HAS2, COX2, тиреоидита GREM1 К.б.н., ст.н.с. Е.А. ШЕПЕЛЬ, Т.В. БЛАШКИВ, Т.Ю. ВОЗНЕСЕНСКАЯ

Интегральная целостность генома и экспрессия генов HAS2, COX2,
GREM1 в кумулюсных клетках в условиях экспериментального
тиреоидита
К.б.н., ст.н.с. Е.А. ШЕПЕЛЬ, Т.В. БЛАШКИВ, Т.Ю. ВОЗНЕСЕНСКАЯ
Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАНУ, Киев, Украина, 01024
Цель исследования: оценить уровень повреждения ДНК и экспрессию генов в клетках кумулюсного окружения ооцитов в
условиях экспериментального тиреоидита.
Материал и методы. Экспериментальный тиреоидит у мышей вызывали ежедневным введением мерказолила (50 мг/кг).
Уровень повреждения ДНК в кумулюсных клетках определяли методом анализа ДНК комет, экспрессию генов HAS2, COX2,
GREM1 на уровне мРНК оценивали с помощью ПЦР.
Результаты. Экспериментальный тиреоидит приводит к гибели 17% кумулюсных клеток, количество клеток с поврежденной
ДНК составляет 46,2%. Наблюдалось снижение уровня мРНК GREM1 в 1,65 раза. Экспрессия HAS2 и COX2 не изменялась.
Выводы. Экспериментальный тиреоидит приводит к изменению интегральной целостности генома и экспрессии гена GREM1
в клетках кумулюсного окружения ооцитов, что может свидетельствовать о нарушении овариальной функции.
Ключевые слова: экспериментальный тиреоидит, кумулюсные клетки, экспрессия генов.
Genome integrity and HAS2, COX2, GREM1 genes expression in cumulus cells due to
experimental thyroiditis
E.A. SHEPEL, T.V. BLASHKIV, T.YU. VOZNESENSKAJA
Bogomoletz Institute of Physiology NASU, Kiev, Ukraine, 10124
Objective. To assess the level of DNA damage and gene expression of HAS2, COX2 and GREM1 in cumulus cells in mice with
experimental thyroiditis.
Material and methods. Experimental thyroiditis in mice was induced by daily administration of merkazolil (50 mg/kg). Cumulusoocyte cellular complexes (COCs) were extracted from murine ovarian follicles. Immediately following COCs retrieval, the cumulus
was stripped from the oocyte. DNA damage in cumulus cells was detected by DNA comet assay; and cumulus gene expression for
COX2, HAS2 and GREM1 at mRNA level was assessed using reverse transcription polymerase chain reaction.
Results. The results showed that experimental thyroiditis causes the death of 17% of cumulus cells. The number of cells with damaged
DNA was 46.2%. The GREM1 mRNA levels decreased in 1.65 times (р<0,05), the expression of COX2 and HAS2 did not changed.
Conclusion. The genome integrity of cumulus cells surrounding the oocyte is disrupted due to experimental thyroiditis. The change
in GREM1 gene expression can be indicator of ovarian disfunction.
Key words: cumulus cells, gene expression, experimental thyroiditis.
Нарушения функции щитовидной железы могут
стать причиной преждевременного или позднего полового созревания, расстройств менструального
цикла, ановуляции, бесплодия, невынашивания беременности, патологии плода [1, 2].
Антитела к щитовидной железе обнаруживают у
женщин с эндометриозом и бесплодием [2]. Бесплодие — одна из важных проблем у пациенток с аутоиммунным тиреоидитом [2—5]. Сегодня актуальны
исследования, направленные на выяснение возможных механизмов развития бесплодия на экспериментальных моделях с использованием животных.
Новейшие стратегии оценки профилей ооцитов,
гранулярных и кумулюсных клеток, эмбрионов и
культуральной среды, включающие геномику, транскриптомику, протеомику и метаболомику (ОМИКСтехнологии), предлагают исключительные преиму16
щества и обнаруживают скрытые на сегодня ограничения вспомогательных репродуктивных технологий
при лечении определенных видов женского бесплодия. В условиях гипофункции щитовидной железы
таким может быть повреждение интегральной целостности ДНК клеток кумулюсного окружения и,
как следствие, — низкое качество ооцитов.
Цель настоящего исследования — оценить уровень повреждения ДНК и экспрессию генов
hyaluronan synthase 2 (HAS2),
cyclooxygenase 2
(COX2), gremlin 1 (GREM1) в клетках кумулюсного
окружения ооцитов в условиях экспериментального
тиреоидита у мышей.
Для корреспонденции:
e-mail: [email protected]
Проблемы репродукции, 3, 2014
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования проведены на самках мышей линии СВА (8 нед, 16—18 г) с соблюдением всех требований по работе с лабораторными животными
(Международная Европейская конвенция по защите позвоночных животных, Страсбург, 1986). После
завершения экспериментов животным вводили
нембутал и умерщвляли методом дислокации шейных позвонков. Экспериментальный тиреоидит как
гипофункцию щитовидной железы у мышей вызывали ежедневным введением мерказолила («Здоровье», Украина) на протяжении 7 дней в дозе 50 мг/кг
[6]. Ежедневно регистрировали общее состояние,
поведение и динамику массы тела подопытных животных. Через 6 сут от момента последнего введения мерказолила у животных забирали яичники для
дальнейших исследований. Контрольным животным вводили физиологический раствор по этой же
схеме.
Объект исследования — клетки кумулюсного
окружения ооцитов мышей линии СВА.
Метод ДНК-комет для выявления повреждений
ДНК на клеточном уровне заключается в микроэлектрофорезе лизированных клеток, когда фрагментированное ядро образует на электрофореграмме своеобразный ореол, похожий на хвост кометы.
Считается, что размеры хвоста ДНК-кометы положительно коррелируют со степенью фрагментации
ДНК [7]. В качестве фактора, взаимодействующего
с ДНК и вызывающего ее повреждение, использовали антибиотик рубомицин (Московский завод
медпрепаратов, Россия). Суспензию клеток в среде
(300—400 тыс. в 1 мл) инкубировали в присутствии
различных концентраций вышеуказанных веществ
в течение 4 ч при 37 °С. Процент мертвых клеток
определяли в аликвоте с помощью теста с трипановым синим (конечная концентрация 0,1%). Электрофорез проводили при напряжении 0,6 В/см в
течение 25 мин [8]. Раствор для окраски (5% пропидиум йодид) готовили непосредственно перед
использованием. Подсчет количества комет проводили при увеличении 200—400. В образце подсчитывали не менее 500 клеток. Кометы разделяли на
5 классов в зависимости от соотношения ДНК в
«голове» и «хвосте» кометы [7].
Определение экспрессии генов HAS2, COX2 и
GREM1 на уровне мРНК в кумулюсных клетках методом полимеразной цепной реакции. Тотальную РНК
выделяли из клеток кумулюсного окружения ооцитов с помощью набора Trizol RNA-prep («Isogen»,
Россия). Обратную транскрипцию проводили, используя First Strand cDNA Synthesis Kit («Fermentas»,
Литва). Реакцию останавливали прогреванием при
70 °С в течение 10 мин, после чего пробирки переносили на лед.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Методом
ПЦР увеличивали количество фрагмента исследуемого гена. Для оценки экспрессии генов использовали по паре специфических праймеров («Fermentas»,
Литва) для генов HAS2, COX2 и GREM1 и гена GAPDH
(внутренний контроль). ПЦР проводили в термоциклере GeneAmp System 2700 («Applied Biosystems»,
США).
Полученные амплификаты разделяли горизонтальным электрофорезом в 1,5% агарозном геле в
трис-боратном буфере. Визуализацию и оценку яркости амплификата после электрофореза при 160 В в
течение 25 мин проводили с помощью трансиллюминатора и программного обеспечения Vitran («Биоком», Россия).
Статистическая обработка данных. Для статистической обработки результатов использовали пакет программ Origin 8Pro («OriginLab Corp.», North,
MA, США) и электронные таблицы Microsoft Excel
2003. Достоверность различий средних значений
определяли по t-критерию Стьюдента, достоверными считали значения р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследование количественного кометного анализа
клеток кумулюсного окружения ооцитов в
условиях экспериментального тиреоидита
Результаты количественного кометного анализа
ДНК клеток кумулюсного окружения ооцитов мыши
приведены в таблице.
Рубомицин в концентрации 4 мкг/мл вызывает
гибель ~25% клеток, причем количество клеток с поврежденной ДНК составляет 53,5%. Большинство
комет отнесены к 3-му классу.
Установлено, что экспериментальный тиреоидит
вызывает гибель ~17% кумулюсных клеток, количество клеток с поврежденной ДНК составляет 46,2%,
большинство комет кумулюсных клеток с двунитевыми разрывами ДНК отнесены к 3-му классу.
Таким образом, оценка интегральной целостности генома, соотношение материала ДНК в «голове»
и «хвосте» кометы как показателя функционирования генома клеток кумулюсного окружения ооцитов
дают основания утверждать, что экспериментальное
повреждение щитовидной железы может изменять
процессы повреждения и репарации, что отображается как двунитевой разрыв ДНК.
Исследование изменения экспрессии генов HAS2,
COX2 и GREM1 на уровне мРНК в кумулюсных
клетках в условиях экспериментального
тиреоидита
Установлено, что в условиях экспериментального тиреоидита происходит снижение экспрессии
17
Экспрессия генов в кумулюсных клетках при тиреоидите
Количественная оценка влияния экспериментального тиреоидита на целостность ДНК клеток кумулюсного окружения
ооцитов
Условие эксперимента
Рубомицин, 4 мкг/мл
Экспериментальный тиреоидит
Количество комет, %
53,5
46,2
0/1
16,5
25
Распределение комет по классам, %
2
3
8,5
72
32
40
4
3
3
GREM1 в 1,65 раза, экспрессия HAS2 и COX2 не изменялась (см. рисунок).
ОБСУЖДЕНИЕ
Распространенность гипотиреоза в популяции
составляет 0,2—2%. Для женщин репродуктивного
возраста этот показатель достигает 2—5%. Гипотиреоз является одним из наиболее частых нарушений
функционального состояния щитовидной железы, в
том числе у женщин, страдающих бесплодием. Частота его в этой группе женщин колеблется от 2 до
25% [5, 9]. Субклеточный гипотиреоз (повышенный
уровень тиреотропного гормона при нормальном
уровне свободного тироксина) может стать причиной нарушений менструального цикла и бесплодия
[2]. Кроме дефицита йода, развитию заболеваний
щитовидной железы способствуют экологическая и
радиологическая ситуация, хронические стрессовые
состояния, инфекционные заболевания, изменения
иммунного статуса.
Гипофункция щитовидной железы у мышей сопровождалась снижением уровня гормонов трийодтиронина и тироксина, увеличением уровня тиреотропного гормона и биохимическими сдвигами в
сыворотке крови, а также морфологическими изменениями самой щитовидной железы и внутренних
органов, что моделирует развитие тяжелого гипотиреоза, который характеризуется снижением двигательной активности и увеличением массы тела животных [6].
Именно жизненно необходимая роль кумулюсных клеток при in vivo и in vitro созревании ооцита
определила их выбор для исследования. Изолированные кумулюсные клетки относительно однородные, практически без загрязнения другими клетками, в то время как изолированные клетки гранулезы,
как правило, содержат текальные клетки и клетки
крови. Ожидания таковы, что кумулюсные клетки
могут стать надежной моделью для понимания составляющих качества ооцитов и оценки эффективности протокола гиперстимуляции яичников, а также диагностики анеуплоидии ооцитов, оценки развития эмбрионов и самого исхода беременности. А
также углубят понимание фундаментальной биологии кумулюсно-ооцитарных клеточных комплексов
и эмбрионов через исследование, например, функции отдельных генов.
18
Изменения экспрессии генов HAS2, COX2 и GREM1 на
уровне мРНК в кумулюсных клетках в условиях экспериментального тиреоидита (ЭТ).
Величины отношения мРНК исследуемых генов к мРНК гена
GAPDH нормированы к соответствующим величинам в контроле.
Окраска пропидиума йодидом дает возможность визуализировать форму комет и позволяет
разделить ДНК-кометы клеток кумулюсного окружения ооцитов мышей в условиях экспериментального тиреоидита на 5 классов в зависимости от соотношения полученного нами материала ДНК в
«голове» и «хвосте» кометы, что полностью соответствует данным литературы [7]. Нами впервые установлено, что экспериментальный тиреоидит вызывает гибель ~17% клеток кумулюсного окружения
ооцитов, количество таких клеток с поврежденной
ДНК составляет 46,2%, большинство комет кумулюсных клеток с двунитевыми разрывами ДНК отнесены к 3-му классу.
Известно, что взаимодействие ооцита и кумулюса в значительной степени опосредовано экспрессией growth differentiation factor 9 (GDF9) и bone
morphogenetic protein 15 (BMP15), входящих в состав
суперсемейства трансформирующих факторов роста
β — одного из крупнейших семейств ростовых факторов у млекопитающих, функционирующего в многочисленных физиологических процесах, в частности, в фолликулогенезе, стероидогенезе и овуляции.
Их ключевая роль в регуляции овуляции первоначально была установлена у мышей, а затем подтверждена у овец и человека [10].
GDF9 регулирует экспрессию нескольких генов
кумулюсных клеток, участвующих в кумулюсном
расширении, в том числе HAS2, COX2 и GREM1, кодирующих gremlin 1 (ВМР — антагонист). GREM1,
Проблемы репродукции, 3, 2014
как считают, осуществляет регуляцию функции кумулюсных клеток через ооцит-продуцируемые
GDF9 и BMP15. HAS2 имеет важное значение для
кумулюсного расширения, гиалуроновая кислота является основным компонентом матрицы, которая
образуется при расширении кумулюса в ответ на овуляторный выброс лютеинизирующего гормона.
COX2 имеет важное значение для овуляции, но также
необходима для оплодотворения и действует как селективный ингибитор BMP15, что предотвращает
преждевременную лютеинизацию кумулюса [11, 12].
В наших опытах впервые установлено, что при экспериментальном тиреоидите происходит снижение
экспрессии GREM1 в 1,65 раза, тогда как экспрессия
HAS2 и COX2 не изменяется.
классу; происходит снижение экспрессии GREM1 в
1,65 раза, экспрессия HAS2 и COX2 не изменяется.
Проведенная нами оценка дает основание утверждать, что в условиях экспериментального тиреоидита происходит нарушение интегральной целостности генома клеток кумулюсного окружения ооцитов, что отражается в увеличении количества двунитевых разрывов ДНК. Однако эти изменения могут
быть обратимыми; изменение экспрессии гена
GREM1 может стать характерным показателем нарушения овариальной функции.
Дальнейшие работы должны быть направлены
на определение оценки качества ооцитов по состоянию генома клеток их кумулюсного окружения в отдельных кумулюсно-ооцитарных клеточных комплексах.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Экспериментальный тиреоидит вызывает гибель
~17% клеток кумулюсного окружения ооцитов, количество таких клеток с поврежденной ДНК составляет 46,2%, большинство комет кумулюсных клеток
с двунитевыми разрывами ДНК отнесены к 3-му
Работа поддержана грантом «Фундаментальные
основы геномики и протеомики» Национальной
академии наук Украины (0112U001477).
The work was supported with a grant “Fundamental
bases of genomics and proteomics” of National Academy
of Sciences of Ukraine (0112U001477).
ЛИТЕРАТУРА
1.
Фадеев В.В., Мельниченко Г.А. Гипотиреоз. Руководство для
врачей. М 2002.
2.
Poppe K., Volkeniers B. Thyroid disoders in infertile women. Ann
Endocrinol 2003; 64: 1: 45—50.
3.
Перминова С.Т., Фадеев В.В., Корнеева И.Е. Репродуктивная
функция женщин с патологией щитовидной железы. Пробл
репрод 2006; 1: 12: 70—77.
4.
Титенко Т.М. Особенности гинекологических заболеваний у
женщин репродуктивного возраста с аутоиммунным тиреоидитом. Репрод здоровье женщины 2006; 1: 25: 149—151.
5.
Poppe K., Volkeniers B. Female infertility and the thyroid. Best
Pract Res Clin Endocrinol Metabol 2004; 18: 2: 153—165.
6.
Соханенкова А.Е., Соханенков М.Ю., Афанасьева Е.Ю., Арзамасцев Е.В. Особенности фармакологического и токсического действия верапамила при нарушениях сердечного ритма у
крыс с тиреотоксикозом и гипофункцией щитовидной железы. Кардиология 2008; 6: 68—72.
7.
Heaton P., Ransley R., Charlton C. et al. Application of single-cell gel
electrophoresis (comet) assay for assessing levels of DNA damage in
canine and feline leukocytes. J Nutr 2002; 132: 1598—1603.
8.
Olive P., Durand R., Banáth J., Johnston P. Analysis of DNA
damage in individual cells. Methods Cell Biol 2001; 64: 235—249.
9.
Redmond J. Thyroid dysfunction and women’s reproductive health.
Thyroid 2004; 14: 1: 5—15.
10. Peng J., Li Q., Wigglesworth K. et al. Growth differentiation factor
9: bone morphogenetic protein 15 heterodimers are potent
regulators of ovarian functions. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 19:
110: 8: E776—E785.
11. Pangas S., Jorgez C., Matzuk M. Growth differentiation factor 9
regulates expression of the bone morphogenetic protein antagonist
gremlin. J Biol Chem 2004; 279: 32281—32286.
12. Hussein T., Froiland D., Amato F. et al. Oocytes prevent cumulus
cell apoptosis by maintaining a morphogenic paracrine gradient of
bone morphogenetic proteins. J Cell Sci 2005; 118: 5257—5268.
19