Исследование механизмов действия хлоргексидина и

Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
УДК 577.352
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ХЛОРГЕКСИДИНА И
ДИМЕФОСФОНА НА ВОДНЫЙ ТРАНСПОРТ В ЭРИТРОЦИТАХ*
Дружинина О.С., Скоринкин А.И.
Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111, Казань, ул. Лобачевского,
2/31
Казанский государственный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 16
Метод ядерной магнитной релаксации с парамагнитным допингом был применен для изучения действия лекарственных препаратов хлоргексидина и димефосфона на водную проницаемость мембран эритроцитов. Показано, что оба исследованных вещества концентрационно-зависимо подавляют водную проницаемость, при этом хлоргексидин действует на аквапорины, а димефосфон – непосредственно на липидный бислой.
ЯМР, лекарственные вещества, физико-химические свойства клеточных мембран
Открытие новых аспектов действия лекарственных препаратов может позволить учесть все возможные последствия их использования в разных ситуациях и, следовательно, расширить спектр их применения в клинической практике. Эта задача требует проверки всех возможных механизмов действия исследуемых веществ. Сейчас действие лекарственных препаратов на живые
клетки оценивается, как правило, только биохимическими либо электрофизиологическими методиками, при этом вне зоны внимания исследователей остается вопрос о влиянии этих веществ на физико-химические свойства клеточных
мембран, что также может быть весьма важным показателем их действия. Ведь
как бы ни действовало то или иное лекарственное вещество на организм человека, прямой «мишенью» препарата часто являются мембраны клеток организма. Известны вещества, способные менять жесткость, плотность, фазовое состояние, проницаемость или иные свойства клеточных мембран [1-9]. Имеются
также многочисленные данные и о существенном влиянии состояния липидных
мембран на функционирование находящихся в них белков [5, 10-14], что делает
особенно важной задачу регистрации влияния исследуемых лекарств на физико-химические свойства мембран.
В связи с этим весьма актуальной становится задача поиска удобных и надежных способов оценки действия биологически активных веществ на свойства
клеточных мембран. В качестве одного из таких способов была использована
оценка влияния веществ на проницаемость клеточных мембран для воды, поскольку считается, что эта проницаемость чувствительна к структурным изменениям в мембране [15-20]. Влияние лекарственных препаратов на проницаемость клеточных мембран для воды изучалось хорошо известным методом
ядерной магнитной релаксации (ЯМР) с парамагнитным допингом [16, 21, 22].
Удобство метода определяется еще и удобством получения экспериментально*
Работа поддержана грантом «Ведущая научная школа РФ» и грантами РФФИ.
53
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
го материала и работы с ним; ЯМР-исследования проводили на эритроцитах,
так как это свободно плавающие клетки и их легко получать и очень удобно
использовать для данного типа исследований.
Что касается конкретно исследуемых лекарственных веществ, то большой
интерес с практической и теоретической точки зрения представляют вещества,
способные оказывать длительное ингибирующее воздействие на синаптическую передачу (такого рода воздействие необходимо при некоторых заболеваниях), однако сейчас известно немного таких веществ. Блокаторы ловушечного
типа могут длительное время оставаться в закрытом канале ионотропного рецептора, но только в неактивном синапсе [23, 24]. Длительное воздействие на
ионотропные рецепторы могут оказывать некоторые токсины [25-28], но их
эффект обусловлен необратимостью связывания с рецептором или каналом, что
сильно ограничивает возможности их применения и делает их веществами,
опасными для жизни. Вещества же безопасные и способные при этом оказывать
длительное воздействие на активно работающий синапс до сих пор известны не
были.
Ранее были получены данные о слабообратимом ингибирующем действии
нетоксичного и широко применяемого в клинической практике амфифильного
антисептика хлоргексидина на постсинаптические токи в нервно-мышечном соединении [29]. Предполагают, что механизм действия хлоргексидина двойной –
это блокирование ионного канала и аллостерическая модуляция, конкретный
механизм которой пока не ясен [30]. Известно, что хлоргексидин способен изменять структуру липидной мембраны [31, 32]. Можно предположить, что слабая обратимость эффектов хлоргексидина связана с его способностью растворяться в мембранных липидах, поскольку в этом случае обратный выход из липида в водную фазу будет затруднен. В случае справедливости этой гипотезы
есть основание говорить о существовании малоисследованного пока класса веществ, способных оказывать на клетки пролонгированное воздействие – липидрастворимых модуляторах.
Димефосфон обладает широким спектром действия, в основном он используется как антиацидотическое и вазоактивное средство, нормализующее
функции нервной системы [33]. Как и для хлоргексидина, для димефосфона
существуют данные о его ингибирующем воздействии на холинорецептор мышечного типа [34, 35]. Молекулярные механизмы действия димефосфона подразумевают взаимодействие молекул препарата с компонентами биологической
мембраны (липидным бислоем и белками) и на данный момент остаются не до
конца ясными.
В настоящей работе предпринята попытка зафиксировать влияние двух
лекарственных препаратов – хлоргексидина и димефосфона – на структурнофункциональные свойства клеточной мембраны и выяснить конкретный механизм этого влияния.
Объектом исследования были эритроциты, выделенные из венозной крови
человека. В качестве антикоагулянтов использовались 3.8 % раствор цитрата
54
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
натрия или гепарин в концентрации 50 ед/мл. Свежий образец крови центрифугировался при 2200 g в течение 5 минут, после чего верхний слой плазмы и
лейкоцитарная пленка удалялись. Далее образец промывался 3 раза физиологическим буферным раствором (в ммоль/л: 150 NaCl, 10 глюкозы, 10 HEPES, 5
KCl, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2; рН=7.3) в отношении 1:3 с последующим центрифугированием при 2200 g в течение 5 минут. В контроле к 0.2 мл базовой суспензии
эритроцитов добавлялся 0.1 мл физиологического раствора с парамагнитным
допингом (6.7 ммоль/л MnCl2) и 0.1 мл физиологического раствора. Дополнительно приготавливалась плотная суспензия эритроцитов путем центрифугирования недопированной базовой суспензии клеток при 5700 g в течение 30 минут.
Проводилась серия экспериментов, в которых исследовалось действие
хлоргексидина и димефосфона на водный транспорт в эритроцитах. Препараты
добавлялись в суспензию клеток из растворов определенной концентрации в
физиологическом растворе. Инкубация производилась при комнатной температуре в течение 30 минут. Препарат: 0.2 мл базовой суспензии, 0.1 мл раствора
исследуемого вещества в концентрации в четыре раза больше рабочей, и 0.1 мл
физиологического раствора с парамагнитным допингом. Препарат + блокатор:
0.2 мл базовой суспензии, 0.1 мл раствора исследуемого вещества в концентрации в четыре раза больше рабочей, и 0.1 мл раствора блокатора (4 ммоль/л) в
физиологическом растворе с парамагнитным допингом. Блокатор: 0.2 мл базовой суспензии, 0.1 мл физиологического раствора, и 0.1 мл раствора блокатора
(4 ммоль/л) в физиологическом растворе с парамагнитным допингом.
Эксперименты проводились на ЯМ-релаксометре Proton, с резонансной
частотой для протонов 20 МГц. В дальнейшем, говоря о времени релаксации,
мы будем иметь в виду релаксацию спин-спиновой намагниченности, которая
была исследована в данной работе. Для измерения времен спин-спиновой релаксации использовалась последовательность Карра-Парселла-Мейбума-Гилла
90°x - (τ - 180°y - τ)n. Эксперименты проводились при различных температурах
(20÷37 °С), создаваемых и поддерживаемых с помощью термоблока.
Поскольку внутриклеточная и внеклеточная вода находятся в состоянии
постоянного обмена, то суспензия эритроцитов с точки зрения ЯМР представляет собой двухфазную систему с обменом. ЯМР в двухфазной системе с обменом может быть описана уравнениями Блоха, модифицированными с учетом
обмена. Их общее решение, полученное в работе [36], следующее:
M(t) = Fa 'exp( − t / Ta ') + Fb 'exp( − t / Tb ') ,
(1)
где M(t) – намагниченность, а наблюдаемые «кажущиеся» времена спинспиновой релаксации внутри- и внеклеточной жидкости и их относительные
доли, обозначаемые как Та', Тb', Fa' и Fb' соответственно, связаны с истинными
значениями времен релаксации Тa, Тb и относительных долей Fa, Fb компонент а
и b (внутри- и внеклеточная жидкость) с помощью уравнений:
55
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
2
⎛
⎞
⎛ 1 1 1 1⎞
1 ⎜ 1
1 1 1
4 ⎟
= ⋅
+ + + m ⎜ − + − ⎟ +
,
Ta,b ' 2 ⎜ Ta Tb τa τ b
⎝ Ta Tb τa τ b ⎠ τa ⋅ τ b ⎟
⎝
⎠
(2)
⎛ 1
1 ⎞ 1 1
(Fa − Fb ) ⋅ ⎜ − ⎟ + +
1 1
⎝ Ta Tb ⎠ τa τ b ,
Fa ' = − ⋅
2
2 2 ⎛
1 1 1 1⎞
4
⎜ − + − ⎟ +
⎝ Ta Tb τa τ b ⎠ τa ⋅ τ b
(3)
Fa '+ Fb ' = 1 ,
(4)
τa ⋅ Fb = τ b ⋅ Fa ,
(5)
Fa + Fb = 1 ,
(6)
1
Fa '
Ta '
F '
+ Tb ' =
b
Fa
Ta
F
+ Tb ,
b
(7)
где Тa' и Тb' в (2) различаются знаком перед корнем, τа и τb – средние времена
жизни молекул воды в фазах а и b. В предельном случае отсутствия обмена (τа-1
= τb-1 = 0) намагниченность описывается с помощью уравнения (1), где измеряемые параметры совпадают с истинными.
Наблюдаемое релаксационное затухание в обычной суспензии эритроцитов одноэкспоненциально, так как компоненты кривой «замаскированы» вследствие быстрого (по сравнению с временами релаксации) обмена. Действительно, при условии τa, τb << Tb, Ta релаксация описывается уравнением:
M(t) = exp( − t ⋅ (Fa / Ta + Fb / Tb))
(8)
В этом случае наблюдаемое релаксационное затухание не зависит от скорости обмена и, следовательно, не позволяет определить проницаемость мембраны для воды.
Для получения информации о проницаемости мембраны эритроцитов для
воды использовали метод парамагнитного допинга [21], который заключается в
исследовании ЯМР в системе, в которую искусственно введены парамагнитные
центры. В случае суспензии эритроцитов парамагнитный допинг добавляли во
внеклеточную жидкость, приводя, таким образом, к существенному уменьшению времен ее релаксации. Наиболее широко и давно используемым парамагнитным допингом является MnCl2, который существенно уменьшает времена
релаксации внеклеточной воды за счет наличия неспаренных электронов. При
этом было показано [21], что для MnCl2 выполняется главное условие в выборе
допинга – он не проникает через мембрану клетки, т.е. не влияет на истинные
времена релаксации внутриклеточной жидкости.
Анализ двухэкспоненциального спада намагниченности позволяет определить 3 независимых параметра: Fa', Тb', Та', при этом в (2-7) остается только 3
56
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
независимых уравнения. Однако в уравнения обмена (2-7) входят четыре независимых неизвестных Fa, Тb, Та, τa. Для соответствия числа неизвестных числу
уравнений как минимум один параметр должен быть измерен независимо. На
практике чаще всего измеряют Та, поскольку ошибка измерения этой величины
минимально сказывается на вычисляемых значениях τа, так ошибка в измерении Та в 10% дает ошибку в вычислении τа всего в 3% [37]. Обычно для измерения Та отделяют плазму от эритроцитов и измеряют время релаксации в плотной (гематокрит 95-97 %) суспензии эритроцитов [37, 38]. В этом случае форма
спада поперечной намагниченности является моноэкспоненциальной, так как
основной вклад в намагниченность дают протоны внутриклеточной воды. Для
оценки времени релаксации внутриклеточной жидкости нами была использована плотная суспензия клеток без добавления допинга, дальнейшее центрифугирование которой не приводило к уменьшению времени релаксации.
Далее для вычисления значения среднего времени жизни молекул воды
внутри клетки τа и относительной доли Fа внутриклеточной воды аналитическое
решение системы (2-7) дает следующие выражения:
(A 2 + B2 + 2 ⋅ A ⋅ B ⋅ C)
τa =
,
(9)
(A 2 − B2 ) ⋅ (B + A ⋅ C)
A 2 ⋅ (1 − C2 )
Fa = 2
,
(A + B2 + 2 ⋅ A ⋅ B ⋅ C)
(10)
1 ⎛ 1
1 ⎞
1 1 ⎛ 1
1 ⎞
где A = ⋅ ⎜
−
+
⎟, B = − ⋅⎜
⎟ , C = 1 − 2 ⋅ Fa '.
2 ⎝ Ta ' Tb ' ⎠
Ta 2 ⎝ Ta ' Tb ' ⎠
Среднее время жизни молекул воды внутри клетки τа – параметр, часто
используемый также как характеристика времени обмена воды через мембрану
эритроцита. Известно [39-41], что обмен воды через мембрану осуществляется
с помощью двух механизмов – через белковые водные каналы аквапорины и
дефекты липидного бислоя. Таким образом, исследуемые в эксперименте характеристики водного трансмембранного обмена в эритроцитах обусловлены
вкладами от обмена как через белковые каналы, так и через липидную часть
мембраны. В [40] показано, что в этом случае изменение разности концентраций (ca – cb) «меченой» воды внутри и снаружи клетки во времени для обоих
путей диффузии может быть записано следующим образом:
⎛ 1
d(ca − c b )
1 ⎞
= −s ⋅ Pd ⋅ ⎜ + ⎟ ⋅ (ca − c b ) ,
(11)
dt
⎝ va v b ⎠
где Рd – диффузионная проницаемость, s – площадь поверхности мембраны одного эритроцита, va – объем внутриклеточной воды одного эритроцита, vb – соответствующий объем внеклеточной воды в суспензии клеток. Множитель
⎛ 1
1
1 ⎞
s ⋅ Pd ⋅ ⎜ + ⎟ можно записать как постоянную скорости изменения, или :
τ
⎝ va vb ⎠
57
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
⎛ 1
1
1 ⎞
= s ⋅ Pd ⋅ ⎜ + ⎟ .
τ
⎝ va vb ⎠
(12)
В наших экспериментах по ЯМР с парамагнитным допингом «меткой» для молекул воды служит поперечная намагниченность. За счет наличия парамагнитных ионов во внеклеточной жидкости, значительно увеличивающих скорость
релаксации молекул внеклеточной воды, можно считать, что «меченая» вода
присутствует только внутри клетки. В соответствии с этим можно считать, что
cb = 0 и va << vb, выражение (12) принимает вид:
⎛ 1 ⎞
1
= s ⋅ Pd ⋅ ⎜ ⎟ .
(13)
τ
⎝ va ⎠
Если пренебречь медленной (относительно скорости релаксации внеклеточной
воды) релаксацией внутриклеточной воды и считать, что τ = τа, получим:
1 v
Pd ≈ ⋅ a .
(14)
τa s
Обычно внутриклеточная воды занимает 0.7 от общего объема эритроцита,
остальная часть объема занята гемоглобином. Таким образом, с учетом того,
что средний объем дискоцита в изотонических условиях при комнатной температуре составляет ≈ 90 мкм3, а площадь поверхности s ≈ 160 мкм2 [39], отношение va/s для нормальных эритроцитов будет равно приблизительно 5.5·10-5 см.
С помощью выражения (14) можно анализировать влияние химических
веществ на мембрану эритроцитов. В случае, если препарат увеличивает время
обмена от τа до τа* и не влияет на отношение va/s, то соответствующую величину относительного подавления проницаемости (уменьшение величины Pd до Pd*
в % от исходной величины) можно вычислить с помощью выражения:
⎛ τ ⎞
Pd − Pd*
⋅ 100% = ⎜ 1 − *a ⎟ ⋅ 100% ,
Pd
⎝ τa ⎠
(15)
Для интактных эритроцитов время обмена воды через мембрану τa, относительная доля внутриклеточной воды Fa и диффузионная проницаемость Pd
составили при 30 oC 10.0±1.1 мс, 0.3±0.04 и 3.7±0.5·10-3 см/с (n = 8) соответственно, что находится в согласии с наиболее часто приводимыми в литературе
данными [21, 22, 42, 43].
Были также измерены времена релаксации в суспензиях эритроцитов, полученных из образцов крови, обработанных разными антикоагулянтами – гепарином и цитратом натрия. Различия во временах релаксации и среднем времени
жизни молекул воды внутри клетки обнаружены не были.
Для выявления механизмов взаимодействия лекарственных препаратов с
мембраной были исследованы зависимости параметров, характеризующих
трансмембранный водный обмен в эритроцитах, от концентрации препаратов
во внеклеточной среде. Сравнительные исследования проводились при Т = 25
58
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
o
С. Время обмена воды через мембрану, диффузионная проницаемость и относительное уменьшение проницаемости для эритроцитов, обработанных различными концентрациями хлоргексидина и димефосфона, приведены в таблицах 1
и 2.
Таблица 1.
Концентрационная зависимость эффекта хлоргексидина.
Концентрация
хлоргексидина,
мкмоль/л
τа, мс
Pd* 10-3, см/с
(Pd-Pd* )/Pd, %
1
3
8
17
44
148
10.5
3.56
5±1.3
11.4
3.28
10±1.2
11.6
3.22
14±1.2
11.9
3.14
16±1.5
12.0
3.10
17±1.6
13.0
2.87
23±1.8
Таблица 2.
Концентрационная зависимость эффекта димефосфона.
Концентрация
димефосфона,
72
96
192
384
480
мкмоль/л
τа, мс
10.6
10.8
10.9
11.0
12.0
-3
Pd* 10 , см/с
3.53
3.46
3.43
3.40
3.11
(Pd-Pd* )/Pd, %
6±1.3
7±1.2
8±1.1
9±1.2 17±1.5
В таблицах 1 и 2 n = 3÷8. Для времени обмена воды через
проницаемости даны только средние значения.
672
960
2160
12.2
12.5
12.6
3.06
2.99
2.96
18±2 20±1.8 21±1.9
мембрану и диффузионной
Надо отметить, что даже в насыщающих концентрациях оба вещества ингибируют проницаемость мембраны для воды лишь на 21÷23%, т.е. они способны оказать лишь модулирующий, но не блокирующий эффект. В связи с
этим приведенные в табл. 1 и 2 зависимости эффектов от концентрации веществ аппроксимировали уравнением Хилла вида [44]:
Kn
y( x ) = n
⋅ Δy + y 0 ,
x + Kn
(16)
где y –проницаемость мембраны (см/с); x – концентрация исследуемого вещества (мкмоль/л); n – постоянная Хилла; K – концентрация (мкмоль/л), при которой исследуемое вещество вызывает ингибирующий эффект, равный половине
максимального; Δy – компонент проницаемости мембраны, ингибируемый исследованными веществами; y0 – компонент проницаемости мембраны, не ингибируемый исследованными веществами. Аппроксимация приведенных в таблицах зависимостей уравнением (16) дала значения n = 0.6 и 0.9 и K = 9 мкмоль/л
и 400 мкмоль/л для хлоргексидина и димефосфона соответственно. Отсюда
следует, что взаимодействие обоих веществ с мембраной одностадийно, но
сродство объекта к хлоргексидину существенно выше. Микроскопические наблюдения не выявили изменения объема или формы клеток под действием препаратов, что говорит о том, что увеличение времени обмена связано именно с
уменьшением проницаемости мембраны. В целом можно отметить, что для
достижения одинакового эффекта требуется значительно большая концентрация димефосфона, чем хлоргексидина. Если же учесть, что коэффициент рас59
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
пределения между октанольной и водной фазами равен приблизительно 1 для
димефосфона [35] и 0.037 для хлоргексидина [45], то реальная концентрация
хлоргексидина в мембране при его концентрации в растворе 9 мкмоль/л составляет лишь около 300 нмоль/л.
Для того чтобы выяснить, каким путем идет ингибирование водного
транспорта в эритроцитах, через аквапорины или через липидный бислой, мы
использовали хорошо известный блокатор аквапоринов n-хлормеркурибензол.
Если вещество действует на водный транспорт через аквапорины, то их блокирование приведет к исчезновению эффекта этого вещества, если же вещество
действует на водный транспорт через липидный бислой, то его эффект останется прежним. Сравнительные исследования проводились при Т = 37 oС, т.к. эта
температура наиболее близка к температуре человеческого тела.
Рис. 1. Влияние блокатора аквапоринов на проницаемость мембран эритроцитов для воды
под действием димефосфона. 1 – контроль, 2 – проницаемость в образце с 2 и 20 мкмоль/л димефосфона, 3 – проницаемость в образце с 2 и 20 мкмоль/л димефосфона и 1 ммоль/л РСМВ, 4
– проницаемость в образце с 1 ммоль/л РСМВ.
На рисунке 1 представлен график, на котором показано как влияет димефосфон в концентрациях 2 и 20 мкмоль/л на проницаемость мембран эритроцитов под действием блокатора аквапоринов (в концентрации 1 ммоль/л) и без него. Из данных зависимостей видно, что димефосфон в таких концентрациях
уменьшает проницаемость мембран эритроцитов на 23.2±2.1 и 32.6±0.4 % соответственно. Блокатор аквапоринов сам по себе уменьшает проницаемость мембран эритроцитов на 21.8±1.6 %, а димефосфон на фоне блокатора на 22.2±2.5 и
34.8±3.4 % от достигнутого под действием блокатора уровня. Это означает, что
димефосфон продолжает действовать с обычной эффективностью и на фоне
блокатора, то есть он взаимодействует с липидным бислоем и подавляет транс60
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
порт воды через него.
На рисунке 2 показано, как влияет хлоргексидин в концентрации 150
мкмоль/л на проницаемость мембран эритроцитов под действием блокатора аквапоринов (в концентрации 1 ммоль/л) и без него. Видно, что хлоргексидин на
фоне блокатора достоверно не изменяет проницаемость мембран эритроцитов
для воды. Отсюда можно сделать вывод, что хлоргексидин влияет на белковые
поры, но не влияет на проводимость через липидный бислой.
Рис. 2. Влияние блокатора аквапоринов на проницаемость мембран эритроцитов для
воды под действием хлоргексидина. 1 – контроль, 2 – проницаемость в образце с 150
мкмоль/л хлоргексидина, 3 – проницаемость в образце с 150 мкмоль/л хлоргексидина и 1
ммоль/л РСМВ, 4 – проницаемость в образце с 1 ммоль/л РСМВ.
Таким образом, нами впервые изучено влияние неконкурентных блокаторов холинорецепторов хлоргексидина и димефосфона на транспорт воды в
эритроцитах человека в норме и при предварительном блокировании водных
каналов ртутьорганическими веществами. Это позволило разделить эффекты
влияния препаратов на разные пути диффузии воды – через липидный бислой и
через белковые водные каналы. Проведенное нами исследование позволяет утверждать, что хлоргексидин влияет на транспорт воды через белковые поры,
тогда как димефосфон подавляет проницаемость через липидный бислой.
61
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
Литература
1. Fischer, T. Bending stiffness of lipid bilayers: IV. Interpretation of red cell shape change / T.
Fischer // Biophys. J.- 1993.- V. 65.- P. 687-692.
2. Bazzoni, G. Effects of an amphipathic drug on the rheological properties of the cell membrane /
G. Bazzoni, M. Rasia // Blood Cells Mol. Dis.- 1998.- V. 24.- P. 552-559.
3. Russel, D. Antiseptics and disinfectants: Activity, action, and resistance / D. Russel, G. McDonnell // Clinical microbiology reviews.- 1999.- V. 12.- P. 147-179.
4. Lahajnar, G. Suppression of red cell diffusional permeability by lipophilic solutes / G. Lahajnar,
P. Macek, I. Zupancic // Bioelectrochemistry.- 2000.- V. 52.- P. 179-185.
5. Subczynski, W.K. Physical properties of lipid bilayer membranes: Relevance to membrane biological functions / W. K. Subczynski, A. Wisniewska // Acta Biochim. Pol.- 2000.- V. 47.- P.
613-625.
6. Bazzoni, G. Effect of tetracaine chlorhydrate on the mechanical properties of the erythrocyte
membrane / G. Bazzoni, M. Rasia // Blood Cells Mol. Dis.- 2001.- V. 27.- P. 391-398.
7. Heerklotz, H. Interactions of surfactants with lipid membranes / H. Heerklotz // Q. Rev. Biophys.- 2008.- V. 41.- P. 205-264.
8. Ingolfson, H. Single molecule methods for monitoring changes in bilayer elastic properties / H.
Ingolfson, R. Kapoor, S.A. Collingwood, O.S. Andersen // J. Vis. Exp.- 2008.- V. 21.- pii: 1032.
doi: 10.3791/1032.
9. Barry, J. Determining the effects of lipophilic drugs on membrane structure by solid-state NMR
spectroscopy: The case of the antioxidant curcumin / J. Barry, M. Fritz, J.R. Brender, P.E.
Smith, D.K. Lee, A. Ramamoorthy // J. Am. Chem. Soc.- 2009- V. 131.- P. 4490-4498.
10. Hwang, T.C. Genistein can modulate channel function by a phosphorylation-independent
mechanism: Importance of hydrophobic mismatch and bilayer mechanics / T.C. Hwang, R.E.
Koeppe, O.S. Andersen // Biochemistry.- 2003.- V. 42.- P. 13646-13658.
11. Lundbaek, J.A. Capsaicin regulates voltage-dependent sodium channels by altering lipid bilayer
elasticity / J.A. Lundbaek, P. Birn, S.E. Tape, G.E. Toombes, R. Søgaard, R.E. Koeppe, S.M.
Gruner, A.J. Hansen, O.S. Andersen // Mol. Pharmacol.- 2005.- V. 68.- P. 680-689.
12. Søgaard, R. GABA(A) receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity / R. Søgaard,
T.M. Werge, C. Bertelsen, C. Lundbye, K.L. Madsen, C.H. Nielsen, J.A. Lundbaek //
Biochemistry.- 2006.- V. 45.- P. 13118-13129.
13 McIntosh, T.J. Bilayers as protein solvents: Role of bilayer structure and elastic properties / T.J.
McIntosh, S.A. Simon // J. Gen. Physiol.- 2007.- V. 130.- P. 225-227.
14. Lundbaek, J.A. Lipid bilayer-mediated regulation of ion channel function by amphiphilic drugs /
J.A. Lundbaek // J. Gen. Physiol.- 2008.- V. 131.- P. 421-429.
15. Lande, M.B. The relationship between membrane fluidity and permeabilities to water, solutes,
ammonia, and protons / M.B. Lande, J.M. Donovan, M.L. Zeidel // J. Gen. Physiol.- 1995.- V.
106.- P. 67-84.
16. Huster, D. Water permeability of polyunsaturated lipid membranes measured by 17O NMR / D.
Huster, A.J. Jin, K. Arnold, K. Gawrisch // Biophys. J.- 1997.- V. 73.- P. 855-864.
17. Hill, W.G. Role of leaflet asymmetry in the permeability of model biological membranes to protons, solutes, and gases / W.G. Hill, R.L. Rivers, M.L. Zeidel // J. Gen. Physiol.- 1999.- V. 114.P. 405-414.
18. Koshiyama, K. Structural change in lipid bilayers and water penetration induced by shock
waves: Molecular dynamics simulations / K. Koshiyama, T. Kodama, T. Yano, S. Fujikawa //
Biophys. J.- 2006.- V. 91.- P. 2198-2205.
19. Gensure, R.H. Lipid raft components cholesterol and sphingomyelin increase H+/OH−
permeability of phosphatidylcholine membranes / R.H. Gensure, M.L. Zeidel, W.G. Hill //
Biochem. J.- 2006.- V. 398.- P. 485-495.
62
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
20. Balaz, S. Modeling kinetics of subcellular disposition of chemicals / S. Balaz // Chem. Rev.2009.- V. 109.- P. 1793-1899.
21. Conlon, T. Water permeability of erythrocytes using an NMR technique / T. Conlon, R. Outhred
// Biochim. Biophys. Acta.- 1972.- V. 288.- P. 354-361.
22. Herbst, M. A review of water diffusion measurement by NMR in human red blood cells / M.
Herbst, J. Goldstein // Am. J. Physiol. Cell Physiology.- 1989.-V.256.-P.1097-1104.
23. Blanpied, T.A. Trapping channel block of NMDA-activated responses by amantadine and
memantine / T.A. Blanpied, F.A. Boeckman, E. Aizenman, J.W. Johnson // J. Neurophysiol.1997.- V. 77.- P. 309-323.
24. Giniatullin, R.A. Rapid relief of block by mecamylamine of neuronal nicotinic acetylcholine
receptors of rat chromaffin cells in vitro: an electrophysiological and modeling study / R.A.
Giniatullin, E.M. Sokolova, S. Di Angelantonio, A. Skorinkin, M.V. Talantova, A. Nistri // Mol.
Pharmacol.- 2000.- V. 58.- P. 778-787.
25. Уткин, Ю.Н. Альфа-нейротоксины и альфа-конотоксины – блокаторы никотинового холинорецептора / Ю.Н. Уткин, И.Е. Кашеверов, В.И. Цетлин // Биоорг. Химия.- 1999.- Т.
25.- С. 805-810.
26. Bambrick, L. Neurotoxins in the study of neural regulation of membrane proteins in skeletal
muscle / L. Bambrick, T. Gordon // J. Pharmacol. Toxicol. Methods.- 1994.- V. 32.- P. 129-138.
27. Lewis, R.J. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and
transporters / R.J. Lewis // IUBMB Life.- 2004.- V. 56.- P. 89-93.
28. Tsetlin, V.I. Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental
aspects and medical applications / V.I. Tsetlin, F. Hucho // FEBS Lett.- 2004.- V. 557.- P. 9-13.
29. Соколова, Е.М. Эффекты антисептиков, электрохимически активного раствора хлорида
калия и хлоргексидина, на состояние переферического нервно-мышечного аппарата /
Е.М. Соколова, В.Ф. Чикаев, Р.А. Гиниатуллин, С.И. Агаджанян // Казанский медицинский журнал.- 1997.- Т. 78.- С. 107-110.
30. Шайхутдинова, А.Р. Механизмы модуляции работы рецепторно-канального комплекса
хлоргексидином / А.Р. Шайхутдинова, Е.Е. Никольский, Р.А. Гиниатуллин, А.И. Скоринкин // Доклады академии наук.- 2005.- T. 402.- C. 427-429.
31. Audus, K.L. Chlorhexidine effects on membrane lipid domains of human buccal epithelial cells
/ K.L. Audus, M.R. Tavakoli-Saberi, H. Zheng, E.N. Boyce // J. Dent. Res.- 1992.- V. 71.- P.
1298-1303.
32. Abu-Elteen, K.H. Effect of sub-inhibitory concentration of chlorhexidine on lipid and sterol
composition of shape Candida albicans / K.H. Abu-Elteen, P.A. Whittaker // Mycopathology.1998.- V. 140.- P. 69-76.
33. Зиганшина, Л.Е. Механизмы действия димефосфона / Л.Е. Зиганшина, И.А. Студенцова,
А.У. Зиганшин // Клин. эксп. фарм.- 1992.- Т. 55.- С. 87-95.
34. Пряжников, Е.Г. Механизмы действия димефосфона на синаптическую передачу в нервно-мышечном соединении / Е.Г. Пряжников, А.И. Скоринкин, Р.С. Гараев, Р.А. Гиниатуллин // Нейрофизиология/Neurophysiology.- 2002.- Т. 34.- С. 635-641.
35. Пряжников, Е.Г. Механизмы действия производных 1,1-диметил-3-оксобутилфосфоновой
кислоты на синаптическую передачу в нервно-мышечном соединении / Е.Г. Пряжников,
А.И. Скоринкин, Р.С. Гараев, Р.А. Гиниатуллин, А.О. Визель, Л.И. Щукина // Бюлл. Эксп.
Биол. Мед.- 2005.- Т. 139.- С. 432-435.
36. Hazlewood, C. Nuclear magnetic resonance transverse relaxation times of water protons in
skeletal muscle / C. Hazlewood, D. Chang, B. Nichols, D. Woessner // Biophys. J.- 1974.- V.
14.- P. 583-606.
37. Pirkle, J. Pulse nuclear magnetic resonanse measurement of water exchange across the
erytrocyte membrane employing a low mn concentration / J. Pirkle, D. Ashley, J. Goldstein //
Biophys. J.- 1979.- V. 25.- P. 389-406.
63
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г
THE INVESTIGATION OF ACTION’S MECHANISMS OF
CHLORHEXIDINE AND DIMEPHOSPHONE ON ERYTHROCYTE
MEMBRANE’S WATER PERMEABILITY
O.S. Druginina, A.I. Skorinkin
Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics KSC RAS, 420111, Kazan, Lobachevskogo str., 2/31
Kazan State University, 420008, Kazan, Kremliovskaja str., 18
E-mail: [email protected]
The method of a nuclear magnetic relaxation in the presence of paramagnetic centers has been applied to studying of the action of drugs chlorhexidine and dimephosphone on the water permeability
of erythrocyte's membrane. It was shown that both investigated substances dose-dependent suppress
water permeability at that chlorhexidine acts on aquaporines and dimephosphone acts direct on lipid
bilayer.
Keywords: NMR, medicinal agents, physicochemical properties of cellular membranes
Сведения об авторах
№№
1
Ф.И.О.
Дружинина Ольга
Сергеевна
Должность и место работы
Аспирант, Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН
Телефон рабочий
E-mail
420111, Казань, ул.
Лобачевского, д.
2/31,
2-319-032,
[email protected]
2.
Скоринкин Андрей
Иванович
д.ф.-м.н., доцент, КГУ им. В.И. Улья- 420008, Казань, ул.
нова-Ленина; в.н.с., КИББ КазНЦ РАН Кремлевская, д. 18,
420111, Казань, ул.
Лобачевского, д.
2/31, (843) 2319032
(р), 5428075 (д),
факс 2927347, email: [email protected].
64