Краткая аннотация на русском языке:
advertisement
«Утверждаю» Председатель Ученого совета биолого-почвенного факультета к.б.н., проф. И.А. Горлинский дата ________________ № протокола_________ Отчет старшего преподавателя кафедры генетики и селекции Андреевой Елены Александровны, работающего по программе поддержки молодых кандидатов наук СПбГУ. Тема исследования: «Сайленсинг генов стеринового метаболизма как метод увеличения устойчивости растений к фитостерин-зависимым патогенам и вредителям» Введение Изучение механизмов замолкания генов является в настоящее время, без преувеличения, одной из наиболее интересных тем в генетике растений. Явление сайленсинга, ведущее к фактическому выключению генов, достаточно широко используют для изучения процессов развития растений, механизмов устойчивости к патогенам, механизмов синтеза стеринов. Стерины - соединения, выполняющие структурные (компонент плазмалемм) и регуляторные (стероидные гормоны) функции у большинства эукариот. Путь биосинтеза стеринов сложен, представляет собой многоступенчатый процесс, наиболее хорошо изучен у модельного объекта генетики растений арабидопсиса (Arabidopsis thaliana L.) (Benveniste, 2003). Интерес к изучению проблемы биосинтеза стеринов у растений связан с несколькими факторами. Во-первых, некоторые группы стеринов участвуют в регуляции развития растения не только опосредованно, через брассиностероиды, но и прямо. Вовторых, некоторые классы стеринов могут выступать в качестве лекарственных средств, так как способны модулировать иммунные реакции, а также, снижать в крови уровень холестерина у человека. В-третьих, фитостерины можно использовать в качестве исходных веществ для синтеза стероидных гормонов. В-четвертых, состав стеринов в растении можно рассматривать как возможный фактор контроля размножения некоторых патогенов и вредителей растений. В 60е годы показано, что некоторые группы эукариот не способны самостоятельно синтезировать стерины, поэтому поглощают их из корма. К числу таких стеринзависимых организмов относятся, в частности, грибы родов Pythium и Phytophthora, беспозвоночные - насекомые-фитофаги, свободноживущие и паразитические нематоды. Отсутствие стеринов в питательном субстрате приводит к ограничению роста и полному торможению процессов бесполого и полового размножения у Phytophthora; невозможности завершения цикла развития у насекомых, поскольку не происходит синтеза гормонов развития. Растительные стерины (ситостерин, стигмастерин, кампестерин и др.) в разной степени способны восстанавливать эти процессы. Экспериментально показано, что при использовании в питательной среде состава стеринов, отличающегося от состава в привычной для насекомых пище, у них нарушается процесс развития, уменьшается количество яиц в кладке, у личинок отмечают различные аномалии в развитии (Камилова и др., 1990; Chitwood and Lusby, 1991; Feldlaufer and Svoboda, 1991; Левашина, 1994). Работы на различных видах фитофторы (Elliot, 1972; Метлицкий и др., 1980; Marshall et al., 2001; Ходжайова и др., 2000) и нематодах (Dotson et al., 2000) выявили аналогичную закономерность. Таким образом, изучение биосинтеза стеринов у растений является важной задачей как с теоретической, так и с практической точек зрения. Ранее изучение биосинтеза стеринов у растений было основано на применении ингибиторов синтеза стеринов и последующего анализа изменений в составе стеринов. В настоящее время у части растений клонированы и секвенированы многие гены, отвечающие за определенные этапы синтеза стеринов. Остается неясным вопрос, как именно изменяется соотношение стеринов в случае сверхэкспрессии или инактивации определенного гена. Для инактивации гена посредством индукции сайленсинга, в антисмысловой ориентации вводят последовательность такого же гена (Burger et al., 2003; Schaller et al., 1995; Heyer et al., 2004). Однако далеко не для всех видов охарактеризованы гены синтеза стеринов. Возникает вопрос: можно ли вызвать эффект замолкания гена в растениях картофеля, вводя в геном последовательность интересующего гена арабидопсиса в анти-смысловой ориентации? Некоторые экспериментальные данные позволяют предположить, что это возможно. Так, во-первых, для растений картофеля показана принципиальная возможность индукции сайленсинга (Brigneti et al., 2004). Вовторых, для развития сайленсинга, по крайней мере, в случае некоторых генов, достаточно небольшого участка гомологии (менее 100 пар нуклеотидов) (Hiriart et al., 2002). Нуклеотидные последовательности генов синтеза стеринов отличаются эволюционной консервативностью среди разных видов растений. Так, гомология между последовательностями кДНК генов HMGR картофеля и арабидопсиса составляет более 70%. В данной работе мы исследуем возможность индукции сайленсинга при введении в геном картофеля отдельных генов биосинтеза стеринов арабидопсиса в анти-смысловой ориентации и изменения состава стеринов. Картофель выбран нами как объект исследования, поскольку, являясь ценной сельскохозяйственной культурой, подвержен действию широкого круга вредителей и патогенов, для некоторых из которых показана зависимость от состава стеринов. Имеется достаточно большое количество экспериментальных данных о зависимости некоторых патогенов (р. Phytophthora) и вредителей - насекомых и нематод от состава стеринов в пище. Среди наиболее опасных можно выделить возбудителя поздней гнили - патоген Phytophthora infestans. Для работы нами выбраны несколько генов синтеза стеринов. Выбор основан на имеющихся литературных данных о пищевых «предпочтениях» упомянутых выше вредителей. Так, для P. sojae (Marshall et al., 2001) и P. cactorium (Elliot et al., 1972) наиболее ценным стерином является ситостерин; для насекомых – C-24-метилированные стерины (Feldlaufer and Svoboda, 1991). Соответственно, предлагается использовать для создания трансгенных растений те гены, изменение экспрессии которых приведет к уменьшению доли указанных групп стеринов в общем количестве, а именно: ген DWF1, кодирующий фермент delta5-стерол-C24-редуктазу (изомеразу) (ответственен за конечный этап синтеза ситостерина); гены SMT1 и 2, кодирующие ферменты стерол-С24метилтрансферазу 1 и 2 (изменение соотношения между С-24-метил- и С-24этилстеринам), а также, ген картофеля HMGR (один из ключевых генов синтеза стеринов) (рис. 1). Таким образом, в нашей работе предлагается получение трансгенных растений картофеля с отдельными генами биосинтеза стеринов в смысловой и анти-смысловой ориентациях (ген картофеля HMGR и арабидопсиса DWF1, SMT1 и SMT2). Результаты позволят ответить на следующие вопросы: 1. можно ли индуцировать явление сайленсинга для генов DWF1, SMT1 и SMT2 у картофеля при введении гетерологичной последовательности (последовательности соответствующего гена арабидопсиса); 2. какие изменения в стериновом метаболизме происходят в растениях картофеля при введении последовательностей генов HMGR, DWF1, SMT1 и SMT2 в смысловой и анти-смысловой ориентациях; 3. измениться ли устойчивость полученных растений к вредителям - ауксотрофам по стеринам, прежде всего, к фитофторозу. Результаты На первом этапе работы совместно с к.б.н. Богомазом Д.И. на основе нуклеотидных последовательностей генов биосинтеза стеринов арабидопсиса (в случае генов SMT2, DWF1) и картофеля (гены HMGR1, SQS), содержащихся в GenBank, нами были сконструированы специфические праймеры для получения соответствующих последовательностей, в праймеры были внесены сайты эндонуклеаз рестрикции (не встречающиеся в нуклеотидных последовательностях самих генов). При проведении полимеразной цепной реакции на матрице ДНК картофеля или арабидопсиса во всех случаях были получены ПЦР-продукты ожидаемого размера. Полученные ПЦР-продукты были клонированы в вектор pART7 (встроены под промотор 35S и терминатор октопинсинтазы). Затем последовательности были переклонированы в вектор pART27, содержащий структурные элементы, необходимые для поддержания в клетках E.coli и Agrobacterium tumefaciens, в последних данный вектор ведет себя как Tiплазмида (Gleave, 1992). Плазмиды со встроенными последовательностями генов стеринового синтеза были перенесены в агробактериальный штамм EHA105. Наличие последовательностей, соответствующих клонированным, было подтверждено ПЦРанализом и секвенированием. Кроме того, был получен контрольный агробактериальный штамм с плазмидой pART27 без дополнительных встроенных последовательностей. Таким образом, нами были получены агробактериальные штаммы, содержащие плазмиды с отдельными генами синтеза стеринов в смысловой и анти-смысловой ориентациях. Перечень плазмид с отдельными генами синтеза стеринов и их условные обозначения – в смысловой ориентации: ген SMT2 – плазмида sm2s; DWF1 – d1s; HMGR1 – hm1s; SQS – sqs; в анти-смысловой ориентации: ген SMT2 – плазмида sm2as; DWF1 – d1as; HMGR1 – hm1as; SQS – sqas; контрольный штамм с немодифицированной плазмидой – pART27. Получение трансгенных растений картофеля Для подтверждения «работоспособности» полученных штаммов проводили трансформацию растений табака Nicotiana tabacum, так как данный вид достаточно легко поддается агробактериальной трансформации. Трансформацию проводили в условиях in vitro стандартным способом – с использованием в качестве эксплантов листовых пластинок (Дрейпер и др., 1991). В результате проведенных экспериментов по трансформации штаммами с генами SMT2 (штаммы с плазмидами sm2s и sm2as), HMGR1 (hm1s, hm1as), DWF1 (d1as) были получены трансгенные растения табака, устойчивые к селективной концентрации антибиотика канамицина, содержащие последовательности соответствующих генов синтеза стеринов. Трансгенная природа полученных растений подтверждена ПЦР с праймерами к гену nptII и целевым генам. Кроме того, был проверен штамм с контрольной плазмидой без вставки pART27. В результате трансформации получены трансгенные (канамицин-устойчивые и ПЦР-позитивные растения). Полученные и апробированные агробактериальные штаммы с генами синтеза стеринов SMT2, DWF1 и HMGR1 (штаммы с плазмидами sm2s, sm2as, d1as, hm1s, hm1as) были использованы для трансформации растений картофеля. Трансформацию проводили в условиях in vitro, с использованием в качестве эксплантов междоузлий. Отбор трансгенных растений проводили на среде с добавлением селективной концентрации канамицина (100 мг/л). В результате были получены растения-регенеранты, устойчивые к селективному антибиотику канамицину. Наличие последовательностей Т-ДНК в полученных растениях подтверждено методом ПЦР с праймерами к гену nptII и целевым генам. Таким образом, с использованием созданных агробактериальных штаммов нами получены трансгенные растения табака и картофеля с последовательностями генов синтеза стеринов арабидопсиса (гены SMT2, DWF1) и картофеля (HMGR1). Оценка эффективности индукции сайленсинга в трансгенных растениях картофеля Из литературных данных известно, что уменьшение продукции стеринов у растений в подавляющем большинстве случаев сопровождается карликовостью. Среди полученных трансгенных растений картофеля и табака все имели нормальный фенотип, как в условиях культивирования in vitro, так и при перенесении в условия теплицы. Индукция сайленсинга отмечена не была. Причинами этого могут быть: - для эффективного развития сайленсинга необходим достаточно высокий процент гомологии между эндогенной и экзогенной копией гена. Поскольку для трансформации в случае генов DWF1 и SMT2 были использованы последовательности арабидопсиса, то, по-видимому, введение в геном картофеля последовательностей генов синтеза стеринов арабидопсиса не позволяет запустить процесс замолкания эндогенной копии гена; - возможно, использованный принцип индуцирования сайленсинга недостаточно эффективен (по литературным данным в зависимости от гена-мишени и вида растения составляет 0-20%). Ключевым моментом запуска процесса пост-транскрипционного сайленсинга является образование двунитевой структуры между РНК с эндогенной и экзогенной копий гена. Таким образом, необходим эффективный синтез РНК с внесенной копии гена, поиск в цитоплазме гомологичной РНК и образование двунитевой структуры. По литературным данным, гораздо более эффективным вариантом искусственного запуска сайленсинга является следующая схема: в плазмиду под контроль одного промотора клонируют последовательность гена-мишени как в анти-смысловой, так и в смысловой ориентациях. В растении, трансформированном такой конструкцией, образование двунитевой РНК происходит сразу же после процесса транскрипции, что позволяет добиться большого выхода трансформантов с «умолкнувшими» генамимишенями. Примером такой конструкции является плазмида pKannibal (Wesley, 2001). Применение конструкций такого типа позволяет добиваться 70-100% выхода трансформантов с «умолкнувшими» генами-мишенями. Учитывая это, нами предложен альтернативный путь получения трансгенных растений картофеля с измененным метаболизмом стеринов за счет «умолкания» отдельных генов синтеза стеринов. Конструирование плазмид с последовательностями генов синтеза стеринов картофеля для индукции сайленсинга Учитывая возможные причины неэффективности в индуцировании сайленсинга, предложена иная схема эксперимента: получение трансгенных растений с помощью плазмид на основе pKannibal (Wesley et al., 2002), несущих последовательности генов синтеза стеринов непосредственно картофеля. Сложность выполнения связана с тем, что в базе данных GenBank нет последовательностей генов синтеза стеринов картофеля, контролирующих поздние этапы синтеза, наиболее перспективные с точки зрения изменения соотношения «привлекательных» продуктов для стеринзависимых вредителей картофеля. Для индукции сайленсинга с помощью плазмиды типа pKannibal по сведениям авторов необходимо клонирование небольшого участка гена-мишени (150-500 нуклеотидов). Поэтому нами была предпринята попытка наработки фрагментов генов DWF1, SMT2 и SMT1 картофеля с праймеров, сконструированных на основе выравнивания нуклеотидных последовательностей этих генов, содержащихся в базе данных для других видов растений. На основе выравнивания были определены наиболее консервативные участки и подобраны праймеры для наработки фрагментов длиной 500600 п.н.: для гена SMT1 – F: AAATCTAGACTCGAG GATGCAGTGTATGCAATAGAAGC, R: AAAATCGATGGTACC CCAAGAAGAAATACATTGGTGTG; SMT2 – F: AAATCTAGACTCGAG AATGAGTATCAGGTGAAACGAGC, R: AAAATCGATGGTACC CTGCAGAGAATCATATGCATAGG; DWF1 – F: AAATCTAGACTCGAG CTTGATGATCTTACCGTTGGTGG, R: AAAATCGATGGTACC TACAAGCATCTTGTGTGCCTGTG. В праймеры были внесены по 2 сайта узнавания эндонуклеазами рестрикции (Xba1, Xho1 в прямые праймеры, Cla1, Kpn1 в обратные) для облегчения клонирования в плазмиду pKannibal. На матрице ДНК картофеля были получены ПЦР-продукты ожидаемого размера для праймеров к генам DWF1, SMT2. В случае гена SMT1 на матрице ДНК был получен фрагмент больше ожидаемого размера (1500 п.н.), продукт ожидаемого размера был получен на матрице кДНК, он и был использован далее. Для проверки того, что последовательности, праймеры к которым мы подобрали, действительно являются частями экспрессирующихся генов, была проведена ПЦР на матрице кДНК (наработанной на РНК побегов картофеля). В случае праймеров к генам DWF1 и SMT2 также получены продукты ожидаемого размера, что свидетельствует об экспрессии этих генов в надземной части растений картофеля. ПЦР-продукты были клонированы; секвенирование подтвердило гомологию клонированных фрагментов с известными последовательностями генов синтеза стеринов. Таким образом, нами получены плазмиды на основе плазмиды pKannibal, содержащие последовательности участков генов непосредственно картофеля, эти нуклеотидные последовательности гомологичны генам синтеза стеринов DWF1, SMT2 и SMT1. Полученные результаты позволяют продолжить работу по получению растений картофеля с измененным метаболизмом стеринов с помощью более эффективного, по литературным данным, метода, что позволит расширить современные представления об экологических цепях и молекулярно-генетических аспектах взаимодействий высших растений и их патогенов и позволит идентифицировать новые гены, вовлеченные в контроль устойчивости растений к стерин-зависимым патогенам. Список процитированной литературы: 1. Камилова Т.А., Лучникова Е.М., Инге-Вечтомов С.Г. Влияние метаболизма стеринов на кроссинговер у дрозофилы в модельной экологической системе «дрозофиладрожжи»//Генетика.-1990.-26.-стр. 249-256. 2. Левашина Е.А. Клеточная селекция in vitro как способ получения растений, ограничивающих развитие стерин-зависимых насекомых. //Диссер. канд. биол. наук.СПб.-1994.-120 с. 3. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И. Фитостерины и их роль во взаимоотношениях растений с паразитарными грибами (на примере грибов семейства Pythiaceae).//Успехи совр. биол.-1980.-89.-стр. 28-41. 4. Ходжайова Л.Т., Левашина Е.А., Усольцева М.Ю., Бондаренко Л.В., Лутова Л.А. Изменение содержания растительных стеринов как способ биологической борьбы с фитостерин-зависимыми организмами/В сб.: Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.-Москва.-2000.стр.124-128. 5. Benveniste P. Sterol metabolism//in The Arabidopsis book. Edit. by Somerville C. and Meyerowitz E.-2003.- www.arabidopsis.org 6. Brigneti G, Martin-Hernandez AM, Jin H. et al. Virus-induced gene silencing in Solanum species.//Plant J..- 2004.- Jul;39(2).-pp.264-272. 7. Chitwood D.J. and Lusby W.R. Metabolism of plant sterols by nematodes.//Lipids.-1991.V.26(8).-pp.619-627. 8. Choi,D., Ward,B.L. and Bostock,R.M. Differential induction and suppression of potato 3hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase genes in response to Phytophthora infestans and to its elicitor arachidonic acid.//Plant Cell.-1992.-V.4 (10).-pp.1333-1344. 9. Dotson WD, Tove SR, Parks LW. Biochemical modifications and transcriptional alterations attendant to sterol feeding in Phytophthora parasitica//Lipids.-2000.-V. 35(3).- pp. 243-247. 10. Elliot C.G. Sterols and production of oospores by Phytophthora cactorum. //J.Gen.Microbiol.-1972.-72.-P.321-327. 11. Feldlaufer M.F. and Svoboda J.A. Sterol utilization and ecdisteroid content in the house fly, Musca domestica (L.)//Insect.Biochem.-1991.-21.-pp.53-56. 12. Gleave A.P. A versatile binary vector system with T-DNA organisational structure inducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome//Plant Mol Biol.-1992.-20.pp.1203-1207. 13. Heyer J, Parker B, Becker D, Ruffino J, Fordyce A, Witt MD, Bedard M,Grebenok R.Steroid profiles of transgenic tobacco expressing an Actinomyces 3-hydroxysteroid oxidase gene.//Phytochemistry.-2004.- V.65(22).-pp. 2967-76. 14. Hiriart JB, Lehto K, Tyystjarvi E, Junttila T, Aro EM. Suppression of a key gene involved in chlorophyll biosynthesis by means of virus-inducing gene silencing.//Plant Mol Biol.- 2002.Sep;50(2).-pp.213-224. 15. Marshall JA, Dennis AL., Kumazawa T, Haynes AM, Nes WD. Soybean sterol composition and utilization by Phytophthora sojae//Phytochemistry.- 2001.-V. 58(3).- pp. 423-428. 16. Schaller H, Grausem B, Benveniste P, Chye ML, Tan CT, Song YH, Chua NH. Expression of the Hevea brasiliensis (H.B.K.) Mull. Arg. 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzyme A reductase 1 in tobacco results in sterol overproduction.//Plant Physiol.- 1995.- V.109(3).-pp. 761770. 17. Wesley V, Helliwell A, Smith N, Wang M, Rouse D, Liu Q, Gooding P, Singh S, Abbott D, Stoutjesdijk P, Robinson S, Gleave A, Green A, Waterhouse P. Construct design for efficient, effective and highthroughput gene silencing in plants// The Plant Journal.- V27(6).-2001.-p581590. 18. Yoshioka,H., Yamada,N. and Doke,N. cDNA cloning of sesquiterpene cyclase and squalene synthase, and expression of the genes in potato tuber infected with Phytophthora infestans.//Plant Cell Physiol.- 1999.-V.40 (9).-pp. 993-998. За отчетный период к публикации статья: Андреева Е.А., Богомаз Д.И., Елсукова Т.С., Лутова Л.А. Генно-инженерный подход по изменению метаболизма фитостеринов как метод получения растений картофеля, устойчивых к стерин-зависимым вредителям и патогенам//В сб. Научных трудов БиНИИ СПбГУ №54 (в печати) и проведены следующие курсы: • курс лекций «Генетика межорганизменных взаимодействий» для студентов 1 курса магистратуры - 12 часов; • практикум по курсу «Геномика» для студентов 2 курса бакалавриатуры - 6 часов; • практические занятия курса «Общая генетика» для студентов 2 курса – 34 часа; • курс лекций «Молекулярно-генетические аспекты устойчивости» – 18 часов; • руководство студентами 5 курса – 30 часов. Отчет заслушан и утвержден на заседании кафедры генетики и селекции. к.б.н., ст. преп. акад. РАН, проф. Е. А. Андреева С. Г. Инге-Вечтомов
