на правах рукописи Дмитриева Елена Владимировна
реклама
на правах рукописи Дмитриева Елена Владимировна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ЭМБРИОНАЛЬНОЕ И ЛИЧИНОЧНОЕ РАЗВИТИЕ СЕРОЙ ЖАБЫ (BUFO BUFO) Специальность: 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2014 Работа выполнена на кафедре биологической эволюции биологического Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. факультета Научный руководитель: кандидат биологических наук Ляпков Сергей Марленович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Вершинин Владимир Леонидович заведующий лабораторией функциональной экологии наземных позвоночных Института экологии растений и животных УрО РАН доцент, кандидат биологических наук Полынова Галина Вячеславовна кафедра системной экологии экологического факультета Российского университета дружбы народов Ведущая организация: Национальный исследовательский Томский государственный университет, Институт биологии, экологии, почвоведения, сельского и лесного хозяйства Защита состоится «09» октября 2014 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.55 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд.389 Факс:8(495)939-43-09; e-mail: [email protected] С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан «......» ……………..2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Н.В. Карташева 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Амфибии издавна являются объектами как научной, так и практической деятельности человека. Практический интерес к земноводным как к перспективному объекту зоокультуры возник относительно недавно. Разработка методик культивирования амфибий требует выявления условий, позволяющих максимально эффективно использовать данный объект. Для этого необходимы масштабные экспериментальные лабораторные исследования по изучению экологических особенностей данной группы животных. Амфибии являются важным компонентом, как естественных экосистем, так и объектом хозяйственной деятельности человека. Во многих странах земноводные являются объектами промышленного разведения. Их дешевизна и широта спектра использования делают амфибий важнейшими лабораторными животными, обычными объектами практических занятий в школе, в медицинских и биологических вузах. Однако в нашей стране промышленное разведение амфибий еще не освоено. Амфибии все чаще используются в качестве биоиндикаторов для оценки состояния антропогенно-нарушенных экосистем, что определяется их широким распространением, а также способностью заселять нарушенные местообитания (Лебединский, 1984; Вершинин, 1985, 1997; Пескова, 2002, 2004). Амфибии также широко используются как объект биотестирования. Разработаны методики по биотестированию с использованием эмбриональных и личиночных стадий развития амфибий: FETAX, AMPHITOX. Амфибии в сильной степени зависят от внешних условий и поэтому являются хорошими индикаторами состояния окружающей среды, в том числе качества воды (Северцов, 1999). Одним из важных и перспективных направлений является использование амфибий в качестве модельных, экспериментальных или учебных объектов в биологии и медицине. Для исследований в лабораторных условиях воздействий различных факторов используют как эмбриональные (Бадтиев и др., 2008; Мытыева и др., 2007; Herkovits et al., 1997; Merila et al., 2000; Rohr et al. 2006), так и личиночные (Северцова, 2009; Ferrari et al., 2005; Little et al., 2003; Coady et al. 2004; Cauble, Wagner 2005; Teplitsky et al., 2005; Mandrillon, Saglio, 2007) стадии развития амфибий. Эмбриональные и личиночные стадии развитие любого животного - один из самых критических периодов онтогенеза в отношении влияния среды на организм. Развивающийся и растущий организм наиболее всего подвержен влиянию внешних условий. Взрослые особи менее чувствительны к различным возмущающим факторам, чем особи в период эмбрионального и личиночного развития (Айверсон, 1979). На стадиях от икры до завершения метаморфоза наблюдается наиболее значительная смертность особей. Влияние среды, положительное или негативное проявляется в этот период в наибольшей степени, что позволяет с максимальной достоверностью регистрировать эффект от такого влияния. Это является важной теоретической предпосылкой для выбора этих этапов онтогенеза в качестве предмета исследования. С практической точки зрения (в условиях зоокультуры), необходимо добиваться оптимальных темпов роста и развития при минимальной смертности именно на этапах получении икры и разведении личинок, так как организм в эти периоды сильнее всего подвержен воздействию внешних факторов. Таких результатов можно добиться лишь в случае оптимизации условий культивирования. Таким образом, для использования в лабораторных условиях эмбриональных и личиночных стадий развития целесообразно оптимизировать методику их содержания с учетом особенностей биологии вида (такие как структура кладки, оптимальная температура развития и др.). Для проведения лабораторных экспериментов по влиянию различных факторов на развитие амфибий сначала требуется установить, какие особенности биологии вида влияют на результаты проводимых экспериментов и каким образом можно минимизировать неоднородность этих воздействий в процессе проведения экспериментов. 3 В качестве объекта исследований использовалась серая жаба (Bufo bufo). Данный вид обладает удобными для исследования признаками, широко распространен, его состояние характеризует структурную трансформацию батрахокомплексов в условиях урбанизации (Вершинин, 2008). Эмбриональные и личиночные стадии развития серой жабы легко наблюдать как в природных, так и в лабораторных условиях. Исходя из вышеизложенного, целью работы является экспериментальное исследование влияния ряда факторов на эмбриональное и личиночное развитие серой жабы (Bufo bufo) для разработки методики проведения лабораторных экспериментов и оптимизации условий культивирования при разведении серой жабы в лабораторных условиях. Задачи исследования. 1. Исследовать в лабораторных условиях влияние ряда факторов (температуры, плотности и структуры кладки) на эмбриональное и личиночное развитие серой жабы. 2. На основе полученных результатов разработать методику проведения лабораторных экспериментов на эмбриональных и личиночных стадиях развития, а также повышающую эффективность выведения молоди серой жабы для хозяйственных нужд. 3. Исследовать влияние концентрации растворенного кислорода на эмбриональное развитие серой жабы с использованием разработанной методики. Научная новизна работы. Разработана новая методика по выявлению влияния ряда факторов среды на эмбриональные и личиночные стадии развития серой жабы Впервые с помощью разработанной методики выявлены различные типы плотности развивающейся икры: «поверхностная», «объемная», «линейная» и плотность, заданная укладкой икряного шнура. Показано, что «поверхностная» и «линейная» плотности оказывают существенное влияние на темпы развития и смертность эмбрионов, в отличие от «объемной» плотности. Также впервые показано, что в эмбриогенезе серой жабы существует два типа реакций на повышение поверхностной плотности: монотонное и немонотонное изменение смертности. Установлено, что при одиночном развитии икринок недостаток кислорода не ведет к увеличению смертности в эмбриогенезе серой жабы, а лишь сдвигает смертность на более ранние стадии развития. При большой «поверхностной» плотности икры в условиях недостатка кислорода смертность к моменту выклева личинок существенно возрастает. Установлено, что условия среды в период эмбрионального развития оказывают влияние на формирование ряда морфометрических признаков головастиков серой жабы. Практическое значение. Практическое значение работы связано с возможностью использования эмбрионов серой жабы в качестве модельного объекта для лабораторного тестирования при изучении влияния различных антропогенных воздействий. Разработанная методика может быть использована для тестирования в лабораторных условиях различных факторов, влияющих на темпы роста и развития, а также на смертность эмбриональных и личиночных стадий развития серой жабы. Кроме того, использование разработанной методики может быть рекомендовано для практического применения в области культивирования земноводных, в частности для содержания икры серой жабы в лабораторных условиях: использование предложенной методики способно заметно снизить смертность в эмбриональный период, поэтому результаты данного исследования могут быть полезны при организации зоокультуры амфибий. Материалы работы могут быть использованы при составлении лекционных курсов по экологии на естественнонаучных факультетах МГУ им. М.В. Ломоносова и других вузов, поддерживающих данное научное направление. 4 Основные положения, выносимые на защиту. 1. Существенное влияние на темпы развития и смертность эмбрионов серой жабы оказывает плотность икры, обусловленная ее структурой кладки. 2. Условия эмбрионального развития оказывают влияние на формирование морфометрических признаков головастиков серой жабы. 3. Недостаток растворенного в воде кислорода оказывает существенное влияние на смертность и темпы развития эмбрионов лишь при высокой «поверхностной» плотности развивающейся икры. Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены II съезде Герпетологического общества им. А.М. Никольского (Санкт-Петербург, 2003); на 10-м конгрессе европейского общества эволюционной биологии (Краков, Польша, 2005), на 1-й (Прага, Чехия, 2006), 2-й (Гент, Бельгия, 2008) и 4-й (Лиссабон, Португалия, 2012) международной конференциях европейского общества эволюционной биологии развития; на 12-м (Санкт-Петербург, 2003), 14-м (Порто, Португалия, 2007) и 15-м (Кушадасы, Турция, 2009) конгрессах Европейского герпетологического общества. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста, состоит из введения, 9 глав, выводов. Работа иллюстрирована 66 таблицами и 50 рисунками. Список литературы включает 214 источников, в том числе 107 на иностранных языках. Благодарности. Работа проводилась на кафедре биологической эволюции биологического факультета МГУ. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н. с.н.с. С.М. Ляпкову за помощь, оказанную при работе над диссертацией. Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам кафедры биологической эволюции к.б.н. с.н.с. Ю.А. Краус, к.б.н. н.с. Т.С. Путятиной за помощь в написании диссертации и критические замечания по тексту, сотруднику кафедры гидробиологии к.б.н. в.н.с. А.Г. Дмитриевой за помощь в подготовке автореферата. Отдельно хочу поблагодарить моего мужа А.Ю. Дмитриева за неоценимую помощь в подготовке и изготовлению экспериментальных установок для проведения экспериментов, а также за помощь в планировании экспериментальной части работы. Также выражаю благодарность сотрудникам кафедры биологической эволюции и кафедры гидробиологии биологического факультета МГУ за обсуждение результатов работы и советы по ее осмыслению. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы В главе приводится обзор литературы по использованию амфибий в хозяйственной и научно-исследовательской деятельности человека, в частности по использованию эмбриональных и личиночных стадий развития. Рассмотрены основные лабораторные методики исследования эмбриональных и личиночных стадий земноводных. Проведен анализ недостатков существующих методик. Приводится обзор литературы по влиянию различных факторов на эмбриональное и личиночное развитие серой жабы. 5 Глава 2. Материалы и методы Работа проводилась на икре серой жабы в течение 2002-2013 годов. Икра для экспериментов была получена в лабораторных условиях от производителей, отловленных в период массового икрометания из водоемов трех популяций в Московской области. Первый из этих водоемов – Стерляжий пруд, расположенный на территории Звенигородской биостанции МГУ. Второй – озеро Глубокое, расположенное в 20 км западнее г. Звенигорода. Озеро ледникового происхождения, является примером эталонного природного объекта по чистоте воды. Третий водоем – верховое болото Шараповского лесничества на границе с заказником Звенигородской биостанции. Вся поверхность болота, кроме открытых зеркал, покрыта сфагнумом, вода в водоеме сильно закисленная (pH от 4,5 до 6,2). Отловленные в период массового икрометания пары производителей, помещались в отдельные аквариумы для откладки икры. Сразу после завершения процесса икрометания, полученная икра рассаживалась по экспериментальным аквариумам. Икряные шнуры разрезались на необходимые для экспериментов фрагменты с небольшим запасом икринок по краям. После помещения икряного шнура в экспериментальный аквариум лишние икринки удалялись. Для каждого эксперимента использовались зародыши, полученные из одной кладки, т.е. от одной пары производителей. Поэтому эмбрионы являлись полными сибсами, что существенно снижало вклад генетической компоненты изменчивости. Для рассадки выбирались качественные фрагменты кладки серой жабы (не смятые, не деформированные), что существенно снижало случайный вклад в результирующую смертность гибели поврежденных и неоплодотворенных эмбрионов. Все эксперименты на эмбрионах проводились от окончания икрометания до момента вылупления личинок. Для оптимизации методики проведения лабораторных исследований с эмбрионами серой жабы был поставлен ряд экспериментов. Задачей этих экспериментов было выявление лабораторных факторов, которые оказывают влияние на результаты проводимых опытов. Проблема охватывает не только используемое оборудование, но и различия между наблюдателями и наблюдениями. Если один эксперимент проводят 2 разных человека, то результаты могут быть различны, а ошибки суммироваться, что будет существенно снижать достоверность полученных результатов. Таким образом, для оптимизации методики лабораторных исследований необходимо оценить объем выборки, используемое оборудование и материалы, а также эффект экспериментатора. Было поставлена серия экспериментов по оптимизации методики лабораторных исследований: 1. Оптимизация объема выборки путем проведения измерений через равные промежутки времени. Как известно, проведение измерений через равные промежутки времени, существенно снижает объем выборки, необходимый для достижения нужного уровня точности проводимых исследований. 2. Поскольку развитие амфибий происходит в водной среде, для проведения лабораторных исследований важно выявить необходимый и достаточный объем воды, а также оптимальную геометрию аквариума. 3. Влияние экспериментатора при удалении погибших эмбрионов, а также при замене воды в аквариумах. Эксперименты были поставлены как на одиночно развивающихся эмбрионах, так и на икряных шнурах с разной плотностью посадки икринок. Температура является одним из наиболее важных факторов, влияющих на рост и развитие амфибий. В эксперименте по исследованию влияния температуры на эмбриональное развитие серой жабы икра помещалась в емкости по 30 и 120 икринок. Часть развивалась при температуре +15°С, а другая - при температуре +19°С. Следующая серия экспериментов была посвящена исследованию влияния плотности, обусловленной структурой кладки, на смертность и темпы развития эмбрионов. При исследовании влияния плотности на развитие и смертность эмбрионов серой жабы, учитывались следующие факторы: 1) икра откладывается в виде шнуров, поэтому эффект плотности может зависеть от укладки икряного шнура; 2) икряные шнуры могут находиться как 6 в свободном состоянии, так и в натянутом между стеблями водной растительности; 3) икра может находиться на разной глубине; 4) плотность определяется собственно соотношением количества икринок и объема воды, в котором они развиваются. Поэтому был поставлен ряд экспериментов по моделированию различных типов плотности: «поверхностная», «объемная», «линейная» и заданная укладкой икряного шнура. «Поверхностная» плотность - это соотношение количества икринок на единицу площади поверхности (дно аквариума). «Объемная» плотность – это соотношение количества икринок и объема воды, в котором они развиваются. «Линейная» плотность – это соотношение количества икринок и длины шнура, на которую он растянут. Первая серия экспериментов по влиянию плотности была посвящена изучению влияния изолированных от кладки эмбрионов их смертность и темпы развития. Для этого икринки из одной кладки рассаживались по одной в небольшие емкости объемом 0.02 л. Всего для данного эксперимента было использовано 6 кладок икры серой жабы, общее количество исследованного материала – 300 икринок. В экспериментах по изучению влияния «поверхностной» плотности икринки помещались в стандартные аквариумы с площадью дна 44 см2 и высотой столба воды 3 см, т.е. на одну и ту же площадь поверхности приходилось разное число икринок. Т.о. в данном эксперименте оценивается соотношение количества икринок на единицу площади поверхности или «поверхностная плотность». Плотность посадки в разных сериях экспериментов составляла от 4 до 960 икринок на аквариум. Всего было исследовано 30036 эмбрионов из 32 кладок серой жабы. Для следующего эксперимента в стандартные аквариумы были помещены икряные шнуры по 30 икринок в каждом. Часть свободно располагалась на дне аквариума, а часть была натянута между специальными пластиковыми распорками (рис. 1). Икряной шнур растягивался на одинаковую длину (45 мм). Таким образом, в данном эксперименте было исследовано влияние «линейной» плотности (т.е. количества икринок на единицу длины натянутого или ненатянутого икряного шнура). Всего было исследовано 570 эмбрионов из 5 кладок. б) Рисунок 1. Расположение икряного шнура в экспериментах по исследованию «линейной» плотности: натянутый икряной шнур (а) и ненатянутый икряной шнур (б) а) В экспериментах по изучению влияния укладки икряного шнура на смертность и темпы развития в стандартные аквариумы были помещены икряные шнуры по 120 икринок в каждом. В одних аквариумах икряной шнур располагался на дне аквариума в распрямленном состоянии (рис. 2а), а в других – был свернут пополам (рис. 2б). Всего было исследовано 10560 эмбрионов из 9 кладок. Для изучения влияния «объемной» плотности на результаты лабораторных исследований, в стандартные аквариумы помещались икряные шнуры по 30, 60 и 120 икринок в каждом. Икра 7 была рассажена в стандартные аквариумы с одинаковой площадью дна, но разной высотой столба воды (в разных сериях экспериментов от 3 см до 64 см). Таким образом, в данном эксперименте был задан разный объем воды (от 0,13 до 1,06 л) при одинаковой площади поверхности дна, но с разной высотой столба воды. Т.о. в данном эксперименте исследовалась «объемная плотность», т.е. количество икринок в определенном объеме воды. Всего было исследовано 3840 эмбрионов из 9 кладок. а) б) Рисунок 2. Расположение икряного шнура в экспериментальных распрямленный икряной шнур (а) и свернутый икряной шнур (б) аквариумах: Во всех экспериментах оценивалась смертность эмбрионов серой жабы на протяжении всего времени исследования, а также темпы развития. Оценка стадий развития проводилась с помощью таблиц нормального развития серой жабы R. Cambar и J. Gipouloux (1956). Для сравнения между собой результатов различных экспериментов по темпам развития был использован показатель «индекс уровня развития», которой оценивалась по формуле (Dmitrieva, 2005а): J X (t ) = ∑ ( K (i) × n(i) i =1 , где M (t ) X(t) – индекс уровня развития эмбрионов в одном аквариуме в момент времени t, M(t) – общее количество выживших икринок в момент времени t, J – количество выделенных стадий развития (по Cambar, Gipouloux, 1956) n(i) – количество эмбрионов, находящихся на стадии развития i в момент времени t, K(i) – условный коэффициент, присвоенный выделенной стадии развития (дробление – 0, гаструла – 1, II(9) – 2, II(12) – 3, II(13) – 4, III(1) – 5, III(2) – 6, III(3) – 7). Условный коэффициент K(i) присваивался таким стадиям развития, которые легко визуально отличить друг от друга без использования микроскопа. Обычно при использовании головастиков амфибий в качестве тест-объектов не учитывается предыстория их развития, т.е. условия, воздействие которых они испытывали в эмбриональный период. Поэтому, задачей следующей серии экспериментов было изучение того, как условия эмбрионального развития оказывают влияние на развитие головастиков до начала метаморфоза. Для экспериментов на развивающихся головастиках серой жабы были использованы личинки, вылупившиеся в лабораторных условиях из ранее проведенных 8 экспериментов по исследованию разных аспектов плотности и структуры кладки. Личинки были разбиты на 2 группы с плотностью посадки по 2 и 5 особей на аквариум. Головастики доращивались до стадии формирования задней конечности IV(4) (Cambar, Gipouloux, 1956) и фиксировались в 4%-м формалине. На головастиках были проведены следующие измерения (рис. 3): длина от кончика морда до конца хвоста (общая длина) – L; длина от кончика морды до конца хорды (длина хорды) – Lh; длина от кончика морды до ануса (длина тела) – La, высота тела головастика в самом его широком месте (Hg.b.); высота хвостовой пластины, измеренная в самой широкой ее части (Hg.t.); ширина тела головастика (Wd.b.); расстояние между передними краями век (Sp.c.r.); расстояние между центрами ноздрей (Sp.n.). Рисунок 3. Схема промеров головастиков Глава 3. Результаты экспериментов по оптимизации методики лабораторных исследований В результате экспериментов с разным интервалом проведения измерений было получено, что оптимальным интервалом проведения измерений является 8 часов. Также было показано, что изменение объема воды от 0,13 л до 0,34 л, изменение высоты столба в пределах 3-6 см воды, а также площади дна аквариума в пределах 44-113 см2, не оказывают влияния на темпы развития и смертность эмбрионов серой жабы. Для дальнейших экспериментов было решено принять за стандартный аквариум емкость с площадью дна 44 см2 и высотой столба воды 3 см, объем воды – 0,13 л. При проведении исследований на эмбрионах амфибий, перед экспериментатором встает вопрос, следует ли удалять из аквариума погибших эмбрионов, и насколько сильно проводимые манипуляции влияют на результаты исследований. Результаты экспериментов показали, что воздействие, производимое при удалении из кладки умерших эмбрионов, приводит к увеличению смертности по сравнению с контролем. В опыте при плотности посадки 120 икринок на аквариум к моменту вылупления выжило всего 10% эмбрионов, тогда как в контроле при аналогичной плотности выжило 63% эмбрионов. При плотностьи посадки 480 икринок на аквариум в опыте к моменту вылупления погибли все эмбрионы, а в контроле выжило 1,7% эмбрионов. Таким образом, воздействие, проводимое экспериментатором, перекрывает возможный положительный эффект от удаления мертвых икринок (Dmitrieva, 2005а). В экспериментах по оценке влияния воздействий экспериментатора на развитие и смертность одиночно развивающихся эмбрионов было показано, что самая высокая смертность наблюдается в опыте с заменой воды на воду из аквариума, содержащего фрагмент кладки, самая низкая - в контроле, который развивался без дополнительных воздействий. В опыте с перемешиванием воды без ее замены смертность была выше, чем в контроле и ниже чем в 9 опытом с заменой воды. Т.е. самыми комфортными были условия у эмбрионов, развивающихся без всякого воздействия со стороны экспериментатора (Dmitrieva, 2005а). Таким образом, было показано, что любое дополнительное воздействие, проводимое в процессе проведения экспериментов, может оказывать существенное влияние на результат лабораторных экспериментов. Поэтому в дальнейших экспериментах подобные воздействия сводились к минимуму. Глава 4. Влияние температуры на темпы развития и смертность Температура является одним из наиболее важных факторов, влияющих на рост и развитие амфибий. Как показали результаты экспериментов, при разнице температуры в 4°С (15°С и 19°С соответственно), различия в темпах развития являются существенными. При более высокой температуре (19°С) время развития эмбрионов от момента оплодотворения до момента вылупления составляет примерно 95 часов, тогда как при температуре 15°С это время увеличивается до 130 часов. Таким образом, скорость эмбриогенеза серой жабы при температуре 19°С увеличилась почти в 1.4 раза по сравнению с развитием при температуре 15°С, и темпы развития не зависят от плотности эмбрионов серой жабы (Дмитриева, 2014). В одной из исследованных кладок при температуре 19°С смертность несколько выше, чем при температуре 15°С. В этой кладке общая смертность эмбрионов несколько выше, чем в другой кладке. Т.е. влияние температуры на итоговую смертность эмбрионов к моменту вылупления сказывается в первую очередь в кладке с пониженной выживаемостью. Таким образом, температура оказывает некоторое влияние на смертность эмбрионов серой жабы, но это влияние тесно связано со свойствами самой кладки Глава 5. Влияние плотности и структуры кладки на темпы развития и смертность При одиночном выращивании отдельных икринок наблюдается высокая синхронность развития эмбрионов, индекс уровня развития для всех эмбрионов составляет максимально возможный 7,0. Смертность отдельно развивающихся эмбрионов очень низкая, выживаемость составляет от 96,67 до 100 %. Результаты экспериментов показали, что с увеличением поверхностной плотности икринок выше 120 на аквариум смертность эмбрионов всегда монотонно возрастает, при плотности посадки 480 икринок на аквариум выживаемость эмбрионов составляет всего 1,7%, а при 960 вообще равна нулю. При большой начальной поверхностной плотности посадки икринок наблюдается замедление темпов развития, и массовая гибель икринок наступает на более ранних стадиях эмбрионального развития, чем при низкой начальной поверхностной плотности посадки. В результате всех проведенных экспериментов выявлено два вида зависимости выживаемости эмбрионов серой жабы от поверхностной плотности (рис.4). В первом случае (у 70% кладок) такая зависимость является монотонной, то есть с увеличением плотности увеличивается и эмбриональная смертность. Во втором случае (у 30% кладок) зависимость выживаемости от плотности имеет выраженный немонотонный характер, возникает второй максимум выживаемости эмбрионов при повышенной (120 икринок на аквариум) поверхностной плотности. Второй вид зависимости наблюдается в кладках, в которых смертность эмбрионов достаточно высока, т.е. общая жизнеспособность кладки ниже, чем в кладках с монотонной зависимостью смертности от плотности. Таким образом, мы наблюдаем две стратегии выживания для кладок серой жабы, различающиеся по жизнеспособности, которая не обусловлена влиянием условий внешней среды, а только особенностями самих кладок. Ранее подобное явление не было описано ни у одного вида амфибий. Выявленные два типа реакции на повышение плотности не обнаружены у кладок, полученных от производителей, отловленных на озере Глубокое, в отличие от 2-х других водоемов. Следует отметить, что во всех исследованных кладках из озера Глубокое выживаемость была достаточно высока (выше 90%). Таким образом, при постановке 10 экспериментов необходимо учитывать локальные приспособления, которые могут возникать в популяциях, из которых берется материал для исследований. Доля выживших к мгменту вылупления (%) 100 95 90 85 80 75 70 Зависимость 1 Зависимость 2 65 60 55 50 30 60 120 240 Поверхностная плотность (икринок на аквариум) Рисунок 4. Два типа реакции на повышение поверхностной плотности При развитии эмбрионов в натянутом икряном шнуре наблюдается высокая выживаемость (табл. 1) и высокая синхронность развития (табл. 2) отдельных эмбрионов. Темпы развития в натянутых икряных шнурах достоверно выше, чем в ненатянутых (табл. 2). Таблица 1. Процент эмбрионов серой жабы, выживших к моменту выклева в икряных шнурах с натяжением и без натяжения (доля от исходного количества, %). N1 – число повторностей для каждого эксперимента в группе «с натяжением», N2 –в группе «без натяжения» № кладки Кладка 1 Кладка 2 Кладка 3 Кладка 4 N1 4 4 4 4 N2 4 4 8 8 «с натяжением» 99.17±0.83 99.17±0.83 99.17±0.83 100±0 «без натяжения» 98.33±1.67 80.00±11.22 97.08±0.98 95.00±1.41 p 0.045 0.043 0.049 0.011 Таблица 2. Темпы развития эмбрионов (приведены значения индексов уровня развития) в икряных шнурах. N1 – число повторностей для каждого эксперимента в группе «с натяжением», N2 –в группе «без натяжения» № кладки Кладка 1 Кладка 2 Кладка 3 Кладка 4 N1 4 4 4 4 N2 4 4 8 8 «с натяжением» 6.98±0.02 6.90±0.10 7.00 7.00 11 «без натяжения» 6.93±0.02 6.86±0.10 6.97±0.11 6.83±0.12 p 0.021 0.041 0.048 0.011 В условиях натянутого икряного шнура уровень развития практически такой же, как для отдельно развивающихся икринок. Таким образом, в натянутых икряных шнурах в условиях низкой линейной плотности условия развития отдельных эмбрионов близки к идеальным, когда смертность минимальна, а темпы развития максимальны. В эксперименте по исследованию укладки икряного шнура мы также наблюдаем 2 вида зависимости смертности от «плотности», заданной укладкой икряного шнура. Часть из исследованных кладок реагируют на «уплотнение» икряных шнуров, т.е. смертность к моменту вылупления достоверно выше в свернутых икряных шнурах, по сравнению с распрямленными. Две трети исследованных кладок достоверно не реагируют на «плотность», заданную укладкой икряного шнура. В результате проведенных экспериментов по изучению влияния «объемной» плотности на результаты лабораторных исследований не удалось выявить достоверных различий при разной глубине залегания икряного шнура или при различной объемной плотности. По результатам экспериментов не наблюдается достоверных различий ни по смертности, ни по темпам развития между икрой, развивающейся в разном объеме воды (от 0,13 до 1,06 л). Таким образом, собственно «объемная плотность» (число икринок в единице объема воды) не оказывает существенного влияния на смертность и темпы развития икринок серой жабы. То есть, при оценке влияния плотности посадки на смертность и темпы развития эмбрионов серой жабы имеет смысл обсуждать либо поверхностную, либо линейную плотность, так как объемная плотность не оказывает существенного влияния на рассматриваемые показатели. По результатам проведенных экспериментов можно сделать вывод, что идеальными условиями для развития икринок серой жабы является одиночное развитие. При этом не имеет большого значения, в каком объеме воды происходит развитие эмбрионов. Однако в природных популяциях такие условия развития трудно себе представить, за исключением случаев выпадения отдельных икринок из икряного шнура. Наиболее близки к идеальным условия, которые возникают в икряном шнуре, натянутом между стеблями водной растительности. Тогда отдельные эмбрионы располагаются относительно удаленно друг от друга. В лабораторных экспериментах самые лучшие условия развития наблюдались у эмбрионов серой жабы, которые располагаются в натянутом икряном шнуре. В таком состоянии смертность отдельных эмбрионов минимальна, а индекс уровня развития достаточно высок, и наблюдается высокая синхронность развития отдельных эмбрионов (табл. 2). Т.е. в натянутом икряном шнуре отдельные эмбрионы развиваются практически как одиночно развивающиеся икринки. Глава 6. Влияние условий эмбрионального периода на развитии головастиков до начала метаморфоза Результаты этого эксперимента показали, что смертность при разной плотности головастиков достоверно не различается. Головастики при более низкой плотности (2 особи/аквариум) всегда достоверно крупнее, независимо от истории эмбрионального развития. В то же время, условия, в которых происходило развитие эмбриональных стадий, оказывали существенное влияние на морфометрические признаки головастиков. Самым показательным является признак длина тела (La). Чаще всего достоверные различия проявляются в условиях повышенной плотности головастиков (табл. 3). Так, головастики, развивавшиеся в икре в условиях повышенной (120 эмбрионов/аквариум) плотности, достоверно мельче по признаку длина тела, чем головастики, развивающиеся при более низкой плотности (30 и 60 эмбрионов/аквариум). 12 Таблица 3. Влияние условий эмбрионального развития на морфометрические признаки головастиков, полученных из икры, развивающейся при разной поверхностной плотности плотность развития в икре плотность головастиков 2 особи/ аквариум 5 особей/ аквариум Измеренные признаки L Lh La L Lh La 30 эмбрионов/ аквариум 60 эмбрионов/ аквариум 120 эмбрионов/ аквариум 13.37±0.55 12.92±0.55 6.12±0.12 12.13±0.16 11.72±0.16 5.69±0.09 13.89±0.18 13.46±0.18 6.11±0.11 12.28±0.15 11.86±0.15 5.70±0.08 13.37±0.55 12.94±0.54 5.89±0.23 11.66±0.30 11.24±0.29 5.37±0.13 N (30) 9 9 9 25 25 25 N (60) 7 7 7 19 19 19 N (120) 14 14 14 25 25 25 Однако, головастики, развивавшиеся на эмбриональных стадиях в условиях разной линейной плотности, достоверно различаются, при низкой плотности головастиков (табл. 4). Различия же при плотности 5 головастиков на аквариум недостоверны. Таблица. 4. Влияние условий эмбрионального развития на морфометрические признаки головастиков, полученных из икры, развивающейся при разной линейной плотности (натянутый и ненатянутый икряной шнур) Измеренусловия развития в икре плотность p ные N1 N2 головастиков признаки с натяжением без натяжения L 14 9 14.59±0.55 13.37±0.55 0.001 2 особи/ Lh 14 9 14.16±0.55 12.92±0.55 0.001 аквариум La 14 9 6.46±0.55 6.12±0.12 0.013 L 11.92±0.55 12.13±0.16 0.086 25 25 5 особей/ Lh 11.49±0.55 11.72±0.16 0.056 25 25 аквариум La 5.544 5.69±0.09 0.074 25 25 Головастики, развивавшиеся на эмбриональных стадиях без натяжения икряного шнура, достоверно мельче головастиков, полученные из икры, развивавшейся в эмбриональных условиях с натяжением икряного шнура. При этом достоверно различаются все исследованные признаки. Глава 7. Разработка методики проведения лабораторных экспериментов На основе полученных результатов разработана методика проведения лабораторных экспериментов на эмбриональных стадиях развития серой жабы с учетом особенностей биологии данного вида. Эта методика позволяет минимизировать неоднородность воздействий ранее неконтролируемых факторов и стандартизировать условия проведения экспериментов. Стандартизировать условия можно при соблюдении следующих условий. Рекомендуется использовать стандартные аквариумы с площадью дна 44 см2 и высотой столба воды 3 см (объем воды в аквариуме примерно 0.13 л). Как показали результаты предварительных экспериментов, данный объем воды является достаточным для нормального развития эмбрионов серой жабы при плотности посадки от 30 до 120 икринок на аквариум. Увеличение объема воды в экспериментах аквариумах не влияет ни на индекс уровня развития, 13 ни на смертность развивающихся эмбрионов. Изменение формы аквариума в пределах исследованных объемов воды, не оказывает существенного воздействия на результаты проводимых экспериментов. Однако в одном эксперименте лучше использовать одинаковые аквариумы с одинаковой площадью поверхности дна и одинаковой высотой воды в аквариуме. Рекомендуемые температурные условия 15-17°С. Проводя измерения через определенные промежутки времени, мы снижаем систематическую ошибку проводимых экспериментов (Хэйек, 2003). Поэтому, рекомендуется проведение регулярных измерений через фиксированные отрезки времени (8 часов). Любое дополнительное воздействие, проводимое в процессе проведения экспериментов, может оказывать существенное влияние на результат, поэтому все подобные воздействия (замена воды, перемешивание воды в аквариуме, удаление мертвых эмбрионов) лучше свести к минимуму. Необходимо проводить каждое тестирование в условиях разной плотности эмбрионов (30 и 120 икринок на стандартный аквариум). При постановке экспериментов следует учитывать влияние не только «объемной», и «поверхностной» и «линейной» плотностей. При проведении тестирования более поздних стадий развития (например, головастиков), следует учитывать предысторию развития (условия развития в икре). Глава 8. Эксперименты по влиянию концентрации кислорода на темпы развития и смертность эмбрионов на основе разработанной методики Для проверки применимости разработанной методики была поставлена серия экспериментов по влиянию концентрации растворенного кислорода на эмбриональное развитие серой жабы. Одиночные икринки, полученные от одной пары производителей, помещались в небольшие емкости с объемом воды примерно 0.02 л. Емкости, в которые помещались одиночные икринки, заполнялись водой до самого верха. Часть из них закрывалась плотными крышками, которые полностью перекрывали доступ воздуха из окружающей среды, препятствуя растворению кислорода в воде. Другая часть емкостей оставалась открытой, обмен кислорода с окружающей средой не был затруднен Всего исследовано 470 эмбрионов из 7 кладок. Аналогичный эксперимент был поставлен в условиях повышенной плотности икринок (120 икринок/чашку). Всего в данном эксперименте было исследовано 7 кладок серой жабы (7680 эмбрионов). Температура на протяжении эксперимента поддерживалась на уровне 1314°C. Концентрация растворенного кислорода измерялась методом титрования с помощью теста TetraTest O2. Основной эксперимент был поставлен в условиях различной поверхностной плотности эмбрионов (30 и 120 икринок на стандартный аквариум). В данной серии эксперимента исследовано 14880 эмбрионов из 11 кладок. Концентрация растворенного кислорода измерялась в начале эксперимента (в момент рассадки икры), а также по окончании эксперимента (массовое вылупление). Использование нового метода измерения концентрации растворенного кислорода с помощью цифрового оптического датчика LDO (портативный оксиметр HQ30D.99. фирмы HACH) позволило избежать дополнительных воздействий, проводимых в ходе эксперимента, которые могут оказывать существенное воздействие на результат исследования (см. Глава 3) а также существенно повысить точность результатов исследований. В результате экспериментов на одиночных эмбрионах было показано, что смертность к моменту вылупления не зависит от концентрации растворенного кислорода. Однако, динамика смертности при недостатке и нормальном доступе кислорода различна (рис. 5). При недостатке кислорода смертность резко возрастает уже на стадии нейрулы, тогда как в условиях свободного доступа кислорода смертность возрастает только на стадии формирования хвостовой почки. К сожалению, с помощью теста TetraTest O2 не удалось выявить различий по концентрации растворенного кислорода в закрытых и открытых планшетах при одиночном развитии эмбрионов серой жабы. 14 70 60 доля умерших (%) 50 40 закрытые 30 открытые 20 10 0 0 16 32 48 64 80 96 112 128 144 160 176 -10 время развития, час Рисунок 5. Динамика смертности одиночно развивающихся эмбрионов при развитии в закрытых (без доступа воздуха) и открытых планшетах (при свободном обмене воздухом с окружающей средой) Как показали результаты экспериментов к моменту вылупления концентрация растворенного кислорода существенно снижается. Использование оптического датчика LDO с портативным оксиметром HQ30D.99 позволило повысить точность измерений и получить новые результаты проводимых экспериментов. В открытых емкостях концентрация кислорода снижается в меньшей степени, чем в закрытых. В закрытых емкостях различия по концентрации растворенного кислорода при разной плотности посадки эмбрионов не всегда достоверны (табл. 5). Таблица 5. Концентрация растворенного в воде кислорода в начале и в конце эксперимента № плотность кладки посадки плотность 30 Кладка 1 плотность 120 плотность 30 Кладка 2 плотность 120 открытые / закрытые открытые закрытые открытые закрытые открытые закрытые открытые закрытые начало эксперимента концентрац насыщенно ия (мг/л) сть (%) 9.46±0.02 112.53±0.12 9.46±0.02 112.53±0.12 9.45±0.04 112.18±0.25 9.45±0.04 112.18±0.25 9.92±0.01 115.10±0.15 9.92±0.01 115.10±0.15 9.81±0.01 114.48±0.26 9.81±0.01 114.48±0.26 15 конец эксперимента концентрац насыщенность ия (мг/л) (%) 6.94±0.21 91.48±2.78 0.87±0.15 11.53±2.10 2.43±0.43 32.52±5.76 0.31±0.03 4.27±0.42 6.44±0.34 85.55±4.49 1.49±0.62 20.02±8.39 2.08±0.43 27.97±5.77 0.38±0.05 5.05±0.71 плотность открытые 30 закрытые Кладка 3 плотность открытые 120 закрытые плотность открытые 30 закрытые Кладка 4 плотность открытые 120 закрытые 9.51±0.02 9.51±0.02 9.47±0.06 9.47±0.06 8.86±0.07 8.86±0.07 9.21±0.05 9.21±0.05 116.15±0.17 116.15±0.17 115.33±0.63 115.33±0.63 110.23±0.24 110.23±0.24 112.48±0.24 112.48±0.24 6.50±0.14 0.36±0.04 1.90±0.33 0.32±0.04 5.94±0.25 0.37±0.05 1.86±0.11 0.34±0.07 86.48±1.92 4.73±0.54 25.02±4.31 4.23±0.56 81.15±3.45 5.12±0.73 24.97±1.45 4.61±1.00 При плотности 120 икринок на аквариум смертность в условиях недостатка кислорода существенно выше, чем в нормальных условиях, до момента вылупления доживает лишь небольшой процент эмбрионов (табл. 6). При этом наблюдается замедление развития, остановка развития на стадии поздней гаструлы. Затем начинается массовая гибель эмбрионов. Лишь небольшое количество выживших эмбрионов достигает стадии вылупления. Таблица 6. Смертность эмбрионов серой жабы к моменту вылупления при плотности посадки 120 икринок на аквариум № кладки Кладка 1 Кладка 2 Кладка 3 Кладка 4 открытые 4.31±0.84 5.00±0.86 12.22±3.19 8.89±2.52 закрытые 96.67±0.86 96.67±1.27 98.06±0.77 96.39±0.85 p 0.004 0.004 0.004 0.004 N1 6 6 6 6 N2 6 6 6 6 При плотности посадки 30 икринок на аквариум смертность к моменту вылупления достоверно различается лишь в 2 из 4 исследованных кладок (таблица 7). Таблица 7. Смертность эмбрионов серой жабы к моменту вылупления при плотности посадки 30 икринок на аквариум № кладки Кладка 1 Кладка 2 Кладка 3 Кладка 4 открытые 0.00±0.00 1.11±1.11 4.44±2.81 1.11±1.11 закрытые 5.56±2.53 3.89±1.34 11.67±2.55 36.11±4.82 p 0.05 0.09 0.15 0.004 N1 6 6 6 6 N2 6 6 6 6 Смертность эмбрионов серой жабы к моменту вылупления при повышенной плотности посадки выше, чем при пониженной плотности, независимо от насыщенности воды кислородом. Т.е. при разной поверхностной плотности посадки концентрация растворенного кислорода по-разному влияет на смертность отдельных эмбрионов серой жабы. В условиях недостатка кислорода индекс уровня развития к началу вылупления достоверно ниже, чем в условиях нормального доступа кислорода как при высокой, так и при нормальной плотности. При высокой плотности посадки к моменту вылупления выживает лишь небольшой процент эмбрионов серой жабы, и эти эмбрионы существенно отстают в развитии от особей, развивающихся в условиях нормального доступа кислорода. Таким образом, недостаток кислорода вызывает замедление развития эмбрионов серой жабы. В результате, в условиях повышенной плотности недостаток кислорода сильнее сказывается на развитии эмбрионов серой жабы. Так, концентрация растворенного кислорода в 16 закрытых емкостях при повышенной и пониженной плотности достоверно не различается в 2-х из 4-х исследованных кладок (табл. 7), т.е. условия насыщенности воды кислородом одинаковые. Однако при повышенной плотности (120 против 30 икринок на аквариум) эти условия гораздо сильнее сказываются как на уровне смертности, так и темпах развития эмбрионов серой жабы. Таким образом, используемая методика, основанная на учете особенностей биологии серой жабы, позволяет получить наиболее полные данные по влиянию исследуемого фактора на эмбриональные стадии развития данного вида. Таблица 8. Влияние недостатка кислорода в период эмбрионального развития на морфометрические признаки головастиков плотность головастико в 2 особи/ аквариум 5 особей/ аквариум Измерен- условия развития в икре ные недостаток нормальные признаки О2 условия L 10.09±0.14 10.06±0.17 Lh 9.79±0.13 9.78±0.17 La 4.37±0.08 4.33±0.08 Wd.b 3.02±0.05 3.04±0.05 Hg.t 2.23±0.05 2.23±0.04 Hg.b 2.26±0.05 2.26±0.04 Sр.n. 1.40±0.02 1.24±0.02 Sp.c.r 3.06±0.05 2.94±0.04 L 8.6±0.19 9.23±0.14 Lh 8.35±0.19 8.96±0.13 La 3.63±0.09 3.99±0.07 Wd.b 2.45±0.08 2.68±0.05 Hg.t 1.78±0.07 2.08±0.04 Hg.b 1.77±0.06 2.03±0.03 Sр.n. 1.10±0.04 1.25±0.03 Sp.c.r 2.56±0.08 2.74±0.05 p 0.641 0.666 0.593 0.986 0.863 0.822 0.000 0.042 0.009 0.010 0.002 0.012 0.000 0.000 0.002 0.042 N1 N2 18 18 18 18 18 18 18 18 19 19 19 19 19 19 19 19 16 16 16 16 16 16 16 16 27 27 27 27 27 27 27 27 В эксперименте по влиянию недостатка кислорода в период эмбрионального развития на личиночный период развития головастики были доращены до стадии IV(10) (Cambar, Gipouloux, 1956) и фиксировались в 4%-м формалине. На головастиках были проведены следующие измерения (рис. 3): длина от кончика морда до конца хвоста (общая длина) – L; длина от кончика морды до конца хорды (длина хорды) – Lh; длина от кончика морды до ануса (длина тела) – La, высота тела головастика в самом его широком месте (Hg.b.); высота хвостовой пластины, измеренная в самой широкой ее части (Hg.t.); ширина тела головастика (Wd.b.); расстояние между передними краями век (Sp.c.r.); расстояние между центрами ноздрей (Sp.n.). По результатам проведенных измерений при повышенной плотности головастиков, головастики, полученные из икры, развивающейся в условиях недостатка кислорода, достоверно меньше по всем исследованным признакам, чем головастики, полученные из эмбрионов, развивающихся в условиях нормального доступа кислорода (табл. 8). В условиях более низкой плотности головастиков (2 особи/ аквариум) различия достоверны лишь по двум признакам - расстояние между передними краями век (Sp.c.r.) и расстояние между центрами ноздрей (Sp.n.). 17 Глава 9. Обсуждение Факторы, влияющие на эмбриональное развитие серой жабы Мною разработана методика проведения лабораторных экспериментов на эмбриональных стадиях развития серой жабы с учетом особенностей биологии данного вида. В частности, данная методика учитывает особенности влияния ряда факторов, а именно температуры, плотности и структуры кладки, на эмбриональное и личиночное развитие серой жабы. Температура – важнейший экологический фактор, влияющий на интенсивность обменных процессов амфибий. Основное значение воздействия температуры на живые организмы состоит в ее влиянии на скорость обменных процессов. Колебания температуры влекут за собой изменения скорости метаболизма, что в свою очередь приводит к изменению темпов развития. Кроме того, при повышении температуры может увеличиваться интенсивность потребления кислорода. В кладках с исходно высокой смертностью повышение температуры может увеличивать чувствительность эмбрионов к недостатку кислорода, что в свою очередь приводит к дальнейшему повышению смертности (Дмитриева, 2014). Другим важным фактором, который оказывает влияние на темпы развития и смертность эмбриональных и личиночных стадий развития серой жабы, а также на результаты проводимых лабораторных экспериментов, является плотность. В экспериментах по исследованию поверхностной плотности на темпы развития и смертность показано наличие двух типов реакции на повышение начальной плотности посадки (Дмитриева, 2007, 2013; Dmitrieva, 2006). Особенности структуры кладки жабы в сочетании с экологией икрометания (структура водоемов, площадь мест для откладки икры и т. п.) делают условия развития эмбрионов внутри одной кладки гетерогенными, что, возможно, и привело к формированию в эмбриогенезе двух типов реакции на повышение поверхностной плотности. Отбору на плодовитость должно препятствовать увеличение эмбриональной смертности (Ляпков, Северцов, 1994). Следовательно, могут формироваться дополнительные механизмы, которые будут поддерживать стабильное существование вида в условиях, как с пониженной, так и с повышенной плотностью развивающейся икры. Таким механизмом у серой жабы и может служить полиморфизм реакции на плотность. При низкой плотности кладок и большом количестве места, доступного для откладки икры в водоемах, преимущество получают кладки с высокой выживаемостью и монотонной зависимостью выживаемости от плотности. При повышенной плотности кладок и небольшом количестве мест для откладки икры, получает преимущество кладки, в которых зависимость выживаемости от плотности немонотонная. Таким образом, существование двух стратегий реагирования на особенности окружающей среды позволяет популяции выжить в широком диапазоне условий. Такая тактика позволяет поддерживать жизнеспособность каждой новой генерации в постоянно меняющихся во времени и в пространстве условиях среды. Выявленные два типа реакции на повышение плотности не обнаружены у кладок, полученных от производителей, отловленных на озере Глубокое. Озеро Глубокое представляет собой эталонный природный объект Московской области (Yanin et al., 1986), в котором условия для эмбрионального и личиночного развития серой жабы практически идеальны. В процессе икрометания самка имеет возможность растянуть икряной шнур почти на всю длину кладки. Переплетения и наматывания икряных шнуров друг на друга практически не наблюдается. Два других водоемах, из которых отлавливались производители, представляют собой небольшие пруды с ограниченной площадью для откладки икры. В результате, в данных водоемах возникает неоднородность условий развития, что приводит к формированию полиморфизма реакции на повышенную плотность. Влияние условий эмбрионального периода на развитие головастиков Как показали результаты проведенных экспериментов, условия эмбрионального развития оказывают влияние на развитие головастиков до начала метаморфоза (Глава 6). На основании анализа морфометрических признаков было показано, что головастики, развивавшиеся на эмбриональных стадиях при оптимальных условиях, гораздо сильнее реагируют на ухудшение условий на личиночных стадиях развития. Так, особи, которые на эмбриональных стадиях 18 развивались в натянутом икряном шнуре (оптимальные условия развития), при плотности 2 головастика на аквариум, были самыми крупными из всех исследованных групп, а при плотности 5 головастиков на аквариум оказывались достоверно мельче всех остальных головастиков. Т.е. «плохие» условия эмбрионального развития обеспечивают «преадаптацию» особей – их реакции на ухудшение условий личиночного развития оказываются более адаптивными. Так называемые «переходящие эффекты» (carryover effects) возникают, когда условия раннего развития влияют на формирование признаков организма на более поздних стадиях (Pechenik et al., 1998). Исследования этого эффекта у разных групп животных показали, что раннее развитие может оказывать долгосрочное влияние на более поздние этапы жизненного цикла (Pechenik, 2006). Как показали результаты моих экспериментов, условия, в которых происходило эмбриональное развитие, оказывают существенное влияние на морфометрические признаки головастиков (длину тела головастиков, расстояние между передними краями век, расстояние между центрами ноздрей). Таким образом, при постановке экспериментов на головастиках, следует уделять внимание стандартизации плотности не только на исследуемых стадиях развития, но и в предыдущем (эмбриональном) периоде, так как этот фактор может оказать существенное влияние на результаты. Применение разработанной методики проведения лабораторных экспериментов на эмбриональных и личиночных стадиях развития серой жабы Для апробации разработанной методики была поставлена серия экспериментов по исследованию влияния концентрации растворенного кислорода на эмбриональное и личиночное развитие серой жабы. Результаты экспериментов показали, что концентрация растворенного кислорода при разной поверхностной плотности развивающихся эмбрионов серой жабы по-разному сказывается на смертности и темпах развития. Смертность эмбрионов серой жабы к моменту вылупления при повышенной плотности посадки выше, чем при пониженной плотности, независимо от насыщенности воды кислородом, т.е. на смертность оказывает влияние не только концентрация растворенного кислорода, но и плотность. В условиях повышенной плотности (120 икринок на аквариум) в условиях недостатка кислорода картина смертности эмбрионов очень похожа на картину смертности при критичных плотностях (480 и 960 икринок на аквариум - см. Глава 5): наблюдалось замедление развития, остановка на стадии гаструлы, а затем начиналась массовая гибель особей. Когда большая часть эмбрионов погибает, то небольшое количество эмбрионов может все-таки выжить и достичь стадии вылупления. Таким образом, в условиях повышенной плотности недостаток кислорода сильнее сказывается на развитии эмбрионов серой жабы. Эти различия удалось выявить благодаря применению разработанной методики проведения лабораторных экспериментов. Головастики в условиях повышенной плотности, развивавшиеся на эмбриональных стадиях в условиях недостатка кислорода, достоверно отличаются от головастиков, развивавшиеся на эмбриональных стадиях в нормальных условиях, по всем исследованным признакам, а при низкой плотности различаются только по двум признакам (Sp.c.r. и Sp.n.). Следовательно, условия эмбрионального развития, связанные с недостатком кислорода, сказываются в первую очередь на формировании признаков головы личинок серой жабы. Таким образом, разработанная методика проведения экспериментов позволяет выявить более тонкие различия влияния исследуемых факторов на эмбриональное и личиночное развитие серой жабы. Помимо обычной стандартизации условий, обычно учитывающихся при проведении экспериментов, в данной методике учтен ряд дополнительных факторов. Показано, что плотность посадки эмбрионов оказывает существенно воздействие на результаты экспериментов. Учет совместного воздействия плотности икры и исследуемого фактора (в нашем случае, влияние концентрации растворенного кислорода) повышает точность оценки влияния исследуемого фактора. Отсутствие в процессе проведения экспериментов дополнительных воздействий на развивающихся эмбрионов существенно снижает вклад смертности, не связанной с изучаемыми факторами, и возникающей за счет действий экспериментатора. Это также позволяет повысить точность получаемых результатов. 19 Разработанная методика позволяет использовать эмбрионов серой жабы в качестве модельных объектов для экспериментальных или учебных целей в биологии и медицине. В частности, амфибии представляют большой интерес для их использования в качестве биоиндикаторов для оценки состояния антропогенно-нарушенных экосистем, (Лебединский, 1984; Вершинин, 1997; Пескова, 2002, 2004). Эмбриональные и личиночные стадии развития серой жабы могут быть использованы в качестве объекта биотестирования. Выбор серой жабы в качестве объекта биотестирования обусловлен тем, что этот вид отвечает ряду необходимых требований для позвоночных-биоиндикаторов: принадлежность разных этапов жизненного цикла к разным средам (в частности, связь с водной средой), принадлежность к разным звеньям трофической цепи, продолжительность жизни и др. (Пястолова, Трубецкая, 1990). Разработанная методика также может быть рекомендована для практического применения в области культивирования земноводных. Использование предложенной методики способно заметно снизить смертность в эмбриональный период развития, поэтому результаты данного исследования должны учитываться при организации зоокультуры амфибий. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. ВЫВОДЫ Изменение температуры в пределах температурного оптимума влияет на выживаемость и темпы развития эмбрионов серой жабы. Увеличение температуры на 4°С (с 15 до 19 °С) приводит к ускорению темпов развития в 1,4 раза и увеличивает смертность эмбрионов, в первую очередь в кладках с пониженной выживаемостью икры. Существенное влияние на темпы развития и смертность эмбрионов серой жабы оказывают поверхностная и линейная плотности, в отличие от объемной плотности. В эмбриогенезе серой жабы существует два типа реакции на повышение поверхностной плотности: в 70 % кладок эта реакция имеет монотонный характер (чем выше плотность, тем выше смертность), а в 30 % кладок – немонотонный (существует второй пик повышенной выживаемости эмбрионов при высокой плотности). При этом общая смертность в кладках с немонотонной зависимостью выше, чем в кладках с монотонной, однако эти кладки получают преимущество при повышенной плотности развития икры. Оптимальным условием эмбрионального развития серой жабы является натянутое состояние икряного шнура: темпы развития и смертность икры максимально близки к таковым одиночно развивающихся эмбрионов. У 30% кладок смертность в распрямленных икряных шнурах достоверно ниже, чем в свернутых, а у 70% укладка икряного шнура не оказывает существенного влияния на смертность эмбрионов. Условия эмбрионального развития оказывают существенное влияние на длину тела головастиков, реже на другие морфометрические признаки (общая длина, расстояние между передними краями век, расстояние между центрами ноздрей). На основе полученных результатов разработана методика проведения лабораторных экспериментов на эмбриональных стадиях развития серой жабы с учетом особенностей биологии данного вида, что позволяет минимизировать неоднородность воздействий ранее неконтролируемых факторов и стандартизировать условия проведения экспериментов. При одиночном развитии икринок недостаток кислорода не приводит к увеличению смертности в эмбриогенезе серой жабы, а приводит лишь к изменению динамики смертности: смертность возникает на более ранних стадиях развития, чем в условиях нормального доступа кислорода. При большой «поверхностной» плотности икры в условиях недостатка кислорода смертность к моменту выклева существенно возрастает. Недостаток растворенного в воде кислорода ведет к замедлению развития эмбрионов серой жабы. 20 Список работ, опубликованных по теме диссертации Журналы из перечня изданий, рекомендованных ВАК: 1. Глухова Е. В., Черданцев В.Г. Микроскладки в супрабласторальной зоне гаструлы лягушки и их отношение к геометрии и механике гаструляции // Онтогенез. 1999. Т. 30. № 6. С. 425-435. 2. Дмитриева Е.В. 2007. Влияние плотности икры на темпы развития и смертность серой жабы (Bufo bufo) в лабораторных условиях // Зоол. журн. Т. 86. № 2. С. 229-235. 3. Дмитриева Е.В. 2013. Влияние структуры кладки серой жабы (Bufo bufo) на эмбриональное развитие // Зоол. журн. Т. 92. № 12. С. 1437-1449. 4. Dmitrieva E.V. 2014. Experimental study of the temperature effect on survival and development rates in the early ontogenesis of common toad (Bufo bufo) // Moscow University Biological Sciences Bulletin. V. 69. № 2. p. 71-73. Другие издания: 5. Dmitrieva E. 2003. The effects of density on growth and mortality of the Bufo bufo eggs and tadpoles // Societas Europaea Herpetologica, 12th Ordinary general meeting. Programme & Abstract, Saint-Petersburg, p. 56. 6. Dmitrieva E. 2005. The effects of density on mortality and development of the Bufo bufo eggs and tadpoles // Herpetologia Petropolitana, Ananjeva N. And Tsinenko O. (eds.), pp. 130 – 133. 7. Dmitrieva E. 2005. Comparative analysis of spawn packing in frogs and toads // 10th Congress European Society for Evolutionary Biology. Krakow, Poland 15-20 August, 2005. р.462. 8. Dmitrieva E. 2006. Plasticity of embryonic survival strategy in common toad Bufo bufo // The 1th and founding meeting of European society for Evolutionary Developmental biology. Prague, Czech Republic, August 16 – 19, 2006. р. 241. 9. Dmitrieva E.V., Dmitriev А.Y., 2007. Comparative analysis of survival in early ontogenesis of two populations of common toad (Bufo bufo) in Moscow region // 14th European Congress of Herpetology. Porto, Portugal, 19-23 September, 2007. р. 202. 10. Dmitrieva E. 2008. The effect of oxygen deficiency on early ontogenesis of common toad (Bufo bufo) // The 2th meeting of European society for Evolutionary Developmental biology. Ghent, Belgium, July 29 – August 1, 2008. р. 216. 11. Dmitrieva E., 2009. Mortality factors in the early development of the common toad (Bufo bufo) // 15th European Congress of Herpetology. Kuşadası, Aydın, Turkey. 28 September-2 October 2009. р. 176. 12. Dmitrieva E., 2012. The influence of eggs different environments on morphometrics of Bufo bufo tadpoles // The 4th and founding meeting of European society for Evolutionary Developmental biology. Lisboa, Portugal, 10-13 July, 2012. р.162. 21
