-9 при увеличении стенозирования артерий согласуется с данными литературы [330]. Вероятно, это можно связать с стимуляцией процессов ремоделирования при множественном поражении артерий. При анализе содержания системы ММР-9 у пациентов различных возрастных групп с ОАНК было зарегистрировано, что уровень ММР-9/TIMP-2 у пациентов 75-89 лет был статистически значимо ниже, чем в группах пациентов 60-74 лет и 45 - 49 лет (1,73 (1,7-23) нг/мл, против 35(16-58,3) и 32,5 (22,4-41) нг/мл (р<0,05), но при этом он не отличался от показателей контроля (р>0,05). При распределении пациентов с ОАНК по полу - не было установлено статистически значимых отличий показателей системы ММР-9 между мужчинами и женщинами (р>0,05). Не было выявлено и зависимости изменений содержания системы ММР-9 у пациентов, госпитализированных по экстренным или плановым показаниям (с наличием или отсутствием клинических проявлений критической ишемии НК) (р>0,05). Однако при распределении пациентов с ОАНК в зависимости от степени ишемии НК, было установлено, что показатели ММР-9 и комплекса ММР9/TIMP-1 при ишемии НК II степени были ниже, а TIMP-1 – выше контрольного уровня. Это видимо, характеризует истощение продукции желатиназы В, или компенсаторное ингибирование его выработки повышенное образованию коллагена и развитию фиброза (таблица 21). При III и IV степенях ишемии НК содержание ММР-9, ММР-9/TIMP-1 увеличивалось, а TIMP-1 снижалось, но при этом показатели не отличалось от референсных значений. Нарастание системного уровня ММР-9, ММР-9/TIMP-1 и снижение содержания TIMP-1 при увеличении степени ишемии НК характеризует активацию желатиназы В при гипоксическом повреждении, что согласуется с результатами других исследователей (таблица 21) [343, 406]. При этом отмечено, что показатели ММР-9/TIMP-2 были выше контрольного 132 уровня при любой степени ишемии НК, без достоверной разницы между группами, что характеризует активацию и относительную стабилизацию связывания ММР-9 ее ингибитором TIMP-2 (таблица 21). По данным литературы известно, что продукция ММР-9, стромелизинов, и коллагеназ зависит от активации цитокинами, в то время как ММР-2 вырабатывается, преимущественно, покоящимися ГМК и эндотелиальными клетками и практически не зависит от стимуляции цитокинами. Экспрессия TIMP-2, ингибитора ММР-2 и ММР-9 также относительно костуитивна, в отличие от TIMP-1, для продукции которого необходимы внешние стимулы, такие как форболовые эфиры, ростовые факторы, цитокины [69]. Таблица 21 – Содержание ММР-9, ее тканевого ингибитора TIMP-1, комплексов ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 у пациентов с ОАНК в зависимости от степени ишемии нижних конечностей Показатели Ишемия НК II Ишемия НК Ишемия НК Здоровые Уровень ст. III ст. IV ст. доноры значимости (Р) 1 2 3 4 ММР-9 217,3 229,13 343,4 241,6 р1-р2>0,05 (нг/мл) (118,1-282.6) (196,8-307,6) (313,4-450,2) (195,6-391,1) р1-р3=0,001 р2-р3=0,002 р1,2,3-р4>0,05 TIMP-1 нг/мл 301,2 273,6 213,2 200,9 р1-р2>0,05 (256,2-318,4) (223,2-330,4) (197,8-239,1) (177,6-234,6) р1-р3=0,04 р2-р3>0,05 р1-р4=0,05 р2,3 - р4>0,05 ММР7,1 10,2 11,4 11,8 р1-р2>0,05 9/TIMP-1 (6,4-9,8) (8,3-11,5) (10,3-12,2) (7,4-13,1) р1-р3=0,01 (нг/мл) р2-р3=0,05 р1-р4=0,03 р2,3-р4>0,05 ММР20,3 31,3 28,1 3,1 р1-р2,3>0,05 9/TIMP-2 (18,2-56,2) (13,4-45,6) (24,4-56,5) (1,7-4,3) р2-р3>0,05 (нг/мл) р3-р4>0,05 р1,2,3-р4<0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25Q75).бр1- р2 - достоверность различий между пациентами с ишемией НК II и III степени; р2- р3 - достоверность различий между пациентами с ишемией НК III и IV степени; р1- р3 достоверность различий между пациентами с ишемией НК II и IV степени; р1,2,3- р4 достоверность различий между пациентами с различными степенями ишемии НК и здоровыми донорами 133 При распределении пациентов в зависимости от формы поражения артерий НК выявлено, что у пациентов с периферической формой ОАНК значения ММР-9 были статистически значимо ниже, чем при окклюзии БПС (161,02 (145-257) нг/мл против 301,01 (282,4-391,5) нг/мл, р=0,05), при этом достоверности различий показателей: TIMP-1, ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP2 между группами не было установлено (р>0,05). Зафиксировано, что значения TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 были выше контрольного уровня (р<0,05), а содержание ММР-9 и ММР-9/TIMP-1 не отличалось от референсных показателей во всех исследуемых группах (р>0,05). Не отмечалось достоверных различий в исследуемой системе ММР-9 в зависимости и от наличия синдрома Лериша в клиническом течении ОАНК (р>0,05). Значения TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 были выше показателей контроля, как в группе с наличием синдрома Лериша в течении ОАНК, так и в группе с его отсутствием (р<0,05). 3.2.2. Определение содержания гормонов жировой ткани (лептина и адипонектина) в сыворотке крови при атеросклерозе Проведено исследование содержания гормонов жировой ткани (лептина и адипонектина) при АС. Установлено, снижение уровня адипонектина в сыворотке крови пациентов с АС, тогда как уровень лептина не отличался от показателей контроля (таблица 22). Выявленные изменения согласуются с данными литературы [288, 359]. В зависимости от локализации и распространенности поражения артерий при АС выявлены некоторые особенности: при АКА (ИБС) значения лептина были выше, чем у здоровых доноров (р=0,04) и пациентов с СА (р=0,05) (таблица 22). При этом у пациентов с СА уровень лептина был несколько ниже референсных значений, но статистически значимо не отличался от них (р>0,05). 134 Отсутствие повышения лептина у пациентов с ОАНК, вероятно, связано с компенсаторным ограничением выработки гормона адипоцитами. Таблица 22 – Содержание лептина и адипонектина в сыворотке крови пациентов с атеросклерозом Показатели Лептин (нг/мл) Пациенты с АС - общая группа 1 3,0 (1,6-4,7) Пациенты с АКА (ИБС) 2 4,4 (2,7-5,1) Пациенты с ОАНК Здоровые доноры 3 1,8 (1,0-3,2) 4 2,7 (1,8-4,1) Уровень значимости (Р) р1-р4>0,05 р2-р4=0,05 р3-р4>0,05 р2-р3=0,04 Адипонектин 4,4 4,5 4,2 5,7 р1-р4=0,01 (мкг/мл) (3,4-5,7) (3,6-5,6) (3,0-6,4) (5,4-6,5) р2-р4=0,02 р3-р4=0,01 р2-р3>0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). р1- р4 - достоверность различий между пациентами с АС и здоровыми донорами; р2- р4 достоверность различий между пациентами с АКА и здоровыми донорами; р2- р3 достоверность различий между пациентами с АКА и с СА; р3- р4 - достоверность различий между пациентами с СА и здоровыми донорами Поскольку известно, что лептин стимулирует симпатическую активность НС, усиливает вазоконстрикцию и способствует прогрессированию ишемии тканей НК [147]. Как при АКА, так и при СА содержание адипонектина, было ниже контрольного уровня, без статистически значимых различий между группами (таблица 22). В зависимости от возраста пациентов с АС выявлено, что в возрасте 75-89 лет, значения лептина были статистически значимо выше, чем в возрасте 60-74 лет и 45-59 лет (р=0,05), а уровень адипонектина в возрасте 75-89 лет - выше, чем в возрасте 45-59 лет (р=0,03) (рисунок 22). Выявленные показатели согласуются с результатами Е.В. Шин (2011), которая в своем исследовании показала, что значения лептина и адипонектина положительно коррелируют с возрастом пациентов с ИБС [155]. Считаем, что при старении организма развивается рецепторная резистентность к адипокинам, связанная с накоплением в организме кислородных радикалов [273, 293, 409]. 135 Рисунок 22 – Уровень лептина и адипонектина у пациентов с АС в зависимости от возраста Не установлено статистически значимых отличий показателей адипокинов в зависимости от пола в общей группе пациентов с АС, однако, у женщин регистрировалась тенденция к повышению значений как лептина, так и адипонектина, по сравнению с мужчинами (уровень лептина - 3,8 (3,6-5,8) нг/мл, против 2,5 (1,7-3,9) нг/мл (р=0,06); уровень адипонектина - 5,2 (4,6-5,5) мкг/мл, против 4,2 (3,3-6,1) мкг/мл (р=0,09). Это согласуется с результатами С.Ю. Чубриевой (2008), С.Д. Ошоровой с соавт. (2011), Е.В. Шин (2011) [100, 147, 155]. При определении содержания адипокинов при разной концентрации общего ХС в крови пациентов с АС выявлено, что при уровне общего ХС более 6,2 ммоль/л значения лептина были статистически значимо выше, чем при значениях общего ХС менее 5,0 ммоль/л р=0,04), при этом они превышали контрольный уровень (р=0,03, рисунок 23). Рисунок 23 – Уровень лептина у пациентов с АС в зависимости концентрации общего ХС в крови 136 Нами не зарегистрировано статистически значимых различий показателей адипокинов при АКА (ИБС) в зависимости от возраста и пола пациентов, определялась лишь тенденция более высокого уровня лептина у женщин, по сравнению с мужчинами (5,6 (5,2-6,3) нг/мл против 3,3 (2,8-4,9) нг/мл, р=0,07). При распределении пациентов с АКА (ИБС) в зависимости от наличия или отсутствия ИМ в анамнезе заболевания, выявлено, что при ИБС, но отсутствии ИМ в анамнезе значения лептина были статистически значимо выше, чем у пациентов с наличием ИМ (4,8 (2,8-5,4) нг/мл, против 3,4 (2,5-4,8) нг/мл (р=0,05) и выше, чем у здоровых доноров (р=0,04). Тогда как содержания адипонектина было ниже уровня контроля в обеих группах пациентов, без достоверности различий между группами (р>0,05). Считаем, что более низкий уровень лептина у пациентов с перенесенным ИМ вероятно связан с постинфарктной терапией, влияющей на концентрацию гормона в крови. При анализе изменений адипокинов в зависимости от интервала времени после перенесенного ИМ, выявлено, что уровень лептина в период от 1 до 3 месяцев после перенесенного ИМ был выше, чем в период более 12 месяцев после ИМ (4,8 (2,7-4,98) нг/мл против 3,2 (2,4-5,0) нг/мл, р=0,05) и статистически значимо превышал показатели контроля(р=0,05), что отражает участие гормона в повреждении миокарда и согласуется с данными других исследователей [294, 368]. Уровень адипонектина не зависел от периода после ИМ (р>0,05). Установлено, что при НС значения лептина были выше, чем при СС (4,0 (2,8-6,3) нг/мл, против (3,4 (2,6-5,0) нг/мл, р=0,05). Уровень адипонектина был выше контрольных значений в обеих группах (р<0,05), однако различий между группами пациентов с СС и НС также не было выявлено (р>0,05). Определено нарастание уровня лептина при увеличении ФК стенокардии. При IV ФК СС его значения были статистически значимо выше, чем при II ФК СС (4,3 (3,1-6,0) нг/мл против (2,8 (2,4-5,8) нг/мл, р=0,05) и были выше 137 контрольного уровня (2,7 (1,8-4,1) нг/мл, р=0,05), что также отражает косвенное участие гормона в ишемическом повреждении миокарда. Обнаружено, что при увеличении степени ХСН, уровень лептина напротив, снижался. При ХСН I степени его значения были выше, чем при II Б степени (4,9 (3,1-5,3) нг/мл, против 3,3 (2,1-4,2) нг/мл, р=0,05) и выше значений здоровых доноров (р=0,03), при этом при II А и II Б степени ХСН уровень лептина не отличался от контрольных показателей (р>0,05). Это, по нашему мнению, вероятно, отражает компенсаторную функцию организма, заключающуюся в экономии энергии в условиях ХСН, поскольку известно, что лептин снижает синтез макроэргов и повышает затраты энергии [64, 147]. Снижение уровня лептина у пациентов с ИБС и наличием ХСН также было выявлен Т.С. Силиной (2012). Зафиксировано, некоторое нарастание значений адипонектина при увеличении степени ХСН, показатели гормона были статистически значимо ниже уровня здоровых доноров только при ХСН I степени (4,0 (3,6-4,6) мкг/мл, против 5,7 (5,4-6,5) мкг/мл, р=0,05), но при увеличении степени ХСН не отличались от них (р>0,05). В своем исследовании Т.С. Силина (2012) определила более высокий адипонектина у пациентов с ИБС с наличием ХСН, по сравнению с пациентами без проявлений ХСН [122]. Нами не выявлено различий между показателями адипокинов у пациентов с АКА (ИБС) в зависимости от ФВЛЖ, однако было зафиксировано, что только в группе пациентов с ФВЛЖ менее 50% уровень лептина был статистически значимо выше контрольных значений (4,1 (3,0-5,4) нг/мл, против 2,7 (1,8-4,1) нг/мл, р<0,05). Не установлено влияния аритмии в анамнезе АКА (ИБС) и количества пораженных коронарных артерий на содержание адипокинов в сыворотке крови пациентов (р>0,05). Проведен анализ содержания адипокинов в сыворотке крови пациентов с ОАНК. Выявлено, что в группе пациентов с СА 75-89 лет показатели лептина были выше, чем в группах пациентов 45-59 и 60-74 лет (4,2 (2,8-6,1) нг/мл, 138 против 1,8 (1,0-3,2) нг/мл и 1,2 (0,8-3,6) нг/мл, соответственно, р=0,05). Зарегистрированы статистически значимые различия и в показателях адипонектина между группами пациентов с СА 75-89 лет и 45-59 лет (6,3 (5,97,3) мкг/мл, против 3,6 (2,7-4,5) мкг/мл, соответственно, р=0,03). Нами не выявлено различий значений лептина и адипонектина между мужчинами и женщинами с ОАНК. При анализе изменений уровня адипокинов не установлено статистически значимых различий содержания лептина и адипонектина между группами пациентов, направленных в стационар по экстренным или по плановым показаниям (р>0,05). Однако зафиксировано, что значения адипонектина были ниже контрольного уровня только у пациентов, поступивших в стационар по экстренным показанием, с клиническими симптомами критической ишемии НК (3,8 (3,0-5,5) мкг/мл, против 5,7 (5,4-6,5) мкг/мл у здоровых, р=0,05). Нами также не выявлено различий в показателях адипокинов в зависимости от формы поражения артерий НК (р>0,05). При распределении групп пациентов с ОАНК по степени ишемии НК выявлено, что при IV ст. ишемии НК уровень адипонектина был ниже референсных значений (3,4 (3,0-7,3) мкг/мл, против 5,7 (5,4-6,5) мкг/мл (р=0,03), тогда как при ишемии II ст. и III ст. не имел с группой контроля достоверных различий (р>0,05). Зафиксировано, что наличие или отсутствие синдрома Лериша в клиническом течении СА (ОАНК+ИБС) не влияло на изменения концентрации адипокинов в крови (р>0,05). При изучении корреляционных связей между содержанием изучаемых показателей и клинико-лабораторными параметрами АС были выявлены: прямая корреляция уровня общего ХС с показателями: ММР-9, TIMP-1 и лептина; прямая корреляция количества пораженных артерий с содержанием ММР-9, TIMP-1, ММР-9/TIMP-2; прямая корреляция ФК СС с уровнем лептина и обратная – с содержанием ММР-9/TIMP-2; прямая корреляция степени ХСН с показателями: TIMP-1, ММР-9/TIMP-1, ММР-9/TIMP-2 и обратная – с уровнем 139 лептина; прямая корреляция степени ишемии НК с содержанием ММР-9, ММР-9/TIMP-1 и обратная –с уровнем TIMP-1, ММР-9/TIMP-2 и адипонектина (таблица 23). Выявлена обратная корреляция между лептином и ММР-9 (r=0,75, р=0,0001), прямые корреляции между лептином и TIMP-1 (r=0,23,р=0,04), лептином и ММР-9/TIMP-1 (r=0,35,р=0,006), обратная корреляция между адипонектином и TIMP-1 (r=-0,22,р=0,05), что отражает их взаиморегуляцию и участие в патогенезе заболевания. Таблица 23 – Коэффициенты корреляции (R) клинико-лабораторных параметров при АС с содержанием показателей системы ММР-9 и адипокинов в сыворотке крови пациентов Показатели Уровень Количество общего пораженных ХС артерий ММР-9 0,42* 0,34* TIMP-1 0,38* 0,27 ММР-9/TIMP-1 0,22 0,34 ММР-9/TIMP-2 0,24 0,53* Лептин 0,30 0,45* Адипонектин -0,29 -0,12 *- достоверность уровней значимости р<0,05 ФК СС Степень ХСН Степень ишемии НК 0,36 0,11 0,27 -0,44* 0,71* -0,24 0,32 0,78* 0,62* 0,54* -0,36* 0,15 0,48* -0,33* 0,42* -0,26 0,18 -0,31* Таким образом, в результате исследования можно сделать следующие выводы: 1. У пациентов с АС в сыворотке крови установлено низкое содержание адипонектина, высокий уровень комплекса ММР-9/TIMP-2, зарегистрированы положительные корреляции ММР-9 с TIMP-1, ММР-9/TIMP-1, ММР-9/TIMP-2, что отражает активацию процессов связывания желатиназы В ее тканевыми ингибиторами 1 и 2 типа. 2. У мужчин с АС с преимущественном поражением коронарных артерий АКА (ИБС) содержание комплекса ММР-9/TIMP-2 значительно выше, чем у женщин. 3. При гиперхолестериемии увеличивается концентрация лептина, ММР-9 и ТIМP-1. 140 4. Особенностью АКА (ИБС) являлось увеличение ММР-9 и лептина в сыворотке крови, что свидетельствует об их участии в повреждении миокарда и манифестации течения ИБС. При ОАНК зарегистрирован избыток TIMP-1, при нормальном уровне ММР-9, что отражает компенсаторную активность организма, проявляющуюся в связывании ММР-9 ее тканевым ингибитором, однако это может свидетельствовать о нарушении процессов ремоделирования тканей НК в ходе их длительной ишемии. 5. У пациентов с АС в возрасте 75-89 лет выявлено увеличение адипокинов в сыворотке крови. 6. Зарегистрированы особенности влияния уровня поражения артерий на содержания комплексов ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 в сыворотке крови пациентов с АС разных возрастных групп. При АКА (ИБС) у пациентов 75-89 лет выявлено низкое содержание ММР-9/TIMP-1, тогда как при ОАНК у пациентов 75-89 лет определяется более низкое содержание ММР-9/TIMP-2. 7. У пациентов с перенесенным ИМ в анамнезе выявлено высокое содержание ММР-9/TIMP-2 и низкий уровень лептина в сыворотке крови. 8. В периоде от 6 до 12 месяцев после ИМ наблюдается увеличение продукции ММР-9, TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2, что указывает на отсроченную реактивацию воспаления и повреждения миокарда. 9. В периоде от 1 до 3 месяцев после перенесенного ИМ, при НС и увеличении ФК стенокардии выявлено увеличение лептина в крови, что косвенно подтверждает участие гормона в стимуляции симпатической активности и ишемическом повреждения миокарда. 10. При увеличении степени ХСН и снижении ФВЛЖ менее 50% зарегистрировано нарастание уровня TIMP-1, что указывает на участие этого ингибитора в стимуляции фиброза и нарушение сократительной функции миокарда. При увеличении ХСН выявлен низкий уровень лептина в крови, что свидетельствует о компенсаторном регулировании выработки гормона с целью сохранения запасов энергии в условиях ХСН (лептин снижает синтез макроэргов и повышает затраты энергии). 141 11. При увеличении количества стенозированных коронарных артерий регистрируется повышение содержания ММР-9 и ММР-9/TIMP-2 в сыворотке крови, что отражает стимуляцию продукции ММР-9 и усиление процессов ремоделирования артерий при множественном повреждении артерий. 12. Установлено прогрессирующее нарастание системного уровня ММР-9, ММР-9/TIMP-1, снижение содержания TIMP-1 и адипонектина при увеличении степени ишемии НК, противовоспалительных что указывает механизмов на активацию реактивности при про- и ишемическом повреждении тканей НК. 13. Сильная обратная корреляция между лептином и ММР-9, слабые прямые корреляция между лептином и TIMP-1, лептином и ММР-9/TIMP-1, слабая обратная корреляция между адипонектином и TIMP-1 при АС, подтверждают взаиморегуляцию данных показателей в патогенезе заболевания. Публикации: 1. Маркелова, Е.В. Значение трансформирующего фактора роста - β и матриксной металлопротеиназы-9 в патогенезе атеросклероза / Е.В. Маркелова, Е.П. Турмова, А.А. Силаев, Н.И. Грачев, Е.А. Бычков, И.В. Чикаловец // Рос. иммунолог. журнал. – 2010. – T. 4 (13), № 3. – С. 261–266. 2. Турмова, Е.П. Изучение продукции MMP-9 и ТФР-β у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей / Е.П. Турмова, Е.А. Бычков, А.А. Левицкий // Актуальные вопросы аллергологии и иммунопатологии»: сб. статей 8-ой регион. научно-практ. конференции /под ред. Е.В. Просековой, В. В. Деркач – Владивосток, 2010. – С. 91-92. 3. Турмова, Е.П. Роль ММP-9/TIMP, TNF-α и его рецептора TNF-αRII в развитии послеоперационных осложнений в кардиохирургии / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, А.А. Силаев // Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии: сб. статей и тезисов IX регион. научно-практ. конф. / под Е.В. Просековой, В. A. Cабыныч. – Владивосток, 2011. – С. 80-81. ред. 142 3.3. Оценка полиморфизма генов интерлейкинов: TNF-α (–308G/A), IL-6 (174G/C), TGFB1 (-509 C/T) и IL-10 (-1082 G/A) и гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) при атеросклерозе Генетические факторы играют существенную роль в возникновении течении воспаления артериальной стенки [54, 377]. Гены интерлейкинов обладают чрезвычайно высокой степенью полиморфизма, количество участков полиморфизма в одном гене может достигать нескольких десятков [8]. Наличие аллельного полиморфизма в промоторных участках генов интерлейкинов обеспечивает разнообразие индивидов по степени продукции в артериальной стенке кодируемых цитокинов и других биологически активных веществ в ответ на действие различных патогенных агентов [117, 123]. Установлена сопряженность полиморфизма генов интерлейкинов с нарушениями липидного обмена и тромбообразования [291, 323, 345, 369, 446]. Расшифровка механизмов влияния полиморфизма иммунорегуляторных генов на развитие воспаления с аутоиммунным компонентом в артериальной стенке позволяет индивидуально, обоснованно и своевременно корректировать профилактику и терапию АС [8, 33, 57, 117, 123, 202, 259, 377]. Однако, результаты исследований в отношении полиморфизма генов цитокинов:TNF-α (-308G/A), IL-6 (-174G/C), TGFβ1 (-509C/T) и IL-10 (-1082G/A) при АС неоднозначны [221, 277, 366]. В настоящее активно изучается полиморфизм гена PTPN22 rs2476601 (С/T аллели) при заболеваниях аутоиммунного генеза, однако практически отсутствует информация по полиморфизму A/G варианта гена. По данным литературы следует, что ген ―PTPN22 (protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22 (lymphoid) расположен на коротком плече хромосомы 1 в позиции 13.2, его функцией является кодирование образования тирозин фосфатазы (Lyp), экспрессирующейся на T-клетках [304]. Этот фермент необходим для осуществления сигналинга, контролирующего 143 активность Т-клеток иммунитета. При аутоиммунных нарушениях – замена свободного нуклеотида гена PTPN22 (rs2476601) приводит к изменению белковой последовательности фермента LYP в позиции 620 (620Arg>Trp), что вызывает снижение функциональной активности Т-регуляторных CD4+CD25+клеток (контроля воспаления, обеспечение иммунологической толерантности протекции аутоагрессии против собственных тканей) [365]. Полиморфизм гена PTPN22 ассоциируют со многими аутоиммунными заболеваниями (АЗ): сахарным диабетом 1 типа, ревматоидным артритом, аутоиммунным тиреоидитом, системной красной волчанкой, миастенией Гравис и др. [95, 240, 268, 320,]. В источниках литературы, Т-вариант гена PTPN22 rs 2476601 1858 (С/T) связывают с риском аутоиммунной патологии, в том числе и АС [365]. При этом в научных кругах существуют неоднозначные мнения в отношении полиморфизма гена PTPN22. R Palomino-Morales с соавт. (2010), при обследовании пациентов с ревматоидным артритом, не выявили связи полиморфизма гена PTPN22 с развитием у них кардиоваскулярной патологии [342]. Требуется дальнейший поиск генетических факторов риска развития атерогенных поражений сосудистого русла и связанных с ними тяжелых клинических проявлений заболевания [349, 394]. С этих позиций, мы решили проанализировать полиморфизм генов интерлейкинов: TNF-α (–308G/A), IL-6 (-174G/C), TGFB1 (-509 C/T), IL-10 (-1082 G/A) и гена - PTPN22 rs 2476601 (G/A) и определить их роль в патогенезе АС (таблица 24). Под наблюдением находились 260 пациентов с АС и 50 здоровых доноров, с отсутствием клинических проявлений заболевания. В зависимости от локализации и клинических проявлений пациенты были разделены на 2 группы: I группа – пациенты с АС коронарных артерий и выраженной клиникой ишемической болезни сердца (140 человек), II группа – пациенты с системным АС с преимущественным поражением артерий нижних конечностей (120 человек), без выраженных клинических проявлений ИБС 144 Таблица 24– Праймеры иммунорегуляторных генов SNP TNFa rs 1800629 IL10 rs1800896 TGFB1 rs1800469 IL6 rs1800795 PTPN22 rs2476601 Праймер U 5’-TTCCGAGGGGGGTCTTCTG -3’ R 5’- GTTCTATCTTTTTCCTGCATCCTGT -3’ U 5’-CACAAATCCAAGACAACACTACT -3’ R 5’-GATAGGAGGTCCCTTACTTTCC -3’ U 5’-CTTACAGGTGTCTGCCTCCTGA-3’ R 5’-CGGAGGGTGTCAGTGGGAG-3’ 5’-GTGCATGACTTCAGCTTTACTC-3’ RC 5’-AATGTGACGTCCTTTAGCATG-3’ RG 5’-AATGTGACGTCCTTTAGCATC-3’ U 5’-TCACCAGCTTCCTCAACCAC -3’ R 5’-CTCCAAGCATAGATGATGAAATC -3’ Достоверность различий (р) в распределении частот генотипов между группами оценивали с помощью критерия χ2. Для определения риска заболевания или риска развития определенных клинических проявлений АС вычисляли отношение шансов (OШ) с доверительным интервалом=95%. ОШ = (а × d)/ (b×c), где а – частота аллеля (генотипа) в выборке больных, b– частота аллеля (генотипа) в контрольной выборке или в выборке группы сравнения, c– сумма частот остальных аллелей (генотипов) в выборке больных и d– сумма частот остальных аллелей (генотипов) в контрольной выборке или в выборке группы сравнения. Если OШ с доверительным интервалом = 95% больше единицы, то предполагаемый фактор риска является значимым (т.е., с большой вероятностью, вызовет наступление события, например, болезни). Проведен анализ полиморфизма исследуемых генов, у здоровых доноров, и у пациентов АС. При этом зарегистрировано, что доминантными аллелями являлись: С аллель гена TGFβ1 (-509 C/T), G аллель гена TNFα (-308G/A), C–аллель гена IL6 (-174G/C), А аллель гена IL10 (-1082 G/A); в гене PTPN22 (G/A) –доминировала G аллель. Результаты нашего исследователя согласуются с данными M. Baddela с соавт. (2012), которые, проанализировали полимофизм генов интерлейкинов у 651 пациента с АС коронарных артерий (острым коронарным синдромом) и у 145 432 здоровых доноров в Южной Индии и показали увеличение у обследованных частоты А аллели гена IL10 (-1082 G/A), C -аллели гена IL-6 (174G/C), G аллели гена TNFα (-308G/A) [176]. Мы не выявили статистически значимых отличий в полиморфизме гена IL10 (-1082 G/A) по сравнению с группой здоровых (таблица 25). Нами подтверждены данные многих авторов [132, 176, 232, 357, 378], которые в своих научных трудах отметили превалирование С аллели гена IL-6 (-174G/C) в группах пациентов с АС и здоровых людей и показали ее значимость в патогенезе АС. Однако, M.Weger с соавт. (2005), напротив, отметили низкую частоту С аллели гена IL-6 (-174G/C) у пациентов с АС, по сравнению со здоровыми донорами и даже показали протективную роль С-генотипа при атерогенной окклюзии ретинальной артерии сетчатки [435]. Таблица 25 – Показатели полиморфизма генов интерлейкинов у пациентов с атеросклерозом и у здоровых доноров Ген (полиморфиз м) IL-6 rs1800795 (174G/C) TGFβ1 rs1800469 (-509 C/T) TNF-α rs 1800629 (-308G/A) IL-10 rs1800896 (1082 G/A) Геноти п/аллел ь G/G C/C C/G C/T C/C T/T G/G A/G A/А G/G A/G A/A Частота (%) Контроль Пациенты с АС 1 2 44,6 39,5 21,2 21,5 34,2 39,0 52,1 43,5 41,6 36,3 6,3 20,2 67 77,1 33 21,8 1,1 25,1 22,4 39,5 49,7 35,4 27,9 Уровень значимос ти P (χ2) ОШ (ДИ=95%) 0,56 1,0 0,55 0,32 0,46 0,007 0,15 0,11 0,73 0,20 0,36 0,81 (0,44-1,48) 0,64 (0,05-0,61) 1,24 (0,67-2,3) 0,72 (0,40-1,31) 0,77 (0,42-1,42) 3,91 (1,39-11,5) 1,64 (0,84-3,23) 0,57 (0,29-1,12) 0,84 (0,41-1,71) 1,5 (0,82-2,73) 0,72 (0,37-1,37) Нами выявлено увеличение частоты встречаемости гомозиготного варианта Т аллели гена TGFβ1 rs1800469 (-509 C/T) у пациентов с АС по сравнению с контролем, р (χ2)=0,007. 146 Мы не подтвердили результаты других исследователей о том, что поражение АС выше среди гомозигот-1082/AA [176, 272] и-1082 G/G гена IL-10 [251, 272]. J. Erdmann (2009), S. Kathiresan (2009), N. Samani (2009) вообще не было установлено ассоциации полиморфизма гена IL-10 с риском ИБС [221, 277, 366]. M. Baddela с соавт. (2012), в своем исследовании показали, что - AA и GA варианты гена TNFα (-308G/A) ассоциированы с АС. Нами не зарегистрировано увеличения частоты GA генотипа TNFα (-308G/A) у пациентов с АС [176]. Однако мы зафиксировали, что A/А вариант определялся только при АС и отсутствовал у здоровых доноров (таблица 25). При распределении пациентов по половому признаку установлено, что у мужчин частота встречаемости гетерозиготных вариантов: G/C гена IL6 (-174 G/C), A/G варианта гена IL10 (-1082 G/A) и A/G гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) была статистически значимо выше, чем у женщин (р(χ2)=0,002; р(χ2) = 0,01; р(χ2)=0,01, соответственно), (рисунок 24). 100% 80% 60% * * * * 40% 20% 0% GG GC IL-6 (-174G/C ) CC GG AG IL-10 (-1082 G/A) М AA GG AG AA PTPN22 (G/A) Ж Рисунок 24 – Полиморфизм генов у пациентов с АС в зависимости от половой принадлежности Гомозиготный АА генотип PTPN22 rs 2476601 (G/A) регистрировался только у мужчин (1,3 %). У женщин выявлено преобладание гомозиготного G варианта гена IL-6 (-174G/C), по сравнению с мужчинами (р(χ2)=0,02), (рисунок 24). 147 Не было выявлено достоверности различий показателей полиморфизма исследуемых генов в зависимости от возраста пациентов с АС. Однако, нами зарегистрирована тенденция к более частому присутствию в геноме гетерозиготного C/G варианта гена IL-6 (-174G/C) у пациентов 45-59 лет 47,9% по сравнению с пациентами старше 60 лет, у которых этот генотип составлял – 34,6%, р(χ2)=0,08. Мы не подтвердили результаты Г.Е. Ройтберга (2010), который обследовал группу молодых мужчин и связал G/A вариант TNFα (-308G/A) с ранним АС [116]. При распределении пациентов с АС на группы в зависимости от концентрации общего ХС крови нами была зарегистрирована ассоциация его высокого уровня с полиморфизмом генов TNF-α (-308G/A), IL-6(-174G/C), и TGFβ1 (-509 C/T) (рисунок 25). 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% * * * * GG AG AA TNFα (–308G/A) ХС низкий CT CC ТТ GG TGFβ1 (-509 C/T) ХС средние знач. GC CC IL-6 (-174G/C ) ХС высокий Рисунок 25 – Ассоциация полиморфизма генов цитокинов с концентрацией общего холестерина крови пациентов с АС У пациентов с содержанием общего ХС крови более 6,2 ммоль/л выявлена высокая частота встречаемости A/G и A/A вариантов гена TNFα (-308G/A), G/G варианта гена IL-6 (-174G/C),Т/Т варианта гена TGFβ1 (-509 C/T) и низкая частота встречаемости G/G варианта гена TNF-α (-308G/A), СG варианта гена IL-6 (-174G/C), C/T варианта гена TGFβ1 (-509 C/T), по сравнению с группой пациентов со средним (от 5,1 до 6,1 ммоль/л) и низким (менее 5,0 ммоль/л) уровнем общего ХС, (р(χ2)< 0,05, рисунок 25). 148 Результаты нашего исследования согласуются с данными А. Riikola с соавт. (2009), выявивших ассоциацию генотипов IL6 (-174G/C) с уровнем общего ХС крови в последовательности: GG>GC>CC [357]. Наибольшую «атерогенность» A/G варианта TNFα (-308G/A) также обозначил в своем исследовании Г.Е. Ройтберг (2010), показав ассоциацию данного генотипа с гипертриглицеридемией крови [116]. Нами установлены особенности полиморфизма генов интерлейкинов в зависимости от локализации и клинических проявлений АС. У пациентов АКА (ИБС) зарегистрирована высокая частота встречаемости G/G варианта гена TNFα (-308G/A) и тенденция снижения его A/G варианта, по сравнению с контролем (р(χ2)=0,05 и р(χ2)=0,07, соответственно), что согласуется с результатами других исследователей [176]. При этом А/А генотип встречался только у пациентов с СА (ОАНК+(ИБС)) в 3,5%. При ОАНК частота встречаемости гетерозиготного C/T варианта TGFβ1 (-509C/T) была статистически значимо ниже, чем в контроле и в группе пациентов с АКА (ИБС), р(χ2)=0,03. Определена тенденция более высокой частоты A/G варианта гена IL-10 (-1082 G/A) при ОАНК, по сравнению с носителями этого генотипа в контрольной группе, р(χ2)=0,07 (таблица 26). Проведено исследование уровня интерлейкинов в сыворотке крови в зависимости от полиморфизма кодирующих их генов (таблица 27). Нами не зарегистрировано соответствующей зависимости среди представителей здоровых доноров. Однако, при АС выявлены изменения регуляции продукции цитокинов в зависимости от полиморфизма соответствующих генов. Установлено, что во всех группах пациентов с АС – носителей гомозиготных G и C аллелей – значения интерлейкина-6 были достоверно выше референсных показателей (таблица 27). У пациентов с ОАНК при носительстве гомозитотного варианта С аллели IL-6 (-174G/C), определялось более высокое содержание IL-6 в сыворотке крови, в отличие от пациентов с АКА (ИБС). Наши данные согласуются с результатами Y.Liu с соавт. (2006), показавших ассоциацию C/С варианта гена 149 IL-6 (-174G/C) [302], с высоким уровнем IL-6 в сыворотке крови, но противоречат результатам M. Weger (2005), связавшего этот генотип с низкой экспрессией IL-6 [435] и результатам M.P. Sie и F.A. Sayed-Tabatabaei (2006), не установивших ассоциации C/С генотипа с уровнем цитокина [381]. Таблица 26 – Частота встречаемости полиморфизма генов интерлейкинов у пациентов с АКА (ИБС), с ОАНК и у здоровых доноров Ген Генотип IL-6 rs1800795 (-174G/C) TGFβ1 rs1800469 (-509 C/T) TNF-α rs 1800629 (–308G/A) IL-10 rs1800896 (-1082 G/A) Пациенты с ОАНК 2 40,6 % 22,0 % 37,3 % 36,2 % Контроль G/G C/C C/G C/T Пациенты с АКА (ИБС) 1 39,1 % 20,3 % 40,6 % 51,6 % C/C T/T 31,4 % 17,0 % 41,4 % 22,4 % 41,6 % 6,3 % р1- р2,3>0,05 р1- р3=0,03 р2- р3=0,003 G/G 79,8 % 72,8 % 67,0 % р1- р3=0,05 р2- р3>0,05 A/G 20,2 % 23,7 % 33,0% р1- р3=0,07 A/A G/G 0% 25,8 % 3,5 % 17,0 % 0% 25,1 % р1- р2,3>0,05 A/G 47,5 % 52,5 % 39,5 % р1- р3 >0,05 р2- р3=0,08 A/A 26,6 % 30,5 % 35,4 % р1- р2,3>0,05 3 44,6 % 21,2 % 34,2 % 52,1 % Уровень значимости P (χ2) р1- р2,3>0,05 р1- р2,3>0,05 р1- р2,3>0,05 р2- р1,3=0,03 р1- р3 >0,05 ОШ (ДИ=95%) ОШ (1,2) <1 ОШ (1,2) <1 ОШ (1,2) <1 ОШ (1) <1 ОШ (2) =2,0 (1,1-3,7) ОШ (1-2) <1 ОШ (1) =3,2 (1,1-9,6) ОШ (2) =4,4 (1,6-12,9) ОШ (1) =2,0 (1,0-4,0) ОШ (2) <1 ОШ (1) =1,9 (0,9-3,7) ОШ (2) <1 ОШ (1,2) <1 ОШ (1) <1 ОШ (1) =1,7 (0,9-3,1) ОШ (1,2) <1 р- достоверность различий между группами 1,2,3,4 Установлено, что высокий уровень TGFβ1 был ассоциирован с C/T вариантом соответствующего гена только в группе пациентов с ОАНК. Значения TGFβ1 в данной группе были статистически значимо выше, чем у пациентов с АКА (ИБС) и выше, чем у здоровых доноров, имеющих аналогичный генотип TGFβ1 (-509 C/T), р<0,05 (таблица 27). При этом нами не было зарегистрировано различий уровня TGFβ1 между группами пациентов – носителей гомозиготных C и G аллелей соответствующего гена, р>0,05. 150 Таблица 27 – Содержание интерлейкинов в сыворотке крови в зависимости от полиморфизма кодируемых генов Ген IL-6 rs1800795 (-174G/C) Генот ип/ал лель G/G C/C C/G TGFβ1 C/T rs1800469 (-509 C/T) C/C T/T TNF-α rs G/G 1800629 АС - общая группа Здоровые доноры % Кодируемые (соответствующие продукты геномной регуляции) интерлейкины - уровень в сыворотке крови (пг/мл) 1 2 3 4 6,4 5,1 7,1 1,9 (2,3-9,8) (1,4-8,2) (3,1-12,2) (0,6-3,1) 6,6 4,3 8,2 1,3 (4,2-8,4) (1,0-6,1) (5,2-14,5) (0,4-2,4) 3,6 4,2 2,4 1,4 (0,5-4,8)* (0,5-6,5) (0,7-3,4)* (0,3-2,7) 24,7 18,63 15,1 41,4* (18,2-38,2) (16,8-25,8) (30,21-61,3) (12,4-36,8) 20,2 (12,8-24,9) 20,2 (15,4-25,8) 6,8 (2,3-9,6) АКА (ИБС) 21,8 (14,7-9,8) 23,8 (14,5-31,9) 6,6 (1,5-12,0) ОАНК 18,2 (16,9-24,6) 16,5 (16,5-17,4) 7,3 (4,1-11,1) 16,2 (11,1-33,2) 14,3 (11,6-28,4) 4,8 (2,2-7,9) Уровень значимости (P) между группами 1,2,3,4 р1,2,3- р4<0,05 р2- р2,3>0,05 р1,2,3- р4<0,05 р2- р3=0,04 р1,2,3- р4>0,05 р2- р3=0,04 р3- р4=0,001 р1,2- р4>0,05 р1,2,3- р4>0,05 р1,2,3- р4>0,05 р1,2,3- р4>0,05 р1- р4=0,03 р2- р3=0,01 (6,2-11,2) р3- р4=0,02 р2- р4>0,05 15,8 12,2 16,6 38,7 р1,2- р4<0,05 IL-10 G/G (7,2-24,1) (5,1-22,7) (11,5-40,8) (18,7-63,3) р3- р4>0,05 rs1800896 8,8 6,2 15,9 26,4 р1,2- р4<0,05 A/G (-1082 (5,1-24,1) (5,1-14,0) (5,3-47,7) (17,1-47,8) р3- р4>0,05 8,2 9,2 18,1 33,7 р1,2- р4<0,05 A/A G/A) (7,8-19,2) (6,2-29,1) (12,6-33,9) (19,2-38,6) р3- р4>0,05 Результаты представлены в виде Медианы, нижнего и верхнего квартилей М (Q25-Q75). * достоверность различий показателей кодируемых интерлейкинов в зависимости от носительства полиморфных вариантов генов в группах группами - 1,2,3,4 (–308G/A) A/G 9,9 1,9* (0,8-6,7) 11,6 (9,1-15,8) 3,6 (2,9-6,2) Выявлено, что у пациентов с АКА (ИБС) – носителей гетерозиготного A/G варианта гена TNF (-308G/A) уровень –TNF-α в сыворотке крови был статистически значимо ниже, чем у носителей G/G генотипа в этой группе пациентов, р<0,05 и ниже, чем у пациентов с ОАНК и здоровых доноров – носителей одноименного (A/G) генотипа (р<0,05) (таблица 27). При СА с преимущественным поражением артерий НК гена A/G генотип TNF-α (-308G/A), напротив, был ассоциирован с высокими значениями 151 кодируемого цитокина в сыворотке крови, по сравнению с контролем (р=0,02) (таблица 27). Эти результаты согласуются с данными А.В. Рыдловской и А.С. Симбирцева (2005), которые в своем исследовании показали, что cинтез белка при А варианте гена TNF-α (-308G/A) происходит в 3 раза активнее, чем при G генотипе [117]. Нами не отмечено влияния полиморфизма гена IL-10 (-1082 G/A) на продукцию кодируемого IL10. Уровень цитокина в сыворотке крови был ниже контрольных значений при любых аллельных вариантах гена IL-10 (-1082 G/A) (таблица 27). У пациентов с АС и у здоровых доноров зарегистрировано увеличение частоты встречаемости гомозиготного G аллеля гена PTPN22 rs 2476601 (G/A). Тогда как А/А генотип был выявлен только при АС (таблица 28). Таблица 28 – Показатели полиморфизма гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) у пациентов с атеросклерозом Ген (полиморфизм) Частота (%) Генотип/ аллель PTPN22 rs 2476601 (G/A) Мы не Уровень значимости P (χ2) ОШ (ДИ=95%) Контроль Пациенты с АС G/G 1 83 2 78,8 0,58 0,77 (0,35-1,65) G/A 17 20,1 0,87 1,13 (0,52-2,46) A/A 0 1,1 - - установили статистически значимых отличий частоты встречаемости полиморфных вариантов гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) между группами, в зависимости от пола и возраста пациентов с АС. При этом не было зарегистрировано различий в полиморфизме гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) между группами пациентов с АКА (ИБС) и с ОАНК (рисунок 26). 152 1 0,5 Контроль СА (ОАНК+АКА (ИБС)) АКА (ИБС) 0 G/G АКА (ИБС) G/A A/A СА (ОАНК+АКА (ИБС)) Контроль Рисунок 26 – Полиморфизм гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) в группах пациентов с АКА (ИБС), с ОАНК и у здоровых доноров Проведено исследование содержания интерлейкинов, продуцентами которых являются Т-лимфоциты. Мы проанализировали уровень основных провоспалительных (IFN-γ, IL-1β, IL-6, TNF-α), противовоспалительных (TGFβ1, TGFβ2, IL-10), иммунорегуляторных (IL-2, IL-17) цитокинов и растворимых рецепторов к цитокинам (TNF-αRI, TNF-αRII, IL-6R, IL-2R) в зависимости от полиморфизма гена PTPN22 rs 2476601 (G/A), с целью оценки его регуляторного влияния на функциональную активность Т-клеток в патогенезе АС. Для этого в группах с различными вариантами гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) нами был проанализирован уровень цитокинов и растворимых рецепторов и произведен расчет отношения показателей между собой в зависимости от принадлежности их к определенному генотипу (таблица 29). В группе здоровых доноров мы не зарегистрировали ассоциации полиморфизма гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) с уровнем цитокинов: IFN-γ, IL-1β, IL-6, TNF-α, TGFβ1, TGFβ2, IL-10, IL-17 и растворимых рецепторов к цитокинам: TNF-αRI, TNF-αRII, IL-6R, IL-2R (таблица 29). Однако было зарегистрировано, что при гетерозиготном G/A варианте гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) в сыворотке крови здоровых доноров определялся более высокий уровень IL-2 (в 4 раза выше, чем при G/G генотипе). Подобная взаимосвязь уровня IL-2 с гетерозиготным G/A генотипом была выявлена и в опытных группах. 153 Таблица 29 – Отношение показателей цитокинов и растворимых рецепторов при различных нуклеотидных вариантах гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) у пациентов с АС, с АКА (ИБС), с ОАНК и у здоровых доноров Показатели АС - общая ОАНК АКА (ИБС)) Здоровые группа доноры PTPN22 PTPN22 PTPN22 PTPN22 (G/G :G/A) (G/G :G/A) (G/G :G/A) (G/G :G/A) 1 2 3 4 IFN-γ 1,6:1 1:1,5 1:2,4 1:4,6 IL-1β 1,9:1 1:1,6 1,4:1 3,3:1 IL-6 1,5:1 1:1,7 1,2:1 2,2:1 TNF-α 1:1,9 2,9:1 1:1,2 1,2:1 IL-2 1:9,4 1:7,2 1:12,4 1:4 IL-17 1,3:1 1:2,3 3:1 1,2:1 IL-10 1:1 1:1,3 1:1 1:1 TGF β1 1:1 1,1: 1 1:1,1 1:1 TGF β2 1:1 1:1,2 1,1: 1 1:1 IL-2 R 1,1:1 1,1:1 1,3:1 1,3:1 IL-6R 1:1 1:1,1 1:1 1:1,2 TNF-α RI 1:1 1:1 1 :1,1 1,1:1 TNF-αRII 1:1 1 :1,1 1,1 :1 1:1 Значения представлены - как отношения показателей между собой Носители G/A варианта гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) в общей группе пациентов с АС, в группе пациентов с АКА (ИБС) и в группе пациентов с ОАНК имели более высокие значения цитокина в сыворотке крови, чем носители гомозиготного G/G генотипа (в 2,4 раза выше, в 12,4 раза выше и в 7,2 раза выше, соответственно), при достоверности различий между группами (р<0,05). Таким образом, результаты нашего исследования указывают на регуляторное активирующее влияние гетерозиготного G/A варианта гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) на продукцию IL-2. Выявлено, что у пациентов с АС – носителей гетерозиготного G/A варианта гена, системный уровень IFN-γ был статистически значимо выше (в 2,4 раза), чем у имеющих гомозиготный G/G вариант гена PTPN22 rs 2476601 (G/A), р<0,05. 154 Нами зафиксированы противоположные изменения относительно сопряженности аллельного полиморфизма гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) с содержанием провоспалительных цитокинов в сыворотке крови пациентов с АС, в зависимости от его локализации и клинических проявлений. В группе пациентов с ОАНК носительство G/G генотипа ассоциировалось с увеличением концентрации TNF-α в сыворотке крови (TNF-α– в 2,9 раз выше, а чем при G/А генотипе, р<0,05). При этом была зарегистрирована достоверность различий системного уровня TNF-α в зависимости от полиморфизма гена PTPN22 rs2476601 (G/A) между группами пациентов с АКА (ИБС) и с ОАНК (рχ2=0,001). У пациентов с АКА (ИБС) установлена ассоциация G/A варианта гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) с увеличением уровня IFN-γ в сыворотке крови (в 4,6 раз выше, чем при G/G генотипе), а носительство гомозиготного G/G варианта гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) сопровождалось более высоким содержанием IL-1β, IL-6 и IL-17 в сыворотке крови (IL-1β - выше в 3,3 раза, IL-6 в 2,2 раза, IL-17 в 3 раза выше, чем при гетерозиготном G/A варианте). Мы не выявили ассоциации концентрации вышеперечисленных цитокинов в сыворотке крови с носительством гомозиготного G аллеля у пациентов с ОАНК. Напротив, носители гетерозиготного G/A варианта гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) имели более высокий уровень цитокинов (IL-1β в 1,6 раз выше, IL-6 - в 1,7 раз выше и IL-17 – в 2,3 раза выше), чем при G/G генотипе. Между группами пациентов с АКА (ИБС) и с ОАНК были выявлены статистически значимые различия относительно ассоциации полиморфизма гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) с уровнем IL-17 (рχ2=0,01, рχ2=0,02, соответственно). Таким образом, анализируя результаты проведенного исследования, можно сделать следующие выводы: 1. У здоровых доноров и пациентов с АС в генах интерлейкинов доминантными аллелями являются: - С аллель гена TGFβ1 (-509 C/T), G аллель гена TNF-α 155 (-308G/A), C - аллель гена IL-6 (-174G/C), А аллель гена IL-10 (-1082 G/A); в гене PTPN22 (G/A) – доминирует G аллель. 2. У пациентов с АС, в отличие от здоровых доноров, отмечается увеличение частоты встречаемости гомозиготной Т-аллели гена TGFβ1 rs1800469 (-509 C/T). 3. У мужчин с АС в геноме превалируют гетерозиготные варианты генов IL-6 (-174G/C), IL-10 (-1082 G/A) и PTPN22 rs 2476601 (G/A), у женщин с АС определяется увеличение частоты встречаемости гомозиготного G варианта гена IL-6 (-174G/C). 4. Зарегистрирована ассоциация уровня общего холестерина крови с полиморфизмом генов TNF-α (–308G/A), IL-6 (-174G/C),TGFβ1 (-509 C/T). 5. При АС выявлена ассоциация высокого уровня IL-6 с гомозиготными С и G вариантами IL-6 (-174G/C), высокого уровня TNF-α – с гетерозиготным A/G вариантом гена TNF-α (-308G/A). 6. У здоровых доноров и у пациентов с АС установлена сопряженность полиморфизма гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) с уровнем IL-2 в сыворотке крови. 7. При АС зарегистрирована ассоциация гетерозиготного G/A варианта гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) с высоким системным уровнем IFN-γ в сыворотке крови. 8. Выявлены особенности сопряженности полиморфных вариантов имммунорегуляторных генов c содержанием про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови в зависимости от локализации и клинических проявлений атеросклероза. При ОАНК высокий уровень IL-6 – ассоциирован с носительством гомозиготного С варианта гена IL-6 (-174G/C), высокий уровень TGFβ1 – с гетерозиготным C/T вариантом гена TGFβ1 (-509 C/T)), высокий уровень TNF-α – с А/G вариантом гена TNF-α (-308G/A) и G/G вариантом гена PTPN22 (G/A), высокая концентрация IL-17 c G/A генотипом PTPN22 (G/A). При АКА (ИБС) – высокий уровень IFN-γ- с G/A вариантом гена PTPN22 (G/A), 156 высокая концентрация IL-1β, IL-6, IL-17 – с гомозиготным G вариантом гена PTPN22 (G/A). Публикации: 1. Турмова, Е.П. Анализ генетического полиморфизма при коронарном атеросклерозе / Е.П. Турмова, А.А. Силаев, В.Г. Раповка, В.Е. Красников, И. Е. Голуб, М.Л. Филипенко, Н.А. Оськина // Рос. аллергол. журнал. – 2013. – № 2. – С. 292-293. 2. Турмова, Е.П. Оценка полиморфизма гена PTNFRS2476601 (G/A) в патогенезе атеросклероза / Е.П. Турмова, А.А. Силаев, Е.А. Чагина // Актуальные вопросы аллергологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики: сб. статей и тезисов XII регион. научно-практ. конференции, 2930 апр. 2014, Владивосток / под ред. Е.В. Просековой, В. A. Cабыныч, Е.В. Маркеловой – Владивосток, 2014. – С. 43-44. 3. Турмова, Е.П. Оценка Полиморфизма генов-кандидатов иммуноопосредованного воспаления для определения предрасположенности к атеросклерозу: информационное письмо / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, А.А. Силаев. – Владивосток, 2014. – 15 с. 4. Караулов А.В. Анализ полиморфизма генов: TNF-Α (–308G/A), IL-6 (-174G/C), TGFB1 (-509 C/T), IL-10 (-1082 G/A) И PTPN22 (RS 2476601) (G/A) при атеросклерозе // А.В. Караулов, Е.В. Маркелова, Е.П. Турмова, А.А. Силаев // Молекулярная медицина. – 2014. Принята редакцией к печати 10.06.2014. Планируется публикация во 2 номере журнала 2015 г. 157 3.4. Экспериментальная модель атеросклероза для оценки основных факторов патогенеза и обоснование применения иммуномодулирующей терапии Инициирующим звеном в патогенезе АС является эндотелиальная дисфункция (ЭД), представляющая собой дисбаланс между продукцией вазодилатирующих, ангиопротективных и антипролиферативных факторов, с одной стороны, и вазоконстриктивных, протромботических, пролиферативных факторов, с другой [91, 92, 167, 203, 379]. Многими показано клиническими влияние и эпидемиологическими многочисленных факторов риска исследованиями на развитие и прогрессирование ЭД и АС, среди которых – артериальная гипертензия (АГ) и гиперлипидемия (ГЛ) – являются основными и наиболее часто встречающимися [22, 92, 98, 245]. ГЛ и АГ способствуют формированию синдрома происходит системного активация воспалительного ответа полиморфно-ядерных в результате лейкоцитов которого (нейтрофилов), усиление продукции и секреции ими активных форм О2- и H2О2, и интенсификация перекисного окисления (ПО) белков и жирных кислот [451]. При активации процессов ПО увеличивается проницаемость эндотелия, происходит окисление и модификация липопротеинов, усиливается их проникновения и накопление в артериальной стенке [69, 156, 451]. Реакция перекиси кислорода с оксидом азота (NO) образует ONOO- и лишает NO его биологического действия, как фактора релаксации. При гиперлипидемии и увеличении уровня ТГ происходит снижение NO [454]. Недостаток NO приводит к усилению АД по типу развития порочного круга [69]. При этом прогрессирование АГ коррелирует с увеличением содержания общего ХС, ТГ, ХС ЛПНП, снижением ХС ЛПВП и ИА крови [98]. Однако, до настоящего времени, нет четкого и согласованного мнения в отношении периода формирования повреждения сосудистой стенки и роли 158 цитокинов в развитии ЭД при совместном действии на организм АГ и ГЛ. Индивидуальная реактивность, разнообразие и неоднородность внутренних и внешних факторов риска ЭД и АС, действующих на человека в повседневной жизни, затрудняют формирование единой выборки для клинического изучения патогенеза заболевания. Экспериментальный метод позволяет: обеспечить относительную чистоту выборки для научного изучения (оценить роль определенных факторов риска в повреждении эндотелия, минимизировать погрешности от влияния сопутствующей патологии), в хронологическом порядке отследить инициацию и прогрессирование АС. Разработка адекватной и недорогой экспериментальной модели АС – необходимый шаг для расширения представлений о взаимосвязях факторов врожденного иммунитета с метаболическими нарушениями в патогенезе заболевания для усовершенствования его диагностики, профилактики и лечения [80, 139, 140, 220, 233, 340, 335, 443,]. Применяемые ранее модели АС на крысах оценивали воздействие только одного фактора риска заболевания – ГЛ, или АГ, при этом в них не изучалось динамика изменений функциональных и морфологических свойств артериальной стенки в условиях длительного интервала времени [63, 80, 120, 136, 139, 140, 444, 445]. Животные подвергались воздействию фактора риска кратковременно, преимущественно на протяжении 2-3 недель, без учета оценки механизмов долговременной компенсации структурных и функциональных повреждений эндотелия. В производимых моделях АС на крысах не оценивалось влияние сочетания нескольких факторов риска, часто наблюдаемых в популяции людей. С этих позиций, целью настоящего раздела исследования была разработка экспериментальной модели, сочетающей влияние на организм животного нескольких основных факторов риска АС: ГЛ и АГ для получения наиболее выраженного атерогенного повреждения сосудов. Учитывая особенности обменных веществ у крыс, способствующих формированию их резистентности к жировой нагрузке, было решено медикаментозно снизить скорость процессов 159 метаболизма животных путем угнетения функции щитовидной железы. Замедление метаболизма также является значимым фактором риска АС, способствует гиперхолестеринемии, симпатовагальному дисбалансу, усилению ПОЛ [212, 270, 396, 455, 460]. R. Marfella с соавт. (2011), исследуя структуру атеросклеротически-измененных сосудов у пациентов с гипотиреозом, обнаружили в них увеличение количества макрофагов, T-лимфоцитов, HLADR(+) клеток, содержания TNF-α, маркеров оксидативного стресса (нитротирозина и О2-), уровня MMP-9 и снижение содержания коллагена [311]. По данным литературы показано снижение продукции NO, увеличение показателей оксидативной активности и морфологических изменений эндотелия при экспериментальном гипотиреозе у крыс [219, 425]. В процессе отработки методики материалом для исследования служили 55 крысы самцов линии Wistаr, массой 250-350 гр (рисунок 27). Материал исследования: 55 крыс I. Моделирование – экзо- и эндогенной ГЛ (гипотиреоз) (жировая диета) (15 крыс) II. Комплексная модель (экзо- и эндогенная ГЛ +АГ) (25 крыс) III. Контроль (здоровые крысы, питающиеся обычным рационом) (15 крыс) Рисунок 27 – Материал экспериментального исследования При экспериментальном моделировании нами были использовано сочетание стандартных методик: 1. Животным добавляли в корм 1 % порошка холестерина в 10 % маргарине, per os, вводили 10 мг/кг мерказолила и 2,5 МЕ/кг витамина D (экзогенная и эндогенная ГЛ) [61]. 2. Моделирование АГ проводилось по методике F. Helle (2006) [254], в модификации – за 15 дней перед началом кормления животных, им была произведена операция – наложение лигатуры на почечную ножку левой почки 160 нерассасывающимся шовным материалом и прошивание верхнего полюса правой почки, оставляя 2/3 органа. Эксперимент производился в динамике, на протяжении 6 месяцев. Через 2, 4 и 6 месяцев наблюдения по 5 животных из каждой группы выводили из эксперимента под эфирным наркозом, путем декапитации. Проводили забор сыворотки крови, фрагментов аорты, бедренных артерий и печени крыс. Эксперимент проводился со строгим соблюдением требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента и последующей утилизации. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. Исследование одобрено междисциплинарным этическим комитетом (протокол № 2, дело № 6, от 06.02.2013). Для установления механизмов атерогенеза перед нами были поставлены следующие задачи: 1. Оценить состояние аорты (А) и бедренных артерий (бедр. арт.) крыс с помощью метода магнитно-резонансной томографии, иммуногистохимического (определение NADPH-диафоразы) и гистологического методов 2. Определить морфологическое состояние ткани печени крыс 3. Оценить липидный спектр крови крыс 4. Изучить состояние цитокинового профиля, показателей общей оксидантной (ООА), общей антиоксидантной активности (АОА), оксидативного индекса (ОИ) и ММР-9 в крови и биоптатах артерий крыс 5. Выявить возможные корреляции локального и системного уровня цитокинов с показателями оксидативной активности, липидного спектра и ММР-9 в модели экспериментального АС. Методы, используемые для выполнения поставленных задач, были описаны нами ранее во 2 главе диссертации. 161 Проводя мониторинг показателей в динамике эксперимента, и сравнивая модель изолированной ГЛ с сочетанием ГЛ и АГ, мы пришли к заключению, что комплексная модель являлась наиболее показательной. При этом она была доступна, легко выполнима, хорошо переносилась и не вызывала гибели животных [127]. Считаем, что модель, сочетающая ГЛ, АГ и угнетение процессов метаболизма – может использоваться для изучения патогенеза АС в целях улучшения его диагностики, профилактики и лечения. В ходе эксперимента, нами было установлено, что наиболее выраженные признаки повреждения артерий наблюдались через 6 месяцев воздействия на организм животного патогенных факторов (ГЛ, АГ и угнетения процессов метаболизма). К этому сроку также были выявлены более значительные отклонения и в исследуемых лабораторных тестах. В данной разделе диссертационной работы нами представлен анализ изучаемых показателей у крыс опытной группы (модель сочетания ГЛ, АГ и угнетения процессов метаболизма) и здоровых животных (контрольная группа) через 6 месяцев эксперимента. При оценке состояния артериального русла методом магниторезонансной томографии (МРТ) от 2 к 6 месяцу наблюдения отмечалось прогрессирующее сужение просвета внутренней сонной артерии (рисунок 28) и грудной части аорты, по сравнению с контрольными крысами (рисунок 29). Рисунок 28 – МРТ сосудов сонных артерий опытной крысы Рисунок 29 – МРТ сосудов сонных артерий контрольной крысы 162 У крыс опытной группы на 6 месяце эксперимента регистрировалось уменьшение ширины просвета подвздошных артерий, что свидетельствует о мультифокальности поражения артериального русла при комплексном действии факторов риска АС (таблица 30). Также в данной группе крыс определялось неравномерное контрастирование артерий, что предполагает локальные атерогенные изменения их стенок (таблица 30). Таблица 30 – Диаметр просвета артерий крыс, установленный методом МРТ Сосуды Диаметр просвета артерий опытных крыс 6 мес 1,14;(1,10 -1,19)мм 0,44(0,42-0,50)*мм 1,23(1,21-1,25)мм 0,44(0,42- 0,50)мм 1,51;(1,47-1,53) мм* 1,53(1,43-1,56)мм 0,74(0,71-0,75) мм* Диаметр просвета артерий контрольных крыс 6 мес 1,23(1,20-1,31)мм 0,77 (0,75-0,91) мм 1,30(1,27-1,32)мм 0,41(0,39-0,44)мм 1,86(1,80-1,93)мм 1,62(1,54-1,63)мм 0,93(0,90-0,99)мм Общая сонная Внутренняя сонная Плечеголовной ствол Мозговые артерии Гр. часть аорты Бр. часть аорты Общие подвздошные артерии Данные представленные в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей (LQ-UQ); * - достоверность между опытной и контрольной группой (р<0,05). Причем уже на 2-ом месяце исследования в аорте опытных крыс содержание NADPH-диафоразы было в 5,6 раз, а в бедренных артериях - в 4 раза ниже, по сравнению с контрольными крысами, со статистически значимым прогрессированием снижения показателей кофермента к 6 месяцу. В аорте опытных крыс NADPH-диафораза на 6 месяце эксперимента составляла 7,1 (5,4-10,2) ед. опт пл. (рисунок 30) против 60 (58-61) ед. опт пл. у контрольных животных (рисунок 31), в бедренных артериях (5,3 (3,1-7,4) ед. опт пл. (рисунок 32), против 29,0 (25,4-32,2) ед. опт пл. у контрольных животных (р<0,05) (рисунок 33). 163 Рисунок 30 – NADPH-диафораза в аорте опытной крысы, увеличение ×100 Рисунок 31 – NADPH-диафораза в аорте (контрольные крысы) увеличение×100 Рисунок 32 – NADPH-диафораза в бедр. арт. опытной крысы, увеличение×100 Рисунок 33 – NADPH-диафораза в бедр. арт. контрольной крысы, увеличение×100 С помощью гистологического анализа зарегистрированы структурные изменения аорты и бедренных артерий, наиболее выраженные к 6 месяцу воздействия факторов риска (ФР) АС на организм крыс – сужение просвета артерий, их морфологические изменения (нарушение архитектоники эластических волокон, смещение ядер миоцитов на периферию, клеточная инфильтрация стенки, утолщение эндотелия, отложение в стенке жировых включений) (рисунок 34; 36; 37), по сравнению с контролем (35; 38). 164 Рисунок 34 –Аорта опытной крысы, увеличение×100, (камераА×Cam MRc, Германия), окраска гематоксилин и эозин Рисунок 35 – Аорта здоровой крысы, увеличение×100, (камераА×Cam MRc, Германия), окраска гематоксилин и эозин Рисунок 36 – Аорта опытной крысы, окраска по методу Окамото (Судан IV), камера А×Cam MRc, Германия), увеличение×100(выявлены нарушение архитектоники эластических волокон и жировые включения (полости слева), окрашенные в фиолетовый цвет (справа) 165 Рисунок 37– Бедренная артерия опытной крысы, увеличение×400, камера А×Cam MRc, Германия, окраска гематоксилин и эозин Рисунок 38– Бедренная артерия контрольной крысы, увеличение×400, камера А×Cam MRc, Германия, окраска гематоксилин и эозин При длительном сочетанном воздействии ФР наблюдались уже на 2 месяце исследования признаки жировой дистрофии печени, с прогрессированием изменений к 6 месяцу. На рисунках 39; 40 – представлены жировые включения и выраженная клеточная инфильтрация в портальных трактах опытных крыс, на 6 месяце действия ФР АС на их организм, по сравнению с контрольными животными (рисунок 41). Рисунок 39 – Печень опытной крысы, увеличение×400, окраска Судан III, (камераА×CamMRc, Германия) 166 Рисунок 40. Печень опытной крысы, увеличение×400, камераА×CamMRc, Германия, окраска гематоксилин эозин Рисунок 41 – Печень здоровой крысы, увеличение×400, камераА×CamMRc, Германия, окраска гематоксилин эозин При оценке липидного спектра крови в динамике эксперимента у опытных крыс было установлено нарастание концентрации общего ХС, ЛПНП и КА (общий холестерин – ЛПВП/ЛПВП) по сравнению с контролем, с максимальными значениями перечисленных показателей на 6 месяце эксперимента (уровень общего ХС у опытных крыс на этом сроке действии ФР был в 3 раза, выше, ЛПНП – в 4 раза выше, а КА – в 3 раза выше значений контроля, определялась тенденция нарастания ЛПВП у опытных животных, р=0,08) (таблица 31). Выявленные изменения спектра липидограммы – 167 отражают выраженность воздействия факторов риска АС (ГЛ, АГ и угнетения процессов метаболизма) на организм животных. Таблица 31 – Состояние липидного спектра крови крыс на 6 месяце при моделировании атеросклероза Показатели липидного обмена Опытная группа крыс Здоровые крысы n=5 n=5 1 2 Общий ХС 6,1 2,2 ммоль/л (5,5-7,2) (1,9- 3,1) р1-p2,3,4<0,05 Триглицериды 0,7 0,46 ммоль/л (0,5-0,85) (0,4-0,7) ЛПВП 1,5 1,1 ммоль/л (1,42-1,9) (1,0 -1,5) р1-p4=0,08 ЛПНП ммоль/л 4,2 0,9 (3,8-5,4) (0,7- 1,4) р1-p2,3,4<0,05 КА 3,1 1,0 (2,7- 4,4) (0,9-1,2) р1-p2,3,4<0,05 Данные представленные в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей (LQ-UQ); р - достоверность различий между группами 1 и 2 При анализе содержания цитокинов в крови крыс было установлено увеличение уровня IL-1β, IFN-γ и IL-10 в опытной группе, с нарастанием изменений от 2 к 6 месяцу исследования. Через 6 месяцев у опытных крыс уровень IL-1β составлял 3,8 (4,0-4,4) пг/мл; IFN-γ - 16,3 (13,9-23,9) пг/мл, IL-10 - 8,7 (2,4-26,42) пг/мл, по сравнению с контрольными животными (0,5 (0,1-0,9) пг/мл, 1,9 (1,6-3,3) пг/мл, 5,62 (5,62-21,61) пг/мл, соответственно р<0,05), что указывает на стимуляцию системных (про-, и противовоспалительных) механизмов иммунного реагирования при действия ФР АС. Однако не было зарегистрировано статистически значимых различий уровня TNF-α между группами (0,27 (0,19-0,30) у опытных крыс, против 0,25 (0,18-0,28) - у здоровых крыс), что не подтверждает результаты Н.С. Юбицкой с соавт. (2009) о системном увеличении содержания TNF-α при ГЛ [159]. 168 При комплексной оценке удельного веса цитокинов в крови крыс было подтверждено значительное увеличение доли IL-1β, нарастание IFN-γ и снижение доли TNF-α и IL-10 в опытной группе животных (рисунок 42). Группа II (здоровые крысы) Группа I (опытная) 0% 20% 40% 60% 80% 100% удельный вес (%) цитокинов в крови крыс IL-1β % IFN-γ TNF-α IL-10 Рисунок 42 – Удельный вес (% соотношение) цитокинов в крови крыс на 6 месяце эксперимента Это указывает на усиление провоспалительной активности макрофагов, NK, NKT клеток и Th –лимфоцитов I типа и снижение функциональной активности Th-2 типа с оппозитными свойствами. При определении цитокинового профиля сосудистой стенки установлена зависимость их локальной продукции от морфологии сосудов. Определено, что в бедренных артериях контрольных крыс содержание TNF-α было в 2,5 раза ниже, а IL-10 почти в 10 раз ниже, чем в аорте (таблица 32). Таблица 32 – Содержание цитокинов в сосудах крыс на 6 месяце при экспериментальном атеросклерозе Цитокины (пг/мл) Опытная группа крыс Здоровые крысы Аорта Бедренные Аорта Бедренные артерии артерии 1 2 3 4 IL-1β 22,01 165,63 128,29 131,94 (21,94-30,83)•* (163,4-240,22) (114,22-337,15) (98,94-233,99) IFN-γ 286,89 1644,18 1269,91 1287,21 (208,46-495,55)•* (1424,1-1546,71)• (513,44-2189,69) (965,40-1321,78) TNF-α 76,59 416,82 117,18 46,11 (55,97-156,01)* (405,78-138,94)• (29,29-87,88)* (11,52-54,56) IL-10 23,98 15,33 47,73 4,86 (1,2-3,63) (18,51-29,07)• (7,65-30,84)• (40,62-257,68)* • - достоверность между опытной и контрольной группой (р<0,05). *– достоверность различий между показателями аорты и бедренных артерий (р<0,05). 169 Видимо, это обусловлено структурным различием сосудов (аорта – артерия эластического типа, тогда как бедренные артерии – мышечноэластического типа). Особенности морфологического строения, скорость кровотока в сосуде, вероятно, оказывают влияние на функциональную активность клеток продуцентов цитокинов. Зависимость особенностей функциональной активности сосудов от их морфологического строения показана разными исследователями [130, 179, 321, 358, 412]. В аорте крыс опытной группы на 2 месяце эксперимента было выявлено увеличение продукции цитокинов: IL-1β в 2,8, раз, TNF-α в 1,7 раз, IFN-γ в 2,2 раза, IL-10 в 3,6 раза, по сравнению с показателями контроля, однако уже на 4 месяце эксперимента содержание TNF-α и IL-10 не отличалось от референсных значений, а показатели IL-1β и IFN-γ были несколько ниже контрольного уровня (р=0,06-0,08). К 6 месяцу эксперимента содержание IL-1β в аорте уже было ниже контрольных значений в 5,5 раз, IFN-γ - в 4,4 раза, IL-10 - в 1,9 раз, (р<0,05), отличий TNF-α не определялось. По нашему мнению, это можно объяснить жировым пропитыванием сосуда, апоптозом клеточных элементов и функциональной инволюцией клеточной стенки в условиях длительного воздействия ФР АС (р<0,05). Выявленные изменения в аорте характеризуют конечную 3 стадию повреждения эндотелия - (истощения) [110]. В бедренных артериях крыс опытной группы на 2 месяце эксперимента регистрировалось увеличение значений исследуемых цитокинов, по сравнению с контрольными животными (IL-1β в 3,2 раза, TNF-α в 2,2 раза, IFN-γ - в 2,8 раз, IL-10 - в 2,4 раза), с постепенным снижением IL-1β, IFN-γ и нарастанием TNF-α и IL-10 к 6 месяцу исследования. Однако, через 6 месяцев действия на организм животных ФР АС – содержание IFN-γ, TNF-α, IL-10 все еще оставалось выше контрольных значений, но определялась нормализация значений IL-1β (р<0,05). При этом концентрация цитокинов в бедренных артериях опытных крыс к 6 месяцу эксперимента стала достоверно выше, чем в аорте (р<0,05). Повидимому, в бедренных артериях, в силу их морфологических особенностей, происходила более продолжительная реализация провоспалительной 170 активности лейкоцитов, эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудистой стенки в ответ на повреждение. При оценке удельного веса цитокинов в аорте опытных крыс к 6 месяцу эксперимента выявлено увеличение доли TNF-α и IL-10, уменьшение - IFN-γ и незначительное снижение содержания IL-1β (рисунок 43). Изменения удельного веса цитокинов в бедренных артериях опытных крыс повторяли их динамику в аорте – отмечалось нарастание доли TNF-α, при некотором снижении доли IFN-γ и IL-1β. Группа II (здоровые крысы) Группа I (опытная) 0% 20% 40% 60% 80% 100% Соотношение цитокинов в аорте крыс IL-1β % IFN-γ TNF-α IL-10 Рисунок 43 – Удельный вес (% соотношение) цитокинов в аорте крыс на 6 месяце эксперимента Удельный вес IL-10 практически не изменялся и составлял 0,7 %, против 0,3 % у здоровых крыс (рисунок 44). Группа II (здоровые крысы) Группа I (опытная) 0% 20% IL-1β % 40% IFN-γ TNF-α 60% 80% 100% IL-10 Рисунок 44 – Удельный вес (% соотношение) цитокинов в бедренных артериях крыс на 6 месяце эксперимента 171 По нашему мнению, это свидетельствует о том, что иммуноопосредованное повреждение артерий сначала реализуется за счет продукции IFN-γ и IL-1β, а затем опосредуется TNF-α, что согласуется с данными литературы [317, 455]. Из литературных источников следует, что продукция макрофагами TNF-α в очаге атероматоза более выражена, чем в крови [411]. Проведено исследование показателей оксидативной активности. В динамике всего эксперимента было выявлено, что значения ООА в крови опытных крыс превышали контрольные величины, без достоверной разницы показателя в периоде наблюдения - 2,4,6 месяцев (коэф. опт. пл. на 6 месяце исследования у опытных крыс был 0,61 (0,57-0,69) против 0,48 (0,32-0,50) у контрольных животных, р<0,05). При мониторинге показателей АОА статистически значимых отличий между опытной и контрольной группами животных не было зафиксировано (на 6 месяце эксперимента коэф. опт. пл. АОА у опытных крыс был 1,0 (0,92-1,1), против 0,91 (0,8-1,0) – у контрольных животных, р>0,05). К 6 месяцу действия ФР АС ОИ у опытных животных составлял 0,60 (0,44-0,67) против 0,52 (0,42-0,54) у здоровых крыс, р<0,05). Выявленные изменения указывают на системную активацию процессов ПО при действии ФР АС и отсутствие адекватного включения антиоксидантных компенсаторных механизмов. При этом не установлено достоверных различий показателей ООА, АОА и ОИ в динамике эксперимента (2,4, 6 месяцев). Исследованы показатели оксидативной активности в сосудах крыс. В процессе проведения сочетанного действия ФР АС нами зарегистрировано увеличение коэффициента ООА в аорте и бедренных артериях у опытных крыс на 2 месяце исследования (в 2,4 и 1,6 раз соответственно), с постепенным снижением к 6 месяцу. При этом установлено, что в аорте опытных животных показатели ООА на 6 месяце были ниже, чем у контрольных крыс (таблица 33). Таким образом, мы подтвердили данные R. Marfella с соавт. (2011) об увеличении активации окислительного стресса в сосудах крыс при гипотиреозе только в относительно раннем его периоде [311]. На 2 месяце действия ФР АС 172 нами было зарегистрировано статистически значимое увеличение значений АОА и тенденция снижения ОИ с сосудах крыс (р=0,02). Однако уже начиная с 4 месяца эксперимента, напротив, была зарегистрирована тенденция снижения АОА и нарастание ОИ, по сравнению с контрольными животными (р=0,070,08), с достоверностью различий исследуемых показателей к 6 месяцу наблюдения (таблица 33). Это указывает на неэффективность механизмов антиоксидантной защиты, направленных на протекцию повреждения эндотелиальных клеток сосудов. Таблица 33 – Содержание показателей ООА, АОА и ОИ в сосудах крыс на 6 месяце эксперимента Группы крыс ООА (коэф. опт.пл.) АОА (коэф. опт.пл.) ОИ (ООА/АОА) Аорта Бедренны Аорта Бедренны Аорта Бедренны е е е артерии артерии артерии Опытная 0,48 0,52 0,21 0,45 2,3 1,2 (0,16 (0,47(0,04(0,41-0,52) (1,8(1,10-1,16) 0,53)•* 0,54)• 0,3)*• 7,9)*• Контрольная 0,69 0,61 0,51 0,46 1,35 1,32 (0,62-0,73) (0,58-0,64) (0,46-0,54) (0,44-0,55) (1,3-1,4) (1,18-1,41) • - достоверность между опытной и контрольной группой (р<0,05). *– достоверность различий между показателями аорты и бедренных артерий (р<0,05). В биоптатах бедренных артерий опытных крыс нами не было зарегистрировано статистически значимых отличий показателей оксидативной активности на 2 и 4 месяце эксперимента, при они лишь незначительно были выше контрольного уровня (р=0,08-0,09). К 6 месяцу исследования было выявлено, что коэф. ООА также был ниже контрольного уровня р<0,05. Показатели АОА и ОИ не имели достоверных различий с группой контроля (р>0,05), что указывает на менее выраженное окислительное повреждение этих сосудов, по сравнению с аортой (таблица 33). Содержание металлопротеиназы-9 в крови крыс опытной группы было выше, чем у здоровых животных на 2 месяце эксперимента (16,7 (13,4-19,2) нг/мл, против 13,9 (10,3-32,8), р=0,04) нг/мл. Однако к 6 месяцу исследования 173 наблюдалось некоторое снижение значений ММР-9 до 8,7 (8,1-33,4) нг/мл, с достоверностью различий по сравнению со 2-ым месяцем исследования (р<0,05), при этом показатели желатиназы находились в пределах контрольного уровня. Зарегистрирована вариабельность локального содержания ММР-9 в зависимости от вида сосуда. В бедренных артериях здоровых крыс уровень ММР-9 был выше, чем в аорте (26,2 (21,4-40,5) нг/мл против 13,1 (6,31-20,1) нг/мл, р<0,05 (рис.), что, вероятно, объясняется преобладанием в бедренных артериях мышечных волокон и снижением отношения эластин/коллаген. Структурную и функциональную разнородность артерий у крыс показали также P. Basu с соавт. (2010) [179]. Авторы выявили различия в уровне кровотока и продукции ММР и TIMP-3 в аорте, в сонных и бедренных артериях животных, при этом более высокая продукция ММР-9 была ими зарегистрирована в сонных артериях, а увеличение значений TIMP-3 – в аорте. В нашем исследовании установлено увеличение показателей ММР-9 на 2 месяце исследования в аорте опытных крыс – в 2,6 раз, в бедренных артериях – в 3,8 раз, что согласуется с данными литературы о повышении локальной продукции ММР-9 при реноваскуляторной гипертензии и гипотиреозе у крыс [243, 311, 440]. На 4 месяце исследования уровень ММР-9 в исследуемых сосудах опытных животных не отличался от референсных показателей, тогда как к 6 месяцу эксперимента значения желатиназы ММР-9 в аорте были ниже контрольных в 1,9 раз, в бедренных артериях – в 1,6 раз, по сравнению с контролем (в А 6,9 (1,5-11,0) нг/мл, в бедренной артерии 16,6 (4,3-32,8) нг/мл, р<0,05). Вероятно, низкий уровень ММР-9, был связан с истощением ее продукции клетками артериальной стенки в условиях действия повреждающих факторов. Не исключено также подавление продукции желатиназы ее тканевыми ингибиторами TIMP [270], или опосредованной межклеточной ингибицией IL-10 или TGF-β1 [156, 331]. Нами была зарегистрирована обратная сильная связь между ММР и IL-10 (r=-0,78, р=0,05), что согласуется с данными литературы [331, 418]. Y.M. Zhang с соавт. (2005, 2006) констатировали 174 увеличение системной продукции TIMP-1 и соотношения TIMP-1/MMP-2 и TIMP-1/MMP-9 у стареющих крыс при развитии у них жирового гепатоза. Результаты нашего исследования выявили развитие выраженного жирового гепатоза у опытных крыс к 6 месяцу эксперимента. Уменьшение локального содержания ММР-9 может способствовать нарушению процессов ремоделирования артерий, снижению эластичности сосудистой стенки, склонности к развитию аневризмы и тромбоза. При проведении корреляционного анализа в крови здоровых крыс корреляций между показателями не было установлено У крыс I (опытной группы) выявлены взаимосвязи между: прямая сильная связь между ЛПНП и TNF-α (r=0,89, р=0,04) обратная сильная связь между КА и IL-10 (r= -0,9, р=0,03) прямая сильная связь между показателями АОА и уровнем NADPHдиафоразы в аорте опытных крыс (r=0,74 p<0,05), отражает зависимость активности NO-синтазы от окислительных процессов в ее стенке подавление прогрессирования повреждения кофермента в условиях действия на организм ФР АС в результате активации механизмов антиоксидантной системы Таким, образом, анализируя и обобщая результаты настоящего исследования, можно сделать следующие выводы: Разработана модель АС у крыс, сочетающая одновременное воздействие на организм животных факторов риска (ГЛ, АГ, снижение процессов метаболизма), морфологических что способствует изменений в возникновению артериальной стенке, выраженных максимально выраженных к 6 месяцу эксперимента (сужению просвета, нарушению архитектоники эластических волокон, смещению ядер миоцитов на периферию, клеточной инфильтрации, утолщению эндотелия сосуда, отложению жировых включений). 175 При экспериментальном АС отмечается изменение метаболических и иммунных показателей крови крыс - увеличение значений общего ХС, ЛПНП, КА, ООА и ОИ, уровня IL-1β, IFN-γ и IL-10, при относительном недостатке показателей АОА. При длительном воздействии на организм крыс факторов риска АС в аорте определяются более выраженные морфологические и функциональные изменения, по сравнению с бедренными артериями животных, что характеризует ранее и преимущественное повреждение данного сосуда. При длительном сочетанном действии факторов риска АС на организм крыс (6 месяцев) наблюдается угнетение константной NO-синтетической активности эндотелия аорты и бедренных артерий (снижение концентрации NADPH-диафоразы эндотелия) и нарушение процессов ремоделирования сосудов животных (снижение локального уровня ММP9). При экспериментальном АС у крыс зарегистрирована дихотомия системного и локального соотношения цитокинов (в крови – нарастание доли IL-1β, IFN-γ и снижение удельного веса TNF-α и IL-10; в аорте и бедренных артериях – противоположная динамика – нарастание доли TNF-α и IL-10 и снижение удельного веса IFN-γ и IL-1β), что свидетельствует о иммунокомпетентных том, клеток что воспалительная (преимущественно активность макрофагов) в артериальной стенке реализуется за счет продукции TNF-α. При сочетанном воздействии факторов риска АС к 6 месяцу эксперимента определяются разнонаправленные изменения локальной продукции цитокинов в зависимости от их морфологического строения (снижение уровня IL-1β, IFN-γ, TNF-α и IL-10 в аорте и высокое содержания IFN-γ, TNF-α и IL-10 в бедренных артериях), с однотипностью соотношения цитокинов между собой в данных сосудах. 176 3.4.1. Патогенетическое обоснование применения иммуномодулирующей терапии при экспериментальном атеросклерозе К настоящему времени получены подтверждения патогенетической связи между изменениями метаболизма липидов, нарушением в системе ПОЛ/АОС и иммуноопосредованным воспалением, являющимся одним из важнейших и неотъемлемых компонентов атерогенеза [17, 58, 75, 90]. В связи с этим эффективность профилактических и лечебных мероприятий на всех стадиях АС во многом связана с коррекцией дислипидемий, нормализацией оксидантного статуса и модуляцией воспалительного процесса в артериальной стенке. Основными препаратами, нормализующими липидный обмен на сегодняшний день, являются ингибиторы синтеза холестерина (статины), фибраты, производные никотиновой кислоты. Длительный прием этих препаратов замедляет прогрессирование АС, однако высокая стоимость лечения и побочные эффекты диктуют поиск новых средств, которые были способны воздействовать на основные звенья патогенеза заболевания [75]. Одним из возможных подходов здесь может явиться использование в комплексной терапии обладающих АС биокорректоров многокомпонентным гиполипидемического, противовоспалительного и действием, антиоксидантного, эффектов синтетических в целях средств, усиления иммуномодулирующего, основных препаратов, сокращения дозировки средств базовой терапии и снижения побочных влияний от их применения. В качестве средств патогенетической терапии, воздействующих на развитие воспалительных механизмов в артериальной стенке, мы применяли 2 препарата: официнальный – (амино-диоксо-тетра-гидро-фталазиндион натрия дигидрат) - синтетических «галавит», производства иммуномодуляторов): (группа ООО низкомолекулярных Альтфарм (Россия), регистрационный номер: 000088/03 и субстанцию, производства ТИБОХ ДВО 177 РАН - полисахаридный гликогеноподобный 1,4; 1,6-α-D-глюкан, выделенную из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus (митилан) [128, 144]. Противовоспалительные, антиоксидантные и гепатопротекторые эффекты галавита подробно описаны в литературе [103, 107]. Показано, что галавит регулирует синтез цитокинов макрофагами (IL1-β, IL-6, TNF-α и др.) и лимфоцитами (IL-2); стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов при исходном ее дефиците; дозозависимо влияет на синтез антител; нормализует пролиферативную функцию Т-лимфоцитов; стимулирует активность естественных клеток-киллеров при их недостаточности. Кроме того, у препарата не зафиксировано тератогенного и токсического действия [67]. Доказана эффективность галавита при эссенциальной артериальной гипертензии, одного из основных факторов риска развития АС [7]. Производство биогликанов из мидии является экологически безопасным процессом, не требующим дорогостоящего оборудования и материалов. Мидийный отвар, необходимый для производства митилана, является отходом производства рыбоперерабатывающей промышленности. Физико-химические и биологические свойства позволяют митилану оказывать УФ- и радиопротекторные эффекты и долгое время этот биоглюкан применялся в составе косметических кремов, выпускаемых рядом предприятий России [128]. В литературных источниках описаны гиполипидемические, иммуномодулирующие и противовоспалительные свойства митилана. Препарат обсолютно не токсичен и безопасен. В экспериментальных исследованиях показано, что преинкубация лимфоцитов с митиланом способствует подавлению апоптоза клеток и нормализует уровень продукции метаболитов NO [49]. При этом некоторые авторы в своих исследованиях продемонстрировали, что митилан способен стимулировать перитонеальные макрофаги мышей, увеличивать лизосомальную активность клеток и усиливать формирование активных форм кислорода в них, что предшествует и сопутствует процессу фагоцитоза макрофагами [144]. 178 Вышеперечисленные свойства галавита и митилана предопределили выбор их в качестве средств патогенетической экспериментальной терапии при сочетанном воздействии факторов риска АС (ГЛ, АГ и замедление процессов метаболизма) на организм крыс. Препараты применяли перед выведением животного из эксперимента. галавит (Гт) вводили в/м, в количестве – 1 мг на 1 кг веса, по схеме: 1 инъекция в день, в течение 10 дней, затем 1 инъекция в 3-е суток. Общий курс лечения крыс галавитом составлял – 15 инъекций. Митилан (Мт) вводили per os, в количестве – 10 мг/кг, через день, в течение 1 месяца. Установлено, что Гт и Мт восстанавливали концентрацию NADPHдиафоразы, как в аорте, так и в бедренных артериях (NADPH-диафораза в группе с Гт 47 (34-61) ед. опт пл.; с Мт 51 (38-65) ед. опт пл.; в группе без лечения (опытная) 27 (24-31) ед. опт пл., р<0,05). При этом не было установлено различий в содержания фермента в эндотелии и гладких миоцитах сосудов между группами Гт и Мт (р>0,05, рисунок 45; 46; 47;48) Рисунок 45 – NADPH-диафораза в аорте крысы группы с Гт, увеличение×100 При терапии (нормализация) как Гт, направления так Рисунок 46 – NADPH-диафораза в аорте крысы группы с Мт, увеличение×100 и волокон Мт наблюдалось стенки аорты восстановление и толщина ее эндотелиальной выстилки, уменьшилась клеточная инфильтрация, практически исчезли полости (жировые включения, рисунок 49; 50). 179 Рисунок 47 – NADPH-диафораза в бедр. арт. крысы группы с Гт увеличение×100 При применении Гт Рисунок 48 – NADPH-диафораза в бедр.арт. крысы группы с Мт, увеличение×100 определялись более выраженные признаки восстановления структуры бедренных артерий, тогда как при применении Мт сохранялось наличие жировых включений, увеличенная толщина и клеточная инфильтрация сосудистой стенки (рисунок 51; 52). Рисунок 49 – Аорта крысы с Гт, увеличение ×400, камера А×CamMRc, Германия, окраска гематоксилин и эозин. Рисунок 50 – Аорта крысы с Мт, увеличение×400, камера А×CamMRc, Германия, окраска - гематоксилин и эозин. Вероятно, процессы липидоза сосудов требуют большей концентрации Мт и/или времени его использования. Критерием выбора дозы Мт послужили данные В.И. Молчановой с соавт., которые описали в своем экспериментальном исследовании на мышах противовоспалительный эффект митилана в дозировке 5 и 10 мг/кг [128]. Однако по данным других авторов морские гидробионты 180 оказывают антиоксидантный и гиполипидемический эффекты в применении в течение 1 месяца, в средней дозировке 40-50 мг/кг [75]. Рисунок 51 – Бедр. арт. крысы с Гт, увеличение×400,Германия, камера А×CamMRc, окраска гематоксилин и эозин Рисунок 52 – Бедр. арт. крысы с Мт увеличение ×400, Германия, камера А×Cam MRc., окраска гематоксилин и эозин. .Установлено, что при применении Гт и Мт наблюдалось восстановление морфологической структуры печени, уменьшались размеры и количество жировых включений в портальных трактах (рисунок 53;54). Рисунок 53 – Печень крысы, пролеченной Гт, увеличение×400, (камераА×CamMRc, Германия) При оценке липидного Рисунок 54 – Печень крысы, пролеченной Мт, увеличение×400, (камераА×CamMRc, Германия) спектра крыс под влиянием иммуномодулирующей терапии (ИМТ), зафиксировано, что Гт и Мт нормализовали показатели липидограммы (р>0,05 с контрольной группой). При 181 применении Гт наблюдалось тенденция к более значительному снижению ЛПНП, по сравнению с группой крыс с Мт (р=0,06). Гт и Мт способствовали значительному снижению уровня IL-1β и IFN-γ в крови, по сравнению с опытной группой (р<0,05). Содержание IL-1β при лечении Гт и Мт нормализовалось, тогда как показатели IFN-γ - снизились в 2,3 раза, но все еще оставались выше значений здоровых крыс (р<0,05). Различий показателей цитокинов в крови между группами крыс с Гт и Мт не было установлено. При использовании Мт уровень IL-10 в крови стал в 4,3 раза выше, чем у опытных животных без лечения, в 6,2 раза выше, чем при терапии Гт, и в 16, 2 раза выше, чем у здоровых крыс (34,8 (22,35-106,78) пг/мл, против 8,68 (2,37-26,42) пг/мл, против 5,62 (5,62-21,61) пг/мл и против 2,14 (2,01-2,16) пг/мл, соответственно, р<0,05). Определены изменения соотношения цитокинов в крови крыс при назначении, иммуномодуляторов (ИМ) (рисунок 55). Зафиксировано, что при применении Мт и Гт удельный вес IL-1β значительно снижался (в группе крыс с Гт стал почти в 2 раза ниже, чем у опытных крыс, в группе с Мт – в 11,7 раз ниже, чем у крыс без лечения и в 6,1 раз ниже, чем у здоровых животных). Несколько разнонаправленный эффект ИМ реализовался в отношении содержания IFN-γ и TNF-α в крови крыс. здоровые крысы митилан галавит опытная гр. (без лечения) 0 20 IL-1β 40 IFN-γ 60 TNF-α 80 100 120 IL-10 Рисунок 55 – Влияние ИМ на удельный вес цитокинов в крови крыс Зарегистрировано, что при назначении Мт доля IFN-γ снизилась в 5,2 раза, по сравнению с опытной группой крыс, в 2,1 раз, по сравнению с 182 контролем, и в 3,8 раз, по сравнению с группой крыс с Гт. Изменений удельного веса TNF-α при лечении Мт не происходило. При терапии Гт, доля TNF-α увеличилась в 2,5 раз, по сравнению с группой крыс без лечения, снижался удельный вес IFN-γ и определялось нарастание доли IL-10. Таким образом, мы подтвердили данные Т.В. Латышевой с соавт. (2011) о том, что Гт регулирует системную продукцию TNF-α макрофагами, способствуя ее нормализации. При назначении обоих ИМ отмечалось нарастание удельного веса IL-10 (при Гт - в 1,8 раз, при Мт - в 2,9 раз) [67]. Проведен анализ действия ИМ на удельный вес цитокинов в артериях крыс. В аорте животных с лечением Мт наблюдалось увеличение доли IL-1β - в 2,4 раза, в группе с Гт - в 1,9 раз, по сравнению с опытной группой без лечения (рисунок 56), что можно связать с усилением биоглюканом функциональной активности макрофагов, что согласуется с данными литературы [128]. Нормализация доли IL-1β может приводить к восстановлению процессов клеточного ремоделирования, однако также может способствовать пролиферации макрофагов и пролонгированию хронического воспаления в артериальной стенке. Рисунок 56 – Влияние ИМ на удельный вес цитокинов в аорте крыс Галавит способствовал нормализации соотношения цитокинов в аорте снижению удельного веса TNF-α и нарастанию IFN-γ (рисунок 56). 183 Изменения удельного веса цитокинов в бедр. арт. при применении ИМ практически полностью соответствовали динамике его изменений в аорте крыс. Нами проанализировано влияние ИМ терапии на показатели оксидативной активности крови. В группе с Гт и Мт наблюдалось увеличение ООА в крови (коэф. опт. пл. (Гт) 0,90 (0,85-1,2), (Мт ) 0,73 (0,65-0,77) против 0,61 (0,57-0,69) – в опытной группе крыс, без лечения, р<0,05). При этом статистически значимых различий показателей ООА между группами Гт и Мт не было зарегистрировано (р>0,05). При применении ИМ терапии наблюдалось увеличение показателей АОА (коэф. опт. пл. у крыс (Гт 1,5 (1,1-1,7), Мт 1,7 (1,3-2,4) против 0,91 (0,9-1,0) – в опытной группе животных (без лечения), р<0,05, соответственно). Нами зарегистрировано снижение ОИ крови только в группе крыс с применением Мт (коэф. опт. пл. (Мт) 0,44 (0,41-0,56) против 0,60 (0,44-0,67) – в опытной группе крыс, без лечения, р<0,05), тогда как при применении Гт изменений ОИ крови не было установлено. Мы выявили особенности эффекта ИМ на оксидативную активность в сосудах крыс. При применении Гт в аорте крыс отмечалось нормализация показателей ООА и АОА и ОИ (увеличение значений ООА в 1,5 раза и АОА в 2,4 раза, и снижение ОИ в 1,5 раза соответственно), по сравнению с группой опытных животных (без лечения), р<0,05). Тогда как при терапии Мт, напротив, отмечалось снижение уровня ООА (в 1,4 раза, ниже, чем у опытных крыс без лечения, и в 2,8 раз ниже, чем в контроле, р<0,05), и нормализация коэффициента АОА и ОИ (увеличение значений АОА и снижение ОИ 1,9 раз) в аорте. В бедренных артериях при применении Мт определялось выраженное снижение показателей ООА – (в 2,8 раз ниже, чем в опытной группе без лечения и в 3,5 раз ниже, чем у здоровых крыс) и уменьшение значений ОИ (в 2,6 раз по сравнению с опытной группой (без лечения) и в 3,1 раз по сравнению с контрольными крысами (р<0,05). Галавит практически не изменял оксидативную активность в бедренных артериях крыс. 184 Нами проведена оценка содержания ММР-9 в зависимости от применения ИМ терапии. Зарегистрирована тенденция к увеличению MMP-9 в крови крыс с назначением Гт и Мт, по сравнению с опытной группой крыс (без лечения) и здоровыми животными (р=0,06-0,08). Мт увеличивал уровень ММР-9 в аорте крыс в 2,2 раза по сравнению с контролем (р<0,05), тогда как Гт не изменял ее содержание. В бедренных артериях изменений ММР-9 при использовании ИМ не отмечалось (р>0,05). У здоровых крыс в крови, аорте и бедренных артериях корреляций между показателями не было установлено При применении митилана определялись следующие корреляции показателей в крови крыс: ООА и уровнем общего холестерина (r=0,9 р=0,03) ООА и ЛПНП (r =0,9, р=0,03) IFN-γ и IL-1β (r = 0,86, р=0,05) IFN-γ и TNF-α (r = 0,94, р=0,01) IL-1β и TNF-α (r = 0,91, р=0,02) IL-1β и КА (r = 0, 89, р=0,04) В аорте крыс с применением митилана корреляций между показателями не установлено В бедренных артериях крыс с применением митилана установлена корреляция показателей между IL-1β и IL-10 (r = 0,9, р=0,03) В крови крыс с применением галавита выявлены корреляции между показателями: ООА и ЛПВП (r = 0,75, р=0,05) ООА и IL-1β (r = -0,84, р=0,03) АОА и TNF-α (r = -0,73, р=0,05) IFN-γ и IL-1β (r = 0,78, р=0,05) IL-10 и ММР (r = -0,89, р=0,01) IL-10 и общим ХС (r = -0,75, р=0,05) 185 IL-10 и ЛПВП (r = -0,95, р=0,03) ММР-9 и ЛПВП (r = 0,97, р=0,004) В аорте крыс с применением галавита выявлены корреляции между показателями: АОА и TNF-α (r = -0,77, р=0,04) IFN-γ и IL-10 (r = 0,84, р=0,04) TNF-α и ММР-9 (r =9, р=0,03) В бедренных артериях крыс с применением галавита корреляций между показателями не выявлено Таким образом, проведенный анализ эффективности ИМ терапии у крыс в модели экспериментального АС, сочетающей комбинацию воздействия на организм животных ФР заболевания (ГЛ, АГ и угнетение процессов метаболизма) позволил сделать следующие выводы: При применении ИМ в терапии экспериментального АС наблюдается структурная репарация артериальной стенки, нормализуется ее функциональная активность (восстанавливается концентрация NADPHдиафоразы), нивелируется локальный и системный цитокиновый дисбаланс (нормализуются показатели TNF-α, IFN-γ, уровень IL-1β и его удельная доля, увеличивается продукция IL-10 в крови). ГЛ и МЛ нормализуют липидный спектр крови. При этом применении Гт наблюдается выраженное снижение ЛПНП в крови, по сравнению с Мт Назначение ИМ при экспериментальном АС у крыс ООА и АОА и уменьшают жировую дистрофию печени. Выявлены особенности действия ИМ на продукцию и удельный вес цитокинов в крови и артериальной стенке (Гт локально и системно нормализует удельный вес TNF-α (увеличивая его в крови, и снижая в аорте и бедренных артериях), Мт снижает удельный вес IFN-γ, увеличивает уровень и процентное содержание IL-10 в крови крыс. 186 Мт обладает преимущественным локальным и системным антиоксидантным эффектом, нормализует содержание ММР в аорте (увеличивая ее локальную продукцию). Публикации: 1. Турмова, Е.П. Мониторинг содержания цитокинов и липидного спектра при экспериментальной гиперлипидемии / Е.П. Турмова, А.А. Григорюк, П.А. Лукьянов, И.Г. Агафонова, А.В. Цыбульский // Сиб. мед. журнал. – 2011. – № 4. – С. 59–62. 2. Турмова, Е.П. (экспериментальное Оксидантный исследование) статус / Е.П. и дисфункция Турмова, эндотелия Е.А. Бычков, А.А. Григорюк, П.А. Лукьянов, Е.А. Чагина // Вест. новых мед. технологий. – 2011. – № 2. – С. 496– 498. 3. Турмова, Е. П. Роль нарушений цитокинового статуса и общей антиоксидантной активности в развитии эндотелиальной дисфункции при экспериментальной гиперлипидемии [Электронный ресурс] / Е.П. Турмова, П.А. Лукьянов, А.А. Григорюк, Е.А. Бычков / Фундаментальная наука в медицине: мат. VI Научно- практ. конф. – Владивосток, 2011 – С. 80-88.– Режим доступа: http://www.piboc.dvo.ru/conf/Basic_Science_for_Medicine_2011_ Vladivostok.pdf 4. Способ моделирования атеросклероза»: пат. 2500041, Российская Федерация; мпк: G09B; G09B23/28 / Григорюк А.В., Турмова E.П., Маркелова Е.В.,; заявитель и патентообладатель Владив. гос. мед.ун-т; заяв. 20.12.2012; опубл. Бюл. № 33. –С. 1–23. 5. Турмова, Е. П. Влияние 1,6-D-глюкана из дальневосточной мидии «Crenomytilus Grayanus» (Митилана) на липидный спектр и цитокиновый профиль сыворотки крови при экспериментальном атеросклерозе / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, В.Е. Красников, Бычков Е.А., Лукьянов П.А. Чикаловец И.В., Григорюк А.А. 2012.– № 11. – С. 46–50. // Фундаментальные исследования. – 187 6. Турмова, Е. П. Изучение применения иммуномодулятора «Галавит» при экспериментальном атеросклерозе / Е.П. Турмова, А.А. Григорюк, Е.А. Бычков , Е.В. Маркелова, И.В. Чикаловец // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – 2012. – № 3 (85) – С. 323–326. 7. Турмова, Е.П. К вопросу о влиянии биоглюкана из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus экспериментальном (Митилана) атеросклерозе на / цитокиновый Е.П. Турмова, профиль Е.В. при Маркелова, В.Е. Красников, Е.А. Бычков, П.А. Лукьянов, И.В. Чикаловец //Рос. аллергол. журнал. – 2012. – № 5 (вып.1).– С. 260-261. 8. Турмова, Е.П. Мониторинг показателей структурно-функционального повреждения сосудов при экспериментальном атеросклерозе / Е.П. Турмова, А.А. Григорюк, Е.В. Маркелова, Е.А. Коцюрбий, О.Б. Щедрина, И.Г. Агафонова, В.Е. Красников, Н.К. Пашко // Вестн. новых мед. технологий. – 2012. – Т. 19, № 2. – С. 276–279. 9. Турмова, Е.П. экспериментальной Развитие гиперлипидемии эндотелиальной / Е.П. дисфункции Турмова, П.А., при Лукьянов, А.А. Григорюк, Е.А. Бычков, А.В. Цыбульский // Тихоокеан. мед. журнал. – 2012. – № 1. – С.97–100. 10. Здор, В.В. Изменения уровня цитокинов и морфологических параметров под влиянием эндокринных и метаболических нарушений в организме крыс в эксперименте / В.В. Здор, Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, Я.Н. Тихонов, А.А. Григорюк // Рос. аллергол. журнал. –2013. – № 2. – С. 108-109. 188 Заключение Атеросклероз является проблемой современности по причине высокого процента смертности от его осложнений, утраты трудоспособности и ухудшения качества жизни людей [14]. По данным международного регистра REACH, атеросклеротическое поражение коронарных артерий, проявляющееся клиникой ИБС, встречается в 60 % среди всех клинических случаев заболевания, тогда как на долю диагностированного мультифокального АС приходится около 20%. При этом, приблизительно у 1/4 пациентов с ИБС, у 2/5 пациентов с АС церебральных артерий и 3/5 пациентов с ОАНК имеется поражение сосудов нескольких артериальных бассейнов [72]. В связи с этим пациенты с ОАНК имеют очень высокую вероятность системного поражения артерий и высокий риск сердечно-сосудистых осложнений. Согласно воспалительной теории АС, основой его развития является иммуноопосредованное повреждение артерий с аутоиммунным компонентом [10, 297, 384, 395, 432]. Провоспалительные цитокины, вырабатываемые в основном активированными лейкоцитами и клетками артериальной стенки, в результате воздействия на организм различных патогенных ФР, запускают и опосредуют течение воспалительного процесса в сосуде [222]. Нарушение цитокиновой регуляции приводит: к повышению адгезивности эндотелия, пролонгированию и усилению процессов перекисного окисления липидов, нарушению синтеза оксида азота, и механизмов ремоделирования сосудистой стенки, итогом этого является прогрессирование заболевания и развитие сосудистых катастроф [229]. Однако, в литературе нет единого мнения в отношении роли некоторых про- и противовоспалительных цитокинов в патогенезе АС. Остаются не до конца решенными вопросы их взаимодействия с показателями, липидного метаболизма, оксидативной активности и с маркерами деградации межклеточного матрикса при различной локализации и степени активности атеросклеротического процесса. 189 Атеросклеротическое поражение возникает преимущественно в одном сосудистом регионе, и проявляется соответствующими клиническими симптомами. В последующем, область первоначального повреждения служит местом развития фатальных осложнений. После перенесенного ИМ риск развития повторного его возникновения увеличивается в 5-7 раз, а в случае нарушения мозгового кровообращения – в 9 раз. Из данных литературы следует, что эндотелиальная выстилка не одинакова в различных регионах сосудистого русла [130, 179, 321, 358, 412]. Выделяют несколько возможных причин ее неоднородности: наличие генетически детерминированных особенностей строения (атеросклеротические наложения возникают в так называемых реснитчатых участках эндотелия (primary cilia) и неодинаковое воздействие гемодинамического удара крови на сосудистую стенку в разных участках артерий (Shear stress) [72]. При этом, недостаточно исследований посвящено изучению и сравнению продукции NO, про- и противовоспалительных цитокинов и ферментов деградации межклеточного матрикса в различных сосудистых регионах в патогенезе АС. С учетом цели и поставленных задач, исследование состояло из 2 разделов – клинического и экспериментального. I. Клинический раздел включал комплексный сравнительный анализ содержания цитокинов: IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-17, IL-10, TGF-β1, TGF-β2, растворимых рецепторов к цитокинам: IL-2R, IL-6 R, TNF-αRI, TNFαRII, оценку полиморфизма генов: TNF-α (rs1800629), IL-6 (rs1800795), IL-10 (rs1800896) и PTPN22 (rs2476601), установление значения изменений показателей деградации межклеточного матрикса: MMP-9, MMP-9/TIMP-1, MMP-9/TIMP-2, TIMP-1 и гормонов жировой ткани (лептина и адипонектина) в сыворотке крови у 260 пациентов с АС. Определялись корреляционные взаимосвязи между исследуемыми показателями. Оценивалось взаимодействие цитокиновой регуляции с содержанием: общего холестерина крови; металлопротеиназы-9; тканевого ингибитора ММР-9 - TIMP 1 типа; комплексов ММР-9 с TIMP 1 и 2; лептина и адипонектина в зависимости от его 190 локализации и клинических проявлений АС. Для этого пациенты были разделены на 2 основные группы: 1) Пациенты с атеросклерозом коронарных артерий и выраженным клиническим течением ИБС, при отсутствии других диагностируемых проявлений атеросклероза -140 человек. 2) Пациенты с выраженной клинической картиной ОАНК - 120 человек. Группой сопоставимых контроля по служили полу, без 50 здоровых клинических доноров, проявлений (30-50 лет), артериальной недостаточности, острых и хронических заболеваний в фазе обострения, не курящих, не употребляющих каких-либо лекарственных препаратов, не злоупотребляющих алкоголем. Из проведенного нами обзора литературы следует, что цитокины, являясь молекулами межклеточного взаимодействия, опосредованно принимают участие в регуляции большинства биохимических процессов в организме, имеющих большое значение в атерогенезе: обмене холестерина, образовании и инактивации кислородных радикалов, реакциях ремоделирования сосудистой стенки с участием металлопротеиназ. Чтобы оценить патогенетическое регуляторное влияние цитокинов у пациентов при АС, было проанализировано их содержание в сыворотке крови. При определении уровня провоспалительных цитокинов было зафиксировано достоверное увеличение значений IL-6 в общей группе пациентов с АС. Тем самым, мы подтвердили результаты многих исследователей об участии этого цитокина в атерогенном повреждении сосудов и поддержании хронического воспаления в артериальной стенке [101, 278, 367]. Однако мы не обнаружили увеличения содержания IL-6R и корреляционной связи с его лигандом, что, по нашему мнению, может затруднять проявление провоспалительной активности IL-6, которая реализуется посредством транс-сигналинга – связью IL-6-IL-6R со вторичным протеином gp130 на мембране клеток мишеней [89, 372]. Отсутствие статистически значимых изменений других провоспалительных цитокинов: IL-1β, TNF-α и IFN-γ в общей группе пациентов с АС можно объяснить несколькими 191 механизмами: снижением функциональной активности клеток-продуцентов цитокинов, конкурентным противовоспалительными компенсаторным цитокинами в условиях ингибированием длительной системной циркуляторной гипоксии и метаболического ацидоза, превалированием локальной секреции, приемом статинов пациентами [210, 322, 353]. Выявленное повышение уровня растворимых рецепторов к TNF-α (TNF-αRI и TNF-αRII) у пациентов с АС представляет собой механизм компенсации, проявляющийся в связывании TNF-α его рецепторами с последующим угнетением биологической активности цитокина, что согласуется с данными литературы [89]. При этом нами была обнаружена корреляция TNF-α только с его растворимым рецептором TNF-αRII (r=0,42, p=0,03). Известно, что TNF-αRII связан с TNF-α в течение короткого промежутка времени, затем происходит разрушение комплекса лиганд-рецептор, с дальнейшим предоставлением места для связывания TNF-αRI [47]. Активация взаимодействия растворимых рецепторов TNF-α у пациентов с АС проявляется в установленной нами прямой сильной корреляции между TNF-αRI и TNF-αRII (r=0,82, p=0,001), тогда как в группе здоровых доноров не было выявлено взаимосвязи между показателями. Однако, существуют противоположные мнения в отношении увеличения уровня TNF-α RI. По результатам M.Valgimigli (2001) и C. Duerrschmid с соавт. (2013) TNF-α RI является сильным предиктором развития СН и летальности и при ИБС из-за развития ангиотензин-II опосредованного кардиальный фиброза, реализуемого при участии TNF-αRI [214, 256]. При анализе содержания иммунорегуляторных цитокинов у пациентов с АС, выявлено, что уровень IL-2 был в 3 раза ниже, чем у здоровых доноров. Причинами снижения уровня IL-2 может являться сопутствующая атеросклерозу циркуляторная гипоксия, а также, ингибирующий эффект статинов, принимаемых пациентами [461]. По данным литературы – снижение IL-2 способствует развитию функционального иммунодефицита по клеточному типу и нарушению адекватного контроля иммунного ответа T-регуляторными клетками [142]. При этом выявлено статистически значимое увеличение значений растворимого рецептора к IL-2 (IL- 192 2R), за счет которого цитокин реализует свое действие на мембране клеток мишеней. Это можно охарактеризовать как компенсаторный механизм – реакцию на недостаточность выработки IL-2. Высокий уровень растворимого рецептора к IL-2 является предиктором аутоиммунных и воспалительных процессов в организме [66]. Наши исследования позволили установить достоверную среднюю корреляцию (r=0,30, p=0,005) между цитокином и его рецептором. При исследовании уровня IL-17 в общей группе пациентов с АС не установлено его достоверных отличий от референсных показателей. Это может свидетельствовать о компенсаторном угнетении функции Th-17 – выработки ими IL-17 в условиях хронической циркуляторной гипоксии, и относительной недостаточности IL-2, поскольку по данным литературы известно, что повышение содержания цитокина способствует проявлению его проатерогенных свойств – усилению продукции макрофагами цитокинов: IL-1β, IL-6, IFN-γ, IL-12p40, активации апоптоза кардиомиоцитов, индукции хемокинов, усилению адгезии проникновения моноцитов и нейтрофилов в артериальную стенку [198, 200, 339, 420]. Однако отсутствие увеличения содержание цитокина при АС может указывать и на вторичную анергию Th 17. По данным Н.М. Калининой c соавт. (2008), S.Taleb с соавт. (2010) – IL-17 стимулирует выработку противовоспалительных медиаторов: IL-10 и IL-1RА [39, 401]. Ограничению продукции IL-17, вероятно, может способствовать нарушение рецепции IL-6, как одного из активаторов Th-17 [198, 459]. При оценке содержания цитокинов противовоспалительного профиля у пациентов с АС, выявлен низкий уровень IL-10 и увеличение уровня TGF β2. Снижение продукции IL-10 - отражает угнетение активности T-регуляторных клеток (CD4+, CD25+, Fox3) в условиях гипоксии и относительного дефицита IL-2 при АС, что согласуется с данными литературы [9, 62]. Мы не подтвердили результаты других авторов о повышении TGFβ1 при АС [128, 213, 431], однако выявили своеобразную особенность изменения реагирования TGFβ1 и TGFβ2 при этом заболевании. Согласно результатам исследования J.S. Holifield с соавт. (2004), эффект стимуляции ангиогенеза, 193 реализуемый TGFβ2 осуществляется им только совместно с TGFβ1 [256]. Выявленная нами средняя прямая корреляция (r=0,40, p=0,002), между изоформами TGFβ1 и TGFβ2 явилась подтверждением их взаимодействия между собой. Согласно данным литературы TGFβ - опосредованно оказывает противоатерогенное действие, через угнетение выработки провоспалительных цитокинов [39, 213]. Исходя из этого увеличение уровня TGFβ2, как кофактора TGFβ1 можно охарактеризовать как защитный механизм, препятствующий атеросклеротическому повреждению стенки сосудов, снижению воспаления и способствующий увеличению содержания коллагена и стабилизации атеромы, что согласуется с результатами других исследователей, выявивших эти протективные свойства у TGFβ1 [156, 213, 310, 416]. Однако, некоторые авторы, напротив, расценивают увеличение уровня TGFβ1 в качестве предиктора усиления ишемии миокарда, нарушения процессов ремоделирования и развития фиброза сосудов [56, 128, 431] и стимуляции выработки IL-17 Th-17лимфоцитами [198]. С целью уточнения изменений цитокинового профиля сыворотки крови при АС нами проведен анализ содержания провоспалительных, иммунорегуляторных и противовоспалительных цитокинов в % от общей суммы их значений. В результате данного анализа установлено, что провоспалительная активность при АС заключалась в увеличении удельного веса IL-1β (в 1,9 раз) и IL-6 (в 1,6 раз), тогда как доля TNF-α и IFN-γ несколько снижалась (в 1,4 и в 1,2 раза, соответственно). Изменения удельного веса иммунорегуляторных цитокинов заключались в снижении доли IL-2 (в 2,7 раз) и незначительном увеличении удельного веса IL-17 (в 1,5 раза). Нарушение противовоспалительной активности у пациентов с АС выражалось низким удельным весом IL-10 (в 3,2 раз ниже, чем у здоровых доноров), доля TGFβ1 и TGFβ2 была выше показателей контроля незначительно – в 1,3 и в 1,2, соответственно. Исследование удельного веса цитокинов косвенно позволило судить об активации преимущественно врожденных механизмов иммунитета - (вовлеченности в воспалительный процесс макрофагов (увеличение доли IL-1β) и нейтрофилов (увеличение доли IL-6 и IL-17). О нарушении адаптивного иммунитета у пациентов с 194 АС свидетельствует уменьшение удельного веса IL-2, некоторое снижение IFN-γ. Угнетение противовоспалительных механизмов реактивности и адекватного функционирования Т-регуляторных клеток подтвердил низкий удельный вес IL-10 и снижение отношения IL-10/IFN-γ - в общей группе пациентов с АС, оно составило 1,02 (0,7-3,0), тогда как у здоровых доноров – 4,6 (3,4-26,7). Полиморфизм в промоторных участках генов цитокинов обеспечивает разнообразие индивидов по степени продукции их в артериальной стенке в ответ на действие различных патогенных агентов [54, 128], тем самым, может влиять на течение воспалительного процесса и развитие атеросклеротического повреждения. Данными многочисленных исследований доказана сопряженность полиморфизма генов цитокинов с нарушениями липидного обмена и тромбообразования [291, 323, 345, 369, 446]. При проведении анализа полиморфизма исследуемых генов как у пациентов с АС, так и у здоровых доноров выявлено, что доминантными аллелями являлись: С аллель гена TGFβ1 (-509 C/T), G аллель гена TNFα (308G/A), C-аллель гена IL-6 (-174G/C), А аллель гена IL-10 (-1082 G/A). Для гена PTPN22 (G/A) – доминантной была G аллель. Результаты нашего исследователя подтверждают данные M. Baddela с соавт. (2012). Авторы показали увеличение частоты А аллели гена IL-10 (-1082 G/A), C-аллели гена IL-6 (-174G/C), и G аллели гена TNF-α (-308G/A) у пациентов с АКА [176]. Выявленное нами превалирование С аллели гена IL-6 (-174G/C) в группах пациентов с АС и здоровых людей согласуется с данными многих авторов [132, 176, 313, 357, 378] и противоречит результатам M.Weger с соавт. (2005), отметивших низкую частоту С-аллели при АС [264]. Нами выявлено увеличение частоты встречаемости гомозиготного варианта Т аллели гена TGFB1 rs1800469 (-509 C/T) у пациентов с АС по сравнению с контролем, р (χ2)=0,007. Не определено статистически значимых отличий в полиморфизме гена IL-10 (-1082 G/A) по сравнению с группой здоровых, что согласуется с результатами J. Erdmann (2009), S. Kathiresan (2009), N. Samani (2009), которые в своих исследованиях также не установили 195 ассоциации полиморфизма гена IL-10 с риском ИБС [221, 277, 366]. Данные нашего исследования не подтвердили результаты других авторов о том, что поражение АС выше среди гомозигот - 1082 A/A [176, 272] и -1082 G/G гена IL-10 [272, 251]. Присутствие гомозиготных и гетерозиготных вариантов гена IL-10 (1082G/А) у обследованных нами пациентов с АС было практически одинаковым. M. Baddela с соавт. (2012), в своем исследовании показали, что - AA и GA варианты гена TNF-α (–308G/A) ассоциированы с АС [176]. Мы не выявили увеличения частоты G/A генотипа TNFα (-308G/A) у пациентов с АС, однако зафиксировали, что A/А вариант определялся только при АС и отсутствовал у здоровых доноров. Не установлено зависимости уровня интерлейкинов в сыворотке крови от полиморфизма кодирующих их генов среди представителей здоровых доноров. При этом определено, что при АС носители гомозиготных G и C аллелей гена IL6 (-174G/C), имели значения интерлейкина-6 – достоверно выше, чем носители гетерозиготного варианта гена. В этом наши данные согласуются с результатами Y. Liu с соавт. (2006), которые показали ассоциацию C/С варианта гена IL-6 (-174G/C) с высоким уровнем IL-6 в сыворотке крови [302], но противоречат результатам M. Weger (2005), связавшего этот генотип с низкой экспрессией IL-6 [435], а также результатам M.P. Sie и F.A. SayedTabatabaei (2006), не установивших ассоциации C/С генотипа с уровнем цитокина [381]. Ген PTPN22 ответственен за адекватное функционирование Т-регуляторных CD4+CD25+-клеток, принимающих непосредственное участие в контроле воспаления, обеспечении иммунологической толерантности и протекции аутоагрессии против собственных тканей [365]. Полиморфизм гена PTPN22 ассоциирован с аутоиммунными заболеваниями (АЗ): сахарным диабетом 1 типа, ревматоидным артритом, аутоиммунным тиреоидитом, системной красной волчанкой, миастенией Гравис и др. [95, 240, 268, 346] в том числе и с АС [365]. В настоящее время активно изучается полиморфизм гена 196 PTPN22 rs 2476601 – его С/T аллели, при этом в большинстве исследований риск аутоиммунной патологии связан с его Т-вариантом. Однако, некоторыми авторами не установлено связи полиморфизма гена PTPN22 с развитием кардиоваскулярной патологии [342]. В литературе практически отсутствует информация по полиморфизму A/G аллели гена PTPN22 rs 2476601 в патогенезе аутоиммунных заболеваний и АС. С этих позиций мы проанализировали полиморфизм гена PTPN22 rs 2476601 и выявили, что у пациентов с АС и у здоровых доноров отмечалось увеличение частоты встречаемости гомозиготного G аллеля гена PTPN22 rs 2476601 (G/A). Однако А/А генотип был выявлен только при АС в 1,1% случаев. С целью оценки регуляторного влияния гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) на функциональную активность Т-клеток в патогенезе АС нами был проанализирован уровень цитокинов и растворимых рецепторов и произведен расчет отношения показателей между собой в зависимости от принадлежности их к определенному варианту гена. Было зарегистрировано, что у носителей гетерозиготного G/A варианта гена в сыворотке крови, как у здоровых доноров, так и у пациентов с АС определялся более высокий уровень IL-2, чем у носителей его гомозиготного G/G варианта (в 4 и 2,4 раза выше, соответственно). Таким образом, результаты нашего исследования указывают на регуляторное активирующее влияние гетерозиготного G/A варианта гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) на продукцию IL-2. В группе здоровых доноров мы не зарегистрировали ассоциации полиморфизма гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) с уровнем цитокинов: IFN-γ, IL-1β, IL-6, TNF-α, TGFβ1, TGFβ2, IL-10, IL-17 и растворимых рецепторов к цитокинам: TNF-αRI, TNF-αRII, IL-6R, IL-2R. Однако, определено, что у пациентов с АС – носителей гетерозиготного G/A варианта гена, системный уровень IFN-γ был статистически значимо выше (в 2,4 раза), чем у имеющих гомозиготный G/G вариант гена PTPN22 rs 2476601 (G/A), р<0,05. 197 Для нормального состояния межклеточного матрикса необходимо равновесие между активностью матриксной металлопротеиназы - 9 и ее ингибиторов (TIMP-1 и TIMP-2) [209, 235, 439, 450]. Большинство авторов связывают высокий уровень ММP-9, ее тканевого ингибитора – TIMP-1, комплекса ММP-9/TIMP-1 с летальностью от сердечно-сосудистой патологии по причине формирования нестабильности атеросклеротической бляшки [20, 28, 55, 69, 137, 217, 341]. Другие исследователи не относят ММР-9 и TIMP-1 к значимым ФР острого коронарного синдрома, ИМ и смертности [195, 266, 328], или описывают противовоспалительные свойства ММР-9, заключающиеся в активации TGF-β и рецептора к IL-1 [131, 300]. Принимая во внимание противоречивость мнений о роли и о регуляции продукции ММР-9 и ее ингибиторов при АС, как воспалительном заболевании, мы провели системный анализ этих показателей в ходе настоящего исследования. У пациентов с АС уровень MMP-9 был несколько выше значений здоровых доноров, однако статистически значимости различий не было установлено (р>0,05). Полученные результаты можно соотнести с ограничением экспрессии генов MMP-9 в гипоксических условиях [38], ингибированием уровня ММР-9 статинами [283], с активацией процессов связывания ММР-9 ее тканевыми ингибиторами 1 и 2 типа [246]. Зафиксирована тенденция увеличения TIMP-1 (р=0,06), тогда как содержание комплекса ММР-9/TIMP1 у пациентов с АС практически не отличалось от референсных показателей. Содержание комплекса ММР-9/TIMP-2 было выше значений здоровых доноров в 11,5 раз. Однако известно, что увеличение уровня TIMP2 способствует также его связыванию с коллагенолитической протеиназой – МТ1-ММР (ММР-14) и усилению желатинолитической активности pro-ММP-2 [247]. Нами установлены корреляционные связи в системе ММР-9: слабая прямая – между ММР-9 и TIMP-1 (r=0,23, р=0,01); средняя прямая – между ММР-9 и ММР-9/TIMP-1 (r=0,48,р=0,0001), средняя прямая – между ММР-9 и ММР-9/TIMP-2 (r=0,32,р=0,003); средняя прямая – между ММР-9/TIMP-1 и TIMP-1 (r=0,34, р=0,003). Корреляцию между ММР-9 и TIMP-1 у пациентов с ИМ на фоне АС также подтвердили в своем исследовании J. Tan с соавт. (2008) 198 [403], тогда как E. Elmas с соавт. (2007) не выявили связи между ММР-9 и TIMP-1, но выявили прямую корреляцию между ММР-9 и комплексом ММР9/TIMP-1 и обратную между ММР-9/TIMP-1 и TIMP-1 при ИМ [218]. При этом у здоровых доноров нами была выявлена сильная прямая корреляция между ММР-9 и ММР-9/TIMP-2 (r=0,94, р=0,05), тогда как между другими показателями системы ММР-9 в данной группе связей не было установлено. Это указывает на более высокую связывающую активность TIMP2, по сравнению с TIMP-1 даже при отсутствии воспалительных изменений и клинических проявлений АС. По данным литературы известно, что экспрессия TIMP-2, ингибитора ММР-2 и ММР-9 относительно костуитивна, в отличие от TIMP-1, продукция которого зависит от многочисленных внешних стимулов (форболовые эфиры, ростовые факторы, цитокины) [69]. Большое значение в патогенезе АС придают гормонам жировой ткани (лептину и адипонектину) [147, 279]. Однако в литературе нет однозначного представления о роли гормонов жировой ткани при различных клинических проявлениях АС. Действие лептина проявляется на уровне гипоталамуса, где он связывается с рецепторами и вызывает активацию сигналов, тормозящих прием пищи и повышающих расход энергии [442]. Одни авторы отводят лептину сугубо проатерогенную роль [242, 294, 368], другие отмечают у него косвенные атеропротективные свойства, благодаря регуляции энергетического и липидного обменных процессов, снижению инсулинорезистентности [64, 201]. Неоднозначность суждений высказывается и о роли адипонектина в патогенезе АС – комплемент-подобного протеина, секретирующегося в белой жировой ткани и участвующего в регуляции энергетического гомеостаза организма. Многочисленные исследования показывают, что адипонектин повышает действие инсулина в скелетной мышце и печеночной ткани, приводит к снижению уровня глюкозы в крови, ингибирует поступление жирных кислот в печень и стимулирует их окисление путем активации протеинкиназы [257, 282, 288, 359]. Но до настоящего времени нет четкого представления о взаимосвязях лептина и адипонектина с системой ММР-9, показателями общего ХС и цитокинами. 199 В проведенном нами исследовании, установлено снижение уровня адипонектина в сыворотке крови пациентов с АС (р=0,001). Выявленные изменения согласуются с данными литературы [288, 359]. Снижение уровня адипонектина может отражать ингибирование его антиатерогенных эффектов, поскольку известно, что этот гормон подавляет связывание моноцитов с клетками эндотелия, экспрессию молекул адгезии VCAM-1, ICAM-1, Еселектина, MCP-1 [64], угнетает секрецию лейкоцитами IL-6; TNF-α, способствует снижению поглощения макрофагами измененных липопротеинов, препятствуя их накоплению в стенке сосудов [258, 299]. Некоторыми авторы выявили обратные корреляционные связи этого гормона с уровнем ТГ и прямые с ЛПВП [164, 458]. Нами установлено, что показатели лептина не отличались от показателей контроля, что не подтверждает результаты других исследователей [242, 294, 368]. Отсутствие повышения лептина, вероятно, связано с компенсаторным ограничением выработки противовоспалительными применением гормона цитокинами, лекарственной терапии адипоцитами, высоким (тиазидовые уровнем угнетением андрогенов, диуретики тормозят выделение этого медиатора) [232, 308]. Атерогенные классы липопротеинов (хиломикроны, ЛПОНП и, особенно, ЛПНП) являются потенциальными провоспалительными факторами [10, 70, 116]. При этом нарушение липопротеинового обмена и формирование гиперлипидемий – представляет собой важный элемент реактивности организма на воспалительные стимулы [138]. По результатам биохимического анализа крови было установлено, что у 134 (51,5 %) пациентов с АС уровень общего ХС крови был в пределах нормы (менее 5,0 ммоль/л), умеренное повышение его концентрации (от 5,1 ммоль/л до 6,1 ммоль/л) было зарегистрировано у 54 пациентов (20,8 %), высокое содержание (более 6,2 ммоль/л) – у 72 человек (27,7%). Нормальные показатели холестерина, наблюдаемые почти у половины обследуемых пациентов с клинически выраженными проявлениями ишемии на фоне АС, позволяют 200 судить, что гиперхолестеринемия является не обязательным проявлением развития и прогрессирования заболевания, что подтверждает мнение других исследователей [37, 68, 70]. Исходя из этого, можно заключить, что в развитии АС важен не уровень повреждающего агента, а нарушение его взаимодействия со структурными компонентами сосудистой стенки эндотелиальными, гладкомышечными клетками и лейкоцитами. Проведено исследование основных групп цитокинов (про-, противовоспалительных и иммунорегуляторных) у пациентов с АС, в зависимости от уровня общего ХС крови. Зарегистрировано, что при концентрации общего ХС>5,1 ммоль/л регистрировался более высокий уровень TNF-α (достоверно выше референсных значений, р<0,05), что согласуется с заключением Г.Е. Ройтберга (2010) о положительных взаимосвязях между TNFα и гиперлипидемией крови, поскольку одним из эффектов этого цитокина является его способность ингибировать поглощение модифицированных ЛПНП макрофагами, в частности – инактивировать мРНК скэвенджер – рецепторы класса А, необходимые для захвата ЛПНП, и подавлять их экспрессию на клетках [116]. При высоком уровне общего ХС показатели TNF-αRI и TNF-αRII, напротив, были статистически значимо ниже, чем при его низком содержании (р<0,05). Была установлена отрицательная корреляция между растворимыми рецепторами TNF-αRI и общим ХС крови (сильная между TNF-αRI и ХС r = - 0,78 и средняя TNF-αRII и ХС, р<0,05), что объясняется антагонизмом этих рецепторов со своим лигандом и, следовательно, - разнонаправленным эффектом в отношении обмена холестерина. По мнению М.И. Душкина с соавт. (2007), положительная корреляция между провоспалительными цитокинами, такими как: TNF-α, TNF-β, IL-1β, IL-6 и IFN-α и липидным обменом заключается в том, что они способствуют индукции синтеза жирных кислот (ЖК) и развитию триглицеридемии [36]. Однако нами установлено, что высокий уровень общего ХС, напротив, сопровождался статистически значимым снижением уровня IL-6 и некоторым уменьшением IL-1β. Это 201 согласуется с результатами диссертационной работы Я.Ш. Шварц (2011), установившего, что высокая системная концентрация холестерина способствует гипореактивности сфингомиелина в мононуклеарных фагоцитах, вследствие чего – уменьшается их способность продуцировать провоспалительные медиаторы и цитокины (TNF-α, IL-1β, NO), снижается зимозан-индуцированное гранулемообразование и миелопоэтический ответ в костном мозге [154]. Нами также не установлено корреляции между IFN-γ c уровнем общего холестерина крови, что, вероятно, связано с влиянием цитокина не на уровень, а на метаболизм холестерина, в том числе – на эффекты, содержащих холестерин ЛПНП и ЛПВП. По данным литературы известно, что IFN-γ влияет на соотношение ХС и его эфиров – в сторону накопления последних, тормозит захват, транспортировку в лизосомы и удаление ХС из клеток с помощью ЛПВП, что приводит к трансформации макрофагов в пенистые клетки [134, 167]. В проведенном исследовании мы установили, что содержание TGFβ1 было выше референсных значений только при высоком уровне общего ХС крови, что также косвенно можно соотнести с результатами Я.Ш. Шварц (2011), который при моделировании АС у мышей и при анализе среды культуры макрофагов, обогащенной холестерином выявил, что гиперхолестеринемия стимулирует продукцию TGF1 и способствует развитию системного фиброгенного ответа в органах и тканях, в частности, в артериальных сосудах и в печени [154]. При этом нами не установлено статистически значимых различий по содержанию TGFβ2 в зависимости от уровня общего ХС в крови, оно было выше значений здоровых доноров, как при низкой, так и высокой концентрации ХС. Однако некоторые исследователи отмечают, что повышенный уровень TGFβ ведет к усиленному связыванию ЛПНП сосудистой стенкой, и, следовательно, способствует повреждению эндотелия [448]. Увеличение общего ХС более 6,2 ммоль/л сопровождалось нарастанием противовоспалительного IL-10 (р=0,04), по сравнению с уровнем ХС менее 5,0 ммоль/л, но показатели цитокина не достигали референсных значений и оставались ниже их (р=0,05). Повышение IL-10 может свидетельствовать о реактивной симуляции T лимфоцитов при 202 усилении действия повреждающего стимула (избытка холестерина, возможно гиперпродукции TNF-α) на эти и другие клетки продуценты цитокина. При анализе зависимости содержания иммунорегуляторных цитокинов от концентрации общего ХС крови выявлено нарастание уровня IL-2 и тенденция к снижению его растворимого рецептора при концентрации общего ХС (>6,2 ммоль/л). При этом показатели цитокина были ниже контрольных значений, как при низкой, так и при высокой концентрации общего ХС в крови. Изменения IL-2 указывают на контролирующее участие этого цитокина в обмене холестерина. По данным литературы известно, что терапия рекомбинантным IL-2 способствует снижению холестерина и липопротеинов [289], а статины снижают уровень IL-2 [405]. Уровень IL-17 также был более высоким при увеличенном содержанием общего ХС в крови (>6,2 ммоль/л) и превышал при этом показатели контроля, р=0,05, что свидетельствует об активации Th-17 при гиперхолестеринемии. Учитывая взаимосвязи системного содержания цитокинов с уровнем общего холестерина крови мы попытались оценить возможное влияние полиморфных локусов генов цитокинов на концентрацию общего ХС крови. В общей группе пациентов с АС уровень ХС крови более 6,2 ммоль/л был сопряжен с высокой частотой встречаемости A/G и A/A вариантов гена TNFα (-308G/A), G/G варианта гена IL6 (-174G/C), Т/Т варианта гена TGFβ1 (-509 C/T) и низкой частотой встречаемости G/G варианта гена TNF α (-308G/A), СG варианта гена IL6 (-174G/C), C/T варианта гена TGFβ1 (-509 C/T), по сравнению с группой пациентов со средним (от 5,1 до 6,1 ммоль/л) и низким (менее 5,0 ммоль/л) уровнем общего ХС, (р = (χ2) < 0,05). На сегодняшний день в научном мире активно изучаются взаимосвязи системы матриксных металлопротеиназ с показателями липидного метаболизма при сердечно-сосудистой патологии [231, 187, 280, 284]. Показано, что ММР-9 вовлечена в дифференцировку адипоцитов и регулирует выделение из них триглицеридов [187]. По данным S.Y. Kim с соавт. (2006), кофактор 203 липопротеинлипазы – аполипопротеин C-II - энзим, вовлеченный в поглощение и метаболизм триглицеридов, расщепляется металлопротеиназами [280]. При анализе системы ММР-9 в зависимости от концентрации общего ХС в крови было выявлено, что при среднем и высоком уровне общего ХС показатели ММР-9, были выше, чем при низком его уровне (р=0,02-0,05), однако при этом они не превышали контрольные значения. Содержание TIMP-1 было выше показателей здоровых доноров только при высокой концентрации общего ХС крови (р=0,05). Нами обнаружена прямая корреляция слабой силы между ММР-9, TIMP-1, ММР-9/TIMP-2 и уровнем общего ХС (r=0,42, r=0,38, r=0,24, при р<0,05). Это согласуется с данными литературы, что при АС увеличению концентрации ММР-9 и ТIМP-1 способствует усиление продукции атерогенных липидов: ХС, ЛПНП, ТГ [20, 187, 280, 231]. При этом, мы не установили изменений показателей комплексов ММР-9/TIMP-1 и ММР9/TIMP-2 от концентрации общего ХС в крови. При определении содержания адипокинов в зависимости от концентрации общего ХС в крови пациентов с АС выявлено, что при уровне общего ХС более 6,2 ммоль/л значения лептина были статистически значимо выше, чем при значениях общего ХС менее 5,0 ммоль/л р=0,04), при этом они превышали контрольный уровень (р=0,03). Нами установлена прямая средняя корреляция между лептином и общим ХС крови (r=0,45, р<0,05). Выявленные изменения, вероятно, свидетельствуют о том, что гиперлептинемия направлена на ограничение продукции общего ХС и подтверждают данные большинства исследователей о прямой корреляции лептина и общего холестерина крови [165, 326, 385]. Но при этом, увеличение содержания лептина в ответ на повышение уровня общего холестерина крови способствует стимуляции активности симпато-адреналовой системы, увеличению толщины каротидной интимы/медиа, кальцификации коронарных артерий [84], активации клеточного иммунного ответа и продукции провоспалительных цитокинов [147, 163]. У пациентов с высоким содержанием общего ХС крови уровень адипонектина был несколько ниже, чем у пациентов со средней концентрацией общего ХС 204 (4,2 (4-4,8) мкг/мл против (5,1 (4,4-6,4) мкг/мл, различия носили характер тенденции (р=0,09). Полученные нами результаты можно согласовать с данными K. Hotta (2000), N. Ouchi (2003), С.А. Бутровой (2005), о том, что адипонектин уменьшает синтез липопротеидов очень низкой плотности, усиливая окисление ЖК в печени [18, 260, 338] и с заключениями Y.Zhou (2011) и [458] O.S. Al-Attas (2012), выявивших обратные корреляционные связи этого гормона с уровнем ТГ [164]. Цитокины выполняют регулирующую роль в активации системы металлопротеиназ – основных ферментов деградации межклеточного матрикса [318]. Мы провели корреляционный анализ между содержанием цитокинов и их рецепторов с уровнем металлопротаиназы-9, ее тканевым ингибитором I типа и комплексами ММР-9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 в сыворотке крови при АС. Зарегистрированная прямая корреляция средней силы IL-1β с ММР-9 - (r=0,57, р = 0,01), подтверждает данные G. Opdenakker с соавт. (2001) [337], A.M. Tuomainen с соавт. (2007) [417], M.Rohla, T.W. Weiss (2013) [359] об участии ММР-9 в активации IL-1β, и согласуется с результатами M.R.Alexander (2012) о том, что IL-1β участвует в ремоделировании сосудистой стенки через ММРзависимые механизмы [166]. Установленная нами прямая корреляция средней силы между IL-1β и комплексом ММР-9/TIMP-1 (r=0,30, р=0,03), вероятно, отражает активирующее влияние цитокина и на продукцию тканевого ингибитора метоллопротеиназы-9 - (TIMP-1), однако, в общей группе пациентов с АС обнаруженная слабая прямая корреляция между IL-1β и TIMP-1 не была статистически достоверна, определялась лишь тенденция связи между показателями (r=0,28, р=0,08). В общей группе пациентов с АС не подтверждено данных об активирующем влиянии провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-α на продукцию ММР-9, показанную другими авторами [131, 300, 404], также нами не установлена обратная корреляция TIMP-1 с IL-6, зафиксированная другими исследователями [145]. Однако выявлена слабая корреляция между TNF-α и TIMP-1 (r=0,21, р=0,05), что указывает на компенсаторное повышение 205 продукции ингибитора ММР-9 1 типа при увеличении продукции провоспалительного цитокина. Установленные прямые корреляции IL-2 и IL-2R c TIMP-1 (r=0,26, р=0,04 и r=0,47, р=0,003, соответственно) и IL-2 и IL-2R с ММР-9/TIMP-1 (r=0,26, р=0,05 и r=0,35, р=0,01, соответственно) при АС, возможно, указывают на компенсаторную стимуляцию продукции TIMP-1, активацию его связывания с ММР-9 в ответ на опосредованное IL-2-IL-2R, усиление лимфоцитарной инфильтрации и воспаления в стенке сосуда [66]. Зарегистрированная прямая слабая корреляция IL-17 с ММР-9/TIMP-1 r=0,30 (р=0,01) может отражать опосредованное усиление IL-17 образования комплекса ММР-9 с ее ингибитором 1 типа, поскольку известно, что IL-17 активирует продукцию провоспалительных цитокинов и хемокинов гладкомышечными клетками и нейтрофилами, что потенцирует воспаление и активацию матриксных металлопротеиназ [215], однако корреляции цитокина с ММР-9 обнаружено не было. Вышеперечисленные взаимосвязи между показателями представлены в рисунке 57. По данным K.N. Couper с соавт. (2008) IL-10 подавляет высвобождение металлопротеиназ из макрофагов, а также стимулирует синтез тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 [205]. Нами не установлено связи ММР-9 и TIMP-1 с IL-10, что не согласуется с результатами исследователей, однако прямая связь комплекса ММР-9/TIMP-1 с IL-10 свидетельствует в пользу влияния цитокина на эффективность связывания ММР-9 с вероятной последующей инактивацией желатиназы В. В литературных источниках показана взаиморегуляция TGF-β и ММР-9, а именно, - стимуляция цитокином продукции ММР-9 [156], или, напротив, активация выработки TGF-β при участии ММР-9 [131, 300]. Тогда как S.S. Signorelli с соавт. (2012) свидетельствуют о снижении содержания TGF-β1 и высоком уровне ММР-9 при ОАНК [382]. Однако в нашем исследовании не выявлено каких либо влияний между показателями в общей группе пациентов с АС. 206 Рисунок 57 – Взаимосвязи системного уровня общего холестерина крови, цитокинов, показателей деградации межклеточного матрикса и адипокинов при атеросклерозе Регулирующее влияние цитокинов на продукцию лептина и адипонектина рассматривается в разных литературных источниках [147, 288, 299]. Нами не выявлено взаимосвязи между TNF-α и лептином, показанное С.Ю. Чубриевой (2008), S. Margetic (2002), S. Gaillard (2007) [147, 232, 312]. В своих исследованиях авторы отметили, что TNF-α вызывает быстрое высвобождение лептина из белой жировой ткани. Наши исследования также косвенно не подтвердили результаты H. Gotts Сhling-Zeller с соавт. (1999), установивших, что длительное воздействие TNF-α на культуру клеток адипоцитов человека приводит к снижению уровней мРНК лептина [236]. T. Ling с соавт. (2009), в своем исследовании выявили, что адипонектин оказывает влияние на угнетение экспрессии TNF-α и IL-6 в эпикардиальной жировой ткани и селективно снижает экспрессию TIMP-1 через индукцию IL-10 [299]. Однако, мы также не обнаружили связи лептина c IL-6 и IL-10, тем самым не подтвердили заключения авторов. 207 При этом нами установлена слабая прямая связь между лептином и IL-1β (r=0,35, р=0,01), что косвенно подтверждает конкордантность их провоспалительного действия при АС и согласуется с данными S. Margetic (2002) и S. Gaillard (2007), о том, что IL-1 стимулируют синтез и секрецию лептина адипоцитами [312, 232]. Выявленная в настоящем исследовании средняя обратная связь адипонектина с TGF-β1 (r - 0,41, р=0,01) и слабая обратная связь его с TGF-β2 (r= - 0,30, р=0,05), по нашему мнению, указывает на то, что низкий уровень адипонектина при АС может способствовать повышению продукции противовоспалительного TGF-β и в то же время стимулировать профиброгенные эффекты цитокина. Это согласуется с данными S.J. Hong с соавт. (2007), выявивших, что пациенты, подвергавшиеся стентированию и получающие лечение термисартаном, значительно снижавшим уровень адипонектина, в последующем имели снижение просвета сосудов [257]. Нами выявлена обратная корреляция между лептином и ММР-9 (r= - 0,75, р=0,0001), прямые корреляции между лептином и TIMP-1 (r=0,23, р=0,04), лептином и ММР-9/TIMP-1 (r=0,35,р=0,006). В этом наши данные согласуются с результатами J. Bao (2010) [177] и M. Wendremaire с соавт. (2013) [437], показавших, что лептин стимулирует синтез коллагена посредством ингибиции продукции MMP-2 и MMP-9; с результатами M.G. Bilbao (2011), установивших, что лептин стимулирует не продукцию, а только активность ММР-9 и при этом повышает экспрессию тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP) [184]; с результатами S. Kralisch (2007) [290], выявивших прямую корреляцию между лептином и TIMP-1. Однако вышеперечисленные корреляции противоречат результатам M.R. Schroeter с соавт. (2012) [371] и L. Wang с соавт. (2013) [430], показавших, что лептин, напротив, повышает экспрессию как MMP-9, так и TGF-β. Однако существуют работы, посвященные влиянию лептина на ангиогенез, в которых не уставлено каких-либо корреляций между уровнем этого гормона и продукцией MMP-2 и MMP-9 [173, 332]. Выявленная нами обратная корреляция между 208 адипонектином и TIMP-1 (r=-0,22, р=0,05), подтверждает данные S. Kralisch (2007) [290] и косвенно согласуется с результатами D. Benaitreau с соавт. (2010), J. Wanninger с соавт. (2011) и R. Adya с соавт. (2012) о стимулирующем эффекте адипонектина на экспрессию и MMP-9 и MMP-2 [162, 181, 433]. Однако E. Essick с соавт. (2011) показали, что адипонектин, напротив, подавляет желатиназную активность через ингибицию продукции матриксных металлопротеиназ – MMP-2 и MMP-9, стимулированную оксидативным стрессом (повышенным образованием кислородных радикалов) [223]. Не вызывает сомнений изменение иммунных и метаболических механизмов реактивности в зависимости от возраста и пола человека. Проведена оценка продукции цитокинов, металлопротеиназ и гормонов жировой ткани – лептина и адипонектина у пациентов с АС разного возраста, согласно классификации ВОЗ. Определено влияние возраста на цитокиновый профиль сыворотки крови в общей группе пациентов с пациентов с АС: в возрасте 75-89 лет значения IL-6 и TNF-α были выше, а уровень IL-2 и TGF-β2 – ниже, чем у пациентов 45-59 лет. Повышение вышеперечисленных цитокинов в сыворотке крови, вероятно, связаны с повышенной дегрануляцией СD4+ и СD8+ у пожилых людей [86]. Дефицит IL-2 и TGF-β2 указывает на наиболее выраженное снижение Т-клеточной пролиферации в результате инвалютивных процессов в тимусе и других тканях при старении. Это может способствовать развитию аутоиммунной патологии в результате ослабления активности Т-регуляторных клеток. Не было выявлено достоверности различий показателей полиморфизма исследуемых генов в зависимости от возраста пациентов с АС. Тем самым мы не подтвердили результаты Г.Е. Ройтберга (2010), который обследовал группу молодых мужчин и связал G/A вариант TNF-α (-308G/A) с ранним АС [116]. Однако нами зарегистрирована тенденция к более частому присутствию в геноме гетерозиготного C/G варианта гена IL-6 (-174G/C) у пациентов 44-59 лет - 47,9% по сравнению с пациентами старше 60 лет, у которых этот генотип составлял – 34,6%, р(χ2)=0,08. При анализе показателей системы металлопротеиназы-9 в зависимости от возраста нами не 209 установлено статистически значимых различий, что согласуется с результатами E. Elmas с соавт. (2007) [218]. Авторы не установили взаимосвязей ММР-9 и ММР-9/TIMP-1 с возрастом у пациентов с ИМ. Однако, мы не подтвердили данные литературы о повышении продукции ММР-9 в связи с увеличением возраста пациентов с АС [46, 448] и TIMP-1 в их крови [218, 328, 391]. Наши данные также не согласуются с результатами клинического исследования А.Ю. Ефименко (2011), которая обнаружила увеличение активности ММР-2 и ММР-9 в кондиционированной клеточной среде мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани только у пациентов старше 60 лет [38]. При этом в своем экспериментальном исследовании, автор выявила, повышение экспрессии мРНК генов ММР-2 и ММР-9 у мышей в возрасте 18 месяцев, что соответствует возрасту людей 50-70 лет с последующим резким снижением экспрессии мРНК генов ММР-2 и ММР-9 у мышей 24 месяцев, что соответствует возрасту людей старше 70 лет [38]. В общей группе пациентов с АС, в возрасте 75-89 лет, значения лептина были статистически значимо выше, чем в возрасте 60-74 лет и 45-59 лет, а уровень адипонектина – выше, чем в возрасте 45-59 лет (р<0,05). Выявленные показатели согласуются с результатами Е.В. Шин (2011), которая в своем исследовании показала, что значения лептина и адипонектина положительно коррелируют с возрастом пациентов с ИБС [155]. При старении организма, вероятно, развивается рецепторная резистентность к адипокинам, связанная с накоплением в организме кислородных радикалов [196, 273, 293, 409]. Не было установлено провоспалительных, достоверных иммунорегуляторных изменений и содержания противовоспалительных цитокинов от пола в общей группе пациентов с АС. Мы также не подтвердили результаты M.Griva с соавт. (2010) о более высоком уровне TNF-α RII в сыворотке крови у мужчин, чем у женщин [341]. При этом наблюдались особенности полиморфизма генов от пола пациентов с АС. У мужчин в геноме превалировали гетерозиготные варианты генов IL-6 (-174G/C), TNF-α (– 308G/A), и PTPN22 rs 2476601, тогда как у женщин определялось увеличение 210 частоты встречаемости гомозиготного G варианта гена IL-6 (-174G/C) и более низкий процент присутствия в геноме гетерозиготных вариантов генов TNF-α (308G/A) и PTPN22. Выявлено отсутствие изменений уровня ММР-9, TIMP-1, ММР-9/TIMP-1 в зависимости от пола пациентов с АС, что подтверждает данные J. Sundström с соавт. (2004) [391], но не согласуется с результатами K. Koh с соавт. (2002), которые показали, что у женщин в постменопаузе наблюдается снижение ММР-9 в плазме крови [284]. Однако нами было установлено, что содержание комплекса ММР-9/TIMP-2 было значительно выше у мужчин, чем у женщин (р=0,05). С целью оценки патогенетических особенностей течения воспаления при АС в зависимости от его локализации, мы определили вышеперечисленные маркеры у пациентов с АКА (ИБС) и ОАНК. В каждой из данных групп исследовались подгруппы в зависимости от анамнеза и клинических особенностей заболевания. У пациентов с АКА (ИБС) иммунооппосредованная провоспалительная активность была представлена высоким содержанием IL-1β и IL-6 (в 5,4 раза и в 2,4 раза, соответственно), по сравнению с его показателями у здоровых доноров. При этом, уровень IL-1β у пациентов с АКА (ИБС) был в 4,6 раз выше, чем у пациентов с СА с преимущественными клиническими проявлениями ОАНК и невыраженном течении ИБС, что данные других авторов об участии IL-1β и IL-6 в атерогенном повреждении коронарных артерий [70, 89, 147, 367]. Возможными причинами наиболее низкого уровня IL-1β при ОАНК могут являться: формирование приобретенного дефицита данного цитокина в условиях выраженной ишемии НК и снижение функциональной активности клеток продуцентов цитокина, гиперпродукция антагониста цитокина – растворимого рецептора к IL-1. Однако, при выраженных клинических проявлениях ОАНК снижение концентрации IL-1β можно расценить как неблагоприятный признак, привести к нарушению MMP-зависимых механизмов ремоделирования сосудов и развитию осложнений, таких как – кровоизлияние в сосудистую стенку и тромбообразование [166]. Нами не зарегистрировано увеличения 211 провоспалительных цитокинов: TNF-α, IFN-γ при АКА (ИБС), что можно объяснить снижением функциональной активности их клеток-продуцентов в результате повреждения циркуляторной тканей гипоксии и в условиях метаболического длительной системной ацидоза, возможным превалированием локальной секреции и потребления в месте поражения артериальной стенки, компенсаторным угнетением естественными ингибиторами – TNF-αRI и TNF-αRII (их уровень был достоверно выше референсных значений при АКА (ИБС), или противовоспалительными цитокинами, приемом статинов пациентами, ингибирующих синтез провоспалительных цитокинов ГМК, Т-лимфоцитами и макрофагами [210, 322, 354]. Показатели TNF-α, IL-6 и IFN-γ при ОАНК были выше, чем при АКА (ИБС) – (в 2,1, в 1,5, в 1,8 раз, соответственно) и выше, чем у здоровых доноров (в 1,9, в 4,4, в 2,4 раз, соответственно). Усиленная продукция данных провоспалительных цитокинов при ОАНК может проявляться активацией макрофагов, выделением ими кислородных радикалов, оксида азота и гидролитических ферментов в условиях ишемического повреждения тканей НК, что потенцирует прогрессирование хронического воспаления и повреждения по типу порочного круга [40, 142]. Установлено, что содержание IL-6R не отличалось от показателей контроля при АКА (ИБС), и при этом не было выявлено корреляции между IL-6 и его сывороточным рецептором в группе пациентов с АКА (ИБС) (r=0,07, р=0,59), что, возможно, указывает на нарушение взаимостимуляции – лиганд-рецептор в условиях системной циркуляторной гипоксии в патогенезе ИБС. Однако, этот факт можно рассмотреть и с позиций компенсации, блокирующий передачу провоспалительного сигнала от комплекса IL-6-IL-6R в клетку-мишень. При ОАНК зарегистрирована слабая корреляция между IL-6 и растворимого рецептора к IL-6 (r=0,31, p=0,04), что характеризует образование комплекса лиганд-рецептор с дальнейшим взаимодействием с мембранным протеином gp130, в результате чего проявляется выраженный провоспалительный эффект IL-6. При АКА (ИБС), как и в общей группе пациентов с АС, уровень IL-2 был 212 ниже, а значения растворимого рецептора IL-2 – выше показателей здоровых доноров, при этом не было выявлено различий с группой пациентов с ОАНК. У пациентов с АКА (ИБС) определялась тенденция к повышению показателей IL-17, что отразилось на показателях цитокина в общей группе пациентов с АС и, косвенно, характеризует активацию нейтрофилов и их участие в атерогенном повреждении коронарных артерий. При СА значения IL-17 были статистически значимо ниже, чем при АКА (ИБС), но при этом не отличались от контрольного уровня (р>0,05). С одной стороны, это можно рассмотреть как ограничение функциональной активности Th-17 при СА и расценить как проявление компенсаторного противовоспалительного эффекта. Однако результатом этого может быть анергия нейтрофильного звена при ишемии и циркуляторной гипоксии и последующее нарушение репаративных процессов в НК. При оценке содержания противовоспалительных цитокинов зафиксировано, что уровень IL10 был низким, как при АКА (ИБС), так и при ОАНК, без достоверной разницы между группами, что согласуется с данными литературы и отражает угнетение противовоспалительных механизмов в условиях гипоксии [9, 62]. Содержание TGFβ1 и TGFβ2 не имело особенностей в зависимости от локализации АС. Анализ удельного веса цитокинов показал выраженное снижение доли IL-2 (в 2,8 раз) и IL-10 (1,8 раз) при АКА (ИБС), по сравнению с СА. Это косвенно указывает на Т-клеточную противовоспалительных иммуносупрессию механизмов реактивности и нарушение при коронарном атеросклерозе. Особенностью же дисбаланса цитокинового профиля при ОАНК – являлся низкий удельный вес IL-1β (в 2 раза ниже, чем у здоровых доноров и в 6,2 раза ниже, чем у пациентов с АКА (ИБС), тогда как доля других провоспалительных цитокинов – IFN-γ и TNF-α, напротив, была несколько выше, чем при АКА (в 1,4 и в 1,6 раз, соответственно), что, косвенно, отражает более выраженную воспалительную активность и цитокино-опосредованную ингибицию процессов ремоделирования сосудистой стенки. 213 При оценке особенностей полиморфизма генов при различной локализации и распространенности АС, выявлено, что при АКА (ИБС) определялась высокая частота встречаемости G/G варианта гена TNF-α (-308G/A) и тенденция снижения его A/G варианта, по сравнению с контролем (р(χ2)=0,05 и р(χ2)=0,07, соответственно) что согласуется с результатами других исследователей [176]. При ОАНК частота встречаемости гетерозиготного C/T варианта TGFβ1 (-509 C/T) была статистически значимо ниже, чем в контроле и в группе пациентов с АКА (ИБС), р(χ2)=0,03. Определена тенденция более высокой частоты A/G варианта гена IL-10 (-1082 G/A) при ОАНК, по сравнению с носителями этого генотипа в контрольной группе, р(χ2)=0,07. Выявлены особенности влияния полиморфизма генов на содержание кодируемых белков в сыворотке крови в зависимости от локализации и клинических проявлений АС. При ОАНК высокий уровень IL-6 был ассоциирован с гомозиготным С вариантом гена IL-6 (-174G/C), высокий уровень TGFβ1 – с гетерозиготным C/T вариантом гена TGFβ1 (-509 C/T)), высокий уровень TNF-α – с A/G вариантом гена TNF-α (-308G/A). Эти результаты согласуются с данными А. В. Рыдловской и А.С. Симбирцева (2005), которые в своем исследовании показали, что cинтез белка при А варианте гена TNF-α (-308G/A) происходит в 3 раза активнее [117]. Высокий уровень TNF-α (-308G/A) - у пациентов этой группы был также сопряжен с G/G вариантом гена PTPN22 (G/A), а высокая концентрация IL-17 – с гетерозиготным G/A вариантом гена PTPN22 (G/A). При АКА (ИБС) высокими значениями IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-17 в сыворотке крови ассоциировались с носительством G/G варианта гена TNF-α (-308G/A). Локализация и уровень поражения АС также имели отличительные особенности активности и регуляции матриксной металлопротеиназы-9. При АКА (ИБС) наблюдалась тенденция к увеличению уровня ММР-9 и комплекса ММР-9/TIMP-2 (р=0,08), по сравнению с СА (ОАНК+(ИБС)), что отражает ее активацию при ишемическом повреждении миокарда. У пациентов с преимущественным атерогенным поражением артерий нижних конечностей и 214 при невыраженной клинике ИБС – уровень ММР-9 был в пределах нормы, тогда как содержание TIMP-1, напротив, было статистически значимо выше референсных значений. Это свидетельствует об активации механизмов контроля выработки ММР-9 ее ингибиторами 1 и 2 типа при выраженных клинических проявлениях ОАНК, но с другой стороны усиленное связывание желатиназы В может отражать нарушение процессов ремоделирования сосудов НК в ходе их длительной ишемии, способствовать развитию в них процессов фиброобразования и тромбоза. Нами определены особенности изменений содержания лептина в зависимости от локализации и распространенности поражения артерий при АС. При АКА (ИБС) значения лептина были выше, чем у здоровых доноров (р=0,04) и пациентов с ОАНК (р=0,05). При этом у пациентов с ОАНК уровень лептина статистически значимо не отличался от референсных показателей (р>0,05). Отсутствие повышения лептина при ОАНК, вероятно, связано с ограничением выработки гормона адипоцитами с целью компенсации ишемии. Поскольку известно, что лептин стимулирует симпатическую активность НС, усиливает вазоконстрикцию и способствует прогрессированию ишемии тканей НК [147]. Как при АКА, так и при ОАНК содержание адипонектина, было ниже контрольного уровня, без статистически значимых различий между группами. Установлены особенности изменений содержания цитокинов в сыворотке крови пациентов разного возраста от локализации и распространенности атеросклероза. При АКА (ИБС) в группе пациентов 75-89 лет определялись наиболее высокие показатели провоспалительных цитокинов: IFN-γ, TNF-α, IL-6, растворимых рецепторов TNF-α RI и TNF-α RII, по сравнению с пациентами 45-59 лет (р<0,05) и низкое содержание IL-2 и IL-10 (достоверно ниже, чем у пациентов в возрасте 60-74, р<0,05), что характеризует выраженную провоспалительную активность у пожилых людей с коронарным атеросклерозом и, косвенно, указывает на дефицит у них Т-регуляторных клеток, склонности к аутоиммунизации и снижение противовоспалительных механизмов. При исследовании провоспалительных цитокинов в зависимости 215 от возраста пациентов с ОАНК, статистически значимых различий не было выявлено, однако у пациентов 75-89 лет наблюдался более низкий уровень IL17, по сравнению с пациентами в возрасте 45-59 лет и 60-74 года (р<0,05), показатели TGFβ2 были статистически значимо ниже, чем у пациентов 45-59 лет (р=0,05), при этом они находились в пределах референсных значений, что отражает нарушение процессов активации нейтрофилов и образования коллагена фибробластами у пациентов 75-89 лет. При АКА (ИБС) выявлено снижение системного уровня ММР-9/TIMP-1 у пациентов 75-89 лет, по сравнению с пациентами 45-49 (р<0,05), что характеризует недостаточное связывание желатиназы В. Анализ содержания системы ММР-9 у пациентов с ОАНК различных возрастных групп показал, что уровень ММР-9/TIMP-2 у пациентов 75-89 лет был статистически значимо ниже, чем в группах пациентов 60-74 лет и 45 - 49 лет, но при этом не отличался от показателей контроля (р>0,05), что также указывает на нарушение процессов связывание ММР-9 ее ингибитором 2 типа. При АКА (ИБС) нами не зарегистрировано статистически значимых различий показателей адипокинов в зависимости от возраста. У пациентов с ОАНК в возрасте 75-89 лет, значения лептина были статистически значимо выше, чем в возрасте 60-74 лет и 45-59 лет, а уровень адипонектина- выше, чем в возрасте 45-59 лет (р<0,05), что также может косвенно отражать нарушение рецепции адипокинов. При анализе влияния половой принадлежности на продукцию цитокинов в зависимости от локализации и распространенности АС, нами зарегистрировано, что у женщин с АКА (ИБС) уровень TNF-α, был достоверно выше, чем у мужчин (р=0,05). Вышеперечисленные изменения, вероятно, обусловлены гормональным фоном (эстроген-зависимой продукцией выработки TNF-α), преобладанием жировой ткани у женщин - одного из источников продукции TNF-α [45, 147], что также согласуется с данными А.М. Косыревой с соавт. (2011), которые экспериментально показали, что у самцов крыс линии Vistar – уровень TNF-α был достоверно выше, чем у самок [59]. 216 Мы не обнаружили достоверной разницы в показателях иммунорегуляторных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови в зависимости от пола пациентов с АКА (ИБС). У мужчин с ОАНК определялось преобладание уровня TNF-α, по сравнению с женщинами, что, вероятно, связано с большим количеством пациентов мужского пола и более высоким количеством среди них курильщиков. Данные литературы свидетельствуют о влиянии курения на повышение уровня TNF-α в сыворотке крови при АС [258]. Более высокий уровень IL-10 и TGFβ1 регистрировался у женщин с ОАНК (р=0,04 и р=0,05, соответственно), что свидетельствует об активации у них противовоспалительных механизмов реактивности. У мужчин с АКА (ИБС) уровень ММР-9/TIMP-2 в сыворотке крови был значительно выше, чем у женщин (р=0,04), что, вероятно, связано с большей выборкой пациентов мужского пола. При распределении пациентов с ОАНК по полу – не было установлено статистически значимых отличий показателей системы ММР-9 (р>0,05). Нами также не выявлено различий значений лептина и адипонектина между мужчинами и женщинами в зависимости от локализации и распространенности атеросклеротического процесса. В ходе анализа цитокиновой регуляции, системы ММР-9 и гормонов жировой ткани в зависимости от особенностей анамнеза и клинического течения АС путем оценки факторной нагрузки - было установлено следующее: наличие ИМ в анамнезе пациентов было сопряжено с более низкими значениями IL-2, увеличением IL-17, увеличением ММР-9/TIMP-2 и лептина в крови, что отражает стимуляцию, преимущественно, врожденных и угнетение адаптивных механизмов иммунитета; активацию компенсаторных механизмов стабилизации процессов ремоделирования миокарда при усилении лептинзависимых симпатических влияний. Определялась различная динамика системной воспалительной активности в зависимости от периода времени после перенесенного ИМ. Период от 1 до 3 месяцев после ИМ характеризовался увеличением уровня лептина и TNF-α RII в крови. По нашему мнению, это свидетельствует о повреждении миокарда в результате лептинзависимых симпатических влияний, усиление 217 провоспалительной активности, опосредуемой TNF-α, и активации компенсаторных механизмов ингибиции этого цитокина. В периоде от 6 до 12 месяцев после перенесенного ИМ – отмечалось увеличение IL-1β, IL-6, ММР-9, TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 и снижение IL-17, что, указывает на реактивацию воспаления и повреждения миокарда, цитокин-опосредованную стимуляцию процессов расщепления межклеточного матрикса с нарушением реагирования нейтрофилов и повышение функциональной активности макрофагов. При НС высокий уровень IL-6, TNF-α II R, лептина и нормальное содержание IL-6 R, свидетельствуют об увеличении провоспалительных механизмов повреждения миокарда в условиях ишемии, и одновременной активации компенсаторных влияний, таких как усиление связывания TNF-α его растворимым рецептором II типа и снижение рецепции IL-6. У пациентов с нестабильным течением стенокардии уровень лептина более 4 нг/мл определялся у 72 % чел. а содержание IL-6>5пг/мл - у 68 % чел. по сравнению со стабильным течением стенокардии (χ2=12,22, p=0,01 и χ2=9,14, p=0,001, соответственно). При выполнении бинарного логистического регрессионного анализа и построении Roc кривой определялось независимое влияние уровней этих показателей (рисунок 58). 1,2 чувствительность 1 0,8 TPF 0,6 Lower Upper 0,4 0,2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 100-специфичность 1 1,2 Рисунок 58 – ROC - кривая для лептина и IL-6 у пациентов с НС 218 Интервал AUC под кривой для лептина и IL-6 был практически одинаковым (для лептина 0,91, для IL-6 0,94). Это доказывает качество модели и позволяет рекомендовать использовать содержание данных показателей в качестве дополнительных диагностических критериев нестабильного течения стенокардии (рисунок 58). При увеличении ФКСС – нарастание уровня TNF-αRII, лептина, при снижении TNF-α, ММР-9/TIMP-2 IL-17, – указывает на активацию воспалительных механизмов (↑лептина), напряжение (↑TNF-αRII), и, по некоторым параметрам (связывания ММР-9 и нарушение IL-17-зависимой продукции нейтрофилов) – истощение противовоспалительных механизмов клеточной реактивности в условиях прогрессирующего ишемического повлеждения миокарда. При увеличении степени ХСН, зарегистрированные: низкий уровень IL-2, лептина, нарастание значений TGFβ2, TIMP-1, ММР9/TIMP-1 и ММР-9/TIMP-2 – свидетельствуют о супрессии клеточного иммунного реагирования, стимуляции процессов фиброзообразования, и включении компенсаторных механизмов при энергосберагающих прогрессировании циркуляторной лептинзависимых гипоксии и метаболического ацидоза. При ФВЛЖ менее 50%, наблюдался более низкий уровень IL-1β, IL-6, IL-10, нарастание содержания TNF-αRII, TIMP-1 и лептина в сыворотке крови, что указывает на усилении лептинзависимых симпатадреналовых влияний на сердце, преимущественную локальную активацию провоспалительных цитокинов и включение компенсаторных механизмов контроля воспалительной активности в условиях низкого ударного объема сердца. При аритмии в течении ИБС наблюдался высокий уровень TNF-αRII, IL-17, при снижении показателей IL-2, TGFβ1, и TGFβ2, что отражает включение механизмов реактивности клеток иммунитета – активацию нейтрофильного и ингибицию лимфоцитарного функционирования в патогенезе нарушения ритма. Снижение трансформирующих факторов роста указывает на нарушение процессов фиброзообразования в патогенезе аритмии. При увеличении количества обтурированных коронарных артерий 219 определялось нарастание уровня TNF-α и показателей межклеточного ремоделирования: ММР-9 и ММР-9/TIMP-2, выявлена положительная корреляция между показателями, что указывает на TNF-α опосредованную стимуляцию процессов ремоделирования при распространенном атерогенном поражении. У пациентов с ОАНК, поступивших экстренно, имеющих НК IV степени и клинику критической ишемии НК – отмечалось высокое содержание IL-1β, нарастание ММР-9, ММР-9/TIMP-1, снижение TIMP-1 и адипонектина, что свидетельствует о превалировании провоспалительных и ингибиции противовоспалительных механизмов в ответ на прогрессирование ишемии НК. Поражение крупных артерий нижних конечностей, сопровождаемое более масштабным ишемическим повреждением тканей НК, характеризовалось более выраженной воспалительной реакцией и активацией лейкоцитов, заключающейся в увеличении продукции IFN-γ и ММР-9. С помощью многофакторного анализа были установлены наиболее значимые факторы при различной распространенности и выраженности клинических проявлений АС. При ОАНК наиболее значимой нагрузкой – более 0,7, характеризовались факторы: адипонектин, цитокины (IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-10, TGF-β2), растворимые рецепторы к цитокинам (IL-2R, TNFαRI TNF-αRII) и показатели деградации внеклеточного матрикса (MMP-9, MMP-9/TIMP-2, TIMP-1) (рисунок 59). Факторы составляли 9 главных компонентов, при этом удельный вес каждого компонента был практически одинаковым, что характеризует их равнозначное участие в патогенезе системного атеросклеротического поражения. I и III компоненты были комплексными - включали несколько показателей. Максимальной была доля I компонента - 10,5%, который был представлен: IFN-γ, IL-2, TNF-α и IL-6, что подтверждает их участие в системном ишемическом повреждении тканей и отражает выраженную провоспалительную активность Th-1 типа. III комплексный компонент, представленный TNF-αRI и TNF-αRII характеризует компенсаторную противовоспалительную активность клеток в патогенезе АС, заключающуюся в связывании и инактивации TNF-α. 220 I. (IFN-γ,IL-2, TNF-α, IL-6) 12,00% IX. (TGF-β1) 10,00% II (IL-10) 8,00% 6,00% 4,00% VIII. (Ади III. (TNF-αRI, TNF2,00% понектин) αRII) 0,00% VII. (MMP-9/TIMP2) IV. (TIMP-1) VI. (MMP-9) V. (IL-2R) Рисунок 59 – Анализ главных компонентов при ОАНК Корреляционный анализ взаимодействия факторов между собой в группе пациентов с ОАНК выявил отрицательную обратную связь средней силы адипонектина c трансформирующими факторами роста (TGFβ 1 и TGFβ2) и r=-0,39, разнонаправленность действия (r=-0,35 адипонектина активируется р<0,05). этих продукция Это вероятно, показателей TGFβ1 и – указывает при TGFβ2, на снижении что может способствовать стимуляции процессов фиброзообразования. Установлена отрицательная обратная связь средней силы (r=-0,34, р<0,05) между адипонектином с IL-10, что представляет компенсаторный механизм – снижение адипонектина и его противоагерогенных эффектов стимулирует продукцию противовоспалительного IL-10. Зарегистрированная прямая связь ММР-9 с IL-1β (r=0,71, р<0,05) – подтверждает взаимодействие данных показателей в ходе ремоделирования тканей при системном АС. Прямые связи TNF-α с TGF-β1 (r=0,50, р<0,05), с TIMP-1 (r=0,37, р<0,05), с IL-2R (r=0,47, р<0,05) и IFN-γ с MMP-9/TIMP-2 (r=0,5, р<0,05) - указывают на то, что провоспалительные цитокины: TNF-α и IFN-γ обладают плеотропными эффектами, в частности, – оказывают иммунорегуляторное действие и участвуют в процессах ремоделирования тканей при системном атеросклеротическом повреждении, с преимущественным повреждением НК. 221 При АКА (ИБС) выявлено 6 главных компонентов значимости факторов (рисунок 60). Из них I, III и V компоненты включали одновременное влияние нескольких факторов. Максимальный удельный вес отмечался у I компонента - 26,8%, составляющими которого являлись про- и противовоспалительными цитокины (IL-1β, IL-2 и IL-10). III компонент доля которого занимала 7,8 %, был сформирован IL-6 и IL-17, что, видимо, подтверждает синергичное действие цитокинов при ишемическом повреждении миокарда. Составляющими V комплексного компонента были лептин и TIMP-1, что, характеризует их взаиморегуляцию и совместное участие в процессах сосудистого ремоделирования при коронарном атеросклерозе. VI. (MMP9/TIMP-2) I. (IL-2, IL-10, IL1β) 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% V. (Лептин, TIMP-1) II: (MMP-9/ TIMP-1) III. (IL-6, IL-17) IV: (TGFβ2) Рисунок 60 – Анализ главных компонентов при АКА (ИБС) Выявленные изменения у пациентов с АКА (ИБС) указывают на активацию клеток врожденного иммунитета (высокая значимость нагрузки >0,7 для IL-1β) и нейтрофилов (высокая значимость нагрузки >0,7 для IL-6) и Th-17 (высокая значимость нагрузки >0,7 для IL-17) у пациентов с АКА (ИБС). В группе пациентов с АКА (ИБС) зарегистрированы многочисленные прямые корреляции: IL-1β с IL-2, с растворимым рецептором IL-2 (IL-2R) (r=0,60 и 0,42, р<0,001), c IL10 (r=0,27 р =0,02), c TIMP-1 (r=0,44, р=0,008), с MMP-9/TIMP-2 (r=0,35, р=0,005), с TNF-α (r=0,48, р =0,001), IL-17 (r=0,28, р =0,01), IL-6 (r=0,28, р =0,03), лептином (r=0,24, р =0,05), обратная корреляция IL-1β с адипонектином (r=-0,26, р=0,05), 222 что доказывает его мультифакторное влияние на различные звенья иммунного ответа и процессы ремоделирования при ишемическом повреждении миокарда. Установлены прямые корреляции IL-2 с его растворимым рецептором (r=0,42, р=0,001), IL-10 (r=0,38, р=0,09), IL-17 (r=0,49, р=0,001), IFN-γ (r=0,47, р =0,004) и обратная связь этого цитокина с адипонектином (r=-0,28, р =0,05), что свидетельствует о его мнококомпонентном регуляторном действии. Интерлейкин6 у пациентов с АКА (ИБС) прямо коррелировал с IL-17 (r=0,34, р =0,01), с IL-10 (r=0,35, р=0,03), TNF-α (r=0,45, р=0,002) и с TNF-αRII (r=0,36, р=0,05). Определялась прямая корреляция IL-10 с IL-17 (r=0,33, р=0,005), лептина с TIMP1 и MMP-9/TIMP-1(r=0,23 и 0,4, р <0,05). Выявленные корреляции подчеркивают прямую плеотропную взаиморегуляцию показателей. Полиэтиологичность АС, разнообразие и неоднородность ФР, действующих на организм человека в повседневной жизни, влияние индивидуальной реактивности, наследственных и конституциональных особенностей индивидуума, зачастую затрудняют формирование единой выборки в клинических исследованиях. Экспериментальный метод позволяет обеспечить относительную чистоту выборки для научного изучения; оценить роль определенных факторов риска в повреждении эндотелия; минимизировать погрешности от влияния сопутствующей патологии и в хронологическом порядке отследить инициацию и прогрессирование АС [220, 233, 443, 340, 335]. В целях расширения представления о взаимосвязях факторов врожденного иммунитета с метаболическими нарушениями и их роли в патогенезе заболевания для усовершенствования его диагностики, профилактики и лечения нами было решено разработать адекватную и недорогую экспериментальную модель АС. Экспериментальный раздел включал разработку модели АС на крысахсамцах линии Wistar. На протяжении 6 месяцев на организм 25 животных осуществлялось сочетанное воздействие основных факторов риска АС (ГЛ, АГ и замедления процессов метаболизма) – комплексная модель. Группой сравнения являлась модель, включающая воздействие 2 ФР: жировой нагрузки 223 (экзогенная ГЛ) – и гипотиреоза (эндогенная ГЛ) на организм 15 животных. Контролем служили 15 крыс, питающиеся обычным рационом. По 5 животных из каждой группы выводили из эксперимента под эфирным наркозом, путем декапитации на 2,4 и 6 месяце наблюдения. Проводили забор сыворотки крови, фрагментов аорты, бедренных артерий и печени крыс. Эксперимент проводился со строгим соблюдением требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента и последующей утилизацией. Животным каждой экспериментальной группы проводился мониторинг липидного спектра, уровня цитокинов (IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-10), отражающих активацию Th 1 и Th 2 лимфоцитов, оценивались: содержание MMP-9 и параметры оксидативной активности (ООА, АОА, ОИ) в крови и в артериальной стенке животных. Проводя мониторинг показателей в динамике эксперимента и, сравнивая модели ГЛ, мы пришли к заключению, что комплексная модель являлась наиболее показательной. При этом она была доступна, легко выполнима, хорошо переносилась и не вызывала гибели животных [127]. Считаем, что модель, сочетающая ГЛ, АГ и угнетение процессов метаболизма, может использоваться для изучения патогенеза АС в целях улучшения его диагностики, профилактики и лечения. В ходе эксперимента, нами было установлено, что наиболее выраженные признаки повреждения артерий наблюдались через 6 месяцев воздействия на организм животного патогенных факторов (ГЛ, АГ и угнетения процессов метаболизма). К этому сроку также были выявлены более значительные отклонения и в исследуемых лабораторных тестах. При оценке состояния артериального русла методом магниторезонансной томографии (МРТ) у крыс основной опытной группы (комплексная модель) от 2 к 6 месяцу наблюдения отмечалось прогрессирующее сужение просвета внутренней сонной артерии и грудной части аорты, по сравнению с контрольными крысами, регистрировалось уменьшение ширины просвета подвздошных артерий, определялось неравномерное контрастирование 224 артерий, что предполагает локальные атерогенные изменения их стенок и свидетельствует о мультифокальности поражения артериального русла при сочетанном действии факторов риска АС. При проведенном исследовании содержания NADPH-диафоразы сосудов было зарегистрировано, что в бедренных артериях содержание кофермента было ниже (р<0,05), чем в аорте, как у опытных, так и у контрольных животных, что, вероятно, можно объяснить анатомическими особенностями строения стенок данных сосудов [321]. Уменьшение NADPH-диафоразы сосудов регистрировалось уже на 2 месяце эксперимента с прогрессированием к 6 месяцу исследования. Зарегистрированы структурные изменения аорты и бедренных артерий, наиболее выраженные к 6 месяцу – сужение просвета артерий, их морфологические изменения (нарушение архитектоники эластических волокон, смещение ядер миоцитов на периферию, клеточная инфильтрация стенки, утолщение эндотелия, отложение в стенке жировых включений). При длительном сочетанном воздействии ФР, уже на 2 месяце исследования, наблюдались признаки жировой дистрофии печени (жировые включения и выраженная клеточная инфильтрация в портальных трактах), с прогрессированием изменений к 6 месяцу. При оценке липидного спектра крови в динамике эксперимента было установлено нарастание концентрации общего ХС, ЛПНП и КА (общий холестерин – ЛПВП/ЛПВП) по сравнению с контролем, с максимальными значениями перечисленных показателей на 6 месяце эксперимента. Выявленные изменения спектра липидограммы отражают выраженность воздействия факторов риска АС (ГЛ, АГ и угнетения процессов метаболизма) на организм животных. При анализе содержания цитокинов в крови крыс было установлено – увеличение уровня IL-1β, IFN-γ и IL-10 в комплексной модели, с нарастанием изменений от 2 к 6 месяцу исследования, что указывает на стимуляцию системных (про-, и противовоспалительных) механизмов иммунного реагирования при сочетанном действии ФР АС. Мы не подтвердили результаты Н.С. Юбицкой с соавт. (2009) о системном увеличении содержания TNF-α при ГЛ, что, вероятно, связано с противовоспалительным 225 влиянием ингибиторов цитокина: TNF-αRI, TNF-αRII и IL-10 [159]. Установленная обратная слабая корреляция между IL-10 и TNF-α (r=-0,28, р=0,04) подтверждает ингибицию продукции TNF-α интерлейкином-10. Однако, мы определили влияние анизоморфизма в отношении IL-10, так как в клиническом исследовании у пациентов с АС регистрировалось снижение IL-10 в сыворотке крови. При комплексной оценке удельного веса цитокинов в крови крыс было зарегистрировано значительное увеличение доли IL-1β, нарастание IFN-γ и снижение доли TNF-α и IL-10 в опытной группе животных. При определении цитокинового профиля сосудистой стенки установлена зависимость их локальной продукции от морфологии сосудов. Определено, что в бедренных артериях контрольных крыс – содержание TNF-α было в 2,5 раза ниже, а IL-10 почти в 10 раз ниже, чем в аорте. Видимо, это обусловлено структурным различием сосудов (аорта – артерия эластического типа, тогда как бедренные артерии – мышечно-эластического типа). Особенности морфологического строения, скорость кровотока в сосуде, вероятно, оказывают влияние на функциональную активность клеток продуцентов цитокинов. Зависимость особенностей функциональной активности сосудов от их морфологического строения показана разными исследователями [130, 179, 321, 412]. В аорте крыс опытной группы на 2 месяце эксперимента было выявлено увеличение продукции цитокинов: IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-10, по сравнению с показателями контроля, однако уже на 4 месяце эксперимента содержание TNFα и IL-10 не отличалось от референсных значений, а показатели IL-1β и IFN-γ были несколько ниже контрольного уровня (р=0,06-0,08). К 6 месяцу эксперимента содержание IL-1β в аорте уже было ниже контрольных значений в 5,5 раз, IFN-γ – в 4,4 раза, IL-10 – в 1,9 раз, по сравнению с показателями контроля, (р<0,05), отличий TNF-α не определялось. По нашему мнению, это можно объяснить жировым пропитыванием сосуда, апоптозом клеточных элементов и функциональной инволюцией клеточной стенки в условиях 226 длительного воздействия ФР АС (р<0,05). Выявленные изменения в аорте характеризуют конечную 3 стадию повреждения эндотелия – истощения [110]. В бедренных артериях крыс опытной группы на 2 месяце эксперимента регистрировалось увеличение значений исследуемых цитокинов по сравнению с контрольными животными (IL-1β в 3,2 раза, TNF-α в 2,2 раза, IFN-γ – в 2,8 раз, IL-10 – в 2,4 раза), с постепенным снижением IL-1β, IFN-γ и нарастанием TNF-α и IL-10 к 6 месяцу исследования. Через 6 месяцев действия на организм животных ФР АС содержание IFN-γ, TNF-α, IL-10 все еще оставалось выше контрольных значений, но определялась нормализация значений IL-1β (р<0,05). При этом концентрация цитокинов в бедренных артериях опытных крыс к 6 месяцу эксперимента стала достоверно выше, чем в аорте (р<0,05). Повидимому, в бедренных артериях, в силу их морфологических особенностей, происходила более продолжительная реализация провоспалительной активности лейкоцитов, эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудистой стенки в ответ на повреждение. При оценке удельного веса цитокинов в аорте опытных крыс к 6 месяцу эксперимента выявлено увеличение доли TNF-α и IL-10, уменьшение IFN-γ, и незначительное снижение содержания IL-1β. Изменения удельного веса цитокинов в бедренных артериях опытных крыс повторяли их динамику в аорте – отмечалось нарастание доли TNF-α, при некотором снижении доли IFN-γ и IL-1β. Удельный вес IL-10 практически не изменялся. По нашему мнению, это свидетельствует о том, что иммуноопосредованное повреждение артерий сначала реализуется за счет продукции IFN-γ и IL-1β, а затем опосредуется TNF-α, что согласуется с данными литературы [293, 364]. Из литературных источников следует, что продукция макрофагами TNF-α в очаге атероматоза более выражена, чем в крови [411]. Проведено исследование показателей оксидативной активности. В динамике всего эксперимента было выявлено, что значения ООА в крови опытных крыс превышали контрольные величины, без достоверной разницы показателя в периоде наблюдения – 2,4,6 месяцев. При мониторинге 227 показателей АОА статистически значимых отличий между опытной и контрольной группами животных не было зафиксировано. Выявленное увеличение ООА на протяжении всего периода наблюдения при отсутствии различий показателей АОА от контрольного уровня указывают на системную активацию процессов ПО при действии ФР АС и отсутствие адекватного включения антиоксидантных компенсаторных механизмов. В сосудах крыс зарегистрировано увеличение коэффициента ООА в аорте и бедренных артериях у опытных крыс на 2 месяце исследования с постепенным снижением к 6 месяцу, при этом он стал ниже, чем у контрольных крыс. Таким образом, мы подтвердили данные R. Marfella с соавт. (2011) об активации окислительного стресса в сосудах крыс при гипотиреозе только в относительно раннем его периоде [311]. Значения АОА были выше контрольного уровня на 2 месяце эксперимента с постепенным снижением к 6 месяцу, при этом отмечалось нарастание ОИ. Это указывает на неэффективность механизмов антиоксидантной защиты, направленных на протекцию повреждения эндотелиальных клеток сосудов. В биоптатах бедренных артерий опытных крыс ООА стал ниже контрольного уровня только к 6 месяцу эксперимента. Содержание металлопротеиназы-9 в крови крыс опытной группы было выше, чем у здоровых животных на 2 месяце эксперимента и также постепенно снижалось к 6 месяцу, но при этом не выходило за пределы референсных значений. Зарегистрирована вариабельность локального содержания ММР-9 в зависимости от вида сосуда. В бедренных артериях здоровых крыс уровень ММР-9 был выше, чем в аорте, что, вероятно, объясняется преобладанием в бедренных артериях мышечных волокон и снижением отношения эластин/коллаген. Структурную и функциональную разнородность артерий у крыс показали также P. Basu с соавт. (2010) [179]. Авторы выявили различия в уровне кровотока и продукции ММР и TIMP-3 в аорте, в сонных и бедренных артериях животных, при этом более высокая продукция ММР-9 была ими зарегистрирована в сонных артериях, а увеличение значений TIMP-3 – в аорте. 228 Установлено увеличение показателей ММР-9 на 2 месяце исследования в аорте опытных крыс, что согласуется с данными литературы о повышении локальной продукции ММР-9 при реноваскуляторной гипертензии и гипотиреозе у крыс [243, 311, 440], однако к 6 месяцу показатели желатиназы также снижались. Вероятно, низкий уровень ММР-9, был связан с истощением ее продукции клетками артериальной стенки в условиях действия повреждающих факторов. Не исключено также подавление продукции желатиназы ее тканевыми ингибиторами TIMP [270], или опосредованной межклеточной ингибицией IL10 или TGFβ1 [156, 331]. Нами была зарегистрирована обратная сильная связь между ММР и IL-10 (r=-0,78, р=0,05), что согласуется с данными литературы [331, 418]. Y.M. Zhang с соавт. (2005, 2006) констатировали увеличение системной продукции TIMP-1 и соотношения TIMP-1/MMP-2 и TIMP-1/MMP-9 у стареющих крыс при развитии у них жирового гепатоза [456, 457]. Результаты нашего исследования подтвердили развитие выраженного жирового гепатоза у опытных крыс к 6 месяцу эксперимента. По нашему мнению – уменьшение локального содержания ММР-9 может способствовать нарушению процессов ремоделирования артерий, снижению эластичности сосудистой стенки, склонности к развитию аневризмы и тромбоза. Выявленные корреляции между показателями цитокинов и параметрами липидного метаболизма: прямая сильная связь между ЛПНП и TNF-α (r= 0,89, р=0,04), обратная сильная связь между КА и IL-10 (r= - 0,9, р=0,03) отражают цитокинопосредованную регуляцию обмена липопротеинов. Прямая сильная связь между показателями АОА и уровнем NADPH-диафоразы в аорте опытных крыс (r=0,74 p<0,05) характеризует зависимость активности NO-синтазы от окислительных процессов в ее стенке – подавление прогрессирования повреждения кофермента в условиях действия на организм ФР АС в результате активации механизмов антиоксидантной системы. Одним из этапов нашего экспериментального исследования явилось применение 2-ух препаратов: амино-диоксо-тетра-гидро-фталазиндиона натрия дигидрата (галавита) производства ООО Альтфарм (Россия), регистрационный 229 номер: 000088/03 и субстанции, производства ТИБОХ ДВО РАН – полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-α-D-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus (митилана) [127] и оценка их патогенетических эффектов: иммуномодулирующего, (гиполипидемического, противовоспалительного). антиоксидантного, Препараты применяли перед выведением животного из эксперимента. Галавит (Гт) вводили в/м, в количестве – 1 мг на 1 кг веса, по схеме: 1 инъекция в день, в течение 10 дней, затем 1 инъекция в 3-е суток. Общий курс лечения крыс галавитом составлял – 15 инъекций. Митилан (Мт) вводили per os, в количестве – 10 мг/кг, через день, в течение 1 месяца. Терапию получали 10 животных опытной группы (комплексная модель АС) - 5 крысам вводили Гт, остальные 5 – получали Мт. Результаты показали, что Гт и Мт восстанавливали концентрацию NADPH-диафоразы, как в аорте, так и в бедренных артериях, при их применении происходила нормализация направления волокон стенки аорты и толщины эндотелиальной выстилки, уменьшилась клеточная инфильтрация, и количество жировых включений. При этом более выраженные признаки восстановления структуры бедренных артерий визуализировались при применении Гт. При использовании Гт и Мт происходило восстановление морфологической структуры печени, уменьшались размеры и количество жировых включений в портальных трактах, нормализовались показатели липидограммы, в крови животных статистически значимо снизился уровень IL1β (до уровня контроля), наблюдалась тенденция снижения IFN-γ, значительно увеличивались показатели IL-10 (наиболее выраженно - при применении Мт – в 6,2 раза выше, чем при применении Гт). Зафиксировано, что при использовании Мт и Гт удельный вес IL-1β сыворотки крови значительно снижался. В отношении удельного веса IFN-γ и TNF-α у препаратов был разнонаправленный эффект. При назначении Мт происходило снижение доли IFN-γ, тогда как изменений удельного веса TNF-α при лечении им не происходило. Гт, же, напротив, способствовал увеличению доли TNF-α в 230 сыворотке крови – в 2,5 раз. Тем самым, мы подтвердили данные Т.В. Латышевой с соавт. (2004) о том, что Гт регулирует системную продукцию TNF-α макрофагами, способствуя ее нормализации [67]. При назначении обоих препаратов отмечалось нарастание удельного веса IL-10. Нами был проведен анализ действия препаратов на удельный вес цитокинов в артериях крыс. В аорте группы животных с лечением Мт наблюдалось нормализация IL-1β (увеличение до уровня референсных значений), что можно связать с усилением биоглюканом функциональной активности макрофагов, что согласуется с данными литературы [128]. Данный эффект Мт способствует восстановлению процессов клеточного ремоделирования, однако при этом не исключает усиление процессов пролиферации макрофагов и пролонгирование хронического воспаления в артериальной стенке. Галавит же преимущественно способствовал снижению удельного веса TNF-α и нарастанию IFN-γ в аорте животных, что еще раз доказывает его регуляторную роль в отношении продукции провоспалительных цитокинов. Изменения удельного веса цитокинов в бедренных артериях при применении препаратов практически полностью соответствовали динамике его изменений в аорте крыс. При патогенетической терапии Гт и Мт увеличивались показатели ООА и АОА в крови. Мт при этом способствовал снижению ОИ. В сосудах крыс при применении Гл и Мт происходила нормализация ОИ, при этом Гт вызывал увеличение АОА, а Мт – снижение ООА. В бедренных артериях при применении Мт определялось выраженное уменьшение показателей ООА и ОИ – в 3,1 раз ниже референсных значений (р<0,05). Гт, практически не изменял оксидативную активность в бедренных артериях крыс. При оценке содержания ММР-9 в зависимости от применения патогенетической терапии выявлено, что увеличение ММР-9 в аорте крыс (в 2,2 раза) наблюдалось при применении Мт. Выявленные изменения свидетельствует о том, что репаративный эффект препарата осуществляется посредством активации процессов ремоделирования через усиление расщепления коллагена и вызванное Мт увеличение уровня IL-1β в аорте – одного из активаторов ММР-9, вероятно, этому способствует. 231 При анализе взаимосвязей между цитокинами, показателями оксидативной активности и липидного метаболизма, нами было установлено, что в крови крыс МТ увеличивал количество прямых корреляций между провоспалительными цитокинами: IL-1β, IFN-γ, TNF-α; ООА с общим холестерином и с ЛПНП; IL-1β с КА. Это указывает на то, что эффективность препарата реализуется путем опосредованного сочетанного воздействия на многие провоспалительные факторы. В бедренных артериях Мт усиливал обратную связь провоспалительного IL-1β с противовоспалительным IL-10, что подчеркивает его регуляторную роль на процесс локального воспаления. Гт также способствовал усилению взаимосвязей между показателями. В.А. Куликов (2004) показал, что холестерин у крыс в отличие от человека преобладает в ЛПВП, а увеличение общей оксидантной активности в крови животных способствует усилению образования ЛПВП [63]. Прямые связи ООА с ЛПВП и ММР-9 и ЛПВП в крови крыс, леченных Гт, характеризуют – усиление образования антиатерогенных ЛПВП при повреждении. Увеличение ООА под действием Гт, в то же время снижение показателей IL-1β, тенденция снижения IFN-γ в крови при наличии прямых связей ООА и IL-1β; IFN-γ и IL1β – указывают на цитокинопосредованый контроль оксидативной активности. Увеличение уровня IL-10 под действием Гт и обратные сильные связи IL-10 и ММР; IL-10 и общим ХС; IL-10 и ЛПВП – характеризуют, то, что этот препарат стимулирует противовоспалительный, и регулирует гиполипидемический эффект цитокина. Прямая связь между АОА и TNF-α свидетельствует, о том, что регулируя функциональную активность клеток в сторону системной продукции TNF-α, Гт – одновременно стимулирует антиоксидантную активность крови. Прямая связь между IFN-γ и IL-10 в аорте животных при лечении их Гт свидетельствует о восстановлении локальной продукция цитокинов клетками сосудистой стенки. Таким образом, несмотря на прогресс в области изучения АС, до настоящего времени отсутствуют четкие данные о роли иммунной системы в его инициации и прогрессировании. В ходе проведенного исследования 232 определен функциональный дисбаланс про- и противовоспалительных механизмов иммунного реагирования при АС, выявлены взаиморегулирующие связи между цитокинам и уровнем общего холестерина крови, адипокинами и маркерами деградации межклеточного матрикса при различной локализации и распространенности атеросклеротического процесса, определены наиболее значимые маркеры клинических проявлений атеросклероза. Установлено влияние полиморфизма генов TNF-α (rs1800629), IL-6 (rs1800795), IL-10 (rs1800896) и PTPN22 (rs2476601) на уровень цитокинов и холестерина в крови пациентов с АС, что опосредованно влияет на возникновение, течение и прогноз заболевания. В результате выполнения экспериментального исследования мы определили динамику изменений иммунного реагирования на уровне цитокинов во взаимосвязи с показателями липидного метаболизма, оксидативной активности и уровня ММР-9 (одного из основных маркеров нарушения ремоделирования артериальной стенки) в ответ на сочетанное воздействие 3 факторов риска АС (гиперлипидемии, замедления процессов метаболизма и артериальной гипертензии). Обоснована патогенетическая эффективность препаратов: амино-диоксо-тетра-гидро-фталазиндион натрия дигидрата (галавита) и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-α-Dглюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus (митилана) в комплексной модели атеросклероза у крыс. На основе результатов клинического исследования и выявленных в ходе его взаимосвязей между показателями нами разработана схема патогенеза атеросклероза у человека, с позиций изменений цитокиновой регуляции (рисунок 61; 62) и схема экспериментального АС при воздействии на их организм крыс 3 факторов риска заболевания (гиперлипидемии, угнетения обмена веществ и артериальной гипертензии) (рисунок 63). 233 Рисунок 61 – исследования Патогенез атеросклероза по результатам клинического 234 Рисунок 62 – Участие цитокинов в компенсаторных механизмах реактивности при АС 235 Рисунок 63 – Патогенез экспериментального атеросклероза 236 Выводы: 1. При АС выявлен функциональный дисбаланс про- и противовоспалительных механизмов системного клеточного реагирования на уровне цитокинов (увеличение содержания в сыворотке крови IL-6, TGFβ2, растворимых рецепторов:TNF-α RI, TNF-α RII, IL-2R, снижение уровня IL-2 и IL-10, увеличением доли IL-6, IL-1β, IL-17 и снижение удельного веса IL-2 и IL10). 2. При АС установлено высокое содержание комплекса ММР-9/TIMP-2 и прямая корреляция ММР-9/TIMP-2 с ММР-9, что отражает усиление продукции желатиназы В и ее преимущественное связывание с тканевым ингибитором 2 при атерогенном ремоделировании сосудистой стенки. 3. Установлены взаимосвязи между цитокинами: (IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-2R IL-17, IL-10), гормонами жировой ткани (лептином, адипонектином), общим холестерином крови с показателями деградации межклеточного матрикса, что характеризует влияние регуляторных иммуновоспалительных механизмов на процессы ремоделирования артериальной стенки при атеросклерозе. 4. В патогенезе коронарного атеросклероза иммуноопосредованная провоспалительная активность при АКА (ИБС) представлена более высоким содержанием IL-1β, IL-17 и лептина, их высокой патогенетической значимостью, увеличением удельного веса IL-1β, снижением доли IL-2 и IL-10 в сыворотке крови. Выраженность провоспалительных механизмов у пациентов с ОАНК определяется увеличением содержания IFN-γ, TNF-α, TNF-αRII, IL-6, их высокой патогенетической значимостью, повышением доли IFN-γ и TNF-α в системном соотношении цитокинов. Избыток TIMP-1, при нормальном уровне ММР-9 при ОАНК в крови отражает более выраженную по сравнению с АКА (ИБС) активацию процессов связывания желатиназы В в условиях ишемии НК. 5. Высокая частота встречаемости Т/T варианта гена TGFβ1 (-509 C/T) у пациентов с АС – свидетельствует о предрасположенности к заболеванию. Установлена сопряженность аллельных вариантов иммунорегуляторных генов 237 с уровнем провоспалительных цитокинов (G/G и C/C гомозиготные варианты гена IL-6 (-174G/C) сопряжены с высоким уровнем в сыворотке крови IL-6; А/G вариант гена TNF-α (–308G/A) – с высоким уровнем TNF-α; G/A вариант гена PTPN22 (rs2476601) с высокими значениями IL-2, IFN-γ и высоким содержанием общего ХС крови; G/G вариант гена IL-6 (-174G/C), Т/Т вариант гена TGF-β1 (-509 C/T), А/G и А/А варианты гена TNF-α (–308G/A)) – с уровнем ОХ крови>6,2 ммоль/л) у пациентов с АС, что характеризует предрасположенность к более выраженной системной воспалительной активности и гиперхолестеринемии при носительстве данных генотипов. 6. У пациентов с различной распространенностью и локализацией АС установлены различия в сопряженности полиморфных вариантов имммунорегуляторных генов c содержанием про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови. 7. При длительном воздействии на организм крыс ФР АС (ГЛ, гипотиреоза и АГ) получены изменения липидного профиля крови, локальной и системной продукции цитокинов, оксидантного статуса, содержания ММР-9, нарушения NO-синтетической активности эндотелия, установлены признаки структурного повреждения артериальной стенки и ткани печени животных, проанализированы взаимосвязи между лабораторными и инструментальными параметрами, на основе чего построена схема патогенеза атерогенного повреждения артерий. 8. При экспериментальном моделировании АС у крыс установлены взаимосвязи между показателями системы цитокинов, липидного метаболизма и оксидативной активности. В крови животных - увеличение ЛПНП стимулирует системную продукцию TNF-α, нарастание КА способствует угнетению выработки IL-10. В аорте крыс снижение АОА и провоцирует подавление продукции NADPH эндотелием и способствует локальному нарушению выработки оксида азота. 9. При сочетанном воздействия факторов риска АС на организм крыс определены особенности структурных и функциональных изменений сосудов в 238 зависимости от их морфологического строения. В аорте (сосуде эластического типа) зарегистрировано раннее (со 2 месяца), прогрессирующее нарастание оксидативного индекса, увеличение продукции про- и противовоспалительных цитокинов: IL-1β, IFN-γ, TNF-α и IL-10 с последующим снижением их локального уровня (с 4 по 6 месяц исследования), что характеризует раннее и более выраженное атерогенное повреждение стенки аорты (клеточная инфильтрация, липидоз, нарушение архитектоники эластических волокон) по сравнению с бедренными артериями. В бедренных артериях (сосудах мышечного типа) определено стойкое увеличение содержания IFN-γ, TNF-α и IL-10 на протяжении всей динамики эксперимента, что подтверждает более длительное сохранение функциональной активности клеток артериальной эффективность амино-диоксо- стенки. 10. Подтверждена патогенетическая тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата (Галавита) и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-α-D-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus (митилана) в модели экспериментального АС. Установлено, что Гт обладает более выраженным гиполипидемическим эффектом, способствует нормализации значений TNF-α (увеличивает удельный вес цитокина в крови, и снижает в аорте и бедренных артериях). Мт в большей степени влияет на снижение удельного веса IFN-γ, увеличивает уровень и удельный вес IL-10 в крови крыс, обладает преимущественным локальным и системным антиоксидантным эффектом, нормализует содержание ММР в аорте при длительном воздействии ФР. 239 Практические рекомендации 1. Рассматривать Т/T генотип при оценке полиморфизма гена TGFβ1 (rs1800469) в качестве диагностического маркера предрасположенности к атеросклерозу. Для прогнозирования течения АС проводить типирование аллельных вариантов иммунорегуляторных генов: носительство G/G и C/C гомозиготных вариантов гена IL-6 (-174G/C) сопровождается высоким уровнем в сыворотке крови провоспалительного IL-6, А/G варианта гена TNF-α (–308G/A) - высоким уровнем TNF-α, G/A варианта гена PTPN22 (rs2476601) - высокими значениями провоспалительных цитокинов: IL-2 и IFN-γ. Наличие в геноме G/G варианта гена IL-6 (-174G/C),Т/Т варианта гена TGF-β1 (-509 C/T) , А/G и А/А вариантов гена TNF-α (–308G/A)) ассоциировано с гиперхолестеринемией >6,2ммоль/л). 2. Дополнительными дифференциально-диагностическими критериями нестабильного течения стенокардии являются: уровень IL-6 > 5 пг/мл и лептина > 4 нг/мл в сыворотке крови. 240 Список сокращений Аг - артериальная гипертензия АС – атеросклероз АКА (ИБС) – атеросклероз коронарных артерий с выраженными клиническими проявлениями ишемической болезни сердца Гл – гиперлипидемия Гт – галавит ИБС – ишемическая болезнь сердца ИМ – иммуномодуляторы ЛПВП – липопротеины высокой плотности ЛПНП – липопротеины низкой плотности ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности мЛПНП – модифицированные липопротеины низкой плотности Мт – митилан НС – нестабильная стенокардия ОАНК – облитерирующий атеросклероз нижних конечностей СС – стабильная стенокардия ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания ТГ – триглицериды ХС – холестерин ХСН – хроническая сердечная недостаточность ФВЛЖ – фракция выброса левого желудочка ФК – функциональный класс стенокардии ФР – факторы риска IL – интерлейкины IFN-γ – интерферон γ IL-2R – растворимый рецептор к интерлейкину 2 IL-6R – растворимый рецептор к интерлейкину 6 241 PTPN22 – protein tyrosine phosphatase, non-receptortype 22 (lymphoid) ген, ген протеин-тирозин фосфатазы, не рецепторного типа 22 (регулирующий функциональную активность лимфоцитов). TGF-β – трансформирующий фактор роста β TNF-α – фактор некроза опухоли α TNF-αRI и TNF-αRII –растворимые рецепторы к факторам некроза опухоли α 1 и 2 типа 242 Список литературы 1.Агапова, И.А. Роль хронической персистирующей инфекции в развитии атеросклероза и ишемической болезни сердца / И.А. Агапова // Вест. СанктПетерб. гос. мед. академии им. И. И. Мечникова. – 2007. – № 4. – С. 82-85. 2.Азизова, О.А. Клиническое и прогностическое значение показателей интенсивности свободнорадикальных процессов у больных ишемической болезнью сердца / О.А. Азизова, В.И. Сергиенко, А.Л. Сыркин [и др.] // Вестн. РАМН. – 2009. – № 10. – С. 32-40. 3.Алуханян, О.А. Показатели дифференциальной антиоксидантой диагностике системы облитерирующего крови в атеросклероза и облитерирующего тромбоангиита нижних конечностей / О.А. Алуханян, Ю.Г. Абрамов, С.П. Корочанская // Ангиол. и сосуд. хирургия. – 2007. – Т. 13, № 1. – С. 25-30. 4.Амчиславский, Е.И. Влияние цитокинов на адгезионную и миграционную активность эндотелиальных клеток / Е.И. Амчиславский, И.С. Фрейдлин // Мед. иммунология. – 2005. – Т. 7, № 2-3. – С. 109. 5.Аничков, Н.Н. Основные теоретические положения к дальнейшему изучению проблемы атеросклероза / Н.Н. Аничков // Атеросклероз: мат. конф., посвящ. 80-летию со дня рождения акад. Н. Н. Аничкова / Отв. ред. З. М. Волынский. – Л., 1965. – С. 14-21. 6.Антонова, А.В. Диагностическое значение PAPP-A и маркеров воспаления при остром коронарном синдроме / А.В. Антонова, А.О. Шевченко, Е.В. Кочетова // Вестник РГМУ. – 2005. – №3 (42). – С. 3-5. 7.Архипова, С.Н. Влияние препарата с иммуномодулирующим действием «Галавит» на содержание в крови субпопуляций Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и естественных киллеров у пациентов с эссенциальной артериальной гипертензией / С.Н. Архипова, П.Ф. Литвицкий, 243 Н.В. Стрижова [и др.] // Курский научно-практ. вестн. «Человек и его здоровье». – 2010. – № 4. – С. 26-30. 8.Афанасьев, Ю.И. Генетические аспекты иммуновоспалительного синдрома в клинике ишемической болезни сердца / Ю.И. Афанасьев, А.В. Кузубова, С. Ю. Григорова // Клинико-лабор. консилиум. – 2010. – № 2-3. – С. 19-24. 9.Баранов, А. Аторвастатин в лечении облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей / А. Баранов, А. Обухов, Н. Шаркова, А. Бузин // Врач. – 2007. – № 9. – С. 66-69. 10.Бобрышев, Ю.В. Клеточные механизмы атеросклероза: врожденный иммунитет и воспаление / Ю.В. Бобрышев // Фундам. науки и практика. – 2010. – Т. 1, № 4. – С. 54–59. 11.Бойцов, С.А. Взаимосвязи артериосклероза, атеросклероза и артериальной гипертонии старый вопрос в свете новых данных / С.А. Бойцов // Тер. архив. – 2009. – № 12. – С. 5-11. 12.Бокерия, Л.А. Микрохирургическая реваскуляризация голени и стопы в лечении больных с критической ишемией нижних конечностей / Л.А. Бокерия, В.И. Коваленко, И.М. Калитко [и др.] // Анналы хирургии. – 2009. – № 6. – С. 91-95. 13.Бокерия, Л.А. Ангиопротекция в лечении больных с облитерирующими заболеваниями нижних конечностей / Л.А. Бокерия, В.И. Коваленко, И.М. Калитко, М.Б. Темрезов // Анналы хирургии. – 2010. – №2. – С 8-11. 14.Бокерия, Л.А. Актуальные проблемы хирургического лечения больных с критической ишемией нижних конечностей — пути решения (состояние проблемы) / Л.А. Бокерия, М.Б. Темрезов, В.И. Коваленко [и др.] // Анналы хирургии. – 2011. – №1. – С. 5-9. 15.Бокерия, Л.А. Современные принципы лечения критической ишемии нижних конечностей./ Л. А. Бокерия, Р.А. Абдулгасанов, М.Б. Темрезов // Клин. физиология кровообращения. – 2011. – №2. – С. 12-17. 244 16.Бондаренко, В.М. Микробный фактор и Toll-подобные рецепторы в патогенезе атеросклероза / В.М. Бондаренко, В.Г. Лихоед // Журн. микробиологии. – 2009. – № 6. – С. 107-111. 17.Булатова, Н.И. Влияние приема ликопида на липидный состав клеток крови при атеросклерозе / Н.И. Булатова, М.И. Макарова, Л.В. Бедулева // Рос. аллергол. журн. – 2009. – №. 3. – С. 149-150. 18.Бутрова, С. А. Ожирение и сахарный диабет: общность этиологии и профилактики / С.А. Бутрова, А.А. Плохая // Сахарный диабет. – 2005.– № 3. – С. 45-50. 19.Валитова, Р.М. Исследование маркеров воспаления у больных со стабильным и нестабильным течением ишемической болезни сердца / Р.М. Валитова // Вест. РНМУ. – 2008. – №2. – C. 68-77. 20.Волков, В.И. Изменение уровня матриксной металлопротеиназы-9 у больных со стабильной и нестабильной стенокардией / В.И. Волков, Д.Н. Калашник // Украин. терапевт. журнал. – 2006. – №1. – С. 4-7. 21.Воложин, А.И. Развитие воспаления при дизрегуляции иммунной системы / А.И. Воложин // Врач. – 2009. – № 12. – С. 76-77. 22.Воробьева, Е.Н. Роль дисфункции эндотелия в патогенезе атеросклероза / Е.Н. Воробьева, Г.И. Шумахер, И.В. Осипова // Кардиоваскул. терапия и профилактика. – 2006. – Т. 6, № 5. – С. 129-136. 23.Воронов, Д.А. Прогнозирование результатов методик комплексного лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей, основанного на технологиях стимуляции ангиогенеза / Д. А. Воронов, А.В. Гавриленко, Н.П. Бочков // Кардиология и сердеч.-сосуд. хирургия. – 2011. – Т. 4, № 2. – С. 37-39. 24.Воспаление этиология, патогенез, патогенетическое обоснование принципов терапии: учебно-методический комплекс по дисциплине «Общая патология», «Патология» / под ред. Н.П. Чесноковой. – Саратов.: Изд-во Саратовского мед. ун-та, 2008. – 118 с. 245 25.Гавриленко, А.В. реконструкций и Прогнозирование вероятности результатов прогрессирования артериальных атеросклероза на основании уровня плазменных цитокинов / А.В. Гавриленко, Д.А. Воронов, С.В. Кочетов // Ангиология и сосуд. хирургия. – 2010. – № 3. – С.146-151. 26.Герасимов, А.И. Медицинская статистика: уч. пособие / А.И. Герасимов. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. – 480 с. 27.Гестел, Я.Р. Влияние кардиоселективных бета-адреноблокаторов на смертность пациентов с хронической обструктивной болезнью легких и атеросклерозом / Я.Р. Гестел // Рус. мед. журн. – 2009. – Т. 17, № 8. – С. 542-546. 28.Гиляров, М.Ю. Биохимические маркеры при остром коронарном синдроме / М.Ю. Гиляров, Н.А. Новикова // Ишемическая болезнь сердца. – 2009. – №5. – С.12–17. 29.Гинцбург, А.Л. Экзогенные и эндогенные факторы в патогенезе атеросклероза. Рецепторная теория атерогенеза / А.Л. Гинцбург, В.Г. Лиходед, В.М. Бондаренко // Рос. кардиол. журн. – 2010. – № 2. – С. 92-96. 30.Гитель, Е.П. Роль интерлейкинов в патогенезе атеросклероза / Е.П. Гитель, Д.Е. Гусев, Е.Г. Пономарь // Клин. медицина. – 2006. – № 6. – С.10-14. 31.Горячева, Е.В. Резистентность к ацетилсалициловой кислоте при атеросклерозе сосудов сердца и нижних конечностей / Е.В. Горячева // Врач. – 2008. – № 10. – С. 23-25. 32.Григорьева, А. А. Причины развития резистентности к ингибиторам ФНО альфа и пути ее преодоления / А.А. Григорьева, Е.И. Алексеева, Р.В. Денисова // Вопр. соврем. педиатрии. – 2009. – № 6. – С. 42-47. 33.Громова, А.Ю. Полиморфизм генов семейства интерлейкина 1 человека / А.Ю. Громова, А.С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т.4, № 2. – С. 3-12. 34.Гусева, Л.В. Применение мексидола в комплексном лечении больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей / 246 Л.В. Гусева // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2006. – Прил. 1. – С. 108-112. 35.Дронова, Т.А. Клиническая эффективность и влияние на цитокиновый статус комбинированной антигипертензивной терапии у больных артериальной гипертонией / Т.А. Дронова, Д.В. Поляков // Мед. иммунология. – 2009. – Т. 11, № 1. – С. 49-56. 36.Душкин, М.И. Интеграция сигнальных путей регуляции липидного обмена и воспалительного ответа / М.И. Душкин, E.H. Кудинова, Я.Ш. Шварц // Цитокины и воспаление. – 2007. – №2. – С. 18-25. 37.Егоренкова, Л.В. Состояние системы цитокинов у пациентов с ишемической болезнью сердца, псориазом и их сочетанием / Л.В. Егоренкова, И.М. Корсунская, А.П. Баранов // Междунар. мед. журн. – 2005. – № 3. – С. 14-16. 38.Ефименко, А.Ю. Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани: автореф. дис… канд. мед. наук / А.Ю. Ефименко. – М., 2011. – 26 с. 39.Заболевания иммунной системы. Диагностика и фармакотерапия / Н.М. Калинина, С.А. Кетлинский, С.В. Оковитый, С.Н. Шуденин. – М.: Эксмо, 2008. – 496 с. 40.Запорожец, Т.С. Особенности иммунного и цитокинового статуса у пациентов с атеросклерозом сосудов нижних конечностей / Т.С. Запорожец, К.В. Майстровский, В.Г. Раповка [и др.] // Цитокины и воспаление. – 2011. – Т.10, №3. – С. 68-75. 41.Зотова, И.В. Синтез оксида азота и развитие атеросклероза / И.В. Зотова, Д.А. Затейщиков, Б.А. Сидоренко // Кардиология. – 2002. – Т. 42, № 4. – С. 58-67. 42.Зудин, А.М. Применение препаратов аутокрови при реконструктивных операциях на магистральных сосудах у больных с мультифокальным атеросклерозом / А.М. Зудин // Анналы хирургии. – 2008. – № 2. – С. 52-55. 247 43.Иванова, М.В. Высокая распространенность метаболического синдрома у мужчин с коронарным атеросклерозом в Сибири / М.В. Иванова, А.М. Чернявский, Ю.И. Рагино, М.И. Воевода // Рос. кардиол. журн. – 2010. – № 1. – С. 65-69. 44.Казанцев, А.В. Диагностика прогрессирующего течения облитерирующего атеросклероза бедренно-подколенно-берцовой локализации / А.В. Казанцев, Е.А. Корымасов // Фундам. исследования – 2011. – №1. – С. 62-67. 45.Казанцева, М.О. Изменение показателей цитокинового ряда на фоне терапии аторвастатином у больных прогрессирующей стенокардией / М.О. Казанцева, И.В. Логачева // Мед. иммунология. – 2006. – Т. 8, № 2–3. – С. 398. 46.Капелько, В.И. Активные формы кислорода, антиоксиданты и профилактика заболеваний сердца / В.И. Капелько // Рус. мед. журн. – 2003. – Т. 11, № 21. – С. 1185-1188. 47.Кетлинский, С.А. Цитокины / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев. – СПб.: Фолиант, 2008. – 552 с. 48.Ким, В.Н. Влияние доклинических нарушений сосудистой и вегетативной реактивности на показатели физической работоспособности у молодых мужчин с факторами риска развития атеросклероза / В.Н. Ким, Г.Б. Кривулина, В.М. Шевелев, Р.С. Карпов // Рос. кардиол. журн. – 2007. – № 6. – С. 63-67. 49.Кипрюшина, Ю.О. Влияние митилана на устойчивость к ультрафиолетовому облучению личинок морских беспозвоночных и лимфоцитов человека / Ю. О. Кипрюшина, Н. А. Одинцова, П .А. Лукьянов // Биология моря. – 2010. – Т. 36. № 4. – С. 297-302. 50.Кисляк, О.А. Факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний в развитии болезней, связанных с атеросклерозом / О.А. Кисляк, Н.В. Малышева, Н.Н. Чиркова // Клин. геронтология. – 2008. – Т. 14, № 3. – С. 3-11. 51.Климов, А.Н. Изучение иммунологических механизмов развития атеросклероза и новые методы его диагностики и лечения / А.Н. Климов, 248 В.А. Нагорнев, А.Д. Денисенко // Мед. акад. журн. – 2005. – Т. 5, № 2. – С. 18-32. 52.Климов, А.Н. Холестерин в патогенезе атеросклероза: роль "плохого" и "хорошего" холестерина / А.Н. Климов // Мед. акад. журн. – 2007. – Т. 7, № 1. – С. 4-11. 53.Козловская, Н.Л. Дисфункция эндотелия у больных системной красной волчанкой / Н.Л. Козловская, Е.М. Шилов, С.Ю. Серикова // Тер. архив. – 2010. – № 2. – С. 70-74. 54.Коненков, В.И. Факторы предрасположенности к развитию атеросклероза / В.И. Коненков, И.Г. Ракова, В.Н. Максимов, М.И. Воевода // Бюл. СО РАМН. – 2006. – Т. 120, №2. – С. 56-62. 55.Копица, Н.П. Роль матриксных металлопротеиназ постинфарктного ремоделирования левого в патогенезе желудочка / Н.П. Копица, Н.В. Белая // Междун. мед. журн. – 2010. – №4. – С. 55-58. 56.Корженевская, К.В. Трансформирующий фактор роста - β1 при различном клиническом течении ишемической болезни сердца после операции коронарного шунтирования / К.В. Корженевская, Н.А. Гавришева, А.В. Панов [и др.] // Мед. иммунология. – 2010. – Т. 12, № 6. – С. 521-528. 57.Королева, О.С. Биомаркеры в кардиологии: регистрация внутрисосудистого воспаления / О.С. Королева, Д.А. Затейщиков // Фарматека. – 2007. – № 8-9. – С. 30-36. 58.Косаев, Д.В. гранулоцитов Влияние и Ронколейкина агранулоцитов на метаболический периферической крови у статус больных окклюзивными заболеваниями артерий нижних конечностей / Д.В. Косаев, И.А. Гасанов // Мед. иммунология. – 2005. – Т. 7, № 2-3. – С. 304. 59.Косырева, А.М. Морфофункциональная характеристика иммунной системы самцов и самок крыс вистар / А.М. Косырева, Е.Ю. Симонова, О.В. Макарова // Иммунология. – 2011. – № 2. – С. 81-83. 60.Кошкин, В.М. Место Трентала (пентоксифиллина) в программе лечения хронических облитерирующих заболеваний артерий конечностей и 249 различных сосудистых осложнений / В.М. Кошкин, Л.И. Богданец, О.Д. Наставшева, Е.А. Алексеева // Рус.мед. журн. – 2009. – Т. 17, № 5. – С. 354-456. 61.Кропотов, А.В. Влияние цимифуги даурской и калужницы лесной на некоторые показатели обмена липидов и половую систему (экспериментальное исследование): автореф. дис…. канд. мед. наук / А.В. Кропотов. – Владивосток, 1975. – 19 с. 62.Кузнецов, М.Р. Прогнозирование отдаленных результатов оперативного лечения больных с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей / М.Р. Кузнецов, Б.В. Болдин, В.М. Кошкин [и др.] // Ангиология и сосуд. хирургия. – 2008. – Т. 14, № 1. – С. 106-112. 63.Куликов, В.А. Особенности метаболизма липопротеинов у крыс / В.А. Куликов, А.А. Чиркин // Патол. физиология и эксперим. терапия. – 2004. – № 1. – С. 26-27. 64.Курушкина, О.В. Роль лептина и адипонектина в формировании начальных проявлений атеросклероза у пациентов без ожирения с инсулинорезистентностью: дис… канд. мед, наук / О.В. Курушкина – М., 2010. – 92 с. 65.Кухарчук, В.В. Динамика воспалительного процесса у больных с острым коронарным синдромом и больных со стабильной стенокардией. Сообщение 1. Биохимические и иммунологические аспекты. / В.В. Кухарчук, К.А. Зыков, В.П. Масенко [и др.] // Кардиол. вестн. – 2007. – № 2-3. – С. 13. 66.Лапин, С.В. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний / С.В. Лапин, А.А. Тотолян. – Спб.: Человек, 2010. – 272 с. 67.Латышева, Т.В. Новые возможности направленной иммунологической коррекции на примере отечественного иммуномодулятора "Галавит" / Т.В. Латышева, O.A. Щербакова // Рос. аллерголог. журнал. – 2004. – №1. – С. 77-81. 68.Лиходед, В.Г. Рецепторная теория атеросклероза / В.Г. Лиходед, В.М. Бондаренко, А.Л. Гинцбург // Вестн. РАМН. – 2010. – № 5. – С.11-25. 250 69.Лупач, Н.М. Матриксные металлопротеиназы, оксидантный статус и дисфункция эндотелия с гиперхолестринемией и у пациентов с различными формами ишемической болезни сердца / Н.М. Лупач, Е.А. Хлудеева, П.А. Лукьянов // Рос. мед. журн. – 2010. – № 4. – С. 71-74. 70.Лутай, М.И. Атеросклероз, современный взгляд на патогенез / М. И. Лутай // Український кардіол. журн. – 2004. – № 1. – С. 22-34. 71.Лутай, М.И. Системное воспаление у пациентов с ишемической болезнью сердца: взаимосвязь с клиническим течением и наличием факторов риска / М.И. Лутай, И.П. Голикова, С.И. Деяк, В.А. Слободской // Украин. мед. журн. – 2006. – № 2. – С. 80-83. 72.Лутай, М.И. Мультифокальный атеросклероз: польза статинов / М.И. Лутай // Діабет і сердце. – 2011. – Т. 152, № 6. – С. 40-44. 73.Мазуров, В.И. Иммунологические механизмы в патогенезе коронарного атеросклероза / В.И. Мазуров, С.В. Столов, М.И. Зарайский // Тер. архив. – 2005. – Т. 77, № 9. – C. 24-28. 74.Майстренко, Д.Н. Современные диагностические технологии в определении тактики лечения больных с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей / Д.Н. Майстренко. Ф.К. Жеребцов, В.В. Оссовских [и др.] // Вестн. хирургии. – 2009. – Т. 168, № 2. – С. 41-46. 75.Майстровский, К.В. Влияние иммуномодулятора фукоидана из бурых водорослей fucus evanescens на показатели антиоксидантной системы, липидного и углеводного обмена у мышей / К.В. Майстровский, Т.С. Запорожец, Л.Н. Федянина [и др.] // Тихоок. мед. журн. – 2009. – № 3. – С. 103-105. 76.Матюшевич, В.Б. Факторы риска развития атеросклероза у молодежи / В.Б. Матюшевич // Гиг. и санитария. – 2008. – № 3. – С. 66-69. 77.Медведева, В.Н. Атеросклероз сонных артерий и брюшной аорты при абдоминальном ожирении в молодом и среднем возрасте / В.Н. Медведева, Н.А. Боева // Рос. кардиол. журн. – 2008. – № 5. – С. 21-24. 251 78.Медик, В.А. Математическая статистика в медицине: учеб. пособие / В.А. Медик, М.С. Токмачев. – М.: Финансы и статистика, 2007. – 800 с. 79.Меньшиков, И.В. Аутоиммунные реакции в патогенезе атеросклероза / И.В. Меньшиков, М.И. Макарова, Н.И. Булатова [и др.] // Клин. иммунология. – 2010. – № 5. – С. 242-245. 80.Меньшиков, И.В. Экспериментальная модель атеросклероза у крыс, вызванного иммунизацией нативными липопротеинами человека / И.В. Меньшиков, К.В. Фомина, Л.В. Бедулева, В.Г. Сергеев // Вестн. Удмуртского ун-та. – 2012. – № 1. – С.80-86. 81.Мещерская, К.А. О методике отбора средств, влияющих на обмен холестерина / К.А. Мещерская, Г.П. Бородина, Н.П. Королева // Элеутерококк и другие адаптогены из дальневосточных растений / Под ред. К. А. Мещерской. – Владивосток, 1966. – С. 289-294. 82.Милютина, О.В. Роль хронического воспалительного процесса в прогрессировании атеросклероза у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких в сочетании с артериальной / О.В. Милютина, Е.Н. Чичерина // Пульмонология. – 2009. – №.3. – С. 43-47. 83.Митрохина, Т.В. Патофизиологическая взаимосвязь атеросклероза и остеопороза / Т.В. Митрохина, Е.Ю. Майчук., И.В. Воеводина, Д.А. Сапунова // Мед. помощь. – 2008. – № 5. – С. 11-16. 84.Митьковская, Н.П. Секреторная активность жировой ткани при поражении коронарных артерий у лиц с метаболическим синдромом / Н.П. Митьковская // Мед. журнал. – 2008. – № 4. – С. 43-46. 85.Могиленко, Д.А. Экспрессия гена аполипопротеина А-1 человека в клетках ТНР-1 / Д.А. Могиленко, С.Орлов, А.С. Трулев [и др.] // Мед. иммунология. – 2009. – Т. 11, № 4-5. – С. 325-326. 86.Муругин, В.В. Дегрануляция NК и Т-клеток улиц пожилого возраста / В.В. Муругин, Н.Е. Муругина, М.В. Пащенков // Иммунология. – 2011. – № 5. – С. 239-243. 252 87.Мясоедова, В.А. Механизмы половых различий при атеросклерозе / В.А. Мясоедова, В.П. Карагодин, И.В. Нейфельд [и др.] // Фундам. науки и практика. – 2010. – Т. 1, № 4. – С. 51-59. 88.Назаренко Г.И. Структурные маркеры атеросклероза и генетические полиморфизмы в прогнозировании риска коронарных событий / Г.И. Назаренко, Е.Б. Клейменова, Р.Г. Романов [и др.] // Ультразвуковая и функциональная диагностика. – 2008. – № 6. – С. 119-127. 89.Назаров, П.Г. Реактанты острой фазы / П.Г. Назаров. – СПб: Наука, 2001. – 423 с. 90.Наставшева, О. Комплексная терапия облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей / О. Наставшева, В. Кошкин, Л. Дергачева // Врач. – 2008. – № 7. – С. 61-66. 91.Невзорова, В.А. Роль эндотелиальной дисфункции в прогрессировании метаболического синдрома от факторов риска до сосудистых катастроф / В.А. Невзорова, О.Г. Помогалова, О.В. Настрадин // Тихоок. мед. журн. – 2008. – № 3. – С. 69-74. 92.Невзорова, В.А. Состояние функции сосудистого эндотелия у лиц с факторами риска и больных ишемической болезнью сердца / В.А. Невзорова, В.Б. Шуматов, О.В. Натрадин, Н.В. Захарчук // Тихоокеан. мед. журн. – 2012. – № 2. – С. 37-41. 93.Неймарк, М.И. Периоперационная профилактика сердечно-сосудистых расстройств у больных с атеросклеротическим поражением сосудов / М.И. Неймарк, О.А. Киричук, В.В. Алишкевич, Т.В. Переверзева // Вест. интенсивной терапии. – 2009. – № 4. – С. 41-46. 94.Непомнящих,Л.М. Морфологические проявления «атеросклеротического сердца» (патологоанатомическое и экспериментальное исследование) / Л.М. Непомнящих, В.Д. Розенберг // Бюл. СО РАМН. – 2006. – Т. 120, №2. – С. 128-122. 95.Никитин, Ю.П. Связь полиморфизма С1858T гена PTPN22 с аутоиммунным тиреоидитом с исходом в гипотиреоз в популяции Новосибирска / 253 Ю.П. Никитин, О.Д. Рымар, В.Н. Максимов [и др.] // Клин. и эксперим. тиреодология. – 2009. – № 1. – С. 47. 96.Новик, Г.А. Механизмы аллергических реакций и методы аллергообследования в клинической практике: учебно-метод. пособие / Г.А. Новик, под ред. И.М.Воронцова – СПб.: Издание ГПМА, 2004. – 76 с. 97.Новицкий, В.В. Роль активных форм кислорода и белков семейства BCL-2 в реализации ФНО-альфа-опосредованного апоптоза лимфоцитов / В.В. Новицкий // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2010. – № 2. – С. 139-142. 98.Овчинникова, Л.К. Школа фармаколога: что нужно знать об атеросклерозе / Л. К. Овчинникова, И. Р. Ягудина, Е. А. Овчинникова // Рос. аптеки. – 2007. – № 14. – С. 26–28. 99.Орлова, Я.А. Оценка жесткости магистральных артерий: новые перспективы неинвазивной диагностики коронарного атеросклероза / Я.А. Орлова // Тер. архив. – 2009. – Т. 81, № 5. – С. 14-20. 100.Ошорова, С.Д. Влияние антигипертензивной терапии на активность адипокинов и эндотелина-1 у больных артериальной гипертонией с ожирением / С.Д. Ошорова, Т.И. Романцова, Т.Е. Морозова // Ожирение и метаболизм. – 2011, № 2. – С.26-31. 101. Палеев, Ф.Н. Изменение интерлейкина-6 при различных формах ишемической болезни сердца / Ф.Н. Палеев, И.С. Абудеева, О.В. Москалец, И.С. Белокопытова // Кардиология. – 2010. – № 2. – С. 69-72. 102.Патофизиология сердечно-сосудистой системы / под ред. Л. Лилли; пер. с англ. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010. – 672 с. 103. Перегуд, Д.И. Иммуномодулятор галавит ослабляет проявления синдрома отмены морфина у крыс роль нитрергической системы мозга / Д.И. Перегуд, М.В. Онуфриев, Л.К. Егорова [и др.] // Нейрохимия. – 2005. – № 3. – С. 187-194. 254 104.Пигаревский, П.В. Иммунная система, атеросклероз и персистирующая инфекция / П.В. Пигаревский, С.В. Мальцева, В.Г. Селиверстова // Вест. РАМН. – 2005. – № 2. – С. 17-19. 105.Плоткин, В.Я. Острый период инфаркта миокарда и генетическая предрасположенность. Сообщение I. Полиморфизмы гена фактора некроза опухолей альфа (TNFA) / В.Я. Плоткин, Т.Э. Иващенко, В.Л. Воронель [и др.] // Вест. С-Петерб. ун-та. – 2007. – № 3. – С. 11–31. 106.Плохотников, К.Э. Статистика: учеб. пособие / К.Э. Плохотников, С.В. Колков. – М.: Флинта: МПСН, 2010. – 288 с. 107.Подколзин, А.А. Коррекция ферментов антиоксидантной системы старых мышей новым иммуномодулятором «Галавит» / А.А. Подколзин, В.И. Донцов, О.М. Бабижаева // Ежегодник национ. геронтол. центра. – 2001. – Вып. 4. – С. 81-83 108.Покровская, Е.В. Атеросклероз и иммунная система (по материалам семинара Европейского общества атеросклероза) / Е.В. Покровская // Кардиология. – 2001. – № 10. – С. 69-73. 109.Пономарева, С.В. Толщина комплекса интима-медиа общей сонной артерии и маркеры воспаления у больных ишемической болезнью сердца: автореф. дис…. канд. мед. наук / С.В. Пономарева. – М., 2004. – 23 с. 110.Потапова, Е.С. Состояние функции сосудистого эндотелия и маркеры воспаления в прогнозировании острого коронарного синдрома: дис. ... канд. мед. наук / Е.С. Потапова. – Владивосток, 2005. – 125 с. 111.Противовоспалительные механизмы в сосудистой стенке при атеросклерозе [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://yondertoxin.narod.ru/doclad01.htm 112.Рагино, Ю.И. Изменение содержания провоспалительных цитокинов и деструктивных металлопротеиназ в процессе развития атеросклеротического очага до нестабильной бляшки / Ю.И. Рагино, А.М. Чернявский, Я.В Полонская [и др.] // Кардиология. – 2009. – № 6. – С. 43-50. 255 113. Рагино, Ю.И. Окислительно-антиоксидантные изменения при формировании нестабильной атеросклеротической бляшки / Ю.И. Рагино, А.М. Чернявский, Я.В. Полонская [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 11. – С. 500-503. 114.Рагино, Ю.И. Уровни липидных и нелипидных биомаркеров в крови у мужчин с коронарным атеросклерозом в Новосибирске / Ю.И. Рагино // Рос. кардиолог. журн. – 2009. – № 2. – С. 31-35. 115.Ребров, А.П. Роль воспалительных и инфекционных факторов в развитии атеросклероза / А.П. Ребров, И.В. Воскобой // Тер. архив. – 2004. – Т. 76, №. 1. – С. 78-82. 116.Ройтберг, Г.Е. Метаболический синдром и распределение жировой ткани: точки соприкосновения Г.Е. Ройтберг, Ж.В. и Дорош, противоречивость взаимоотношений О.В. // Курушкина / Профилактическая медицина. – 2010. – № 1. – С. 22-25. 117.Рыдловская, А.В. Функциональный полиморфизм гена TNFA и патология / А.В. Рыдловская, А.С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, № 3. – С. 4-10. 118.Савельев, В.С. Патогенез и консервативное лечение тяжелых стадий облитерирующего атеросклероза нижних конечностей / В.С. Савельев, В.М. Кошкин, А.В. Каралкин. – М.: Мед. информационное агентство, 2010. – 216 с. 119.Самовилова, Н.Н. Церамиды аорты человека в норме и при атеросклерозе / Н.Н. Самовилова, Е.В. Грачева, Н.К. Голованова [и др.] // Кардиолог. вестн. – 2006. – Т. I (XIII) – № 1. – С.38-42. 120.Санникова, А.А. Иммуномодулирующее действие глюкозаминил-мурамилдипептида при измененном липидном обмене и атеросклерозе / А.А. Санникова, Н.Н. Чучкова, Э.Ш. Гайсина // Вестн. Уральской мед. акад. науки. – 2008. – № 1. – С.64-66. 121.Сергеенко, И.В. Влияние реваскуляризации миокарда на динамику сосудистого эндотелиального и трансформирующего факторов роста у 256 больных ишемической болезнью сердца / И.В. Сергеенко, А.Е. Семенова, В.П. Масенко, Л.И. Хабибуллина // Кардиоваскул. терапия и профилактика. – 2007. – Т.6, № 5. – С. 12-17. 122.Силина, Т. С. Клинические и патофизиологические особенности хронической сердечной недостаточности у пациентов старческого возраста с ожирением: автореф. дис… канд. мед. наук / Т.С. Силина. – Самара, 2012. – 19 с. 123.Симбирцев, А.С. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления / А.С. Симбирцев, А.Ю. Громова // Цитокины и воспаление. – 2005. –Т. 4, № 1. – С. 3-10. 124.Симбирцев, А.С. Влияние ИЛ-1β на поведение крыс в условиях слабой стрессорной нагрузки при тестировании в открытом поле / А.С. Симбирцев // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2009. – № 11. – С. 488-490. 125.Система цитокинов: теоретические и клинические аспекты / под ред. В.А. Козлова, С.В. Сенникова. – Новосибирск: Наука, 2004. – 324 с. 126.Смирнов, И.Е. Интерлейкины и оксид азота при пороках развития легких и бронхов у детей / И.Е. Смирнов, А.Г. Кучеренко, Ц.Уртнасан // Рос. педиатр. журн. – 2010. – № 1. – С. 12-17. 127.Способ моделирования атеросклероза: заявка 2500041, Российская Федерация; МПК G09B23/28 / Маркелова Е.В., Турмова E.П., Григорюк А.В. заявитель и патентообладатель Владив. гос. мед. ун-т; заяв. 20.12.2012; опубл. 27.11.2013 128.Средство, обладающее иммуномодулирующим, противовоспалительным и ранозаживляющим действием: заявка 2379044, Российская Федерация; МПК A61K35/56 / В.И. Молчанова, И.В. Чикаловец, О.В. Черников и др.; заявитель и патентообладатель ТИБОХ ДВО РАН; заяв. 24.11.08; опубл.20.01.2010. 129.Статистика: учебник / под ред. И.И. Елисеевой. – М.: Юрайт, 2010. – 565 с. 257 130.Столов, С.В. Цитокиновая активность в крови и сосудистой стенке у больных ИБС / С.В. Столов, В.И. Мазуров, М.И. Зарайский // Мед. иммунология. – 2006. – Т. 8, № 2-3. – С. 406. 131. Стрижова, Н.В. Активность матриксных металлопротеиназ ММП-2 и ММП-9 в сыворотке крови у пациенток с гиперплазией эндометрия в периоде перименопаузы / Н.В. Стрижова, Г.М. Соболева, А.И. Ибрагимов, Е.А. Рейснер // Акуш. и гинекология. – 2010. – № 1. – С. 65-66. 132. Судомоина, М.А. Комплексный анализ ассоциации полиморфизма генов воспаления с инфарктом миокарда / М.А. Судомоина, Т.С. Сухинина, Р.М. Барсова [и др.] // Молекул. биология – 2010. – Т. 44, № 3. – С. 463-471. 133.Тепляков, А.Т. Роль цитокинов в улучшении стратификации риска коронарного рестеноза после эндоваскулярного стентирования у больных ИБС / А.Т. Тепляков, Е.В. Рыбальченко, С.Е. Мамчур, Т.Е. Суслова // Тер. архив. – 2008. – №9. – С. 45-52. 134.Титов, В.Н. Общность атеросклероза и воспаления: специфичность атеросклероза как воспалительного процесса (гипотеза) / В.Н. Титов // Клин. лаб. диагностика . – 2006. – № 4. – С. 310. 135.Титов, В.Н. Сочетанные нарушения эссенциальных жирных кислот и эндотелийзависимой вазодилатации в патогенезе артериальной гипертонии и атеросклероза / В.Н. Титов // Клин. лаб. диагностика. – 2008. – № 10. – С. 3-14. 136.Толмачева, Н.В. Исследование риска атеросклероза в условиях экспериментального моделирования / Н.В. Толмачева, В.Л. Сусликов // Успехи совр. естествознания. – 2007. – № 12. – С. 61-62. 137. Турна, А.А. Матриксные металлопротеиназы и сердечно-сосудистые заболевания / А.А. Турна, Р.Т. Тогузов // Артериальная гипертензия. – 2009. – Т. 15, №5. – С. 533-538. 138.Фалько, Е.В. Нарушения липидного обмена при псориатической болезни / Е.В. Фалько, Б.С. Хышиктуев // Дальневосточный мед. журнал. – 2009. – № 2. – С. 118-122. 258 139.Фомина, К.В. Изменение уровня липопротеинов у крыс, иммунизированных гетерологичными нативными липопротеинами низкой плотности / К.В. Фомина, С.В. Цыпленкова, Л.В. Бедулева, И.В. Меньшиков // Вестн. Уральской мед. акад. науки. – 2010. – № 2/1. – С. 219-220. 140.Фомина, К.В. Новая экспериментальная модель атеросклероза у крыс / К.В. Фомина, И.В. Меньшиков, Е.И. Кузнецова // Вестн. Уральской мед. акад. науки. – 2012. – Вып.4 (41) – С. 175. 141.Хайруллин, Р.Н. Об эффективности неинвазивных методов лечения больных атеросклерозом / Р.Н. Хайруллин, Н.К. Крутикова // Казан. мед. журн. – 2008. – Т. 89, № 6. – С. 775-777. 142.Хаитов, Р.М. Норма и патология: учебник / Р.М. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович – М.: Медицина, 2010. – 752 с. 143.Цурко, В.В. Роль медиаторных механизмов в иммунопатогенезе воспаления при сердечно-сосудистых заболеваниях и остеопорозе / В.В. Цурков, И.В. Леоненко, И.В. Егоров, М.Я. Красносельским // Тер. архив. – 2009. – № 6. – С. 92-96. 144. Черников, О.В. Биологически активные вещества из отходов переработки пищевой мидии / О.В. Черников, В.И. Молчанова, И.В. Чикаловец, П.А. Лукьянов [и др.] // Современное состояние и перспективы развития пищевой промышленности и общественного питания: сб. матер. III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, Челябинск, 11 дек. 2009 г – Челябинск, 2009. – С. 1-3. 145.Чернявский, А.М. Уровни воспалительных и деструктивных биомаркеров в крови при коронарном атеросклерозе разной степени выраженности / А.М. Чернявский, Ю.И. Рагино, М.И. Воевода [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2010. – № 5. – С. 520-523. 146.Черпаченко, Н.М. Влияние статинов на содержание липидов в интиме аорты человека при атеросклерозе по данным компьютерной морфометрии / Н.М. Черпаченко, И П. Дробкова, В.С. Жданов // Кардиология. – 2008. – Т. 48, № 5. – С. 4-9. 259 147.Чубриева, С.Ю. Жировая ткань как эндокринный регулятор (обзор литературы) / С.Ю. Чубриева, Н.В. Глухов, А.М. Зайчик // Вестн. С-Петерб. ун-та. – 2008. – 11 (1) – С. 1-43. 148.Чукаева, И.И. неинфекционными Роль воспалительных заболеваниями / И.И. процессов Чукаева, у больных В.А. с Алешкин, А.А. Александров, Н.В. Орлова // Инфекц. болезни. – 2007. – Т. 5, № 2. – С. 62-71. 149.Шаврин, А.П. Маркеры воспаления в процессе развития атеросклероза / А.П. Шаврин, Я.Б. Ховаева, В.А. Черешнев // Кардиоваск. терапия и профилактика – 2009. – Т 8, № 3. – С. 13-15. 150.Шальнев, В.И. Роль воспалительных факторов в патогенезе атеросклеротического поражения сосудов / В.И. Шальнев // Рос. семейный врач. – 2005. – Т. 9, № 3. – С. 4-11. 151.Шарафеев, А.З. Эндоваскулярное лечение больных мультифокальным атеросклерозом в клинике без кардиохирургической службы / А.З. Шарафеев, Р.Ф. Акберов, В.В. Коробов // Мед. визуализация. – 2009. – № 1. – С. 100-108. 152.Швальб, П.Г. Антиоксидантная защита и функциональное состояние эндотелия у больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей до и после оперативного лечения / П. Г. Швальб, Р. Е. Калинин // Хирургия. – 2009. – № 1. – С. 53-55. 153.Шварц, В.А. Воспаление жировой ткани и атеросклероз / В.А. Шварц // Кардиология. – 2009. – № 12. –С. 80-86. 154.Шварц, Я.Ш. Реактивность макрофагальной системы при фибропластических процессах воспалительного генеза: оценка, механизмы регуляции и патогенетическое значение: дис. … докт. мед. наук / Я.Ш. Шварц. – Новосибирск, 2011. – 336 с. 155.Шин, Е.В. Клиническое значение адипонектина и лептина у больных ишемической болезнью сердца: автореф. дис… канд. мед наук / Е.В. Шин. – М., 2011. – 22 с. 260 156. Шляхто, Е.В. Влияние индуцированного воспаления на метаболизм коллагена в атеросклеротических бляшках у мышей // Е.В. Шляхто, Н.А. Гавришева, О.А. Овчинникова, Г.К. Ханссон // Мед. иммунология. – 2008. – Т. 10, № 6. – С. 507-512. 157.Шмелева, В.М. Состояние окислительной и антиокислительной систем у больных с атеросклерозом при наличии и отсутствии гипергомоцистеинемии / В.М. Шмелева, Л.П. Рыбакова // Казан. мед. журн. – 2008. – Т. 89, № 3. – С. 281-285. 158. Щукин, Ю.В. Влияние кратковременной высокодозной терапии аторвастатином на состояние окислительного стресса и эндогенного воспаления у больных с распространенным атеросклерозом / Ю.В. Щукин, А.Н. Вачев, В. А. Дьячков [и др.] // Казан. мед. журн. – 2008. – Т. 89, № 3. – С. 298-303. 159.Юбицкая, Н.С. Роль фактора некроза опухоли в развитии метаболического синдрома / Н.С. Юбицкая, М.В. Антонюк, Л.В. Веремчук, К.К. Ходосова // Тер. архив. – 2009. – № 11. – С. 59-63. 160. Яхонтов, Д.А. Нарушения в системе цитокинов и оксидантный стресс у больных хронической сердечной недостаточностью различных возрастных групп / Д.А. Яхонтов, И.А. Сукманова, Д.М. Дымова // Вестн. РАМН. – 2010. – № 2. – С. 25-28. 161.Abbate, A. Effects оf interleukin-1 blockade with anakinra to prevent adverse cardiac remodeling following acute myocardial infarction: results of the vcu-art2 pilot study / A. Abbate, B. van Tassell, G. Biondi-Zoccai [et al.] // J. Am Coll. Cardiol. – 2013. – №. 10. – Vol. 61. – P. 10. 162.Adya, R. Protective actions of globular and full-length adiponectin on human endothelial cells: novel insights into adiponectin-induced angiogenesis / R. Adya, B.K. Tan, J. Chen, H.S. Randeva // J. Vasc. Res. – 2012. – Vol. 493, № 6. – P. 534-543. 261 163.Al Awadhi, S. A. Associations of adipokines & insulin resistance with sex steroids in patients with breast cancer / S. A. Al Awadhi, R. M. Al Khaldi, T. Al Rammah, K. Kapila [et al.] // J. Med. Res. – 2012. – Vol.135, № 4. – P. 500-550. 164.Al-Attas, O.S. Association of body mass index, sagittal abdominal diameter and waist-hip ratio with cardiometabolic risk factors and adipocytokines in Arab children and adolescents / O.S Al-Attas, N.M. Al-Daghri, M.S. Alokail , K.M. Alkharfy [et al.] // BMC Pediatr. – 2012. – Vol. 7, № 12. – P. 119. 165.Al-Azzam, S. I. Atorvastatin treatment modulates the interaction between leptin and adiponectin, and the clinical parameters in patients with type II diabetes / S. I. Al-Azzam, A. M. Alkhateeb, K. H. Alzoubi [et al] // Exp. Ther. Med. – 2013. – Vol. 6, № 6. – P. 1565-1569. 166.Alexander, M. R. Genetic inactivation of IL-1 signaling enhances atherosclerotic plaque instability and reduces outward vessel remodeling in advanced atherosclerosis in mice / M. R. Alexander , C.W. Moehle, J.L. Johnson [et al.] // J. Clin. Invest. – 2012. – Vol. 122, №. 1. – P.70-79. 167. Allison, B. Reiss Glass Atherosclerosis: immune and inflammatory aspects / B. Reiss Allison, D. Amy // J. of invest. med. – 2006. – Vol. 54, № 3. – P.123-131. 168.Anakwue, R.C. Cardiovascular Disease Risk Profiling in Africa: Environmental Pollutants are not on the Agenda / R.C. Anakwue, A.C. Anakwue [electronic resource] // Cardio. Toxicol. – 2014. – Аccess mode: http:// link.springer.com/article/10.1007%2Fs12012-013-9242 169.Angel, K. Tumor necrosis factor-alpha antagonists improve aortic stiffness in patients with inflammatory arthropathies: a controlled study / K. Angel , S.A. Provan, H.L. Gulseth [et al.] // Hypertension. – 2010. – Vol. 55, № 2. – P.333-588. 170.Anogeianaki, A. Atherosclerosis: a classic inflammatory disease / A. Anogeianaki, D. Angelucci, E. Cianchetti, M.D.'Alessandro [et al.] // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. – 2011. – Vol. 24, № 4. – P. 817-825. 171.Apostolakis, S. IL-1 Cytokines in Cardiovascular Disease: Diagnostic, Prognostic and Therapeutic Implications / S. Apostolakis, K. Vogiatzi, 262 E. Krambovitis [et al.] // Cardiovascular & Hematological Agents in Medicinal Chemistry. –2008. –№. 6. – P. 150-158. 172.Aquino, A.R. Molecular survey of atheromatous plaques for the presence of DNA from periodontal bacterial pathogens, archaea and fungi / A.R. Aquino, K. C. Lima, M.S. Paiva [et al.] // J. Periodontal. Res. – 2011. – Vol. 46, № 3 – P. 305-309. 173.Aronis, K.N. Leptin administered in physiological or pharmacological doses does not regulate circulating angiogenesis factors in humans / K.N. Aronis, K.N. Diakopoulos, C.G. Fiorenza [et al.] // Diabetolog. – 2011. – Vol. 54, № 9. – P. 2358-2367. 174. Aspirin for the prevention of cardiovascular disease: U.S. Preventive Services Task Force recommendation statement // Ann. Intern. Med. – 2009. – Vol. 150, №6 – P. 396-404. 175.Assimes, T. Susceptibility locus for clinical and subclinical coronary artery disease at chromosome 9p21 in the multi-ethnic ADVANCE study / T. Assimes, J.W. Knowles, A. Basu // Hum. Mol. Genet. – 2008. – Vol. 17. – P. 2320-2328. 176.Adela, M.V. Cytokine gene polymorphisms in the susceptibility to acute coronary syndrome. Genet Test Mol. Biomarkers / M.V. Adela, B.M.S. Babe, B.P. Reddy [et al.] // Genet. Test. Mol. Biomarkers. – 2012. – Vol. 16, № 5. – P. 359-365. 177. Boa, J. P. Lepton plays a catabolic role on articular cartilage / J.P. Boa, W.P. Chen, J. Fang [et al.] // Mol. Biol. Rep. – 2010. – Vol. 37, № 7. – P. 3265-3272. 178.Barrett-Connor, E. Coronary artery calcium versus intima-media thickness as a measure of cardiovascular disease among asymptomatic adults (from the Rancho Bernardo Study) / E. Barrett-Connor, G.A. Laughlin, C. Connor // Am. J. Cardio. – 2007. – Vol. 99, № 2. – P. 227-231. 179.Base P. Blood flow inters plays with elastin: collagen and MMP: TIMP ratios to maintain healthy vascular structure and function / P. Base, U. Seen, N. Tragi, S. C. Tragi // Vass. Health. Risk. Manga. – 2010. – Vol. 15, № 6. – P. 215-228. 263 180.Beat, J. Meyer MD Inhibition of Interleukin-6 Receptor: A Target of Atherosclerosis Prevention [electronic resource] // J. Watch. Cardio. – 2012. – Аccess mode: http://cardiology.jwatch.org/cgi/content/full 181.Benaitreau, D. Effects of adiponectin on human trophoblast invasion / D. Benaitreau, E. Dos. Santos, M. C. Leneveu [et al] // J. Endocrinol. – 2010. – Vol. 207, № 1. – P. 45-53. 182.Bennet, .M. Association of apolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronary risk / A.M. Bennet, E. Angelantonio, F. Wensley [et al.] // JAMA. – 2007. – Vol. 298. – P. 1300-1311. 183.Berrahmoune, H. Association between TNF and IL-1 bloc polymorphisms and plasma MCP-1concentration / H. Berrahmoune, B. Herbeth, J.V. Lamont, P.S. Fitzgerald [et al.] // Atherosclerosis. – 2007. – Vol. 192, № 2 – P. 348-353. 184.Bilbao, M.G. Differential effects of leptin on ovarian metalloproteinases and their tissue inhibitors between in vivo and in vitro studies / M. G. Bilbao, M.P. Di Yorio, A. G. Faletti // J. Endocrinol. – 2011. – Vol. 209, № 1. – P. 65-74. 185.Bismuth, J. Ceramide: A Common Pathway for Atherosclerosis? / J. Bismuth, P. Lin, Q. Yao [et al] // Atherosclerosis. – 2008. – Vol. 196, № 2. – P. 497-504. 186.Boddi, M. Hepatitis C virus RNA localization in human carotid plaques / M. Boddi, R. Abbate , B. Chellini [et al.] // J. Clin. Virol. – 2010. – Vol. 47, № 1. – P. 72–75. 187.Bouloumie, A. Adipocyte produces matrix metalloproteinases 2 and 9: involvement in adipose differentiation / A. Bouloumie, C. Sengenes, G. Portolan [et al.] // Diabetes. – 2001. – Vol. 50, № 9. – P. 2080-2086. 188.Bouwman, J.J. Infection-induced inflammatory response of adipocytes in vitro / J.J. Bouwman, F.L. Visseren, K.P. Bouter, R.J. Diepersloot // Int. J. Obes. (Lond). – 2008. – Vol. 32, № 6. – P. 892-901. 189.Bowden, K. OSBP negatively regulates ABCA1 protein stability / K. Bowden, N. D. Ridgway // J. Biol. Chem. – 2008. – Vol. 283, № 26. – P. 18210-18217. 190.Briguori, C. Novel approaches for preventing or limiting events (Naples) II trial: impact of a single high loading dose of atorvastatin on periprocedural myocardial 264 infarction / C. Briguori, G. Visconti, A. Focaccio // J. Am. Coll. Cardiol. – 2009. – Vol. 54, № 23. – P. 2157-1263. 191.Butcher, M. J. The IL-17A/IL-17RA Axis Plays a Proatherogenic Role via the Regulation of Aortic Myeloid Cell Recruitment / M. J. Butcher, B. N. Gjurich, T. Phillips, E. V. Galkina // Circ. Res. – 2012. – Vol. 110. №.2. – P. 675-687. 192.Calder, P.C. The role of marine omega-3 (n-3) fatty acids in inflammatory processes, atherosclerosis and plaque stability / P.C. Calder // Mol. Nutr. Food. Res. – 2012. – Vol. 56, № 7. – P. 1073-1078. 193.Carlson, L.A. Nicotinic acid: the broad-spectrum lipid drug. A 50thanniversary review / L.A. Carlson // J. Intern. Med. – 2005. – Vol. 258. – P. 94-114. 194.Carvalho, J.F. Vaccination, atherosclerosis and systemic lupus erythematosus / J. F. Carvalho, R.M.R. Pereira, Y. Shoenfeld // Lupus. — 2009. – Vol. 18, № 13. – P. 1209-1212. 195.Cavusoglu, E. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) is independent predictor of all-cause mortality, cardiac mortality, and myocardial infarction / E. Cavusoglu, C. Ruwende, V. Chopra // Am. Heart. J. – 2006. – Vol. 151, №5. – P. 1101-1108. 196.Ceci, R. Acute, but not chronic, leptin treatment induces acyl-CoA oxidase in C2C12 myotubes / R. Ceci, S. Sabatini, G. Duranti [et al.] // Eur. J. Nutr. – 2007. – Vol. 46, № 6. – P. 364-368. 197.Chasman, D.I. Polymorphism in the apolipoprotein(a) gene, plasma lipoprotein (a), cardiovascular disease, and low-dose aspirin therapy / D.I. Chasman, D. Shiffman, R.Y. Zee [et al.] // Atherosclerosis. – 2009. – Vol. 203, №2. – P. 371-376. 198.Chen, S. Emerging role of IL-17 in atherosclerosis / S. Chen, T. R. Crother, M. Arditi // J. Innate Immun. – 2010. – Vol. 2, № 4. – P. 325-333. 199.Chen, S. IL-17A is proatherogenic in high-fat diet-induced and Chlamydia pneumoniae infection-accelerated atherosclerosis in mice / S. Chen, K. Shimada, W. Zhang [et al.] // J. Immunol. – 2010. – Vol. 185, № 9. – P. 5619 -5627. 265 200.Cheng, X. The Th17/T reg imbalance in patients with acute coronary syndrome / X. Cheng, X. Yu, Y.J. Ding, Q.Q. Fu [et al.] // Clin. Immunol. – 2008. – Vol. 127, № 1. – Р. 89–97. 201.Chiba, T. Leptin deficiency suppresses progression of atherosclerosis in apoEdeficient mice / T. Chiba, S. Shinozaki, T. Nakazawa [et al.] // Atherosclerosis. – 2008. – Vol. 196. – P. 68–75. 202.Chu, N F. Association between interleukin-6 receptor gene variations and atherosclerotic lipid profiles among young adolescents in Taiwan / N. F. Chu, L.F. Hung, C.H. Chuan [et al.] // Lipids in Health and Disease – 2011. –Vol. 136, №. 10. – P.1-9. 203.Ciftci Dogansen, S. The relationship between early atherosclerosis and endothelial dysfunction in type 1 diabetic patients as evidenced by measurement of carotid intima-media thickness and soluble CD146 levels: a cross sectional study / S. Dogansen Ciftci, A. Helvaci, M. Adas, S. Deniz Onal // Cardiovasc. Diabetol. – 2013. – Vol. 12, № 1. – P. 153. 204.Cooney, B.S. The effect of omega-3 fatty acids on the atherogenic lipoprotein phenotype in patients with nephrotic range proteinuria / B.S. Cooney, J. Packard, C.J. Caslake, M.J. Deighan [et al.] // Clin. Nephrol. – 2012. – Vol. 77, № 6. – P. 445-453. 205.Couper, K.N. IL-10: the master regulator of immunity to infection / K.N. Couper, D.G.Blount, E.M. Riley // J. Immunol. – 2008. – Vol. 180, № 9. – P. 5771-5777. 206.Crivello, A. Frequency of polymorphisms of signal peptide of TGF-beta1 and 1082G/A SNP at the promoter region of Il-10 gene in patients with carotid stenosis / A. Crivello, A. Giacalone, L. Scola [et al.] // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2006. – Vol.1067. – P. 288-293. 207.Cuaz-Perolin, C. Apolipoprotein E knockout mice overexpressing human tissue inhibitor of metalloproteinase 1 are protected against aneurysm formation but not against atherosclerotic plaque development / C. Cuaz-Perolin, I. Jguirim, G. Larigauderie [et al.] // J. Vasc. Res. – 2006. – Vol. 43, № 6. – P. 493-501. 266 208.Damoiseaux, J. Pneumococcal vaccination does not increase circulating levels of IgM antibodies to oxidized LDL in humans and therefore precludes an antiatherogenic effect / J. Damoiseaux, G. Rijkers, JW. Tervaert // Atherosclerosis. – 2007. – Vol. 190, № 1. – P. 10-11. 209.Danesh, J. Long-term interleukin-6 level sand subsequent risk of coronary heart disease: two new prospective studies and a systematic review / J. Danish, S. Kaptoge, A.G. Mann // P. Lo S. Med. – 2008. – № 5. – P. 78. 210.Delles, C. Reduced LDL-cholesterol levels in patients with coronary artery disease are paralelled by improved endothelial function: An observational study in patients from 2003 and 2007 / C. Delles, J. A. Dymott, U. Neisius [et al.] // Atherosclerosis. – 2010. – Vol. 211, № 1. – P. 271-277. 211.Denis, M. ATP-binding cassette A1-mediated lipidation of apolipoprotein A-I occurs at the plasma membrane and not in the endocytic compartments / M. Denis, Y. D. Landry, X. Zha // J. Biol. Chem. – 2008. – Vol. 283, № 23. – P. 16178-16186. 212. Dirican, M. High-dose taurine supplementation increases serum paraoxonase and arylesterase activities in experimental hypothyroidism / M. Dirican, S. Taş, E. Sarandöl // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2007. – Vol. 34, № 9. – P. 833-837. 213.Doran, A.C. Role of smooth muscle cells in the initiation and early progression of atherosclerosis / A.C. Doran, N. Meller, C.A. Mc. Namara // Atheroscler. Tromb. Vasc. Biol. – 2008. – Vol. 28, № 5. – P. 812-819. 214.Duerrschmid, C. TNF receptor 1 signaling is critically in volved inmediating angiotensin-II-induced cardiac fibrosis / C. Duerrschmid, J. R. Crawford, E. Reineke [et al.] // J. Mol. Cell. Cardiol. – 2013. – Vol. 57. – P. 59–67. 215.Eid, R. E. Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells / R.E. Eid, D.A. Rao, J. Zhou, S.F. Lo [et al.] // Circulation. – 2009. – Vol. 119, № 10. – P. 1424-1432. 216.Eisen, A. Calcification of the thoracic aorta as detected by spiral computed tomography among stable angina pectoris patients: association with 267 cardiovascular events and death / A. Eisen, A. Tenenbaum, N. Koren-Morag [et al.] // Circulation. – 2008. – Vol. 118, № 13 – P. 1328-1334. 217.Eldrup, N. Elevated matrix metalloproteinase-9 associated with stroke or cardiovascular death in patients with carotid stenosis / N. Eldrup, M. L. Gron holdt, H. Sillesen // Circulation. – 2006. – Vol. 114, №17. – P. 1847-1854. 218.Elmas, E. High plasma levels of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP1) and interleukin-8 (IL-8) characterize patients prone to ventricular fibrillation complicating myocardial infarction / E. Elmas, S. Lang, C.E. Dempfle [et al.] // Clin. Chem. Lab. Med. – 2007. – Vol. 45, №10 – Р. 1360 -1365. 219.Engin, A.B. Engin, Oxidative stress-induced endothelial cell damage in thyroidectomized rat / A.B. Engin, A. Sepici-Dincel, Gonul II, A. Engin // Exp. Toxicol. Pathol. – 2012. – Vol. 64, № 5. – P. 481-485. 220.Erbel, C. Inhibition of IL-17A attenuates atherosclerotic lesion development in apoE-deficient mice / C. Erbel, L. Chen, F. Bea [et al.] // J. Immunol. – 2009. – Vol. 183, №12. – P. 8167-8175. 221.Erdmann, J. New susceptibility locus for coronary artery disease on chromo some 3q22.3 / J. Erdmann, A. Grosshennig, P.S. Braund [et al.] // Nat. Genet. – 2009. – Vol. 41, № 13. – P. 280-282. 222.Espinola-Klein, C. Inflammatory markers and cardiovascular risk in the metabolic syndrome / C. Espinola-Klein, T. Gori, S. Blankenberg, T. Munzel [et al.] // Front. Biosci. – 2011. – Vol. 16, № 1. – P. 1663-1674. 223.Essick, E.E. Adiponectin mediates cardioprotection in oxidative stress-induced cardiac myocyte remodeling / E.E. Essick, N. Ouchi, R.M. Wilson [et al.] // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. – 2011. – Vol. 301, № 3. – P. 984-993. 224.Etoh, T. Miocardial and interstitial matrix metalloproteinase activity after acute myocardial infarction in pigs / T. Etoh, C. Joffs, A.M. Deschamps [et al.] //Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. – 2001. – Vol. 281, № 3. – P. 987-994. 225.Fadini , G.P. Low CD34+ cell count and metabolic syndrome synergistically increase the risk of adverse outcomes / G.P. Fadini , S. de Kreutzenberg, C. Agostini [et al.] // Atherosclerosis. – 2009. – Vol. 207, № 1. – P. 213-219. 268 226.Fisman, E.Z. Interleukin-6 and the risk of future cardiovascular events in patients with angina pectoris and/ or healed myocardial infarction / E.Z. Fisman, M. Benderly, R.J. Esper [et al.] // Am. J. Cardiol. – 2006. – Vol. 98, № 1. – P. 14-18. 227.Folco, E.J. Adiponectin inhibits pro-inflammatory signaling in human macrophages independent of interleukin-10 / E.J. Folco, V.Z. Rocha, M. LópezIlasaca [et al.] // J. Biol Chem. – 2009. – Vol. 284(38). – №. 18. – P. 2556925575. 228.Folsom, A.R. Coronary artery calcification compared with carotid intima-media thickness in the prediction of cardiovascular disease incidence: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA) / A.R. Folsom, R.A. Kronmal, R.C. Detrano [et al.] // Arch. Intern. Med. – 2008. – Vol. 168, № 12. – P. 1333-1339. 229.Foteinos, G. Immune-mediated mechanisms of endothelial damage in atherosclerosis / G. Foteinos, X. Qingbo // Autoimmunity. – 2009. – Vol. 42, № 7. – P. 627-633. 230.Fumitake, U. Interleukin-17 deficiency reduced vascular inflammation and development of atherosclerosis in Western diet-induced apoE-deficient mice / U. Fumitake, K. Hiroaki, O. Taichi [et al.] // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2012. – Vol. 420, №1 – P. 72-77. 231.Furenes, E.B. Long-term influence of diet and/or omega-3 fatty acids on matrix metalloproteinase-9 and pregnancy-associated plasma protein-A in men at high risk of coronary heart disease / E.B. Furenes, I . Seljeflot, S . Solheim [et al.] // Scand J. Clin. Lab. Invest. – 2008. – Vol. 68, № 3. – P. 177-184. 232.Gaillard, S. Adipose tissue as an endocrine organ / S. Gaillard, R. Gaillard // Obesity and Metabolism. – 2007. – Vol. 3. – P. 191-205. 233.Gao Q. A critical function of Th17 pro-inflammatory cells in the development of atherosclerotic plaque in mice / Q. Gao, Y. Jiang, T. Ma [et al.] // J. Immunol. – 2010. – Vol. 185, №10. – P. 5820-5827. 234.Gardner, C.D. Comparison of the Atkins, Zone, Ornish, and LEARN diets for change in weight and related risk factors among overweight premenopausal 269 women: the A TO Z Weight Loss Study: a randomized trial / C. D. Gardner, A. Kiazand, S. Alhassan [et al.] // JAMA. – 2007. – Vol. 297, № 9. – P. 969-977. 235.Gerlach, R.F. Rapid separation of serum does not avoid artificially higher matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels in serum versus plasma / R.F. Gerlach, C. Demacq, K. Jung, J.E. Tanus-Santos // Clin. Biochem. – 2007. – Vol. 40, №12. – P. 119 -123. 236.Gottschling-Zeller, H. Depot-specific release of leptin from subcutaneous and omental adipocytes in suspension culture: effect of tumor necrosis factor-alpha and transforming growth factor-beta1 / H. Gottschling-Zeller, M. Birgel, D. Scriba [et al.] // Eur. J. Endocrinol. – 1999. – Vol. 141, № 4. – P. 436-442. 237.Gourdy, P. G. Role of inflammatory cytokines in the effect of estradiol on atheroma / P. Gourdy, B. Calippe, H. Laurell [et al.] // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.. – 2008. – Vol. 35, № 4. – P. 396-401. 238.Grainger, D.J. TGF-β and atherosclerosis in man / D.J. Grainger // Cardiov. Research. – 2007. – Vol. 74, №2. – P. 213-222. 239.Grandl, M. E-LDL and Ox-LDL differentially regulate ceramide and cholesterol raft microdomains in human Macrophages / M. Grandl , S.M. Bared, G. Liebisch [et al.] // Cytometry. A. – 2006. – Vol. 69, № 3. – P. 189-191. 240.Gregersen, P.K. Risk for myasthenia gravis maps to a (151) Pro?Ala change in TNIP1 and to human leukocyte antigen-B*08 / P.K. Gregersen, R. Kosoy, A.T. Lee, J. Lamb // Ann. Neurol. – 2012. – Vol. 72, № 6. – P. 927-935. 241.Griva, M. Potential role of selected biomarkers for predicting the presence and extent of coronary artery disease / M. Griva, R. Naplava, M. Spendlikova [et al.] // Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky. Olomouc. Czech.Repub. – 2010. – Vol. 154, № 3. – Р. 219-226. 242.Gualillo, O. The emerging role of adipokines as mediators of cardiovascular function: physiologic and clinical perspectives / O. Gualillo, J.R. GonzalezJuanatey, F. Lago // Trends. Cardiovasc. Med. – 2007. – Vol. 17, № 8. – P. 275–283. 270 243.Guo, R.W. Angiotensin II induces matrix metalloproteinase-9 expression via a nuclear factor-kappaB-dependent pathway in vascular smooth muscle cells / R. W. Guo, L. X. Yang, H. Wang [et al.] // Regul. Pept. – 2008. – Vol. 147, № 1-3. – P. 37-44. 244.Gusel, S. Interleukin-33, matrix metalloproteinase-9, and tissue ingibitor of matrix metalloproteinase-1 in myocardial infarction / S. Gusel, S. Osden, E.S.Guzel [et al.] // Korean J. Intern Med. – 2013. – Vol. 28, № 2. – P. 165-173. 245.Gutiérrez, E. Endothelial dysfunction over the course of coronary artery disease / E. Gutiérrez, A.J. Flammer, L.O. Lerman [et al.] // Eur. Heart J. – 2013. – Vol. 34, № 41. – P. 3175-3181. 246.Gomez, D.E. Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological functions / D.E. Gomez, D.F. Alonso, H. Yoshiji [et al.] // Eur. J. Cell. Biol. –1997. – Vol. 74, № 2. – P. 111-122. 247.Hagemann, C. Сomplete compilation of matrix metalloproteinase expression in human malignant gliomas / C. Hagemann, J. Anacker, R.I. Ernestus [et al.] // World J. Clin. Oncol. – 2012. – Vol. 3, № 5. – P. 67-79. 248.Hassan, H. H. Identification of an ABCA1-dependent phospholipid-rich plasma membrane apolipoprotein A-I binding site for nascent HDL formation: implications forcurrent models of HDL biogenesis / H. H. Hassan, M. Denis, D.Y. Lee [et al.] // J. Lipid. Res. – 2007. – Vol. 48, № 11. – P. 2428-2442. 249. Hata, T. Critical role of Th17 cells in inflammation and neovascularization after ischaemia / T. Hata, M. Takahashi, S. Hida [еt al.] // Cardiovasc. Res. – 2011. – Vol. 90, №2. – P. 364-372. 250.Hein, T.W. Hein Human C-reactive protein induces endothelial dysfunction and uncoupling of eNOS in vivo / T.W. Hein, U. Singh, J. Vasquez-Vivar [et al.] // Atherosclerosis. – 2009. – Vol. 206, № 1. – P. 61-68. 251.Heiskanen, M. Polymorphism in the IL10 promoter region and early markers of atherosclerosis: The Cardiovascular Risk in Young Finns Study / M. Heiskanen, M. Kähönen, M. Hurme [et al.] // Atherosclerosis. – 2010. – Vol. 208, № 1. – P.190-196. 271 252.Helgadottir, A. The same sequence variant on 9p21 associates with myocardial infarction, abdominal aortic aneurysm and intracranial aneurysm / A. Helgadottir, G. Thorleifsson, K.P. Magnusson [et al.] // Nat. Genet. – 2008. – Vol. 40, №2 – P. 217-224. 253.Helgadottir, A.A. Сommon variant on chromosome 9p21 affects the risk of myocardial infarction / A. Helgadottir, G. Thorleifsson, A. Manolescu [et al.] // Science. – 2007. – Vol. 316, №5830 – P. 1491-1493. 254. Helle, F. Angiotensin II-induced calcium signaling in the afferent arteriole from rats with two-kidney, one clip hypertension / F. Helle, O. B. Vagnes, B. M. Iversen // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. – 2006. – Vol. 291, №1. – P. 140-147. 255. Hinohara, K. Replication of the association between a chromosome 9p21 polymorphism and coronary artery disease in Japanese and Korean populations / K. Hinohara, T. Nakajima, M. Takahashi // J. Hum. Genet. – 2008. – №. 3. – P. 357-359. 256.Holifield, J.S. TGF-beta1, -beta2 and -beta3 cooperate to facilitate tubulogenesis in the explanted quail heart / J.S. Holifield, A.M .Arlen, R.B. Runyan R.J. Tomanek // J. Vasc. Res. – 2004. – Vol. 41, № 6. – Р. 491-498. 257.Hong, S.J. Comparison of effects of telmisartan and valsartan on late lumen loss and inflammatory markers after sirolimuseluting stent implantation in hypertensive patient / S.J. Hong, W. J. Shim, J.I. Choi, H.J. Joo // Am. J. Cardiol. – 2007. – Vol. 100, № 11. – P. 1625-1629. 258. Hongwei, Y. The effects of second-hand smoke on biological processes important in atherogenesis / Y. Hongwei, L.S. Wong, M. Bhattacharya [et al.] // BMC Cardiovasc. Disord. – 2007. – Vol. 7. – Р. 1. 259. Hopewell, J.C. Lipoprotein (a) genetic variants associated with coronary and peripheral vascular disease but not with stroke risk in the Heart Protection Stud/ J.C. Hopewell, R.Clarke, S.Parish, J.Armitage // Circ. Cardiovasc. Genet. – 2011. – Vol. 4, № 1. – P. 68-73. 260. Hotta, K. Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients / K. Hotta, T. Funahashi, Y. Arita [et al] // Arterioscler. Thromb.Vasc.Biol. – 2000. – Vol. 20, № 6. – P. 1595-1599. 272 261. Howard, B.V. Low-fat dietary pattern and lipoprotein risk fаctors: the Women’s Health Initiative Dietary Modification Trial / B.V. Howard, J.D. Curb, C.B. Eaton [et al.] // Am. J. Clin. Nutr. – 2010. – Vol. 91, № 4. – P. 860-874. 262. Izgi, C. Role for matrix metalloproteinase-2 in oxidized low-density lipoprotein-induced activation of the sphingomyelin/ceramide pathway and smooth muscle cell proliferation / C. Izgi, C. Cevik , M. Ozkan // Circulation. – 2005. – Vol. 111, № 4. – P. 38-39. 263. Jacobs, M. Tumor necrosis factor-alpha at acute myocardial infarction in rat sand effects on cardiac fibroblasts / M. Jacobs, S. Staufenberger, U. Gergs, K. Meuter // J. Mol. Cell. Cardiol. –1999. – Vol. 31, № 11. – P. 949-959. 264. Jakobsen, M.U. Intake of carbohydrates compared with intake of saturated fatty acids and risk of myocardial infarction: importance of the glycemic index / M.U. Jakobsen, C. Dethlefsen, A.M. Joensen [et al.] // Am. J. Clin. Nutr. – 2010. – Vol. 91, № 6. – P. 1764-1768. 265. Jang, Y. Interleukin-6-572C>G polymorphism-association with inflammatory variables in Korean men with coronary artery disease. / Y. Jang, O.Y.Kim, Y.J. Hyun [et al.] // Transl. Res. – 2008. – Vol. 151, №3 – P. 154-161. 266. Jefferis, B. Prospective study of matrix metalloproteinase-9 and risk of myocardial infarction and stroke in older men and women / B. Jefferis, P. Whincup, P. Welsh [et al.] // Atherosclerosis. – 2010. – Vol. 208, № 2. – P. 557-563. 267.Jialal, I. Decreased Number and Impaired Functionality of Endothelial Progenitor Cells in Subjects with Metabolic Syndrome: Implications for Increased Cardiovascular Risk / I. Jialal, S. Devaraj, U. Singh [et al.] // Atherosclerosis. – 2010. – Vol. 211, № 1. – P. 297-302. 268.Jin Y. Variant of TYR and autoimmunity susceptibility loci in generalized vitiligo / Y. Jin, S.A. Birlea, P.R. Fain [et al.] // N. Engl. J. Med. – 2010. – Vol. 362, №18. – P. 1686-1697. 269.Jonson, L. Divergent effects of matrix mettalloproteinases 3,7,9, and 12 on atherosclerotic plaque stability in mouse brachiocephalic arteries / L. Jonson, 273 S.George, A. Newby, C. Jackson [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci USA. – 2005. – Vol.102, №43. – P. 15575-15580. 270.Jublanc, C. Serum levels of adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 and tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP-1, are elevated in patients with autoimmune thyroid disorders: relevance to vascular inflammation / C. Jublanc, J. L. Beaudeux, F. Aubart [et al.] // Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. – 2011. – Vol. 21, № 10. – P. 817-822. 271.Kaden, J.J. Time-dependent changes in the plasma concentrations of matrix metalloproteinase-9 after acute myocardial infarction / J.J. Kaden, C. E. Dempfle, T. Sueselbeck [et al.] // Cardiology. – 2003. – Vol. 99, № 3. – P. 140 -144. 272.Kahraman, S. IL-10 genotype predicts serum levels of adhesion molecules, inflammation and atherosclerosis in hemodialysis patients / S. Kahraman, R. Yilmaz, M. Arici [et al.] // J. Nephrol. – 2006. – Vol. 19, № 1. – P. 50-56. 273.Kamigaki, M.K Oxidative stress provokes atherogenic changes in adipokine gene expression in 3T3-L1 adipocytes. / M. Kamigaki, S. Sakaue, I. Tsujino [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2006. – Vol. 339, № 2. – P. 624-632. 274. Kaptoge, S. C-reactive proteinconcentration and risk of coronary heart disease, stroke, and mortality: an individual participant meta-analysis / S. Kaptoge, E. Di Angelantonio, G. Lowe [et al.] // Lancet. – 2010. – Vol. 375, № 9709. – P.132-140. 275.Kastelein, J.J. Simvastatin with or without ezetimibe in familial hypercholesterolemia / J. J. Kastelein, F. Akdim, E. S. Stroes [et al.] // N. Engl. J. Med. – 2008. – Vol. 358, № 14. – P. 1431-1443. 276.Kathiresan, S. Six new loci associated with blood low-density lipoprotein cholesterol, high-density lipoprotein cholesterol or triglycerides in humans / S. Kathiresan, O. Melander, C. Guiducci [et al.] // Nat. Genet. – 2008. – Vol. 40, № 2. – P. 189-197. 277.Kathiresan, S. Genome-wide association of early-onset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants / S. Kathiresan, B. F. Voight, S. Purcell [et al.] // Nat. Genet. – 2009. – Vol. 41, № 3. – P. 334-341. 274 278.Kempf, K. Increased TNF-alpha and decreased TGF-beta expression in peripheral blood leukocytes after acute myocardial infarction / K. Kempf, G. Haltern, R. Füth, C. Herder [et al.] // Horm. Metab. Res. – 2006. – Vol. 38, № 5. – P. 346-351. 279.Kim, S.J. Correlation between epicardial fat thickness by echocardiography and other parameters in obese adolescents / S.J. Kim, H.S. Kim, J.W. Jung [et al.] // Korean Circ. J. – 2012. – Vol. 42, № 7. – P. 471-478. 280.Kim, S.Y. Apolipoprotein C-II is a novel substrate for matrix metalloproteinases / S.Y. Kim, S.M. Park, S.T. Lee // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2006. – Vol. 339, № 1. – P. 47-54. 281.King, V.L. A murine model of obesity with accelerated atherosclerosis / V.L. King, N.W. Hatch, H.W. Chan [et al.] // Obesity. – 2010. – Vol. 18, № 1. – P. 35-41. 282.Kistorp, C. Plasma adiponectin, body mass index, and mortality in patients with chronic heart failure / C. Kistorp, J. Faber, S. Galatius [et al.] // Circulation. – 2005. – Vol. 112, № 12. – P. 1756-1762. 283.Koh, K.K. Non-lipid effects of statin on hypercholesterolemic patients established to have coronary artery disease who remained hypercholesterolemic while eating a step- II diet / K.K. Koh, J.W. Son, J.Y. Ahn [et al.] // Coron. Artery. Dis. – 2001. – Vol. 12, № 4. – P. 305-311. 284.Koh, K.K. Comparative effects of diet and statin on NO bioactivity and matrix metalloproteinases in hypercholesterolemic patients with coronary artery disease / K.K. Koh, JW. Son, JY. Ahn [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2002. – Vol. 22, № 9. – P. 19-23. 285.Koh, K.K. Are statins effective for simultaneously treating dyslipidemias and hypertension? / K.K. Koh, M.J. Quon, M.A. Waclawiw / Atherosclerosis. –2008. – Vol. 196, № 1. – P. 1-8. 286.Kotani, K. An association between angiotensin II type 2 receptor gene A/C3123 polymorphism and glycemic control marker in a general Japanese population / 275 K. Kotani, S. Fujiwara, K. Tsuzaki [et al.] // Mol. Biol. Rep. – 2009. – Vol. 36, №5 – P. 9917–9920. 287.Kulev, B. D. Effect of various approaches to therapy with statins in high risk patients from the point of view of vascular endothelium / B.D. Kulev, F.T. Ageev // Kardiolog. – 2009. – Vol. 49, № 5. – P. 4-10. 288.Kumada M. Adiponectin specifically increased tissue inhibitor of metalloproteinase-1 through interleukin-10 expression in human macrophages / M. Kumada, S. Kihara, N. Ouchi [et al.] // Circulation. – 2004. – Vol. 109, № 17. – P. 2046-2049. 289.Kwong, L.K. Acute dyslipoproteinemia induced by interleukin-2: lecithin: cholesteryl acyl transferase, lipoprotein lipase, and hepatic lipase deficiencies / L.K.Kwong, D.N. Ridinger, M. Bandhauer [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1997. – Vol. 82, № 5. – Р. 1572-1581. 290.Kralisch, S. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 predicts adiposity in humans / S. Kralisch, M. Bluher, A. Tonjes [et al.] // Eur. J. Endocrinol. – 2007. – Vol. 156, № 2. – P. 257-261. 291. Lakka, H.M. The TNF-alpha G-308A polymorphism is associated with C-reactive protein levels: the HERITAGE Family Study / H.M. Lakka, T.A. Lakka, T. Rankinen [et al.] // Vasc. Pharmacol. – 2006. – Vol. 44, № 5. – P. 377-383. 292.Lardizabal, J.A. The Anti-Ischemic and Anti-Anginal Properties of Statins / J.A. Lardizabal, P.C. Deedwania // Curr. Atheroscler. Rep. – 2011. – Vol. 13, №1 – P. 43–50. 293.Laschober, G.T. Leptin receptor / CD295 is upregulated on primary human mesenchymal stem cells of advancing biological age and distinctly marks the subpopulation of dying cells / G.T. Laschober, R. Brunauer, A. Jamnig [et al.] // Exp. Gerontol. – 2009. – Vol. 44, № 1-2. – P. 57-62. 294.Lawlor, D.A. Leptin and coronary heart disease risk: prospective case control study of British women / D.A. Lawlor, G. D. Smith, A. Kelly [et al.] // Obesity. – 2007. – Vol. 15, № 7. – P. 1694-1701. 276 295.Li, Y. KIF6 polymorphism as a predictor of risk of coronary events and of clinical event reduction by statin therapy / Y. Li, O. Iakoubova, D. Shiffman [et al.] // Am. J. Card. – 2010. – Vol. 106. – P. 994-998. 296.Liao, Y.H. Interleukin-17A contributes to myocardial ischemia/reperfusion injury by regulating cardiomyocyte apoptosis and neutrophil infiltration / Y.H. Liao , N. Xia, S.F. Zhou [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 2012. – Vol. 59, №. 4. – P. 420-429. 297.Libby, P. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis / P. Libby, P. M. Ridker, G. K. Hansson // Nature. – 2011. – Vol. 473, № 7347. – P. 317-325. 298.Libra, M. Analysis of G(-174)C IL-6 polymorphism and plasma concen trations of inflammatory markers in patients with type 2 diabetes and peripheral arterial disease / M. Libra, S.S. Signorelli, Y. Bevelacqua [et al.] // J. Clin. Pathol. – 2006. – Vol. 59, № 21. – P. 1-5. 299.Ling, T. Adiponectin reduces lipid accumulation in Macrophage Foam Cells / T. Ling, L. Nanlan, L.R. Klein [et al.] // Atherosclerosis. – 2009. – Vol. 202, № 1. – P. 152-161. 300.Lint, P.V. Chemokine and cytokine processing by matrix metalloproteinases and its effect on leukocyte migration and inflammation / P. V. Lint, C. Libert // J. Leukoc. Biol. – 2007. – Vol. 82, № 6. – P. 1375-1381. 301.Liu, X. Toll-like receptor 2 plays a critical role in the progression of atherosclerosis that is independent of dietary lipids / X. Liu, T. Ukai, H. Yumoto [et al.] // Atherosclerosis. – 2008. – Vol. 196, № 1. – P. 146-154. 302.Liu, Y. L-6 haplotypes, inflammation, and risk for cardiovascular disease in a multiethnic dialysis cohort / Y. Liu, Y. Berthier-Schaad, M.D. Fallin [et al.] // J. Am. Soc. Nephrol. – 2006. – Vol. 17, № 3. – P. 863-870. 303.Liu, Z. Correlation of peripheral Th17 cells and Th17-associated cytokines to the severity of carotid artery plaque and its clinical implication / Z. Liu, F. Lu , H. Pan [et al.] // Atherosclerosis. – 2012.–Vol 221, №1.. – P. 232-241. 277 304.Lopez-Escamez, J.A. A variant of PTPN22 gene conferring risk to autoimmune diseases may protect against tuberculosis / J.A. Lopez-Escamez // J. Postgrad. Med. – 2010. – Vol. 56, № 3. – P. 242-243. 305.Louhelainen, N. Elevation of sputum matrix metalloproteinase-9 persists up to 6 months after smoking cessation: a research study / N. Louhelainen, H. Stark, W. Mazur [et al.] // BMC. Pulm. Med. – 2010. – № 10. – Р. 13. 306. Madamanchi, N. R. Mitochondrial dysfunctionin atherosclerosis / N. R. Madamanchi, M. S. Runge // Circ. Res. – 2007. – Vol. 100, № 4. – P. 460-473. 307.Madan, M. Atheroprotective Role of Interleukin-6 in Diet- and/or Pathogenassociated Atherosclerosis using an ApoE Heterozygote Murine Model / M. Madan, B. Bishayi, M. Hoge, S. Amar // Atherosclerosis. – 2008. – Vol. 197, № 2. – P. 504-514. 308.Maeda, N. PPAR gamma ligands increase expression and plasma concentration of adiponectin, an adipose-derived protein / N. Maeda, M. Takahashi, T. Funahashi [et al.] // Diabetes. – 2001. – Vol. 50, № 9. – P. 2094-2099. 309.Maitra, A. Polymorphisms in the IL6 gene in Asian Indian families with premature coronary artery disease the Indian Atherosclerosis Research Study / A. Maitra, J. Shanker, D. Dash [et al.] // Thromb. Haemost. – 2008. – Vol. 99, №5. – P. 944-950. 310.Mallat, Z. The role of transforming growth factor beta in atherosclerosis: novel insights and future perspectives / Z. Mallat, A. Tedgui // Curr. Opin. Lipidol. – 2002. – Vol. 13, № 5. – P. 523-529. 311.Marfella, R. Innate immune activity in plaque of patients with untreated and Lthyroxine-treated subclinical hypothyroidism / R. Marfella, F. Ferraraccio, M.R. Rizzo [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2011. – Vol. 96, № 4. – P. 1015-1020. 312.Margetic, S. Leptin: a review of its peripheral actions and interactions / S. Margetic, C. Gazzola, G.G. Pegg [et al.] // Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. – 2002. – Vol. 26, № 11. – P. 1407-1433. 278 313.Markus, H.S. Genetic and acquired inflammatory conditions are synergistically associated with early carotid atherosclerosis / H.S. Markus, R. Labrum, S. Bevan [et al.] // Stroke. – 2006. – Vol. 37, № 9. – P. 2253-2259. 314.Marso, S.P. Increase in interleukin-6 following arterial injury is related to insulin resistance, the -174G-->C polymorphism and complex plaque morphology / S.P. Marso, J.A. House, P.J. Hopkins [et al.] //Int. J. Immunogenet. – 2006. – Vol. 33, №. 5. – P. 347-354. 315.Martin, S.S. C-reactive protein modifies the association of plasma leptin with coronary calcium in asymptomatic overweight individuals / S.S. Martin, A.N. Qasim, D.J. Rader, M.P.Reilly [et al.] // Obesity (Silver Spring). – 2012. – Vоl. 4, № 20. – P. 856-861. 316.Martinez-Calatrava, M.J. Common haplotypes of the C-reactive protein gene and circulating leptin levels influence the inter individual variability in serum C-reactive protein levels. The Segovia study / M.J. Martinez-Calatrava, J.L. Gonzalez-Sanchez, M.T. Martinez-Larrad [et al.] // Thromb. Haemost. – 2007. – Vol. 98, № 108. – P. 88-95. 317.Matavelli, L.C. AT₂ receptor stimulation inhibits early renal inflammation in renovascular hypertension / L.C. Matavelli, J. Huang, H.M. Siragy // Hypertension. – 2011. – Vol. 57, № 2. – P. 308-313. 318.Matsumura, E. Oxidative modification of low-density lipoprotein and immune regulation of atherosclerosis / E. Matsumura, K. Kobayashi, M. Tabuchi, L.R. Lopez // Prog. Lipid. Res. –2006. – Vol. 45, № 6. – P. 466-486. 319.Matsunaga, Y. The relationship between cotinine concentrations and inflammatory markers among highly secondhand smoke exposed non-smoking adolescents / Y. Matsunaga, C.I. Vardavas , M. Plada , J. Wärnberg // Cytokine. – 2014. – Vol. 66, № 1. – P. 17–22. 320.Mc Pherson, R. A common allele on chromosome 9 associated with coronary heart disease / R. Mc Pherson, A. Pertsemlidis, N. Kavaslar [et al.] // Science. – 2007. – Vol. 316, №5830 – P. 1488-1491. 279 321. Miller, A.A. NADPH oxidase activity is higher in cerebral versus systemic arteries of four animal species: role of Nox2 / A. A. Miller, G. R. Drummond, T. M. De Silva [et al.] // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2009 – Vol. 296, № 1. – P. 220-225. 322.Montecucco, F. CB2 cannabinoid receptor agonist JWH-015 modulates human monocyte migration through defined intracellular signaling pathways / F. Montecucco, F. Burger, F. Mach, S. Steffens // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. – 2008. – Vol. 294, № 3. – P.1145-1155. 323.Morange, P.E. Polymorphisms of the tumor necrosis factor-alpha (TNF) and the TNF-alpha converting enzyme (TACE/ADAM17) genes in relation to cardiovascular mortality: the AtheroGene study / P. E. Morange, D. A. Tregouet, T. Godefroy [et al.] // J. Mol. Med. – 2008. – Vol. 86, № 10. – P. 1153-1161. 324.Morimoto, H. Cardiac overexpression of monocyte chemoattractant protein-1 in transgenic mice prevents cardiac dysfunction and remodeling after myocardial infarction / H. Morimoto, M. Takahashi, A. Izawa [et al.] // Circ. Res. – 2006. – Vol. 99, №8. – P. 891-899. 325.Mosser, D.M. Exploring the full spectrum of macrophage activation / D.M. Mosser, J.P. Edwards // Nat. Rev. Immunol. – 2008. – Vol. 8, № 12. – P. 958-969. 326.Mucellini, A.B. Effects of exposure to a cafeteria diet during gestation and after weaning on the metabolism and body weight of adult male offspring in rats // A.B. Mucellini, J.F. Goularte, A.C. de Araujo da Cunha [et al.] // Br. J. Nutr. – 2013. – Vol. 111, №8. – P. 1-8. 327.Najjar, S.S. Pulse wave velocity is an independent predictor of the longitudinal increase in systolic blood pressure and of incident hypertension in the Baltimore Longitudinal Study of Aging / S. S. Najjar, A. Scuteri, V. Shetty [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 2008. – Vol. 51, №14. – P. 1377-1383. 328.Nambi, V. Matrix metalloproteinase-1 and tissue Inhibitors do not predict incident coronary artery disease / V. Nambi, M. D. Alanna, C. Morrison [et al.] // Texas Heart Instit. J. – 2008. – Vol. 35, № 4. – Р. 388-394. 280 329.Negi, S.I. Association of low plasma adiponectin with early diastolic dysfunction / S.I. Negi, E.M. Jeong, I. Shukrullah [et al.] // Cong. Heart. Fail. – 2012. – Vol. 18, №.4. – P. 187-191. 330.Noji, Y. Circulating matrix metalloproteinases and their inhibitors in premature coronary atherosclerosis / Y. Noji, K. Kajinami, M.A. Kawashiri [et al.] // Clin. Chem. Lab. Med. – 2001. – Vol. 39, № 5. –380-384. 331.Nomoto, T. Systemic delivery of IL-10 by an AAV vector prevents vascular remodeling and end-organ damage in stroke-prone spontaneously hypertensive rat / T.Nomoto, T.Okada, K.Shimazaki [et al.] // Gene. Ther. – 2009. – Vol. 16, № 3. – P. 383-391. 332.Nourshahi, M. The correlation between resting serum leptin and serum angiogenic indices at rest and after submaximal exercise / M. Nourshahi, M. Hedayati, K. Ranjbar // Regul. Pept. – 2012. – Vol. 173, № 1-3 – P. 6-12. 333.O’Connor Jr, W. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation / W.O’Connor Jr., M. Kamanaka, C.J. Booth [et al] // Nat. Immunol. – 2009. – Vol. 10. – P. 603-609. 334.Oda, K. Polymorphisms in pro- and anti-inflammatory cytokine genes and susceptibility to atherosclerosis: a pathological study of 1503 consecutive autopsy cases / K. Oda, N.Tanaka, T. Arai [et al.] // Human Molec. Genetics. – 2007. – Vol. 16, №. 6. – P.592-599. 335.Ohshiro, T. Pyripyropene a, an acyl-coenzyme a:cholesterol acyltransferase 2selective inhibitor, attenuates hypercholesterolemia and atherosclerosis in murine models of hyperlipidemia / T. Ohshiro, D. Matsuda, K. Sakai [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. – 2011. – Vol. 31, №5. – P. 1108-1115. 336.Okamoto, Y. Adiponectin reduces atherosclerosis in apolipoprotein K-defi cient mice / Y. Okamoto, S. Kihara, N. Ouchi [et al.] // Ibid. – 2002. – Vol. 106, № 22. – P. 2767-2770. 337.Opdenakker, G. Review Gelatinase B functions as regulator and effector in leukocyte biology / G. Opdenakker, P.E. Van den Steen, B. Dubois, I. Nelissen // J.J. Leukoc. Biol. – 2001. – Vol. 69, № 6. – P. 851-859. 281 338.Ouchi, N. Obesity, adiponectin and vascular inflammatory disease // N. Ouchi, S. Kihara, T. Funahashi [et al.] // Curr. Opin. Lipidol. – 2003. – Vol. 14, № 6. – P. 561-566. 339.Ouyang, W. The biological functions of T helper 17 cell effector cytokines in inflammation / W. Ouyang, J.K. Kolls, Y. Zheng // Immunity. – 2008. – Vol. 28, № 4. – P. 454-467. 340.Oyedemi, S.O. Effect of aqueous extract of Leonotis leonurus (L.) R. Br. leaves in male Wistar rats / S.O. Oyedemi, M.T. Yakubu, A.J. Afolayan // Human and Experimental Toxicology. –2010. – Vol. 29, № 5. – P.377-384. 341.Paik, J.K. Additive effect of interleukin-6 and C-reactive protein (CRP) single nucleotide polymorphism on serum CRP concentration and other cardiovascular risk factors / J.K. Paik, O.Y. Kim, S.J. Koh [et al.] // Clin. Chim. Acta. – 2007. – Vol. 380, № 1-2. – P. 68-74. 342.Palomino-Morales, R. Lack of association of PTPN22, STAT4 and TRAF1/C5 gene polymorphisms with cardiovascular risk in rheumatoid arthritis / R. Palomino-Morales, C. Gonzalez-Juanatey, T.R. Vazquez-Rodriguez [et al.] // Clin. Exp. Rheumatol. – 2010. – Vol. 28, № 5. – P. 695-701. 343.Papazafiropoulou, A. Matrix metalloproteinases and cardiovascular diseases / A. Papazafiropoulou, N. Tentolouris // Hippokratia. –2009. – Vol. 13, № 2. – Р.76-82. 344.Park, J.T. Leptin/adiponectin ratio is an independent predictor of mortality in nondiabetic peritoneal dialysis patients / J.T. Park, T.H. Yoo, J.K. Kim [et al.] // Peritoneal Dialysis International. – 2013. –Vol. 33, №1. – P. 67-74. 345.Pereira, T.V. Effect of the G-308A polymorphism of the tumor necrosis factor alpha gene on the risk of ischemic heart disease and ischemic stroke: a metaanalysis / T.V. Pereira, M. Rudnicki, R.F. Franco [et al.] // Am. Heart. J. – 2007. – Vol. 153, № 82. – P. 1-30. 346.Petrone, A. The PTPN22 1858T Gene Variant in Type 1 Diabetes Is Associated With Reduced Residual β-Cell Function and Worse Metabolic Control / 282 A. Petrone, M. Spoletini, S. Zampetti [et al.] // Diabetes Care. – 2008. – Vol. 31, № 6. – P. 1214-1218. 347.Pischon, T. Plasma Adiponectin Levels and Risk of Myocardial Infarction in Men / T. Pischon, C.J. Girman, G.S. Hotamisligil [et al.] // JAMA. – 2004. – Vol. 291, № 14. – P. 1730-1737. 348.Pourcet, B. XR-alpha regulates macrophage arginase 1 through PU.1 and interferon regulatory factor 8 / B. Pourcet, J. E. Feig, Y.L. Vengrenyuk [et al.] // Circ. Res. – 2011. – Vol. 109, № 5. – P. 492-501. 349.Preuss, M. Cardiogram Consortuim. Design of the coronary artery disease genome wide replication and meta-analysis (CARDIoGRAM) study:a genomewide association meta-analysis involving more than 22,000 cases and 60,000 controls / M. Preuss, I.R. Kцnig, J.R. Thompson [et al.] // Circ. Cardiovasc. Genet. – 2010. – Vol. 3, № 5. – P. 475-483. 350.Putko, B. N. Circulating levels of tumor necrosis factor-alpha receptor 2 are increased in heart failure with preserved ejection fraction relative to heart failure with reduced ejection fraction: evidence for a divergence in pathophysiology / B.N. Putko, Z. Wang , J. Lo [et al.] // PLoS One.– 2014. – Vol. 9, № 6. – е. 99495. 351.Rafferty, B. Cultivation of Enterobacter hormaechei from human atherosclerotic tissue / B. Rafferty, S. Dolgilevich, S. Kalachikov [et al.] // J. Atheroscler. Thromb. – 2011. – Vol. 18, №1. – P. 72-81. 352.Ray, K.K. Statins and all-cause mortality in high-risk primary prevention: a meta-analysis of 11 randomized controlled trials involving 65,229 participants / K.K. Ray, S.R. Seshasai, S. Erqou [et al.] // N. Arch. Intern. Med. – 2010. – Vol. 170. – P. 1024-1031. 353. Ridker, P.M. C-reactive protein and the prediction of cardiovascular events among those at intermediate risk: moving an inflammatory hypothesis to ward consensus / P.M. Ridker // J. Am. Coll. Cardiol. - 2007. – Vol. 49, № 21. – P. 29-38. 354. Ridker, P.M. Inflammation, C-reactive protein, and athero thrombosis / P. M. Ridker, J.D. Silvertown // J. Periodontol. – 2008. – Vol. 79, № 8. – P. 1544-1551. 283 355.Ridker, P.M. Rosuvastatin to prevent vascular events in men and women with elevated C-reactive protein / P. M. Ridker, E. Danielson, F. A. Fonseca [et al.] // N. Engl. J. Med. – 2008. – Vol. 359, № 21. – P. 2195-2207. 356.Ridker, P.M. Testing the inflammatory hypothesis of atherothrombosis: scientific rationale for the cardiovascular inflammation reduction trial (CIRT) / P.M. Ridker // J. Thromb. Haemost. – 2009. – Vol. 7, № 1. – P. 332-339. 357.Riikola, A. Interleukin-6 promoter polymorphism and cardiovascular risk factors: The Health 2000 Survey / A. Riikola, K. Sipilä, M. Kähönen, A. Jula // Atheroscler. – 2009. – Vol. 207, № 2. – P. 466-470. 358.Robert, R. Different effects of interleukin-1 on reactivity of arterial vessels isolated from various vascular beds in the rabbit / R. Robert, B. Chapelain, G. Néliat // Circ Shock. – 1993. – Vol. 40, № 2-3. – P. 139-143. 359.Rohla, M. Metabolic syndrome, inflammation and athero thrombosis / M. Rohla, T. W. Weiss // Hamostaseologie. – 2013. – Vol. 33, № 4. – P. 283-294. 360.Rose-John, S. IL-6 Trans-Signaling via the Soluble IL-6 Receptor: Importance for the Pro-Inflammatory Activities of IL-6 / S. Rose-John // Int. J. Biol. Sci. – 2012. – Vol. 8, № 9. – P. 1237-1247. 361.Rosenfeld, M.E. Pathogens and atherosclerosis: Update on the potential contribution of multiple infectious organisms to the pathogenesis of atherosclerosis / M. E. Rosenfeld, L. A. Campbell // Thromb. Haemost. – 2011. – Vol. 106, № 5. – P. 858-867. 362.Ross, R. Response to injury and atherogenesis / R. Ross, J. Glomset, L. Harker // Am. J. Pathol. – 1977. – Vol. 86, № 3. – P. 675-684. 363.Rubin, J. Association between high-sensitivity C-reactive protein and coronary plaque subtypes assessed by 64-slice coronary computed tomography angiography in an asymptomatic population / J. Rubin, H.J. Chang, K. Nasir [et al.] // Circ. Cardiovasc. Imaging. – 2011. – Vol. 4, № 3. – P. 201-209. 364.Ryoo, S. Endothelial arginase II: a novel target for the treatment of atherosclerosis / S. Ryoo, G. Gupta, A. Benjo [et al.] // Circ. Res. – 2008. – Vol. 102, № 8. – P. 923-932. 284 365.Saccucci, P. Atherosclerosis and PTPN22: A Study in Coronary Artery Disease / P. Saccucci, M. Banci, E. Cozzoli [et al.] // Cardiology. – 2011. – Vol. 119, №1. – P. 54-56. 366.Samani, N.J. Large scale association analysis of novel genetic loci for coronary artery disease / N.J. Samani, P. Deloukas, J. Erdmann // Arterioscler. Thromb.Vasc. Biol. – 2009. – Vol. 29, № 5. – P. 774-780. 367.Saremi, A. Association between IL-6 and the extent of Coronary Atherosclerosis in The Veterans Affairs Diabetes Trial (VADT) / A. Saremi, R.J. Anderson, P. Luo [et al.] // Atherosclerosis. – 2009, № 2. –Vol. 203, № 2. – P. 610-614. 368.Sattar, N. Leptin and coronary heart disease: prospective study and systematic review / N. Sattar, G. Wannamethee, N. Sarwar [et al.] / J. Am. Coll. Cardiol. 2009. – Vol. 53, № 2. – P. 167-175. 369.Sbarsi, I Inflammation and atherosclerosis: the role of TNF and TNF receptors polymorphisms in coronary artery disease / I. Sbarsi, C. Falcone, C. Boiocchi [et al.] // Int. J. Immunopathol.Pharmacol. – 2007. – Vol. 20, № 1. – P. 145-154. 370.Schmermund, A. Comparison of Subclinical Coronary Atherosclerosis and Risk Factors in Unselected Populations in Germany and US-America / A. Schmermund, N. Lehmann, L. Bielak [et al.] // Atherosclerosis. – 2007. – Vol. 195, № 1. – P. 207-216. 371.Schroeter, M.R. Schroeter Leptin promotes the mobilization of vascular progenitor cells and neovascularization by NOX2-mediated activation of MMP9 / M. R. Schroeter, S. Stein, N. M. Heida [et al.] // Cardiovasc Res. – 2012. – Vol. 93, № 1. – P. 170-180. 372.Schuett, H. How much is too much? Interleukin-6 and its signalling in atherosclerosis / H. Schuett, M. Luchtefeld, C. Grothusen [et al.] // Thromb. Haemost. – 2009. – Vol. 102, № 2. – P. 215-222. 373.Scott, L. Sub endothelial proteoglycan synthesis and transforming growth factor beta distribution correlate with susceptibility to atherosclerosis / L. Scott, A. Kerr, D. Haydock [et al.] // J. Vasc. Res. – 1997. – Vol. 34, №. 5. – P. 365-377. 285 374.Scuteri, A. Independent and additive effects of cytokine patterns and the metabolic syndrome on arterial aging in the Sardinia Study / A. Scuteri, M. Orru, C.Morrell, M.G. Piras [et al.] // Atherosclerosis. – 2011. - Vol. 2, № 2. P. 15459-15464. 375. Sekuri, C. No association of interleukin-6 gene polymorphism (-174 G/C) with premature coronary artery disease in a Turkish cohort / C. Sekuri, F.S. Cam, A. Sagcan [et al.] // Coronary Artery Dis. –2007. – Vol. 18. – P. 333- 337. 376. Selvina E. A comprehensive histopathological evaluation of vascular medial fibrosis: Insights into the pathophysiology of arterial stiffening / E. Selvina, S.S. Najjar, T. C. Cornish, M. K. [et al.] // Atherosclerosis. – 2010. – Vol. 208, № 1. – P. 1-11. 377.Shanker, J. Implications of Genetic Polymorphisms in Inflammation-Induced Atherosclerosis / J. Shanker, V.V. Kakkar // Open. Cardiovasc. Med. J. – 2010. – Vol. 4. – P. 30–37. 378. Shanker, J. Genotype-phenotype relationship of F7 353Q polymorphism and plasma factor VII coagulant activity in Asian Indian families predisposed to coronary artery disease./ Shanker J, Perumal G, Maitra A [et al.] // J Genet. – 2009. – Vol. 88, № 3. – Р. 291–297. 379. Shen, Y. Dietary quercetin attenuates oxidant-induced endothelial dysfunction and atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice fed a high-fat diet: a critical role for heme oxygenase-1 / Y. Shen, N. C. Ward, J. M. Hodgson [et al.] // Free. Radic. Biol. Med. – 2013. – Vol. 65. – P. 908-915. 380.Shiba, Y. M-CSF accelerates neointimal formation in the early phase after vascular injury in mice. The critical role of the SDF-1-CXCR4 system / Y. Shiba, M. Takahashi, T. Yoshioka [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2007. – Vol. 27, № 2. – P. 283-289. 381.Sie, M. P. Interleukin 6-174 G/C promoter polymorphism and risk of coronary heart disease: results from the rotterdam study and a meta-analysis / M. P. Sie, F.A. Sayed-Tabatabaei, H. H. Oei [et al.] // Arterioscler. Thromb.Vasc. Biol. – 2006. – Vol. 26, № 1. – P. 212-217. 286 382.Signorelli, S.S. Patients with unrecognized peripheral arterial disease (PAD) assessed by ankle-brachial index (ABI) present a defined profile of proinflammatory markers compared to healthy subjects / S.S. Signorelli, M. Anzaldi, V. Fiore [et al.] // Cytokine. – 2012. – Vol. 59, № 2. – P. 294-298. 383.Sivapalaratnam, S. Genome-Wide Association Studies in Atherosclerosis / S. Sivapalaratnam, S.Motazacker, G. Maiwald, K. Hovingh [et al.] // Curr. Atheroscler. Rep. – 2011. – №. 13. – P. 225-232. 384.Smith, E. Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice / E. Smith, K. M. Prasad, M. Butcher [et al.] // Circulation. – 2010. – Vol. 121, № 15. – P. 1746-1755. 385.Solomon, G. Effect of peripherally administered leptin antagonist on wholebody metabolism, and bone microarchitecture and biomechanical properties in mouse / G. Solomon, A.Atkins, R. Shahar [et al.] // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. – 2014. – Vol. 306, №1. – P. 14-27. 386.Stamler, J. Diet-heart: a problematic revisit / J. Stamler // Am. J. Clin. Nutr. – 2010. – Vol. 91, № 3. – P. 497-499. 387. Stein, J.H. Use of carotid ultrasound to identify subclinical vascular disease and evaluate cardiovascular disease risk: a consensus statement from the American Society of Echocardiography Carotid Intima-Media Thickness Task Force. Endorsed by the Society for Vascular Medicine / J.H. Stein, C.E. Korcarz, R.T. Hurst [et al.] // J. Am. Soc. Echocardiogr. – 2008. – Vol. 21, № 2. – P. 93-111. 388.Stelzer , I. Link between leptin and interleukin-6 levels in the initial phase of obesity related inflammation / I. Stelzer , S. Zelzer , R. B. Raggam [et al.] // Transl. Res. – 2012. – Vol. 159, № 2. – P. 118-124. 389. Stępień, M. SSerum concentrations of adiponectin, leptin, resistin, ghrelin and insulin and their association with obesity indices in obese normo- and hypertensive patients - pilot study / M. Stępień, R.N. Wlazeł, M. Paradowski [et al.] // Med. Sci. – 2012. – Vol. 8, № 3. – P. 431-336. 390.Su, J. Antibodies of Ig M subclass to phosphorylcholine and oxidized LDL are protective factors for atherosclerosis in patients with hypertension / J. Su, 287 A. Georgiades, R. Wu [et al.] // Atherosclerosis. – 2006. – Vol. 188, № 1. – P. 160-166. 391.Sundström, J. Relations of plasma matrix metalloproteinase-9 to clinical cardiovascular risk factors and echocardiographic left ventricular measures. The Framingham Heart Study / J. Sundström, J. C. Evans, E. J. Benjamin [et al.] // Circulat. – 2004. – Vol. 109, № 23. – P. 2850-2856. 392.Sundström, J. Relations of plasma total TIMP-1 levels to cardiovascular risk factors and echocardiographic measures: the Framingham heart study / J. Sundström, J. C. Evans, E. J. Benjamin [et al.] // Eur. Heart. J. – 2004. – Vol. 25, № 17. – P. 1509-1516. 393.Superko, H.R. Lipid management to reduce cardiovascular risk: a new strategy is required / H. R. Superko, S. King 3rd // Circulation. – 2008. – Vol. 117, № 4. – P. 560-568. 394.Superko, H.R. Genetic Testing for Early Detection of Individuals at Risk of Coronary Heart Disease and Monitoring Response to Therapy: Challenges and Promises / H. R. Superko, R. Roberts, A. Agatston [et al.] // Curr. Atheroscler. Rep. – 2011. – Vol.13, № 5. – P. 396-404. 395.Speid, W.S. The complement component C5a is present in human coronary lesions in vivo and induces the expression of MMP-1 and MMP-9 in human macrophages in vitro / W. S. Speid, S. P. Kast, R. Hutter [et al.] // FASEB J. – 2011. – Vol. 25, № 1. – P. 35-44. 396.Syamsunder, A.N. Association of sympathovagal imbalance with cardiovascular risks in overt hypothyroidism / A.N. Syamsunder, G.K. Pal, P. Pal, C.S. Kamalanathan // N. Am. J. Med. Sci. – 2013. –Vol. 5, № 9. – P. 554-561. 397.Tacke, F. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniquesт / F.Tacke, R.Weiskirchen // Expert. Rev. Gastroenterol. Hepatol. – 2012. – Vol. 6, № 1. – P. 67-80. 398.Takasu, J. Relationships of thoracic aortic wall calcification to cardiovascular risk factors: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA) / J. Takasu, R. Katz, K. Nasir [et al.] // Am. Heart. J. – 2008. – Vol.155, № 4. – P. 765-771. 288 399.Takasu, J. Relationship between coronary artery and descending thoracic aortic calcification as detected by computed tomography: The Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis / J. Takasu, M. J. Budoff, K. D. O'Brien [et al.] // Atherosclerosis. – 2009. – Vol. 204, № 2. – P. 440-446. 400.Takasu, J. Relationship between common carotid intima-media thickness and thoracic aortic calcification: the multi-ethnic study of atherosclerosis / J. Takasu, M. J. Budoff, R. Katz [et al.] // Atherosclerosis. – 2010. – Vol. 209, № 1. – P. 142-146. 401.Taleb, S. Interleukin-17: friend or foe in atherosclerosis / S. Taleb, A. Tedgui, Z. Mallat // Current Opinion in lipidology. – 2010. – Vol. 21, № 5. – P. 404- 408. 402.Tamehiro, N. SPTLC1 binds ABCA1 to negatively regulate trafficking and cholesterol efflux activity of the transporter // N. Tamehiro, S. Zhou, K. Okuhira [et al.] // Biochemistry. – 2008. – Vol. 47, № 23. – P. 6138-6147. 403.Tan, J. Clinical implications of elevated serum interleukin-6, soluble CD40 ligand, metalloproteinase-9, and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction / J. Tan , Q. Hua, J. Gao, Z.X. Fan [et al.] // Clin. Cardiol. – 2008. – Vol. 31, № 9. – P. 413-438. 404.Tanindi, A. Relationship Between MMP-1, MMP-9, TIMP-1, IL-6 and Risk Factors, Clinical Presentation, Extent and Severity of Atherosclerotic Coronary Artery Disease / A. Tanindi, A. Sahinarslan, S. Elbeg , M. Cemri // Open Cardiovasc Med J. – 2011. – Vol. 5. – P. 110-116. 405. Tao, R. Regulating regulatory T cells to achieve transplant tolerance / R. Tao, W.W. Hancock // Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. – 2007 – Vol. 6, № 4 – P. 348-357. 406.Tayebjee, M.H. Abnormal circulating levels of metalloprotease 9 and its tissue inhibitor 1 in angiographically proven peripheral arterial disease: relationship to disease severity / M.H. Tayebjee, K. T. Tan, R J. MacFadyen, G.Y. Lip // J. Intern.Med. – 2005. – Vol. 257, №1 – P. 110-116. 407.Teles, R. Mechanisms involved in the association between peridontal diseases and cardiovascular disease / R. Teles, C.Y. Wang // Oral. Dis. – 2011. – Vol. 17, № 5. – P. 450-461. 289 408.Teng, M. S. Association between C-reactive protein gene haplotypes and Creactive protein levels in Taiwanese: interaction with obesity / M. S. Teng, L.A. Hsu, S. Wu [et al.] // Atherosclerosis. – 2009. – Vol. 204, № 2. – P. 64-69. 409. Tereshin, E.V. A role of fatty acids in the development of oxidative stress in aging. A hypothesis / E.V. Tereshin //Adv. Gerontol. – 2007. – Vol. 20, № 1. –P. 59-65. 410.Testa, M. Circulating levels of cytokines and their endogenous modulators in patients with mild to severe congestive heart failure due to coronary artery disease or hypertension free / M. Testa, M. Yeh, P. Lee [et al.] //J. Am. Coll. Cardiol. – 1996. – Vol. 28, № 4. – P. 964-971. 411.Tipping, P.G. Production of tumor necrosis factor and interleukin-1 by macrophages from human atheromatous plaques / P.G. Tipping, W.W. Hancock // Am. J. Pathol. – 1993. – Vol. 142, № 6. – P. 1721-1728. 412.Tirapelli, C. R. Effect of ethanol consumption on blood pressure and rat mesenteric arterial bed, aorta and carotid responsiveness / C.R. Tirapelli, A.F. Leone, E.B. Coelho [et al.] // J. Pharm. Pharmacol. – 2007. – Vol. 59, № 7. – P. 985-993. 413.Tomaszewski, M. Association between lipid profile and circulating concentrations of estrogens in young men / M. Tomaszewski, F. J. Charchar, C. Maric [et al.] // Atherosclerosis. – 2009. – Vol. 203, № 1. – P. 257-262. 414.Tousoulis, D. Role of inflammation and oxidative stress in endothelial progenitor cell function and mobilization: therapeutic implications for cardiovascular diseases / D. Tousoulis, I. Andreou, C. Antoniades [et al.] // Atherosclerosis. – 2008. – Vol. 201, №2 – P. 236-247. 415.Trompet, S. Genetic variation in the interleukin-10 gene promoter and risk of coronary and cerebrovascular events: the PROSPER study / S. Trompet, D.E. Pons, A.J.Craen, P. Slagboom [et al.] // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2007. – Vol. 1100. – P. 89-98. 416.Tsuchida, K. Ingibitors of the TGF beta superfamily and their clinical applications / K.Tsuchida, Y. Sunada, S.Noji [et al.] // Mini Rev. Med. Chem. – 2006. – Vol. 6, №. 11. – P. 1255-1261. 290 417.Tuomainen, A.M. Serum matrix metalloproteinase-8 concentrations are associated with cardiovascular outcome in men / A.M. Tuomainen, K. Nyyssönen, J. A. Laukkanen [et al.] // Arterioscler. Thromb.Vasc.Biol. – 2007. – Vol. 27, № 12. – P. 2722-27288. 418.Tziakas, D.N. Anti-inflammatory cytokine profile in acute coronary syndromes: behavior of interleukin-10 in association with serum metalloproteinases and proinflammatory cytokines / D.N. Tziakas , G.K. Chalikias, H.I. Hatzinikolaou [et al.] // Int. J. Cardiol. – 2003. – Vol. 92, № 2-3. – P. 169-175. 419.Valgimigli, M. Tumor necrosis factor-α receptor 1 is a major predictor of mortality and new-onset heart failure in patients with acute myocardial infarction. the Cytokine-Activation and Long-Term Prognosis in Myocardial Infarction (CALPHA) study / M. Valgimigli, C. Ceconi, P. Malagutti [et al.] // Circulation. – 2001. – Vol. 111, № 7. – P. 863–870. 420.Van Es, T. Attenuated atherosclerosis upon IL-17R signaling disruption in LDLr deficient mice / T. van Es, G.H. van Puijvelde, O.H. Ramos [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2009. – Vol. 388, № 22. – P. 261-265. 421.Van Gaal, L. Efficacy and safety of rimonabant for improvement of multiple cardiometabolic risk factors in overweight/obese patients: pooled 1-year data from the Rimonabant in Obesity (RIO) program / L. Van Gaal, X. Pi-Sunyer J.P. Després [et al.] // Diabetes Care. – 2008. – Vol. 31, Suppl 2. – P. 229-240. 422.Van Meer, G. Membrane lipids: where they are and how they behave / G. van Meer, D.R. Voelker, G.W. Feigenson // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. – 2008. – Vol. 9, № 2. – P. 112-124. 423.Van Tassell, B.W. Interleukin-1 trap attenuates cardiac remodeling after experimental acute myocardial infarction in mice / B.W. Van Tassell , A. Varma , F.N. Salloum [et al.] / J. Cardiovasc. Pharmacol. – 2010. – Vol. 55, № 2. – P. 117-122. 424.Varani, J. Decreased collagen production in chronology aged skin / J. Varani, M. Dame, L. Rittie // Am. J. Pathol. – 2006. – Vol. 68, №1. – P. 1861-1868. 291 425.Virdis, A. Inducible nitric oxide synthase is involved in endothelial dysfunction of mesenteric small arteries from hypothyroid rats / A. Virdis, R. Colucci, M. Fornai [et al.] // Endocrinol. – 2009. – Vol. 150, № 2. – P. 1033-1042. 426.Virella, G. Infections and Immunity/ G. Virella, S. Tomlinson // Medical Immunology. – 6th Ed. – New York and London: Informa, 2007. – P. 183–200. 427.Virella, G. Humoral immune response and its induction by active immunization / G. Virella // Medical Immunology. – 6th Ed. – New York and London: Informa, 2007. – P. 159-172. 428.Virella, G. Atherogenesis and the humoral immune response to modified lipoproteins / G. Virella, M.F. Lopes-Virella // Atherosclerosis. – 2008. – Vol. 200, № 2. – P. 239-246. 429.Von Eynatten, M. Eynatten High-molecular weight adiponectin is independently associated with the extent of coronary artery disease in men / M. Von Eynatten, P.M. Humpert, A. Bluemm [et al.] // Atherosclerosis. –2008. – Vol. 199, №1. – P. 123-128. 430.Wang, L. The effect of leptin and its mechanisms on the migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells // L. Wang, H. Cao, X. Pang [et al.] // Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. – 2013. – Vol. 29, № 12. – P. 1272-1276. 431.Wang, X.L. Circulating transforming growth factor beta and coronary artery disease / X. L. Wang, S.X. Liu, D.E. Wilcken // Cardiovasc. Res. – 1998. – Vol. 37, № 3. – P. 829-830. 432.Wang, Z. Increased Th17 cells in coronary artery disease are associated with neutrophilic inflammation / Z. Wang, J. Lee, Y. Zhang [et al.] // Scand. Cardiovasc. J. – 2011. – Vol. 45, № 1. – P. 54-61. 433.Wanninger, J. MMP-9 activity is increased by adiponectin in primary human hepatocytes but even negatively correlates with serum adiponectin in a rodent model of non-alcoholic steatohepatitis / J. Wanninger, R. Walter, S. Bauer [et al.] // Exp. Mol. Pathol. – 2011. – Vol. 91, № 2. – P. 603-607. 292 434.Watson, T. Endothelial progenitor cells, endothelial dysfunction, inflammation, and oxidative stress in hypertension / T. Watson , P.K. Goon, G.Y. Lip // Antioxid. Redox. Signal. – 2008. – Vol. 10, № 6. – P. 1079-1088. 435.Weger, M. Role of the interleukin-6 -174 G>C gene polymorphism in retinal artery occlusion / M. Weger, I. Steinbrugger, A. Haas [et al.] // Stroke. – 2005. – Vol. 36, № 2. – P. 249-252. 436.Welsh, J.A. Caloric sweetener consumption and dyslipidemia among US adults / J.A. Welsh, A.Sharma, J.L. Abramson [et al.] // JAMA. – 2010. – Vol. 303, № 15. – P. 1490-1497. 437.Wendremaire, M. Effects of leptin on lipopolysaccharide-induced remodeling in an in vitro model of human myometrial inflammation. / M. Wendremaire, P. Mourtialon, F. Goirand [et al] // Biol. Reprod. – 2013. – Vol. 88, № 2. – P. 45. 438.Wenzel, P. Mechanisms underlying recoupling of eNOS by HMG-CoA reductase inhibition in a rat model of streptozotocin-induced diabetes mellitus / P. Wenzel, A. Daiber, A. M. Oelze [et al.] // Atherosclerosis. – 2008. – Vol. 198, № 1. – P. 65-6. 439.Wu, C.Y. Plasma matrix metalloproteinase-9 level is better than serum matrix metalloproteinase-9 level to predict gastric cancer evolution / C.Y. Wu, M.S. Wu, E.P. Chiang [et al.] // Clin. Cancer. Res. – 2007. – Vol. 13, № 7. – P. 2054-2060. 440.Wu, M. The expression of CD40-CD40L and activities of matrix metalloproteinases in atherosclerotic rats / M. Wu, Y.G. Li // Mol. Cell. Biochem. – 2006. – Vol. 282, № 1-2. – P. 141-146. 441.Wymann, M. P. Lipid signalling in disease / M. P. Wymann, R. Schneiter // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. – 2008. – Vol. 9, № 2. – P. 162-176. 442.Wynne, K. Diabetes. Subcutaneous oxyntomodulin reduces body weight in overweight and obese subjects: a double-blind, randomized, controlled trial / K. Wynne, A. J. Park , C. J. Small [et al.] // Diabetes. – 2005. – Vol. 54, № 8. – P. 2390-2395. 293 443.Xing, S.S. Over expression of IL-18 aggravates cardiac fibrosis and diastolic dysfunction in fructose-fed rats / S.S. Xing, X.P. Bi, H.W. Tan [et al.] // Mol. Med. – 2010. – Vol. 16, № 11-12. – P. 465-470. 444.Xu, X.L. The expression of matrix metalloproteinase-2, 9 on atherosclerosis in experimental rats by treatment of 2,3,4',5-tetrahydroxystilbene - 2-0-beta-D glucoside / X.L. Xu, F. Li, C.H. Wang [et al.] // Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. – 2009. – Vol. 25, № 1. – P. 91-95. 445.Xue, Z.W. Effects of Shen shao Decoction on the inflammatory response in the aorta of a rat atherosclerotic model / Z.W. Xue, X.M. Shang, S.H. Lv [et al.] 2013. – Vol. 19, № 5. – P. 347-352. 446.Yamada, Y. Genetic risk for ischemic and hemorrhagic stroke / Y. Yamada, N. Metoki, H. Yoshida [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2006. – Vol. 26, № 8. – P. 1920-1925. 447.Yan, D. ABCA1 expression and cholesterol efflux from macrophages / D. Yan, M. I. Mayranpaa, J. Wong [et al.] // J. Biol. Chem. – 2008. – Vol. 283, № 1. – P. 332-340. 448.Yang, S.N. Transforming growth factor-β regulation of proteoglycan synthesis in vascular smooth muscle: contribution to lipid binding and accelerated atherosclerosis in diabetes / S. N. Yang, M. L. Burch, L. R. Tannock [et al.] // J. Diabetes. – 2010. – Vol. 2, № 4. – P. 233-242. 449.Yang, X.F. Factors regulating apoptosis and homeostasis of CD4+ CD25(high) FOXP3+ regulatory Tcells are new therapeutic targets / X. F. Yang // Front. Biosci. – 2008. – Vol. 13. – P. 1472-1499. 450.Ye, S. Influence of matrix metalloproteinase genotype on cardiovascular disease susceptibility and outcome / S. Ye // Cardiovasc. Res. – 2006. – Vol. 69, № 3. – P. 636-645. 451.Yubero-Serrano, E.M. Oxidative stress is associated with the number of components of metabolic syndrome: LIPGENE study / E. M. Yubero-Serrano, J. Delgado-Lista, P. Peña-Orihuela [et al.] // Exp. Mol. Med. – 2013. – Vol. 45, № 6. – P. 28. 294 452.Zernecke, A. Chemokines in atherosclerosis: an update / A. Zernecke, E. Shagdarsuren, C. Weber // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2008. – Vol. 28, № 11. – P. 1897-1908. 453.Zhand, X. Interleukin-17A gene variants and risk of coronary artery disease: a large angiography-based study // Clinica chimica acta. – 2011. – Vol. 412, №. 3-4. – P. 327-331. 454.Zhang, H.F. Effects of mild moxibustion on contents of blood lipoids and serum NO in hyperlipidemia rat / H. F. Zhang, L. L. Wang, M.Y. Ji, X.Y. Zhou // Zhongguo. Zhen. Jiu. – 2013. – Vol. 33, № 5. – P. 438-442. 455.Zhang, W. 2,3,4',5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside suppresses matrix metalloproteinase expression and inflammation in atherosclerotic rats / W. Zhang, C.H. Wang, F. Li, W.Z. Zhu // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2008. – Vol. 35, № 3. – P. 310-316. 456.Zhang, Y.M. Expression of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1 during aging in rat liver / Y.M. Zhang, X.M. Chen, D. Wu, S.Z. Shi // World J. Gastroenterol. – 2005. – Vol. 11, № 24. – P. 3696-3700. 457.Zhang, Y. M. Expression of tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in aging of transgenic mouse liver / Y.M. Zhang, X.M. Chen, D.Wu [et al.] // Chin. Med. J. (Engl). – 2006. – Vol. 19, № 6. – P. 504–509. 458.Zhou, Y. Decreased adiponectin and increased inflammation expression in epicardial adipose tissue in coronary artery disease / Y. Zhou, Y. Wei, L. Wang [et al.] // Cardiovasc. Diabetol. – 2011. –Vol. 12, № 10. – P. 2. 459.Zhou, L. IL-6 programs T(h)-17 cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 and IL-23 pathways / L. Zhou, I.I. Ivanov, R. Spolski [et al.] // Nat. Immunol. –2007. – № 8, № 9. – P. 967-974. 460.Zhou, X. Z. Decreased protein and gene expression of hepatic cholesterol 7ahydroxylase associated with dilated endoplasmic reticulum in chronic hypothyroid rats // X. Zhou, Y. Han, J. Liu [et al.] // Pathol. Int. – 2009. –Vol. 59, № 10. – P. 729-734. 295 461.Zubelewicz-Szkodzińska, B. Simvastatin decreases concentration of interleukin2 in hypercholesterolemic patients after treatment for 12 weeks / B. ZubelewiczSzkodzińska, J. Szkodziński, W. Romanowski [et al.] // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. – 2004. –Vol. 18, № 3-4. – P. 295-301.
