011959 Настоящее изобретение относится к области биологических наук и к сфере... частности к развитию стратегий и продуктов для предотвращения, лечения или...

011959
Настоящее изобретение относится к области биологических наук и к сфере нормы и патологии, в
частности к развитию стратегий и продуктов для предотвращения, лечения или излечения заболеваний.
В отличие от редукционистического подхода, который обычно применяется фармацевтическими
компаниями для разработки новых лекарственных средств, настоящее изобретение основано на холистическом подходе к живым организмам.
Такой холистический подход к живым организмам был, например, основанием применения медицины трав, такой как традиционная китайская медицина (ТСМ) с ее самых ранних лет. Важной отправной точкой в подходах, основанных на медицине трав, является то, что каждый здоровый организм находится в балансе. Считается, что баланс представляет собой сложное взаимодействие между телом и мозгом, которое отражается на всех уровнях в диапазоне от перспективы биохимических компонентов до
регуляции энергетической системы нашего физического тела. Внутренний дисбаланс может исходить из
широкого разнообразия факторов и привести к множеству состояний в диапазоне от кратковременных
расстройств до хронических патологических процессов. Кроме того, при таком подходе, как ТСМ, признается уникальность каждого человека, и она стимулирует необходимость в разработке персонифицированной медикаментозной терапии для получения оптимальных результатов, основанных на многокомпонентных способах лечения.
На первый взгляд, «западный» медицинский подход может казаться очень отличающимся от этого.
Однако революция в геномике, которая произошла в биологических науках за последнее десятилетие,
предоставила существенную поддержку более холистического взгляда на диагностику и лечение. Кроме
того, выпуск персонифицированных лекарственных средств получает в настоящее время значительное
внимание вследствие новых проникновений, наряду с другими аспектами, в фармакогеномику. Хотя
принцип гомеостаза был краеугольным камнем западной физиологии в течение более чем века, огромная
сложность биологических систем часто стимулировала фармацевтические исследования в направлении
попытки идентификации и влияния только на одни мишени, которые создают различие между нормой и
патологией. Этот подход в действительности дал много активных лекарственных средств, но также выявил большие недостатки. В действительности, делаются попытки влияния на систему взаимодействием
с одним белком, который часто представляет собой часть сложного пути и участвует в каскаде реакций и
петлях обратной связи. Действительность состоит в том, что большинство заболеваний являются многофакторными, и это значит, что лечение одной мишени обеспечивает частичное лечение (уменьшение
симптомов), а в большинстве случаев не приводит к излечению. Хотя эта озабоченность не нова, было
невозможно обнаружить альтернативные пути, дающие указанную сложность системы.
Однако в настоящее время был разработан способ, который обеспечивает возможность очень подробного профилирования сложных смесей и последующих измерений сложных, многокомпонентных
вызванных изменений биологических систем (биологических эффектов), таких как системы in vitro (такие как клеточные культуры) и системы in vivo (такие как экспериментальные животные модели и люди). При этом способе можно очень эффективно измерить взаимодействие множества компонентов в
сложных смесях, таких как натуральные продукты или экстракты и их смеси (включая питательные продукты, функциональные пищевые продукты, продукты медицины трав, другие натуральные соединения
и биологические жидкости), с живыми биологическими системами, используя определенный набор стадий, где применяются такие технологии, как биостатистика и биоинформатика. Посредством таких измерений можно преимущественно определить воздействие многокомпонентных смесей на биологический
профиль заболевания. Более того, такие измерения обеспечивают возможность идентификации эффективных компонентов внутри многокомпонентных смесей и их соответствующих концентраций, требуемых для оказания воздействия на биологический профиль заболевания.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу определения воздействия многокомпонентной смеси натуральных продуктов на биологический профиль заболевания внутри группы живых
систем, включающему стадии:
(a) определения с использованием многомерного анализа биологического профиля заболевания
сравнением биологического профиля группы живых систем с симптомами заболевания с биологическим
профилем эталонной (или здоровой) группы живых систем;
(b) определения с использованием многомерного анализа воздействия ряда образцов многокомпонентной смеси на биологический профиль заболевания, причем в образцах концентрации одного или
нескольких натуральных компонентов или одной или нескольких групп натуральных компонентов различаются;
(c) определения с использованием многомерного анализа состава образцов многокомпонентной
смеси, которые на стадии (b) проявили желательное воздействие на биологический профиль заболевания;
(d) идентификации с использованием многомерного анализа среди композиций, определенных на
стадии (с), эффективных натуральных компонентов или групп натуральных компонентов и их соответствующих концентраций, требуемых для оказания желательного воздействия на биологический профиль
заболевания.
-1-
011959
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения многокомпонентная смесь
оптимизирована в сторону оптимальной активности для излечения или предотвращения развития патологического состояния живой системы и с точки зрения эффективности и безопасности (излечение или
лечение).
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу в соответствии с настоящим
изобретением, где за стадией (d) следует стадия (е), на которой набор многокомпонентных смесей натуральных продуктов готовят на основании информации, полученной на стадии (d), причем ожидается, что
смеси проявляют желательное воздействие на биологический профиль заболевания, после чего за стадией (е) следует стадия (f), на которой с использованием многомерного анализа определяется воздействие
набора многокомпонентных смесей, полученных на стадии (е), на биологический профиль заболевания.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу определения воздействия многокомпонентной смеси натуральных продуктов на биологический профиль заболевания, включающему
стадии:
(a) определения с использованием многомерного анализа биологического профиля заболевания
сравнением биологического профиля группы живых систем с симптомами заболевания с биологическим
профилем эталонной (или здоровой) группы живых систем;
(b) определения с использованием многомерного анализа воздействия ряда образцов многокомпонентной смеси на биологический профиль заболевания, причем в образцах концентрации одного или
нескольких натуральных компонентов или одной или нескольких групп натуральных компонентов различаются;
(c) определения с использованием многомерного анализа состава образцов многокомпонентной
смеси, которые на стадии (b) проявили желательное воздействие на биологический профиль заболевания;
(d) идентификации с использованием многомерного анализа среди композиций, определенных на
стадии (с), эффективных натуральных компонентов или групп натуральных компонентов и их соответствующих концентраций, требуемых для оказания желательного воздействия на биологический профиль
заболевания;
(e) получения набора многокомпонентных смесей натуральных продуктов на основании информации, полученной на стадии (d), причем ожидается, что указанные смеси проявляют желательное воздействие на биологический профиль заболевания; и
(f) определения с использованием многомерного анализа воздействия на биологический профиль
заболевания набора многокомпонентных смесей, полученного на стадии (е).
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения на стадии (g) отбирают одну или несколько многокомпонентных смесей, полученных на стадии (е), причем указанные смеси проявляют на стадии (f) желательное и улучшенное воздействие на биологический профиль заболевания. Отобранные таким образом на стадии (g) одна или несколько многокомпонентных смесей проявляют улучшенное воздействие на биологический профиль заболевания, по сравнению с другими многокомпонентными смесями, полученными на стадии (е).
В другом привлекательном варианте осуществления настоящего изобретения одну или несколько из
отобранных многокомпонентных смесей, полученных на стадии (g), доводят посредством добавления
одного или нескольких дополнительных компонентов к смеси (смесям), после чего воздействие доведенной смеси на биологический профиль заболевания определяют, используя многомерный анализ.
Другое преимущество настоящего изобретения состоит в том, что в пределах определенного диапазона качества можно разработать многокомпонентные смеси натуральных продуктов. Это очень важно,
потому что качество соответствующих натуральных компонентов или групп натуральных компонентов
может локально отличаться вследствие, например, различных погодных условий во время культивирования, несмотря на внедрение надлежащей сельскохозяйственной практики. Если один или несколько натуральных компонентов или одна или несколько групп натуральных компонентов не имеют желательного качества, то многокомпонентная смесь может быть доведена в отношении указанного одного или нескольких натуральных компонентов или одной или нескольких групп натуральных компонентов с тем,
чтобы оказывать желательное воздействие на биологический профиль заболевания. Это можно, например, установить регулировкой количества соответствующего одного или нескольких натуральных компонентов или одной или нескольких групп натуральных компонентов с тем, чтобы получить требуемую
концентрацию (концентрации) одного или нескольких натуральных компонентов или одной или нескольких групп натуральных компонентов, обеспечивая желательное воздействие многокомпонентной
смеси на биологический профиль заболевания.
Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация по меньшей мере одного натурального компонента или группы натуральных компонентов смеси регулируется для обеспечения того, чтобы по меньшей мере один натуральный компонент или группа натуральных компонентов смеси оказывали желательное воздействие на биологический профиль заболевания.
-2-
011959
В соответствии с настоящим изобретением можно очень привлекательно организовать разработку и
контроль качества лекарственных препаратов на основе натуральных продуктов.
В контексте настоящего изобретения многокомпонентная смесь натуральных продуктов определяется как смесь натуральных компонентов или групп натуральных компонентов, причем указанные компоненты получены не химическим синтезом, а натуральным способом. Многокомпонентная травяная
смесь, например, содержит 2 или более трав, причем травы, как таковые, могут состоять из ряда различных компонентов.
Живые системы включают людей и все виды животных. Когда используются животные, группу живых систем можно выбрать из одного конкретного типа животного.
Способ в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает возможность измерения воздействий вмешательств, направленных на множественные мишени, и разработки продуктов для оптимального
выполнения таких вмешательств необычным подходом, выявляющим биологический профиль эффективных компонентов. Поэтому настоящее изобретение предоставляет важную функцию мостика между
двумя дополнительными подходами, используемыми в ТСМ и западной медицине, потому что оно может выявить, кроме воздействий простых препаратов, подобных одному лекарственному средству, также
и сложные расстройства, используя многокомпонентные смеси, такие как, например, продукты медицины трав и функциональные пищевые продукты. Этот необычный подход именуется многомерной фармакологией (MDF), и в ней используется подход системной биологии, при котором биологические системы
изучаются измерением и интегрированием метаболических данных и других профильных данных, таких
как генетические и/или протеомные данные.
Определение биологических эффектов и, в частности, синергических многокомпонентных эффектов в соответствии с настоящим изобретением иллюстрируется примером продуктов медицины трав в
стратегиях вмешательств. Определение таких эффектов не ограничивается биологическими и синергическими эффектами в системах млекопитающих, но оно может быть направлено на все возможные формы
живых систем со сложными смесями, полученными из одного и того же набора живых систем.
Настоящее изобретение не ограничивается определенным типом заболевания, но охватывает любое
заболевание, биологический профиль которого можно определить, и в равной степени его можно применять в целях профилактики.
Значительное преимущество настоящего изобретения заключается в том, что оно обеспечивает научную основу и эффективности и безопасности испытанных многокомпонентных смесей.
Способ по настоящему изобретению позволяет охарактеризовать сложные многокомпонентные
смеси, а в случае продуктов ТСМ эффекты этих продуктов в системах млекопитающих для выявления
биологических эффектов и воздействий ТСМ на пациентов.
Еще один очень важный аспект способа в соответствии с настоящим изобретением состоит в том,
что он обеспечивает возможность измерения всех биологических эффектов, включая аддитивные и синергические эффекты.
В исследованиях нормы и патологии профиль биологических жидкостей, например образца плазмы,
взятого у контрольной группы (эталонной группы) и группы пациентов (группы с симптомами заболевания с биологическим профилем), можно использовать для измерения как можно большего количества
компонентов и произвести оценку для выявления различий одиночных компонентов или типов компонентов между двумя группами для получения лучшего проникновения в сущность лежащих в основе
биологических механизмов для выявления новых биологических маркеров/суррогатных маркеров для
прогноза токсикологии или фармакологической реакции или для разработки новых путей вмешательства.
В контексте настоящего изобретения биологический маркер определяется как характеристика, которая
объективно измерена и оценена как показатель нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологической реакции на терапевтическое вмешательство. Биологические маркеры могут представлять собой гены, транскрипты, белки, метаболиты, (микро)элементы или любую комбинацию этих компонентов.
Концепция настоящего изобретения, заключающаяся в использовании образцов для динамического
моделирования непосредственно или после нелинейного или линейного многомерного сжатия, открывает уникальный путь изучения динамических процессов с использованием описания систем на основании
образцов компонентов. В таких исследованиях расстройства, такие как, например, вызванные посредством лекарственного вмешательства, можно контролировать и оценивать многомерным образом и использованием таких способов, как динамический анализ, искажение времени и нелинейные динамические
методики. При оценке данных, полученных способом настоящего изобретения, также может иметь значение дополнение других данных и информации из других источников, такой как информация из клинических досье пациентов, описывающих медицинский диагноз и биохимические данные, или данные исследования заболевания, касающиеся поведения, познавательной функции, психологических, социальных и других показателей. Эти данные могут быть включены или связаны с набором данных, полученных способом в соответствии с настоящим изобретением, для классификации пациентов или для выявления подклассов или других релевантных данных. В частности, при создании нового травяного лекарственного средства часто предпочтительны экспериментальные животные модели для получения биологи-3-
011959
ческой активности, например измерения устойчивости к инсулину при изучении метаболического синдрома (ожирение, сахарный диабет II типа, гипертония и другие родственные сердечно-сосудистые заболевания). Прямая корреляция таких данных с составом травяной смеси и профилем биологической реакции на этой модели представляет собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения, когда изучаются новые смеси. Когда уже была доказана безопасность смесей у человека или животного в случае использования в ветеринарии, для оценки можно непосредственно использовать профили биологических маркеров человека.
Применение настоящего изобретения создает широкое разнообразие новых подходов в использовании метаболомики, протеомики и/или других профилей компонентов биологических жидкостей для усиления общего процесса биомедицины или обнаружения лекарственных средств, разработки, включая
клиническую оценку, диагностических применений и постмаркетингового контроля. Созданные профили
можно использовать, прежде всего, для получения лучшего проникновения в сущность лежащего в основе биологического процесса и т.д. для токсикологической оценки (прогностическая токсикология), обнаружения биологического маркера/суррогатного маркера или типа биологического маркера/суррогатного
маркера, обоснования мишени белка, сравнения экспериментальных моделей и их связи с исследованиями у людей, типового фенотипирования на уровне метаболита и/или белка, оценки реагента/не реагента,
обоснования экспериментальных моделей, таких как трансгенные модели, обеспечения способности корреляции данных об уровне метаболита с другими уровнями в системной биологии, таких как данные о
генах, мРНК, РНКи и белках.
Способ в соответствии с настоящим изобретением создает образцы компонентов, а используемый
многомерный анализ создает образцы релевантных компонентов для данной ситуации или исследования.
В современной биологии и родственных индустриях производства питательных веществ, фармацевтических средств и биотехнологической промышленности он представляет собой радикально новый пример
стимуляции процессов научных исследований, промышленных открытий и разработок. Основное представление заключается в том, что биология в целом и патологические процессы, в частности, являются
многофакторными по природе,и поэтому понимание таких процессов требует описания или понимания,
основанного на множестве компонентов. В большинстве случаев процессы разработки основаны, например, на оценке одной мишени одним биологическим маркером для оценки эффективности или для дифференцировки контрольных групп от групп пациентов. Однако настоящее изобретение представляет способ, который обеспечивает возможность создания прорыва в способности описания многофакторных
заболеваний многофакторными образцами, а также многофакторных реакций в отношении многофакторных вводимых переменных величин, как, например, при комбинированных видах лечения (химиотерапия) или при оценке медицины трав, функциональной пищи и питательных реакций.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно по меньшей мере одна спектрометрическая методика, по меньшей мере одна методика на основе электромиграции или по меньшей мере одна
хроматографическая методика используется на стадии (а) для определения профиля заболевания. Предпочтительнее используются 2 или более спектрометрические методики, но также включены специальные
методики выявления, например вызванная лазером флюоресценция и электрохимическое выявление в
комбинации с методиками разделения ((нано)ВЭЖХ, способы на основе электромиграции). Наиболее
предпочтительно для определения профиля заболевания на стадии (а) используется, по меньшей мере,
методика ядерного магнитного резонанса и/или методика масс-спектрометрии.
Биологический профиль, который предстоит определить на стадии (а), включает предпочтительно
один или несколько метаболических, генетических и/или полемических профилей. Можно использовать
любую комбинацию этих профилей. Предпочтительно такая комбинация включает один или несколько
метаболических профилей. Предпочтительнее биологический профиль включает метаболические, генетические и протеомные профили.
На стадии (а) предпочтительно определяется биологический профиль по меньшей мере одного типа
биологической жидкости или по меньшей мере одного типа ткани. Предпочтительнее на стадии (а) определяются биологические профили по меньшей мере двух различных типов биологической жидкости.
Биологические профили определяются на стадии (а) с использованием одного или нескольких из
следующих биологических маркеров: гены, транскрипты, белки, метаболиты и (микро)элементы.
На стадии (b) предпочтительно используется по меньшей мере одна спектрометрическая методика,
по меньшей мере одна методика на основе электромиграции или по меньшей мере одна хроматографическая методика для определения воздействия ряда образцов многокомпонентной смеси на биологический
профиль заболевания. Предпочтительнее используются две или более спектрометрические методики,
тогда как наиболее предпочтительно используется, по меньшей мере, методика ядерного магнитного резонанса и/или методика масс-спектрометрии. В случае профилирования белка включаются также другие
методики, такие как электрофоретические методики на основе геля.
На стадии (с) предпочтительно используется по меньшей мере одна спектрометрическая методика,
по меньшей мере одна методика на основе электромиграции или по меньшей мере одна хроматографическая методика для определения состава образцов. Предпочтительнее используются две или более спектрометрические методики, тогда как наиболее предпочтительно используется, по меньшей мере, методи-4-
011959
ка ядерного магнитного резонанса и/или методика масс-спектрометрии. На стадии (с) количество образцов, состав которых определяется на стадии (с), составляет предпочтительно по меньшей мере 2, а предпочтительно от 5 до 100.
На стадии (d) предпочтительно используется по меньшей мере одна спектрометрическая методика,
по меньшей мере одна методика на основе электромиграции или по меньшей мере одна хроматографическая методика для идентификации эффективных компонентов или групп компонентов и их соответствующих концентраций, требуемых для оказания воздействия на биологический профиль заболевания.
Предпочтительнее используются две или более спектрометрические методики. Наиболее предпочтительно на стадии (d) используются, по меньшей мере, методика ядерного магнитного резонанса и методика
масс-спектрометрии.
На стадии (f) предпочтительно используется по меньшей мере одна спектрометрическая методика,
по меньшей мере одна методика на основе электромиграции или по меньшей мере одна хроматографическая методика для идентификации эффективных компонентов или групп компонентов и их соответствующих концентраций, требуемых для оказания воздействия на биологический профиль заболевания.
Предпочтительнее используются две или более спектрометрические методики. Наиболее предпочтительно на стадии (е) используются, по меньшей мере, методика ядерного магнитного резонанса и методика
масс-спектрометрии.
Многокомпонентная смесь, которая подлежит использованию в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой любую многокомпонентную смесь, оказывающую (потенциальное)
воздействие на биологический профиль заболевания. Такая многокомпонентная смесь может представлять собой любой натуральный продукт. Подходящие примеры такой смеси включают питательные продукты, функциональные пищевые продукты, травяные продукты, водоросли, микробные, грибковые лекарственные продукты или (экстракты) биологических жидкостей.
Предпочтительно многокомпонентная смесь натуральных продуктов представляет собой травяную
смесь.
На каждой из стадий (a)-(d) и (f), (e) предпочтительно используется по меньшей мере одна спектрометрическая методика. Возможно использование методики ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или
методики масс-спектрометрии (МС), причем последняя методика сосредоточена на ограниченном числе
низкомолекулярных соединений. Однако обе эти методики имеют ограничения. Подходы с использованием ЯМР ограничены тем, что они обычно предоставляют надежную информацию только о соединениях, присутствующих в высокой концентрации. С другой стороны, методики глобальной или сфокусированной масс-спектрометрии не требуют высоких концентраций, но могут предоставить информацию на
уровне широкого скрининга или только ограниченных частей биологического профиля. Используемые в
настоящем описании термины «мелкие молекулы» и «метаболиты» используются взаимозаменяемо.
Мелкие молекулы и метаболиты включают, без ограничения, липиды, стероиды, аминокислоты, органические кислоты, желчные кислоты, эйкозаноиды, пептиды, углеводороды и микроэлементы.
Поэтому на каждой из стадий (a)-(d) и (f), (e) предпочтительно используется, по меньшей мере, методика ядерного магнитного резонанса и/или методика масс-спектрометрии с предпочтением массспектрометрии в области профилирования белков (протеомики).
Ситуация для мелких молекул обсуждается в качестве примера. Подготовка образца для ЯМР может быть в целом очень простой с использованием лиофилизации и растворения перед использованием в
D2O, потому что исследование фокусируется на компонентах, имеющих более высокую концентрацию,
т.е. типичную концентрацию >100 нг/мл. Для МС можно использовать разнообразные подходы к подготовке образцов в диапазоне от экстрагирования твердой фазы и экстрагирования жидкости жидкостью до
более специфических способов с использованием, например, способов на основе аффинитета или процедур дериватизации как для газовой хроматографии с масс-спектрометрией (ГХ-МС), так и для жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХ-МС).
На каждой из стадий (a)-(d) и (f), (е) можно использовать спектрометрические данные, полученные
от одной или нескольких платформ, включая, без ограничения, МС, ЯМР, жидкостную хроматографию
(ЖХ), газовую хроматографию (ГХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), капиллярный электрофорез (КЭ) и любую известную форму гифенированной масс-спектрометрии в режиме
низкого или высокого разрешения, такую как ЖХ-МС, ГХ-МС, КЭ-МС, ЖХ-УФ, МС-МС, МСn и т.д.
Данные типичного профиля можно также получить использованием более специфичных для компонентов детекторов, таких как вызванная лазерным излучением флюоресценция и электрохимическое выявление.
Используемый в настоящем описании термин «спектрометрические данные» включает данные, полученные любой спектрометрической или хроматографической методикой.
Спектрометрические методики включают, без ограничения, резонансную спектроскопию, массспектроскопию и оптическую спектроскопию. Хроматографические методики включают, без ограничения, хроматографию жидкой фазы, хроматографию газовой фазы и электрофорез.
-5-
011959
Если получен спектральный профиль, как при стандартных спектроскопических способах, первичной, необходимой стадией является регулировка небольших сдвигов спектров и по размеру интенсивности, а также по спектральному и хроматографическому размеру. Сдвиги могут быть вызваны инструментальными факторами, условиями окружающей среды или меняющимися концентрациями компонентов
(как часто происходит в случае анализа мочи). В качестве примера часто происходит и должно учитываться изменение химических сдвигов ЯМР, но воспроизводимость и стандартизация интенсивности
(или площади пика) одиночного профиля (количественного размера) обычно очень удовлетворительные.
Это наблюдается в отличие от МС, при которой размер максимальной интенсивности (изобилие ионов)
нужно тщательно довести или стандартизировать вследствие отсутствия калибраторов для каждого компонента, присутствующего в профиле. При гифенированных методиках также необходимо тщательно
оценить воспроизводимость способа разделения (ГХ, ЖХ или методики, запускаемые электромиграцией,
такие как капиллярный электрофорез (КЭ)). В этом отношении впечатляющими являются спектральные
профили около инфракрасной области спектра и коррекция любого размера вряд ли требуется.
В целом, небольшие инструментальные сдвиги спектрального (вариабельного) размера будут ложно
трактоваться как представляющие различные компоненты, когда сбор профилей данных подвергается
анализу распознавания образца. Простым путем для того, чтобы справиться с этой проблемой, является
использование методик дискретизации, при которых спектр снижен по разрешению до степени, достаточной для обеспечения того, чтобы данный пик оставался в своем элементе дискретизации, несмотря на
небольшие спектральные сдвиги между анализами. Например, при ЯМР ось химического сдвига может
быть дискретизирована и подвергнута грубому разрешению, а точность величин МС спектров может
быть округлена до целых величин единиц атомной массы. Однако предпочтительны более тонкие процедуры, такие как частичная линейная подгонка для ЯМР или другие процедуры совмещения для МС.
После предварительной обработки исходных данных спектральные профили устанавливаются для
распознавания образца (многомерный анализ).
Возможность применения различных методик для создания профилей биологических жидкостей
оптимально используется многоходовым, многомерным анализом и обеспечивает возможность измерения различных биологических жидкостей одной и той же системы (таких как плазма и моча или плазма и
спинно-мозговая жидкость) для выявления новых проникновений в сущность системной биологии, например воздействия гематоэнцефалического барьера, по сравнению с профилями плазмы и мочи. Следовательно, на каждой стадии (а)-(d) предпочтительно используется многоходовой, многомерный анализ.
Настоящее изобретение предоставляет способ обработки спектрометрических данных с использованием множественных стадий многомерного анализа для обработки данных в иерархической процедуре
(стадии (a)-(d) и (f, e)). На каждой из стадий (а)-(d) и (f, e) первый многомерный анализ можно использовать на множестве наборов данных для различения одного или нескольких наборов различий и/или
сходств между ними, после чего второй многомерный анализ можно использовать для определения корреляции (и/или антикорреляции, т.е. отрицательной корреляции) по меньшей мере между одним из этих
наборов различий (или сходств) и одним или несколькими из множества наборов данных. На стадии (а)
определение биологического профиля заболевания может быть также основано на корреляции.
Используемый в настоящем описании термин «набор данных» относится к спектрометрическим
данным, связанным с одним или несколькими спектрометрическими измерениями. Например, когда
спектрометрическая методика представляет собой ЯМР, набор данных может включать один или несколько ЯМР спектров. Когда спектрометрическая методика представляет собой УФ-спектроскопию,
набор данных может включать один или несколько спектров эмиссии или поглощения УФ. Аналогичным
образом, когда спектрометрическая методика представляет собой МС, набор данных может включать
один или несколько масс спектров. Когда спектрометрическая методика представляет собой хроматографическую МС-методику (например, ЖХ-МС, ГХ-МС и т.д.), набор данных может включать одну или
несколько масс-хроматограмм. Альтернативно, набор данных может представлять собой набор хроматограмм или реконструированных TIC хроматограмм. Кроме того, следует понимать, что термин «наборы
данных» включает и необработанные спектрометрические данные, и данные, которые были подвергнуты
предварительной обработке (например, для удаления шума, определения исходного уровня, выявления
пиков и т.д.).
Более того, используемый в настоящем описании термин «наборы данных» может относиться, по
существу, ко всему или к поднабору спектрометрических данных, связанных с одним или несколькими
спектрометрическими измерениями. Например, данные, связанные со спектрометрическими измерениями различных источников образцов (образцов групп с симптомами заболевания (образцов экспериментальной группы) в сравнении с образцами эталонных или здоровых групп (образцы контрольной группы)), можно группировать в различные наборы данных. В результате первый набор данных может относиться к измерениям образца экспериментальной группы, а второй набор данных может относиться к
измерениям образца контрольной группы. Кроме того, наборы данных могут относиться к данным,
сгруппированным на основании любой другой классификации, считающейся релевантной.
-6-
011959
Настоящее изобретение также представляет способ обработки спектрометрических данных с использованием многомерного анализа для обработки данных на двух или более иерархических уровнях
корреляции. На каждой из стадий (a)-(d) и (f, e) можно использовать многомерный анализ множественных наборов данных для различения корреляций (и/или антикорреляций) между наборами данных на
первом уровне корреляции, после чего многомерный анализ можно использовать для различения корреляций (и/или антикорреляций) между наборами данных на втором уровне корреляции. На стадии (а) определение биологического профиля биологической системы может быть также основано на корреляциях,
различенных на одном или нескольких уровнях корреляции.
В соответствии с настоящим изобретением обработку спектрометрических данных на каждой из
стадий (a)-(d) и (f, e) можно проводить с использованием множественных этапов многомерного анализа
для обработки наборов данных в иерархической процедуре, причем одна или несколько из стадий многомерного анализа, кроме того, включает обработку данных на двух или более иерархических уровнях
корреляции. Например, на каждой из стадий (a)-(d) первый многомерный анализ можно использовать на
множестве наборов данных для различения одного или нескольких наборов различий и/или сходств между ними; второй многомерный анализ можно использовать для определения первого уровня корреляции (и/или антикорреляций) между первым набором различий (или сходств) и одним или несколькими
наборами данных; а второй многомерный анализ можно использовать для определения второго уровня
корреляции (и/или антикорреляций) между первым набором различий (или сходств) и одним или несколькими наборами данных. На стадии (а) определение биологического профиля заболевания может
быть основано на корреляциях, различенных на одном или более уровнях корреляции.
Подходящие формы многомерного анализа включают, например, анализ основных компонентов
(РСА), дискриминантный анализ (DA), PCA-DA, факторный анализ, каноническую корреляцию (СС),
частичные минимальные квадратические (PLS), прогностический линейный дискриминантный анализ
(PLDA), невральные сети, многоуровневый/многоходовой/многоблочный анализ, повторяющийся целевой анализ, общий «прокрустов» анализ, вспомогательные векторные машины (SVM), методики распознания парафакторов и образцов.
Использование описанных выше методик многофакторного анализа хорошо известно в данной области. Для более подробного описания можно, например, сослаться на международную публикацию
WO 03/017177 (Способ и устройство для профилирования биологических систем), содержание которой
включено сюда в качестве ссылки. Для выведения максимальной величины из данных указанные выше
инструменты многомерного анализа можно использовать совместно с дополнительными статистическими и информационными стратегиями. После определения и количественной характеристики статистически значимых различий, например обилия метаболитов среди групп образцов, целью становится понимание лежащих в основе биологических причин и контекстов результатов. Первой стадией является идентификация метаболических компонентов, наблюдаемых в спектрах данных и выявленных многомерным
анализом, являющихся значимыми различиями среди образцов. Такая идентификация обычно включает
исследование различных баз данных известных спектров и структур компонентов метаболитов. Следующая стадия состоит в анализе существующих представлений о молекулярных взаимодействиях посредством поиска в публичных и частных базах данных. Это может в определенной степени помочь в
объяснении связей и поведения, наблюдаемого в результатах изучения метаболического профиля. Однако, потому что большинство метаболических, геномных, протеомных и относящихся к взаимодействиям
баз данных описывают биохимические явления в статическом состоянии, для объединения разобщенных
биологических ключей в динамические модели, которые больше подходят для объяснения, например,
патологических процессов, необходимы все более изощренные аналитические и математические инструменты.
Действительно, и линейные, и нелинейные многомерные анализы могут раскрыть статистически
значимые связи между биомолекулярными компонентами, которые нельзя объяснить посредством анализа существующих баз данных или литературы.
Предпочтительный вариант осуществления способа по настоящему изобретению включает следующие стадии:
1. Выбор релевантных образцов, например биологических жидкостей (плазмы, мочи, спинномозговой жидкости, слюны, синовиальной жидкости и т.д.).
2. Выбор ширины биологического профилирования: транскрипты, белки, метаболиты и т.д.
3. Получение образца на основании спектрометрических методик, которые предстоит использовать
для определения биологического профиля (например, комбинации ГХ-МС, ЖХ-МС, КЭ-МС, МС/МС,
различные методологии ЯМР, электрофоретические методики на основе геля и т.д.).
4. Определение профиля с использованием спектрометрических методик, методик на основе геля,
профилей ЯМР и предпочтительных МС-подходов в случае охватывающих метаболомику липидов, стероидов, желчных кислот, эйкозаноидов, (нейро)пептидов, витаминов, органических кислот, нейромедиаторов, аминокислот, углеводородов, ионных органических веществ, нуклеозидов, неорганических веществ, ксенобиотиков и т.д. с предпочтительным включением пептидов. Может также быть включен
глобальный МС-профиль для описания в одном эксперименте основных компонентов с высокой концен-7-
011959
трацией, который часто является хорошим показателем баланса/гомеостаза системы в дополнение к ЯМР
профилю.
5. Обработка полученных данных с использованием предпочтительной методики, описанной в заявке на патент Дании 1016034, в комбинации с PCA-DA, многоблочным/многоходовым многомерным
анализом на основании линейных и нелинейных методик и алгоритма частичной линейной подгонки.
6. Комбинирование результата стадии 4 с другими релевантными источниками данных, такими как
медицинский анамнез, результаты биохимических анализов, данные медицинской документации и поведенческие, социальные, психологические данные и т.д.
7. Изучение динамики (нелинейной или линейной) динамических заболеваний с использованием
одного из компонентов профилирования или любой комбинации профилирующих компонентов, предпочтительно использованием комбинации методик нелинейного сжатия и динамического моделирования.
Концепция настоящего изобретения подходящим образом основана на следующих аспектах:
профилирование сложных смесей, таких как биологические жидкости;
комбинация ЯМР и выбор гифенированных масс-спектрометрических методик (GC-, LC-, СЕMS/MS, ICPMS);
оценка комбинации с данными предварительной обработки/масштабирования, предшествующими
многоблочному/многоходовому многомерному анализу;
комбинация баз инструментальных данных, созданных с другими релевантными наборами данных;
связывание наборов данных, полученных из образцов из одной системы, но посредством других
профилей биологических жидкостей и
способность изучать все формы нелинейной динамики.
В случае, когда обнаружены биологически активные компоненты или группы активных компонентов и выявлены ограничения композиции для желательного эффекта, это знание можно использовать для
создания смесей или нового травяного лекарственного средства.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу получения лекарственного средства на основе натуральных продуктов, при котором эффективные натуральные компоненты или группы
компонентов, определенные на стадии (d), комбинируются в соответствующих концентрациях, требуемых для оказания желательного воздействия на биологические профили заболевания.
Настоящее изобретение также относится к применению многокомпонентной смеси, полученной на
стадии (е), для получения лекарственного средства на основе натуральных продуктов. Настоящее изобретение также относится к применению многокомпонентной смеси, отобранной на стадии (g), из набора
смесей, полученных на стадии (е), для получения лекарственного средства на основе натуральных продуктов.
Настоящее изобретение также относится к применению многокомпонентной смеси, полученной на
стадии (е), в пищевых продуктах. Подходящие виды применения в виде пищевых продуктов включают
питательные смеси и функциональные пищевые продукты. Изобретение можно также применять для
определения безопасности пищевых продуктов.
Изобретение, кроме того, относится к лекарственному средству, включающему многокомпонентную смесь, полученную на стадии (е).
Выявление биологически активных образцов в смесях, таких как травяные продукты, обеспечивает
возможность также сфокусированного контроля качества или оптимизированного получения растений,
обеспечивающего возможность изготовления эффективных и хорошо контролируемых продуктов. Это
решающий этап и основное узкое место в современном состоянии контроля качества натуральных продуктов. Хотя были предложены спектроскопические методики для контроля состава смеси (см., например, WO 0047922 (Dunn et al.)), неспособность связать изменение концентрации компонента или возможности воздействия соотношения в композиции между множественными компонентами в продукте с
биологической активностью мешает настоятельной необходимости контроля зависимости эффекта от
концентрации. Настоящее изобретение поэтому является прорывом, так как можно выполнить и профилирование многокомпонентного продукта, и профилирование биологической реакции и можно провести
корреляцию обоих полученных таким образом профилей. Поэтому настоящее изобретение также относится к способу создания многокомпонентной смеси и контролю состава многокомпонентной смеси, где
концентрация по меньшей мере одного натурального компонента или по меньшей мере одной группы
натуральных компонентов смеси доводится для обеспечения того, чтобы по меньшей мере один натуральный компонент или по меньшей мере одна группа натуральных компонентов смеси оказывали воздействие на биологический профиль заболевания. Многокомпонентная смесь может, например, содержаться в растении, качество которого контролируется и доводится для получения продукта высокого
качества.
Выявление биологически активных образцов в смесях, таких как травяные продукты, также обеспечивает возможность сфокусированного контроля качества или оптимизированной продукции растений,
обеспечивающей возможность получения эффективных и хорошо контролируемых продуктов.
-8-
011959
В случаях, когда обнаружены все или часть биологически активных компонентов и выявлены ограничения для оптимального эффекта композиции, знание можно использовать для создания смесей синтетически полученных компонентов. В последнем случае можно создать фармацевтические препараты.
Настоящее изобретение также относится к применению настоящего способа для организации программ разведения животных, протоколов должной сельскохозяйственной/производственной практики
(GAP/GMP) и обработки натуральных продуктов после сбора урожая для использования в лекарственных средствах на основе натуральных продуктов.
Пример.
Способ в соответствии с настоящим изобретением схематически изображен на фиг. 1. Типичный
эксперимент для медицины трав в соответствии с настоящим изобретением основан на «отпечатках
пальцев», полученных подходом биологии систем, и основан на следующих стадиях.
1. Ряд партий смеси или набора различных травяных смесей, предпочтительно со значительным изменением состава, измеряют (проводят «фингерпринтинг») методикой профилирования, такой как ЯМР
или масс-спектрометрия; указаны как партии 1-n в левой части фиг. 1.
2. Измеряют профили воздействия этих партий после введения животному в экспериментальной
модели или при испытании человеку, а также эталонной группе, которую не лечат (состоящей и из больных животных, и субъектов дикого типа или здоровых субъектов/пациентов) или выбирают для лечения
другим образом.
3. Эталонная группа обеспечивает профиль биологического маркера для заболевания, а другие эксперименты обеспечивают воздействие смеси на тип заболевания и выявляют также другие эффекты.
Кроме того, клинические исходы при испытаниях на людях или типичные биологические эффекты, измеренные на клеточных моделях и/или экспериментальных моделях у животных, можно использовать
для оценки многокомпонентной смеси. Это доказывает эффект в отношении группы определенных заболеваний. В случае, если контрольная группа отсутствует, сравнительный анализ можно использовать для
выявления оптимального биологического эффекта в отношении клинического исхода или гипотезы.
4. (Не)линейная многомерная корреляция образцов компонентов смеси и профили эффекта, включая также всю другую информацию, такую как клинические исходы или любой биологический эффект,
полученный на других моделях (моделях на основе клеток или животных), обеспечивает возможность
выявления образцов компонентов, ответственных за биологические эффекты.
5. При создании травяного лекарственного средства состав продукта можно изменять и оценку, основанную на биологической реакции на экспериментальной модели у животного или «отпечатке пальцев» биологического маркера заболевания, можно использовать для оптимизации эффективности и безопасности. На фиг. 2 представлен эксперимент считывания данных эксперимента на животном, измеряющего действие травяных смесей на устойчивость к инсулину и безопасность для печени. Различные композиции дают различную эффективность (устойчивость к инсулину) и также проявляют различные профили безопасности по данным измерения посредством печеночного фермента (ALAT) на модели. В дополнение, можно оценить «отпечатки пальцев» биологического маркера каждой смеси, как показано на
фиг. 3, на котором многомерный анализ одной из смесей представлен, по сравнению с группой контроля
(заболевания) в динамике. Эффект отчетливо проявляется после 4 недель лечения, и дальнейший анализ
данных дает информацию, специфичную для компонентов и специфичную для биологического пути или
сообщения системы. Корреляция между исходом экспериментов, относящихся к фиг. 2 и 3, представляет
информацию о том, какой компонент (компоненты) или группы компонентов ответственны за биологический эффект. Оптимизацию можно выполнить с идентификацией или без идентификации компонентов
смеси.
6. После создания оптимальной многокомпонентной смеси «отпечатки пальцев» смеси можно контролировать на основании информации, полученной на этапе 4. Профилирование многокомпонентных
смесей, таких как травяное лекарственное средство, можно выполнить способами разделения, но предпочтительнее спектроскопическими методиками, такими как ЯМР или масс-спектрометрические методики с использованием прямого вливания методологиями GC/MS и LC/MS. Особенно привлекательны
стратегии прямых «отпечатков пальцев» на основе масс-спектрометрии с трансформацией Фурье с учетом способностей высокого разрешения и уникальной возможности идентификации, которая часто предпочтительна ввиду сложности продуктов медицины трав.
7. В случае выращивания и производства растений описанное изобретение можно использовать для
оптимального отбора условий производства/культивирования таких растений и контроля качества продукции.
-9-
011959
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ in vitro определения внутри сложной многокомпонентной смеси натуральных продуктов
эффективных натуральных компонентов или групп натуральных компонентов и их соответствующих
концентраций, требуемых для оказания желательного воздействия на биологический профиль заболевания внутри группы живых систем, где указанная смесь содержит питательный продукт, функциональный
пищевой продукт, продукт медицины трав, биологическую жидкость, экстракт биологической жидкости
или их смесь, при этом способ предусматривает стадии:
(a) определения биологического профиля заболевания сравнением биологического профиля группы
живых систем с симптомами заболевания с биологическим профилем эталонной (или здоровой) группы
живых систем с использованием многомерного анализа, измерением и интегрированием данных от одного или более из метаболических, генетических и/или протеомных профилей;
(b) определения с использованием многомерного анализа воздействия ряда образцов многокомпонентной смеси на биологический профиль заболевания, причем в образцах концентрации одного или
нескольких натуральных компонентов или одной или нескольких групп натуральных компонентов различаются;
(c) определения с использованием многомерного анализа состава образцов многокомпонентной
смеси, которые на стадии (b) проявили желательное воздействие на биологический профиль заболевания;
(d) идентификации с использованием многомерного анализа среди композиций, определенных на
стадии (с), эффективных натуральных компонентов или групп натуральных компонентов и их соответствующих концентраций, требуемых для оказания желательного воздействия на биологический профиль
заболевания.
2. Способ по п.1, где за стадией (d) следует стадия (е), на которой набор многокомпонентных смесей натуральных продуктов готовят на основании информации, полученной на стадии (d), после чего за
стадией (е) следует стадия (f), на которой с использованием многомерного анализа определяется воздействие набора многокомпонентных смесей, полученных на стадии (е), на биологический профиль заболевания.
3. Способ по п.2, где из набора многокомпонентных смесей, полученных на стадии (е), на стадии (g)
выбирают одну или несколько многокомпонентных смесей, проявляющих желательное и улучшенное
воздействие на биологический профиль заболевания.
4. Способ по любому из пп.1-3, где на стадии (а) используется по меньшей мере одна спектрометрическая методика, по меньшей мере одна методика, основанная на электромиграции, или по меньшей
мере одна хроматографическая методика для определения профиля заболевания.
5. Способ по любому из пп.1-4, где на стадии (b) используется по меньшей мере одна спектрометрическая методика, по меньшей мере одна методика на основе электромиграции или по меньшей мере
одна хроматографическая методика для определения воздействия ряда образцов многокомпонентной
смеси на биологический профиль заболевания.
6. Способ по любому из пп.1-5, где на стадии (с) используется по меньшей мере одна спектрометрическая методика, по меньшей мере одна методика на основе электромиграции или по меньшей мере
одна хроматографическая методика для определения состава образцов.
7. Способ по любому из пп.1-6, где на стадии (d) используется по меньшей мере одна спектрометрическая методика, по меньшей мере одна методика на основе электромиграции или по меньшей мере
одна хроматографическая методика для идентификации эффективных компонентов и их соответствующих концентраций, требуемых для оказания воздействия на биологический профиль заболевания.
8. Способ по любому из пп.2-7, где на стадии (f) используется по меньшей мере одна спектрометрическая методика, по меньшей мере одна методика на основе электромиграции или по меньшей мере одна
хроматографическая методика для идентификации эффективных компонентов и их соответствующих
концентраций, требуемых для оказания воздействия на биологический профиль заболевания.
9. Способ по любому из пп.2-8, где используются две или более спектрометрические методики.
10. Способ по п.9, где используется, по меньшей мере, методика ядерного магнитного резонанса и
методика масс-спектрометрии.
11. Способ по п.10, где биологический профиль включает метаболические, генетические и протеомные профили.
12. Способ по любому из пп.1-11, где на стадии (а) определяются биологические профили по меньшей мере одного типа биологической жидкости.
13. Способ по любому из пп.1-12, где на стадии (а) определяются биологические профили по меньшей мере одного типа ткани.
14. Способ по п.12, где на стадии (а) определяются биологические профили по меньшей мере двух
различных типов биологической жидкости.
15. Способ по любому из пп.1-14, где на стадии (а) биологические профили определяются с использованием одного или нескольких из следующих биологических маркеров: гены, транскрипты, белки, ме- 10 -
011959
таболиты и (микро)элементы.
16. Способ по любому из пп.1-15, где количество образцов, состав из которых определяется на стадии (с), составляет по меньшей мере 2.
17. Способ по п.16, где количество образцов, состав из которых определяется на стадии (с), находится в диапазоне от 5 до 100.
18. Способ по любому из пп.1-17, где многокомпонентная смесь натурального продукта представляет собой травяную смесь.
19. Способ по любому из пп.1-18, где концентрация по меньшей мере одного натурального компонента или группы натуральных компонентов смеси регулируется для обеспечения того, чтобы по меньшей мере один натуральный компонент или группа натуральных компонентов смеси оказывали желательное воздействие на биологический профиль заболевания.
20. Применение способа по любому из пп.1-19 для организации программ разведения животных,
протоколов должной сельскохозяйственной/производственной практики (GAP/GMP) и обработки натуральных продуктов после сбора урожая для использования в лекарственных средствах на основе натуральных продуктов.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 11 -
011959
Фиг. 3
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 12 -