Изучение субхронической токсичности препарата филграстима

ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ
Сравнительное изучение субхронической токсичности
доз препаратов <Название тестируемого препарата> и
<Название препарата сравнения> после 6 разовой
внутримышечной вакцинации крыс CD в течение 64 дней
Номер исследования:
Заказчик:
Представитель Заказчика:
ФИО, контактные координаты
Исследовательское учреждение:
Руководитель исследования:
ФИО, контактные координаты
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
1. Ключевые даты
Дата инициации исследования:
Первый день введения вещества:
Последний день введения вещества:
Первая некропсия:
Последняя некропсия:
2. Персонал (ответственные исполнители)
Руководитель исследования:
Подготовка доз:
Старший лаборант:
Ветеринарный врач:
Гистология:
Биохимия сыворотки:
Гематология:
3. Цель исследования
Цель исследования – изучить токсичность препарата < > по сравнению со «стандартным»,
зарегистрированным препаратом < > при 6 разовом внутримышечном введении самцам и
самкам крыс CD в течение 64 дней, а также изучить восстановление от эффекта при отмене
введения в течение 14 и 28 дней.
4. Дизайн исследования
Тестируемое, стандартное и контрольное вещество вводят внутримышечно один раз в день
на 1, 8, 15, 22, 27 и 36 дни исследования. Животным 1-ой группы вводится контрольное
вещество – фосфатный буфер. Животным 2-й и 3-й группы вводится, соответственно,
тестируемое или стандартное вещество из расчёта 1 человеческая доза на 1 животное (0,5
мл вакцины).
В течение периода введения у животных регистрируют прирост массы тела, потребление
корма, внешние проявления отклонений в состоянии здоровья.
На 50 и 64 дни после введения животных подвергают эвтаназии и определяют показатели
фармакологической активности и токсикологии.
Группа
1
2
3
Дата печати
Пол
Количество
животных/эвтаназия
Всего
После
24
часа
На 8
день
M
20
10
10
F
20
10
10
M
20
10
10
F
20
10
10
M
20
10
10
F
20
10
10
Вещество
Растворитель
< >
< >
Дозы,
чел.доза
Объём
введения,
мл/животное
0
0.5
im
1-20
0
0.5
im
61-80
1
0.5
im
21-40
1
0.5
im
81-100
1
0.5
im
41-60
1
0.5
im
101-120
Способ
введения
Номера
животных
стр 2 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
5. Регулирующие стандарты
Исследовательская организация будет следовать требованиям данного утвержденного
протокола исследования и стандартным операционным процедурам (СОП) лаборатории.
Данное исследование будет выполняться в соответствии с требованиями Правил
лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения
Российской Федерации №267 от 19.06.2003).
5.1.
Обеспечение качества исследования
Служба обеспечения качества исследовательской организации будет аудировать
протокол, выполнение исследования и итоговый отчет.
5.2.
Комиссия по биоэтике
Все процедуры с животными в исследовании будут рассмотрены и утверждены
институтской комиссией по уходу за животными и их использованию (IACUC) на
предмет соответствия нормативным требованиям.
6. Обоснование
6.1.
Необходимость исследования
<Актуальность исследования: важность, предназначение тестируемого перапарата>.
Данное исследование токсичности препарата < > в сравнении с токсичностью
зарегистрированного препарата < > при их однократном введении в большой дозе
регламентируется
требованиями
нормативного
документа
Министерства
Здравоохранения РД 42-28-8-89. «Доклинические испытания новых медицинских
иммунобиологических препаратов. Основные положения». Данное исследование
входит в комплекс доклинических исследований, необходимых для регистрации
продукта.
Информация, полученная в ходе данного исследования, не будет дублировать
результаты других проводимых ранее исследований.
6.2.
Выбор вида животных
Достижение цели исследования возможно только при использовании животных. Для
данного исследования были выбраны крысы как вид, общепринятый для
доклинических исследований.
6.3.
Количество животных
Количество животных, используемое в исследовании, достаточно для полной
регистрации изучаемых эффектов. В группы включено необходимое количество
животных для изучения периода отмены введения.
6.4.
Дозы, схема и способ введения
Данное исследование направлено на установление безопасности многократной
инъекции нового препарата < > в объёме одной человеческой дозы, а также
последующей отмены препарата. Выбор уровня доз основан на информации,
полученной от Заказчика и на основании указаний РД 42-28-8-89.
Дата печати
стр 3 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
Используется внутримышечное
введения человеку.
введение,
поскольку
это
планируемый
способ
7. Вещества
7.1.
Тестируемое вещество
Название:
Производитель:
7.2.
Лот №:
Номер лота будет записан в документацию и
указан в итоговом отчете.
Условия хранения:
+2 - +8 °C
Вещество сравнения
Название:
Производитель:
7.3.
Лот №:
Номер лота будет записан в документацию и
указан в итоговом отчете.
Условия хранения:
+2 - +8 °C
Контрольное вещество
Название:
Производитель:
7.4.
Лот №:
Номер лота будет записан в документацию и
указан в итоговом отчете.
Условия хранения:
22 ± 5 °C
Характеристика тестируемого вещества
Заказчик отвечает за характеристику
исследования препаратов.
и
стабильность
предоставляемых
для
К итоговому отчету будут приложены сертификаты анализа/качества каждой партии
тестируемого препарата, препарата сравнения и контрольного препарата.
7.5.
Учет тестируемого вещества
После получения тестируемого вещества провизорская служба будет вести
документацию его расходования. В данные будет приложена следующая
документация: количество полученных и израсходованных веществ исследовательской
организацией, количество веществ, возвращенных Заказчику.
7.6.
Дата печати
Правила безопасности
стр 4 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
Манипуляции с веществами выполняются согласно стандартным правилам
безопасности. Заказчик предоставляет информацию о правилах безопасности при
работе с предоставляемыми на испытания препаратами (MSDS или заполненную
форму Лаборатории).
7.7.
Ликвидация остатков веществ
В конце исследования все неиспользованные флаконы с тестируемым препаратом
возвращаются Заказчику.
7.8.
Подготовка доз
Вводимые препараты будут предоставлены Заказчиком в готовом для введения виде.
Дозы до введения хранятся при +4°C .
8. Животные
8.1.
Вид:
Линия:
Источник:
Rattus spp.
CD-1
«Питомник лабораторных животных»,
Филиал Института биоорганической химии РАН
Возраст к введению:
Вес тела к введению:
Количество самцов:
Количество самок:
6-8недель
Будет записан в данных по исследованию
60 + 5 запасных
60 + 5 запасных
Содержание животных
Животные содержатся в комнате барьерного типа. Условия содержания соответствуют
стандартам, указанным в руководстве The Guide for Care and Use of Laboratory Animals
(ILAR publication, 1996, National Academy Press, 1996).
8.1.1.
Клетки
Животные содержатся индивидуально в поликарбонатных клетках с дном,
покрытых стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением.
8.1.2.
Подстил
В
качестве
подстила
используется
нехлорированная
резаная
автоклавированная бумага. Проводится рутинная проверка подстила на
микробиологическое загрязнение. Результаты анализов хранятся в
документации лаборатории.
8.1.3.
Корм
Животные будут кормиться стандартным кормом для лабораторных грызунов
«Чара» (Ассортимент Агро, Россия, ГОСТ ПК-120, Россия) ad libitum. Этот
корм проверяется производителем на содержание пищевых компонентов.
Образцы корма периодически анализируются на микробиологическое
загрязнение. Результаты анализов корма прикладываются в текущую
документацию лаборатории.
8.1.4.
Дата печати
Вода
стр 5 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
Фильтруемая водопроводная вода, дается ad libitum в стандартных питьевых
бутылочках.
Образцы
воды
периодически
анализируются
на
микробиологическое загрязнение. Результаты анализов прикладываются в
текущую документацию лаборатории. Не было контаминации воды, способной
повлиять на результаты исследования.
8.1.5.
Условия окружающей среды
Животные содержатся в контролируемых условиях окружающей среды (18-26°
C и 30-70% относительная влажность). Температура и влажность постоянно
контролируются в каждой экспериментальной комнате и вручную
документируются раз в день. В комнатах содержания животных
поддерживается 12 часовой цикл освещения и, по крайней мере, 10-ти
кратная смена объема воздуха комнаты в час.
8.1.6.
Акклиматизация
Животные будут адаптированы/акклиматизированы в лаборатории в течение
как минимум 5 дней до начала введения. Во время этого периода будет
осуществляться ежедневный осмотр внешнего состояния животных.
Животные с
обнаруженными в
ходе осмотра отклонениями
в
экспериментальные группы включены не будут.
8.1.7.
Распределение по группам
Животные распределяются по группам рандомизировано. В качестве критерия
принимается масса тела, таким образом, чтобы индивидуальное значение
массы не отклонялось от среднего значения в пределах одного пола более
чем на 20%.
8.1.8.
Идентификация животных
Каждому животному будет присвоен индивидуальный номер, помечаемый
проколом ушной раковины, и фиксируемый на карточке клетки.
8.1.9.
Действия с остатками животных
Оставшиеся после формирования групп животные будут включены в стоковую
популяцию для использования внутри исследовательской организации.
9. Методы
9.1.
Манипуляции с животными
9.1.1.
Процедура введения
Введение будет осуществляться инъекцией в четырёхглавую мышцу бедра в
объеме 0.5 мл/животное в одно и то же время дня.
9.1.2.
Клинический осмотр
Клинический осмотр каждого животного будет проводиться в течение первого
часа после введения препарата и еженедельно в последующем.
Выполняют подробный осмотр животного в клетке содержания, в руках и на
стандартной открытой площадке. Отмечают проявление и выраженность, где
приемлемо, определенных признаков, указанных в таблице.
Дата печати
стр 6 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
9.1.3.
ОСМОТР В КЛЕТКЕ
Пилоэрекция
Конвульсии
Поза
Состояние шерсти
Тремор
Поведение
Закрытие века, птоз
Аномальные движения
Конвульсии
Аномалии дыхания
Тремор
Красная корка на слизистых
Аномальные движения
Цвет кожи и слизистых
Уринация/Дефекация
Аномальная походка,
позы
Стереотипии
Внешний вид
Экзофтальм
РЕФЛЕКСЫ
Диарея
Мышечный тонус
Реакция на человека
ОСМОТР В РУКАХ
ОСМОТР НА ОТКРЫТОЙ
Реакция на резкий звук
Реактивность
ПЛОЩАДКЕ
Болевой ответ
Слезотечение/Хромадакриорея
Общая подвижность
Зрачковый рефлекс
Саливация
Исследовательская активность
Тесты на состояние центральной нервной системы
У животных, эвтаназия которых запланирована на 64 день после вакцинации,
на 50-51 дни после введения будут выполнены тесты на активность ЦНС.
9.1.3.1. Локомоторная активность
Регистрация локомоторной активности будет выполнена в
соответствии с СОП Fun/3.0 “Регистрация локомоторной активности
у крыс с использованием ATM3 Auto System”.
9.1.3.2. Координация
Координация животных будет изучена в тесте Rotarod согласно СОП
Neu/4.0 “Изучение координации у грызунов с использованием
прибора Economex Rota-Rod”.
9.1.3.3. Болевая чувствительность
Болевая чувствительность будет определена в тесте Tail Flick
согласно СОП Neu/5.0 “Тест Tail flick”.
9.1.3.4. Мышечная сила
У животных будет оценена мышечная сила передних конечностей с
использованием прибора Grip Strength в соответствии с СОП Neu/3.0
“Регистрация мышечной силы на приборе Digital Grip Strength Meter”.
9.1.4.
Тесты на состояние сердечно-сосудистой системы
У животных, эвтаназия которых запланирована на 64 день после вакцинации,
на 50 дни после введения будет выполнено измерение хвостовой манжетой
кровяного давления и частоты сердечных сокращений.
9.1.5.
Масса тела
Масса тела будет регистрироваться перед введением и в последующем на 5,
10, 17 и 25 дни исследования. Масса тела голодного животного
непосредственно перед некропсией будет взята для расчета процентного
отношения массы органов к массе тела.
9.1.6.
Дата печати
Потребление корма
стр 7 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
Потребление корма будет определяться для каждого животного визуально
каждый день и количественно еженедельно взвешиванием решетки с кормом
в начале и спустя 24 часа на 5, 10, 17 и 25 дни исследования.
9.1.7.
Лишение корма
Животным не будет даваться корм в ночь перед некропсией и определением
показателей биохимии сыворотки. Доступ к воде при этом ограничиваться не
будет.
9.1.8.
Сбор проб крови
Перед некропсией на 8 день после введения препаратов будет взята кровь
для анализа клинической патологии из брюшной аорты после
предварительной анестезии животных O2/СО2 (кровь может забираться при
необходимости также из нижней полой вены или из сердца).
9.2.
Клинические исследования
9.2.1.
Гематология
У животных, указанных в таблице главы 4, кровь объемом около 1 мл
собирают в пробирки с ЭДТА. Анализ проводят по параметрам, указанным в
таблице ниже.
9.2.2.
Количество эритроцитов (RBC)
Среднее содержание гемоглобина в клетке (MCH)
Уровень гемоглобина (HGB)
Средняя концентрация гемоглобина на клетку (MCHC)
Гематокрит (HCT)
Средний объем эритроцита (MCV)
Количество лейкоцитов (WBC)
Количество тромбоцитов (PLT)
Лейкоформула
Содержание эритроцитов (RTC)
Гемостаз
У животных, указанных в таблице главы 4, кровь помещают в пробирки,
содержащие цитрата натрия. Пробирки центрифугируют для получения
плазмы, в которой определяют следующие показатели:
Активированное частичное тромбопластиновое время
Протромбиновое время
9.2.3.
Биохимия сыворотки
У животных, указанных в таблице главы 4, кровь объемом 2-3 мл собирают в
пробирки без антикоагулянта, центрифугируют после свертывания для
получения сыворотки. В сыворотке определяют следующие показатели:
Аланинаминотрансфераза
Креатинин
Альбумин (A)
Глобулин (G)*
Отношение A/G*
Глюкоза
Щелочная фосфатаза
Ионорганические фосфаты
Аспартатаминотранфераза
Общий билирубин
Азот мочевины крови
Белок
Холестерин
Триглицериды
Креатинин
* - рассчитываемые значения
Дата печати
Мочевина
стр 8 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
9.3.
Терминальные процедуры и анатомическая патология
9.3.1.
Умирающие и мертвые животные
Если животное умирает в течение исследования, устанавливается и
документируется время гибели с максимально возможной точностью.
Животное взвешивается и вскрывается как можно раньше.
Умирающие животные взвешиваются, подвергаются эвтаназии и вскрываются.
Эвтаназия умирающих животных выполняется после решения руководителя
исследования и ветеринара. Если возможно, берутся образцы крови для
анализа показателей клинической патологии.
9.3.2.
Эвтаназия
Животные подвергаются эвтаназии ингаляцией O2/CO2 с последующим
обескровливанием.
9.3.3.
Некропсия
Животные будут подвергнуты полной некропсии, которая включает осмотр
внешней поверхности тела, места инъекции, всех проходов, черепной,
грудной, брюшной полостей и их содержимого.
9.3.4.
Вес органов
Нижеследующие органы (соответствующие полу) будут взвешены у всех
животных при запланированной некропсии. У умерших животных или
животных, подвергнутых незапланированной эвтаназии, органы взвешиваться
не будут. Парные органы будут взвешены вместе. Кроме абсолютного веса
органов, будет определено процентное отношение веса органа к весу тела.
9.3.5.
Надпочечники
Печень
Головной мозг
Легкие
Придатки семенников
Селезенка
Сердце
Семенники
Почки
Тимус
Коллекция органов и тканей
У каждого вскрытого животного будут взяты органы (целые или части органов)
и ткани, указанные ниже, и зафиксированы в 10% нейтральном забуференном
формалине, за исключением глаз, которые будут зафиксированы в растворе
Дэвидсона.
Органы и ткани, или их остатки после гистологии будут архивированы и
переданы Заказчику согласно его требованию.
Дата печати
стр 9 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
Место введения
Двенадцатиперстная
Аорта
Тощая кишка
Костный мозг – бедренная
кость
Подвздошная кишка
Седалищный нерв
Скелетные мышцы
Левая медиальная
/каудальная бедренная
Кожа
Мозжечок
Печень
Область молочной
железы
Позвоночник
Передний мозг
Легкие
Шейный отдел
Ствол мозга
Лимфатические узлы
Грудной отдел
Головной мозг:
Пищевод
Глаза с глазным нервом
Самки:
Почки
Подчелюстные
Мезентериальные
Самцы:
Поясничный отдел
Селезенка
Желудок:
Яичники
Придатки семенников
Кардиальный отдел
Матка
Простата
Антральный отдел
Влагалище
Семенные пузырьки
Тимус
Семенники
Щитовидные железы
Молочные железы
Сердце
Поджелудочная железа
Язык
Толстый кишечник:
Паращитовидные железы
Трахея
Слепая кишка
Гипофиз
Мочевой пузырь
Ободочная кишка
Слюнные железы:
Место инъекции
Прямая кишка
9.3.6.
Тонкий кишечник:
Надпочечники
Подчелюстные
Мазок костного мозга
У всех животных при некропсии берут костный мозг из бедренной кости
аспирацией и делают мазки. Мазки высушивают, фиксируют, окрашивают и
исследуют микроскопией для изучения клеточного состава, индекса
созревания нейтрофилов и лейкоэритробластического соотношения.
9.3.7.
Гистология
У животных, подвергнутых эвтаназии и некропсии
гистологический анализ следующих органов и тканей:
Дата печати
будет
выполнен
стр 10 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
Место введения
Тонкий кишечник:
Надпочечники
Двенадцатиперстная
Аорта
Тощая кишка
Костный мозг – бедренная
кость
Подвздошная кишка
Седалищный нерв
Скелетные мышцы
Левая медиальная
/каудальная бедренная
Кожа
Мозжечок
Печень
Область молочной
железы
Позвоночник
Передний мозг
Легкие
Шейный отдел
Ствол мозга
Лимфатические узлы
Грудной отдел
Головной мозг:
Почки
Пищевод
Подчелюстные
Глаза с глазным нервом
Мезентериальные
Самки:
Самцы:
Поясничный отдел
Селезенка
Желудок:
Яичники
Придатки семенников
Кардиальный отдел
Матка
Простата
Антральный отдел
Влагалище
Семенные пузырьки
Тимус
Молочные железы
Семенники
Щитовидные железы
Сердце
Поджелудочная железа
Язык
Толстый кишечник:
Паращитовидные железы
Трахея
Слепая кишка
Гипофиз
Мочевой пузырь
Ободочная кишка
Слюнные железы:
Место инъекции
Прямая кишка
Подчелюстные
Образцы указанных тканей будут вырезаны, обезвожены, пропитаны
парафином, нарезаны на срезы, окрашены гематоксилином и эозином и
исследованы микроскопией. Остатки тканей будут сохранены в фиксаторе. По
решению патолога могут быть сделаны электронные фотографии препаратов.
10. Анализ данных
Для всех данных будет применена описательная статистика: подсчитаны среднее значение и
стандартная ошибка среднего, которые вместе со значением N будут представлены в
итоговых таблицах. Для определения достоверности межгрупповых различий данные будут
проанализированы адекватными статистическими тестами. Анализ будет выполнен для
каждого пола отдельно. Статистический анализ будет проводиться программой Statistica for
Windows v.7. Различия определяются при 0.05% уровне достоверности.
11. Изменения протокола
Изменения утвержденного протокола обсуждаются руководителем исследования и
Заказчиком и документируются в форме поправки, которая утверждается и имеет дату
действия. Поправки подписываются и датируются и руководителем исследования, и
представителем Заказчика, и прикладываются ко всем верным копиям протокола. Заказчик
может утверждать поправки по факсу или по электронной почте файлом PDF с подписью.
12. Отклонения
Все отклонения будут документироваться в данных по исследованию с оценкой их влияния на
исследование. Отклонения, которые потенциально могут влиять на интерпретацию данных,
будут перечислены в отчете (включены в приложение).
13. Отчет
Дата печати
стр 11 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
Черновой вариант итогового отчета будет подан Заказчику так быстро, как только возможно
после последней некропсии. В окончательный отчет будут включены все пункты протокола и
полное представление всех данных, полученных в ходе исследования. По окончании
Заказчику будут предоставлены одна бумажная копия и одна электронная копия (pdf)
итогового отчета. Протокол исследования, изменения и значимые отклонения будут включены
в приложение к отчету.
14. Хранение данных
По завершении итогового отчета все данные по исследованию и необходимые материалы,
включая ниже перечисленные, будут храниться в архиве лаборатории в течение 1 года.
-
Протокол, изменения, отклонения
Данные о вводимых препаратах
Заявки на животных, включая данные о состоянии здоровья от поставщика
Распределение по группам
Записи введения
Записи наблюдения за животными и клинического осмотра
Данные тестов на состояние ЦНС
Вес тела
Потребление корма и воды
Записи сбора образцов
Данные клинической патологии
Результаты некропсии
Вес органов
Стекла с мазками крови и костного мозга
Стекла с гистологическими препаратами и парафиновые блоки *
Письма и другая письменная информация, касающаяся исследования
Черновой и итоговый отчет
* Ткани в фиксаторе после вырезания фрагментов для гистологии будут переданы Заказчику.
После указанного срока хранения архивные материалы по согласованию с Заказчиком будут
переданы Заказчику.
Дата печати
стр 12 из 13
Название учреждения-исполнителя
Протокол исследования №
15. Утверждение
__________________________________________________________________________
Представитель Заказчика 1
__________________________________________________________________________
Дата
Руководитель исследовательской организации
_________________________________________________________________________
Дата
Руководитель исследования
Дата печати
стр 13 из 13