СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ

ÁÈÎÒÅÕÍÎËÎÃÈß
УДК 619:591.81:576.80
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ
МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ КОНТАМИНАЦИИ КУЛЬТУР
КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМАМИ
Л.И. Матвеева, А.С. Гизатуллина, Р.Я. Гильмутдинов
Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт,
г. Казань
(ТЕЗИСЫ)
Несмотря на наличие в настоящее
время большого количества чувствительных инструментальных методов
(ИФА, ПЦР и др.), позволяющих с
высокой степенью вероятности выявлять контаминацию культур клеток, исследователям, работающим
с ними, зачастую приходится пользоваться более доступными подручными средствами, а именно микроскопией или посевом на различные
бактериологические среды. Опытному «культуральщику» бывает достаточно визуально оценить качество
монослоя, чтобы определить ее контаминацию.
В настоящей работе мы попытались поделиться своим опытом по
выявлению контаминации используемых в производстве культур клеток.
Материалы и методы
Изучена контаминация микроорганизмами первично-трипсинизированной культуры клеток почки эмбрионов свиньи (ПЭС) и перевиваемых
культур ВНК-21 (почка сирийского
хомячка), СПЭВ и ППК (почка эмбриона свиньи).
Контаминация культур клеток
определялась визуально без использования какого либо инструмента, а также с помощью светового (МБИ-15-2),
фазово-контрастного (КФ-4) и люминесцентного (МЛД-1) микроскопов.
При световой микроскопии цитологические препараты окрашивали по Романовскому-Гимзе, при фазово-контрастной — орсеином, при люминес40
центной-акридиновым оранжевым.
Для выявления микроорганизмовконтаминантов культуры клеток высевали на бактериологические среды:
мясо-пептонные бульон и агар, среды Китта-Тароцци и Чапека, а также
триптический перевар сердца (ТПС)
и гидролизат плацентарно-эмбриональный (ГПЭМ). Инокулированные
среды помещали в термостат на 37оС
и просматривали ежедневно в течение 10–15 суток. Видимый рост отмечался обычно на 3–4 сутки.
Основные результаты
Внешний осмотр контаминированных культур обычно выявлял резкое
закисление среды и ее опалесценцию.
Кариологическое
исследование
метафазных пластинок этой культуры
показало, что при контаминации хромосомы выглядят более разбухшими
и рыхлыми, очевидно в связи с угасанием митотической активности культуры клеток. При этом количество
хромосом не изменялось, свидетельствуя о сохранении видовой принадлежности исследуемых культур.
При микроскопическом просмотре контаминированной культуры
СПЭВ отмечались нечеткость контура клеток, плохая выраженность
рельефности поверхности монослоя,
неплотное прилегание клеток друг к
другу, а также наличие на отдельных
участках монослоя пространств без
клеток («окон») вследствие гибели и
отторжения последних от стекла. Появление мелких обломков возле клеВетеринарная патология. № 1. 2003.
ÁÈÎÒÅÕÍÎËÎÃÈß
точной поверхности — первый признак истощения ростового потенциала клеток. При контаминации в цитоплазме и межклеточном пространстве
ПЭС и СПЭВ (в 3–4 препаратах из 10)
обнаруживаются
микроорганизмы
фиолетового цвета с розовым ободком. Количество зерен внутри ободка
колебалось от 5 до 9.
Под люминесцентным микроскопом в клетках ПЭС (3–4 препарата)
на монослое видны зеленые нити в
виде сеточки с красно-оранжевыми
центрами. В культуре СПЭВ в цитоплазме и вне ее на желто-зеленом
фоне клеток обнаруживались единичные оранжево-красные зерна микроорганизмов (в 4–7 препаратах соответственно). На отдельных участках
культуры клеток ВНК-21 в 4 препаратах под люминесцентным микроскопом были видны единичные и в виде
небольших колоний палочковидные
микроорганизмы красного цвета. В
препаратах мазков, сделанных из питательной среды этой культуры наблюдались удлиненные палочковидные и короткие микроорганизмы с
оранжевым центром и зеленой периферией, расположенные колониями и
единичные (среди них были и сегментированные).
Фазово-контрастная микроскопия
препаратов показала, что монослой
клеток приобретает желто-оранжевый цвет. В межклеточном пространстве препаратов контаминированных
культур клеток СПЭВ (в 5 случаях из
20) встречались скопления мелких
черных точек (4–10 и более), тогда
как в неокрашенных нативных препаратах эти точки отсутствовали.
При посеве на бактериологические среды показано, что на мясопептонном бульоне положительный
результат в виде хорошо выраженного
осадка получается почти от всех подозреваемых на контаминацию культур клеток, тогда как на мясо-пептонном агаре и среде Китта-Тароцци
видимого роста микроорганизмов
Ветеринарная патология. № 1. 2003.
обнаружить не удалось. Результаты,
совпадающие с инструментальными
методами были получены при высеве контаминированной культуры клеток СПЭВ на полужидкие и плотные
среды ТПС и ГПЭМ, где были видны
скопления серовато-белых микроколоний по пути инокулята (в полужидких средах), а на плотных средах
обнаруживались микоплазмы с характерными, вросшими в агар, округлыми колониями с вдавленным центром
и возвышенной периферией в 6 из 8
случаев. При высеве на среду Чапека подозреваемых на контаминацию
культур микроскопические грибы не
обнаружены.
Заключение
Среди изученных культур более
часто контаминировались клетки
СПЭВ. Сравнительное изучение методов диагностики контаминации
культур клеток с помощью светового,
люминесцентного и фазово-контрастного микроскопов показало следующее. Под световым микроскопом в
фиксированных и окрашенных препаратах культур клеток ПЭС в цитоплазме и межклеточном пространстве
удавалось обнаружить микроорганизмы в виде мелких фиолетовых зерен
на розово-фиолетовом фоне цитоплазмы. При фазово-контрастной
микроскопии клеток на фоне яркожелтой цитоплазмы была видна мелкоточечная зернистость черного цвета. Ярче и нагляднее контаминация
клеток наблюдалась под люминесцентным микроскопом, при этом на
цитоплазме обнаруживались оранжево-красные зерна (предположительно
микоплазмы).
В целом результаты исследований
на контаминацию с помощью бактериальных сред и инструментальных методов были сопоставимы. Из инструментальных методов более наглядно и
ярко картина контаминации выглядела
при люминесцентной микроскопии, а
более простым и доступным методом
являлась световая микроскопия.
41