АПОПТОЗ И ЕГО РОЛЬ В ЦЕЛОСТНОМ ОРГАНИЗМЕ
реклама
ЛЕКЦИЯ ЛЕКЦИЯ А.А. Ярилин ГНЦ — Институт иммунологии Минздрава России, Москва ки клеток и поддержания постоянства их численности. Роль апоптоза в популяциях неделящихся клеток минимальна; обычно она сводится к реакции на внешние воздействия (типа ионизирующей радиации). Напротив, в формирующихся и обновляющихся популяциях клеток апоптозу принадлежит существенная роль фактора, уравновешивающего процессы пролиферации и тоза. Для этого вида свойствен очень жесткий контроль общей численности клеток. Показано, что этот гомеостаз обеспечивается путем апоптоза части клеток. Его индукция и осуществление контролируются набором из 14 генов, из которых один (ces-1) обусловливает выбор апоптического пути, два (ced-З и ced-4) — его реализацию, а остальные или ингибируют апоптоз, или АПОПТОЗ И ЕГО РОЛЬ В ЦЕЛОСТНОМ ОРГАНИЗМЕ* 2. Роль апоптоза в многоклеточном организме 2.1. Апоптоз, процессы формообразования и клеточного гомеостаза на уровне организма Если массовая гибель клеток многоклеточного организма по механизму некроза (например, вследствие гипоксии) часто ассоциируется с гибелью всего организма, то гибель клеток по механизму апоптоза рассматривается скорее как условие нормального существования организма. В наиболее общей форме назначение апоптоза (в сочетании с его альтернативой — пролиферацией) состоит в определении размеров и «архитектуры» организма, что проявляется: • в поддержании постоянства численности клеток; • в определении формы организма и его частей; • в обеспечении правильного соотношения численности клеток различных типов; • в удалении генетически дефектных клеток. Эти функции апоптоза реализуются на уровне клеточных популяций — в процессе дифференциров- * Продолжение, начало в №1, 2003. 46 корригирующего дифференцировку. Из этого следует, что интенсивность апоптоза выше в начальные периоды онтогенеза, в частности во время эмбриогенеза, а во взрослом организме апоптоз продолжает играть большую роль лишь в быстро обновляющихся тканях. Назначение апоптоза в клеточных популяциях можно сформулировать таким образом: • поддержание численности клеток в популяции на заданном уровне; • определение этого уровня и его изменение под влиянием внешних (по отношению к клетке) сигналов вплоть до полной элиминации данного типа клеток; • селекция разновидностей клеток внутри популяции (в том числе элиминация клеток с генетическими дефектами). Хотя общетеоретические представления в данной области не разработаны, накоплено достаточно много фактов, позволяющих иллюстрировать вышесказанное. Наиболее простой иллюстрацией значимости апоптоза для многоклеточного организма являются данные о роли этого процесса в поддержании постоянной численности клеток нематоды Caenorhabditis elegans, о чем уже упоминалось в связи с генетическим контролем апоп- отвечают за фагоцитоз и расщепление погибших клеток. Примером проявления апоптоза в поддержании численности отдельных клеточных популяций может служить увеличение численности эндотелиальных клеток и размера сосудов у мышей с прицельной инактивацией («нокаутом») гена Braf, контролирующего апоптоз эндотелиальных клеток у мышей. In vitro регуляция численности клеток в популяции проявляется в индукции их апоптоза при достижении определенного уровня плотности. Роль апоптоза в формообразовании иллюстрируют результаты исследования локализации апоптотических клеток в процессе морфогенеза внутреннего уха у куриных эмбрионов. Апоптозу подвергаются клетки тех участков закладки внутреннего уха, которым предстоит участвовать в формировании полуциркулярных каналов. Подавление апоптоза путем гиперэкспрессии гена bcl-2 обусловливает задержку или отсутствие формирования просвета названных каналов. Морфогенетические аномалии, связанные с блокадой апоптоза, могут быть вызваны также ингибированием биохимических процессов, лежащих в основе апоптоза. Так, ингибиторы каспаз задерживают закрытие 2/2003 ГЛАУКОМА нейральной трубки у куриных эмбрионов. Роль апоптоза в дифференциации отдельных частей органов и их формообразовании изучается на примере становления в эмбриогенезе органов, особенно почки и головного мозга. Особенно пристальное внимание привлекает в этом контексте процесс формирования коры головного мозга. Так, у человеческого плода критическим периодом кортикогенеза является срок с 12-й до 23-й недели беременности, когда происходит интенсивная пролиферация клеток вентрикулярной зоны и миграция нейронов. Наиболее интенсивный апоптоз регистрируется в постмитотических клетках вентрикулярной зоны и вдоль путей миграции нейронов в промежуточной зоне; он отсутствует в кортикальной пластинке. Роль апоптоза при этом сводится к селекции клеток, которым предстоит участвовать в формировании коры. Другим примером селективного апоптоза определенного типа клеток может служить массовая гибель (апоптоз) интернейронов (но не мотонейронов) серого вещества спинного мозга крыс вскоре после рождения. Формированием условий, способствующих массовому апоптозу целых клеточных популяций, объясняют такие драматические события эмбриогенеза, как утрата хвоста зародышами амфибий или атрофия у них гипохорды. В качестве причины внезапной утраты гемопоэтической функции печенью эмбрионов называют тотальный апоптоз кроветворных клеток, вследствие снижения восстановительного потенциала в их микроокружении. Это снижение обусловлено деятельностью гепатоцитов, которая приводит к ослаблению активности γ-глутаматтрансферазы и уменьшению концентрации глутатиона. Наконец, быстрая атрофия гормонально-зависимых тканей обусловлена апоптозом клеток в связи со снижением концентрации соответствующих гормонов. Процессы такого рода периодически совершаются в женских половых органах в ГЛАУКОМА 2/2003 течение менструального цикла. Аналогичные процессы в предстательной железе происходят при снижении концентрации андрогенов. Роль апоптоза в гомеостазе обновляющихся популяций клеток во взрослом организме прослежена также на примере кроветворных клеток, клеток сперматогенного эпителия, энтероцитов ворсинок слизистой тонкой кишки. Во всех этих клеточных популяциях апоптозу подвергаются клетки на определенных стадиях развития. Чувствительность клеток к апоптозу чаще всего определяется ослаблением экспрессии эндогенных ингибиторов апоптоза — Bcl-2, Bcl-xL и др. Так, в сперматогенном эпителии эти факторы экспрессируются слабее всего в мейотических и постмейотических клетках и сильно — в сперматогониях — в полном соответствии с подверженностью апоптозу первых и устойчивостью к нему вторых. Судьба кроветворных клеток наглядно иллюстрирует зависимость развития их апоптоза от соотношения факторов с противоположным эффектом. Ранние кроветворные предшественники, несущие маркер CD34, не экспрессируют Fas-рецептор; половина этих клеток содержит Вс1-2. Под влиянием фактора некроза опухоли или интерферона γ Fas-рецептор индуцируется, а экспрессия Вс1-2 ослабляется, и клетки становятся более подверженными апоптозу. Дальнейшая их судьба определяется соотношением цитокинов, препятствующих развитию апоптоза (трансформирующего фактора роста β, ФНО, хемокина MIP-1) или защищающих от него (ИЛ-3 и фактора стволовых клеток для наиболее юных кроветворных клеток, ГМ-, Г- и М-колониестимулирующих факторов и ИЛ-10 для клеток миелоидного ряда, ИЛ-7 для клеток лимфоидного ряда, эритропоэтина для эритроидных клеток, ИЛ-5 для эозинофилов). Еще более важным для предотвращения апоптоза развивающихся клеток, в частности кроветворных, является сохранение контакта с межклеточным матриксом, обусло- вленное мембранными интегринами. Межклеточные контакты могут как способствовать, так и препятствовать развитию апоптоза. Уже упоминалось о контактной индукции апоптоза в плотных культурах клеток. Примерами апоптогенного действия межклеточных взаимодействий могут служить индукция апоптоза пре-В-клеток под влиянием плазмоцитов in vitro. Роль утраты контактов с межклеточным матриксом является универсальной причиной апоптоза клеток, «теряющих свой дом». Апоптоз неизбежно развивается при отделении клеток от субстрата (при утрате способности или возможности прикрепляться к поверхностям и переходе прилипающих клеток в суспензию). Приобретение устойчивости к такого рода переходам может быть связано с генетическими перестройками и обычно означает малигнизацию клеток. То же справедливо в отношении потребности клеток в факторах, защищающих их от апоптоза. Помимо упомянутых цитокинов, поддерживающих выживаемость кроветворных клеток, аналогичные факторы существуют для всех прочих типов клеток. Примерами таких факторов могут служить фактор роста фибробластов, поддерживающий жизнеспособность фибробластов, коллаген типа II, необходимый для выживания хондроцитов, фактор роста нервов и нейротрофины, защищающие от апоптоза нейроны, и т. д. Целую систему факторов, контролирующих развитие апоптоза клеток различных типов, образуют морфогенетические белки из костной ткани. Они действуют главным образом на клетки, происходящие из мезодермы, вызывая (реже ингибируя) развитие апоптоза. Спектр этих факторов, обладающих определенной специфичностью в отношении клеток разных типов, неодинаков в различных органах, что в определенной степени определяет судьбу образующих их клеток. Эти факторы участвуют в формировании архитектуры определенных участков тела, например, суставных полостей, в которых локализуются 47 ЛЕКЦИЯ ЛЕКЦИЯ два типа белков этой группы — ВМР-2 и ВМР-7, причем первый содержится на хрящевых поверхностях, формирующих сустав, а второй — в околохрящевой зоне. Приведенные примеры лишь выборочно отражают участие апоптоза в детерминации размеров и формы тела, а также в процессах морфогенеза и поддержания гомеостаза клеточных популяций. Факты такого рода быстро накапливаются, и в ближайшее время можно ожидать новых обобщений в этой области. Пока же они продолжают оставаться в значительной степени разрозненными. Есть лишь одна область знаний, в которой роль апоптоза определялась достаточно точно и разносторонне — это иммунология. К краткому обзору места апоптоза в иммунологических процессах мы обратимся в следующей главе. 2.2. Роль апоптоза в иммунных процессах Можно выделить 3 стадии развития лимфоцитов, на которых роль апоптоза велика, но реализуется по-разному (табл. 4): 1) до формирования антигенраспознающего рецептора; 2) в период формирования рецептора, последующей селекции и созревания лимфоцитов; 3) в период функционирования зрелых лимфоцитов. В первой стадии лимфоциты фактически еще не выделяются из общего семейства кроветворных клетокпредшественников. Выше мы уже говорили о том, что все эти клетки нуждаются в факторах выживания, предохраняющих их от самопроизвольного развития апоптоза. Это свидетельствует о предсуществовании в этих клетках программы гибели и отсутствии внутренней защиты в виде экспрессии факторов Вс1-2 и Bcl-xL. Основным экзогенным фактором выживания предшественников лимфоцитов обоих классов служит ИЛ-7. На стадиях, непосредственно предшествующих началу перестройки генов антигенраспознающих рецепторов, — CD19+CD76+ про-В-клеток и CD44+CD25+ про-Т-клеток, — экспрессируется Вс1-2 и клетки при48 обретают устойчивость к индукторам апоптоза, что означает их выход из пула малодифференцированных клеток-предшественников. Далее следует этап драматических перестроек генов В- и Т-клеточного рецепторов (BCR, TCR), важной составляющей которых являются разрывы и рекомбинации нитей ДНК. Это само по себе может служить сигналом к развитию апоптоза (с участием фактора р53). Однако высокий уровень экспрессии Bcl-2 и Bcl-xL препятствует этому. Лишь в случае неудачной реализации перестройки рецепторных генов клетка подвергается апоптозу. После завершения перестроек и экспрессии рецепторов (BCR на В-лимфоцитах и TCR на Т-лимфоцитах) происходит резкое снижение экспрессии Bcl-2 и Bcl-xL. Это событие означает начало процесса селекции клонов — выбраковки ненужных и опасных для организма клонов лимфоцитов. Процесс селекции достаточно полно изучен для Т-клеток. Объектом селекции являются кортикальные тимоциты, слабо экспрессирующие рецепторный комплекс TCR–CD3 и несущие одновременно корецепторы CD4 и CDS. Эти клетки практически лишены Bcl-2 и Bcl-xL, но содержат на своей поверхности Fas-рецептор. Такое соотношение факторов, препятствующих и способствующих развитию апоптоза, обрекает их на гибель в отсутствие специальных факторов зашиты. Источником защитных сигналов для них служит взаимодействие их рецептора (TCR) с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), которые экспрессируют эпителиальные клетки микроокружения глубоких слоев коры тимуса — распознавание аутологичных молекул ГКГ. Если клетка несет рецептор, способный распознать эти молекулы (при этом роль встроенного в них пептида пока неясна), она получает «поддерживающий» сигнал, который приводит к усилению экспрессии рецептора TCR, активации и пролиферации клетки. Остальные клетки «игнорируются», что означает для них неизбежное развитие апоптоза. Пока не вполне ясно, что служит непосредственным сигналом к развитию апоптоза в данном случае — действие глюкокортикоидов и пуриновых нуклеотидов, присутствующих в микроокружении, или активные воздействия со стороны окружающих эпителиальных клеток — всех или определенных их субпопуляций. Положительная селекция сопряжена с дифференцировкой тимоцитов на субпопуляции CD4+CD8– и CD4–CD8+ клеток, основой которой является выбор способа распознавания антигенных пептидов — в составе молекулы I класса (в их распознавании участвует молекула CD8) или II класса (распознаваемой с участием CD4). При этом экспрессия корецептора CD4 в сочетании с TCR, распознающим пептид в контексте молекул ГКГ I класса (не комплементарных корецептору), приводит к апоптозу клетки, так же как экспрессия CD8 в сочетании с TCR, распознающим пептид в контексте молекул ГКГ II класса. Причиной развития апоптоза в этом случае может служить «неполнота» сигнала от распознавания молекул ГКГ, который оказывается недостаточным для включения защиты от апоптоза. После положительной селекции тимоциты подвергаются второму туру отбора — отрицательной селекции (пока неясно, как соотносится во времени этот этап селекции и дифференцировка на субпопуляции). На этой стадии выбраковываются аутореактивные клетки, т. е. тимоциты, чьи рецепторы распознают аутологичные пептиды в составе аутологичных молекул ГКГ. «Проба» на распознавание осуществляется при контакте тимоцитов, прошедших положительную селекцию и содержащих на своей поверхности больше молекул TCR-CD3, чем на предыдущем этапе развития, с дендритными клетками, богатыми мембранными молекулами ГКГ обоих классов. Пространственно этот процесс приурочен к кортико-медуллярной и, возможно, мозговой зонам. В случае распознавания аутологичного комплекса возникает летальный сигнал, приводящий к развитию апоптоза, 2/2003 ГЛАУКОМА Таблица 4 Роль апоптоза на различных этапах развития Т-лимфоцитов Экспрессия факторов, связанных с апоптозом Проявления апоптоза Развитие предшественников Т-лимфоцитов (до экспрессии TSR) В костном мозгу отсутствует экспрессия Bcl-2, в тимусе на стадии CD25 + — сильная экспрессия Bcl-2, слабая — Fas До стадии CD25 + апоптоз развивается в отсутствие ИЛ-7 и фактора стволовых клеток; в процессе перестройки генов рецептора — при непродуктивной перестройке Селекция клонов и дифференцировка субпопуляций На стадии CD4 +CD8 + слабая экспрессия Bcl-2, сильная — Fas, позже — наоборот CD4 +CD8 + тимоциты выживают при условии распознавания аутологичных молекул ГКГ на мембране эпителиальных клеток (положит. селекция), позже тимоциты гибнут при распознавании аутологичных комплексов пептид-молекула ГКГ на поверхности дендритных клеток (отрицат. селекция) Функционирование зрелых Т-клеток На покоящихся клетках сильная экспрессия Bcl-2, но не Fas. Активированные Т-клетки экспрессируют Fas и со временем теряют Bcl-2 Покоящиеся клетки устойчивы к индукции апоптоза. Активированные клетки гибнут при дефиците сигнала, повторной стимуляции, связывании CD4, в поздние сроки — спонтанно. Цитотоксические клетки индуцируют апоптоз клеток-мишеней Этап развития т. е. к удалению потенциально аутореактивных клонов. До сих пор нет четкого ответа на вопрос, почему распознавание аутологичных молекул на поверхности эпителиальных клеток защищает тимоциты от апоптоза, а их распознавание на мембране дендритных клеток индуцирует апоптоз тимоцитов. Предполагается, что исход зависит от интенсивности воздействия, определяемой степенью сродства рецептора по отношению к распознаваемому комплексу и плотности молекул TCR и ГКГ на поверхности клеток. Поскольку не все антигены представлены в тимусе, процесс выбраковки аутореактивных клонов и формирования аутотолерантности продолжается после эмиграции Т-клеток из тимуса. Однако в этом случае значительная часть аутоспецифических клеток не погибает, а блокируется вследствие индукции энергии и подавления их активности супрессорными клетками. Процесс селекции развивающихся В-лимфоцитов менее изучен. Однако известно, что и они подвергаются двум этапам селекции. При этом ГЛАУКОМА 2/2003 положительную селекцию определяет распознавание неизвестного фактора(ов) микроокружения, тогда как отрицательная селекция происходит аналогично тому, как она осуществляется в популяции Т-клеток. Реальность процессов отрицательной селекции ярко продемонстрирована в различных системах с трансфекцией генов, детерминирующих экспрессию неких чужеродных для данного вида молекул и одновременно — рецептора, специфичного в отношении этой молекулы. Поскольку при этом все лимфоциты несут рецептор, специфичный к «аутоантигену», они становятся объектом отрицательной селекции и полностью элиминируются. Зрелые Т- и В-лимфоциты, подвергшиеся селекции, в покоящемся состоянии лишены мембранного Fas-рецептора и экспрессируют протоонкогены Bcl-2 и Bcl-xL, что определяет их устойчивость к индукторам апоптоза. Положение меняется на обратное при активации лимфоцитов соответствующим антигеном или митогеном. Моноклональные антитела анти-Fas не дей- ствуют на покоящиеся лимфоциты и убивают активированные Т- и В-клетки. Активированные лимфоциты могут подвергнуться апоптозу при самых различных воздействиях — повторной стимуляции через перекрестное сшивание рецептора, при недостатке факторов роста (для Т-клеток — ИЛ-2, для В-клеток — главным образом ИЛ-4), действии глюкокортикоидов и т. д. Апоптоз может развиться и в процессе активации — например после предварительного связывания молекул CD4, при отсутствии костимуляции Т-клеток через CD28, В-клеток через CD40 и ростовых факторов. Дифференцировка В-лимфоцитов в клетки, секретирующие IgG-антитела, происходящая в зародышевых центрах, сопровождается интенсивным мутагенезом (он осуществляется в основном в темных зонах зародышевых центров на стадии центробластов, рис. 5). Конечное назначение мутагенеза в данном случае — появление клонов с более высоким сродством к антигену, чем у исходных В-лимфоцитов. Однако при этом отнюдь не все мутации приводят к 49 ЛЕКЦИЯ ЛЕКЦИЯ Рис. 5. Схема строения зародышевого центра, экспрессии Всl-2 в различных его зонах и процессов, в которые вовлекаются в этих зонах В-лимфоциты повышению сродства рецептора к антигену, а большинство из них даже снижают это сродство. Требуется отбор клонов с высоким сродством рецепторов к антигену и элиминация прочих клонов. Это происходит в базальных участках светлых зон зародышевых центров при взаимодействии В-лимфоцитов (центроцитов) и фолликулярных дендритных клеток, несущих антиген, на фоне ослабления экспрессии Bcl-2 в В-клетках. При сильном сродстве рецептора В-центроцитов к антигену их взаимодействие стабилизируется с помощью связывания молекулы CD40 В-клеток с ее лигандом CD 154 (CD40L), которое служит источником сигнала выживания В-клеток. 50 Лимфоциты, не получившие этого сигнала, гибнут. После завершения этапа селекции центроциты перемещаются в апикальные участки светлых зон, а затем мигрируют в мантию зародышевых центров, где дифференцируются в плазматические клетки-продуценты антител и В-клетки памяти. Уже в апикальном отделе светлых зон в В-клетках проявляется экспрессия Bcl-2; она возрастает в мантийной зоне. На этих этапах клетки В-ряда становятся устойчивыми к индукторам апоптоза. После дифференцировки Т-лимфоцитов в эффекторные клетки — цитотоксические Т-лимфоциты, Тклетки продуценты цитокинов, а также Т-клетки памяти в них также экспрессируется Bcl-2, и они временно приобретают устойчивость к индукторам апоптоза. Однако эффекторные клетки, несущие маркер CD45RO, все-таки легче направить на путь апоптоза, чем «наивные» Т-лимфоциты, несущие маркер CD45RA. Кроме того, экспрессия Bcl-2 в эффекторных клетках иммунной системы как Т-, так и В-типа продолжается недолго. Ее прекращение неизбежно приводит к гибели клеток. В клетках памяти экспрессия «защитных» протоонкогенов типа Bcl-2 продолжается дольше, что обусловливает длительный срок их жизни. Особенно стабильной оказывается экспрессия Bcl-2 и долгим срок жизни клеток памяти, если они периодически испытывают воздействие специфического антигена, локализующегося на поверхности дендритных клеток зародышевых центров. Известно еще по меньшей мере два аспекта функционирования лимфоцитов, непосредственно связанных с проявлениями апоптоза. Один из этих аспектов — реализация цитотоксической активности лимфоцитов. Клетки-мишени и естественных киллеров, и цитотоксических Т-лимфоцитов гибнут при морфологических и биохимических проявлениях апоптоза, хотя при этом примешиваются некоторые черты некротической гибели клеток. Эта двойственная природа гибели с преобладанием апоптоза может быть проанализирована на примере наиболее универсального механизма действия киллеров, состоящего в формировании в мембране клеткимишени пор, образованных вследствие полимеризации перфорина, и поступления через эти поры сериновых протеаз — гранзимов (главным образом гранзима В), который включает механизм апоптоза. Перфориновые поры, как правило, недостаточны для того, чтобы нарушить ионный гомеостаз клетки и вызвать ее отек и разрыв мембраны, хотя в определенный момент могут включиться и эти процессы. Однако раньше успевают сработать эффекты, обусловленные «впры2/2003 ГЛАУКОМА скиванием» гранзимов, которые проявляются в форме апоптоза. Среди других механизмов цитотоксического действия Т-лимфоцитов (но не NK-клеток) могут быть названы Fas-опосредованный апоптоз (клетки-мишени экспрессируют Fasрецептор, а цитотоксические Т-лимфоциты — Fas-лиганд) и апоптоз, индуцируемый фактором некроза опухоли или лимфотоксином через рецептор 1 типа (TCRF1). Другая область функционирования иммунной системы, для которой оказалась важной реализация апоптоза, — изоляция «иммунологически привилегированных» зон от проявлений активности эффекторных клеток иммунной системы. Недавно выяснилось, что по крайне мере две такие зоны — внутренние среды глаза и семенников — выстланы клетками, экспрессируюшими Fas-лиганд. В глазу его несут клетки эпителия, эндотелия, радужки, сетчатки, ресничных телец, в семенниках — эпителиальные, эндотелиальные и сертолиевы клетки. В результате эффекторные Т-лимфоциты, экспрессирующие Fas-рецептор, неизбежно гибнут в процессе миграции через этот барьер вследствие взаимодействия этого рецептора с Fas-лигандом барьерных клеток, приводящего к реализации апоптоза агрессивных мигрантов. Таким образом, апоптоз является одним из ключевых процессов, определяющих формирование антигеноспецифической составляющей иммунной системы и в значительной степени — реализацию ее эффекторных функций. В особенности важной оказывается роль апоптоза и обеспечении неотвечаемости лимфоцитов в отношении собственных компонентов организма, что достигается, с одной стороны, путем формирования аутотолерантности вследствие апоптоза аутореактивных клонов лимфоцитов, с другой — путем исключения некоторых областей организма из-под контроля иммунной системы с помощью заслона, преодолевая который, активированные клетки подвергаются апоптозу. ГЛАУКОМА 2/2003 4. Патология, обусловленная нарушениями апоптоза Материал предшествующих глав свидетельствует о том, что в реализации и контроле апоптоза участвуют многочисленные внутриклеточные факторы, он может быть вызван действием разнообразных внешних агентов, и от его осуществления зависят многие важные процессы, реализуемые на уровне организма. Из этого следует неизбежность существования патологии, связанной с нарушениями в звеньях индукции и регуляции апоптоза. Хотя этот аспект патологии привлек к себе внимание относительно недавно и не подвергнут исчерпывающему изучению, накопленных данных достаточно, чтобы с определенностью подтвердить высказанное выше суждение. Далее мы рассмотрим две группы патологических процессов, связанных с ослаблением и усилением апоптоза. 4.1. Патологические процессы, обусловленные ослаблением апоптоза На основании знаний о роли апоптоза в осуществлении физиологических процессов можно предположить, что недостаточность проявления апоптоза должна отразиться на процессах морфогенеза, элиминации клеток с генетическими поломками, становлении аутотолерантности и проявляться в форме разного рода дефектов развития, аутоиммунных процессах и злокачественных опухолях. Однако моделирование ослабления апоптоза путем трансфекции мышам гена bcl-2 в форме, предусматривающей его спонтанную экспрессию во всех или в определенных клетках, показало, что спектр проявляющихся при этом дефектов уже, чем можно было ожидать. Основное последствие гиперэкспрессии Bcl-2 состоит в развитии системных аутоиммунных процессов (вплоть до волчаночного синдрома), а также в накоплении необычных клеток Т-ряда с фенотипом CD3-TCRαβ+CD4–CD8–B220+ (т. е. лишенных корецепторов и несущих маркер В-клеток В220), в норме обнаруживаемых в ограниченном количестве лишь в некоторых органах, например, в печени. У таких мышей не наблюдалось повышения частоты развития злокачественных опухолей. Лишь при одновременной гиперэкспрессии трансфецированного гена с-mус у мышей наряду с аутоиммунными развивались лимфопролиферативные процессы. Патология, фенотипически идентичная описанной выше для мышей с гиперэкспрессией Bcl-2, была описана ранее у мышей линии MRL, несущих мутации Ipr (lymphoprolifеration) и gld (generalized limphoproliferative disease), которые используются в качестве моделей системных аутоиммунных процессов, в частности системной красной волчанки. Генетический анализ показал, что мутация Ipr затрагивает ген Fas-рецептора, а мутация gld — ген Fas-лиганда. У этих мышей с возрастом определяется широкий спектр аутоантител, в том числе к нативной ДНК, развивается аутоиммунный гломерулонефрит, гипертрофируются периферические лимфоидные органы с накоплением в них Т-клеток указанного выше мембранного фенотипа, что и обозначается как лимфопролиферативный синдром, хотя он и лишен признаков злокачественности. Существенно, что селекция клонов Т-лимфоцитов в тимусе этих мышей происходит, хотя и медленнее, чем в норме, тогда как селекция на периферии отменяется полностью. Таким образом, во-первых, нарушение экспрессии Fas-рецептора и Fas-лиганда имеет сходные последствия, проявляющиеся в нарушении формирования аутотолерантности и экспансии субпопуляции Т-клеток с неизвестной функцией, в норме имеющей ограниченное распределение в иммунной системе; во-вторых, эти же последствия наблюдаются при повышенной экспрессии фактора Bcl-2, ограничивающего апоптоз; в-третьих, от экспрессии Fas и Bcl-2 сильнее зависит селекция клонов Т-лимфоцитов на периферии, чем в тимусе. Поскольку среди последствий генетически обусловленного ослаб51 ЛЕКЦИЯ ЛЕКЦИЯ ления апоптоза в иммунной системе доминируют проявления системной аутоиммунной патологии, возник вопрос о состоянии апоптоза и связанных с ним факторов при аутоиммунных заболеваниях человека, прежде всего при системной красной волчанке. Прямые нарушения экспрессии Fas-рецептора и Bcl-2 или других представителей этого семейства при коллагенозах, как правило, не обнаруживается; выявлен единичный случай мутации гена Fas-лиганда. В то же время описан семейный аутоиммунный лимфопролиферативный синдром с генетическим дефектом Fas-рецептора. Хотя при системной красной волчанке апоптоз лимфоцитов при соответствующих условиях осуществляется, при этом заболевании и некоторых других коллагенозах (например, ювенильном ревматоидном артрите) обнаружена усиленная выработка растворимой формы Fas-рецептора, накопление которого в микроокружении лимфоцитов может препятствовать реализации Fas-зависимого апоптоза, например, апоптоза активированных лимфоцитов или Т-клеток, подвергающихся отрицательной селекции на периферии. Нами показано, что у части больных системной красной волчанкой для включения активационного апоптоза требуется присутствие клеток-индукторов в количестве на 2 порядка большем, чем требуется для развития апоптоза активированных Т-клеток здоровых людей. Образование растворимой формы Fas-рецептора особенно характерно для острого Тлимфобластного лейкоза. Оно обусловлено альтернативным сплайсингом транскриптов гена fas, что приводит к формированию белка, лишенного трансмембранного участка. Данные об изменениях в чувствительности к индукции апоптоза различных типов клеток при системной красной волчанке противоречивы. При волчаночном нефрите подавляется апоптоз клеток клубочков. С другой стороны, при системной красной волчанке нередко повышается экспрессия FasL и регистрируется усиление апоптоза лимфоцитов 52 in vitro, что коррелирует с усилением их спонтанной активации. При ревматоидном артрите Тлимфоциты, присутствующие в пораженной суставной полости, имеют все признаки, «обрекающие» их на развитие апоптоза (в частности, высокую экспрессию Fas-рецептора и низкую — Bcl-2), однако не подвергающиеся ему; предполагается, что в данном случае срабатывает некий механизм, препятствующий реализации апоптоза лимфоцитов (нейтрофилы в суставных полостях тех же больныx подвергаются массовому апоптозу). При болезни Бехчета с увеоретинитом ослаблена экспрессия Fas-рецептора на активированных CD4 + Т-клетках, что свидетельствует о потенциальном снижении их чувствительности к индукции апоптоза. Принципиально важная закономерность была установлена при анализе мишеней аутоантител при системной красной волчанке. Оказалось, что они одновременно являются мишенями действия сериновых протеаз (каспаз), обусловливающих включение эффекторного механизма апоптоза (см. раздел 1.4). Кроме того, аутоантитела при данном и родственных заболеваниях направлены против серин-треониновых киназ, которые активируются при клеточном стрессе. Вторую большую группу заболеваний, к генезу которых имеет отношение подавление апоптоза, образуют злокачественные опухоли, особенно имеющие гематогенное происхождение. В этом случае ключевым событием, способствующим развитию патологии, чаще всего служат соматические мутации, затрагивающие ген р53 (обычно его экзоны 5-8). Выше упоминалось, что фактор р53 трансформирует сигнал о нерепарированных разрывах цепей ДНК в сигнал к развитию апоптоза. Благодаря этому элиминируются клетки с повреждениями генетического аппарата, спонтанными или индуцированными (например, облученными). В нормальных клетках белок р53 не выявляется, а при опухолях его мутантную форму экс- прессирует до 70% трансформированных клеток. Однако большой разброс частоты мутаций р53 при различных злокачественных опухолях не позволяет сделать универсального заключения относительно его роли в патогенезе злокачественных процессов. Аномалии фактора р53, а также других внутриклеточных факторов, контролирующих апоптоз, в процессе развития опухоли имеют отношение к ее прогрессированию. Лишившись такого контроля, клетки, утрачивающие связи с межклеточным матриксом и другими факторами нормального микроокружения, не гибнут, а благополучно развиваются в чужой для них среде, что способствует метастазированию опухолей. Общеизвестным является факт рекомбинации гена bcl-2, при лимфоме Беркитта и некоторых формах фолликулярных лимфом, когда он транслоцируется из хромосомы 18 в ген Igh хромосомы 14. При тех же типах лимфом выявляется также аналогичное перемещение гена сmус из хромосомы 8 в тот же локус Igh. He вызывает сомнений связь патогенеза с этими транслокациями, которая реализуется через повышение резистентности измененных клеток к индукции апоптоза. Изменения р53, гиперэкспрессия Bcl-1 и Bcl-xL, активация каспаз являются основой формирования устойчивости к лечебным воздействиям, основанным на индукции апоптоза опухолевых клеток — рентгено- и радиотерапии, химиопрепаратам. Наиболее полной формой таковой резистентности является множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток. 4.2. Патологические процессы, связанные с усилением апоптоза Заболеваниям, основой которых является усиление апоптоза клеток организма, принадлежит, по-видимому, не меньшее место в патологии. Наиболее выраженные формы такого рода нарушений, при которых в процесс апоптоза тотально вовлекаются клетки любых типов, обычно несовместимы с развитием 2/2003 ГЛАУКОМА плода и приводят к внутриутробной гибели. Отмечаются лишь те локальные формы расстройств такого рода, проявляющиеся как дефекты развития с формированием «минусткани» (например, волчьей пасти). Наиболее распространенными вариантами патологии такого рода в сформировавшемся организме являются разного рода аплазии и дегенеративные процессы. Наиболее разнообразные их формы описаны в области патологии системы крови. Чаще всего они развиваются вследствие недостаточности факторов выживания костномозговых клеток-предшественников. Так, в эксперименте направленная инактивация гена ИЛ-7 приводит к тотальной лимфопении, в значительной степени связанной с гибелью предшественников В- и Т-лимфоцитов на стадиях, предшествующих формированию антигенраспознающих рецепторов. Аналогичные причины лежат в основе апластической анемии, анемии при дефиците железа, фолатов, витамина В12 талассемии, тромбоцитопении, нейтропении, панцитопении, хотя конкретные механизмы гибели клеток-предшественников в этих случаях отнюдь не всегда установлены. Отключение генов факторов выживания в ряде случаев не приводит к указанным последствиям в силу избыточности контроля выживания клеток. Особенно пристально изучается роль апоптоза в патогенезе миелодиспластических процессов, приводящих к панцитопении в результате апоптоза стволовых клеток и ранних кроветворных предшественников. Повышенная готовность к развитию апоптоза Т-лимфоцитов обнаружена при мультицентрической болезни Кастлемана. Большую группу заболеваний, связанных с усилением апоптоза, образуют инфекционные процессы. Индукторами апоптоза служат бактериальные эндотоксины (например, липополисахарид кишечных микробов) и экзотоксины (в частности, стафилококков, бордетелл и т. д.). Массовый апоптоз, опосредованный фактором некроза опухоли и ГЛАУКОМА 2/2003 его рецепторами I типа, развивается при сепсисе. При вирусных инфекциях сосуществуют факторы, индуцирующие и ингибирующие апоптоз (вирусам «не выгодна» тотальная гибель клеток-мишеней). Особая ситуация складывается при СПИДе. Установлено, что доля инфицированных клеток среди гибнущих Т-лимфоцитов невелика. Показано, что гибель лимфоцитов происходит по механизму апоптоза и ее выраженность коррелирует с быстрой прогрессией заболевания. Апоптозу подвергаются предварительно активированные лимфоциты, в основном несущие маркер клеток памяти CD45RO. Полагают, что одним из механизмов, повышающих их чувствительность к активационному апоптозу, может быть перекрестное связывание молекул CD4 мембранным гликопротеином ВИЧ-1 gp120 (что моделируется при действии на Т-клетки моноклональных антител к CD4). Определенную роль в активационном апоптозе CD4 + клеток играет корецептор CD28, поскольку антитела к этой молекуле предотвращают гибель Т-клеток больных СПИДом. Более того, CD4+ клетки, инфицированные вирусом ВИЧ-1, менее чувствительны к индукции апоптоза, поскольку один из вирусных белков — Nef — подавляет его развитие. Другим примером болезней, связанных с усилением апоптоза, являются заболевания нервной системы, вызываемые атрофией определенных ее участков. Как правило, эта атрофия является следствием индукции апоптоза. К таким заболеваниям относятся боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, спинальная мышечная атрофия и другие заболевания нервной системы. Идентифицирован «ген болезни Альцгеймера», продукт которого оказался транскрипционным фактором ∆LG-2. Существует ряд других заболеваний, при которых в реализации основного поражения решающая роль принадлежит апоптозу. Их примером может служить инфаркт миокарда (апоптоз является преоблада- ющей формой гибели миоцитов в ранний период развития инфаркта), токсический (в частности, алкогольный) гепатит и т. д. Со временем увеличивается доля патологических процессов, основывающихся на усилении апоптоза, которое вызвано действием внешних апоптогенных факторов. На первом месте среди них находится ионизирующая радиация. В связи с тем, что она индуцирует апоптоз по преимуществу лимфоидных клеток, эта сторона ее действия проявляется в иммунной недостаточности, хотя вызываемые облучением нарушения кроветворения по крайней мере частично обусловлены индукцией апоптоза клеток-предшественников. Аналогичный эффект дают многие химиотерапевтические препараты, используемые при лечении опухолей, а также гормоны, прежде всего глюкокортикоиды, широко применяемые при лечении различных заболеваний. Источником апоптогенных факторов служит внешняя среда. Нормальное окружение человека практически не является источником апоптогенных воздействий, однако при формировании экологического неблагополучия во внешней среде накапливаются факторы, моделирующие или вызывающие развитие апоптоза. Наиболее ярким примером агрессивных факторов, загрязняющих среду, которые способны вызвать гибель клеток путем индукции апоптоза, относится диоксан, повреждающий, в частности, эпителиальные клетки тимуса. Таким образом, в основе достаточно большого числа патологических процессов лежат нарушения процесса апоптоза. У взрослых могут регистрироваться лишь дефекты с ограниченными фенотипическими проявлениями, поскольку организмы с обширными дефектами такого рода гибнут на ранних этапах онтогенеза. Наиболее характерным проявлением недостаточности апоптоза служит развитие аутоиммунных процессов и злокачественных новообразований, проявлениями усиленного апоптоза — аплазии и дегенеративные процессы, а также некоторые уродства с дефектами тканей. 53 ЛЕКЦИЯ Заключение Сосредоточение значительных усилий исследователей на изучении апоптоза позволило и относительно короткий срок (с начала 90-х годов) осуществить прорыв в анализе его молекулярных механизмов. Особенно существенные успехи достигнуты в понимании структуры и функционирования Fas-рецептора и связанных с ним молекул, факторов, контролирующих апоптоз (Bcl-2, Вах и т. д.), сериновых протеаз (каспаз). В то же время с полной определенностью не установлена природа эндонуклеаз, осуществляющих расщепление ДНК при апоптозе, и не выяснено, каким образом протеолиз, осуществляемый каспазами, приводит к активации этих эндонуклеаз. Параллельно накапливаются сведения о месте апоптоза в развитии организма и деятельности его функциональных систем, в особен- ности иммунной. Наконец, в последние годы началось широкомасштабное изучение места апоптоза и его нарушений в развитии патологических процессов. Показана его реальная роль в патогенезе нервных заболеваний, аутоиммунных, опухолевых процессов и другой патологии. Особую важность приобрела проблема устойчивости опухолевых клеток к лекарственным средствам, обусловленной нарушением апоптоза. Эти направления исследований смыкаются с разработкой подходов к генотерапии заболеваний человека. Рекомендуемая литература 1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. // Рос. онкол. журн.– 1996.– № 1.– С. 5861. 2. Программированная клеточная гибель / Под ред. В.С. Новикова.– СПб., 1996. 3. Ярыгин А.А. Иммунология.– 1996.– № 6.– С. 10-23. 4. Green D.R., Bissonnette R.P., Glynn J.M., Shi Y. // Semin. Immunol.– 1992.– Vol. 4.– P. 379—388. 5. Griffiths T.S., Fergtison T.A. // Immunol. Today.– 1997.– Vol. IS.– P. 240-243. 6. Hockenbery D.M. // Semin. Immunol.– 1992.– Vol. 4.– P. 413-420. 7. Kerr J.R., Winierford C.M., Hartnon B.Y. // Cancer (Philad.).– 1994.– Vol. 73.– P. 2013-2016. 8. Kroemer G. // Advanc. Immunol.– 1995.– Vol. 58.– P. 211-296. 9. Kroemer G., Zamzami N., Susin S.A. // Immunol. Today.– 1997.– Vol. 18.– P. 4451. 10. Nagata S., Golstein P. // Science.– 1995.– Vol. 267.– P. 1449-1456. 11. Onichi Y., Kizaki H. // Hum. Cell.– 1994.– Vol. 7.– P. 27-32. 12. Rowan S., Fischer D.E. // Leukemia.– 1997.– Vol. 11.– P. 457-465. 13. Russel J.H. И Curr. Opin. Immunol.– 1995.– Vol. 7.– P. 382-388. 14. Steller H.H // Science.– 1995.– Vol. 267.– P. 1145-1149. 15. Winnto A.I.// Curr. Opin. Immunol.– 1997.– Vol. 9.– P. 365-370. 16. Wong, В., Clioi Y. // Ibid.– P. 358-364.
