Ген!
advertisement
1. Инструменты генной инженерии - ФЕРМЕНТЫ Момыналиев К.Т. Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 ПОНЯТИЯ «липкие» концы сайт 5`.......GTGATGCGTTCGG.....3` 3`..ATGCTCACTACGCAAGCC.....5` «тупые» концы Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 I. Эндонуклеазы рестрикции («рестриктазы») Часть системы «рестрикциимодификации» бактерий. Специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов, называемых «сайтами рестрикции» Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 I (a): Эндонуклеазы рестрикции • Эндонуклеазы рестрикции распознают и гидролизуют специфические последовательности внутри молекулы ДНК • Мишеневые последовательности для этих ферментов – палиндромные (в результате образуются гомодимеры ) 5’-ATAT-3’ 3’-TATA-5’ • Мишеневые последовательности обычно 4-6 п.о. «Мелкощепящие» (каждые 256 п.о.) или «крупнощепящие» каждые 4096 п.о.) Mbo I (4 cutter) 5’--AACGATCGAA---TTGCTAGCTT-- Pvu I Pvu I (6 cutter) 5’--AAC-OH --TTGCTAG-P Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 5’ выступающие / «липкие концы» I (b): Эндонуклеазы рестрикции • некоторые рестриктазы образуют «тупые» концы 5’-GATATC-CTATAG-5’ EcoRV • некоторые рестриктазы распознают сайты 8, 10, 12 п.о. -AGACGTCTC A Эти ферменты менее специфичны, поскольку гидролизуют так называемые «дегенеративные» Современные проблемы биологии, ЕНУ, последовательности Астана, 2012 Сайт расщепления находится на обоих цепях ДНК пример, EcoRI 5’-NNGAATTCNN-3’ 3’-NNCTTAAGNN-5’ Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 II. ДНК-лигазы • Формируют фосфодиэфирные связи • Обратное действие эндонуклеаз —OH (P)— Для работы необходимы ATФ, 3’OH и 5’ фосфат на 3’ цепи ДНК • Работают более эффективно с «липкими» концами ДНК OH P ATФ 5’-AATCGATCGTCC5’-AATCGATCGTCC-TTAGCTAGCAGG-5’ -TTAGCTAGCAGG-5’Лигаза P OH - Фермент не является чувствительным к Современные проблемы биологии, ЕНУ, последовательности ДНК Астана, 2012 Этапы реакции: 1. Образование промежуточного конъюгата фермента с АМФ 2. Перенос остатка АМФ на 5` - фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК 3. Возникшая фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки 3`-ОН группы соседнего нуклеотида. Образуется новая фосфодиэфирная связь, освобождается АМФ Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Структура гена, транскрипция Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Обычная структура гена Промотор Кодирующий регион +1 транскрипция Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Прокариоты Координированная экспрессия генов: гены в кластере (оперон) контролируются одним промотором и транскрибируется как полицистронная мРНК и кодирует множество продуктов Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Эукариоты Прерывистые гены (экзон/интрон) Моноцистронная мРНК Пост-трансляционная модификация: 5’ CAP polyA tail splicing Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Пост-транскрипционная добавление 5’ CAP к кодируемой эукариотической мРНК Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Сигнал для сплайсинга Экзоны прерываются интронами и обычно фланкированы GT и AG Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Промотор • Промотор - сегмент ДНК, находящийся перед транскриптом Promoter 5’ 3’ • Промотор притягивает RNA Polymerase к старту транскрипции Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Предсказание генов Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Предсказание генов • Ген: Последовательность нуклеотидов, кодирующая белок • Проблема предсказания генов: Определение начала и концевой позиции гена в геноме Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Предсказание генов aatgcatgcggctatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgcat gcggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgaatg gtcttgggatttaccttggaatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgaatggtcttgggatt taccttggaatatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgcatgc ggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggatccg atgacaatgcatgcggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatcctgcggctatgctaatgaatggtcttgg gatttaccttggaatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgaatggtcttgggatttaccttg gaatatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcat gcggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcgg ctatgctaagctcatgcggctatgctaagctgggaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgc ggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcggct atgctaagctcggctatgctaatgaatggtcttgggatttaccttggaatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgc ggctatgctaatgaatggtcttgggatttaccttggaatatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggaatgcatgcg gctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatccgatga ctatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcggctatgctaagctcatgcgg Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Предсказание генов aatgcatgcggctatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgcat gcggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgaatg gtcttgggatttaccttggaatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgaatggtcttgggatt taccttggaatatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgcatgc ggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggatccg atgacaatgcatgcggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatcctgcggctatgctaatgaatggtcttgg gatttaccttggaatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgaatggtcttgggatttaccttg gaatatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcat gcggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcgg ctatgctaagctcatgcggctatgctaagctgggaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgc ggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcggct atgctaagctcggctatgctaatgaatggtcttgggatttaccttggaatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgc ggctatgctaatgaatggtcttgggatttaccttggaatatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggaatgcatgcg gctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatccgatga ctatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcggctatgctaagctcatgcgg Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Предсказание генов aatgcatgcggctatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgcat gcggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgaatg gtcttgggatttaccttggaatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgaatggtcttgggatt taccttggaatatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgcatgc ggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggatccg atgacaatgcatgcggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatcctgcggctatgctaatgaatggtcttgg gatttaccttggaatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgaatggtcttgggatttaccttg gaatatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcat gcggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcgg ctatgctaagctcatgcggctatgctaagctgggaatgcatgcggctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgc ggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatccgatgactatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcggct atgctaagctcggctatgctaatgaatggtcttgggatttaccttggaatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgc ggctatgctaatgaatggtcttgggatttaccttggaatatgctaatgcatgcggctatgctaagctgggaatgcatgcg gctatgctaagctgggatccgatgacaatgcatgcggctatgctaatgcatgcggctatgcaagctgggatccgatga ctatgctaagctgcggctatgctaatgcatgcggctatgctaagctcatgcgg Ген! Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Кодон • В 1961 Sydney Brenner и Francis Crick открыли frameshift мутации • Систематический выброс (стирание) нуклеотидов из ДНК – Единичная и двойная делеция драматически изменяет структуру белка – Эффект делеции триплета минимален – Вывод: каждый нуклеотидный триплет (кодон) кодирует только одну аминокислоту в белке Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 The Sly Fox • В ряду THE SLY FOX AND THE SHY DOG • Уберите 1, 2, и 3 нуклеотида после ‘S’: THE SYF OXA NDT HES HYD OG THE SFO XAN DTH ESH YDO G THE SOX AND THE SHY DOG • Какая из делеций наименее ущербна? Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Трансляция нуклеотидов в аминоксилоты • Кодон: 3 нуклеотида • 4 3 = 64 возможных кодона • Генетический код вырожден и избыточен – включает старт и стоп кодоны – Аминокислота может кодироваться более чем одним кодоном Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Генетический код Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Экзоны и интроны • У эукариот, ген является комбинацией кодирующего сиквенса (exons), который прерывается некодирующим сиквенсом (introns) • Компьютерное предсказывание генов у эукариот более проблематичное • Прокариоты не имеют интронов –гены протяженные структуры Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Два подхода для предсказания гена • Статистический: кодирующий сегмент (exons) имеет типичные последовательности на концах и использует разные последовательности для некодирующих сегментов (introns). • Сходство генов: множество генов человека похожи на гены мышей, цыплят и бактерий. Поэтому, известные гены мышей, цыплят и бактерий могут помочь в идентификации генов человека. Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Подход основанный на сходстве последовательностей Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Генетический код и стоп кодоны UAA, UAG и UGA 3 Stop кодона, которые (вместе со старт кодоном ATG) определяют Open Reading Frames Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Шесть рамок считывания в ДНк последовательности CTGCAGACGAAACCTCTTGATGTAGTTGGCCTGACACCGACAATAATGAAGACTACCGTCTTACTAACAC CTGCAGACGAAACCTCTTGATGTAGTTGGCCTGACACCGACAATAATGAAGACTACCGTCTTACTAACAC CTGCAGACGAAACCTCTTGATGTAGTTGGCCTGACACCGACAATAATGAAGACTACCGTCTTACTAACAC CTGCAGACGAAACCTCTTGATGTAGTTGGCCTGACACCGACAATAATGAAGACTACCGTCTTACTAACAC GACGTCTGCTTTGGAGAACTACATCAACCGGACTGTGGCTGTTATTACTTCTGATGGCAGAATGATTGTG GACGTCTGCTTTGGAGAACTACATCAACCGGACTGTGGCTGTTATTACTTCTGATGGCAGAATGATTGTG GACGTCTGCTTTGGAGAACTACATCAACCGGACTGTGGCTGTTATTACTTCTGATGGCAGAATGATTGTG GACGTCTGCTTTGGAGAACTACATCAACCGGACTGTGGCTGTTATTACTTCTGATGGCAGAATGATTGTG • Стоп кодон – TAA, TAG, TGA • Старт кодон - ATG Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 n 3 Открытые рамки считывания (ORFs) • Определение потенциально кодирующих регионов (ORFs) – Геном размером n состоит из (n/3) кодонов – Стоп кодоны разбивает геном на сегменты – Субсегменты которые начинаются со старт кодона (ATG) являются ORFs • ORFs в различных рамках считывания могут перекрываться ATG TGA Genomic Sequence Open reading frame Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Длинные vs.Короткие ORFs • Длинные ОРС могут быть генами • При случайном распределении, мы можем ожидать стоп кодон каждые (64/3) ~= 21 кодон – Однако, гены более протяженные – Основной подход – сканирование ОРС превосходящих по длине определенный порог – Несколько наивно, так как некоторые гены (напмер кодирующие иммунный ответ) относительно короткие Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Проверка ОРС: Использование кодонов • Создание 64-элементной таблицы частоты использования кодонов в ОРС • Аминокислоты обычно имеют более одного кодона, но определенные кодоны используются более часто • Неравное использование кодонов может характеризовать реальный ген • Таким образом можно компенсировать недостаток теста длины ОРС Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Использование кодонов в геноме человека Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Использование кодонов в геноме мыши AA codon Ser TCG Ser TCA Ser TCT Ser TCC Ser AGT Ser AGC /1000 4.31 11.44 15.70 17.92 12.25 19.54 frac 0.05 0.14 0.19 0.22 0.15 0.24 Pro Pro Pro Pro 6.33 17.10 18.31 18.42 0.11 0.28 0.30 0.31 CCG CCA CCT CCC AA codon Leu CTG Leu CTA Leu CTT Leu CTC /1000 39.95 7.89 12.97 20.04 frac 0.40 0.08 0.13 0.20 Ala Ala Ala Ala GCG GCA GCT GCC 6.72 15.80 20.12 26.51 0.10 0.23 0.29 0.38 Gln Gln CAG CAA 34.18 11.51 0.75 0.25 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Предсказывание генов и мотивы • Регион находящийся перед геном часто содержит мотивы, которые могут быть использованы для предсказания гена ATG -35 -10 0 TTCCAA TATACT Pribnow Box 10 GGAGG Ribosomal binding site Transcription start site Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 STOP Структура промотора прокариот (E.Coli) Старт транскрипции 0. • Pribnow Box (-10) • Gilbert Box (-30) • Ribosomal Binding Site (+10) Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 National Center for Biotechnology Information Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012
