Методические положения СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ТКАНЕЙ ПЕЧЕНОЧНЫХ СОСАЛЬЩИКОВ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПЦР А.С. ГУЛЯЕВ Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И.Скрябина, г. Москва, Б. Черемушкинская, 28, e-mail: vigis@ncport.ru С.К. СЕМЕНОВА Институт биологии гена РАН (одобрены секцией «Инвазионные болезни животных РАСХН 22 марта 2012 г., протокол № 1) Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) – основа всех исследований, так или иначе касающихся молекулярной генетики. Для проведения ПЦР необходимо использовать высокоочищенную ДНК концентрацией не менее 0,05 мкг/мкл. Экстракцию и очистку ДНК проводят различными методами: с помощью коммерческих наборов реагентов и стандартным фенолхлороформным методом. Фенол-хлороформный метод (ФХ-метод) – это классический метод выделения нуклеиновых кислот (НК). Он включает в себя лизис биологического материала детергентами в присутствии протеиназы К и экстракцию НК с помощью фенола и хлороформа. Достоинством этого метода является более высокий выход ДНК по сравнению с набором реагентов Diatom DNA Prep, а к недостаткам можно отнести длительность, трудоемкость, использование агрессивных органических растворителей и недостаточную очистку ДНК как от белков, так и от РНК. Методика ФХ-экстракции НК из тканей фасциол состоит из следующих этапов: - от тела фасциолы отрезают кусочек ткани массой 0,05 г (желательно ротовой присоски, чтобы не затронуть половую систему, необходимую для морфологической идентификации); - ткань фасциолы гомогенизируют с буферным раствором, содержащим 40 мМ трис-HCl (pH = 8,0), 0,5 мМ ЭДТА, 1 SSC (при соотношении ткани и буфера 100 мкг/500 мкл); - добавляют SDS до 0,5 % и протеиназу K до конечной концентрации 1 мг/мл, перемешивают и инкубируют при 37 ºC в течение ночи; - в пробирку добавляют 5М ацетата натрия до конечной концентрации 0,1M и перемешивают. Затем добавляют фенол в соотношении 1 : 1, насыщенный трис-HCl, (pH = 8,0), перемешивают 10–15 мин; - добавляют хлороформ в объемном соотношении 1 : 1 с последующим перемешиванием в течение 5–10 мин; - полученную смесь центрифугируют при 4 C 20 мин (4000 об/мин); - верхнюю фракцию с растворенной ДНК (супернатант) отбирают пипеткой; - ФХ депротеинизацию повторяют до полного удаления белка; - к отобранному супернатанту добавляют хлороформ в объемном соотношении 2 : 1, перемешивают 10–15 мин, центрифугируют 15 мин (4000 об/мин) и отбирают верхнюю фазу; - к 1 мл растворенной ДНК добавляют 5М ацетат натрия до конечной концентрации 0,2 M и перемешают; - добавляют два объема 96%-ного этанола и плавно перемешивают до выпадения ДНК в осадок; 128 - охлаждают в течение суток при температуре – 20 оС, затем центрифугируют 15 мин при 15 000 об/мин (с охлаждением до 0 оС); - удаляют супернатант, осадок ДНК промывают 70%-ным этанолом; - спирт сливают, ДНК высушивают на воздухе до окончательного испарения спирта и растворяют в деионизированной воде. Концентрация экстрагированной ДНК составляет 2,0–2,3 мкг/мкл при чистоте OD260/280 нм = 1,4–2,0. Метод выделения ДНК с помощью набора реагентов Diatom DNA Prep 100 представляет собой один из методов экстракции НК с помощью коммерческих наборов реагентов, или китов. Этот набор позволяет выделять ДНК из различных природных материалов, а также проводить быструю очистку ДНК из клинических проб. От ФХ-метода данный способ отличается быстротой (0,5–1,5 ч на одну пробу), отсутствием токсичных реагентов. Принцип действия основан на использовании лизирующего реагента (ЛР) с гуанидинтиоцианатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии ЛР ДНК активно сорбируется на поставляемом в наборе NucleoS-сорбенте, а затем легко отмывается от белков и солей спиртовым раствором. ДНК, элюированную из сорбента, можно напрямую использовать для ПЦР. Состав набора: лизирующий реагент, солевой буфер, суспензия сорбента NucleoS, суспензия смеси ионообменников «ЭкстраГен». Методика экстракции ДНК из тканей фасциол с помощью Diatom DNA Prep 100 состоит из следующих этапов: - готовят рабочий раствор солевого буфера (СБ) согласно инструкции; - от тела фасциолы отрезают кусочек ткани массой 0,05 г (желательно ротовой присоски, чтобы не затронуть половую систему, необходимую для видовой идентификации); - растирают ткань фасциолы в 100 мкл ЛР, переносят смесь в чистую пробирку; - добавляют в нее 400 мкл ЛР, перемешивают переворачиванием 5–10 раз, термостатируют 5–7 мин при 65 °С; - центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 с; супернатант переносят в чистую пробирку, добавляют к нему 20 мкл предварительно гомогенизированной суспензии NucleoS; - перемешивают при 10–20 об/мин в течение 10 мин и центрифугируют пробирку при 5000 об/мин в течение 10 с; - к осадку добавляют 200 мкл ЛР и интенсивно перемешивают до гомогенного состояния; - добавляют к смеси 1 мл рабочего раствора СБ, перемешивают 5–10 раз, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 с, а затем удаляют супернатант; - повторяют предыдущий пункт; - подсушивают осадок при температуре 65 °С в течение 4–5 мин; - вносят 50–100 мкл суспензии «ЭкстарГен» и перемешивают до гомогенного состояния, затем термостатируют 5 мин при 65 °С и снова перемешивают; - центрифугируют при 10000 об/мин в течение 1 мин; - отбирают супернатант, хранят при – 20 °С. Концентрация экстрагированной ДНК составляет 0,12–0,17 мкг/мкл при чистоте OD260/280 нм = 1,6–2,0. ДНК, выделенную «быстрым» ФХ-методом, зачастую необходимо доочищать от оставшихся белков и углеводов. Это можно эффективно сделать суспензией NucleoS из набора реагентов Diatom, начиная работу с пункта 5 методики. 129