автореферат - Институт микробиологии РАН
реклама
На правах рукописи ПОДОСОКОРСКАЯ ОЛЬГА АНДРЕЕВНА НОВЫЕ АНАЭРОБНЫЕ ТЕРМОФИЛЬНЫЕ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ Специальность 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН) Научный руководитель: Бонч-Осмоловская Елизавета Александровна доктор биологических наук Официальные оппоненты: Горленко Владимир Михайлович доктор биологических наук, профессор, ИНМИ РАН, Зав. лабораторией Щербакова Виктория Артуровна кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (ИБФМ РАН), Зав. лабораторией Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет Защита состоится «20» февраля 2013 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 при ИНМИ РАН по адресу: 117312, Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп. 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН Автореферат диссертации разослан « » января 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Хижняк Т.В. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Целлюлоза - основной компонент клеточных стенок растений, является самым распространенным (исключая ископаемые ресурсы) источником органического углерода на Земле (Coughlan, 1990). Кристаллическая структура целлюлозы обуславливает ее исключительную устойчивость к различным внешним факторам среды и необходимость синергетического действия нескольких типов гидролитических ферментов (целлюлаз) для ее полного гидролиза. Тем не менее, в природе происходит эффективная деструкция целлюлозы за счет деятельности грибов и бактерий, которые участвуют, таким образом, в минерализации органического вещества и глобальном цикле углерода. При этом доступность кислорода, по всей видимости, играет одну из ключевых ролей в стратегии разложения целлюлозы микроорганизмами. В аэробных условиях значительная роль в этом процессе принадлежит грибам, хотя среди аэробных бактерий также есть целлюлолитические представители (Cellulomonas fimi, Streptomyces cellulolyticus и др.). Аэробные целлюлолитики характеризуются высокими урожаями клеток и наличием неассоциированных целлюлазных систем (Рабинович и Мельник, 2000). В анаэробных условиях целлюлозу расщепляют, как правило, бактерии, которые синтезируют мультидоменные гидролитические ферменты, связанные с клетками, либо надмолекулярные комплексы – целлюлосомы. В то же время открытым остается вопрос о способности факультативно анаэробных микроорганизмов разлагать целлюлозу, поскольку за исключением нескольких мезофильных бактерий - Cellulomonas terrae (An et al., 2005), Telmatobacter bradus (Pankratov et al., 2012) для абсолютного большинства представителей этой физиологической группы рост на целлюлозе не показан. Работы по изучению целлюлолитических микроорганизмов были начаты еще в середине прошлого века. Однако повышенный интерес к данной группе был вызван топливным кризисом 70-х гг., поскольку низкая себестоимость и повсеместное присутствие целлюлозного сырья делает его доступным ресурсом для производства топлива (Lynd et al., 2002). С тех пор был изучен целый ряд мезофильных и термофильных микроорганизмов, способных с разной степенью эффективности гидролизовать целлюлозу (Beguin et al., 1994; Schwarz, 2000; Blumer-Schuette et al., 2008). К настоящему времени целлюлазы уже нашли успешное применение во многих отраслях промышленности и сельском хозяйстве (Hongpattarakere, 2002; Sukumaran et al., 2005). Вместе с тем, использование именно термофильных представителей и их термостабильных ферментов позволяет избежать загрязнения нежелательной микрофлорой (Vielle & Zeikus, 2001). Кроме того, воздействие высоких температур способствует увеличению доступности трудногидролизуемых нерастворимых веществ (Niehaus et al., 1999) и делает возможным проведение консолидированной биообработки сырья (Consolidated Bioprocessing, CBP, Lynd et al., 2002). К началу наших исследований большинство описанных термофильных целлюлолитических бактерий относились к типам Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes. Среди архей рост на целлюлозе был показан только для одного 3 гипертермофильного представителя – Desulfuroccocus fermentans (Perevalova et al., 2005). Помимо изучения биоразнообразия целлюлолитических микроорганизмов, многочисленные исследования, проводимые в настоящее время, направлены на попытки увеличения скорости и эффективности микробного разложения целлюлозы. У ряда микроорганизмов исследована структура и функции отдельных ферментов и целлюлазных систем в целом, проведено клонирование и экспрессия целлюлаз (Zverlov et al., 1998; Berger et al., 2006; Raman et al., 2009; Olson et al., 2010). Однако фундаментальное понимание процесса микробного разложения целлюлозы остается неполным, а энергетические проблемы - нерешенными (Lynd et al., 2002). Вышесказанное свидетельствует об актуальности изучения термофильных целлюлолитических микроорганизмов как с научной, так и с прикладной точек зрения. В то же время данные о малом количестве культивируемых прокариот относительно их общего числа (Amann et al., 1995) и недостаточная изученность микробного разнообразия термальных мест обитания прямо указывают на возможность выделения новых термофильных целлюлолитических микроорганизмов. Они, в свою очередь, могут прояснить роль этой группы в занимаемых эконишах и оказаться потенциальным источником ценных ферментов. Цели и задачи исследования Целью работы было обнаружение, выделение и характеристика новых термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов и их ферментов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) изучение разнообразия термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов из различных термальных местообитаний; 2) характеристика новых термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов; 3) первичная характеристика целлюлолитической активности у представителей новых таксонов. Научная новизна и практическая значимость работы Из наземных, подземных и морских термальных мест обитания было выделено 30 штаммов анаэробных целлюлолитических прокариот, относящихся к различным таксонам. Из них 26 штаммов оказались термофильными организмами. Описаны новые виды экстремально термофильных целлюлолитических бактерий типа Thermotogae – Thermosipho affectus sp. nov. и Fervidobacterium riparium sp. nov. Для представителей данных родов способность к росту на целлюлозе была показана впервые. Для представителей типа Thermotogae в целом впервые был продемонстрирован рост на микрокристаллической целлюлозе. Выделена новая умеренно термофильная целлюлолитическая бактерия ‘Melioribacter roseus’ gen. nov., sp. nov., отнесенная к новому семейству ‘Melioribacteraceae’. Предложен новый тип ‘Ignavibacteriae’, включающий класс Ignavibacteria, порядок Ignavibacterales и два семейства ‘Melioribacteraceae’ и Ignavibacteraceae. 4 Описан новый род термотолерантной бактерии – Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov. Впервые показан рост на целлюлозе, в том числе микрокристаллической, у представителей класса Anaerolinea типа Chloroflexi. Частично охарактеризованы штаммы анаэробных целлюлолитических бактерий родов Thermotoga, Caldicellulosiruptor и Clostridium, представляющие новые виды. Кроме того, получены новые штаммы ряда известных целлюлолитических микроорганизмов, расширяющие представления об их распространении и физиологии. В результате работы создана коллекция анаэробных целлюлолитических микроорганизмов (30 штаммов 22 видов), способных разлагать целлюлозу и другие полисахариды в широком диапазоне температуры (20 - 92°С), рН (5.0 – 9.5) и солености среды (0 - 8%). Новые микроорганизмы являются продуцентами термостабильных целлюлаз, которые могут быть устойчивы и к действию других физико-химических факторов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о большом разнообразии термофильных целлюлолитических микроорганизмов, которые могут играть существенную роль в процессах разложения целлюлозы в природе при высоких температурах, и демонстрируют, что способность разлагать целлюлозу широко распространена у представителей различных филогенетических групп. Апробация работы Материалы диссертации были представлены на международных конференциях “Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles 2010”, “Extremophiles 2010”, “Thermophiles 2011”, “Extremophiles 2012”, “ISME 2012”, “Copper in Biology 2012”, а также на Конкурсе научных работ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН в 2011 году и Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» в 2010 и 2012 году. Публикации Материалы диссертации опубликованы в 17 печатных работах: 5 экспериментальных статьях, 1 коллективной монографии и 11 тезисах конференций. Место проведения работы и благодарности Основная работа выполнялась в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук. Секвенирование последовательностей полных геномов и генов 16S рРНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре «Биоинженерия» РАН. Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и ИБФМ РАН (г. Пущино). Определение хинонов проводили в ИБФМ РАН (г. Пущино). Состав жирных кислот и фосфолипидов проводили в РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина. 5 Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. БончОсмоловской Е.А. и к.б.н. Кубланову И.В. за практическую помощь, ценные советы, полезную критику и постоянное внимание на всех этапах выполнения работы. Также автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам, принимавшим активное участие в работе на разных ее этапах. Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и включает 43 рисунка и 12 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследований и их обсуждение, выводов и списка литературы, который включает 300 наименований. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования Объектами исследования служили термофильные целлюлолитические микроорганизмы, выделенные из наземных горячих источников кальдеры Узон, Долины гейзеров, Паужетки (Камчатка), Байкальского региона, Кунашира (Курильские о-ва), о-ва Сан-Мигель (Азоры, Португалия); глубоководных морских гидротерм (бассейн Гуаймас и Срединно-Атлантический хребет); глубинных термальных мест обитания (скважины Томской области и г. Кисловодск). Получение первичных накопительных культур целлюлолитиков Накопительные культуры в источниках получали путем инкубации флаконов с добавленной в них целлюлозой, как это было описано ранее (Kublanov et al., 2009). Время инкубации составляло от 1 до 7 суток. В лабораторных условиях накопительные культуры получали путем анаэробного внесения образцов воды, осадков или матов (0.5 мл) в пробирки Хангейта, содержащие минеральную среду. В качестве субстратов использовали различные типы целлюлозы: фильтровальную бумагу (ФБ), опилки, аморфную (АМЦ), микрокристаллическую (МКЦ) или карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). Посевы инкубировали при температуре и рН, близких к таковым в источниках. Накопительные и чистые культуры целлюлолитических микроорганизмов культивировали на минеральных средах, описанных в публикациях (2, 3, 4) с добавлением дрожжевого экстракта (0.05-0.1 г/л) в качестве источника факторов роста. Органические субстраты добавляли в концентрации 20 мМ или 2 г/л. Растворимые акцепторы электронов вносили в концентрации от 2 до 10 мМ непосредственно перед инокуляцией, а элементную серу (5 г/л) и оксид Fe(III) (90 мМ) - перед стерилизацией. Среду готовили аэробно и разливали в пробирки с ватными пробками либо анаэробно. В последнем случае среду с резазурином (0.002 г/л) кипятили, охлаждали под током чистого N2 и добавляли Na2S*9H2O (0.3 г/л), в качестве восстановителя. рН доводили до нужного значения 6 н растворами HCl или 6 NaOH, после чего под током азота среду разливали по пробиркам и герметично закрывали пробками из бутиловой резины. Стерилизацию сред проводили при 1 или 0.5 (при наличии в среде S0) ати. Среду с аморфным оксидом железа готовили без добавления восстановителя и резазурина. Получение чистых культур. Чистые культуры целлюлолитиков получали анаэробно, методом предельных разведений в жидкой среде, либо выделением отдельных колоний на агаровых столбиках (1.5-2.5%) с использованием КМЦ и МКЦ в качестве субстрата. Чистоту культур проверяли микроскопически, а также геносистематическими методами. Микроскопия. Наблюдение за ростом и подсчет клеток проводили с помощью светового микроскопа Микмед-1 (ЛОМО, Россия) и Olympus CX-41 (Япония). При наличии в среде Fe(III) его нерастворимые в воде формы растворяли в оксалатном буфере (Гаврилов и др., 2003), разведение учитывали при подсчете. Тонкое строение клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963), с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Япония). Целлюлазная активность. Целлюлазную активность коллекционных и выделенных в данной работе штаммов детектировали на агаризованных средах и методом зимографии с использованием красителя Конго красного. Определение концентрации редуцирующих сахаров, высвободившихся в ходе гидролиза целлюлозы, определяли динитросалициловым методом (ДНС, DNS). Хемотаксономические методы Состав жирных кислот, фосфолипидов и хинонов микроорганизмов определяли, как это описано в публикации (5). чистых культур Геносистематические методы. Выделение ДНК проводили согласно Park, 2007. Очистку ПЦР продуктов из реакционной смеси или агарозного геля проводили с помощью коммерческого кита фирмы Евроген (Россия). Содержание Г+Ц пар оснований в ДНК определяли по кривым плавления (Marmur & Doty, 1962) или по данным анализа полного генома. ДНК-ДНК гибридизацию проводили методом оптической реассоциации (De Ley et al., 1970). Амплификацию генов 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ) и секвенирование полученных ампликонов проводили согласно описанным ранее методикам (Kublanov et al., 2009). Сравнение генов 16S рРНК с последовательностями, представленными в базах данных GenBank и EzTaxon server (Kim et al., 2012), проводили с помощью алгоритма BLAST (Altshul et al., 1990). Построение филогенетических дендрограмм проводили с помощью различных алгоритмов, заложенных в программах MEGA 4 и MEGA 5.05 (Tamura et al., 2007, 2011) и ARB (Ludwig et al., 2004). 7 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Разнообразие анаэробных целлюлолитических прокариот и первичная характеристика их целлюлаз Поиск и выделение термофильных целлюлолитических микроорганизмов проводили, используя в большинстве случаев образцы свежих проб и полевые накопительные культуры, полученные в ходе рейсов и экспедиций в 2008-2012 гг. в области с высокой геотермальной активностью – Камчатка, Кунашир, Байкальская рифтовая зона, Азорские острова, Срединно-Атлантический хребет, бассейн Гуаймас (Табл. 1). Кроме того, для посева использовались свежие образцы воды из нефтепоисковых скважин Томской области (отбор в 2009 и 2012 гг.), а также две пробы осадков, отобранные ранее (экспедиции 2005 г. на о-в Кунашир и 2003 г. в Байкальский регион). Как правило, выбор проб для выделения целлюлолитических микроорганизмов определялся наличием в месте отбора высшей растительности с признаками ее активного разложения либо мощных микробных обрастаний. Первичную оценку роста и активности целлюлолитических прокариот в накопительных культурах проводили, учитывая урожай клеток при росте на различных типах целлюлозы и используя метод зимографии для определения активности целлюлаз, вырабатываемых микроорганизмами. В последнем случае в качестве положительных контролей были использованы экстремально термофильные целлюлолитические микроорганизмы Dictyoglomus thermophilum, штамм 1445d и Caldicellulosiruptor kronotskyensis штамм 2002, выделенные ранее в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ. В результате для ряда накопительных культур методом зимографии была продемонстрирована активность эндоглюканаз, что в дальнейшем способствовало выделению из них чистых культур целлюлолитиков. Так, например, связанные с клетками целлюлазы удалось детектировать в полевых накопительных культурах 2319opik, 2310opik и 2307opik, полученных непосредственно в горячих источниках о-ва Кунашир в 2011 г. (Рис. 1). В лабораторных условиях из них были выделены штаммы целлюлолитических бактерий родов Caldicellulosiruptor, Fervidobacterium, Dictyoglomus (Табл. 1). Стоит отметить, что в целом, для накопительных культур была характерна высокая активность в образцах клеток и значительно меньшая в супернатанте, что хорошо соотносится с литературными данными об ассоциированности целлюлаз большинства анаэробных прокариот с клетками (Lynd et al., 2002). Кроме того, характерным было то, что детектируемые методом зимографии эндоглюканазы обладали более высоким оптимумом активности по сравнению с вырабатывающими их продуцентами. Наглядным примером может служить штамм 2319opik, для которого нами было показано, что вырабатываемые эндоглюканазы, ассоциированные с клеточными стенками, активны при температуре 85ºС, а максимум роста для штамма – 75ºС. Более того, после прогревания при 96ºС в течение 10 мин активность данных ферментов снижалась незначительно. Тем не менее, после прогревания при 96оС в течение 30 мин ферменты инактивировались полностью. (Рис. 2). Таким образом, исследование целлюлазной активности накопительных культур и выделенных в данной работе штаммов термофильных микроорганизмов позволило обнаружить ряд 8 закономерностей и показало эффективность использования метода зимографии как ценного инструмента выявления наиболее активных целлюлолитических агентов. Рисунок 1. Зимограмма. Субстрат КМЦ. Инкубация 2 часа, при 75°C в 40 мМ Трис, рН 8.8, 5 мМ CaCl2. Всего из образцов воды, осадков и матов различных по физико-химическим характеристикам термальных источников удалось выделить 30 штаммов анаэробных микроорганизмов, способных расти на целлюлозе и ее производных (Табл. 1). По физиологии они существенно отличались между собой: среди них присутствовали 4 мезофильных (оптимум роста в области умеренных температур) бактерии и 26 термофильных (оптимум роста выше 50°С) прокариот, в том числе 6 штаммов гипертермофильных (оптимум роста выше 80°С), 18 штаммов экстремально термофильных (оптимум роста выше 65°С) и 2 штамма умеренно термофильных (оптимум роста выше 50°С) микроорганизмов. Большинство изолятов принадлежали к группе строгих анаэробов, однако, для 2 штаммов был характерен факультативно анаэробный образ жизни. По отношению к рН среди выделенных микроорганизмов были слабо ацидофильные, нейтрофильные, а также слабо алкалофильные представители. С точки зрения филогении полученные Рисунок 2. Зимограмма. Субстрат КМЦ. штаммы относились к 6 глубоким Инкубация 1 час, при 85°C в 50 мМ МОПС, филогенетическим линиям - археям типа рН 7.43, 5 мМ CaCl2. Образцы прогревали Crenarchaeota и бактериям типов при 96°С в течение 30 мин либо не Thermotogae, Dictyoglomi, Firmicutes, прогревали. Chloroflexi и нового типа – ‘Ignavibacteriae’. 9 Таблица 1. Основные характеристики штаммов, исследованных в данной работе. Штамм Источник выделения 1865 Долина гейзеров, Камчатка Паужетка, ВТП, Камчатка Ист-ки «Дачные», Камчатка Кунашир, Столбовские ист-ки Паужетка, ВТП, Камчатка СрединноАтлантический хребет Бассейн Гуаймас (Калифорн. залив) Кунашир, «Горячий пляж» 1903 2143opik3 2307opik-2 1910a ik275mar2 Rift-s3 1445t 1868 2205c)opik 2310opik-2 1864opik 1944 1923 2307opik Долина гейзеров, Камчатка Азоры, Португалия Кунашир, Столбовские ист-ки Долина гейзеров, Камчатка Паужетка, «Речки», Камчатка Паужетка, террит. поселка, Камчатка Кунашир, Столбовские ист-ки Т опт, °С, рН опт 92, 6.0 Субстраты для роста Вид Ближайший родственник КМЦ1 Desulfurococcus sp. D. kamchatkensis 92, 5.5 КМЦ -//- -//- 99 92, 6.5 МКЦ, КМЦ -//- -//- 99 90, 7.0 КМЦ -//- D. amylolyticus 99 85, 6.0 МКЦ Fervidicoccus sp. F. fontis 99.8 70, 6.6 МКЦ, КМЦ, ФБ, Thermosipho affectus крахмал, декстрин sp. nov. T. melanesiensis 94.5 65, 6.5 МКЦ, КМЦ T. atlanticus 96.5 65, 7.8 МКЦ, КМЦ, ФБ, АМЦ, опилки, ксилан, крахмал МКЦ ‘Thermosipho activus’ sp. nov. Fervidobacterium riparium sp. nov. F. gondwanensis 98.3 Fervidobacterium sp. F. riparium 99 65, 8.0 % сходства Тип по гену 16S рРНК 99 Crenarchaeota 65, 7.0 70, 6.57.0 80, 7.8 МКЦ МКЦ, КМЦ, ФБ -//-//- F. nodosum -//- 99 99 МКЦ T. hypogea 97.4 75, 7.8 КМЦ, МКЦ, АМЦ 'Thermotoga agilis', sp. nov. Dictyoglomus sp. D. thermophilum 99.9 75, 7.0 КМЦ, МКЦ, ФБ -//- -//- 99.9 75, 7.5 МКЦ, ксилан -//- -//- 99 10 Thermotogae Dictyoglomi 2320opik 1809Bl 2310opik 1023p 1866opik 2319opik 2320opik-2 1943opik 2321opik P3M-3 KK-282 KK-28 P3M-1 P3M-2 Par-f-1 Кунашир, «Горячий пляж» Байкал, Гарга Кунашир, Столбовские источники Байкал, Баргузин. долина, Гусиха. Долина гейзеров, Камчатка Кунашир, «Горячий пляж» -//Паужетка, «Под пиком», Камчатка Кунашир, кальдера Головнина Мат, Парабель, Томск Древесная труха, Подмосковье -//Мат, Парабель, Томск -//- 75, 7.5 МКЦ, СМС -//- -//- 60, 7.0 70, 6.2 ФБ, МКЦ, ксилан КМЦ, МКЦ, ФБ, бамбук T. gondwanense С. lactoaceticus 99.9 97.8 70, 7.5 ФБ, МКЦ, АМЦ C. acetigenes 99.3 75, 7.0 МКЦ, Thermovenabulum sp. 'Caldicellulosiruptor kunashiriensis’ sp. nov. Caldicellulosiruptor sp. -//- C. hydrothermalis 99 75, 7.0 МКЦ, КМЦ, ФБ -//- С. lactoaceticus 99 70, 7.0 75, 6.0 МКЦ МКЦ -//Caldanaerobacter sp. 99 98.8 65, 6.2 37, 7.58.0 37, 8.0 МКЦ, КМЦ, ФБ, кукурузные листья МКЦ, КМЦ, ФБ, целлобиоза МКЦ, КМЦ C. aminovalericum 94 C. phytofermentans 94 37, 7.5 МКЦ Thermoanaerobacter sp. 'Clostridium parabelense’ sp.nov. 'Clostridium arboreum’ sp. nov. Bacillus sp. -//C. subterraneus subsp. tengcongensis Т. uzonensis 99.4 42-45, 7.5-8.0 52-55, 7.5 МКЦ, целлобиоза B. thermoamilovorans Levilinea saccharolytica Ignavibacterium album МКЦ, КМЦ, ксилан, лихенан, агароза, крахмал МКЦ, КМЦ, Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov. ‘Melioribacter roseus’ gen. nov., sp. nov. ‘Melioribacter’ sp. 99 Firmicutes 98 92.8 Chloroflexi 90.8 ‘Ignavibacteriae’ Вода из скважины, 54, 7.099.9% ‘M. roseus’ Парабель, Томск 7.5 1 – Сокращения: МКЦ – микрокристаллическая целлюлоза, КМЦ – карбоксиметилцеллюлоза, ФБ – фильтровальная бумага, АМЦ – аморфная целлюлоза, ВТП – Верхнее термальное поле 2 - жирным шрифтом обозначены представители новых таксонов 11 Гипертермофильные археи, выделенные на микрокристаллической и карбоксиметилцеллюлозе, принадлежали родам Desulfurococcus и Fervidicoccus. Экстремально и гипертермофильные бактерии были представлены организмами, хорошо известными своими целлюлолитическими способностями (роды Caldicellulosiruptor, Dictyoglomus), а также бактериями порядка Thermoanaerobacterales, для которых ранее только в одной работе была показана способность расти на целлюлозе (Kublanov et al., 2009). Кроме того, из наземных, подземных и морских мест обитания были выделены умеренно термофильные и термотолерантные бактерии типа Firmicutes (Табл. 1), что расширяет наши представления о физиологии и распространении уже известных ранее организмов – Thermovenabulum gondwanense и Bacillus thermoamilovorans. Повсеместная распространенность бактерий этого типа и их способность расти в широком диапазоне температур (от 20 до 85°С) может свидетельствовать о существенном вкладе данных бактерий в процесс разложения органического вещества, в том числе целлюлозы, в анаэробных условиях. Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК выделенных в работе целлюлолитических микроорганизмов показал, что 9 из 30 штаммов представляют новые таксоны разного уровня (Табл. 1). Все эти микроорганизмы принадлежали домену Бактерии и являлись представителями 4 типов. Новыми представителями типа Thermotogae оказались гипертермофильная бактерия ‘Thermotoga agilis’, штамм 1864opik и экстремально термофильная бактерия ‘Thermosipho activus’, штамм Rift-s3. Ближайшими родственными организмами для изолятов были Thermotoga hypogea (97% сходства по генам 16S рРНК) и Thermosipho atlanticus (96.5% сходства по генам 16S рРНК), соответственно. Оба штамма имели типичную для представителей родов морфологию и являлись строго анаэробными хемоорганогетеротрофными организмами, что характерно для всех Thermotogae. Однако в нашей работе впервые для представителей рода Thermotoga удалось продемонстрировать рост штамма 1864opik на микрокристаллической целлюлозе, а для представителей рода Thermosipho рост штамма Rift-s3 на хитине, пектине и ксилане. Представителями новых таксонов типа Firmicutes оказались экстремально термофильный штамм 2310opik (ближайший родственник – Caldicellulosiruptor lactoaceticus, 97.8% сходства по генам 16S рРНК) и два термотолерантных штамма Р3М-3 и КК-282, для которых ближайшими родственниками оказались бактерии рода Clostridium - C. aminovalericum (94% сходства по генам 16S рРНК) и C. phytofermentans (94% сходства по генам 16S рРНК), соответственно. Для остальных 4 термофильных анаэробных целлюлолитических бактерий, которые к настоящему моменту валидно описаны нами как представители новых таксонов, подробные характеристики будут приведены ниже. Таким образом, наши данные свидетельствуют о большом разнообразии анаэробных термофильных целлюлолитических прокариот в различных термальных местах обитания. При этом в процессе разложения целлюлозы в диапазоне температур 45-92ºС принимают участие как бактерии, так и археи, хотя разнообразие целлюлолитических архей значительно уступает бактериальному. 2. Характеристика Thermosipho affectus sp. nov., штамм ik275marT Чистая культура ik275marT была выделена из накопительной культуры, полученной в ходе рейса R/V Revelle (июль-август 2008) в район Срединно-Атлантического хребта. Клетки штамма представляли собой короткие, неподвижные палочки, окруженные «чехлом» из внешней мембраны («тогой») (Рис. 3). Длина клеток варьировала в пределах 1.2-6.0 мкм, 3. Электронная ширина – 0.4-0.9 мкм. Часто наблюдали Рисунок микроскопия клеток штамма образование цепочек, содержащих до 11 клеток. T (негативное ik275mar Клеточная стенка – грамотрицательного типа. контрастирование). Шкала, 1 мкм. Образование спор не обнаружили. Штамм ik275marT рос в интервале температуры от 37 до 75ºС, рН 5.6-8.2 и солености среды 10-55 г/л NaCl. Оптимальный рост штамма наблюдали при температуре 70ºС, рН 6.6 и концентрации 20 г/л NaCl (Рис. 4). Минимальное время удвоения в оптимальных условиях, при росте на мальтозе составляло 32 мин. Рост поддерживался как на восстановленной (с добавлением Na2S*9H2O), так и на невосстановленной среде. 65 60 Время удвоения, мин Время удвоения, мин 400 350 300 250 200 150 100 50 55 50 45 40 35 30 25 0 40 50 60 70 4,5 80 5,5 6,5 7,5 8,5 pH Т, ºС Рисунок 4. Зависимость скорости роста штамма ik275marT от температуры и рН. Субстрат для роста – мальтоза. Линия тренда полиномиального типа. Штамм ik275marT использовал для роста следующие субстраты: дрожжевой экстракт, мясной экстракт, глюкозу, мальтозу, сахарозу, крахмал, декстрин, МКЦ, КМЦ и фильтровальную бумагу (Рис. 5). Штамм сбраживал глюкозу до ацетата, молекулярного водорода и углекислоты. Элементная сера, сульфат и тиосульфат натрия не стимулировали рост штамма на МКЦ, в то время как сульфит натрия ингибировал его. 13 Рисунок 5. Рост штамма ik275marT на целлюлозе и ее производных. Штамм ik275marT культивировали 15 часов в оптимальных условиях на минеральной среде, содержащей 0.1 г/л дрожжевого экстракта (фон). Урожай клеток на мальтозе (положительный контроль) составил (5.3±0.3)*107 кл/мл. 5,5 7 клетки/мл (*10 ) 4,5 3,5 2,5 1,5 0,5 -0,5 фон КМЦ целлобиоза МКЦ ФБ Субстрат Филогенетический анализ, основанный на сравнении гена 16S рРНК исследуемого штамма и родственных организмов, показал, что он относится к роду Thermosipho и является новым видом этого рода – T. affectus sp. nov. (94,5% сходства по генам 16S рРНК) (Рис. 6). Содержание Г+Ц пар оснований в ДНК штамма составляло 27 мол %. Рисунок 6. Филогенетическое положение штамма ik275marT и других представителей рода Thermosipho, определенное на основе сравнения генов 16S рРНК. Дендрограмма построена при помощи Neighbour-joining метода (Saitou & Nei, 1987). Thermotoga maritima, штамм MSB8 использован в качестве репера. Достоверность ветвления (bootstrap test) определяли при 1000 повторах. Среди бактерий данного рода ранее не были описаны целлюлолитические представители, следовательно, нам удалось расширить представления о метаболических способностях представителей рода Thermosipho и разнообразии морских целлюлолитиков. Более того, в секвенированных геномах 2 штаммов разных видов (T. africanus и T. melanesiensis) не были обнаружены гены, кодирующие известные целлюлазы. Геном T. affectus в настоящее время находится в процессе секвенирования, и его последующий анализ позволит выявить гены, кодирующие целлюлазы и целлюлозосвязывающие домены, принимающие участие в процессе разложения целлюлозы. 14 3. Характеристика Fervidobacterium riparium sp. nov., штамм 1445tT Штамм 1445tT был выделен из накопительной культуры, полученной при посеве образца, отобранного с поверхности ветки, погруженной в горячий источник приливной зоны острова Кунашир – «Горячий пляж». Клетки штамма имели форму коротких, подвижных палочек, с характерными Рисунок 7. Электронная «вздутиями» клеточной стенки на одном конце микроскопия клеток штамма клетки (Рис. 7). Длина клеток варьировала в 1445tТ (ультратонкие срезы). пределах 1.0-3.0 мкм и достигала 6 мкм при Шкала, 1 мкм. росте культуры в щелочных условиях (рН 9.0). Ширина клеток составляла 0.4-0.5 мкм. Можно было также наблюдать образование цепочек, содержащих до 17 клеток. Изолят 1445tT рос в пределах температуры 4680ºС, рН 5.7-9.0 и солености среды менее 20 г/л NaCl. Оптимальный рост штамма наблюдали при температуре 65ºС, рН 7.8 (Рис. 8) и в отсутствие NaCl в среде. Минимальное время удвоения в оптимальных условиях, при росте на глюкозе составляло 55 мин. 125 Время удвоения, мин Время удвоения, ч 18 16 14 12 10 8 6 4 2 120 115 110 105 100 95 90 85 80 0 40 50 60 70 80 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 pH Т, ºС Рисунок 8. Зависимость скорости роста штамма 1445T от температуры и рН. Субстрат для роста – КМЦ. Линия тренда полиномиального типа. Штамм 1445tT рос только в анаэробных условиях и использовал следующие субстраты: пептон, дрожжевой экстракт, пируват, глюкозу, ксилозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, целлобиозу, крахмал, ксилан, МКЦ, КМЦ, аморфную целлюлозу, фильтровальную бумагу и березовые опилки (Рис. 9). Продуктами брожения при росте на глюкозе штамма 1445tT были ацетат, молекулярный водород и углекислый газ. Также были детектированы следы пропионата, бутирата и изобутирата. Элементная сера оказывала стимулирующее влияние на рост штамма на КМЦ, при этом было отмечено образование сульфида. Сульфат и тиосульфат натрия не оказывали влияния, а сульфит натрия ингибировал рост штамма. 15 Рисунок 9. Рост штамма 1445tT на целлюлозе, ее производных и ксилане. Штамм 1445tT инкубировали 36 ч в оптимальных условиях на минеральной среде, содержащей 0.1 г/л дрожжевого экстракта (фон). 4,5 7 Клетки/мл (*10 ) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 фон опилки КМЦ МКЦ ФБ ксилан Субстрат Филогенетический анализ, основанный на сравнении генов 16S рРНК исследуемого штамма и родственных организмов, показал, что процент сходства с последовательностью ближайшего родственного организма – Fervidobacterium gondwanense – составляет 98.3% (Рис. 10). Уровень ДНК-ДНК гибридизации между штаммом 1445tT и F. gondwanense не превышал 20%. Рисунок 10. Филогенетическое положение штамма 1445T и других представителей рода Fervidobacterium, определенное на основе сравнения генов 16S рРНК. Дендрограмма построена при помощи Neighbour-joining метода (Saitou & Nei, 1987). Thermotoga maritima MSB8 использован в качестве репера. Достоверность ветвления (bootstrap test) определяли при 1000 повторах. Ранее были опубликованы данные о способности двух представителей рода Fervidobacterium – F. islandicum и F. gondwanense - к росту на целлюлозе (Huber et al., 1990; Andrews & Patel, 1996). Однако последующие работы их опровергли (Andrews & Patel, 1996; Podosokorskaya et al., 2011). Вместе с тем, проведенный нами анализ 2 секвенированных геномов представителей рода выявил у F. nodosum и F. pennivorans присутствие эндоглюканаз, однако, роста на целлюлозе для этих микроорганизмов показано не было. Таким образом, выделенный нами новый вид – F. riparium - является первым представителем рода Fervidobacterium, для которого показан достоверный рост на различных типах целлюлозы и, кроме того, на ксилане. Его геном также находится в процессе секвенирования, что в дальнейшем позволит выявить гены, кодирующие целлюлолитические ферменты. 16 4. Характеристика Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov., штамм Р3М-1Т Накопительная культура Р3М была получена из образца мата, образующегося на деревянном желобе, заполняемом горячей (47°С) водой из скважины (глубина 2775 м) (Парабельский район, Томская область). Штамм Р3М-1Т удалось выделить из накопительной культуры Р3М серией последовательных разведений на пресной модифицированной среде Видделя с МКЦ в качестве субстрата. Морфологически штамм Р3М-1T представлял собой прямые или изогнутые многоклеточные нити, длиной от 15 мкм до 200 мкм и более и шириной 0.3-0.7 мкм (Рис. 11). Клеточная стенка грамотрицательного типа. При росте на глюкозе или дрожжевом экстракте наблюдали образование видимых хлопьевидных структур, состоящих из переплетенных нитей, и биопленок. Подвижность и споры обнаружены не были. Штамм Р3М-1Т являлся строго анаэробным организмом. Слабый рост наблюдали на невосстановленной среде, однако, в микроаэробных (2% кислорода) условиях он полностью прекращался. Штамм Р3М-1Т рос в диапазоне температур от 20 до 50°С, рН 6.5-9.0 и Рисунок 11. Световая микроскопия Т концентрации NaCl до 5 г/л. Оптимальными клеток штамма P3M-1 . Шкала, 10 условиями для роста были 42-45°С, рН 7.5-8.0 и мкм. 1 г/л NaCl. Минимальное время удвоения в оптимальных условиях, при росте на глюкозе составляло 6 часов. Присутствие в газовой фазе водорода в высокой (>20%) концентрации ингибировало рост штамма Р3М-1T, при этом полного ингибирования не происходило даже при 100% водорода. Необходимым условием роста штамма было добавление в среду дрожжевого экстракта в концентрации 0.05 г/л. Изолят Р3М-1Т использовал для роста следующие субстраты: дрожжевой экстракт, мясной экстракт, гидролизат казеина, глюкозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу и микрокристаллическую целлюлозу. Основными продуктами сбраживания глюкозы штаммом Р3М-1T были водород, ацетат и этанол. В небольших количествах наблюдалось также образование лактата и формиата. Присутствие в среде культивирования элементной серы, сульфата, тиосульфата и нитрата натрия, а также оксида кристаллического железа (III) не влияло на рост штамма на МКЦ. В составе клеточной стенки преобладали изо-С15:0 (39.3%) и антеизо-С15:0 (24.3%) жирные кислоты. Хиноны у штамма Р3М-1T отсутствовали. Преобладающими фосфолипидами оказались неизвестные аминофосфогликолипиды и гликофосфолипиды. Кроме того, были детектированы неизвестные фосфолипид и гликолипид. Размер генома штамма Р3М-1Т составил 4.3 Мб. Содержание Г+Ц пар в ДНК 55 мол %. Штамм KIBI-1T мезофильной строго анаэробной бактерии Levilinea saccharolytica был филогенетически наиболее близок (сходство генов 16S рРНК – 92.8% (Рис. 12). 17 Морфологические и физиологические особенности штамма Р3М-1T в совокупности с данными филогенетического анализа позволили описать его как представителя нового рода – Ornatilinea apprima. Кроме того, это первый представитель класса Anaerolinea, для которого была показана способность расти на целлюлозе, в том числе микрокристаллической. Рисунок 12. Филогенетическое положение штамма Р3М-1T и других представителей типа Choloroflexi, определенное на основе сравнения генов 16S рРНК. Дендрограмма построена при помощи Neighbour-joining метода (Saitou & Nei, 1987). Последовательности Deinococcus radiodurans DSM20539T и Thermus aquaticus YT-1Tиспользованы в качестве репера. Достоверность ветвления (bootstrap test) определяли при 1000 повторах. 5. Характеристика ‘Melioribacter roseus’ gen. nov., sp. nov., штамм P3M-2T Штамм Р3М-2Т был выделен из накопительной культуры Р3М, описанной выше, на аналогичной среде, но с КМЦ в качестве субстрата. Морфологически штамм представлял собой прямые или слегка искривленные палочки, 0.65-10 мкм в длину и 0.25-0.35 мкм в ширину (Рис. 13А). Подвижность наблюдали только в ранней экспоненциальной фазе роста. Характерной особенностью было образование крупных розеток и биопленок (Рис. 13Б), формирующихся за счет синтеза полисахаридного матрикса, который прокрашивался Конго красным (Bernardet et al., 1996). Данные электронной микроскопии подтвердили наличие жгутиков и экзополисахаридов и, кроме того, были обнаружены включения запасных веществ. Клеточная стенка грамотрицательного типа. Споры не обнаружены. 18 А) Б) Рисунок 13. (А) Электронная микроскопия клеток штамма P3M-2Т (ультратонкие срезы). Шкала, 1 мкм. (Б) Биопленки штамма P3M-2Т. Шкала, 2 см. Рост культуры наблюдали при температуре от 35°С до 60°С, в диапазоне рН 6.0-8.7, оптимальными значениями были 52-55°С и 7.5, соответственно. Штамм Р3М-2Т был способен расти в среде, не содержащей хлорида натрия, и выдерживать до 60 г/л NaCl, при этом оптимальная концентрация составляла 6 г/л. При проверке отношения штамма Р3М-2Т к кислороду оказалось, что он является факультативным анаэробом. Минимальное время удвоения при росте на КМЦ в анаэробных условиях составляло 2.5 ч, в полностью аэробных – 30 мин. Каталазная и оксидазная реакция были положительными. В присутствии кислорода клетки штамма окрашивались в розовый цвет за счет синтеза каротиноидов, которые выявлялись по характерным пикам при длине волны 467, 492, 523 нм (Рис. 14). Бактериохлорофиллы обнаружены не были. Помимо кислорода, при росте на ацетате штамм Р3М-2Т использовал в качестве акцепторов электронов нитрит, арсенат и ферригидрит (Рис. 15). Элементная сера, тиосульфат и нитрат не стимулировали рост штамма, а сульфит его ингибировал. 0,4 0,35 Поглощение 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 350 450 550 650 750 850 950 1050 1150 Длина волны, нм Рисунок 14. Спектр поглощения пигментов штамма Р3М-2Т. 19 Рисунок 15. Образование магнетита штаммом Р3М-2Т при росте на ацетате+Fe(III). Присутствие цитохрома типа С в мембранной фракции клеток штамма Р3М-2Т, выращенных на КМЦ в полностью аэробных условиях, было обнаружено спектрофотометрически по характерным пикам при 409 нм (окисленная форма) и при 422, 526 и 552 нм (восстановленная форма). Показано полное восстановление цитохрома С раствором дитионита (0.1 мМ) и последующее полное его окисление кислородом (либо 30%-ное в случае с 3 мМ ферригидритом). При добавлении 0.05 г/л дрожжевого экстракта в качестве источника факторов роста изолят использовал широкий спектр органических соединений, включая различные полисахариды: МКЦ, КМЦ, ксилан, крахмал, лихенан, декстран и др. Основными детектируемыми продуктами брожения штамма Р3М-2Т на глюкозе были водород, СО2 и ацетат. Наблюдали также образование лактата в следовых количествах. Целлюлазную активность умеренно термофильной бактерии нового типа 'M. roseus’, штамм Р3М-2Т изучали с использованием ДНС метода, зимографии и агаризованных чашек с КМЦ в качестве субстрата. Используя твердые агаризованные среды с применением Рисунок 16. Детекция целлюлазной активности Т Конго красного в качестве красителя, в штамма Р3М-2 по появлению зон просветления аэробных условиях удалось на агаризованной (1.5%) среде. Субстрат, КМЦ. 21 час, при 54 °С. Окраска Конго детектировать активность Инкубация красным. Слева – отрицательный контроль, целлюлолитических ферментов в справа – образец клеток штамма Р3М-2Т. образцах клеток штамма (Рис. 16); в супернатанте активность не была обнаружена. Это было также подтверждено методами ДНС и зимографией. Методом зимографии было установлено, что присутствие хлорида кальция не являлось обязательным для поддержания активности целлюлолитических ферментов штамма Р3М-2Т при экстремальных значениях температуры. Кроме того, целлюлазы были активны в присутствии хлорида натрия в концентрации от 0 до 100 мМ, что хорошо соотносится с ростовыми экспериментами. Для отделения целлюлаз от поверхности клеточных стенок были опробованы различные химические агенты: 1% додецилсульфат натрия (ДСН), 9M мочевина, 2.5% Tритон Х-100, 1 M NaCl. Во всех случаях были получены положительные результаты (Рис. 17). Рисунок 17. Зимограмма. Субстрат КМЦ. Инкубация 3 часа, при 52°C в 50 мМ Трис, рН 8.8. (а) – клетки, выращенные в аэробных условиях (б) - клетки, выращенные в анаэробных условиях Контроль – образцы нативных клеток 20 n(1%) суп Проверка термостабильности целлюлаз штамма Р3М-2Т при температурах, превышающих максимум роста микроорганизма-продуцента (60°С), показала, что исследуемые гидролитические ферменты в равной степени активны при 60°С и 80°С (Рис. 18) и, более того, выдерживают прогревание при 96°С в течение 10 минут. А) Б) Рисунок 18. Зимограммы. Субстрат КМЦ Инкубация 1 час, в 50 мМ Трис, рН 8.8 при 60°C (А) и при 80°C (Б). Сокращения: суп – супернатант, кл-ки – клетки. Отметим, что штамм Р3М-2Т вырабатывал целлюлолитические ферменты не только при росте на целлюлозе и ее производных, но также и при росте на простых моно- и дисахаридах и белках после многократных последовательных пересевов на эти субстраты (Рис. 19). Таким образом, можно предположить, что выработка некоторых из детектируемых целлюлаз для штамма Р3М-2Т может носить конститутивный характер. Рисунок 19. Зимограмма. Субстрат КМЦ. Инкубация 1 час, при 70°C, в 50 мМ Трис, рН 8.8. Фермент смыт Triton-X100 (0.5%). 1) клетки, выращенные на арабинозе 2) клетки, выращенные на мальтозе 3) клетки, выращенные на КМЦ (положительный контроль) Преобладающими жирными кислотами для штамма Р3М-2Т были изо-С15:0 (18.7 %), антеизо-С15:0 (15.7 %) и С16:0 (9.9 %). Основными детектированными фосфолипидами были 4 неизвестных аминофосфолипида, фосфотидилхолин и неизвестный фосфолипид. Преобладающим дыхательным хиноном был МК-7. 21 Рисунок 20. Филогенетическое положение штамма P3M-2T, определенное на основе сравнения генов 16S рРНК. Дендрограммы построены при помощи Maximal Likelihood метода (Tamura et al., 2004). Borrelia turicatae 91E135 (Spirochaetes) использована в качестве репера. Достоверность ветвления (bootstrap test) определяли при 1000 повторах. 22 Размер генома штамма Р3М-2Т составил 3.3 Мб. Содержание Г+Ц пар в ДНК 41.3 мол %. Наиболее близкородственным организмом был хемогетеротрофный, умеренно термофильный микроорганизм Ignavibacterium album, штамм Mat9-16T. Процент сходства генов 16S рРНК составил 90.8% (Рис. 20). Ранее I. album был описан как представитель нового класса Ignavibacteria внутри типа Chlorobi (Iino et al., 2010). Однако по фенотипическим признакам микроорганизмы этой группы резко отличаются от всех других представителей типа (отсутствие хлоросом, факультативно анаэробный и хемогетеротрофный образ жизни, подвижность за счет жгутиков, способность к разложению полисахаридов, а также состав жирных кислот и содержание Г+Ц пар). Эти данные коррелируют и с данными филогенетического анализа (процент сходства по генам 16S рРНК ниже 85% (Hugenholtz et al., 1998); кластеризация I. album, 'M. roseus’ и ближайших клонов по генам 16S рРНК, 23S рРНК и RecA в отдельную глубокую филогенетическую ветвь, описанную ранее как ZB-1 (Elshahed et al., 2003); распределение ближайших гомологов всех белков протеома). На основании этих данных мы предложили выделить класс Ignavibacteria в отдельный тип ‘Ignavibacteriae’. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В пробах из наземных, подземных и морских местообитаний проведен поиск анаэробных термофильных микроорганизмов, способных разлагать целлюлозу, что привело к выделению чистых культур архей и бактерий различных филогенетических групп. Несмотря на редкую встречаемость этого свойства у микроорганизмов (Zverlov & Schwarz, 2008), целенаправленный поиск целлюлолитических прокариот позволил обнаружить новые организмы и расширить представления о распространении и физиологии уже известных таксонов. Использование целлюлозы в качестве субстрата и детекция целлюлазной активности в первичных накопительных культурах методом зимографии способствовали успешному получению штаммов активных целлюлолитиков. Установлено, что активность целлюлаз выделенных микроорганизмов, как правило, связана с клеточными фракциями штаммов-продуцентов. Температурный оптимум активности целлюлаз обычно более высокий, чем температурный оптимум роста вырабатывающих их микроорганизмов. Выделенные нами представители экстремально и гипертермофильных целлюлолитических прокариот относились к типам Crenarchaeota, Thermotogae, Dictyoglomi, Firmicutes. Для представителей типа Thermotogae нами впервые была показана способность расти на микрокристаллической целлюлозе. Полностью описаны два новых вида облигатно анаэробных бактерий – Thermosipho affectus и Fervidobacterium riparium. Обе бактерии являются первыми целлюлолитическими представителями своих родов. Кроме них, выделены еще два целлюлолитических представителя родов Thermosipho и Thermotoga, также представляющие новые виды. Выделены новые умеренно термофильные и термотолерантные целлюлолитические бактерии Ornatilinea apprima и ‘Melioribacter roseus’, относящиеся к типу Chloroflexi и новому, предложенному нами типу ‘Ignavibacteriae’, соответственно. Обе бактерии обитали в микробном мате, 23 развивающемся под током глубинной термальной воды, и росли на микрокристаллической целлюлозе, являясь первыми целлюлолитическими представителями своих классов. Кроме того, и для O. аpprima, и для ‘M. roseus’ была показана повышенная способность к формированию биопленок, изучение которых может стать важным этапом для понимания их роли в процессе гидролиза целлюлозы (Alonso, 2007; Wang et al., 2011). Отличительные черты ‘M. roseus’ - толерантность к высоким концентрациям хлорида натрия, широкий спектр гидролизуемых полисахаридов и факультативно анаэробный образ жизни. Известно, что за редким исключением мезофильных представителей, целлюлолитики являются либо аэробами, либо строгими анаэробами. Этот феномен связывают с невозможностью сочетания различных механизмов гидролиза целлюлозы, присущих аэробам и анаэробам (Lynd et al., 2002). Более того, среди термофилов факультативно анаэробные целлюлолитические организмы раньше не были обнаружены, и ‘M. roseus’ является, по-видимому, первым описанным представителем данной физиологической группы. Кроме того, обнаружение конститутивного характера синтеза эндоглюканаз штаммом Р3М-2Т представляет большой интерес, так как большинство целлюлаз являются индуцибельными ферментами (Sukumaran et al., 2005). Способность ‘M. roseus’ использовать целлюлозу как субстрат, а также ферригидрит и нитрит в качестве акцепторов электронов существенным образом отличает его от ближайшего родственника – Ignavibacterium album, описанного ранее как представитель нового класса Ignavibacteria внутри типа Chlorobi. Детальный анализ физиологических особенностей и филогенетического положения представителей класса позволил нам предложить выделение его в новый тип ‘Ignavibacteriae’, включающий класс Ignavibacteria, порядок Ignavibacterales и два семейства Ignavibacteraceae и ‘Melioribacteraceae’. Исследование вопроса эволюционных преобразований, которые претерпевал предковый организм, в ходе формирования 3 «сестринских» филогенетических линий – Chlorobi, Bacteroidetes и ‘Ignavibacteriae’ - является актуальной задачей будущей работы. Таким образом, в результате проведенного исследования выявлено значительное разнообразие целлюлолитических прокариот в термальных местах обитания. Полученные данные расширяют представления о физиологии, распространении и роли, которую играют целлюлолитические прокариоты в природе, где их субстратом может являться растительность, поступающая из окружающих низкотемпературных зон. ВЫВОДЫ 1. Обнаружено высокое таксономическое разнообразие анаэробных целлюлолитических прокариот в термальных источниках различного происхождения c температурой от 45 до 92ºС. Среди архей к росту на целлюлозных субстратах оказались способными представители типа Crenarchaeota, среди бактерий – представители типов Thermotogae, Dictyoglomi, Firmicutes, Chloroflexi и нового типа ’Ignavibacteriae’. 9 целлюлолитических штаммов оказались представителями новых таксонов. 24 2. Охарактеризованы 2 новых вида экстремально термофильных целлюлолитических бактерий типа Thermotogae – Thermosipho affectus и Fervidobacterium riparium. Для представителей типа впервые продемонстрирована способность расти на микрокристаллической целлюлозе. 3. Описан новый род, представленный термотолерантной целлюлолитической бактерией Ornatilinea apprima в классе Anaerolinea типа Chloroflexi. Это первый представитель класса Anaerolinea, способный расти на целлюлозе, в том числе микрокристаллической. 4. Предложен новый тип ‘Ignavibacteriae’, включающий факультативно анаэробную хемоорганотрофную умеренно термофильную целлюлолитическую бактерию нового рода и вида ‘Melioribacter roseus’ и Ignavibacterium album. На основании анализа филогенетического положения ‘M. roseus’ и его способности к росту на широком спектре полисахаридов (в том числе различных типах целлюлозы), использованию в качестве акцепторов электронов, помимо кислорода, ферригидрита и нитрита, предложено новое семейство ‘Melioribacteraceae’ внутри типа ‘Ignavibacteriae’. 5. Продемонстрирована целлюлазная активность у новых представителей типов Firmicutes, Dictyoglomi и ‘Ignavibacteriae’. Установлено, что данные организмы обладают термостабильными и связанными с клеточной стенкой эндоглюканазами. Синтез некоторых из детектированных эндоглюканаз ‘M. roseus’ может носить конститутивный характер. Список работ по теме диссертации Экспериментальные статьи и обзоры 1. Кубланов И.В. и Подосокорская О.А. Термофильные микроорганизмы, разлагающие биополимеры. (2011) Глава в сборнике «Труды Института микробиологии имени С.Н. Виноградского. Вып. 16: «Термофильные микроорганизмы», Отв. редактор В.Ф. Гальченко. М.: МАКС Пресс, 315 – 342. 2. Podosokorskaya O.A., Kublanov I.V., Reysenbach A.-L., Kolganova T.V. and BonchOsmolovskaya E.A. (2011) Thermosipho affectus sp. nov., a novel thermophilic anaerobic cellulolytic bacterium isolated from a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61, 1160 – 1164. 3. Podosokorskaya O.A., Merkel A.Yu., Kolganova T.V., Chernyh N.A., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. (2011) Fervidobacterium riparium sp. nov., a novel thermophilic anaerobic cellulolytic bacterium isolated from a Kunashir hot spring. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61, 2697-2701. 4. Podosokorskaya O.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Novikov A.A., Kolganova T.V. and Kublanov I.V. (2013) Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov., a novel cellulolytic representative of class Anaerolineae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 86-92. 5. Podosokorskaya O.A., Kadnikov V.V., Gavrilov S.N., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Merkel A.Yu., Karnachuk O.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. (2013) Melioribacter roseus gen. nov. sp. nov., a novel facultatively anaerobic thermophilic cellulolytic bacterium, and the description of a novel bacterial phylum Ignavibacteriae. Environm. Microbiol., as doi:10.1111/1462-2920.12067. 25 6. Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Podosokorskaya O.A., Gavrilov S.N., Kublanov I.V., Beletsky A., Bonch-Osmolovskaya E.A., and Ravin N.V. (2013) Genomic analysis of organotrophic facultatively anaerobic bacterium Melioribacter roseus supports a novel phylum Ignavibacteriae within Bacteriodetes/Chlorobi group. PLOS ONE. 8, e53047. Тезисы конференций 1. Подосокорская О.А., Бонч-Осмоловская Е.А., Кубланов И.В. Новые умеренно термофильные целлюлолитические бактерии филумов Chlorobi и Chloroflexi. VI Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Октябрь 2010, Москва, Россия. Сборник тезисов, стр. 54-56. 2. Podosokorskaya O.A., Kublanov I.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. New data on diversity of cellulolytic Thermotogales. International Workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", August 2010, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. Book of abstracts, p. 25. 3. Podosokorskaya O.A., Kublanov I.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Novel cellulolytic representatives of Phylum Thermotogae. 8th International congress ”Extremophiles”, September 2010, Ponta Delgada, Portugal, Book of abstracts, p. 153. 4. Podosokorskaya O.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. Thermophilic cellulolytic representative of a novel bacterial lineage within the superphylum Bacteroidetes - Chlorobi. International conference “Thermophiles”, September 2011, Big Sky, Montana, USA, Book of abstracts, p. 92. 5. Kublanov I.V., Podosokorskaya O.A., Ravin N.V., Gavrilov S.N., Lebedinsky A.V. and BonchOsmolovskaya E.A. Metabolic features of ”Melioribacter roseus” and its genomic analysis support its phylogenetic position within Bacteria. International conference “Thermophiles”, September 2011, Big Sky, Montana, USA. Book of abstracts, p. 109. 6. Podosokorskaya O.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Novikov A.A., Kolganova T.V. and Kublanov I.V. Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov., a first cellulolytic representative of class Anaerolineae. 9th International congress ”Extremophiles”, September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 140. 7. Kublanov I.V., Podosokorskaya O.A., Kadnikov V.V., Gavrilov S.N., Mardanov A.V., Merkel A.Yu, Karnachuk O.L., Ravin N.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. “Melioribacter roseus” gen. nov. sp. nov., a novel facultatively anaerobic moderately thermophilic cellulolytic bacterium and proposal of “Ignavibacteriae” phyl. nov. 9th International congress ”Extremophiles”, September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 150. 8. Gavrilov S.N, Podosokorskaya O.A., Kublanov I.V., Merkel A.Yu, Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Ravin N.V., Frank Y.A., Karnachuk O.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Metabolic versatility of “Melioribacter roseus” gives insights into the evolution and deep subsurface origin of a novel phylum “Ignavibacteriae”. 9th International congress ”Extremophiles”, September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 211. 9. Подосокорская О.А., Бонч-Осмоловская Е.А., Кадников В.В. и Кубланов И.В. Разложение целлюлозы факультативно анаэробными бактериями и их первый термофильный представитель ”Melioribacter roseus”. VII Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Октябрь 2012, Москва, Россия. Сборник тезисов, стр. 30-32. 10. Karnachuk O., Avakian M., Podosokorskaya O., Gavrilov S., Frank Yu., Gerasimchuk A., Kublanov I. and Bonch-Osmolovskaya E. Genome insight into copper homeostasis in a new phylum of Bacteria. 8th International Copper Meeting “Copper in Biology”, September-October 2012, Alghero, Italy. Book of abstracts, p. 61. 11. Kadnikov V., Mardanov A., Podosokorskaya O., Bonch-Osmolovskaya E. and Ravin N. Complete genome sequence of organotrophic bacterium Melioribacter roseus representing new phylum-level lineage affiliated with Chlorobi. 14th International Symposium on Microbial Ecology, August 2012, Copenhagen, Denmark. Book of abstracts, p. 942. 26
