генетическая идентификация бактерий коллекционных штаммов

реклама
С.Сейфуллин атындағы Қазақ агротехникалық университетінің Ғылым жаршысы /
Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина. – 2013.
- №2 (77). – C.14-21
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ
КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММОВ НА ОСНОВЕ ПРОВЕДЕНИЯ
АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 16S RRNA
ГЕНА
М.А. Куйбагаров, А.Б. Шевцов, А.Х.Жумалин,
Т.Б. Карибаев, Ж.Ж.Аканова, Е.С. Шевцова
Аннотация
В результате проведенной работы выделено 36 образцов ДНК
коллекционных штаммов микроорганизмов. Амплифицирован фрагмент
протяженностью около 800 п.н. и определена нуклеотидная
последовательность 16S rRNA гена.
Ключевые слова: бактерии, штаммы, генетическая идентификация,
праймеры, секвенирование.
Введение
Начиная с постулатов Коха
идентификация бактерий сводилась
в выделение чистых культур с
последующей
идентификацией
фенотипическими
тестами,
к
основным из которых можно
отнести микроскопию по Грамму и
анализ ферментации углеводов.
Данные методы не всегда пригодны
для
точного
и
достоверного
определения
бактериальных
патогенов
так
как:
в
бактериологической
практике
встречаются культуры, биохимический
профиль
которых
не
соответствует
характеристикам
предполагаемого рода или вида; не
все бактерии растут на средах используемых
при
анализе
ферментации
углеводов;
достоверная идентификация редко
встречаемых
видов
бактерий
требует
наличие
химических
реагентов или иммунологических
тестов, которые не доступны в
обычных
ветеринарных
лаборатория. Сложно применять
фенотипические методы и при
типировании медленно растущих
культур
(микобактерий)
идентификация которых занимает от
6-8 недель. Все это приводит к тому,
что врач бактериолог вынужден
определять культуру на основании
результатов ограниченного списка
фенотипических
тестов,
эпизоотологических и клинических
данных, что приводит к ошибкам и
как следствие к проблемам терапии
и
не
эффективности
противоэпизоотических
мероприятий.
В практику современных
ветеринарных лабораторий вошли
новые методы основанные на
фенотипических и генетических
данных [1, 2, 3]. Универсальной
системой
идентификации
по
генетической информации является
анализ нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена. Метод
начал развиваться в 1980-х годах
когда С. Woese с сотрудниками,
установили что, филогенетические
отношения бактерий могут быть
определены, сравнивая высоко
консервативную
часть
генетического кода [4]. Развитие
автоматических
генетических
анализаторов и баз данных привело
к тому что современная таксономия
бактерий построена на основании
нуклеотидной последовательности
16S rRNA гена. Протяженность
данного
гена
составляет
приблизительно
1540
п.н.,
нуклеотидная последовательность
чередуется
участками
консервативными для всех видов
бактерий с вариабельными, что
позволяет подобрать универсальные
праймеры для ПЦР амплификации
практически
полной
последовательности.
Принцип
метода основан на ПЦР амплификации
полной
или
частичной
последовательности
гена
с
последующим определение нуклеотидной
последовательности.
В
ветеринарной
практике
сравнительная идентификация 22
видов
фенотипически
трудно
идентифицируемых видов бактерий
выделенных
от
животных
с
использованием
фенотипических
тестов и с использованием анализа
нуклеотидной последовательности
16S rRNA гена выявил, что
используя полное определение
последовательности 16S rRNA гена
95 % (21/22) штаммов были
идентифицированы до рода и 86 %
(19/22) до вида. Фенотипическая
идентификация с использованием
коммерческих
наборов
или
обычным методом 20 из 22 штаммов
(91%) были идентифицированы до
рода, а 1 штамм до вида. Однако,
только 55 % (12/22) фенотипически
идентифицированных
штаммов
были правильно идентифицированы
до рода и 4,.5 % (1/22) до вида [5].
Опираясь на литературные данные, в
нашем исследовании мы хотели
проверить
достоверность
идентификации
бактериальных
штаммов
в
депозитариях
в
сравнении с анализом фрагмента 16S
rRNA гена.
Материалы и методика исследований
В
исследовании
были проводили
с
использованием
использованы 36 штаммов (таблица спектрофотометра
BioPhotometer
1). Выделение ДНК из культур plus (Eppendorf). После чего все оббактерий проводили с помощью на- разцы ДНК были доведены до
бора выделения и очистки ДНК единой концентрации 1 нг/мкл.
GeneJET™ (Fermentas) согласно
ПЦР
амплификацию
инструкции
по
применению. фрагмента ДНК протяженностью
Количественный
анализ
ДНК около 800 п.н. была выполнена с
универсальными праймерами [6] 8f
5’– AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3 и
806R5’
ggACTACCAgggTATCTAAT
в
общем объеме 20 мкл. Готовили
смесь, содержащую 25 нг ДНК, 1Ед.
Taq DNA Polymerase (Fermentas), 0,2
mM каждого дНТФ, 1-х ПЦР буфер,
2,5 mM MgCl2, 10 пмоль каждого
праймера.
Программа
ПЦР
выполнялась на амплификаторе
Mastercycler Gradient, (Eppendorf) и
включала в себя длительную
денатурацию 5 минут при 95С; 30
циклов: 95С-30 с, 55С – 40 с, 72С
– 50 с; финальную элонгацию 72С –
7 минут.
Анализ амплифицированных
целевых
фрагментов
ДНК
проводили методом разделения
фрагментов ДНК в 1,5 агарозном
геле,
в
присутствии
интеркалирующего
агента
–
бромистого этидия, который был
использован с целью дальнейшей
визуализации ДНК. Электрофорез
проводили в камере для горизонтального электрофореза Max Fill
HU10, и источником тока «Consort
EV 243». В качестве электродного
буфера использовали 1х ТАЕ-буфер.
Документирование
полученных
результатов проводили, используя
систему
документаций
гелей
Bio-Print.
Размеры
молекул
анализируемых
образцов
ДНК
определяли путем сопоставления их
электрофоретической подвижности
в геле с подвижностью маркеров –
фрагмент
ДНК
известной
молекулярной массы. В качестве
маркера
молекулярных
масс
использовали DNA Ladder 1kb
(Fermentаs).
ПЦР продукты очищали от
остатков олигонуклеотидов методом
дефосфолирирования с помощью
щелочной фосфатазы (SAP – shrimp
alkaline phosphatase) и эндонуклеазы
I типа.
Реакцию
секвенирование
проводили с применением набора
реагентов
для
циклического
секвенирования с использованием
красителей-терминаторов
CEQ
WellRED (CEQ Dye Terminator Cycle
Sequencing
Kit)
согласно
инструкции
производителя,
с
последующим
разделением
фрагментов на автоматическом
генетическом анализаторе CEQ 8000
(Beсkman Coulter). Нуклеотидные
последовательности, полученные, с
применением прямого и обратного
праймеров были проанализированы
и объединены в общую последовательность, используя программное
обеспечение SeqMan (DNASTAR).
Полученные
нуклеотидные
последовательности 16S rRNA гена
были
идентифицированы
относительно доступных нуклеотидных
последовательностей
депонированных в базах данных
Gene
Bank
(www.ncbi.nih.gov),
используя
алгоритм
BLAST.
Идентификация была осуществлена
относительно инвентарных номеров
GeneBank
первых
трех
нуклеотидных последовательностей
имеющих максимальное совпадение.
Кроме
этого,
эти
же
нуклеотидные последовательности
были использованы для построения
филогенетических деревьев с рефе-
рентными
нуклеотидными
последовательностями
используя
программное обеспечение Mega 5.0.
Для выравнивания использовали
алгоритм ClustalW, а для построения
древ
метода
присоединения
ближайших
соседей
(Neiighbor-Joining NJ).
Основные результаты исследований НИР и обсуждение
полученных данных
Была проведена работа по от 4,5 до 80 нг/мкл, соотношение
рекультивированию коллекционных длин волн 260/280 в среднем
штаммов
микроорганизмов
на составляло 1,7. В результате
питательных средах. Одновременно постановки
ПЦР
был
проводился
контроль
роста амплифицирован
фрагмент
изучаемых микроорганизмов по протяженностью около 800 п.н. В
характеру образуемых колоний. В качестве примера на рисунке 1
результате проведенной работы отображены результаты амплифибыли выделено 36 образцов ДНК кации 16 образцов с отрицательным
концентрация которых варьировала контролем.
Обозначения: (1-16) образцы, (М) маркер молекулярного веса
(Fermentas) (100 – 10000 п.н., от 100-1000 шаг 100 п.н.), (К-) отрицательный
контрольный образец;
Рисунок 1 - Электрофореграмма ПЦР продуктов амплификации фрагмента
16S rRNA гена
Как видно на рисунке 1 во всех
образцах
отчетливо
видна
специфическая
полоса,
свидетельствующая
об
амплификации фрагмента ДНК
протяженностью около 800 п.н. В
отрицательном
контроле
отсутствуют
продукты
амплификации.
В фореграмме нуклеотидной
последовательности штамма B.
abortus 1324 было выявлено наличие
смешанного профиля (рис. 2),
указывающее на его контаминацию.
Смешанный профиль
Рисунок 2 – Смешанный профиль нуклеотидной последовательности
16S rRNA штамма B. abortus 1324
Сравнительный анализ генетических и фенотипических методов
представлен в таблице 1.
Штамм идентифицируемый
фенотипическими методами как C.
chavoe
при
генетической
идентификации в BLAST имел максимальное совпадение (100%) с
нуклеотидной последовательностью
C. novyi , также при построение
филогенетического дерева (рис 3а)
расположен на одной кладе с C.
novyi.
Штамм E. сoli 015 достоверно
был
идентифицирован
фенотипическими и генетическими
методами (рисунок 3б).
Нуклеотидная
последовательность 16S rRNA гена
S. abortus ovis 17 при идентификации в BLAST имела максимальный
процент
совпадения
с
нуклеотидными
последовательностями
Citrobacter
freundii
(JX001466, JX0014665), однако при
построение
филогенетического
дерева с референтными последовательностями имеющимися в базе
LPSN
(http://www.bacterio.cict.fr/)
расположена отдельной ветвью но
наиболее генетически близка группе
сальмонелл (рис 3в). Таким образом
для данного штамма анализ 16S
rRNA гена не позволил провести
видовую идентификацию.
Штамм P. multocida bovis 11
генетическим
методом
идентификации был идентифицирован как Enterococcus spp. На
рисунке 3г видно что он расположен
на одной ветви с E. durans, E. hirae,
E. faecium. Высокая нуклеотидная
идентичность 16S rRNA гена между
данными видами не позволяет
провести
их
видовую
идентификацию.
Трудно
идентифицируемые
фенотипическими
методами
штаммы
микобактерий
M.
tuberculosis и M. phlei на основе
анализа
нуклеотидной
последовательности 16S rRNA гена
были идентифицированы как M.
avium и Paenibacillus barengoltzii
соответственно (рис 3д.).
26 штаммов бруцелл на
основании анализа нуклеотидной
последовательности 16S rRNA гена
были
идентифицированы
как
Brucella spp. Штаммы B. suis 1024, B.
suis 1001-1, B. ovis 68 на основе
анализа
нуклеотидной
последовательности 16S rRNA гена
были
идентифицированы
как
Bordetella bronchiseptica (в связи с
большими
размера
филогенетическое
дерево
не
приводится).
AF025367 Citrobacter sp.
3а
AF025373 Citrobacter werkmanii
AJ233408 Citrobacter freundii
3в
AB045606 Clostridium novyi
Clostridium chavoe KazNIVI
AB037910 Clostridium haemolyticum
X74770 Clostridium tetani
L37585 Clostridium botulinum A
60
100 X68189 Clostridium sporogenes
NR 074482 Clostridium perfringens
U59278 Clostridium septicum
M59091 Clostridium carnis
U51843 lostridium chauvoei
AB075771 Clostridium sordellii
100
AF025368 AF025368 Citrobacter braakii
AF025369 Citrobacter sp.
100
58
36
100
48
M59291 Citrobacter freundii
AY373829 S. subterranea strain FRC1
EU014684 S. enterica subsp. houtenae
AF025372 Citrobacter diversus
HQ992945 Citrobacter koseri
AF025363 Citrobacter rodentium
AF025364 Citrobacter sedlakii
0.02
EU014687 S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis
EU014685 S. enterica subsp. salamae
3б
X80725 E.coli (ATCC 11775T)
E. coli 015
AF530475 Escherichia fergusonii
EU014688 S. enterica subsp. diarizonae
EU014681 S. choleraesuis
EU014686 S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium
EU014681 S.choleraesuis
Z47544 S.typhi
AJ508775 Escherichia albertii
JN175333 Escherichia blattae
JN175345 Escherichia hermannii
Salmonella abortus ovis 17 KazNIVI
EU014680 S. enterica subsp. indica
JN175338 Leclercia adecarboxylata
AF008580 S. enterica IIIa
AF530476 Escherichia vulneris
AF025371 Citrobacter farmeri
FR870441 Citrobacter amalonaticus
AF029227 S. bongori
0.002
0.002
3г
3д
X 7 6 1 7 7 E .ca n is
A F 0 6 1 0 1 3 E . m u n dtii
E F 1 9 7 9 9 4 E . th a ila n dicu s
AJ536036 M . intracellulare
EF054881 M . arosiense
U84502 M . bohemicum
EF591053 M . bouchedurhonense
JF738056 M . yongonense
AJ536037 M . avium subsp. avium
X52934 M . avium subsp. paratuberculosis
A J 2 7 6 3 5 4 E . du ra n s
P a s te u re lla m u lto cida b o v is 1 1 K A Z N I V I
Y1 7 3 0 2 E . h ira e
A J 3 0 1 8 3 0 E . fa e ciu m
EF521891 M . avium subsp. silvaticum
X52934 M . paratuberculosis
M ycobacterium tuberculosis KAZNIVI
AF547932 M . haemophilum
A F 5 3 9 7 0 5 E .ra tti
A F 3 3 5 5 9 6 E .v illo ru m
A J 2 7 1 3 2 9 E .v illo ru m
X52930 M . malmoense
X52926 M . szulgai
AF480602 M . gastri
AJ536035 M . kansasii
A J 8 9 1 1 6 7 E .de v rie s e i
A F 0 6 1 0 0 2 E . ps e u do a v iu m
A F 1 3 3 5 3 5 E . a v iu m
Y1 8 2 9 6 E . ra ffin o s u s
X88922 M .conspicuum
AY368456. M . nebraskense
DQ536403 M . seoulense
D Q 4 1 1 8 1 0 E . gilv u s
A J 3 0 1 8 3 5 E .m a lo do ra tu s
FJ042897 M . mantenii
GQ153270 M . paraffinicum
AF480604 M . scrofulaceum
X52923 M . gordonae
A Y0 2 8 4 3 7 E .ph o e n icu lico la
A Y3 9 6 0 4 7 E . h e rm a n n ie n s is
D Q 4 1 1 8 1 2 E . pa lle n s
Y1 1 6 2 1 E .a s in i
AB548725 M . ulcerans
AB268503 M . shinjukuense
AF406783 M . lacus
AF480605 M . africanum
A J 8 8 8 9 0 6 E .ca n in te s tin i
A F 0 6 1 0 0 7 E .dis pa r
A B 0 1 2 2 1 2 E . fa e ca lis
AF547903 M . bovis
AJ131120 M . tuberculosis
AF480584 M . microti
A M 0 3 9 9 6 8 E . te rm itis
A Y9 4 3 8 2 0 E . ca cca e
A F 2 8 6 8 3 1 E . m o ra v ie n s is
AF502574 M . pinnipedii
X58890 M .tuberculosis
X58890 M ycobacterium
A F 2 8 6 8 3 2 E .h a e m o pe ro x idu s
A M 0 3 9 9 6 6 E .s ile s ia cu s
A F 0 3 9 9 0 0 E . ga llin a ru m
AY457083 M . w olinskyi
X67847 M .intermedium
A F 0 3 9 9 0 3 E .ca s s e lifla v u s
A J 4 2 0 8 0 2 E . fla v e s ce n s
AJ431371 M ycobacterium sp.
U94745 M . duvalii
A J 8 7 7 0 1 5 E . a qu a m a rin u s
AJ010747 M . elephantis
AF480603 M . phlei
A F 0 6 1 0 0 1 E .s u lfu re u s
A J 3 0 1 8 4 0 E . s o lita riu s
AJ634379 M . confluentis
AB537170 M . madagascariense
A F 0 6 1 0 0 4 E . s a cch a ro ly ticu s
E F 1 5 4 4 5 4 E . ca m e llia e
AJ131761 M . smegmatis
A J 5 8 2 7 5 3 E . ita licu s
X55602 M . thermoresistible
AJ429045 M . agri
N R 0 2 5 6 2 5 E .ita licu s
A F 0 6 1 0 0 9 E . ce co ru m
A F 0 6 1 0 0 6 E . co lu m b a e
X52932 M . flavescens
AB073196 P. macerans
AY323610 P. timonensis
M ycobacterium phlei KAZNIVI
L 3 2 8 1 3 E .s e rio licida
A F 2 9 4 4 1 0 P a s te u re lla m u lto cida s u b s p. m u lto cida
0 .0 5
AJ548480 M . chimaera
AY167814 P. barengoltzii
0.02
Рисунок 3 – Филогенетические деревья построенные на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена
Во
многих
нуклеотидной
случаях
анализ
видовой принадлежности. Это связано с
16S
тем что, бруцеллы наземных животных
последовательности
rRNA является окончательным решением
являются
при определении этиологических агентов
уровень ДНК гибридизации между видами
инфекционных
превышает
болезней
человека,
генетически
80%,
а
однородными:
нуклеотидная
встречаемыми
идентичность 16S rRNA составляет около
бактериями [7]. Но ограниченная дис-
100%. Также видовая идентичность не
криминационная способность 16S rRNA
была установлена у Enterococcus spp и
гена
Salmonella spp.
вызванных
редко
не
всегда
позволяет
идентифицировать бактерии до видового
Важно отметить, что генетическая
уровня и требуется дальнейший анализ
идентификация
генов кодирующих белки или постановка
недостоверную
целевых
идентификацию у 9 из 36 штаммов, что
фенотипических
тестов.
В
нашем исследовании не один штамм
позволила
выявить
фенотипическую
составило 25%.
бруцелл не был идентифицирован до
Заключение
Проведенные исследования еще
раз
доказывают
введения
целесообразность
генетической
выделенных
культур
лабораторную
в
практику
ветеринарных лабораторий необходима
ветеринарных
лабораториях
является
автоматизация
технологии. В настоящее время может
быть оптимизировано только постановка
ПЦР и анализ последовательности с
соответствующего
программного обеспечения с валидированными базами данных, например MicroSeq
(Applied Biosystems Inc) или SmartGene
IDNS.
Однако,
обеспечение
затрудняет интерпретацию. Поэтому для
клиническую
16S rRNA анализа в микробиологических
использованием
что
внедрения данной методики в практику
больших препятствий в использовании
недостаточная
результаты,
идентификации
лабораторий Казахстана. Одно из самых
клинических
противоречивые
разное
программное
может
выдавать
дальнейшая
разработка методических
указаний и валидированных баз данных.
Таблица 1. Сравнительный анализ генетических и фенотипических методов идентификации
№
штамма
В-0179
В-0083
В-0089
В-0053
В-0055
В-0113
B-0101
Фенотипическая
идентификация
Генетическая
идентификация
№
штамма
Фенотипическая
идентификация
E. сoli 015
E. сoli
B-014
B. melitensis
1
499
Enterococcus B-014
B.
bovis 11
spp.
8
melitensis487
S.abortus ovis
Salmonella
B-015
B. melitensis
17
spp.
4
511
M. tuberculosis
M. avium
B-015
B.
8
melitensis10
Brucella spp.
1
B.melitensis 1
Brucella spp.
B-016
B.
1
melitensis909
B-017
B.melitensis
0
54
B-017
B.
4
melitensis653
B-034
B.melitensis10
7
ш3
B-034
B.melitensis
8
А1/3
B-039
B. melitensis
9
Ю-1
Brucella spp.
В-010
B. abortus
Контаминирована
0
1324
B-018
B. suis 4-1
M. phlei
C. chavoe
P. barengoltzii
C. novyi
B. abortus 4556
B. abortus
T-7-1
B-0107
Brucella spp.
B. abortus 4004
Brucella spp.
B-0113
B. abortus 1106
Brucella spp.
B-0101
B. abortus 4556
Brucella spp.
B-0137
B. abortus 64-1
Brucella spp.
B-0345
B. abortus
ЮК-1
B-0346
B-0467
Brucella spp.
B. abortus
ЮК-2
B-0377
Brucella spp.
P. multocida
Brucella spp.
B-0103
Генетическая
идентификация
B. abortus
Brucella spp.
B-016
К-9-1
Brucella spp.
0
B. abortus
Brucella spp.
B-019
Brucella spp.
Brucella spp.
Brucella spp.
Brucella spp.
B. suis 723-1
Brucella spp.
8
B-020
Brucella spp.
Brucella spp.
7
B-018
Brucella spp.
Brucella spp.
B. suis 196-1
Brucella spp.
B. suis 1024
B.
B-0501
К-4107
2
B. abortus 1126
B-018
Brucella spp.
B-0509
B. abortus
Brucella spp.
B. suis 1001-1 B.
bronchiseptica
9
B-018
43-62
bronchiseptica
B. ovis 68
B.
bronchiseptica
0
Список литературы
1.
Onderdonk A.B., Sasser M. Gas-liquid and high-performance chromatographic
methods for the identification of microorganisms. Manual of Clinical Microbiology, 6th Ed. Washington: American Society for Microbiology, 1995. – 1506 р.
2.
Pfyffer.
J.A. Kellogg, D.A. Bankert, G.S. Withers, W. Sweimler, T.E. Kiehn, G.E.
Application
of
the
Sherlock
Mycobacteria
Identification
System
using
high-performance liquid chromatography in a clinical laboratory // J Clin Microbiol. - 2001. –
Vol. 39. – P. 964-970.
3.
A. Karger, R.Stock, M.Ziller, M.C.Elschner, B.Bettin, F.Melzer, T.Maier,
M.Kostrzewa, H.C.Scholz, H.Neubauer, H.Tomaso. Rapid identification of Burkholderia mallei
and Burkholderia pseudomallei by intact cell Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation
mass spectrometric typing // BMC Microbiology. – 2012. – Vol. 12. – P. 229 - 234.
4.
Woese C. R. Bacterial evolution // Microbiological Reviews. - 1987. – Vol. 51. –
P 221–271.
5.
H. Cai, M. Archambault, J. F. Prescott. 16S ribosomal RNA sequence–based
identification of veterinary clinical bacteria // J Vet Diagn Invest. – 2003. – Vol.
15. P.
465–469.
6.
Vegas E. Z. S., Nieves B., Araque M., Velasco E., Ruiz J., Vila J. Outbreak of
Infection With Acinetobacter Strain RUH 1139 in an Intensive Care Unit // Infection control
and hospital epidemiology. – 2006. - Vol. 27, № 4. - P. 397 – 404.
7.
C.J. Somers, B.C. Millar, J.Xu. Haemophilus segnis: a rare cause of
endocarditis // Clinical Microbiology and Infection.- 2003. – Vol. 9. – P. 1048–1050.
Түйін
Коллекциялық микроорганизм штамдарының қоректік ортада қайта өсіру
жұмыстары жүргізілді. Концентрациясы 4,5 тен 80 нг/мкл дейін болатын ДНҚ-ң 36
сынамасы бөлініп алынды. ПТР қою нәтижесінде 800 ж.н. болатын фрагмент
амплификацияланды және штамдардың 16S rRNA генінің нуклеотидтік тізбегі
анықталды.
Анықталған
бояғыш-терминаторларды
нуклеотидтік
қолдану
арқылы
тізбектермен
секвенирлеу
CEQ
жүргізіліп,
WellRED
ары
қарай
автоматтық генетикалық анализаторда CEQ 8000 (Beсkman Coulter) фрагменттерді
бөлініп талданды және жалпы тізбекке біріктірілді. Алынған 16S rRNA генінің тізбектері,
Gene Bank деректер базасында депонирленген нуклеотидтік тізбектермен BLAST
алгоритімін
қолдану
арқылы
нақтыланды.Референтті
нуклеотидтік
тізбектермен
филогенетикалық ағаштар құрылды.
Summary
The work on reculturing collection strains of microorganisms was carried on culture
media. 36 DNA samples were isolated with a concentration of 4.5 to 80 ng/mcl. As a result
of PCR analysis fragment with the length of about 800 bp was amplified and the nucleotide
sequence of 16S rRNA gene of strains was determined. Nucleotide sequences were
sequenced using the CEQ WellRED Dye Terminator, followed by the separation of fragments
on an automatic genetic analyzer a CEQ 8000 (Beckman Coulter), analysis and association
in the general sequence. The resulting nucleotide sequences of the 16S rRNA gene were
identified by the comparison with the accessible nucleotide sequences deposited at GenBank
databases, using the algorithm BLAST. Phylogenetic trees were constructed with the
reference nucleotide sequences.
Скачать