На правах рукописи ВИКУЛИНА АННА СЕРГЕЕВНА
реклама
На правах рукописи ВИКУЛИНА АННА СЕРГЕЕВНА ПЕРОКСИДАЦИЯ ЛИПИДОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЦИТОХРОМА C И ЕГО КОМПЛЕКСА С АНИОННЫМИ ЛИПИДАМИ И ЕЕ РОЛЬ В АПОПТОЗЕ 03.01.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена на кафедре медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ФГБУ «Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий лаборатории биохимии свободнорадикальных процессов доктор биологических наук, профессор ФГБУН Институт биофизики клетки Российской академии наук, заведующий лаборатории внутриклеточной сигнализации Владимиров Юрий Андреевич Ланкин Вадим Зиновьевич Зинченко Валерий Петрович Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научноисследовательский институт физико-химической медицины Федерального медикобиологического агентства» Защита состоится «.........» ................................. 20___ года в __ часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.14 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 Автореферат разослан «..........» ............................ 2015 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор 2 А.А. Кягова Общая характеристика работы Актуальность исследования. Апоптоз - генетически запрограммированная смерть клетки, один из механизмов ее гибели наряду с некрозом, необходимый для развития многоклеточного организма и участвующий в поддержании тканевого гомеостаза. В то же время, нарушения апоптоза лежат в основе патогенеза многих заболеваний: ингибирование апоптоза приводит развитию раковых опухолей, аутоиммунных болезней и нейропрофилеративных заболеваний (шизофрения); с усилением апоптоза связывают развитие СПИДа, нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, паркинсонизм), ишемических повреждений (инсульт, инфаркт миокарда) и др. Современные биофизические и медицинские исследования в области апоптоза направлены, в основном, на изучение его молекулярных механизмов, понимание которых позволит разработать эффективные способы контроля над этим процессом и, в конечном счете, управлять самой клеточной смертью. На настоящий момент известно, что апоптоз представляет собой многостадийный процесс биологически регулируемых последовательных событий, берущий свое начало в митохондриях, при этом ключевым моментом в развитии апоптоза принято считать образование комплекса между белком цитохромом c и анионным липидом митохондриальной мембраны кардиолипином (комплекс Цит-КЛ), приводящее к образованию пор во внешней митохондриальной мембране и последующему высвобождению митохондриального цитохрома c в цитозоль. Было также показано, что комплекс Цит-КЛ обладает пероксидазной активностью и участвует в процессе пероксидации липидов. Точные молекулярные механизмы действия комплекса Цит-КЛ не были установлены, однако известно, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ приводят к нарушению целостности митохондриальной мембраны. Вопрос о существовании других биологических 3 функций процесса пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с кардиолипином, а также другими анионным липидами остается открытым. Ответы на эти вопросы позволят уточнить механизм и значимость процесса пероксидации липидных мембран в апоптозе, что, в свою очередь, является важным шагом для понимания и регулирования механизмов клеточной смерти. Цель работы: изучение молекулярных механизмов реакций пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с анионными липидами и исследование роли этого процесса в апоптозе. В ходе работы были поставлены следующие задачи: 1. Изучить молекулярные механизмы реакций липидной пероксидации под действием комплекса Цит-АЛ методом активированной хемилюминесценции в сочетании со спектральными методами исследования. 2. Сравнить пероксидазные свойства комплекса Цит-АЛ в водном окружении и в монослое липида методом люминол-активированной хемилюминесценции. Разработать новые системы для изучения комплекса Цит-АЛ в гидрофобном окружении. 3. Выявить роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ в биосинтезе липидных медиаторов в клетках, подверженных апоптозу, методом хромато-масс-спектрометрии. 4. Установить роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса ЦитКЛ в тканях животных с ишемическими повреждениями и с нейродегенеративными заболеваниями (болезнь Паркинсона) методом ВЭЖХ-МС. 5. Установить роль пероксидации анионного липида фосфатидилсерина на последней (фагоцитарной) стадии апоптоза с использованием хромато-массспектрометрии. 4 6. Разработать методики экспрессного определения первичных продуктов реакций пероксидации липидов, их гидропероксидов, в химических системах и биологических объектах для медицинских исследований. Научная новизна работы. Для описания процесса пероксидации липидов под действием цитохрома c и его комплекса с АЛ предложено использовать две реакции. Описаны возможные схемы этих реакций. Определена пероксидазная активность комплекса Цит-КЛ в монослое липида. Комплекс Цит-КЛ впервые получен в гидрофобном растворителе. Показано, что комплекс Цит-КЛ в гидрофобном растворителе обладает пероксидазной активностью. Установлено, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ играют роль не только при инициации апоптоза, но и приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов. Показано, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при болезни Паркинсона и при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реперфузией. Установлено, что про- фагоцитарная активность фосфатидилсерина примерно в 50 раз выше по сравнению с неокисленным. Практическая ценность работы. Открытие нового механизма биосинтеза окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, важно для клинической практики: понимание механизма биосинтеза медиаторов воспаления для тех или иных заболеваний поможет выбирать оптимальную и наиболее эффективную схему лечения. Был установлен механизм биосинтеза липидных медиаторов при болезни Паркинсона и церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реперфузией, в последнем случае показана эффективность действия лекарственного вещества XJB-5-131, ингибитора 5 пероксидации кардиолипина. Разработана и апробирована высокочувствительная методика (10-8 М) определения гидропероксидов липидов крови - маркера многих апоптоз-инициированных патологий. Положения, выносимые на защиту: 1. Пероксидация липидов под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами осуществляется путем протекания двух реакций: собственно, пероксидации липидов под действием активных форм кислорода и реакции разложения гидропероксидов липидов с образованием липидных радикалов. 2. Комплекс Цит-КЛ впервые получен в неполярном растворителе. Соотношение липид:белок в комплексе в хлороформ-метанольной смеси найдено равным 77±11. 3. Реакции пероксидации кардиолипина под действием цитохрома c не только приводят к инициации апоптоза, нарушая целостность митохондриальной мембраны, но и могут сопровождаться последующими реакциями гидролиза окисленных жирных кислот Ca2+-независимыми фосфолипазами, что приводит к образованию окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов. 4. Биосинтез окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реанимацией происходит согласно предложенному выше механизму из окисленного кардиолипина. 5. Биосинтез окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при болезни Паркинсона происходит согласно предложенному выше механизму из окисленного кардиолипина. 6. Про-фагоцитарная активность окисленного фосфатидилсерина примерно в 50 раз выше, чем для неокисленного ФС. 6 Личное участие автора заключалось в проведении всех экспериментов, результаты которых представлены в диссертационной работе, за исключением культивации клеток и описания клеточного ответа, а также операций, проводимых с животными; лично автором были проведены обработка и интерпретация всех полученных данных. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были представлены на симпозиуме с международным участием «Проблемы медицинской биофизики» (Москва, 2012), всероссийской конференции «Второй съезд аналитиков России» (Москва, 2013) и международной конференции «Ломоносов-2015» (Москва, 2015). Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 183 страницах, содержит 71 рисунок и 9 таблиц. Библиография содержит 226 литературных источников. Содержание работы Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и основные задачи исследования, показана научная новизна и практическая значимость работы. Обзор литературы посвящен рассмотрению молекулярных основ апоптоза, структуры и функций Цит c и Цит-АЛ, а также механизмов пероксидации липидов. Материалы и методы исследования В работе использовали Цит c, выделенный из сердца лошади (Sigma) и неокисляемый тетраолеоилкардиолипин или кардиолипин, выделенный из сердца быка и подверженный окислению, полученные от Avanti Polar Lipids. Гидропероксид линолевой кислоты был получен от Cayman Chemicals. Все 7 используемые в работе реактивы были как минимум ч.д.а. Для приготовления водных растворов использовали бидистиллированную деионизованную воду. Кинетику реакций пероксидации липидов изучали методом кумарин- активированной ХЛ с использованием приборов SmartLum-5773 и Lum-100 (ИнтерОптика-С, Россия). Пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ определяли по люминол-активированной ХЛ под действием Н2О2. Спектральные характеристики Цит c и комплекса Цит-КЛ были получены методами фотометрии (Analytic Jena SPECORD 200, Германия) и флуоресценции (RF-5301, Shimadzu Corporation, Япония). Комплекс Цит-КЛ переводили из водного раствора в CHCl3-CH3OH методом экстракции и далее в н-гексан – упариванием досуха на ротационном испарителе с последующим перерастворением. Монослои ТОКЛ формировали на ленгмюровской ванне Nima 601A (Финляндия) сотрудники ИК РАН им. А.В. Шубникова. Все эксперименты по культивированию и работе с клетками и животными были проведены сотрудниками лаборатории В.Е. Кагана в университете Питтсбурга (Пенсильвания, США). Использовали клеточные линии человеческих нейтрофилов (HL60), макрофагов (RAW264.5 и ТНР-1) и человеческих Т-лимфоцитов (Jurkat), а также мышиные эмбриональные клетки Цит c +/+ и мутантные клетки Цит c -/-. Апоптоз в клетках инициировали различными методами: Н2О2, tBuOOH (окислители), актиномицином Д, стауроспорином (не окислители) или FAS антителами (внешний путь апоптоза). В каждом случае степень протекания апоптоза и некроза оценивались по связыванию с аннексином V/пропидий иодидом. Фагоцитоз клеток HL60 и ЛК-HL60 оценивали по степени их захвата макрофагами. 8 Ротенон-индуцированный паркинсонизм и церебральная ишемия после остановки сердца и сердечно-легочной реанимации были использованы в качестве моделей апоптоз-инициированных заболеваний. Липиды экстрагировали согласно методике, предложенной Фолчем. Для клеток и тканей определяли суммарное содержание фосфолипидов и белка. Высокоэффективную жидкостную хроматографию липидов с последующим детектированием методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением проводили с использованием хроматографической системы Dionex HPLC (Thermo Fisher Inc., США), которая была сопряжена с масс-спектрометром LXQ с ионной ловушкой или с гибридным квадруполь-орбитральным масс-спектрометром QExactive (Thermo Fisher Inc., США). Результаты и обсуждение I. Молекулярные механизмы реакций пероксидации липидов под действием цитохрома c и его комплекса с АЛ I.1. Реакция 1. Разложение гидропероксидов липидов Взаимодействие комплекса цитохрома c с тетраолеилкардиолипином (Цит-ТОКЛ) с гидропероксидом линолевой кислоты изучали методом хемилюминесценции (ХЛ) с использованием физического активатора кумарина С-525 (рис. 1). При добавлении смеси комплекса Цит-ТОКЛ и С-525 к раствору ЛК-ООН наблюдается короткая вспышка ХЛ, свидетельствующая об образовании радикалов в системе: 𝑐𝑦𝑡 𝑐 LOОН → + 𝐿𝐻 LO•→ О2 LOH + L•→ LOO• При повторной добавке того же количества Цит-ТОКЛ новой вспышки не наблюдается, а при добавке ЛК-OOH развивается новая вспышка, по форме и светосумме не отличающаяся от первой. Это означает, что в стехиометрической реакции ЛК-OOH полностью расходуется за 5 минут, а количество цитохрома c остается прежним или меняется незначительно (каталитическое действие Цит-КЛ). 9 Рис. 1. Первая вспышка: ХЛ кривая в системе 5 мкМ Цит-ТОКЛ1:30, 5 мкМ ЛКООН и 20 мкМ C-525 в 20 мМ ФБ pH 7,4. Добавка 5 мкМ Цит-ТОКЛ1:30 не приводила к повторной вспышке ХЛ (серым цветом). Добавка 5 мкМ ЛК-ООН приводила к повторной ХЛ (вторая вспышка). Частота регистрации 10 Гц. Сходные результаты были получены при разложении гидропероксидов, содержащихся в природном кардиолипине (рис. 2, Цит/БКЛ, первая вспышка ХЛ). Рис. 2. Кривые ХЛ при разложении липогидропероксидов и последующем добавлении H2O2. Смесь 5 мкМ Цит c и 25 мкМ С-525 в 20 мМ ФБ pH 7,4 была добавлена к 150 мкМ БКЛ (или 5 мкМ ЛК-ООН) (1-я вспышка ХЛ). Через ~ 10 мин реакционная смесь (1000 мкл) была добавлена к 100 мкл Н2О2 (конечная концентрация 100 мкМ) –2-я вспышка ХЛ. Через ~ 5 мин к реакционной смеси добавили столько же Н2О2 – третья вспышка ХЛ. Частота регистрации - 10 Гц. Схема реакций может быть представлена уравнениями: LOOH + Pr-◊-Fe3+ (ферроцитохром c) → Pr-◊- Fe4+=O (compound II) + LO•, Pr-◊- Fe4+=O + LOOH → Pr-◊-Fe3+ (ферроцитохром c) + LOO•, LO• + LH + O2 → LOH + LOO•; LOO• + LOO• → хемилюминесценция. Pr – белковая часть молекулы Цит c, ◊ - порфирин. 10 I.2. Реакция 2. Пероксидация липидов В опыте на рис. 2 после добавления Цит-БКЛ или Цит-LOOH происходило полное разложение липогидропероксидов, после чего ХЛ прекращалась. При последующем добавлении Н2О2 в обоих случаях наблюдались новые вспышки ХЛ (рис. 2), возникающие в результате пероксидазной реакции, схему которой можно представить в следующем виде: HOOH + Pr-◊-Fe3+ (ферроцитохром c) → Pr•-◊- Fe4+=O (compound I) Pr•-◊-Fe4+=O + LH → L• + H+ + Pr•-◊-Fe3+ (compound II), Pr•-◊-Fe3+ + LH → L• + H+ + Pr-◊-Fe3+. В присутствие кислорода, радикалы липидов L• далее инициируют реакции цепного окисления. Молекула Цит c участвует в пероксидазном цикле как катализатор, то есть не должна изменяться в ходе реакции. Однако фотометрический и флуоресцентный анализ показали практически полное разрушение гема и ароматических остатков Цит c в комплексе с КЛ под действием избытка Н2О2 (данные не показаны), а формы кривых ХЛ при первом и втором добавлении Н2О2 были разными (рис. 2). По-видимому, Цит c все же разрушается в ходе пероксидазной реакции, что при избытке субстрата (в наших опытах 20кратном) приводит к заметному изменению активности. Так или иначе, обе реакции сопровождаются образованием липидных радикалов, а следовательно, приводят к инициированию цепной пероксидации липидов. Роль этого процесса в апоптозе будет рассмотрена в последней главе диссертации. II. Комплекс цитохрома c с кардиолипином в гидрофобном окружении II.1. Активность комплекса Цит c с кардиолипином в липидном монослое Важно отметить, что рассмотренные выше реакции проводили в водной среде. Известно, что в водных растворах комплекс Цит-КЛ представляет собой наносферу, молекулу Цит c, окруженную слоем КЛ. Однако важно учитывать, что 11 Цит c меняет свою конформацию и ферментативные свойства в зависимости от микроокружения, и в митохондриях комплекс Цит-КЛ имеет другую структуру. С целью оценить, в какой степени результаты, полученные для водного комплекса Цит-КЛ, применимы для описания мембранно-связанного комплекса, цитохром c встраивали в монослой ТОКЛ на границе раздела вода-воздух, после чего определяли пероксидазную активность комплекса Цит-ТОКЛ в монослое методом люминол-активированной ХЛ в присутствие Н2О2. В качестве аналитического сигнала использовали площадь под кривой ХЛ, пропорциональную количеству образованных в пероксидазной реакции радикалов. Чтобы определить максимальную активность Цит c, встроенного в монослой, этот комплекс переводили в водный раствор и добавляли к нему избыток ТОКЛ. Найденное значение приняли за 100%. Пероксидазная активность Цит c, встроенного в монослой ТОКЛ, составила 27±3% от максимального значения. Цитохром c, связанный с монослоем кардиолипина, обладает пероксидазной активностью того же порядка величины, что и комплекс Цит-КЛ в водной среде. II.2. Получение комплекса Цит-КЛ в среде гидрофобного растворителя Несмотря на то, что применение высокочувствительного метода активированной ХЛ позволило определить пероксидазную активность Цит c в монослое ТОКЛ, дальнейшее изучение такой системы затруднено, главным образом, ввиду сложности накопления количества мембранно-связанного комплекса, достаточного для анализа, а также технической сложностью получения липидных монослоев. Моделью мембранно-связанного комплекса Цит-КЛ, лишенной этих недостатков, может служить истинный раствор комплекса Цит-КЛ в гидрофобном растворителе, однако ранее наши многократные попытки перевести комплекс Цит-КЛ, выпавший в осадок из водного раствора, в малополярные органические растворители не увенчались успехом. По-видимому, гидрофобные 12 взаимодействия между сложившимися в кристаллоподобную структуру наносферами (или нанотрубками) настолько велики, что растворитель не в состоянии оторвать друг от друга наносферы в составе твердой фазы. Чтобы это произошло, к растворителю надо добавить более полярный растворитель – метанол. При этом в отсутствие кардиолипина Цит с в хлороформ не переходит ни в отсутствие метанола, ни при его 50% содержании в водном растворе. Как видно на рис. 3Б, при отношении КЛ:Цит c в исходной смеси ≤ 15:1 Цит c переходит в СHCl3 в незначительном количестве, тогда как при соотношении КЛ:Цит c 20:1 и 30:1 доля гемопротеина, перешедшего в хлороформ, существенно возрастает. Рис. 3. А. Экстракция Цит-КЛ в органическую фазу. Б. Спектры поглощения ЦитТОКЛ, экстрагированного в хлороформ, при различных молярных отношениях липид/белок: 1 – 30:1, 2 – 20:1, 3 – 15:1, 4 – 10:1 и 5 – 0:1. Экстракция производилась путем добавления хлороформа к водно-метанольной смеси (10:11 по объему) 20 мкМ Цит c и ТОКЛ в соответствующей концентрации. С учетом того, что при добавлении реактива Фолча в фазу хлороформ-метанол переходят все фосфолипиды исходного водного раствора, соотношение ТОКЛ:Цит c было найдено равным 77±11, что равно или незначительно превышает значения, которые были получены для комплекса в осадке из водно-буферных растворов. III. Роль в апотозе реакций пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с анионными липидами 13 Известно, что реакции пероксидации липидов играют роль в разрушении митохондриальной мембраны на стадии инициации апоптоза, после чего каскад каспаз развивается в цитозоле и на финальной стадии достигает клеточной мембраны. Дальнейшая судьба продуктов пероксидации кардиолипина и других липидов митохондриальной мембраны ранее не была изучена. Однако, хорошо известно, что продукты окисления полиненасыщенных жирных кислот, липидные медиаторы, выступают в роли сигнальных молекул в апоптозе. В ранних работах был изучен путь биосинтеза липидных медиаторов из фосфатидилсерина, находящегося на клеточной мембране. Известно, что этот механизм осуществляется ферментными системами, находящимися в цитозоле. То, что КЛ в митохондриях подвергается пероксидации под действием Цит c, также может приводить к синтезу липидных медиаторов. III.1. Механизм биосинтеза липидных медиаторов из кардиолипина митохондрий под действием цитохрома c в процессе апоптоза Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа липидов мутантных клеток, не содержащих цитохром c (Цит c -/-) и обычных клеток той же линии (Цит c +/+ ), подвергнутых апоптозу, инициированному актиномицином Д или tBuOOH, показали, что апоптоз в Цит c +/+ клетках сопровождается накоплением продуктов окисления (рис. 4Б) и последующего гидролиза кардиолипина (рис. 4В). Уровень апоптоза оценивали по степени связывания с аннексином V (рис. 4А). Использование ингибиторов различных фосфолипаз в сочетаниии с последующим ВЭЖХ-МС анализом позволило установить, что гидролиз окисленного КЛ происходит под действием Ca2+-независимой фосфолипазы (данные не показаны). 14 Рис. 4. Цит c +/+ и Цит c -/- клетки без обработки и после обработки актиномицином Д или tBuOOH: А. Уровень апоптоза, оцененный по связыванию клеток с аннексином V. Б. Количество свободных окисленных жирных кислот. В. Количество лизо-кардиолипинов. Стандартные отклонения даны для n=3. * – значения, статистически (p≥0,99) отличающиеся от контрольных. Далее, на основании МС спектров гидролизованных окисленных ПНЖК, была определена их структура. Основным субстратом окисления была найдена линолевая кислота. Для количественной оценки каждого из молекулярных видов продуктов ее окисления, было проведено окисление тетралинолеоилкардиолипина смесью Цит c/Н2О2 с последующим ВЭЖХ-МС анализом (рис. 5). Рис. 5. МС спектры исходного кардиолипина (m/z 1448) и продуктов его окисления смесью цитохрома c и H2O2 (количество присоединенных атомов кислорода указано стрелками). Были обнаружены 7 кластеров окисленного кардиолипина, отличающихся по степени окисления (количеству присоединенных атомов кислорода, от 1 до 7). 15 Известно, что первые два кластера (+1[O] и 2[O]) окисленной ЛК представляют собой липидные медиаторы. Биологическая роль окисленных ЖК, содержащих 3 и более присоединенных атомов кислорода, на настоящий момент не известна. Таким образом, было показано, что в результате реакций пероксидации кардиолипина с последующим гидролизом кальций-независимыми фосфолипазами образуются липидные митохондриях и медиаторы. представляет Этот собой путь биосинтеза альтернативный локализован в классическому (под действием цитозольных ферментных систем) механизм. Роль этого механизма при церебральной ишемии-реперфузии и болезни Паркинсона будет показана в последующих двух разделах. III.2. Пероксидация кардиолипина в процессе апоптоза клеток мозга при церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца Патогенез церебральной ишемии связан с апоптотической гибелью клеток мозга. Ввиду этого долгое время считалось, что лечение пациентов с ишемическими повреждениями, направленное на усиление антиоксидантной системы клеток, окажется эффективным. Тем не менее, в клинических испытаниях на животных антиоксидантные препараты показали отсутствие положительного эффекта. Поиск новых способов лечения привел к необходимости более глубокого понимания механизмов апоптотических процессов. В данной работе крыс подвергали остановке сердца с последующей реанимацией, в результате чего крысы выживали, но у них развивались нейрокогнитивные нарушения. Другой группе крыс после возобновления циркуляции крови ввели препарат XJB - митохондриальный ингибитор окисления. Это вещество показало высокую эффективность: у таких крыс нейроповеденческих отклонений не было. Методом ВЭЖХ-МС были изучены изменения, произошедшие с липидным составом мозга крыс через две недели после остановки сердца. 16 Было обнаружено, что все основные классы фосфолипидов подверглись окислению, тем не менее, наиболее значимые изменения произошли с кардиолипином. Окисленные кардиолипины были найдены только в образцах крыс с ишемическими повреждениями (рис. 6А, Б), но не в контрольной группе. Бóльшая часть окисленного кардиолипина подверглась гидролизу под действием фосфолипаз, в результате чего образовались окисленные свободные жирные кислоты – липидные медиаторы (данные не показаны), и накопились монолизокардиолипины (рис. 6В). Уровни окисленных кардиолипинов у крыс после лечения XJB были такими же, как и для контрольной группы крыс или ниже (рис. 6). Рис. 6. ВЭЖХ-МС анализ окисленного кортикального кардиолипина. А. Хроматографический пик окисленного кардиолипина обнаружен только в образцах мозга крыс после ишемии-реперфузии. Б. МС2 спектры окисленного кардиолипина с [M-H]- 1464 и 1480, полученные для хроматографического пика слева. m/z 293, 295, 309 и 311 соответствуют окисленной линолевой кислоте в составе кардиолипина, m/z 255, 279 и 303– неокисленные ЖК. m/z 153 характерен для фосфолипидов. В. Содержание монолизокардиолипина. Стандартные отклонения даны для n=4. * – значения, статистически (p≥0,99) отличающихся от найденных для контрольных крыс, # –от найденных для ишемия-реперфузионных крыс. Полученные данные служат индикатором того, что при реперфузионном окислении фосфолипидов митохондриальный путь окисления кардиолипина под действием 17 Цит c, по-видимому, преобладает над путем окисления фосфолипидов под действием цитозольных ферментов – циклооксигеназы, липоксигеназы, цитохрома P450 и других пероксидаз. III.3. Пероксидация липидов при болезни Паркинсона Болезнь Паркинсона – медленно прогрессирующее хроническое нейродегенеративное заболевание, вызванное разрушением и гибелью нейронов, вырабатывающих нейромедиатор дофамин в substantia nigra. Одной из основных причин, приводящих к развитию паркинсонизма, считают митохондриальный стресс, тесно связанный с усилением процесса апоптоза. Основным продуктом окисления липидов при болезни Паркинсона был найден 4-гидрокси-2-ноненаль, транкированная жирная кислота, но молекулы, служащие ее источниками, не были известны. В данной работе паркинсонизм у крыс вызывали введением им ротенона. Методом ВЭЖХ-МС были изучены изменения, произошедшие с липидным составом в substantia nigra мозга крыс через 1 день, 5 дней или на последний день эксперимента, когда у крыс явно обнаруживали внешние признаки паркинсонизма. В отличие от исследования крыс с ишемическими повреждениями, описанным в предыдущем разделе, в данной работе был применен новый подход к ВЭЖХ-МС анализу липидов. Он заключался в том, что на первом этапе исследования липидный экстракт обрабатывали различными фосфолипазами, гидролизующими ЖК из фосфолипидов. Такой подход значительно упрощает анализ ВЭЖХ-МС данных и позволяет оценить суммарную степень окисления липидов и потенциальные мишени окисления. Эта работа была проведена лично автором. В результате ВЭЖХ-МС анализа был определен состав неокисленных ЖК (рис. 7 А, Б) и найдены окисленные ЖК (рис. 7В). Из трех представленных на рис. 7А и Б групп ЖК, только полиненасыщенные ЖК могут служить субстратом окисления. 18 Доминирующими видами ПНЖК в обоих положениях были найдены докозагексаеновая кислота, содержащая систему 6 двойных связей (22:6) и арахидоновая кислота (20:4), содержащая систему 4 двойных связей. Ввиду большей доли докозагексаеновой и арахидоновой кислот среди обнаруженных ПНЖК, а также наличию в них длинной системы двойных связей, предполагалось обнаружить большее количество продуктов их окисления при развитии паркинсонизма по сравнению с прочими жирными кислотами. Анализ окисленных ЖК, напротив, не выявил ни одного продукта их окисления. Единственным субстратом, подвергнутым окислению, была линолевая кислота были обнаружены ее моноокси- (гидрокси- и эпокси-) производные (рис. 7В). Их содержание увеличилось на 5 и на последний день (10-14, в зависимости от индивидуальной реакции крысы) введения ротенона. Дальнейший анализ липидов был проведен другими авторами опубликованной по теме этого исследования статьи и выявил, что основной мишенью окисления и источником окисленной линолевой кислоты служил кардиолипин. Таким образом было показано, что реакции пероксидации кардиолипина, катализируемые комплексом Цит-КЛ, приводят к биосинтезу липидных медиаторов при болезни Паркинсона. 19 Рис. 7. Жирнокислотный состав фосфолипидов в (А) sn1 и (Б) sn2-положениях для substantia nigra крыс. ЖК разделены на три группы: 1 - насыщенные (14:0, 16:0, 18:0, 20:0 и 22:0), 2 - мононенасыщенные (16:1, 18:1 и 20:1) и 3 полиненасыщенные жирные кислоты (молекулярные виды указаны на рис). В. Количество моноокси-производных линолевой кислоты, найденных в substantia nigra на 1, 5 или последний день введения ротенона. Звездочками отмечены статистически отличные (черным) от контрольного (серым) значения (p≥0.99, n=5). Погрешности – стандартные отклонения. III.4. Роль пероксидации липидов в формировании фагоцитарных сигналов «съешь меня» Кардиолипин – основной анионный липид митохондриальной мембраны. Изучению роли пероксидации кардиолипина в апоптозе были посвящены предыдущие три раздела данной работы. В то же время, основной анионный липид клеточной мембраны, фосфатидилсерин, также подвергается окислению в процессе апоптоза. Известно, что фосфатидилсерин, экстернализованный на поверхность клетки, служит сигналом для фагоцитов. В данной работе изучали, как влияет степень окисления ФС на его про-фагоцитарную активность. 20 Апоптоз и фагоцитоз изучали на клетках линии HL60. В культивационную среду клеток была добавлена линолевая кислота (LA-HL60), которая встраивалась в фосфолипиды клеток, и за счет этого доля окисляемых фосфолипидов повышалась, что в свою очередь приводило к усилению клеточного ответа на индукторы апоптоза. Обычные HL60 клетки использовались при этом в качестве контроля. На рис. 8А показаны уровни фагоцитарного захвата апоптических HL60 и LA-HL60 клеток макрофагами после их обработки Н2О2. Для LA-HL60 клеток наблюдалось значительно большее (в 7.2 раз по фагоцитарному индексу) увеличение уровня фагоцитоза. Методом ВЭЖХ-МС было показано, что к усилению фагоцитоза в апоптотических клетках приводит накопление окисленного фосфатидилсерина. МС анализ фосфолипидов LA-HL60 клеток показал существенное уменьшение содержания окисляемого ФС (рис 8Б) и примерно четырехкратное увеличение количества окисленного ФС (количество ФСокисл. в Н2О2-LA-HL60 клетках составило 130±9 пмоль/106 клеток). Доминирующими продуктами окисления при этом были молекулярные виды, содержащие два атома кислорода (гидроперокси-, дигидрокси- и гидокси-эпокси) в линолеате ацильной цепи C18:0/C18:2-ФС. Дальнейший ВЭЖХ-МС анализ в сочетании с предобработкой клеток различными фосфолипазами показал, что на поверхность клеток было экстернализовано в среднем 173 пмоль ФС/106 клеток, из них 24±8 пмоль окисленного ФС (14±4% от общего количества экстернализованного ФС). Статистически значимых изменений в составе других фосфолипидов не было обнаружено. 21 Рис. 8. Н2О2-индуцированный апоптоз в HL60 клетках. А. Фагоцитарные индексы, посчитанные для контрольных (naïve) и обогащенных ЛК (LA-HL60) клеток без и после обработки Н2О2. Соответствующие изображения макрофагов и захваченных ими клеток представлены на врезке. Б. Количество основных окисляемых молекулярных видов ФС в LA-HL60 и в LA-HL60, обработанных Н2О2. Стандартные отклонения даны для n=3. Поскольку фагоцитарный индекс для LA-HL60 клеток на порядок больше по сравнению с контрольными клетками и среди экстернализованного на поверхность клеток в процессе апоптоза фосфатидилсерина, окисленный ФСокисл представляет лишь десятую часть от общего количества экстернализованного ФС, можно считать, что про-фагоцитарная активность окисленного фосфатидилсерина примерно в 50 раз выше, чем для неокисленного ФС. Выводы 1. Методом активированной хемилюминесценции было показано, что пероксидация липидов под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами реализуется в результате протекания двух реакций: реакции разложения гидропероксидов липидов и липопероксидации под действием пероксида водорода. Предложены возможные схемы этих двух реакций. 2. Впервые был получен комплекс цитохрома c с кардиолипином в виде раствора в неполярном растворителе. Соотношение липид:белок в комплексе было найдено равным 77±11. 22 3. Методом хроматографического разделения липидов и их масс- спектрометрического определения было показано, что реакции пероксидации кардиолипина под действием цитохрома c не только приводят к инициации апоптоза, нарушая целостность митохондриальной мембраны, но и могут сопровождаться последующими реакциями гидролиза окисленных жирных кислот Ca2+-независимыми фосфолипазами, что приводит к образованию окисленных жирных кислот, исполняющих роль липидных медиаторов воспаления. 4. Методом ВЭЖХ-МС было показано, что реакции пероксидации кардиолипина, катализируемые комплексом Цит-КЛ, приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, исполняющих роль липидных медиаторов воспаления, при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реанимацией; показана эффективность применения селективного ингибитора пероксидации кардиолипина, вещества XJB. 5. Методом ВЭЖХ-МС было показано, что реакции пероксидации кардиолипина, катализируемые комплексом Цит-КЛ, приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, исполняющих роль липидных медиаторов воспаления, при болезни Паркинсона. 6. Установлено, что про-фагоцитарная активность окисленного фосфатидилсерина является примерно в 50 раз выше, чем для неокисленного ФС. Основные результаты диссертации опубликованы в работах: 1. Tyurin, V.A. Oxidatively modified phosphatidylserines on the surface of apoptotic cells are essential phagocytic 'eat-me' signals: cleavage and inhibition of phagocytosis by Lp-PLA2 / V.A. Tyurin, K. Balasubramanian, D. Winnica, Y.Y.Tyurina, A.S. Vikulina, R.R. He, A.A. Kapralov, C.H. Macphee, V.E. Kagan // Cell Death and Differentiation. - 2014. V. 21. - №5. - P. 825-835. 23 2. Tyurina, Y.Y. A mitochondrial pathway for biosynthesis of lipid mediators / Y.Y. Tyurina, S.M. Poloyac, V.A. Tyurin, A.A. Kapralov, J. Jiang, T.S. Anthonymuthu, V.I. Kapralova, A.S. Vikulina, M.Y. Jung, M.W. Epperly, D. Mohammadyani, J. KleinSeetharaman, T.C. Jackson, P.M. Kochanek, B.R. Pitt, J.S. Greenberger, Y.A. Vladimirov, H. Bayır, V.E. Kagan // Nature Chemistry. - 2014. V. 6. - №6. - P. 542552. 3. Ji, J. Deciphering of mitochondrial cardiolipin oxidative signaling in cerebral ischemia-reperfusion / J. Ji, S. Baart, A.S. Vikulina, R.S. Clark, T.S. Anthonymuthu, V.A. Tyurin, L. Du, C.M. St Croix, Y.Y. Tyurina, J. Lewis, E.M. Skoda, A.E. Kline, P.M. Kochanek, P. Wipf, V.E. Kagan, H. Bayır // Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. - 2015. V. 35. - №2. - P. 319-328. 4. Tyurina, Y.Y. LC/MS analysis of cardiolipins in substantia nigra and plasma of rotenone-treated rats: Implication for mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease / Y.Y. Tyurina, A.M. Polimova, E. Maciel, V.A. Tyurin, V.I. Kapralova, D.E. Winnica, A.S. Vikulina, M.R. Domingues, J. McCoy, L.H. Sanders, H. Bayır, J.T. Greenamyre, V.E. Kagan // Free Radical Research. - 2015. V. 49. - №5. - P. 681-691. 5. Викулина, А.С. Комплекс цитохрома с с кардиолипином в неполярном окружении / А.С. Викулина, А.В. Алексеев, Е.В. Проскурнина, Ю.А. Владимиров // Биохимия. - 2015. Т. 80. - №10. - С. 1573-1578. Список сокращений Цит c – цитохром c, КЛ – кардиолипин, Цит-КЛ – комплекс цитохрома c с кардиолипином, ТОКЛ – тетраолеоилкардиолипин, БКЛ – кардиолипин, выделенный из сердца быка, АЛ – анионный липид, Цит-АЛ – комплекс цитохрома c с анионными липидами, ФС – фосфатидилсерин, ЖК – жирная кислота, ПНЖК – полиненасыщенная жирная кислота, ЛК – линолевая кислота, ЛК-ООН – 24 гидропероксид линолевой кислоты, ХЛ – хемилюминесценция, ВЭЖХ-МС – высокоэффективная жидкостная хроматография детектированием. 25 с масс-спектрометрическим
