Взаимодействие между генами и питательными веществами

Изменения активности генов в клетках рака предстательной железы
человека линии PC3, подвергшихся воздействию индол-3-карбинола
(I3C) и 3,3’-дииндолилметана (DIM), установленная с помощью метода
кДНК-микрочипов1
Yiwei Li, Xingli Li и Fazlul H. Sarkar 2
Отдел патологии, Институт рака Karmanos, Медицинский колледж государственного
университета Уэйна, Детройт, Мичиган, 48201
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ.
В результате исследований, проведенных в нашей лаборатории и других
исследовательских центрах, было показано, что индол-3-карбинол (I3C) и его
образующийся in vivo димерный метаболит 3,3’-дииндолилметан (DIM) подавляют рост
клеток рака предстательной железы линии PC3 и вызывают их апоптоз путем подавления
сигнальных путей ядерного фактора NF-κB и Akt. Для изучения изменения активности
генов под воздействием I3C и DIM, использовался метод кДНК-микрочипов.
С помощью микрочипов была оценена активность 22 215 известных генов. Мы
обнаружили, что изменение активности более чем в 2 раза после 24 часов воздействия
DIM отмечалось у 738 генов. Из них активность снижалась у 738 генов и повышалась у 61
гена. Аналогичным образом, после воздействия I3C изменение активности более чем в 2
раза отмечалось у 727 генов. Из них активность снижалась у 685 генов и повышалась у 42
генов. Изменение активности генов регистрировалось уже через 6 часов и было более
выраженным при более длительном воздействии.
В результате кластерного анализа было установлено, что как I3C, так и DIM повышают
активность генов, связанных с ферментами I и II фазы, что позволяет предположить
наличие у них возможности детоксикации в отношении канцерогенов или химических
веществ. Кроме того, мы установили, что I3C и DIM снижают активность генов,
играющих ключевую роль в регуляции клеточного роста, клеточного цикла, апоптоза,
передачи сигналов, фактора транскрипции Pol II и онкогенеза.
Для подтверждения данных, полученных при анализе данных кДНК-микрочипов,
проводилась полимеразная цепная реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Результаты
подтвердились.
Мы сделали вывод, что I3C и DIM влияют на активность большого количества генов,
связанных с контролем канцерогенеза, жизнеспособности клеток и физиологических
функций. Это может способствовать выявлению молекулярных механизмов действия I3C
и DIM в отношении клеток рака предстательной железы линии PC3. Кроме того, эти
данные могут разрабатываться в дальнейшем с целью создания стратегий профилактики
и/или лечения рака предстательной железы. J. Nutr. 133: 1011–1019, 2003.
Исследование
В эпидемиологических исследованиях было показано, что потребление в большом
количестве фруктов и овощей предотвращает канцерогенез во многих тканях (1,2).
Наиболее эффективными в отношении снижения риска развития рака считаются
Исследование частично финансировалось за счет гранта, полученного Fazlul H. Sarkar от Министерства
обороны.
1
2
Автор, на имя которого следует направлять корреспонденцию. Электронная почта: [email protected].
1
представители семейства крестоцветных, включая брокколи, капусту, брюссельскую
капусту и цветную капусту (3,4). Практически во всех представителях семейства
крестоцветных имеется индол-3-карбинол (I3C) 3, химическое соединение растительного
происхождения. Накапливается база сведений, свидетельствующих, что I3C может
предотвратить развитие или даже использоваться для лечения ряда часто встречающихся
видов рака, в особенности гормонально-зависимых опухолей (5,6). Сообщалось, что
соблюдение диеты, богатой овощами семейства крестоцветных или добавка к пище I3C
приводила к регрессии опухолей или замедлению скорости роста опухоли у пациентов с
рецидивирующим папилломатозом гортани (7,8). В in vivo и in vitro исследованиях было
также показано, что I3C оказывает противоопухолевый эффект у экспериментальных
животных и ингибирует рост клеток рака человека (9,10). В связи с этими данными в
последние несколько лет значительно вырос интерес к I3C в качестве препарата для
предотвращения развития рака.
I3C является химически нестабильным в кислой среде и в желудке быстро превращается в
различные продукты конденсации, среди которых – 3,3’-дииндолметан (DIM), основной
продукт конденсации I3C в кислой среде, образующийся в in vitro и in vivo условиях. В
связи с быстрым превращением I3C в DIM и другие вещества в различных биологических
условиях, биологические эффекты I3C могут быть обусловлены как I3C, так и DIM. В
экспериментальных исследованиях было установлено, что DIM обладает ингибирующим
эффектом в отношении опухолевых клеток за счет ингибирования роста клеток и
индуцирования апоптоза, такие же эффекты оказывает и I3C (11,12). Сообщалось, что
DIM оказывает химиопротективный эффект в тканях, отвечающих на воздействие
эстрогенов, а вызванная DIM остановка клеточного цикла на стадии G1 развивается с
повышением уровня p21WAF1/CIP1 в клетках рака молочной железы, что позволяет
заподозрить, что DIM обладает ингибирующим влиянием на гормонально-зависимые
опухоли (11,13).
Рак предстательной железы является наиболее частой недерматологической опухолью в
США, заболеваемость которой составляет, по оценкам, 189000 случаев в год, а количество
случаев смерти в 2002 г. достигло 30200 случаев (14). Рецидив заболевания
регистрируется у вплоть до 30% пациентов, перенесших радикальную простатэктомию,
что часто является результатом микрометастазирования во время операции (15). Таким
образом, существует значительная потребность в разработке патогенетически
обоснованных и направленных методов профилактики и лечения рака предстательной
железы. Методика кДНК-микрочипов делает возможным быструю и одновременную
оценку активности десятков тысяч генов, что, в свою очередь, позволяет установить
эффект противоопухолевой терапии в отношении клеток рака предстательной железы
(16). С помощью методики кДНК-микрочипов изучались профили активности генов
различных видов опухолевых клеток (17,18). Также регистрировалось изменение
активности генов в результате воздействия некоторых противоопухолевых препаратов
(19,20). Вероятно, эти данные будут способствовать разработке профилактических и/или
терапевтических методов и определению молекулярных механизмов действия препаратов
для профилактики и/или лечения злокачественных опухолей.
Список сокращений: ДМСО – диметилсульфоксид; ПЦР – полимеразная цепная реакция; РЭФР – рецептор
эпидермального фактора роста; ФРФ – фактор роста фибробластов; ATF - активирующий фактор
транскрипции; CBFβ – основной фактор связывания β; CYP – цитохром P450; DIM - 3,3’-дииндолметан; I3C
– индол-3-карбинол; MAP2K – митоген-активируемая киназа киназы; MAPK - митоген-активируемая
протеинкиназа; MIG - митоген-индуцируемый ген; NF – ядерный фактор; PI3K - фосфатидилинозитол-3киназа; ST16 – супрессор канцерогенеза 16; TFDP – фактор транскрипции Dp-1; TGF-β трансформирующий фактор роста-β.
3
2
В наших предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что I3C ингибирует рост
клеток рака предстательной железы линии PC3 и индуцирует апоптоз за счет
ингибирования ядерного фактора κB и сигнального механизма Akt, что позволят
предположить, что I3C может использоваться в качестве препарата для профилактики
и/или лечения при раке предстательной железы (21,22). Однако сведений об общем
профиле активности генов клеток рака предстательной железы после применения I3C и
DIM недостаточно; точные молекулярные механизмы, за счет которого I3C и DIM
оказывают ингибирующий эффект в отношении рака предстательной железы, также
остается неизвестным. В этом исследовании с целью оценки изменения активности генов
клеток рака предстательной железы линии PC3, подвергавшихся воздействию I3C и DIM,
будет использоваться генетическая матрица с высокой пропускной способностью, которая
содержит 22215 известных генов.
Материалы и методы
Клеточная культура и ингибиторы роста. Клетки рака предстательной железы линии
PC3 (ATCC, Manassas, VA) культивировались в среде RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad,
CA) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина и
стрептомицина в атмосфере с 5% содержанием CO2 при температуре 37,3ºC. I3C (Sigma,
St. Louis, MO) и DIM (LKT, St. Paul, Minnesota) растворялись в диметилсульфоксиде
(ДМСО) до получения исходного раствора с концентрацией 100 или 50 ммоль/л,
соответственно. Для ингибирования роста клетки линии PC3 подвергались воздействию
I3C в концентрации 30, 60 и 100 мкмоль/л или DIM в концентрации 15, 30 и 60 мкмоль/л в
течение 1-3 дней. Контрольная группа клеток линии PC3 подвергалась воздействию 0,1%
ДМСО на протяжении такого же периода времени. Затем клетки инкубировались с MTT
(0,5 г/л, Sigma, St. Louis, MO) при температуре 37ºC в течение 4 часов и с ДМСО при
комнатной температуре в течение 1 часа. Спектрофотометрическое поглощение в
образцах измерялось с помощью многофункционального микропланшетного сканера
ULTRA (TECAN, Durham, NC) с длиной волны 495 нм. Эксперимент проводился трижды.
Для определения того, наблюдается ли ингибирование клеточного роста под воздействием
указанных препаратов, использовались t-тесты.
Метод к-ДНК-микрочипов. Клетки линии PC3 подвергались воздействию I3C в
концентрации 60 мкмоль/л или DIM в концентрации 40 мкмоль/л в течение 6, 24 и 48 ч.
DIM представляет собой образующееся в in vivo условиях производное I3C. Дозы I3C и
DIM, которые использовались в этом эксперименте, приближались к 50% ингибирующей
концентрации. Тем не менее, полной оценки соответствия этих доз в плане применения с
целью профилактики или лечения, не проводилось, хотя они могут использоваться с
терапевтической целью. Выбор моментов времени для оценки основывался на
необходимости регистрации профилей экспрессии генов раннего ответа, генов, которые
могут участвовать в запуске процессов ингибирования роста или апоптоза, и, наконец,
генов, которые могут выступать в качестве эффекторов при индукции апоптоза. Вся РНК
в каждом образце выделялась с помощью системы Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) и
очищалась с помощью наборов RNeasy Mini Kit and RNase-free DNase Set (QIAGEN,
Valencia, CA) в соответствии с протоколом производителя. кДНК в каждом образце
синтезировалась с помощью набора Superscript cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) и праймера
T7-(dT)24 вместо олиго(dT), который поставляется вместе с набором. Затем в in vitro
условиях меченная биотином кРНК транскрибировалась с кДНК с помощью набора
BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit (ENZO Biochem, New York, NY)и
очищалась с помощью набора RNeasy Mini Kit. Очищенная кРНК подвергалась
фрагментации путем инкубации в фрагментационном буфере (200 ммоль/л трис-ацетата,
pH 8,1; 500 ммоль/л калия ацетата; 150 ммоль/л магния ацетата) при температуре 95ºC в
течение 35 минут и замораживалась на льду. Фрагментированная меченная кДНК
анализировалась с помощью кДНК-микрочипа Human Genome U133A Array (Affymetrix,
3
Santa Clara, CA), содержащего образцы для анализа 22215 генов, и подвергалась
гибридизации с образцами генов в микрочипе. После отмывания и окрашивания микрочип
считывался с помощью сканера HP GeneArray Scanner (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA).
Для оценки воспроизводимости результатов проводилось два независимых эксперимента.
Нормализация и анализ результатов метода кДНК-микрочипа. Уровень экспрессии
генов в изучаемых образцах подвергался нормализации и анализу с помощью
программного обеспечения Microarray Suite, MicroDB и Data Mining Tool (Affymetrix). С
помощью программного обеспечения Microarray Suite в соответствии с рекомендациями
производителя значение сигнала, полученного в экспериментальной группе, умножалось
на значение фактора нормализации с целью достичь эквивалентности между средней
интенсивностью сигнала в экспериментальной и контрольной группах. Абсолютный
статус экспрессии (наличие, сомнительные данные, отсутствие) и усредненное различие
экспрессии для 22215 генов в образце, а также различие абсолютного статуса экспрессии,
кратность изменения и усредненное различие экспрессии генов между 2 или несколькими
образцами оценивались с помощью упомянутого выше программного обеспечения.
Статистический анализ различия средней экспрессии генов, которое указывало на
изменение более чем в 2 раза, проводился повторно для образцов, подвергшихся и не
подвергшихся воздействию исследуемых веществ, с помощью t-тестов. Иерархическая
кластеризация данных с использованием усредненной связи проводилась с помощью
программного обеспечения Cluster (23), результаты были представлены с помощью
программного обеспечения TreeView (23). Гены, у которых было зарегистрировано
изменение экспрессии, также были отнесены в различные категории в зависимости от
локализации, клеточного компонента и описанных или предполагаемых биохимических,
биологических и молекулярных функций с помощью программного обеспечения OntoExpress (24). Гены без описаний или с трудом поддававшиеся классификации
исключались из функционального кластерного анализа.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени. Вся
РНК, подготовленная для анализа с помощью микрочипов, также использовалась для
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией для выделения отдельных
генов. Весь объем РНК (2 мкг) из каждого образца подвергался обратной транскрипции с
помощью набора для синтеза одноцепочечной кДНК Superscript (Invitrogen) в
соответствии с протоколом производителя. Затем в реакционной смеси объемом 25 мкл (в
состав которой входило 2 мкл кДНК, 12,5 мкл смеси 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1,5
мкл 5 мкмоль-раствора пары специфических праймеров и 9 мкл воды) проводилась ПЦР в
реальном времени с использованием системы ABI Prism 7700 Sequence Detection System
(Applied Biosystems, Foster City, CA). Последовательности праймеров, которые
использовались в ПЦР в реальном времени, были описаны ранее (25). Программа
проведения ПЦР начиналась с инкубации в течение 2 мин при температуре 50°C и затем
10 минут при температуре 95°C с последующими 40 термальными циклами, каждый из
которых включает инкубацию в течение 15 секунд при 95°C и 1 минуты при 60°C. Данные
анализировались с использованием метода порогового значения цикла сравнения (Ct) с
нормализацией по экспрессии актина в каждом образце. Для каждой ПЦР строились
кривые плавления с целью обеспечить чистоту продукта амплификации.
Результаты
Ингибирование роста клеток. В результате MTT-теста было показано, что воздействие
на клетки рака предстательной железы линии PC3 с помощью I3C или DIM приводит к
дозо- и времязависимому подавлению пролиферации клеток (Рис. 1). Эти результаты
согласуются с опубликованными ранее результатами (22).
Регуляция экспрессии мРНК. Профили экспрессии генов клеток линии PC3,
подвергшихся воздействию I3C или DIM, оценивались с помощью метода кДНК4
микрочипов. В результате 2 независимых экспериментов было показано, что более чем
двукратное изменение активности через 24 часа после применения DIM регистрировалось
в общей сложности для 738 генов. Из них снижение активности было отмечено для 677
генов, увеличение – для 61 гена. Аналогичным образом, в клетках, подвергшихся
воздействию I3C, более чем двукратное изменение активности регистрировалось для 727
генов со снижением активности для 685 генов и увеличением активности для 42 генов.
При кластерном анализе было выявлено 18 различных типов изменения активности генов
в клетках линии PC3 после воздействия DIM или I3C. В 1-й и 18-й кластеры включались
гены, для которых, соответственно, отмечалось типичное постепенное снижение или
увеличение активности. Изменение активности генов отмечалось уже через 6 часов после
применения I3C и DIM и являлось более выраженным при увеличении длительности
воздействия (Рис. 2).
Гены, активность которых изменялась, также подвергались кластерному анализу в
соответствии с локализацией и клеточными компонентами. Такие гены в основном
локализовались на 1-й, 2-й, 3-й, 6-й 7-й и 12-й хромосомах и главным образом
обеспечивали транскрипцию и трансляцию компонентов ядра и белков
цитоплазматической мембраны. При кластеризации в соответствии с биологической
функцией было выяснено, что применение I3C и DIM приводило к снижению активности
в основном тех генов, которые участвовали в процессе передачи биологических сигналов,
онкогенезе, пролиферации клеток, антиапоптозе и регуляции транскрипции с промоутера
Pol II. С другой стороны, применение I3C и DIM приводило к повышению экспрессии в
основном тех генов, которые связаны с I и II фазой биотрансформации, передачей
биологических сигналов, индукцией апоптоза, воспалительным ответом и метаболизмом
простагландинов (Таблицы 1, 2 и 3). При классификации генов по молекулярной
функции было установлено, что применение I3C и DIM приводило к снижению
экспрессии генов, которые обеспечивали связывание с РНК, связывание с ДНК,
кодирование факторов транскрипции, коактиваторов транскрипции и протеинкиназ,
включая митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK), киназы MAP2, MAP3, c-Jun-Nтерминальную протеинкиназу, и повышало экспрессию супрессоров опухолей,
корепрессоров транскрипции и ферментов системы цитохрома P450 (Таблицы 1-3). В то
же время профили воздействия I3C и DIM на экспрессию генов несколько отличались
(Таблица 3).
Верификация целевых изменений с помощью ПЦР с обратной транскрипцией.
С целью верификации изменения экспрессии генов на уровне мРНК, которые были
выявлены при анализе микрочипов, для анализа с помощью ПЦР с обратной
транскрипцией в реальном времени было выбрано 6 генов с различными профилями
экспрессии [трансформирующий фактор роста-β (TGF-β)2, p57KIP2, цитохром b5, 4-й
фактор инициации синтеза белка эукариот, тромбоспондин-1 и нейропилин-1]. Результаты
ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени для этих генов согласовывались с
результатами анализа микрочипов (Рис. 3 и 4). Изменения экспрессии генов, выявленные
при ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени, были такими же, хотя величина
экспрессии, установленная с помощью двух методов анализа, отличалась. Эти результаты
поддерживают данные, полученные с использованием микрочипов, а также позволяют
предположить, что применение I3C и DIM регулирует транскрипцию генов, вовлеченных
в физиологические процессы, которые протекают в клетках рака предстательной железы.
Обсуждение
Полученные с помощью метода кДНК-микрочипов результаты представляют собой
проведенный в масштабе генома анализ клеточного ответа на воздействие I3C и DIM.
Клеточный ответ на любые антипролиферативные соединения включает в себя изменение
сложных сигнальных путей, которые в конечном итоге определяют выживание или гибель
5
клетки. Полученные данные говорят о том, что изменения биологических процессов и
молекулярных функций, происходящие в клетках в результате применения I3C и DIM,
имеют комплексный характер и, вероятно, опосредованы множеством регуляторных
путей. Во-первых, было установлено, что I3C и DIM регулируют экспрессию ферментов I
и II фазы в клетках рака предстательной железы линии PC3, что указывает на
антиканцерогенные эффекты I3C и DIM. Канцерогенез представляет собой многоэтапный
процесс, и существует прекрасная возможность для разработки вмешательства, которое
может прекратить, обратить или приостановить этот процесс. Одним из
антиканцерогенных воздействий является изменение метаболизма канцерогенов, включая
ингибирование активации проканцерогенов, в том числе – детоксикация и блокирование
активных метаболитов (3). К веществам, принимающим участие в этом воздействии,
относятся ферменты I и II фазы биотрансформации. Наиболее важными ферментами I
фазы являются ферменты системы цитохрома P450 (CYP). Эти ферменты окисляют
канцерогены и делают их более гидрофильными и чувствительными к детоксикации
(3,26). Метаболические процессы II фазы включают в себя реакции детоксикации и
конъюгации, в результате которых метаболиты I фазы становятся более полярными и
легко выводимыми (3,26). Мы установили, что I3C и DIM повышают экспрессию
фермента I фазы CYP1A1 и ферментов II фазы глутатион S-трансферазы тета-1 и
альдокеторедуктазы в клетках рака предстательной железы линии PC3, что позволяет
предположить наличие у них повышенной возможности детоксикации и ингибирования
канцерогенов. Сообщалось, что и I3C, и DIM повышают активность ферментов I и II фазы
в печени крысы (3). Таким образом, полученные нами с помощью метода кДНКмикрочипов результаты согласуются с результатами in vivo экспериментов,
опубликованными другими исследователями, и служат молекулярным доказательством
того, что I3C и DIM могут служить в качестве препаратов для профилактики рака
предстательной железы, что связано с их способностью индуцировать ферменты I и II
фазы.
Поскольку DIM является одним из крупных димерных метаболитов I3C, образующихся in
vivo, мы также установили, что молекулярный ответ клеток рака предстательной железы
линии PC3 на воздействие как I3C, так и DIM включает в себя в основном ингибирование
генов, связанных с клеточным ростом, контролем клеточного цикла, апоптозом, передачей
сигналом, онкогенезом, регуляцией транскрипции и фосфорилированием белков, помимо
индукции ферментов I и II фазы. Рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР)
представляет собой белок клеточной мембраны, который в большом количестве
экспрессируется на клетках многих видов злокачественных опухолей, для которых
характерен неблагоприятный прогноз. Этот белок клеточной мембраны считается
превосходной «мишенью» для противоопухолевых препаратов (27). TGF-β и фактор
роста фибробластов (ФРФ) представляют собой многофункциональные молекулы и
абсолютно необходимы для выживания клеток злокачественной опухоли. Они играют
важную роль в обеспечении роста клеток и ангиогенезе (28,29). Мы зарегистрировали
снижение экспрессии генов РЭФР, TGF-β2 и ФРФ при воздействии I3C и DIM, что
демонстрирует ингибирующий эффект I3C и DIM на рост клеток рака предстательной
железы линии PC3. Циклин E, активирующий фактор транскрипции (ATF) и митогениндуцируемый ген (MIG) регулируют дальнейшее продолжение клеточного цикла, а BCL2
ингибирует гибель клетки в результате апоптоза (30-33). Повышение экспрессии ATF
также наблюдалось в клетках метастатических злокачественных опухолей (34). p57KIP2
является супрессором опухоли, который ингибирует циклин-зависимую киназу, что
приводит к остановке клеточного цикла (35). Согласно нашим результатам, I3C и DIM
ингибируют экспрессию циклина E2, ATF5, MIG-2 и BCL2 и индуцируют экспрессию
p57KIP2, что может привести к индукции остановки клеточного цикла и апоптозу. Если
рассматривать их совместно, I3C и DIM изменяют экспрессию ряда генов, которые могут
6
участвовать в наблюдаемом ингибировании клеточного роста, что было
продемонстрировано в MTT-тесте с ингибированием клеточного роста.
Передача клеточных сигналов важна для выживания клеток. В последнее время большое
внимание в исследованиях злокачественных опухолей стало уделяться сигнальным путям,
связанным с MAPK и фосфатидилинозитол-3-киназой (PI3K)/Akt. Считается, что они
представляют собой наиболее подходящие цели для профилактических и терапевтических
воздействий. Сигнальный путь MAPK состоит из трехступенчатого киназного ядра, в
котором MAP3K активирует MAP2K, которая активирует MAPK, что приводит к
активации NF-κB, клеточного роста и выживаемости клеток (36,37). В нашем
исследовании регистрировалось снижение экспрессии MAP2K3, MAP2K4, MAP4K3 и
MARK3 под воздействием I3C и DIM. Это позволяет предположить, что I3C и DIM
оказывают ингибирующий эффект на сигнальный путь MAPK, следствием чего является
блокирование жизнеспособности клеток. Сигнальный путь PI3K/Akt представляет собой
другой важный путь передачи сигналов, который играет ключевую роль в
контролировании жизнеспособности клеток и апоптоза (38). При анализе профилей
экспрессии генов клеток рака предстательной железы линии PC3, которые подвергались
воздействию I3C, мы выявили снижение экспрессии PI3K. Это позволяет предположить,
что I3C может индуцировать апоптоз и ингибировать жизнеспособность клеток
злокачественной опухоли путем изменения сигнального пути PI3K/Akt. Эти данные,
полученные при анализе генов с помощью кДНК-микрочипов, согласуются с нашей
предыдущей работой, в которой было показано, что применение I3C ингибирует рост
клеток злокачественной опухоли и индуцирует апоптоз путем ингибирования сигнальных
путей NF-κB и Akt (21,22).
Ряд факторов транскрипции Pol II, включая фактор транскрипции Dp-1 (TFDP) и NF-YC,
играют важную роль в транскрипции (39,40). Повышение экспрессии TFDP1 приводит к
увеличению уровня циклина E, который служит позитивным регулятором для перехода
клеточного цикла в фазу G1/S (39). Повышенная экспрессия этих факторов транскрипции
также связана с онкогенезом. Кроме того, основной связывающий фактор β (CBFβ) и
супрессор канцерогенеза 16 (ST16) также участвуют в онкогенезе. CBFβ формирует
гибридный белок с другими генетическими продуктами и стимулирует онкогенез (41), в
то время как ST16 подавляет онкогенез (42). Согласно нашим данным, применение I3C и
DIM снижает экспрессию TFDP1, NF-YC, DKC1, циклина E и CBFB и увеличивает
экспрессию ST16. Это позволяет предположить, что I3C и DIM могут ингибировать
транскрипцию и онкогенез, а также могут вызвать остановку клеточного цикла в фазе G1,
как было показано в нашем предыдущем исследовании (22).
Тем не менее, важно отметить, что I3C и DIM оказывают несколько различный эффект на
профиль экспрессии генов, что является ожидаемым. Мы отмечали, что DIM, в отличие от
I3C, индуцировал экспрессию других ферментов II фазы, включая
метилмалонатсемиальдегиддегидрогеназу, фофсфолипазу A2, углеводную
сульфотрансферазу 7 и глюкуроносилтрансферазу I. Это позволяет предположить, что
DIM может оказывать более выраженный ингибирующий эффект в отношении
онкогенеза, чем I3C.
Подводя итог, целью данного исследования являлся анализ профилей экспрессии генов
клеток рака предстательной железы линии PC3 после воздействия на них I3C и DIM. Как
I3C, так и DIM вызывают изменение экспрессии большого количества генов, связанных с
контролем канцерогенеза, жизнеспособности клеток и физиологических функций. Это
может способствовать выявлению молекулярного механизма(ов), благодаря которым I3C
и DIM оказывают плейотропные эффекты на клетки рака предстательной железы линии
PC3.Эти данные могут разрабатываться в дальнейшем с целью создания стратегий
профилактики и/или лечения рака предстательной железы.
7
8
Процент роста клеток
Клетки линии PC3, подвергшиеся воздействию I3C
1-й день
2-й день
3-й день
мкмоль/л
Процент роста клеток
Клетки линии PC3, подвергшиеся воздействию DIM
1-й день
2-й день
3-й день
мкмоль/л
Рисунок 1. Влияние различных доз индол-3-карбинола (I3C) и 3,3’-дииндолметана (DIM)
на рост клеток линии PC3 в течение 3 дней. Данные представлены в виде «среднее ±
стандартная ошибка среднего», n = 3. *Различия в сравнении с контрольным раствором
(C), P <0,05.
9
Воздействие I3C
ч
1-й кластер
Низкая экспрессия
Воздействие DIM
2-й кластер
ч
4-й кластер
ч
5й
ч
16-й кластер
ч
Высокая экспрессия
3-й кластер
ч
6-й кластер
ч
ч
18-й кластер
17-й кластер
ч
ч
Контроль
1-й кластер
48 ч
ч
1-й кластер
ч
18-й кластер
18-й кластер
17-й кластер
ч
18-й кластер
16-й кластер
ч
48 ч
ч
6-й кластер
24 ч
5-й кластер
ч
24 ч
4-й кластер
ч
6ч
ч
3-й кластер
6ч
2-й кластер
Контроль
1-й кластер
10
Рисунок 2. Кластерный анализ генов, для которых выявлено изменение экспрессии мРНК
после воздействия индол-3-карбинола (I3C) и 3,3’-дииндолметана (DIM) на клетки линии
PC3. 1-й и 18-й кластеры включают в себя гены, у которых отмечается типичное
увеличение и уменьшение экспрессии, соответственно.
11
Кривая амплификации TGF-β2
Контроль-48 ч-1
Контроль-48 ч-2
I3C-48 ч-1
Сигнал репортера
I3C-48 ч-2
Цикл
Кривая амплификации TGF-β2
Контроль-48 ч-1
Контроль-48 ч-2
DIM-48 ч-1
Сигнал репортера
DIM-48 ч-2
Цикл
Флюоресценция
Кривая плавления TGF-β2
Рисунок 3. Кривые амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной
транскрипцией в реальном времени, демонстрирующие амплификацию
трансформирующего фактора роста (TGF)-β2 из РНК клеток линии PC3, подвергшихся
воздействию индол-3-карбинола (I3C) с концентрацией 60 мкмоль/л (верхний график) или
12
3,3’-дииндолметана (DIM) c концентрацией 40 мкмоль/л (средний график) в течение 48 ч.
Отметки «48 ч-1» и «48 ч-2» означают дублированный эксперимент для образцов,
подвергавшихся воздействию в течение 48 часов. Нижний график: кривая плавления в
ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени, демонстрирующий, что продукт
является чистым (только 1 пик).
13
KIP2
p57
Сравнительный уровень
экспрессии
TGF-β2
Тромбоспондин 1
Сравнительный уровень
экспрессии
Нейропилин
Рисунок 4. Анализ некоторых генов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
обратной транскрипцией в реальном времени, продемонстрировавшей изменение
экспрессии мРНК отдельных генов клеток линии PC3, подвергшихся воздействию индол3-карбинола (I3C) с концентрацией 60 мкмоль/л или 3,3’-дииндолметана (DIM) c
концентрацией 40 мкмоль/л в течение 48 ч в сравнении с контрольными клетками линии
PC3. С – контрольный раствор; TGF - трансформирующий фактор роста. Данные
представлены в виде «среднее ± стандартная ошибка среднего», n = 3. Данные
рассчитывались с помощью метода порогового значения цикла сравнения.
14
Таблица 1. Классификация по функции генов, экспрессия которых в клетках линии PC3
изменилась после воздействия индол-3-карбинола (I3C) с концентрацией 60 мкмоль/л в
течение 48 ч1
Снижение экспрессии
Биологические процессы
Передача сигналов
Регуляция транскрипции с промоутера
Pol II
Адгезия клеток
Пролиферация клеток
Онкогенез
Контроль клеточного цикла
Фосфорилирование белков
Передача сигналов от клетки к клетке
Модификация белков
Процессинг РНК
Гены,
n
Повышение регуляции
Гены,
n
56
18
Контрольная точка клеточного цикла
Процессы развития
3
3
16
16
12
11
10
8
8
8
Фосфорилирование белков
Транспорт малых молекул
Развитие центральной нервной системы
Передача сигналов
Неселективный пузырьковый транспорт
Развитие скелета
Иммунный ответ
Передача сигналов с помощью рецептора на
поверхности клетки
Рост и поддержание жизнедеятельности
клеток
Ответ на стресс
Транспорт натрия
2
2
2
2
1
1
1
1
1
Регуляция транскрипции
6
Репликация ДНК
Положительный контроль пролиферации
клеток
Передача сигналов с помощью рецептора
тирозинкиназы
Транскрипция с промоутера Pol II
5
5
Резистентность к лекарственным
препаратам
Сигнальный путь РЭФР
Регуляция, инициация трансляции
Каскад JNK
Подвижность клеток
Каскад JAK-STAT
Антиапоптоз
Активация киназы JUN
Сигнальный путь рецептора TGFβ
Каскад MAP3K
Молекулярные функции
Фактор транскрипции
Связывание ДНК
Серин/треонинкиназа
Аденозинтрифосфатаза
Ко-активатор транскрипции
Протеинкиназа
Связывание РНК
Фактор транскрипции РНК-полимеразы II
Ко-репрессор транскрипции
Фактор трансляции
Передача сигналов
Рецептор протеинтирозинфосфатазы
Фактор активации транскрипции
Ингибитор апоптоза
Адаптер передачи сигнала по JAK-пути
РЭФР
MAP3K
Рецептор инозитол-1,4,5-трифосфата
TGFβ-рецептор II типа
Цитокин
Регулятор клеточного цикла
Ко-фактор транскрипции
4
Повышение концентрации ионов кальция в
цитозоле
Передача сигналов с помощью рецептора,
связанного с G-белком
Подавление транскрипции с промоутера Pol II
4
4
4
3
2
2
2
2
1
Индукция апоптоза
Экскреция
Апоптоз
Развитие сперматид
Мужской мейоз
Развитие периферической нервной система
Гуморальный антимикробный ответ
Метаболизм цистеина
Развитие головного мозга
1
1
1
1
1
1
1
1
1
13
12
12
9
9
9
8
6
5
5
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
1
1
Связывание кальция
Серпин
Цитохром P450
Супрессор опухолей
Серин-C-пальмитоилтрансфераза
Белок сигнального рецептора
Рецептор интерлейкина
Диамин-N-цетиалтрансфераза
Рецептор
Лиганд
Рецептор, связанный с G-белком
Связывание белка
Ко-репрессор транскрипции
Переносчик триптофана
Переносчик пуриновых нуклеотидов
Переносчик АТФ-связывающей кассеты (ABC)
Связывание АТФ
Переносчик
Ингибитор ферментов
Белок теплового шока
Шаперон
Лиганд-зависимый ядерный рецептор
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
5
5
1
1
1
1
1
Используемые сокращения: РЭФР – рецептор эпидермального фактора роста; JNK - c-Jun-N-терминальная
протеинкиназа; MAPK - митоген-активируемая протеинкиназа; TGF - трансформирующий фактор роста.
1
15
Таблица 2. Классификация по функции генов, экспрессия которых в клетках линии PC3
изменилась после воздействия 3,3’-дииндолметана (DIM) c концентрацией 40 мкмоль/л в
течение 48 ч1
Снижение экспрессии
Биологические процессы
Передача сигналов
Онкогенез
Пролиферация клеток
Передача сигналов от клетки к клетке
Контроль клеточного цикла
Гены,
n
Повышение регуляции
Гены,
n
Регуляция транскрипции с промоутера
Pol II
Транскрипция с промоутера Pol II
Процессинг РНК
Фосфорилирование белков
Адгезия клеток
Подвижность клеток
Положительный контроль пролиферации
клеток
Репликация ДНК
Сплайсинг РНК
Сбор комплекса белков
Патогенез
Концентрация ионов кальция в цитозоле
Антиапоптоз
Иммунный ответ
Транскрипция с промоутера Pol I
Каскад JNK
Транскрипция
Транскрипция с промоутера Pol III
Сигнальный путь РЭФР
11
Воспалительный ответ
Передача сигналов
Метаболизм простагландинов
Контрольная точка клеточного цикла
Передача сигналов с помощью рецептора,
связанного с G-белком
Сбор комплекса белков
11
9
9
9
9
6
Иммунный ответ
Транспорт калия
Защитный ответ
Физиологические процессы
Ответ на патогенные грибы
Протеолиз и пептидолиз
1
1
1
1
1
1
5
5
5
5
5
5
5
3
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Инициация транскрипции с промоутера Pol
II
Активация MAPK
1
Активация комплемента
Метаболизм глюкозы
Процессы развития
Ответ на стресс
Адгезия гомофильных клеток
Транспорт малых молекул
Ответ на тяжелые металлы
Транспорт протонов
Вирулентность
Сигнальный путь тирозикиназного рецептора
Гидролиз фосфатидилинозитола бифосфата
Повышение концентрации ионов кальция в
цитозоле
Циркуляция
1
Передача сигналов с помощью рецептора на
поверхности клетки
1
20
16
15
10
9
8
8
8
7
7
6
6
3
3
Цитохром P450
Переносчик электронов
Связывание белков
Связывание кальция
Антипортер цистина/глутамата
Шаперон
Рецептор интерлейкина-1
Активируемый кальцием калиевый канал
Простагландигэндопероксидсинтаза
Связывание ГТФ
Пептидаза серинового типа
Фактор комплемента D
Связывание двухцепочечной РНК
Аденозиндеаминаза
3
3
3
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
3
2
2
2
2
Связывание РНК
Альдокеторедуктаза
Фосфоенопируваткарбоксилаза
Супрессор опухоли
АТФаза
Общий фактор транскрипции РНК-полимеразы
II
Рецептор брадикинина
Рецептор хемокина
Цитокин
Фермент
1
1
1
1
1
1
Молекулярные функции
Связывание РНК
Фактор транскрипции
Связывание ДНК
Ко-активатор транскрипции
Фактор транскрипции РНК-полимеразы II
Связывание белков
Передача сигналов
Серин/треонин киназа
АТФаза
Цитокин
Фактор активации транскрипции
Белок теплового шока
Регулятор клеточного цикла
Специфический фактор транскрипции РНК
pol II
Ингибитор апоптоза
Рецептор TGFβ
Общий фактор транскрипции РНК pol II
Циклин, специфичный для G1/S-фазы
Опухолевый антиген
Белок-рецептор тирозинфосфатаза
Циклин
Фактор роста
Лиганд рецептора интерлейкина-8
MAP-киназа киназы
1
Используемые сокращения – см. Таблицу 1.
42
16
16
15
13
2
1
1
1
4
4
2
2
2
1
1
1
1
1
1
16
Таблица 3. Изменение (в разы) экспрессии некоторых генов в клетках линии PC3 после
воздействия индол-3-карбинола (I3C) с концентрацией 60 мкмоль/л или 3,3’дииндолметана (DIM) c концентрацией 40 мкмоль/л в течение 6, 24 или 48 ч1,2
Название гена
Ферменты I и II фазы
NM_000499.2 Цитохром P450 (CYP1A1)
M25813.1 Ген P450c21 человека
N21019 Цитохром P450
AU154504 Цитохром P450
AU144855 Цитохром P450
NM_000104.2 Цитохром P450 (CYP1B1)
AB018580.1 Альдокеторедуктаза
NM_005589 Метилмалонатсемиальдегиддегидрогеназа
AK000550.1 Фосфолипаза A2 β
NM_000853.1 Глутатион-S-трансфепаза theta 1
NM_019886.1 Углеводная сульфотрансфераза 7
NM_012200.2 Глюкуронилтрансфераза I
AB009598 Глюкуронилтрансфераза I
Рост клетки, клеточный цикл, апоптоз
K03193.1 Рецептор эпидермального фактора роста человека
BF061658 Трансформирующий фактор роста
NM_003238.1 Трансформирующий фактор роста
NM_000358.1 Трансформирующий фактор роста
M19154.1 Рецептор эпидермального фактора роста человека
β-2
NM_002006.1 Фактор роста фибробластов 2
AI434345 Фактор активации транскрипции 1
Z24725.1 Митоген-индуцируемый ген -2
NM_004702.1 Циклин E2 (CCNE2)
AF112857.1 Циклин E2, сплайс-вариант 1
NM_021960.1 Последовательность миелоидной
гемобластоза (связанная с BCL2)
NM_004049.1 BCL2-связанный белок (BCL2A1)
D64137 KIP2 Ген для ингибирования p57KIP2
NM_000076.1 Циклинзависимый ингибитор киназы (p57Kip2)
NM_030579.1 Цитохром b5.
Пути передачи клеточных сигналов
NM_003954.1 MAP-киназа киназы киназы 14
NM_002756.1 MAP-киназа киназы 3 (MAP2K3)
NM_002376.1 MAP-регулирующая кинеза (MARK3)
NM_003010.1 MAP киназа киназы 4 (MAP2K4)
NM_003618.1 MAP-киназа киназы киназы киназы 3 (MAP4K3)
NM_006218.1 Фосфоинозитид 3 киназы
NM_002646.1 Фосфоинозитид 3 киназы
Фаторы транскрипции, онкогенеза, ангиогенеза и др.
NM_007111.1 Фактор транскрипции Dp-1 (TFDP1)
U62296.1 Фактор транскрипции NF-YC
BE966878 Фактор инициации синтеза белка 4 у эукариот
NM_001755.1 Основной снимающий фактор-binding factor, β.
УЗИ сердца есть
NM_006850.1 Подавление онкогенности 16 (ST16)
AI812030 Тромбоспондин 1
BE999967 Тромбоспондин 1
BE620457 Нейропилин 1
M92934.1 Фактор роста соединительной ткани
6ч
I3C
24 ч
48 ч
6ч
DIM
24 ч
1,4
3
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
3,7
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
5,2
НИ
НИ
НИ
НИ
НИ
3,6
НИ
НИ
2,1
НИ
НИ
НИ
1,8
НИ
НИ
НИ
НИ
2
НИ
НИ
НИ
НИ
1,7
12,6
2,3
2,2
НИ
5,2
2,3
2,3
1,9
2,9
НИ
5
НИ
1,4
НИ
НИ
5,4
3,5
3,5
3,4
3
2,2
9,2
2,4
НИ
2,1
2
НИ
НИ
-1,4
НИ
НИ
-1
НИ
-2,6
-1,8
-2
-1,1
-2
-4,3
-4
-6,9
-2,1
-5,4
1
-1,2
-1,2
-1
-1
-2,7
-5,1
-3,5
-3,3
-3
-4,1
-6,4
-4,9
-3,7
-4,7
НИ
-1,2
НИ
НИ
НИ
-1,1
-1,9
-1,4
-1,4
НИ
НИ
НИ
-4,9
-3,8
-2,2
-1,7
-1,3
-1,5
НИ
НИ
-1,1
НИ
-1
-1
-1,8
-1,8
-2,4
-2,3
-2,8
-2,3
-1,3
-2,2
-2
-4,3
-5,4
-3,4
НИ
НИ
НИ
-1,4
НИ
2,2
1,6
-1,4
-1,4
4,3
1,1
-6,9
-1,2
2,3
2,1
НИ
-2,1
4,5
3,4
-1,6
-3,5
4,5
4,7
-1,9
-1,1
-1,2
-1,3
-1,3
-1,4
-1,4
-3
-1,6
1,1
-1,7
-1,7
-2
-1,2
-1,4
-2,3
-1,7
-3,3
-4,1
-6,8
-2,1
-2,4
-1,1
НИ
НИ
-1,1
НИ
НИ
НИ
-2,7
-2,3
-2,2
-2
-2
НИ
НИ
-3,9
-2,7
-3,1
-2,9
-2,4
НИ
НИ
-1,2
-1,2
НИ
-1,2
-1,3
-1,5
НИ
-1,6
-3,8
-3,4
НИ
-2,9
НИ
НИ
-1,1
НИ
-2,1
-2
-1,8
-2
-3,7
-2,1
-2,1
-2,1
2,2
НИ
-1
-1,6
НИ
3,6
-1,9
-1,4
-1,9
НИ
2,4
-4,7
-3,9
-8,2
НИ
1,2
-1
-1,2
НИ
-1,9
1,7
-3
-3,3
НИ
-14,7
2,4
-4,3
-5
НИ
-19,8
Положительные значения отражают увеличение, отрицательные - уменьшение.
Сокращения: Cdk – циклинзависимая киназа; MAP –митоген-активированный белок; NF –ядерный фактор.
3
Нет изменений.
1
48 ч
2
17
Список литературы
1. Heber, D. & Bowerman, S. (2001) Applying science to changing dietary patterns. J. Nutr. 131:
3078S–3081S.
2. Bal, D. G., Foerster, S. B., Backman, D. R. & Lyman, D. O. (2001) Dietary change and
cancer: challenges and future direction. J. Nutr. 131: 181S–185S.
3. Verhoeven, D. T., Verhagen, H., Goldbohm, R. A., van den Brandt, P. A. & van Poppel, G.
(1997) A review of mechanisms underlying anticarcinogenicity by Brassica vegetables. Chem.
Biol. Interact. 103: 79–129.
4. Verhoeven, D. T., Goldbohm, R. A., van Poppel, G., Verhagen, H. & van den Brandt, P. A.
(1996) Epidemiological studies on Brassica vegetables and cancer risk. Cancer Epidemiol.
Biomark. Prev. 5: 733–748.
5. Bradlow, H. L., Sepkovic, D. W., Telang, N. T. & Osborne, M. P. (1995) Indole-3-carbinol. A
novel approach to breast cancer prevention. Ann. N.Y. Acad. Sci. 768: 180–200.
6. Brignall, M. S. (2001) Prevention and treatment of cancer with indole-3-carbinol. Altern.
Med. Rev. 6: 580–589.
7. Auborn, K., Abramson, A., Bradlow, H. L., Sepkovic, D. & Mullooly, V. (1998) Estrogen
metabolism and laryngeal papillomatosis: a pilot study ondietary prevention. Anticancer Res. 18:
4569–4573.
8. Rosen, C. A., Woodson, G. E., Thompson, J. W., Hengesteg, A. P. & Bradlow, H. L. (1998)
Preliminary results of the use of indole-3-carbinol for recurrent respiratory papillomatosis.
Otolaryngol. Head Neck Surg. 118: 810–815.
9. He, Y. H., Smale, M. H. & Schut, H. A. (1997) Chemopreventive properties of indole-3carbinol (I3C): inhibition of DNA adduct formation of the dietary carcinogen, 2-amino-1methyl-6-phenylimidazo [4, 5-b]pyridine (PhIP), in female F344 rats. J. Cell. Biochem. Suppl.
27: 42–51.
10. Cover, C. M., Hsieh, S. J., Tran, S. H., Hallden, G., Kim, G. S., Bjeldanes, L. F. & Firestone,
G. L. (1998) Indole-3-carbinol inhibits the expression of cyclin-dependent kinase-6 and induces
a G1 cell cycle arrest of human breast cancer cells independent of estrogen receptor signaling. J.
Biol. Chem. 273: 3838–3847.
11. Hong, C., Kim, H. A., Firestone, G. L. & Bjeldanes, L. F. (2002) 3, 3_-Diindolylmethane
(DIM) induces a G(1) cell cycle arrest in human breast cancer cells that is accompanied by Sp1mediated activation of p21(WAF1/CIP1) expression. Carcinogenesis 23: 1297–1305.
12. Ge, X., Yannai, S., Rennert, G., Gruener, N. & Fares, F. A. (1996) 3, 3_-Diindolylmethane
induces apoptosis in human cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 228: 153–158.
13. Riby, J. E., Chang, G. H., Firestone, G. L. & Bjeldanes, L. F. (2000) Ligand-independent
activation of estrogen receptor function by 3, 3_-diindolylmethane in human breast cancer cells.
Biochem. Pharmacol. 60: 167–177.
14. American Cancer Society (2002) Cancer Facts & Figures 2002, pp. 5–6. American Cancer
Society, Atlanta, GA.
15. Gopalkrishnan, R. V., Kang, D. C. & Fisher, P. B. (2001) Molecular markers and
determinants of prostate cancer metastasis. J. Cell. Physiol. 189: 245–256.
16. Brown, P. O. & Botstein, D. (1999) Exploring the new world of the genome with DNA
microarrays. Nat. Genet. 21: 33–37.
18
17. Xie, W., Mertens, J. C., Reiss, D. J., Rimm, D. L., Camp, R. L., Haffty, B. G. & Reiss, M.
(2002) Alterations of Smad signaling in human breast carcinoma are associated with poor
outcome: a tissue microarray study. Cancer Res. 62: 497–505.
18. Xu, J., Stolk, J. A., Zhang, X., Silva, S. J., Houghton, R. L., Matsumura, M., Vedvick, T. S.,
Leslie, K. B., Badaro, R. & Reed, S. G. (2000) Identification of differentially expressed genes in
human prostate cancer using subtraction and microarray. Cancer Res. 60: 1677–1682.
19. Kudoh, K., Ramanna, M., Ravatn, R., Elkahloun, A. G., Bittner, M. L., Meltzer, P. S., Trent,
J. M., Dalton, W. S. & Chin, K. V. (2000) Monitoring the expression profiles of doxorubicininduced and doxorubicin-resistant cancer cells by cDNA microarray. Cancer Res. 60: 4161–
4166.
20. Zembutsu, H., Ohnishi, Y., Tsunoda, T., Furukawa, Y., Katagiri, T., Ueyama, Y., Tamaoki,
N., Nomura, T., Kitahara, O., Yanagawa, R., Hirata, K. & Nakamura, Y. (2002) Genome-wide
cDNA microarray screening to correlate gene expression profiles with sensitivity of 85 human
cancer xenografts to anticancer drugs. Cancer Res. 62: 518–527.
21. Chinni, S. R. & Sarkar, F. H. (2002) Akt inactivation is a key event in indole-3-carbinolinduced apoptosis in PC-3 cells. Clin. Cancer Res. 8: 1228–1236.
22. Chinni, S. R., Li, Y., Upadhyay, S., Koppolu, P. K. & Sarkar, F. H. (2001) Indole-3-carbinol
(I3C) induced cell growth inhibition, G1 cell cycle arrest and apoptosis in prostate cancer cells.
Oncogene 20: 2927–2936.
23. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O. & Botstein, D. (1998) Cluster analysis and
display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A 95: 14863–14868.
24. Khatri, P., Draghici, S., Ostermeier, G. C. & Krawetz, S. A. (2002) Profiling gene expression
using onto-express. Genomics 79: 266–270.
25. Li, Y. & Sarkar, F. (2002) Down-regulation of invasion and angiogenesis-related genes
identified by cDNA microarray analysis of PC3 prostate cancer cells treated with genistein.
Cancer Lett. 186: 157.
26. van Iersel, M. L., Verhagen, H. & van Bladeren, P. J. (1999) The role of biotransformation in
dietary (anti)carcinogenesis. Mutat. Res. 443: 259–270.
27. Mendelsohn, J. (2002) Targeting the epidermal growth factor receptor for cancer therapy. J.
Clin. Oncol. 20: 1S–13S.
28. Platten, M., Wick, W. & Weller, M. (2001) Malignant glioma biology: role for TGF-beta in
growth, motility, angiogenesis, and immune escape. Microsc. Res. Tech. 52: 401–410.
29. Cross, M. J. & Claesson-Welsh, L. (2001) FGF and VEGF function in angiogenesis:
signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends Pharmacol. Sci. 22:
201–207.
30. Schneider, G., Oswald, F., Wahl, C., Greten, F. R., Adler, G. & Schmid, R. M. (2002)
Cyclosporine inhibits growth through the activating transcription factor/cAMP-responsive
element-binding protein binding site in the cyclin D1 promoter. J. Biol. Chem. 277: 43599–
43607.
31. Wick, M., Burger, C., Brusselbach, S., Lucibello, F. C. & Muller, R. (1994) Identification of
serum-inducible genes: different patterns of gene regulation during G03S and G13S progression.
J. Cell Sci. 107: 227–239.
32. Nakayama, K. I., Hatakeyama, S. & Nakayama, K. (2001) Regulation of the cell cycle at the
G1-S transition by proteolysis of cyclin E and p27Kip1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:
853–860.
19
33. Cory, S. & Adams, J. M. (2002) The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death
switch. Nat. Rev. Cancer 2: 647–656.
34. Jean, D. & Bar-Eli, M. (2001) Targeting the ATF-1/CREB transcription factors by single
chain Fv fragment in human melanoma: potential modality for cancer therapy. Crit. Rev.
Immunol. 21: 275–286.
35. Lee, M. H. & Yang, H. Y. (2001) Negative regulators of cyclin-dependent kinases and their
roles in cancers. Cell Mol. Life Sci. 58: 1907–1922.
36. Seger, R. & Krebs, E. G. (1995) The MAPK signaling cascade. FASEB J. 9: 726–735.
37. Sebolt-Leopold, J. S. (2000) Development of anticancer drugs targeting the MAP kinase
pathway. Oncogene 19: 6594–6599.
38. Cantley, L. C. (2002) The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science (Washington, DC)
296: 1655–1657.
39. Yasui, K., Arii, S., Zhao, C., Imoto, I., Ueda, M., Nagai, H., Emi, M. & Inazawa, J. (2002)
TFDP1, CUL4A, and CDC16 identified as targets for amplification at 13q34 in hepatocellular
carcinomas. Hepatology 35: 1476–1484.
40. Izumi, H., Molander, C., Penn, L. Z., Ishisaki, A., Kohno, K. & Funa, K. (2001) Mechanism
for the transcriptional repression by c-Myc on PDGF betareceptor. J. Cell Sci. 114: 1533–1544.
41. Kundu, M. & Liu, P. P. (2001) Function of the inv(16) fusion gene CBFB-MYH11. Curr.
Opin. Hematol. 8: 201–205.
42. Jiang, H., Su, Z. Z., Lin, J. J., Goldstein, N. I., Young, C. S. & Fisher, P. B. (1996) The
melanoma differentiation associated gene mda-7 suppresses cancer cell growth. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 93: 9160–9165.
20