экспрессия эпиаллелей генов oct4 и nanog, ответственных за
реклама
На правах рукописи БАТТУЛИН НАРИМАН РАШИТОВИЧ ЭКСПРЕССИЯ ЭПИАЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ OCT4 И NANOG, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА ПОДДЕРЖАНИЕ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ, И ТКАНЕСПЕЦИФИЧНЫХ ГЕНОВ В МЕЖВИДОВЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТКАХ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 1 Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Серов О.Л. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Дымшиц Г.М. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск доктор биологических наук, Лебедев И.Н. НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН, г. Москва Защита диссертации состоится 7 апреля 2010 года на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090, тел/факс: (383)3331278, e-mail: [email protected] С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан «_____» ___________ 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Восстановление плюрипотентности в дифференцированных клетках и связанные с ним процессы репрограммирования генома являются одними из актуальных проблем современной биологии. Исследования, посвященные данной проблеме, помимо прикладных аспектов, таких как получение иммуносовместимых клеток для трансплантологического лечения различных заболеваний, тесно связаны с другими фундаментальными проблемами биологии (регуляция дифференциальной активности генов, регуляция процессов индивидуального развития и др.). В нормальном развитии эмбриональные клетки при дифференцировке теряют свой изначальный высокий потенциал - плюрипотентность, в результате чего специализированные клетки лишены способности к превращению в другие типы клеток. Долгое время считалось, что утрата плюрипотентности необратима, однако, в опытах на амфибиях и млекопитающих было показано, что ядра дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, после пересадки в энуклеированные ооциты способны обеспечить полное развитие организма (Di Berardino, Orr, 1992; Wilmut et al., 1997). Эти данные показали, что ядра некоторых дифференцированных клеток могут быть репрограммированны цитоплазматическими факторами ооцита. На сегодняшний день, помимо метода переноса ядер, существует еще два метода репрограммирования клеток взрослого организма. Это метод слияния эмбриональных стволовых (ЭС) и дифференцированных клеток (Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2003; Cowan et al., 2005) и метод получения индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток, основанный на эктопической экспрессии небольшого числа транскрипционных факторов в культуре соматических клеток (Takahashi, Yamanaka, 2006; Wernig et al., 2007). Каждый из методов экспериментального репрограммирования клеток имеет свои преимущества и ограничения. Исследование молекулярных механизмов репрограммирования в гибридных клетках предоставляет более широкие возможности, нежели метод переноса ядер в энуклеированные ооциты, поскольку имеется возможность собрать достаточное для анализа количество материала. В отличие от получения ИПС клеток, ЭС клетки при слиянии содержат все необходимые для правильного репрограммирования факторы, в том числе и неидентифицированные. Однако после объединения геномов родительских клеток в ядре гибридной клетки, становится сложно следить за изменениями генной активности и эпигенетических модификаций геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток. Попытка использовать ЭС клетки для репрограммирования генома дифференцированных клеток была впервые предпринята в 1996 году. С этой целью плюрипотентные ЭС клетки мыши были слиты со спленоцитами, клетками селезенки, взрослого животного. Полученные в этом эксперименте клеточные гибриды обладали плюрипотентными свойствами, сопоставимыми со свойствами ЭС клеток (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998). Позднее эти данные получили подтверждение при анализе гибридов, полученных от слияния ЭС клеток с тимоцитами (Tada et al., 2001; Tada et al., 2003), незрелыми клетками-предшественниками гемопоэза (Terada et al., 2002) и нейрогенеза (Ying 3 et al., 2002). При слиянии ЭС клеток человека с фибробластами человека, также отмечается высокий уровень плюрипотентности гибридных клеток, сходный с потенциалом родительских ЭС клеток (Cowan et al., 2005). Высокий потенциал эмбриональных стволовых гибридных клеток подразумевает доминирование плюрипотентности - ключевого свойства ЭС клеток. Тот факт, что в гибридах типа ЭС клетка – дифференцированная клетка проявляются лишь свойства плюрипотентного партнера, предполагает репрограммирование генома соматического партнера. Однако прямых доказательств этого на сегодняшний день не так много. Свидетельства репрограммирования эпиаллелей соматического партнера (эпиаллелями называются аллели, дифференциальная активность которых обусловлена различием эпигенетических модификаций, приобретенных в процессе индивидуального развития) были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭС клеток Mus musculus domesticus и тимоцитов M. musculus molossinus (Tada et al., 2001; Tada et al., 2003; Hatano et al., 2005). В исследованиях последних лет были определены транскрипционные факторы, ответственные за поддержание плюрипотентности ЭС клеток и клеток ранних эмбрионов млекопитающих. В настоящее время считается, что ключевыми звеньями сложной генной сети, регулирующей плюрипотентный статус, являются гены Oct4, Nanog и Sox2 (Chambers, Smith, 2004). Показано, что эти гены играют важную роль и в процессах репрограммирования соматических клеток (Takahashi, Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007). Поэтому большое внимание уделяется изучению процессов, сопровождающих реактивацию «генов плюрипотентности», таких как Oct4 и Nanog, при репрограммировании геномов дифференцированных клеток. Важная роль в регуляции активности этих генов отводится эпигенетическим модификациям генома, таким как метилирование ДНК и модификации гистонов. Необходимым условием репрограммирования генома является не только активация «генов плюрипотентности», но также и подавление активности тканеспецифичных генов, активных в дифференцированных клетках. К такой категории генов, экспрессия которых характерна для всех типов дифференцированных клеток, относится ген белка ядерной ламины - lamin A/C (Lmna) (Constantinescu et al., 2006). На сегодняшний день не опубликовано работ, в которых исследовалась бы экспрессия этого гена в процессе репрограммирования дифференцированных клеток. В связи с необходимостью различать аллели родительских геномов при исследовании процессов репрограммирования, особый интерес представляют межвидовые гибридные клетки. В лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН были получены межвидовые гибриды от слияния плюрипотентных ЭС клеток Mus musculus и спленоцитов близкого вида мыши M. caroli. Полученные клоны гибридных клеток, кариотип которых детально описан (Matveeva et al., 2005; Пристяжнюк и др., 2005), имеют фенотип и ростовые характеристики, сходные с ЭС клетками. Межвидовая вариабельность гомологичных последовательностей ДНК позволяет надежно различать аллели плюрипотентного и соматического партнеров в гибридных клетках. Благодаря этому появилась возможность изучения молекулярных механизмов 4 репрограммирования генома соматической клетки и интерпретации полученных данных с учетом хромосомного состава гибридных клеток и присутствием хромосом соматического партнера. Цели и задачи исследования. Цель работы заключалась в оценке репрограммирования генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, а также гена Lmna, экспрессия которого характерна для всех типов дифференцированных клеток, в межвидовых гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток Mus musculus и спленоцитов Mus caroli. А также в оценке репрограммирования тканеспецифичных генов при дифференцировке гибридных клеток в составе химерного животного. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Определить первичную структуру фрагментов генов Oct4 и Nanog M. caroli и провести поиск видоспецифичных сайтов узнавания рестриктаз, позволяющих различать видовую принадлежность транскриптов этих генов в гибридных клетках. 2. Исследовать экспрессию эпиаллелей генов Oct4, Nanog спленоцита в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках. 3. Определить первичную структуру 5'-регуляторных областей генов Oct4, Nanog и Lmna M. caroli. 4. Провести сравнительный анализ метилирования 5'-регуляторных областей эпиаллелей генов Oct4, Nanog и Lmna в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках. 5. Провести сравнительный анализ метилирования 5'-регуляторной области эпиаллелей гена Oct4 при дифференцировке эмбриональных стволовых гибридных клеток в условиях in vivo (формирование тератом). 6. Оценить экспрессию тканеспецифичных генов с аллелей соматического партнера в тканях химер, полученных введением эмбриональных стволовых гибридных клеток в бластоцисты мышей линии C57BL. Научная новизна. 1. В работе впервые проведено детальное исследование уровня метилирования 5'-регуляторных областей родительских аллелей генов Oct4 и Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках. Показано, что реактивация эпиаллелей соматического партнера генов Oct4 и Nanog сопровождается деметилированием их 5'-регуляторных областей. 2. Впервые исследовано метилирование 5'-регуляторной области гена Oct4 в тератомах, развившихся из эмбриональных стволовых гибридных клеток. Показано, что диффернцировка гибридных клеток сопровождается гиперметилированием 5'-регуляторной области гена Oct4, уровни метилирования родительских аллелей не различаются. 3. Получены новые данные о метилировании 5'-регуляторной области гена Lmna в ЭС клетках и фибробластах мыши. Показано, что метилирование района от -300 п.н. до -94 п.н. гена Lmna (относительно первого кодона) поддерживается на одном уровне вне зависимости от того, находится ли ген в активном или репрессированном состоянии. 5 4. В работе впервые проведена оценка экспрессии тканеспецифичных генов соматического партнера в тканях химер, полученных введением эмбриональных стволовых гибридных клеток в бластоцисты мышей. Показано, что репрограммированные гены соматического партнера экспрессируются тканеспецифичным образом в органах химерного животного. Положения, выносимые на защиту. В клонах гибридных клеток, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток M. musculus со спленоцитами M. caroli, происходит репрограммирование генов Oct4 и Nanog, признаками которого являются реактивация эпиаллелей спленоцита генов Oct4 и Nanog и деметилирование их 5'-регуляторных областей. Дифференцировка гибридных клеток в тератомах сопровождается гиперметилированием 5'-регуляторной области гена Oct4, причем уровни метилирования эпиаллелей спленоцита и ЭС клетки не имеют существенных различий. Репрограммирование гена Lmna в гибридных клетках сопровождается подавляением экспрессии эпиаллеля Lmna спленоцита, причем это подавление не связано с изменением метилирования 5’-регуляторной области гена Lmna. Эпиаллель гена Des спленоцита экспрессируется тканеспецифичным образом в тонком кишечнике химерной мыши, полученной введением гибридных клеток клона HMC29-3 в бластоцисты мышей линии C57BL. Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют наши знания о процессах репрограммирования и используются при чтении курса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете. Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 2007 г.), на международной конференции 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine and Stem Cells (Фошань, Китай, 2008 г.), на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009 г.). По теме диссертации опубликованы 3 работы. Две – в рецензируемых зарубежных журналах и одна – в рецензируемом отечественном журнале. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 103-х страницах, иллюстрирована 18-ю рисунками и содержит 4 таблицы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовались: - ЭС клетки линии НМ-1, любезно предоставленные доктором Мелтоном, Великобритания. - Двадцать независимых межвидовых гибридных клонов серии НМС, полученных от слияния клеток линии НМ-1 мыши M. musculus и спленоцитов M. caroli (Серов и др., 2003). Серия гибридных клеток была получена Н.М. Матвеевой в лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН. 6 Суммарную РНК, а также ДНК из клеточных культур выделяли с использованием TRIzol Reagent (Life Technology, США), согласно рекомендациям производителя. Для очистки образцов РНК выделенных с помощью Trizol Reagent от контаминаций ДНК использовали набор реагентов TURBO DNA-free (Ambion). РНК из органов химерных мышей (печень, почка, легкое, сердце, икроножная мышца, мозг, тонкий кишечник) выделяли с использованием SV Total RNA Isolation System (Promega, США). Для синтеза кДНК использовали набор реактивов Reverse Transcription System (Promega, США). Определение нуклеотидной последовательности проводили согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation). Образцы анализировали в Центре Коллективного Пользования «Секвенирование ДНК» СО РАН. Для бисульфитной обработки геномной ДНК использовался набор реактивов EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN). Для наработки продукта ПЦР при использовании в качестве матрицы модифицированной бисульфитной обработкой ДНК применяли метод ПЦР с вложенными праймерами (NestedPCR). Для субклонирования продуктов Nested-PCR использовался набор реактивов pGEM-T Easy Vector System (Promega, США). После трансформации клеток E. coli, клонированные фрагменты индивидуальных клонов амплифицировали в ПЦР и затем секвенировали. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Экспрессия генов – молекулярных маркеров плюрипотентности Oct4 и Nanog в гибридных клетках Транскрипционные факторы Oct4 и Nanog являются ключевыми элементами системы регуляции плюрипотентного статуса клеток. Поэтому важной характеристикой любой культуры плюрипотентных клеток является активность генов Oct4 и Nanog. В данной работе методом ОТ-ПЦР мы исследовали экспрессию генов Oct4 и Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках серии HMC (рис. 1). Было показано, что все 20 клонов серии НМС позитивны по экспрессии Oct4 и Nanog (Vasilkova et al., 2007; Battulin et al., 2009). В качестве внутреннего контроля ОТ-ПЦР использовалась экспрессия гена «домашнего хозяйства» бета-актина (Actb). Экспрессия молекулярного маркера дифференцированных клеток гена Lmna в гибридных клетках Эмбриональные стволовые гибридные клетки образуются при слиянии ЭС и дифференцированных клеток. Каждый из исходных клеточных типов имеет свою генетическую программу, свой неповторимый профиль генной экспрессии. В качестве маркера плюрипотентного состояния ЭС клеток традиционно используется активность генов Oct4 и Nanog, тогда как до последнего времени не было общепринятого генетического маркера дифференцированного состояния клеток. В 2006 году в качестве такого маркера было предложено использовать активность гена Lmna (Constantinescu et al., 2006). Этот ген неактивен в плюрипотентных клетках, таких как ЭС клетки, но экспрессируется в 7 дифференцированных клетках, например, в фибробластах и спленоцитах (рис. 1). С помощью метода ОТ-ПЦР мы исследовали активность гена Lmna в гибридных клетках серии HMC. Проведенный анализ показал, что уровень экспрессии Lmna в гибридных клетках сопоставим с уровнем экспрессии в ЭС клетках и значительно снижен, по сравнению с таковым в дифференцированных клетках - фибробластах и спленоцитах (рис. 1). Рис. 1. Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии генов Oct4, Nanog, Lmna и Actb в ЭС клетках НМ-1 (ЭС), эмбриональных фибробластах (ЭФ), спленоцитах (С) и гибридных клонах серии НМС (числами указаны номера клонов). Поиск аллель-специфичных сайтов рестрикции для идентификации транскриптов разного родительского происхождения Для исследования профиля активности генов в гибридных клетках были выбраны гены, экспрессирующиеся в родительских клетках альтернативным образом. Oct4 и Nanog активны в ЭС клетках, а в спленоцитах нет, ген Lmna активен в спленоцитах, а в ЭС неактивен (рис. 1). Однако результаты ОТ-ПЦР анализа, приведенные выше, не позволяют ответить на важный вопрос: участвует ли геном спленоцита в экспрессии «генов плюрипотентности» или, иными словами, репрограммируется ли геном дифференцированной клетки при образовании гибридных клеток? Для ответа на этот вопрос необходимо надежно различать транскрипты генов ЭС клетки и спленоцита в гибридных клетках. Для идентификации транскриптов родительских аллелей генов Oct4 и Nanog был использован рестрикционный полиморфизм между аллелями родительских видов. Для поиска аллель-специфичных сайтов была определена первичная структура фрагментов генов Oct4 и Nanog M. caroli. При сравнении с гомологичными последовательностями M. musculus были выявлены видоспецифичные сайты рестрикции. Таким образом, найденные аллельспецифичные различия родительских аллелей Oct4 и Nanog позволили нам надежно дискриминировать транскрипты спленоцита (M. caroli) и ЭС клетки (M. musculus), поскольку после обработки продуктов ОТ-ПЦР соответствующей рестриктазой аллели легко различить по разной подвижности при электрофорезе. Тем самым можно сравнить экспрессию «плюрипотентного» и «дифференцированного» аллелей в гибридных клетках. Нуклеотидные последовательности участков генов M. caroli зарегистрированы в GenBank (табл. 1). 8 Таблица 1. Нуклеотидные зарегистрированые в GenBank. Район фрагмент Oct4 M. caroli фрагмент Nanog M. caroli фрагмент Lmna M. caroli GenBank № DQ250732 DQ250731 DQ218139 последовательности M. caroli Район 5' область гена Oct4 M. caroli 5' область гена Nanog M. caroli 5' область гена Lmna M. caroli GenBank № EF166066 EF166065 EF166064 Экспрессия родительских аллелей гена Oct4 и Nanog в гибридных клетках Проведенный ОТ-ПЦР ПДРФ (полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов) анализ показал, что во всех 13 клонах гибридных клеток серии HMC, содержащих хромосому 17 M. caroli (в этой хромосоме локализуется ген Oct4), активны как аллель ЭС клетки, так и аллель спленоцита (рис. 2). Таким образом, показано, что в эмбриональных гибридных клетках ген Oct4 спленоцита, ранее не активный, реактивируется, а активность данного гена ЭС клетки сохраняется. Рис. 2. Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии аллелей M. caroli и M. musculus гена Oct4 в гибридных клетках серии НМС и ЭС клетках НМ-1 (ЭС). Присутствие фрагмента размером 313 п.н. соответствует транскрипту аллеля M. musculus, а 254 п.н. - аллеля M. caroli. Клон HMC15 не содержит хромосому 17 M. caroli и потому транскрипт Oct4 M. caroli в нем не выявляется. Аналогичные результаты были получены при ОТ-ПЦР ПДРФ анализе экспрессии гена Nanog в гибридных клетках серии HMC (рис. 3). Аллель гена Nanog спленоцита был активен во всех 13 клонах, содержащих хромосому 6 M. caroli (в этой хромосоме локализуется ген Nanog), что свидетельствует о реактивации гена Nanog спленоцита в гибридных клетках. Тогда как экспрессия аллеля гена Nanog ЭС клетки при образовании гибридных клеток не изменяется, поскольку этот аллель был активен в родительской линии ЭС клеток и остается активным в гибридных клетках (рис. 3). Рис. 3. Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии аллелей M. caroli и M. musculus гена Nanog в гибридных клетках серии НМС и ЭС клетках НМ-1 (ЭС). Присутствие фрагмента размером 101 п.н. соответствует транскрипту аллеля M. musculus, а 148 п.н. - аллеля M. caroli. В клоне НМС15 не выявлены транскрипты аллеля M. caroli, поскольку в нем отсутствует хромосома 6 M. caroli. 9 Определение последовательности 5’-регуляторных областей генов Oct4, Nanog и Lmna M. caroli Для того чтобы исследовать эпигенетические изменения сопровождающие реактивацию генов Oct4 и Nanog при репрограммировании, мы оценивали метилирование 5’-регуляторных областей этих генов в гибридных клетках. Широкомасштабное секвенирование генома M. caroli не проводилось, в отличие от генома M. musculus, и потому при анализе метилирования нам было необходимо определить последовательности интересующих нас районов. Последовательности определяли путем амплификации при помощи ПЦР с последующим секвенированием. По результатам анализа удалось определить последовательности размером 333 п.н. гена Nanog, 575 п.н. гена Oct4 и 453 п.н. гена Lmna M. caroli. Нуклеотидные последовательности были зарегистрированы в GenBank (табл. 1). В результате выравнивания полученных последовательностей с гомологичными последовательностями M. musculus при помощи программы DNA assist 1.0 удалось локализовать участки 5’-регуляторной области генов M. caroli относительно предполагаемого старта трансляции: (-324;+4) для гена Nanog, (-631;-27) для гена Oct4, (-495;+42) для гена Lmna. В результате выравнивания последовательностей удалось выявить межвидовые различия и участки гомологии, которые использовались в дальнейшем для подбора праймеров для метода бисульфитного секвенирования. Анализ профилей метилирования 5’-регуляторной области гена Oct4 в ЭС клетках и спленоцитах Уровень метилирования ДНК исследовали методом бисульфитного секвенирования (Clark et al., 1994). Из множества существующих методик оценки метилирования ДНК метод бисульфитного секвенирования был выбран потому, что это единственная методика, позволяющая количественно оценить метилирование нескольких аллелей, одновременно присутствующих в образце. Кроме того, в отличие от других методик результатом исследования является не просто усредненный процент метилирования конкретного CpG динуклеотида в образце, но набор профилей метилирования протяженного участка ДНК, отображающий всѐ разнообразие вариантов его метилированиия существующих в образце. За все эти преимущества бисульфитное секвенирование часто образно называют «золотым стандартом» исследований метилирования ДНК. Результаты анализа профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в родительских клетках: ЭС клетках линии HM-1 M. musculus и спленоцитах M. caroli, представлены на рисунке 4. Было показано, что 12 CpG дуплетов (от -470 п.н. до -110 п.н., относительно старта трансляции) в ЭС клетках гипометилированы (1±1% из анализированных CpG дуплетов были метилированы) (рис. 4). В спленоцитах M. caroli наблюдалась противоположная ситуация, 11 CpG дуплетов (от -458 п.н. до -111 п.н., относительно старта трансляции) в 5’ области гена Oct4 были гиперметилированы, то есть 83±3% из анализированных CpG дуплетов были метилированы (рис. 4). Поскольку ген Oct4 активен в ЭС клетках и неактивен в дифференцированных клетках, то полученный результат подтверждает связь между метилированием выбранного участка 5'-регуляторной области и активностью гена. 10 Рис. 4. Анализ 5’-регуляторной области гена Oct4. А – схема 5’-регуляторной области гена Oct4. Изогнутой стрелкой отмечена позиция старта транскрипции, указаны позиции CpG дуплетов (обозначены кружками) относительно старта трансляции. Б – результаты анализа метилирования 5’-регуляторной области Oct4 в ЭС клетках и спленоцитах, в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка. Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными – метилированные. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в эмбриональных стволовых гибридных клетках Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 анализировались в клонах гибридных клеток HMC1, HMC2, HMC6, HMC21 и HMC28 (рис. 5), HMC29 и HMC56 (рис. 6). Поскольку последовательность 5’области гена Oct4 у M. musculus и M. caroli имеет различия (рис. 4А), метод бисульфитного секвенирования позволяет раздельно исследовать метилирование аллелей родительских видов. Было показано, что во всех анализированных клонах уровень метилирования эпиаллелей 5’-регуляторной области Oct4 ЭС клеток и спленоцитов не отличается. В тоже время, уровень метилирования 5’-регуляторной области Oct4 в разных клонах меняется от полностью деметилированного (0%) в клоне HMC2, до частично метилированного (примерно 25%) в клоне HMC6. Таким образом, было показано, что в исследованных клонах гибридных клеток уровень метилирования эпиаллелей 5’-регуляторной области Oct4 существенно не отличается, и соответствует уровню метилирования в ЭС клетках, в тоже время отличается от такового в спленоцитах. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в тератомах, полученных из эмбриональных стволовых гибридных клеток Выше не раз подчеркивалось, что реактивация «генов плюрипотентности» - это важный этап процесса репрограммирования и получения плюрипотентных клеток. Однако по определению, плюрипотентными называются клетки, способные дифференцироваться во все типы клеток взрослого организма. Поэтому не менее важным является и процесс подавления активности «генов плюрипотентности», таких как Oct4, при дифференцировке клеток. Известно, что экспрессия гена Oct4 препятствует дифференцировке клеток (Niwa et al., 11 2000), более того, его эктопическая экспрессия в клетках взрослого организма может быть связана с опухолевым перерождением клеток (Monk, Holding, 2001). Поэтому мы исследовали изменение активности гена Oct4 и метилирование его 5’-регуляторной области при индуцированной in vivo дифференцировке гибридных клеток. Рис. 5. Профили метилирования 5’-регуляторной области гена Oct4 в клонах эмбриональных стволовых гибридных клеток HMC1, HMC2, HMC6, HMC21 и HMC28; в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка (для аллелей ЭС клетки, для аллелей спленоцита). Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными – метилированные. Для каждого клона отмечены аллели ЭС клеток (M. musculus) и спленоцита (M. caroli). На рис. 6 представлены результаты анализа уровня метилирования 5’-регуляторной области гена Oct4 в двух тератомах, полученных подкожным введением клеток клонов HMC29 и HMC56 иммунодефицитным мышам nude. Полученные результаты говорят том, что процесс дифференцировки гибридных клеток in vivo сопровождается гиперметилированием 5’-регуляторной области гена Oct4. Важно отметить, что уровень метилирования эпиаллелей существенно не отличается, то есть гиперметилирование затрагивает как аллель «плюрипотентного», так и реактивированного «соматического» аллеля (рис. 6). 12 Рис. 6. Профили метилирования 5’-регуляторной области гена Oct4 в клонах эмбриональных стволовых гибридных клеток HMC56 и HMC29, а также тератомах полученных из этих клонов; в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка (для аллелей ЭС клетки, для аллелей спленоцита). Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными – метилированные. Для каждого клона отмечены аллели ЭС клеток (M. musculus) и спленоцита (M. caroli). Анализ профилей метилирования 5’-регуляторной области гена Nanog в ЭС клетках и спленоцитах Анализ метилирования пяти CpG дуплетов (от -301 п.н. до -142 п.н., относительно старта трансляции, рис. 7) 5'-регуляторной области гена Nanog в ЭС клетках M. musculus показал, что все они неметилированны. Уровень метилирования гомологичного района (от -306 п.н. до -142 п.н., относительно старта трансляции) в спленоцитах M. caroli составил 24±5%. Также для сравнения был определен уровень метилирования указанного района в другом типе дифференцированных клеток — фибробластах M. musculus, уровень метилирования в них составил 69±6% (рис. 7). Таким образом, хотя уровень метилирования 5’-регуляторной области Nanog выше в клетках, в которых ген Nanog неактивен (спленоциты и фибробласты), не наблюдается четкой связи между его активностью и метилированием выбранного участка гена. Это хорошо видно из рисунка 7, примерно половина анализированных аллелей в спленоцитах неметилирована, несмотря на то, что ген Nanog в этих клетках не экспрессируется. 13 Рис. 7. Анализ метилирования 5’-регуляторной области гена Nanog. А – схема 5’-регуляторной области гена Nanog. Изогнутой стрелкой отмечена позиция старта транскрипции, указаны позиции CpG дуплетов (обозначены кружками) относительно старта трансляции. Б – результаты анализа метилирования 5’-регуляторной области Nanog в ЭС клетках, фибробластах и спленоцитах; в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка. Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными – метилированные. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках На рисунке 8 представлены результаты анализа метилирования 5’-регуляторной области гена Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках HMC1, HMC2, HMC6, HMC21 и HMC28. Установлено, что уровень метилирования эпиаллелей Nanog не отличается во всех исследованных гибридных клетках. Кроме того, за исключением клона HMC6 уровень метилирования 5’-регуляторной области Nanog в гибридных клетках сопоставим с уровнем метилирования 5’ области гена Nanog в ЭС клетках, но не спленоцитах. Анализ профилей метилирования 5’-регуляторной области гена Lmna в ЭС клетках, фибробластах и эмбриональных стволовых гибридных клетках 5’-регуляторная область гена Lmna мало изучена и, на сегодняшний день, нет данных о влиянии метилирования этого участка на экспрессию гена. Для анализа метилирования был выбран участок 5’ области от -495 п.н. до +42 гена Lmna, прилежащий к старту трансляции. Проведенное бисульфитное секвенирование выбранного участка показало, что данный район неметилирован как в ЭС клетках, так и в дифференцированных клетках (рис. 9). Сходные результаты были получены при исследовании гибридных клонов HMC1 и HMC2 (рис. 9). Полученные данные свидетельствуют о том, что метилирование данного участка 5’-регуляторной области гена Lmna в анализированных типах клеток не отражает его активность. То есть неактивное состояние гена в плюрипотентных клетках закрепляется какими-то иными эпигенетическими механизмами, не 14 связанными с метилированием выбранного участка 5’-регуляторной области гена Lmna. Рис. 8. Профили метилирования промоторной области гена Nanog в клонах эмбриональных стволовых гибридных клеток HMC1, HMC2, HMC6, HMC21 и HMC28; в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка (для аллелей ЭС клетки, для аллелей спленоцита). Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными – метилированные. Для каждого клона отмечены аллели ЭС клеток (M. musculus) и спленоцита (M. caorli). Экспрессия тканеспецифичных генов соматического партнера в тканях взрослых химер Для того чтобы оценить потенциал репрограммированного генома, мы попытались ответить на вопрос участвует ли репрограммированный геном соматического партнера в экспрессии тканеспецифичных генов в тканях взрослых химер. Химерные животные были получены Кизиловой Е.А. путем введения клеток клона HMC29 в полость реципиентной бластоцисты линии С57BL. Для проведения такого анализа из базы данных BioGPS (http://biogps.gnf.org) были выбраны гены, экспрессирующиеся преимущественно в одном органе или ткани: Alb (активен в печени), Bdh2 (в почках), Ager (в легком), Des (в мышечной ткани), Nefh (в нейронах) и Cdx2 (в тонком 15 кишечнике). После отбора генов-кандидатов были подобраны праймеры для амплификации фрагментов этих генов. Далее была определена первичная структура амплифицированных фрагментов этих генов у M. caroli. Рис. 9. Анализ метилирования 5’-регуляторной области гена Lmna. А – схема 5’-регуляторной области гена Lmna. Изогнутой стрелкой отмечена позиция старта транскрипции, указаны позиции CpG дуплетов (обозначены кружками) относительно старта трансляции. Б – результаты анализа метилирования промотора Lmna в ЭС клетках, фибробластах и гибридных клонах HMC1 и HMC2; в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка. Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными – метилированные. На рисунке 10 представлены результаты ОТ-ПЦР анализа генов Alb, Bdh2, Ager, Des, Nefh и Cdx2 у химерного животного № 6-17 в печени, почке, легком, икроножной мышце, мозге и тонком кишечнике. Видно, что каждый ген преимущественно активен в одном из органов, а Des экспрессируется в поперечнополосатой мускулатуре икроножной мышцы и гладкой мускулатуре кишечника. Для того, чтобы определить участвует ли геном соматического партнера в экспрессии тканеспецифичных генов в тканях химер, была определена первичная структура амплифицированных фрагментов генов Alb, Bdh2, Ager, Des, Nefh и Cdx2, представленных на рисунке 10. Однако на полученных секвенограммах не было обнаружено транскриптов, характерных 16 для соответствующих генов M. caroli. Чувствительность этого метода оценивается примерно в 30%, то есть с его помощью можно обнаружить минорную последовательность в образце, содержащем две аллельные последовательности, если ее концентрация не меньше 30% от доминирующей последовательности. Рис. 10. Результаты ОТ-ПЦР анализа генов Alb, Bdh2, Ager, Des, Nefh, Cdx2 и Actb в органах химерной мыши №617, полученной введением клеток субклона HMC29-3 в полость бластоцисты; Пе – печень, По – почка, Л – легкое, Мы – мышца, Мо – мозг, К – кишка. Чувствительность метода ПЦР-ПДРФ выше и оценивается примерно в 110%, потому было принято решение применить его для дискриминации транскриптов родительских аллелей генов Alb, Bdh2, Ager, Des, Nefh, Cdx2 и Actb у химерных животных. Для того чтобы сформировать видоспецифичные сайты рестрикции для генов Alb и Bdh2, были подобраны праймеры с введением одного некомплементарного основания. Мы не обнаружили транскрипты генов Alb и Bdh2 M. caroli в печени и почке химеры №6-17. Для того чтобы применить метод ПЦР с видоспецифичными праймерами, были выбраны гены Des и Nefh, поскольку из генов, выбранных для данного исследования, последовательности именно этих генов имеют наибольшие различия у M. musculus и M. caroli. ОТ-ПЦР анализ гена Nefh в головном мозге и гена Des в икроножной мышце и кишечнике у химеры №6-17 показал, что в головном мозге отсутствуют транскрипты специфичные для Nefh M. caroli, тогда как с использованием видоспецифичных праймеров на ген Des удалось добиться амплификации в образцах икроножной мышце и кишечнике химеры №6-17. Амплифицированные фрагменты были отсеквенированы, показано, что данный фрагмент гена Des является транскриптом M. caroli. Таким образом, было показано, что тканеспецифический ген Des M. caroli активируется при дифференцировке гибридных клеток в кишечнике химер. ВЫВОДЫ 1. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в межвидовых гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток M. musculus и спленоцитов M. caroli, показал, что эпиаллели генов Oct4 и Nanog спленоцита реактивируются, что является одним из признаков процесса репрограммирования генома спленоцита. 2. Реактивация эпиаллелей генов Oct4 и Nanog спленоцита в эмбриональных стволовых гибридных клетках сопровождается деметилированием 5’-регуляторной области этих генов до уровня, характерного для 17 5’-регуляторной области Oct4 и Nanog в ЭС клетках. Полученные данные свидетельствуют о том, что репрограммирование генома дифференцированной клетки сопровождается изменением эпигенетического статуса генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности. 3. При дифференцировке эмбриональных стволовых гибридных клеток в тератомах, образовавшихся в местах введения гибридных клеток иммунодефицитным мышам, происходит гиперметилирование 5’-регуляторной области гена Oct4, причем уровни метилирования эпиаллелей спленоцита и ЭС клетки не имели существенных различий. 4. Исследование экспрессии гена Lmna, а также уровня метилирования его 5’-регуляторной области в ЭС клетках, фибробластах и эмбриональных гибридных клетках показало, что экспрессия эпиаллеля гена Lmna спленоцита подавляется в гибридных клетках, причем это подавление не связано с изменением метилирования 5’-регуляторной области гена Lmna. 5. Исследование экспрессии тканеспецифичных генов Alb, Bdh2, Ager, Des, Nefh и Cdx2 в органах взрослой химерной мыши, полученной введением гибридных клеток клона HMC29-3 в бластоцисты мышей линии C57BL, показало, что эпиаллель гена Des спленоцита экспрессируется тканеспецифичным образом в тонком кишечнике химерной мыши. Активность эпиаллелей генов Alb, Bdh2, Ager, Nefh и Cdx2 спленоцита не была выявлена, повидимому, из-за невысокой доли потомков гибридных клеток в органах химерной мыши. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Темирова С.А., Матвеева Н.М., Сердюкова Н.А., Графодатский А.С., Серов О.Л. Анализ экспрессии родительских аллелей Xist и Gla в межвидовых эмбриональных гибридных клетках в условиях индуцированной in vitro инактивации Х-хромосом. // Онтогенез, 2007, Т. 38, № 2, С. 1-8. 2. Vasilkova A.A., Kizilova H.A., Puzakov M.V., Shilov A.G., Zhelezova A.I., Golubitsa A.N., Battulin N.R., Vedernikov V.E., Menzorov A.G., Matveeva N.M., Serov O.L. Dominant manifestation of pluripotency in embryonic stem cell hybrids with various numbers of somatic chromosomes. // Mol. Reprod. Dev. 2007 V.74(8). P.941-951. 3. Battulin N.R., Pristyazhnyuk I.E., Matveeva N.M., Fishman V.S., Vasilkova A.A., Serov O.L. Allelic expression and DNA methylation profiles of promoters at the parental Oct4 and Nanog genes in Mus musculus ES cell/Mus caroli splenocyte hybrid cells. // Cell Tissue Res. 2009 V.337 P. 439-448. DOI 10.1007/s00441-009-0835-5 4. Баттулин Н.Р., Пузаков М.В. Анализ экспрессии родительских аллелей генов Nanog, Oct-4, Gla, Xist и Lmna в межвидовых гибридных клетках. // Материалы XLIV Международной научной студенческой конференции, Биология, Новосиб. гос. университет, Новосибирск, 2006, С. 112. 5. Василькова А.А., Кизилова Е.А., Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Шилов А.Г., Железова А.И., Голубица А.Н., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Полное доминирование эмбрионального генома в гибридных клетках индуцирует восстановление потенций (репрограммирование) дифференцированных клеток. // Материалы международной конференции «Фундаментальные науки – биотехнологии и медицине», Новосибирск, 2006, С. 16. 18 6. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Серов О.Л. Изучение репрограммирования X-хромосом спленоцитов в геноме эмбриональных гибридных клеток. // Цитология, 2006, Т. 48, № 9. С. 795. 7. Vasilkova A.A., Kizilova H.A., Puzakov M.V., Shilov A.G., Zhelezova A.I., Golubitsa A.N., Battulin N.R., Menzorov A.G., Matveeva N.M., Serov O.L. Developmental potential of embryonic stem cell hybrids does not depend on numbers of somatic chromosomes. // Proceedings of international scientific-practical interdisciplinary workshop ―New technology in medicine and experimental biology‖ ―IW + SDC’07‖, Pattaya-Bangkok, Thailand, 26 February – 08 March, 2007. P. 19. 8. Баттулин Н.Р., Юдина К.В., Пристяжнюк И.Е., Серов О.Л. Влияние соотношения гомеологичных хромосом на репрограммирование генов Nanog, Oct-4 и Lmna в межвидовых эмбриональных гибридных клетках. // Цитология, 2007, Т.49, №9. С. 714. 9. Юдина К.В., Баттулин Н.Р., Серов О.Л. Репрограммирование генов Nanog, Oct-4 и Lmna в межвидовых эмбриональных гибридных клетках. // Сборник материалов международной молодежной научно-методической конференции "Проблемы молекулярной и клеточной биологии" 10 - 12 мая 2007 г., г.Томск, С. 193. 10. Василькова А.А., Кизилова Е.А., Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Шилов А.Г., Железова А.И., Голубица А.Н., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Полное доминирование эмбрионального генома в гибридных клетках индуцирует восстановление потенций (репрограммирование) дифференцированных клеток. // International conference ―Basic Science for Biotechnology and Medicine‖ September 3 – 7, 2006, Novosibirsk, Russia, P. 16. 11. Nariman Battulin, N. Matveeva, O. Serov EXPRESSION AND METHYLATION STATUS OF PARENTAL ALLELES AT THE OCT4 AND NANOG LOCI IN Mus musculus ES – Mus caroli SPLENOCYTE CELL HYBRIDS. // Abstracts of papers presented at the LXXIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantative Biologe CONTROL & REGULATION OF STEM CELLS May 28 – June 2, 2008, New York, USA, P. 20 12. Nariman R. Battulin, Inna E. Pristyazhnyuk, Natalia M. Matveeva and Oleg L. Serov Expression and methylation status of parental alleles at the Oct4 and Nanog loci in ES-splenocyte hybrid cell clones with different ratio of parental chromosomes. // BIT Life Sciences 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine and Stem Cells December 2-4, 2008, Foshan, China, P. 139. 13. Н.Р. Баттулин, В.С. Фишман, Н.М. Матвеева, О.Л. Серов Изменение метилирования ДНК при репрограммировании соматического генома в гибридных клетках. // V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21-27 июня 2009, Москва, С. 336. О.Л. Серов, А.А. Круглова, Н.М. Матвеева, М.А. Гридина, Е.А. Кизилова, Н.Р. Баттулин Ранние стадии перепрограммирования фибробластов в гетеро- и синкарионах и при индукции в них плюрипотентности с помощью трансфекции векторами экспрессирующими Oct4/Sox2 и Nanog/Lin28. // Тезисы докладов и сообщений, представленных на Всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий (СанктПетербург, 12-14 октября 2009 г.) Цитология, 2009, Т.51, №9. С. 785. 19 Подписано к печати 24.02.2010 Формат бумаги 60 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. 07. Тираж 100 экз. Заказ 11. Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10. 20
