П ГенеТиЧеСКиЙ ПоЛиМорФиЗМ и ГенеТиЧеСКаЯ диФФеренЦиаЦиЯ СеВероТаежнЫХ ПоПУЛЯЦиЙ СоСнЫ оБЫКноВенноЙ

ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ СЕВЕРОТАЕЖНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ
СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ
М.В. СУРСО, с. н. с. Института экологических проблем Севера УрО РАН, канд. биол. наук
П
ри изучении генофондов популяций могут применяться различные подходы.
Хотя тесты на внутривидовую внешнефенотипическую изменчивость являются наиболее
простым и доступным методом исследований,
использование таких тестов для описания аллельных частот едва ли приемлемо, т.к. для
выявления рецессивных аллелей необходимы
длительные процедуры многократных многовариантных скрещиваний. К тому же при
изучении природных панмиктичных популяций и с учетом сроков вступления большинства хвойных видов в репродуктивную стадию
такие скрещивания часто нецелесообразны.
Поэтому предпочтительнее использовать такие генетические маркеры, которые позволяли бы сразу выявлять оба аллеля каждого
гена, при этом количество маркерных генов
было бы достаточно большим. Этим условиям в наибольшей мере отвечает метод электрофоретического анализа изоферментов.
Объем выборки при изучении генофондов природных популяций сосны составлял не менее 30–40 деревьев. Использовались
гаплоидные (эндоспермы) ткани. При таком
подходе, хотя и увеличивался существенно
объем рутинных лабораторных исследований, исключалось проявление внутрилокусных гетеродимеров, что в значительной
степени упрощало последующую процедуру дешифровки зимограмм и снижало вероятность появления артефактов. Кроме того,
изоферментные спектры диплоидных тканей
не позволяют идентифицировать т.н. нулевые («глухие» или «молчащие») аллели гетерозигот без анализирующих скрещиваний,
и только изучение изоферментных спектров
гаплоидных тканей позволяет увидеть их [8].
Для анализа одной ген-ферментной системы
каждого дерева по мегагаметофитам бралось
не менее чем по 7 семян с развитыми зародышами и эндоспермами. В этом случае вероятность правильной диагностики генотипа де-
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 4/2009
[email protected]
рева по любому локусу была не ниже 0,99 при
условии, что в большинстве случаев у гетерозиготных деревьев отсутствовали существенные нарушения в сегрегации аллелей [5].
Для удобства препарирования и с целью активации ферментов семена инкубировали во влажных камерах в течение 3–4 дней.
Затем при помощи бритвы и препаровальной
иглы у них удаляли кожуру, разделяли зародыши и эндоспермы. У эндоспермов удаляли
пленку нуцеллуса, а у зародышей – остатки
суспензора с архегониями. Для гомогенизации использовали эндоспермы, имеющие
материнский гаплотип. Гомогенизацию производили в стеклянных гомогенизаторах на
льду. Состав экстрагирующего буфера зависел от выявляемых ферментов и представлял собой обычно гелевый буфер, или 0,05М
трис-HCl буфер, pH 8,0, в которые добавлялись 0,00363М дитиотрейтола для защиты
SH-групп ферментов, 0,00318М аскорбиновой
кислоты, 0,5814М сахарозы, 0,000456М динатриевой соли ЭДТА для связывания ионов
двухвалентных металлов [9]. Для нейтрализации фенолов в состав буфера вводилось небольшое количество поливинилпирролидона.
Объем экстрагирующего буфера на один эндосперм зависел от объема ткани и составлял
20–30 мкл. Гомогенаты оставлялись на ночную экстракцию в холодильнике. Для электрофореза использовались супернатанты, полученные в результате центрифугирования
при 8000 об./мин. в течение 20 мин. Хранение супернатантов допускалось при –20 °С
в течение не более 7 дней, при –80 °С – не
более одного месяца. Перед электрофорезом
супернатанты (гомогенаты) разбавлялись 1:1
60 %-м забуференным раствором сахарозы,
слегка подкрашенным БФС.
Электрофорез проводился в камерах
с вертикальной ориентацией параллельных
пластин полиакриламидного геля (ПААГ).
При использовании трис-глицинового буфера
19
ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
pH 8,7 применялась методика формирования
двухслойного ПААГ (8,0 %-й разделяющий
и 2,5 %-й концентрирующий гели), составленная на основе прописи C.R. Shieldes,
T.J. Orton и S.W.Stuber [11]. Если использовался трис-ЭДТА-боратный буфер pH 8,4
электрофоретическое
фракционирование
проводили в однослойном 8,0 %-м ПААГ.
Режимы электрофоретической разгонки для
каждого фермента подбирались эмпирически. В качестве источника постоянного тока
для электрофореза использовался трансформатор производства СЭЛТА Лтд., программируемый по напряжению, силе тока и мощности, автоматически стабилизирующийся по
одному из указанных параметров. Скорость
электрофореза определялась визуально по
скорости движения полосы БФС. Число треков устанавливалось эмпирически и зависело
от тех ферментов, которые выявлялись при
последующем инкубировании гелей.
По окончании электрофореза гелевые
пластины помещались в кюветы с инкубирующими растворами, в которых окрашивались
на соответствующие ферменты. Для приготовления инкубирующих растворов использовались общеизвестные прописи, данные в
обзорах [2, 7, 10, 11].
Для приготовления инкубирующих
растворов, компонентов гелей и буферных
растворов использовались свежие сертифицированные реактивы и препараты производства Sigma-Aldridge, ICN, AppliChem и
других фирм.
Математическую обработку результатов дешифровки электрофореграмм проводили на основе общепринятых методов анализа частот генов в природных популяциях
[4, 14, 17].
Частоты аллелей изучены в 7 природных северотаежных популяциях сосны,
краткая характеристика которых приведена в
табл. 1.
Для исследования было взято 10 генферментных систем гаплоидных тканей (мегагаметофитов): аспартатаминотрансфераза
(AAT, 2.6.1.1), алкогольдегидрогеназа (ADH,
1.1.1.1), диафораза (DIA, 1.6.4.3), эстераза
(EST, 3.1.1.1), глутаматдегидрогеназа (GDH,
1.4.1.2),
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
(G-6-PD, 1.1.1.49), лейцинаминопептидаза
(LAP, 3.4.11.1), малатдегидрогеназа (MDH,
1.1.1.37), малик-энзим (ME, 1.1.1.40) и шикиматдегидрогеназа (SkDH, 1.1.1.25). Для анализа использовано только 14 полиморфных
локусов с 40 аллельными вариантами. Ряд
других изучавшихся ген-ферментных систем
и некоторые полиморфные локусы вышеперечисленных систем были исключены из анализа из-за трудности идентификации аллельных
вариантов и в тех случаях, когда возникали
сомнения в их генетической детерминированности, проявлявшейся при расщеплении
гаплотипов гетерозигот. Частоты аллелей по
всем 14 полиморфным локусам, включенным
в анализ, приведены в табл. 2.
Высокополиморфными
у
сосны
обыкновенной являются локусы Aat-2 (наблюдаемая гетерозиготность Ho в среднем
равняется 0, 454), Adh-1 (Ho=0,394), Adh-2
(Ho=0,387), Gdh (Ho=0,364). Слабополиморфные: Dia-4 (Ho=0,052), G6pd (Ho=0,011), Lap1 (Ho=0,028), Lap-2 (Ho=0,042). Остальные из
приведенных в таблице 2 локусов – среднеполиморфные (Ho от 0,115 до 0,229). Указанные
уровни полиморфизма по отдельным локусам
в большинстве случаев характерны для всех
изученных популяций.
Таблица 1
Краткая характеристика пробных площадей
№ пробной
площади
1
2
3
4
5
6
7
20
Географические координаты
с. ш.
в. д.
64° 47’
40° 48’
64° 44’
43° 24’
64° 58’
40° 21’
64° 42’
40° 44’
64° 58’
40° 12’
64° 27’
38° 55’
65° 03’
40° 43’
Краткая характеристика насаждений
(тип леса, происхождение)
Сосняк куст.-сф., коренной
Сосняк бр., производный
Сосняк сф., коренной
Сосняк баг.-сф., коренной
Сосняк черн., черн.-дм., производный
Сосняк баг.-куст.-сф., коренной
Сосняк ос.-сф., коренной
Возраст
деревьев, лет
150–180
70–90
130–170
200–280
80–90
120–150
180–250
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 4/2009
ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
Таблица 2
Частоты аллелей по генам, кодирующим изоферменты, в популяциях сосны
Локус
Aat-2
Adh-1
Adh-2
Dia-2
Dia-4
Est-1
Gdh
G6pd
Lap-1
Lap-2
Mdh-1
Me
Skdh-1
Skdh-2
Аллель
1,00
1,30
1,40
1,00
1,15
0,70
1,00
1,30
0,60
0,80
0,95
1,00
1,10
0,90
1,00
0,85
1,00
1,15
1,30
1,00
1,10
0,95
1,00
0,85
1,00
0,85
1,00
1,15
1,00
1,30
0,90
0,95
1,00
1,05
0,85
1,00
1,15
0,85
1,00
1,15
1
0,483
0,467
0,050
0,600
0,400
0,233
0,633
0,134
0,000
0,100
0,000
0,900
0,000
0,020
0,980
0,000
0,700
0,300
0,000
0,586
0,414
0,000
1,000
0,000
1,000
0,017
0,983
0,000
0,875
0,125
0,000
0,107
0,893
0,000
0,033
0,950
0,017
0,000
0,900
0,100
2
0,550
0,375
0,075
0,525
0,475
0,250
0,725
0,025
0,000
0,100
0,000
0,900
0,000
0,025
0,975
0,000
0,825
0,175
0,000
0,725
0,275
0,075
0,925
0,000
1,000
0,075
0,900
0,025
0,900
0,100
0,000
0,275
0,725
0,000
0,000
0,925
0,075
0,000
0,900
0,100
Основные (наиболее часто упоминаемые в литературе) показатели генетической
изменчивости северотаежных популяций сосны приведены в табл. 3.
Каких-либо существенных различий
в значениях показателей среднего количества
аллелей на локус и относительного количества полиморфных локусов между северотаежными популяциями сосны, независимо от
стадии сукцессии и условий произрастания
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 4/2009
Популяция (№№ пр.пл.)
3
4
5
0,500
0,595
0,466
0,500
0,393
0,534
0,000
0,012
0,000
0,452
0,561
0,621
0,548
0,439
0,379
0,194
0,232
0,155
0,726
0,683
0,759
0,080
0,085
0,086
0,000
0,000
0,017
0,190
0,139
0,052
0,000
0,012
0,000
0,810
0,837
0,931
0,000
0,012
0,000
0,071
0,035
0,000
0,929
0,965
1,000
0,000
0,024
0,190
0,823
0,857
0,786
0,177
0,119
0,024
0,000
0,000
0,000
0,645
0,524
0,600
0,355
0,476
0,400
0,000
0,012
0,000
1,000
0,988
1,000
0,016
0,000
0,000
0,984
1,000
1,000
0,048
0,000
0,000
0,952
1,000
1,000
0,000
0,000
0,000
0,919
0,929
0,983
0,081
0,071
0,017
0,000
0,000
0,000
0,274
0,024
0,017
0,726
0,976
0,983
0,000
0,000
0,000
0,016
0,034
0,017
0,887
0,841
0,966
0,097
0,125
0,017
0,024
0,000
0,000
0,833
0,920
0,914
0,143
0,080
0,086
6
0,439
0,561
0,000
0,667
0,333
0,288
0,682
0,030
0,000
0,167
0,000
0,833
0,000
0,045
0,955
0,061
0,788
0,136
0,015
0,588
0,412
0,000
1,000
0,083
0,917
0,000
1,000
0,000
0,955
0,045
0,015
0,061
0,909
0,015
0,061
0,939
0,000
0,000
0,833
0,167
7
0,483
0,417
0,100
0,683
0,317
0,283
0,634
0,083
0,000
0,083
0,000
0,867
0,050
0,067
0,933
0,050
0,900
0,017
0,033
0,738
0,262
0,000
1,000
0,000
1,000
0,033
0,967
0,000
0,933
0,067
0,000
0,133
0,867
0,000
0,017
0,983
0,000
0,000
0,950
0,050
(типа леса) не выявлено. Более того, их средние значения близки к данным, полученным
другими авторами [3], занимавшимися подобными исследованиями в разных регионах
и использовавших для анализа нетождественный набор ген-ферментных систем. Последнее обстоятельство подтверждает то, что
случайная достаточно большая выборка ферментных локусов достоверно отражает общие
свойства их генеральной совокупности.
21
ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
Таблица 3
Показатели генетической изменчивости северотаежных популяций сосны
Популяция
(№№ пр. пл.)
1
2
3
4
5
6
7
средн.
Гетерозиготность
Ho
He
0,182
0,243
0,200
0,256
0,200
0,270
0,204
0,227
0,169
0,186
0,223
0,242
0,198
0,215
0,197
0,234
Коэффициент
инбридинга, F
0,251
0,219
0,259
0,101
0,091
0,079
0,079
0,154
Различия между уровнями гетерозиготности в изученных популяциях если и
наблюдаются, то они не столь существенны.
Разброс среднепопуляционных значений наблюдаемой гетерозиготности (Ho) составляет
–2,8...+2,6 %, ожидаемой (He) –4,8...+3,6 %.
Следовательно, изученные выборки характеризуются близкими по значению уровнями генетического полиморфизма. В целом в
северотаежных популяциях сосны этот уровень достаточно высок: каждое дерево сосны здесь в среднем гетерозиготно по 20 %
генов.
Теоретически ожидаемая из соотношения Харди-Вайнберга гетерозиготность,
как известно, показывает, какой должна была
бы быть гетерозиготность в популяции, если
бы эта популяция находилась в равновесном
состоянии, т.е. не испытывала бы давления
отбора. Из приведенных данных видно, что
средние значения ожидаемой гетерозиготности во всех популяциях выше по сравнению
со средними значениями наблюдаемой гетерозиготности. Из сказанного следует вывод,
что в северотаежных популяциях сосны наблюдается дефицит гетерозигот: индекс фиксации Райта (F) имеет довольно высокие положительные значения: от +0,079 до +0,259.
Дефицит гетерозигот может быть, хотя и не
всегда, обусловлен инбридингом, который и
оценивается при помощи данного коэффициента.
Некоторые авторы указывают на дефицит гетерозигот у сосен в ранних возрастных группах и увеличение уровня гетерозиготности во взрослой части насаждений. Так,
для сосны обыкновенной на Южном Урале
соотношение Ho и He меняется от дефицита
22
Среднее число ал- Доля полиморфных локусов
лелей на локус, μ
P95
P99
2,07
78,6
85,7
2,14
85,7
92,9
2,14
78,6
92,9
2,21
64,3
85,7
1,93
71,4
71,4
2,14
78,6
85,7
2,21
64,3
85,7
2,12
74,5
85,7
гетерозигот у зародышей (индекс фиксации
Райта F = +0,143) до их эксцесса у материнских деревьев (F = –0,123) [9]. Аналогичную
картину наблюдали К.В. Крутовский с соавт.
[6] у Pinus sibirica Du Tour. В качестве вероятной причины дефицита гетерозигот у зародышей и молодого поколения эти авторы
называют инбридинг, крайним проявлением
которого является самоопыление, происходящее у хвойных по разным оценкам с частотой
10–20 %. В этом случае избыток гетерозигот,
который наблюдается у хвойных во взрослой
части популяции, достигается за счет элиминации той части особей в этой популяции, которые имеют наименьшую гетерозиготность.
Г.Г. Гончаренко с соавт. [3] говорят о том, что
популяции сосны обыкновенной в Восточной Европе и Восточной Сибири находятся
в состоянии генетического равновесия, поскольку значения показателей Ho и He здесь,
по их данным, практически совпадают. Аналогичное совпадение обнаружено и в шотландских популяциях Pinus sylvestris L. [12].
Вместе с тем в калифорнийских популяциях
Pinus radiata D.Don. при их высоком уровне
полиморфизма во всех случаях наблюдается
дефицит гетерозигот (F = +0,024…+0,174)
[15]. У P. radiata, интродуцированной в Австралии, при относительно невысоком уровне
полиморфизма также отмечен небольшой дефицит гетерозигот [13].
Следует отметить, что дефицит гетерозигот может наблюдаться не только в результате близкородственного скрещивания,
но и вследствие подразделенности популяций (т.н. эффект Валунда), когда доля гомозигот в панмиктичных группах подразделенной
популяции возрастает на величину межпо-
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 4/2009
ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
пуляционной вариансы частот генов за счет
уменьшения доли гетерозигот [1]. Противоречия в результатах могут возникать в этом
случае при разных методических подходах к
отбору исходного материала.
Локальную дифференциацию частот
генов в подразделенных популяциях оценивали в терминах F-статистик С. Райта [17]: FIS
– коэффициент инбридинга особи относительно субпопуляции; FIT – коэффициент инбридинга особи относительно целой популяции;
FST – коэффициент инбридинга субпопуляции
относительно всей подразделенной популяции. Соотношение между этими величинами
определяется следующим выражением
FIT = FST + (1 – FST)·FIS.
(1)
Значения указанных коэффициентов
приведены в табл. 4.
Таблица 4
Показатели FIS, FIT и FST по 14 локусам в
северотаежных популяциях сосны
Локус
Aat-3
Adh-1
Adh-2
Dia-2
Dia-4
Est-1
Gdh
G6pd
Lap-1
Lap-2
Mdh-1
Me
Skdh-1
Skdh-2
средн.
FIS
0,132
0,167
0,151
0,127
0,268
0,252
0,202
0,522
–0,077
0,208
–0,098
0,152
0,135
0,206
0,168
F-статистики
FIT
0,147
0,186
0,161
0,146
0,297
0,289
0,219
0,542
0,000
0,222
–0,082
0,233
0,154
0,219
0,195
FST
0,017
0,023
0,011
0,021
0,041
0,050
0,021
0,042
0,071
0,019
0,015
0,083
0,022
0,016
0,032
Таким образом, гетерогенность обобщенной популяции (FIT) выше по сравнению
с подразделенными панмиктичными группами (FIS). Приведенные данные подтверждают
вывод, сделанный на основе анализа средних
значений наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностей: северотаежные популяции сосны испытывают дефицит гетерозигот. Среднее значение показателя FST, определяющего
подразделенность, относительно невелико
и равняется 0,032. Следовательно, внутри-
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 4/2009
популяционная составляющая генетической
изменчивости сосны равна 96,8 %, тогда как
ее межпопуляционная составляющая – всего
3,2 %. Таким образом, несмотря на довольно
высокий уровень генетического полиморфизма и географическую удаленность друг от
друга (т.н. генетическую изоляцию расстоянием) северотаежные популяции сосны в целом генетически однородны.
Показатель подразделенности FST связан с уровнем генного потока Nem [16] соотношением
FST = 1 / (1 + 4Nem).
(2)
Исходя из значения показателя
FST = 0,032, значение величины генного потока Nem будет равно 7,57. Это означает, что в
субпопуляции с эффективным размером Ne 8
деревьев имеют привнесенные гены, или, другими словами, интенсивность обмена генами
в северотаежных популяциях сосны составляет в среднем 8 мигрантов за поколение.
На основе частот встречаемости аллелей рассчитаны коэффициенты генетических
дистанций M. Nei [14] между популяциями
сосны (табл. 5).
Таблица 5
Генетические дистанции M. Nei [14] между коренными северотаежными популяциями сосны
Популяция 2
3
4
5
6
7
1
0,010 0,009 0,006 0,008 0,006 0,010
2
0,005 0,013 0,015 0,014 0,009
3
0,010 0,014 0,011 0,013
4
0,007 0,012 0,011
5
0,005 0,008
6
0,008
Как известно, значения коэффициентов генетических дистанций М. Нея соответствуют числу аллельных замещений на 1000
генов. В пределах вида эти значения обычно
не превышают 0,030–0,050 [2]. Из приведенных данных видно, что коэффициенты генетических дистанций между географически
изолированными северотаежными популяциями сосны не превышают 0,015, в среднем
они составляют 0,010. Это говорит о том, что
все изученные популяции генетически близки между собой.
23