ДНК инициирует полиморфные структурные переходы лецитина
advertisement
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Природные липиды способны образовывать разнообразные структуры в зависимости от рН, ионной силы, температуры и других факторов. При этом липидный бислой, наиболее хорошо изученная составляющая биологических мембран, является лишь одной из известных фаз – а именно, ламеллярной фазой, наиболее полно отражающей наши представления о барьерных свойствах мембран. Однако все разнообразие функций биологических мембран связано с процессами временного и локального разрушения-восстановления бислоя в таких явлениях, как: трансмембранный перенос метаболитов, секреция белков, обмен генетической информацией между клетками, внутриклеточная доставка различных компонентов, эндоцитоз и экзоцитоз, клеточное деление, слияние клеток, бактериальная инвазия, вирусная инфекция и многие другие. Все эти процессы сопровождаются разнообразными видами межмембранного взаимодействия и слияния мембран при которых происходят изменения фазового состояния липидов. Такие кооперативные структурные перестройки в мембранах называются фазовыми переходами. Два обширных и сильно отличающихся по физической природе типа фазовых переходов липидов привлекают особое внимание исследователей. Во-первых, это процессы плавления липидов, способные вызывать разделение твёрдых и жидких фаз, приводящее к латеральной сегрегации компонентов в плоскости мембраны. Вовторых, это полиморфные фазовые переходы липидов, в результате которых могут образовываться такие небислойные структуры, как кубические или гексагональные фазы. Биологическое значение обоих явлений чрезвычайно велико. В живых клетках гомеостатически поддерживается такой состав липидов, при котором, в интервале температур, характерных для жизнедеятельности данного организма, липиды находятся в расплавленном состоянии, при этом существует возможность возникновения полиморфных фазовых переходов ________________________________________________ Принятые сокращения: Природные липиды и их синтетические аналоги DGDG – дигалактозилдиглицерин MGDG – моногалактозилдиглицерин PG – фосфатидилглицерин DOPE – диолеилфосфатидилэтаноламин DOPC – диолеилфосфатидилхолин DMPC – димиристоилфосфатидилхолин DPPC – дипальмитоилфосфатидилхолин Синтетические катионные липиды E-DOPC – этил-диолеоилфосфатидилхолин DOTAP – диолеилтриметиламмоний пропан TTMA – татрадецилтриметиламмоний бромид DC-Chol – диметиламиноэтанкарбамоил-холестерин Методы исследования ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия КД – круговой дихроизм ЯМР – ядерный магнитный резонанс 1 В последние годы интерес к исследованию свойств липидов особенно возрос в связи с широким использованием липосомальных препаратов в медицине и, прежде всего, в генной терапии. Возникла практическая необходимость создания липосом, содержащих генетический материал или лекарственные вещества и способных активно и избирательно взаимодействовать с поверхностью определённых клетокмишеней, проникать в цитоплазму и там освобождать биологически активный агент. Создание молекулярных машин, способных выполнять столь сложные и многостадийные операции, моделирующие явления живой природы, невозможно без глубокого и всестороннего изучения всего разнообразия физико-химических свойств липидов, которые, наряду с белками, полинуклеотидами и полисахаридами являются венцом биологической эволюции молекул. Цели и задачи исследования. Целью представленной работы было изучение структурной организации различных фаз липидов, как в модельных системах, так и в живой клетке. Мы ставили следующие задачи исследования фазового поведения модельных систем: Роль электростатических взаимодействий в регуляции полиморфного поведения липидов. Влияние больших амфипатических молекул, например молекулы хлорофилла, на полиморфное поведение различных липидов. Роль процессов перекисного окисления липидов в регуляции фазового поведения мембран. Структурные изменения в комплексах цитохром с – кардиолипин. Физико-химические свойства комплексов белков или ДНК с различными липидами. Закономерности, обнаруженные в модельных системах, были рассмотрены также на примере клеточных мембран. При этом ставились задачи исследовать: Структуру и динамику изменений межмембранных контактов в зонах адгезии внешней и внутренней мембран грамотрицательных бактерий. Влияние двухвалентных катионов на полиморфизм мембран грамотрицательных бактерий и проникновение ДНК в цитоплазму. Роль мембранных процессов в инфецировании клеток Escherichia coli фагом Т4. Изменения структурной организации клеточных мембран при взаимодействии с катионными липосомами. Научная новизна. Впервые обнаружена возможность контроля полиморфного поведения липидов основанная на регуляции электростатических взаимодействий между противоположно заряженными полярными головами молекул. Было показано, что, изменяя соотношение зарядов липида, мы можем получать определённые полиморфные кубические или гексагональные фазы. Впервые показано, что амфипатические молекулы, имеющие большой объем в полярной области, например молекулы хлорофилла, способны инициировать полиморфные переходы липидов благодаря изменению соотношения размеров полярной и гидрофобной поверхностей мембраны. Проведен анализ влияния перекисного окисления липидов на фазовое состояние и структурную организацию мембран, образованных кардиолипином и цитохромом с. Показано, что наблюдаемые структурные изменения мембран связа- 2 ны с образованием олигомеров белка и продуктов перекисного окисления липидов. Впервые обнаружено стабилизирующее воздействие катионных липидов, используемых в генной терапии, на молекулу ДНК. Благодаря формированию специфической мультиламеллярной фазы ДНК-липидного комплекса, в которой молекула ДНК оказывается «зажатой» между мембранами, температура плавления ДНК повышается до 105-115˚С. Проведен детальный анализ структурных изменений мембран в условиях трансформации клеток грамотрицательных бактерий экзогенной ДНК. Показано сходство механизмов полиморфных изменений мембран бактерий, ответственных за трансмембранный перенос ДНК, и полиморфизма липидов, наблюдаемого в модельных системах. Исследованы структурные изменения мембран Escherichia coli при инфицировании бактериофагом Т4. Впервые показана роль межмембранных взаимодействий и процессов слияния мембран в инфицировании бактериальных клеток. Обнаружена специфическая структура, названная «тоннелем», ответственная за перенос молекулы ДНК через мембраны бактериальной клетки. 3
