общие вопросы выбора метода выделения роль процессов
реклама
ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ВЫБОРА МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ РОЛЬ ПРОЦЕССОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БАВ СТАДИИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ОБОРУДОВАНИЕ В ПРОЦЕССАХ ВЫДЕЛЕНИЯ ОЧИСТКА ПРОДУЦЕНТОВ БИОМАССЫ ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ОЧИСТКИ ПРОДУЦЕНТОВ БИОМАССЫ Гарбуз С.А. Гарбуз Семен Александрович/Garbuz Semjon Alexandrovich, студент, кафедра биохимии и биотехнологии, биологический факультет Общие вопросы выбора метода выделения Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных суспензий или растворов, при этом характерно невысокое содержание основного компонента и наличие многих примесных веществ.[1] В большинстве промышленных производств на первом этапе переработки культуральной жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию. Жидкость далее также подвергается переработке, если содержит метаболиты, представляющие практическую ценность. В производствах, где целевым продуктом являются клетки как источник белка, культуральная жидкость подвергается лишь очистке, позволяющей использовать водную фазу многократно и снизить образование сточных вод. Технологические приемы, используемые для отделения клеток от среды зависят от природы продуцента. Например, сахаромицеты (хлебопекарные дрожжи) имеют относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. В дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и получают продукт с высоким содержанием живых клеток, имеющих высокую хлебопекарную активность.[1] Дрожжи же рода Candida, служащие источником кормового белка плохо флотируются и фильтруются. Поэтому дрожжи, растущие на углеводородах, а также бактерии-продуценты белка на основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются, причем в несколько ступеней. Оставшаяся вода ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru удаляется путем выпаривания, а все компоненты жидкой фазы остаются в конечном продукте. К аналогичному приему прибегают и при производстве бактериальных энтомопатогенных препаратов и удобрений. Конечный продукт удается получить в активной форме лишь в принципе отказавшись от выделения его из культуральной жидкости: содержимое реактора выпаривают и сушат в условиях, обеспечивающих жизнеспособность конечного продукта. Неутилизированные компоненты культуральной жидкости могут отразиться на способности продукта к хранению.[3] При выделении и очистке метаболитов биомасса, если она не содержит заметных количеств целевого продукта, осаждается добавлением извести или других твердых компонентов, увлекающих клетки или мицелий на дно физическое осаждение.[1] Отделение твердой фазы (мелкодисперсный клеточный материал, внутриклеточные биополимеры) возможно и методом фильтрации. Так как фильтруемая суспензия склонная к гелеобразованию, то производительность фильтров быстро падает. Предотвратить это можно добавлением в смесь или на фильтрующую ткань размолотых вулканических пород, содержащих оксиды кремния и алюминия, тогда осадки приобретают пористую структуру.[5] Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость.[13] Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор. Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента (например интерферонов, гормонов) вводится стадия разрушения клеточных ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы. К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпресия (сжатие с последующим резким снижением давления).[6] Химические и химико-ферментативные методы более избирательны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Культуральную жидкость освобождают от сопутствующих растворимых веществ и фракционируют. Освобождение от растворимых веществ производят несколькими способами: 1. Осаждение – концентрирование) физическое или (нагревание, химическое (с охлаждение, помощью разбавление, органических и неорганических веществ).[2] Осаждение органическими растворителями основано на снижении диэлектрической постоянной среды. Устойчивость белковых растворов обусловлена наличием гидратного слоя у молекулы. Если его разрушить, белки осаждаются. Для этого молекулы добавляемых веществ должны быть более гидрофильны, чем молекулы белков. В качестве осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. При разных количествах растворителя и разных значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50% этанол осаждает 80% протеазы и 3-5% амилазы, 70% спирт осаждает 98% амилазы.[15] Высаливание - механизм тот же, что и при действии органических веществ, гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как наиболее дешёвый реагент используют сульфат аммония. Также применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия.[14] ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru 2. Экстракция. При твердожидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую, при жидкожидкофазной – из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Для извлечения антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов применяют жидкожидкофазную экстракцию, когда культуральную жидкость смешивают с органическими растворителями.[14] 3. Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент – твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: - катионит карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); - анионит - диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по ионообменному механизму.[14] Роль процессов выделения и очистки биологически активных веществ Завершающие стадии биотехнологических процессов - выделение целевого продукта - существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке, или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является клеточная биомасса. Наиболее сложным является выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть их разрушению, а затем целевой продукт очистить от остатков разрушенных клеток. Выделение продукта существенно облегчается, если он экскретируется продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому одной из насущных задач биотехнологии является создание микроорганизмов, секретирующих промышленных возможно большее число штаммов ценных продуктов в значительных количествах.[5] Технология выделения и очистки в значительной степени определяется природой целевого продукта. В ряде случаев существует возможность не ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru использовать тщательную очистку продукта, если он обладает требуемыми активностями в неочищенном состоянии и если примесь посторонних веществ не оказывает каких-либо нежелательных влияний при его использовании. Некоторые традиционные биотехнологические процессы вообще исключают этап отделения продукта.[6] Первым этапом в процессе очистки целевого продукта является разделение культуральной жидкости и клеточной биомассы - сепарация. В некоторых случаях сепарации предшествует специальная обработка реакционной смеси, способствующая более эффективному отделению биомассы и стабилизации выделяемого продукта. Применяются различные методы сепарации. Флотация. Метод используется в том случае, если клетки продуцента в силу низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях содержимого биореактора. Особые устройства (флотаторы) различной конструкции удаляют образующуюся при культивировании пену вместе с прилипшими к пузырькам газа клетками. Повышение эффективности отбора биомассы достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя механическим путем. Достоинствами метода являются его экономичность, высокая производительность и возможность использования в непрерывных процессах.[7] Фильтрация. Различны применяемые в настоящее время фильтрующие системы (барабанные, ленточные, тарельчатые фильтры, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы, мембранные фильтры) основаны на одинаковом принципе - задержке биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Недостатком способа является налипание клеток на фильтре, слой которых снижает скорость протока жидкости в процессе фильтрования. Для фильтров непрерывного действия предусматриваются системы автоматической очистки от биомассы, забивающей поры. Она может сдуваться с поверхности фильтров сжатым воздухом или удаляться специальными "ножами".[8] ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru Существуют также фильтры для многократного или однократного периодического использования. Например, мембранные (в частности, тефлоновые) фильтры, позволяющие фильтровать очень разбавленные клеточные взвеси. Однако проблемой их использования является быстрая закупорка пор клетками, белками и другими коллоидными частицами. Центрифугирование. Данный способ требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование, поэтому он применяется, если: а) суспензия фильтруется слишком медленно; б) возникает необходимость максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся в ней частиц; в) требуется обеспечить непрерывный процесс сепарации, когда фильтры рассчитаны на периодическое действие.[9] Методы разрушения клеток. Разрушение клеток проводится физическими, химическими и ферментативными методами. Наибольшее промышленное значение имеют физические способы дезинтеграции: - ультразвуком; - лопаточными или вибрационными дезинтеграторами - метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках; - встряхиванием со стеклянными бусами; - продавливанием через узкие отверстия под высоким давлением; - раздавливанием замороженной массы; - растиранием в специальных ступках; - с помощью осмотического шока; - многократным замораживанием и оттаиванием; - сжатием клеточной взвеси с последующим резким снижением давления (декомпрессией).[10] Физические способы дезинтеграции отличаются большей экономичностью в сравнении с другими методами, однако они характеризуются отсутствием ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru выраженной специфичности, вследствие чего обработка может отрицательно влиять на качество получаемого целевого продукта. Мягкое и избирательное разрушение клеточной стенки обеспечивается применением химических и ферментативных методов. Так, бактериальные клетки разрушаются лизоцимом в присутствии ЭДТА (этилен- диаминтетрауксусной кислоты), а клеточные стенки дрожжей зимолиазой улитки или ферментами грибного либо актиномицетного происхождения. Клеточные стенки микроорганизмов могут быть разрушены путем обработки толуолом или бутанолом. Элективный лизис клеток вызывается воздействием ряда антибиотиков: полимиксин, новобиоцин, нистатин и др. После дезинтеграции клеток необходимо избавляться от их "обломков", для чего используют те же методы, что и при сепарации, т.е. центрифугирование или фильтрацию.[13] Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или получаемого в результате процессов дезинтеграции гомогената разрушенных клеток осуществляется путем осаждения, экстракции или различных методов адсорбции.[16] Осаждение растворенных веществ осуществляется физическими (нагревание, разведение или концентрирование, охлаждение раствора) или химическими воздействиями, переводящими растворенное вещество в малорастворимое состояние.[12] Экстракция подразделяется на твердо-жидкофазную (при которой продукт из твердой фазы переходит в жидкую) и жидкожидкофазную (когда обеспечивается перевод продукта из одной жидкой фазы в другую, также жидкую фазу).[10] Твердо-жидкофазная экстракция сводится порой к простой обработке твердого образца водой или органическим растворителем с целью извлечения из него растворимых соединений. Достаточно широко применяются различные органические растворители, в частности экстрагирование ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru ацетоном, который эффективно переводит в раствор ряд липидных и белковых компонентов клеток.[14] При жидко-жидкофазной экстракции используются различные органические растворители - алкилфенолы, эфиры, галогениды, гексан, хлороформ и др. Почти полностью избежать инактивации позволяют методы экстрагирования на холоде, т. е. путем использовании методов криоэкстракции. При этом уравниваются различия между твердым субстратом и культуральной жидкостью, поскольку и то и другое находится в замороженном состоянии (в одной фазе). Криоэкстракция проводится с применением растворителей, температура кипения которых низка и при обычной комнатной температуре находится в газообразном состоянии.[12] Адсорбция является достаточно распространенным методом отделения продукта и рассматривается в качестве частного случая экстракции, при котором экстрагирующим агентом служит твердое тело. Механизм ее сводится к связыванию выделяемого из жидкой или газообразной фазы вещества поверхностью твердого тела. Традиционными адсорбентами являются древесный уголь, пористые глины и т. п.[13] Более современные методы разделения веществ включают хроматографию, электрофорез, электрофокусировку, которые основаны на принципах экстракции и адсорбции.[13] Оборудование в процессах выделения Культуральная жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многофазную систему: в водной фазе содержатся клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, непотреблен-ные компоненты питательной среды, мельчайшие капельки жира, пузырьки воздуха, как правило, мел. В свою очередь водная фаза культуральной жидкости (нативный раствор) включает большое число органических и неорганических веществ, коллоидных фракций белков, сухой остаток культуральной жидкости - до 17% и более; содержание биомассы в ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru культуральной жидкости достигает 8-10%. Концентрация целевого продукта чаще всего не превышает 1,5%, что составляет менее 10% сухого остатка. В зависимости от целевого назначения конечного продукта (для здравоохранения, технических целей, сельского хозяйства и т. д.) реализуют различной степени сложности схемы производства, при этом учитывают и место накопления целевого продукта - внутриклеточно или внеклеточно. Если способы выделения целевых продуктов можно разделить на несколько типовых групп, то очистка каждого из них практически индивидуальна, поскольку зависит от физико-химических свойств конкретного вещества.[13] Примером наиболее простой схемы может служить производство биовита, базирующегося на использовании продуцента антибиотика хлортетрациклина. Кальциевый комплекс хлортетрациклина осажадают из культуральной жидкости при pH выше 7,0. Формирующийся при этом осадок увлекает с собой и клетки продуцента. Так в осадке вместе с биомассой оказываются внеклеточный антибиотик и внутриклеточный витамин В12. Осадок фильтруют, высушивают, размельчают, добавляют отруби в качестве наполнителя и фасуют. Этот комплекс используют в качестве добавки к корму для скота.[15] Если целевым продуктом является биомасса клеток, например, кормовые или пекарские дрожжи, необходимо их концентрирование (сгущение). При этом широко применяют флотацию, с помощью которой увеличивают концентрацию дрожжей в 4-6 раз. Основной движущей силой флотации являются всплывающие пузырьки газа, которые захватывают клетки и выносят их на поверхность. В результате над слоем отработанной культуральной жидкости сконцентрированы образуется дрожжи. Процесс пенный слой, проводят в в котором специально предназначенных для этой цели емкостных аппаратах - флотаторах, в ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru которые нагнетают воздух и, в зависимости от их конструкции, диспергируют его через барботер или эжектор, пену гасят в специальной части аппарата с помощью пеногасителя и выводят сконцентрированную суспензию дрожжей.[15] Для последующего концентрирования дрожжей широко применяют сепарирование, например, с помощью сепаратора-сгустителя непрерывного действия тарельчатого типа СОС-501 К-3. Для сгущения суспензии дрожжей от 20-30 г/л до 550-600 г/л необходимо последовательное сепарирование в 23 ступени.[15] Методы извлечения целевых продуктов из клеток зависят от свойств изолируемых веществ. Полиеновые антибиотики, например, экстрагируют органическими растворителями из нативных клеток, тогда как эндоферменты получают из разрушенных (дезинтегрированных) клеток. На рисунке 7 представлена схема процесса выделения L-аспарагиназы. Клетки отделяют на дисковой центрифуге (позиция 4), позволяющей концентрировать от 6 г/л до 120 г/л по массе сухих веществ. Разрушение клеток проводят в гомогенизаторе (позиция 5) при двукратном пропускании высвобождается до 97% фермента. От остатков клеток освобождаются после добавления этанола (позиция 9) до 30% концентрации с последующей фильтрацией на ротационном фильтре (позиция 10). Затем фермент осаждают метанолом при его концентрации в маточнике 50% (позиция И), фильтруют (позиция 12), растворяют в воде и переосаждают (позиция 13) при концентрации метанола 60%. Осадок центрифугируют (позиция 12), снова растворяют в воде (позиция 14) и концентрируют ультрафильтрацией (позиция 16), затем выделяют с помощью сефадекса ДЕАЕ-А50 (позиция 19), осажадют этанолом (0,6 объема) при pH 5,0 (позиция 27) и собирают в корзинчатой центрифуге (позиция 28). Осадок еще раз растворяют в воде (позиция 29), стерилизуют фильтрацией через мембрану (позиция 30), разливают (позиция 32) и подвергают сублимационной сушке (позиция 34).[12] ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru Выделение большей части продуктов микробного синтеза из культуральной жидкости начинают при их содержании около 1,5%. Чтобы иметь возможность выделить вещество, используя осаждение, кристаллизацию или высушивание, необходимо оперировать с растворами, содержащими 15-20% целевого продукта. Вот почему приходится применять разномасштабное оборудование по ходу процесса: вначале необходимы емкости в несколько десятков м3, высокопроизводительное оборудование непрерывного или полунепрерывного действия, а завершают процесс небольшими аппаратами вместимостью порядка нескольких сотен и даже десятков литров с периодической загрузкой и выгрузкой, или лабораторное оборудование. Технологические показатели фильтрации культуральных жидкостей определяются свойствами их как дисперсных систем. Клетки микробовпродуцентов, например, грибов чаще всего образуют микроколонии различной плотности размером 16-600 мкм. Фильтрационные свойства жидкости обусловлены размерами отдельных гиф, типом микроколоний, характером роста мицелия. Эти факторы зависят от вида и штамма биообъекта, условий его культивирования.[11] Пенициллы и аспергиллы образуют легко фильтруемую биомассу, поэтому для получения нативного раствора в этом случае применяют барабанные вакуум-фильтры - аппарат непрерывного действия с фильтрующим основанием, расположенным на наружной цилиндрической поверхности горизонтального вращающегося барабана, частично погруженного в суспензию.[6] Культуральные жидкости после ферментации проактиномице-тов представляют собой густые суспензии с относительной вязкостью 50-1000 и с высоким содержанием твердой фазы. Они практически не расслаиваются при стоянии. Характерной особенностью и других бактериальных суспензий является изменчивость их фильтрационных свойств как во времени, так и от одной операции до другой.[6] ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru Необходимо также отметить, что образуемые осадки заметно сжимаемы (показатель сжимаемости 0,9), значит процесс фильтрации не может быть интенсифицирован повышением разности давления из-за соответственно возрастающего удельного сопротивления осадка. Такие суспензии без предварительной практически обработки невозможно. культуральной жидкости отфильтровать Предварительную обработку культуральной жидкости проводят с целью максимального перевода конечного продукта в ту фазу, из которой предполагают его выделить, а также для коагуляции коллойдных примесей и, следовательно, улучшения процесса фильтрации, для удаления или связывания в растворимые комплексы тех побочных веществ, которые затрудняют последующий процесс химической очистки. К тому же при коагуляции изменяется структура твердой фазы культуральной жидкости.[6] Применяют несколько видов коагуляции: неорганическими солевыми электролитами, органическими и неорганическими кислотами, термической обработкой, добавлением веществ, образующих наполнители. Эффективным методом коагуляции дисперсных систем является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами - флоккулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции, образуются флоккулы или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации. Для получения нативного раствора из труднофильтруемых культуральных жидкостей после коагуляции применяют вакуум-барабанный фильтр с намывным слоем - аппарат полунепрерывного действия. Перед работой на фильтрующую поверхность барабана намывают дренажный слой наполнителя. В качестве наполнителя используют суспензию порошков целлюлозы, перлита, древесной муки. Особенность работы такого фильтра (в отличие от вакуум-барабанного) состоит в том, что нож, предназначенный для съема осадка с барабана, имеет специальную микрометрическую подачу. С каждым оборотом барабана нож подается к центру, срезая ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru нафильтрованный осадок вместе с тонким слоем дренажа, обновляя таким образом фильтрующую поверхность; поэтому скорость фильтрации не снижается. На рисунке 8 представлена схема аппаратурного оформления процесса фильтрации культуральной жидкости на вакуум-барабанном фильтре с намывным слоем.[8] Очистка продуцентов биомассы Общие принципы очистки продуцентов биомассы Проведение этих стадий процесса обусловлено рядом технических сложностей, связанных, в основном, с нестабильностью (лабильностью) ферментов, потерей им активности под влиянием незначительных изменений внешних условий. Поэтому при выборе технологии выделения, концентрирования и очистки ферментных препаратов ищут решения, позволяющие проводить эти процессы в непрерывном режиме, с высокой скоростью, в "мягких" условиях и добиваться максимального обезвоживания образующихся осадков. Для уменьшения потерь продуктов применяют различные стабилизаторы ферментов, проводят процесс при оптимальном значении рН растворов, стараются обеспечить максимально возможную механизацию и автоматизацию всех процессов.[3] Процесс ультрафильтрации в режиме диализа позволяет получать высокоочищенные препараты. Для его осуществления в получаемый концентрат постоянно добавляют чистую воду. Такая пятикратная промывка позволяет в 250-300 раз повысить активность ферментного раствора, т.е. при концентрации 30% раствор содержит практически один белковый ферментный препарат.[2] На практике процесс ультрафильтрации проводят в циркуляционных аппаратах периодического действия. Перед подачей раствора на стадию ультрафильтрации из него предварительно удаляют клетки продуцента и для предотвращения развития посторонней микрофлоры на поверхности мембран подвергают стерилизующей фильтрации через специальные бактериальные ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru фильтры. В ходе проведения процесса ультрафильтрации в зависимости от свойств получаемого фермента раствор постоянно охлаждается до температуры 4-15* С.[6] Недостатком метода ультрафильтрации следует считать забивание пор мембраны осадками или адсорбированными молекулами, что приводит к снижению производительности Последнее требует мембранного периодического аппарата проведения во промывки времени. материала мембраны. Для предотвращения забивания пор мембраны осадками или сорбирующимися молекулами циркуляционный насос, используемый в этих установках, должен обеспечить линейную скорость потока жидкости через мембрану около 2-5 м/с. При таких скоростях наблюдается значительное гидравлическое сопротивление. Для его снижения на практике применяют две конструкции мембранных аппаратов: трубчатые мембранные аппараты и проточные с плоскими мембранными элементами, устанавливаемыми параллельно основному потоку раствора.[8] Для концентрирования и выделения ферментных препаратов часто применяют процесс высаливания. Он основан на уменьшении растворимости большинства белков в солевых растворах. Для этой цели в технологии чаще всего используют сульфат аммония как наиболее дешевый и хорошо растворимый реагент. Однако недостатком использования сульфата аммония является выделение аммиака при повышенных значениях рН раствора, что приводит к коррозии металлических частей оборудования.[12] Тот же эффект высаливания достигается при использовании сульфата натрия вместо сульфата аммония. Однако из-за меньшей по сравнению с сульфатом аммония растворимостью его можно использовать при температурах раствора не ниже 35-40*С. При охлаждении раствора наблюдается выпадение осадка сульфата натрия, что создает возможность его регенерации и повторного использования. Однако использование сульфата натрия предполагает повышение энергозатрат на нагревание растворов, ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru а пребывание ферментов в условиях повышенных температур способствует их инактивации. При проведении процесса высаливания большое значение имеет режим осуществления контакта соли с раствором фермента. Для высаливания можно брать соль в виде тонкоизмельченного порошка или в виде насыщенного раствора. В последнем случае процесс можно проводить в периодическом или непрерывном режиме. Установлено, что наибольший эффект - минимально необходимое количество соли на 1 кг осаждаемого белка - достигается при использовании соли в виде тонко измельченного порошка. Наименьший эффект достигается при непрерывном смешении насыщенного раствора соли с раствором фермента. Для достижения того же процента высаливания в последнем случае соли требуется в 1,3-1,5 раза больше.[17] Время образования осадков белков при высаливании для различных ферментов колеблется в пределах 0,5-12 часов. Время высаливания и необходимое для проведения процесса количество соли зависят от количества (процентного содержания) растворенных веществ. Чем их больше, тем меньшее количество воды подлежит связыванию. Так, например, для получения 1 кг препарата из культуральной жидкости требуется 45-50 кг соли, а из упаренного до 30%-ной концентрации раствора - только 1,4-1,6 кг. В получаемых таким образом осадках белка содержится 60-85% балластных веществ, в том числе 30-45% соли. Повторное использование операций растворение - высаждение дает возможность получать высоко-очищенные ферментные препараты для медицинских целей. Варьируя такие параметры, как температура и рН среды, в ряде случаев, возможно, осуществить фракционное высаждение белков. Для этого в присутствии соли изменяют рН исходного раствора или температуру, добиваясь денатурации балластной фракции белка. Последние необратимо ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru выпадают в осадок, который отделяют от маточного раствора. На последующей стадии уже выделяют целевой ферментный препарат. Довольно часто вместо соли используют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000. Он оказывает стабилизирующее воздействие на активные белки, легко отделяется от белка методом ионообменной хроматографии или ультрафильтрации.[14] В технологии выделения ферментов методом осаждения значительное место занимает процесс получения активных белков осаждением их с помощью органического растворителя. Действие органических растворителей основано на снижении диэлектрической постоянной среды, которая определяет величину силы электростатического взаимодействия между молекулами растворенного белка и растворителя. Устойчивость белковых растворов обусловлена толщиной гидратного слоя, окружающего молекулу белка. При разрушении этого гидратного слоя молекулы белка начнут образовывать конгломераты и выпадать в осадок. Для осуществления такого процесса необходимо использовать вещества более гидрофильные, чем осаждаемый белок. В качестве растворителей используют, в основном, этанол, метанол, изопропанол и ацетон. Варьируя тип органического растворителя, его количество, величину рН раствора можно проводить избирательное осаждение той или иной фракции белков. В технологии процесс осаждения органическим растворителем проводят в реакторе непрерывного и периодического действия. Для снижения процента потерь активности выделяемого фермента при смешении растворителя с водным раствором активных белков обе жидкости первоначально охлаждают до температур соответственно -8оС и 5-6о С. Полученную смесь, содержащую не менее 8-10% белков, тщательно перемешивают, и через 2030 мин происходит выпадение мелких частиц белка. Процесс осаждения проводят в вертикальном цилиндрическом аппарате с коническим днищем, снабженным мешалкой и рядом штуцеров для удаления жидкой фазы. ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru Потеря активности фермента на этой стадии составляет около 15%, в основном, по причине длительного контакта фермента с органическим растворителем. Организация процесса по способу непрерывного осаждения при времени контакта 10-15 мин позволяет снизить потери активности фермента на 20-25%.[15] Полученный на этой стадии осадок отделяют на центрифуге, промывают чистым этанолом и вновь сепарируют до остаточной влажности 30-35%. Для получения высокоочищенных ферментных препаратов, полученные на стадии выделения активные белки подвергают, как правило, сорбционной чистке. Поскольку в молекуле фермента присутствуют функциональные группы, сообщающие ей кислотный или основной характер, то обычно для этой цели используют метод ионного обмена на ионитах, полученных на основе целлюлозы: катионит КМЦ (карбоксиметилцеллюлоза) и анионит ДЭАЭ (диэтиламиноэтилцеллюлоза). В последние годы число различных ионитов сильно возросло, и для конкретного производства ферментного препарата существует возможность выбрать наилучший. Среди ионитов, получивших достаточно широкое распространение, необходимо отметить такие, как обработанный крахмал, сефадексы на основе декстрана, катиониты на основе полиметакриловой кислоты, аниониты на основе поливинилового спирта и др.[15] Процесс проводят в насадочных колоннах, через которые пропускается раствор фермента, или в аппаратах с мешалкой. В последнем случае предполагается последующее отделение твердой фазы. Десорбцию осуществляют элюирующими растворами, специально подобранными для каждого фермента и сорбента. Потери фермента на стадии сорбционной чистки не превышают 15%. Для получения более высокоочищенных ферментов используют различные препаративные методы. Среди них наибольшее распространение получили ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru такие, как диализ, гельфильтрация, вымораживание, электрофорез, аффинная хроматография и др.[1] Диализ - процесс диффузии ионов через полимерную мембрану под действием градиента концентраций. При этом за счет диффузии через мембрану удаляются соли и другие низкомолекулярные продукты, а их место в исходном растворе ферментного препарата занимают молекулы растворителя, в данном случае воды. И хотя исходный раствор фермента при этом увеличивается в объеме, но активность его возрастает в 3-4 раза. В последние годы с развитием промышленности по производству синтетических пленок сильно возрос интерес к использованию процесса диализа в промышленном масштабе и был создан для его осуществления ряд промышленных установок.[3] Разновидностью процесса диализа является электродиализ. Перенос ионов через мембраны осуществляется в этом случае не за счет градиента концентраций, а под действием электрического поля.[3] Гельфильтрация - хроматографический метод разделения, основанный на использовании высокопористых носителей со строго определенным размером пор. При этом молекулы, способные проникнуть в поры носителя, дольше задерживаются в его материале, так как проходят при этом больший путь. В качестве материалов для проведения процессов гельфильтрации используют декстраны с поперечными связями, полиакриламид, стекло и др. Вымораживание - метод основан на частичном замораживании раствора ферментного препарата. Образующиеся при этом кристаллы льда отделяют на центрифуге. Фермент концентрируется в водной фазе. Подбирая условия замораживания исходного раствора можно фракционировать белки по составу и еще более сконцентрировать целевой фермент. Электрофорез - метод, основанный на различной подвижности ионов в электрическом поле. Процесс достаточно длительный. За счет диффузии может происходить размытие концентрационных зон. Частичная ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru интенсификация процесса возможна за счет создания температурного градиента. Применяется, в основном, для получения высокоочищенных препаратов в лабораторных условиях. Аффинная хроматография - метод, основанный на способности ферментов избирательно связывать те или иные лиганды - субстраты, коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффекторы и т.п. Такое связывание весьма специфично, что позволяет выделить тот или иной фермент из множества других белков. Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители).[6] Заключение Современный уровень развития биотехнологии обусловлен общим прогрессом науки и техники, особенно - в течение последних 50 лет. Достаточно отметить лишь такие события, как установление структуры и функций нуклеиновых кислот, обнаружение ферментов рестрикции ДНК и выявление их значения в жизни клеток с последующим использованием в генно-инженерных работах, создание гибридом и получение моноклональных антител, внедрение ЭВМ и компьютерной техники в биотехнологические процессы и т. д. Изучение биотехнологии невозможно без знания основ химических дисциплин и, прежде всего, органической, биологической и коллоидной химии, ряда биологических дисциплин (общей биологии, микробиологии, ботаники, генетики, иммунологии, экологии), а также процессов и аппаратов химической и биологической технологии и ряда других общеинженерных дисциплин. ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru Биотехнологию относят к числу приоритетных наук, где можно прогнозировать более быстрые и важнейшие достижения для социальноэкономического прогресса общества. Основные направления совершенствования биотехнологической науки складываются из поиска новых продуцентов и совершенствования технологической схемы их производства. Сюда можно отнести такие процессы как, культивирование продуцентов, их очистка и выделение, а также способы идентификации. В данной курсовой работе были рассмотрены основные составляющие любого биотехнологического производства, а именно: культивирование продуцентов и аппаратура используемая для этого выделение и очистка продуцентов, технологическое оборудование, используемое для этого идентификация продуцентов, методы и способы. ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru Список литературы 1. Похило Н.Д., Уварова Н.И. Изопреноиды различных видов рода Betula // Химия природных соединений. 1988. №3. С. 325-341. 2. Экстрактивные вещества березы / Г.Н. Черняева, С.Я. Долгодворова, С.М. Бондаренко. – Красноярск: ИЛиД, 1986. – 123 с. 3. Долгодворова С.Я., Черняева Г.Н. Дубильные вещества коры березы. АН СССР. Биологические ресурсы лесов Сибири. – Красноярск, 1980. С. 137-143. 4. Коптелова Е.Н. Интенсификация процесса выделения бетулина из бересты с использованием СВЧ-поля / Е.Н. Коптелова, Л.Н. Кузнецова, Н.А. Кутакова, С.И. Третьяков // Лесной журнал. – 2013. – № 5. – С. 193-201. 5. Рязанова Т.В. Оптимизация процесса получения дубильного экстракта из луба березовой коры / Т.В. Рязанова, Б.Н. Кузнецов, С.А. Кузнецова и др. // Химия растительного сырья. – 2004. – № 3. – С. 29-33. 6. Планирование эксперимента в примерах и расчетах: учеб. пособие / Н.И. Богданович, Л.Н. Кузнецова, С.И. Третьяков, В.И. Жабин. – Архангельск: Северный (Арктический) федеральный университет, 2010. – 126 с. 7. Энтеробактерии: (Руководство для врачей)/ И. В. Голубева, В.А. Килессо, и др.- М.: Медицина, 1985,- 321 с. 8. Демин Ю.С. Влияние гирудотерапии на некоторые показатели свертывания крови у больных гипертонической болезнью // Труды военно мед. акад. им. Кирова. -Л.:- 1958,- С. 18-24. 9. Девени Т.,. Гергей Я,- Аминокислоты, пептиды и белки.-М.: Мир, 1976. 364с. 10. Ю.Девис Р., Ботстаин Д., Рот Дж. Генетика бактерий,- М.: Мир. 1984,176 с. 11.Живодеров В.М., Пинькевич Н.М. Гирудотерапия и некоторые показатели свертывания крови при гипертонической болезни. // Труды Владивост. мед. ин-та,-1962. № 1.С. 171-175. ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru 11. Фактор некроза опухоли и лимфотоксин эндогенные противоопухолевые антибиотики. / С. А. Кетлинский, Л. А. Белова, Л. А. Селезнева, В. А. Пасечник// Усп. совр. биол,- 1989,- Т.107,- С. 79-91. 12. Козлов A.M., Софьина З.П. Частота, сроки и тип метастазирования различных перевиваемых опухолей мышей//БЭБМ.-1978.-N 12,-С. 715-718. 13. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Пер. с англ.- М.: Мир, 1984,- 480 с. 14. Мгалоблишвили П.И., Мирианашвили К.А., Бартадзе Т.Л. Гирудотерапия при некоторых болезнях кожи // С-Пб. науч. тр. / Тбилисский ин-т дерматологии. -1941.-С. 2-3 ,С. 66-74. 15. Лабораторные методы исследования в клинике / В.В. Меньшиков, Л.Н. Делекторская, Р.П. Золотнитская, и др.: Справочник.- М.: Медицина, 1987.368 с ________________________________________________________________ «Экономика и социум» №1(20) 2016 www.iupr.ru
