Глубинные фильтры Zeta Plus® и альтернативные

Глубинная фильтрация Zeta Plus и альтернативные технологии для осветления клеточных культур
Глубинные фильтры Zeta Plus® и альтернативные технологии осветления
клеточных культур
Введение
Производство терапевтических и диагностических препаратов с помощью технологии клеточных культур
стало краеугольным камнем биотехнологической индустрии. В системах клеточных культур могут
использоваться бактериальные и дрожжевые клетки, клетки насекомых и млекопитающих, причем системы с
применением клеток млекопитающих становятся наиболее широко распространенными. Производство
терапевтических препаратов методом клеточной культуры начинается с выращивания клеток нужного
организма, после чего происходит очистка экспрессируемого в этих клетках терапевтического белка. Первый
этап очистки связан с отделением продукта от массы клеток. Осветление культуральной жидкости ставит
перед технологом задачу выбора метода, дающего максимальный выход продукта, соответствующего
нормативным требованиям FDA и обеспечивающего приемлемые экономические показатели.
В настоящих рекомендациях компании 3М представлены вопросы, связанные с перечисленными ниже
технологиями отделения клеток (осветления), и описаны преимущества системы глубинной фильтрации Zeta
Plus®.
Глубинная фильтрация Zeta Plus;
Тангенциальная фильтрация (TFF);
Центрифугирование.
Технологический процесс
Наиболее распространенный метод производства терапевтических продуктов, таких как моноклональные
антитела и другие белки – это культивирование клеток млекопитающих. Как правило, эти продукты в ходе
культивирования напрямую секретируются клетками млекопитающих в культуральную среду. Процессы
культивирования клеток могут различаться по объему, от менее, чем 5 литров до 10 000 литров, при этом
первый этап очистки связан с отделением клеточной массы от продукта, содержащегося в культуральной
жидкости. На рис. 1 показано, на каком этапе технологии применяется осветление клеточной культуры.
Альтернативными методами очистки от клеток являются центрифугирование и фильтрация.
Рис. 1. Процесс очистки культуры от клеток (осветления)
Рис. 1. Процесс очистки от клеток
Глубинный
фильтр
®
3М Zeta Plus
Подача
среды
Фильтр 3М
®
LifeASSURE
Вентиляционный
фильтр 3М на
емкости
Microfluor®
Биотехнологии, биологические и фармацевтические препараты
РЕКОМЕНДАЦИИ КОМПАНИИ 3M
Осветленная
культуральная
жидкость
Клеточная
суспензия
Емкость
для
продукции
Биореактор
Области применения
фильтровального
картриджа Zeta Plus®
1
1
Глубинная фильтрация Zeta Plus и альтернативные технологии для осветления клеточных культур
Проблема
Выбор системы удаления биомассы из клеточной культуры зависит от технологических особенностей процесса,
соответствия нормативным технологическим документам и экономичности. Проблемы технологичности процесса
включают масштабируемость, надежность качества продукта для дальнейшей очистки, выход продукта и гибкость
системы отделения клеток, если система будет использоваться при внедрении будущих технологических процессов.
Аспекты соответствия нормативным документам связаны с чистотой и предотвращением перекрестного загрязнения
партий продукта. К экономическим вопросам относятся затраты на обслуживание, затраты на расходные материалы и
капитальные затраты на оборудование. Все эти вопросы рассматриваются ниже, в разделе «Техническое решение,
предлагаемое компанией 3М».
Техническое решение, предлагаемое компанией 3М
Технологические вопросы
Масштабируемость. Материал фильтра Zeta Plus можно протестировать в небольшом объеме, а полученные данные
можно использовать для расчетов систем промышленного масштаба. Полное обсуждение оценки масштабируемости для
фильтра Zeta Plus (под названием «Clarification of Animal Cell Culture Process Fluids Using Depth Microfiltration», авторы
Singhvi и др.) было опубликовано в журнале BioPharm (выпуск №9 за апрель 1996 г.). С помощью аппарата,
представленного на рис. 2, с применением дисков с фильтрующей площадью 13,5 см2, были получены данные для оценки
системы удаления клеток на 1200 литров с фильтрующей площадью 3,1 м2. Эксперименты по масштабированию
производились с использованием модели постоянного потока (фиксированный расход на единицу площади). При данной
постановке эксперимента результаты для фильтров Zeta Plus масштабируются линейно. Для получения точных данных по
масштабированию необходимо использовать ту же культуральную жидкость и те же технологические условия, что и в
полномасштабном производстве.
Рис. 2. Схема оборудования для лабораторных испытаний материала фильтра Zeta Plus
Манометр
Направление
потока
Резервуар с
образцом
Магнитная
мешалка
Корпус
для
проверки
фильтра,
47 мм
Насос с регулируемой
скоростью
Сбор
фильтрата
Системы тангенциальной фильтрации (TTF) также можно анализировать в малом масштабе и использовать
результаты для регламентации систем промышленного типа. Для получения точных данных по масштабированию TTFсистем необходимо использовать устройства для проверки фильтров, имеющие ту же длину траектории прохождения
жидкости, что и в фильтрационных TTF-системах промышленного типа.
Центрифугирование представляет больше проблем при масштабировании. Для получения точной информации
необходимо использовать устройство с той же гравитационной нагрузкой и потоком. По причине технических
ограничений масштабировать результаты экспериментов на центрифуге не всегда возможно.
Качество фильтрата. Эффективность отделения клеток зависит от выбранного метода и существенно влияет на
дальнейшие операции очистки целевого продукта. Как правило, глубинные фильтры Zeta Plus и TTF-системы
обеспечивают высокое качество фильтрата.
2
Глубинная фильтрация Zeta Plus и альтернативные технологии для осветления клеточных культур
Материалы фильтров Zeta Plus и TFF состоят из
матрикса с фиксированным размером пор, который
контролируется в процессе производства фильтров, что
позволяет получать фильтрат постоянно высокого
качества.
Количество частиц (число на мл)
Рис. 3. Отношение количества частиц к объему пропущенного
через фильтр продукта при использовании фильтров Zeta Plus
На рис. 3 показаны результаты исследования
отношения количества частиц к объему пропущенного
через фильтр продукта при использовании фильтров
Zeta
Plus.
Цель
таких
исследований—
продемонстрировать,
что
фильтр
сохраняет
удерживающую способность с течением времени и при
увеличении объема фильтрата. То обстоятельство, что
количество частиц после тестируемого фильтра
остается низким, является доказательством того, что
качество фильтрата будет оставаться постоянным с
течением времени при увеличении объема фильтрата.
2
1 л/фут /мин
0,5 л/фут2/мин
0,25 л/фут2/мин
Накопленный объем продукта (л/фут2)
Центрифуги отделяют клетки и обломки клеток на основе их плотности. Поскольку разница в плотности цельных
клеток, их обломков и других коллоидных веществ может быть небольшой, эффективность разделения будет не такой
высокой, как при использовании фильтрации. По этой причине верхнюю фракцию центрифугата необходимо
дополнительно довести до необходимого качества фильтрацией, чтобы защитить расположенные далее в
технологическом процессе системы.
Выход продукта. Система отделения клеток напрямую влияет на выход продукта и определяет экономичность
процесса. Продукты, произведенные методом культивирования клеток млекопитающих, имеют высокую собственную
стоимость, и любое снижение выхода продукта наносит производству прямой экономический ущерб.
Использование TFF-систем и центрифуг может ограничивать выход продукта. Центрифуги, используемые для
отделения клеток, относятся к типу саморазгружающихся. Ограничение выхода продукции связано с достижимым
уровнем содержания влаги в отбрасываемых твердых осадках. Степень уплотнения и обезвоживания твердых отходов
может варьироваться от 50 до 70%, что снижает выход продукции до 30-50%.
Системы тангенциальной фильтрации (TTF) ограничены фактором объемного концентрирования (VCF), достижимым
для клеточного бульона. В некоторых случаях максимальное значение VCF может быть равным 10, это означает, что
общий выход составляет 90%, а потери продукции — 10%. Выход продукта можно повысить диафильтрацией, однако
при этом возрастает общий технологический объем для последующей очистки.
Системы глубинной фильтрации Zeta Plus являются
тупиковыми, это означает, что вся поступающая
жидкость проходит сквозь фильтр. Выход продукта, по
существу, стопроцентный. Выход продукта может
оцениваться по ресурсу фильтра до полной забивки.
Однако, иногда выход продукта может снижаться из-за
адсорбции или механического удержания материалом
фильтра Zeta Plus. В данных, приведенных на рис. 4,
сравнивается
общая
концентрация
белка
и
концентрация IgG в фильтрате после фильтров Zeta
Plus. Концентрации общего белка и IgG в образцах
фильтрата
анализировались
с
регулярными
интервалами в разных экспериментах по фильтрации, и
сравнивались с одним и тем же исходным материалом.
Результаты показывают практически полное отсутствие
потери концентрации общего протеина или IgG во всем
диапазоне пропускаемого через фильтр объема. Это
указывает на отсутствие потерь выхода продукта из-за
адсорбции или задержки фильтром.
Общая концентрация белка
(мг/мл)
Концентрация IgG (мг/мл)
Концентрация IgG (мг/мл)
Общая концентрация белка (мг/мл)
Рис. 4. Общая концентрация белка и IgG в фильтрате фильтров
Zeta Plus
Накопленный объем обработанного продукта (л/фут2)
Гибкость системы. Выбор системы отделения клеток может определяться изменениями объема получаемой
культуральной жидкости, или будущими потребностями увеличения объем партии. Из разных методов отделения клеток
только глубинная фильтрация обеспечивает оперативную гибкость.
3
Глубинная фильтрация Zeta Plus и альтернативные технологии для осветления клеточных культур
Как было указано ранее, системы глубинной фильтрации Zeta Plus являются прямоточными и тупиковыми. Для
повышения ресурса фильтра необходимо лишь увеличить его площадь, и это единственная адаптация технологии к
необходимости работать с большими объемами партий, проходящими через ферментер. Если из-за увеличения объема
партий требуется дополнительная площадь фильтра, можно легко добавить дополнительные корпуса с фильтрами. В
большинстве случаев можно использовать ту же насосную установку. Необходимо лишь обеспечить такое давление,
которое позволяет продавить жидкость через фильтры. Насосы для рециркуляции не нужны.
TFF-системы для отделения клеток также можно масштабировать в соответствии с конкретными технологическими
требованиями. Если объем получаемой жидкости уменьшается или увеличивается, необходимо вносить изменения в
скорость рециркуляции поперечного потока. Если требуются дополнительные площади фильтров, их можно добавлять на
модульной основе, однако необходимо повысить объем жидкости, перекачиваемой рециркуляционным насосом, для чего
часто бывает нужно устанавливать новый насос. TFF-системы так же, как правило, автоматизируются с целью контроля
производительности, и любые изменения технологического процесса требуют перепрограммирования. В некоторых
случаях повышение объема партий ведет к необходимости смены трубопроводов и датчиков регулирования потока.
Системы с центрифугами также масштабируются в соответствии с параметрами процесса. При увеличении объема
партий объем центрифуги нельзя нарастить. Единственный выход – приобрести новую центрифугу.
Вопросы соответствия нормативным документам
Мойка. Валидация процессов отмывки оборудования (мойка в линии – CIP) считается существенным элементом при
аттестации систем отделения клеток. Глубинные фильтры Zeta Plus являются одноразовыми, и их необходимо менять
после каждого использования. По этой причине валидация отмывки не требуется, и вероятность перекрестного
загрязнения партий отсутствует. Однако TFF-системы работают таким образом, что их мембраны неизбежно
используются для разных партий. После каждой фильтрации необходимы эффективные процедуры CIP-очистки, чтобы
устранить загрязнения, создающие сопротивление протоку. Помимо мембраны, необходимо освободить от остатков
клеток все тонкие каналы рециркуляции. Эффективность очистки оценивается путем измерения восстановления
исходного перепада давления или путем измерения восстановления исходного значения содержания общего
органического углерода (ТОС). Независимо от используемого метода измерений, всегда существует вероятность
перекрестного загрязнения партий. Аналогично, центрифуги применяются для разных партий, и они должны проходить
проверку процессов CIP. В большинстве случаев в центрифугах есть поверхности, вступающие в контакт с жидкостью,
такие как нержавеющая сталь и полимерные уплотнители. Адекватная очистка таких поверхностей зависит от доступа к
ним жидкости, используемой для CIP-очистки. Инжекторные форсунки центрифуг и другие отверстия сложно
прочистить на месте, и может потребоваться трудоемкая разборка оборудования для тщательной мойки.
Масштабирование. Все технологии процессы с клетками млекопитающих начинаются с небольших масштабов, часто
с объемов 5 литров и менее. Но даже при таких исходно небольших масштабах можно применить и оценить глубинные
фильтры. Когда объем партии возрастает, тот же материал фильтра можно использовать на всех этапах работ, от ранних
стадий клинических исследований до полномасштабного производства. TFF-фильтры теоретически также могут
масштабироваться, однако для малых объемов TFF-системы применять очень сложно. Чтобы добиться адекватного
масштабирования, необходимо поддерживать все параметры контроля протока в состоянии, соответствующем тому,
который будет использоваться на производственных стадиях. Центрифуги также создают проблемы для
масштабирования. Из-за различий в конструкциях роторов при увеличении технологических объемов может оказаться
невозможным точно смоделировать производительность в малом масштабе.
Контрактные производства. Валидация технологии, если на одном и том же оборудовании производятся продукты
для нескольких клиентов, также ставит проблемы на операциях по отделению клеток. Как указано выше, глубинные
фильтры Zeta Plus являются одноразовыми и, следовательно, не создают возможностей для перекрестного загрязнения
между партиями или даже между продуктами для разных клиентов. TFF-системы и центрифуги, из-за проблем чистоты, в
таких случаях уязвимы для перекрестного загрязнения.
4
Глубинная фильтрация Zeta Plus и альтернативные технологии для осветления клеточных культур
Вопросы экономичности фильтрации.
Выход продукта. Любое уменьшение выхода продукта отрицательно сказывается на экономических показателях
всего процесса. Наряду с потерей продукта из-за безвозвратных потерь культуральной жидкости, механические нагрузки
могут привести к денатурации белка или к разрыву клеток, что ведет к высвобождению протеаз, разрушающих продукт.
Срезающие механические нагрузки связаны с высокими гравитационными воздействиями и с развитием поверхностей
раздела воздух/жидкость (вспенивание), что характерно для центрифугирования. В TFF-системах необходимы высокие
скорости рециркуляции, чтобы предотвратить забивание мембран. Насосы, осуществляющие рециркуляцию, могут
создавать кавитацию, приводящую к денатурации белка, а высокая скорость рециркуляции через мембранные каналы
также может приводить к денатурации. Глубинные фильтры имеют прямоточную конструкцию, обеспечивающую
максимальное извлечение продукта, и работают при относительно низких давлениях. Это сводит к минимуму
денатурацию, вызываемую срезающими механическими нагрузками.
Валидация. Основные затраты на валидацию систем удаления клеток связаны с демонстрацией эффективности
процессов CIP-мойки. Глубинные фильтры, которые заменяются после каждого использования, предотвращают
перекрестное загрязнение партий или даже продукции, предназначенной разным клиентам. TFF-мембраны, напротив,
обычно, используются многократно. В центрифугах для мойки существуют препятствия—труднодоступные для
чистящих жидкостей контактные поверхности.
Капитальные затраты. Глубинные фильтры являются относительно простой системой для отделения клеточной
массы. Оборудование состоит из корпусов с фильтрами, трубопроводов и насосных установок. TFF и центрифужные
системы, напротив, более сложные, включают в себя сложную систему контроля потока и средства автоматизации. Это
существенно увеличивает капитальные затраты на системы тангенциальной фильтрации и сепараторы, часто в 5-10 раз по
сравнению с системами глубинной фильтрации.
Затраты на обслуживание. Из глубинных фильтров, TFF и центрифужных систем наибольших затрат требуют
центрифуги, для которых ежегодные затраты на обслуживание составляют 5% покупной стоимости. TFF-системы
являются следующими из-за сложности оборудования для контроля и мониторинга потока. Глубинные фильтры требуют
наименьших затрат на обслуживание, они проще в работе и, как правило, не автоматизируются.
Затраты, связанные с технологическим процессом
CIP. Все три технологии удаления клеток предусматривают затраты на CIP-мойку. Для TFF-систем и центрифуг
затраты на CIP наибольшие, поскольку TFF-мембраны требуют тщательной мойки после каждой фильтрации. Для
центрифуг может потребоваться разборка, чтобы гарантировать полноту чистки. Затраты на CIP-очистку для
глубинных фильтров минимальны, и они связаны, главным образом, с поверхностями корпусов фильтров,
контактирующих с продуктом.
Затраты на электроэнергию. Для работы центрифуг требуется больше всего энергии, за ними следуют TFFсистемы, а для глубинных фильтров расход наименьший. В TFF-системах требуется поддерживать относительно
высокую скорость рециркуляции для предотвращения забивания мембран, что ведет к высоким требованиям к
мощности насосов. Системы глубинной фильтрации предъявляют минимальные требования к насосам, поскольку
жидкость напрямую подается на фильтры, для которых высокое давление не требуется.
Расходные материалы. Для глубинных фильтров и TFF-систем затраты на расходные материалы наибольшие.
Эти затраты связаны с заменой мембран. Глубинные фильтры нужно заменять после каждой операции по
фильтрованию. TFF-мембрана используется многократно, однако срок службы мембраны может варьироваться в
зависимости от эффективности очистки. Хотя срок службы TFF-мембраны существенно выше, чем у глубинных
фильтров, они значительно более дорогие.
5
Глубинная фильтрация Zeta Plus и альтернативные технологии для осветления клеточных культур
Заключение и выводы
В данном документе рекомендаций компании 3М представлены вопросы, связанные с альтернативными
технологиями, которые могут использоваться для отделения клеточной массы после культивирования клеток. Акцент в
данном сравнении технологий делается на применении фильтров для отделения клеток млекопитающих. В приведенной
ниже табл. 1 дается общий обзор сравнения глубинных фильтров Zeta Plus, TFF-систем и центрифужных систем.
Таблица 1. Сравнение глубинных фильтров Zeta Plus, систем тангенциальной фильтрации (TFF) и
центрифужных систем
Проблема
Глубинная фильтрация
Zeta Plus
TFF
Центрифуга
Масштабируемость
Да, линейная
Да, линейная
Качество фильтрата
Превосходное
Может потребоваться
Требуется дополнительная
дополнительная фильтрация фильтрация
Выход
Превосходный, > 95%
Хороший, может
потребоваться
диафильтрация
Зависит от достижимого
осушения осадка
Гибкость системы:
Легко масштабировать в
обоих направлениях
Трудно масштабировать в
сторону увеличения
Нет, фиксированная
технологическая
конструкция
Фиксированность
технологического решения
Нет
Да
Да
Срезающие нагрузки
Низкие
Умеренные
Высокие
Валидация CIP
Простая, одноразовые
фильтры
Сложная, требуется
повторное использование
мембраны
Сложная, может
потребоваться разборка
оборудования
Перекрестное загрязнений
партий
Нет, одноразовые фильтры
Да, повторное использование Да, сложности для CIPмембраны
оборудования
Возможность стерилизации
паром на месте
Да
Нет
Да
Капитальные затраты
Низкие
Высокие
Высокие
Затраты на обслуживание
Низкие
Умеренные
Высокие
Расходные материалы
Умеренные, замена фильтров
Низкие/высокие, зависит от
срока службы мембраны
Умеренные, потребление
электроэнергии
6
Затруднена
Глубинная фильтрация Zeta Plus и альтернативные технологии для осветления клеточных культур
Дополнительная справочная литература
Название/описание справочного материала
Идентификатор публикации
Фильтровальные системы 3М для разделения в биологии и биотехнологии
Предоставляются по запросу
Фильтровальные картриджи Zeta Plus Maximizer
Предоставляются по запросу
Файл нормативной поддержки для Zeta Plus Maximizer
Предоставляются по запросу
Материал фильтров Zeta Plus серии S
Предоставляются по запросу
Файл нормативной поддержки для Zeta Plus SP
Предоставляются по запросу
Корпуса гигиенического фильтра ZPB, ZPC
Предоставляются по запросу
Корпуса гигиенического фильтра ZPB, инструкции по эксплуатации
Предоставляются по запросу
Корпуса гигиенического фильтра ZPC, инструкции по эксплуатации
Предоставляются по запросу
Служба поддержки научных исследований
Краеугольным камнем принципов компании 3М является обслуживание заказчиков, что подразумевает не только
высокое качество продукции и услуг, но также и помощь в разрешении проблем, помощи в конкретных применениях
фильтров и предоставлении научной информации. Служба поддержки научных исследований (SASS) компании 3М это группа ученых и инженеров, ориентированная на рынок, работающая в тесном контакте с клиентами над решением
сложных проблем с очисткой продуктов и помогающая подобрать наиболее эффективную и экономичную систему
фильтрации. Компания 3М предлагает специализированную поддержку для фармацевтической и биотехнологической
отрасли благодаря реализации программы услуг помощи при валидации. SASS ежедневно предлагает конечным
пользователям следующие услуги:
Валидация и поддержка нормативной документацией;
Анализ экстрагируемых веществ и совместимости фильтров;
Работы по оптимизации систем фильтрации;
Проверка с помощью прибора для контроля целостности MicroCheck® 2.
За дополнительной информацией о программе услуг помощи при проверке
от компании 3M обращайтесь в службу технической поддержки 3M или к
местному дистрибьютору 3M.
7
Глубинная фильтрация Zeta Plus и альтернативные технологии для осветления клеточных культур
Компания 3M ... Мировой лидер в области очистки жидкостей
На производственных предприятиях компании 3M применяются системы управления качеством,
сертифицированные в соответствии со стандартом ISO 9001. Производственные предприятия и дистрибьюторы
готовой продукции по всему миру при поддержке самых современных лабораторий предлагают
высококачественные решения сложнейших задач фильтрации.
Очистка жидкостей
3М Фильтрующие системы
Офис-парк "Крылатские холмы"
ул.Крылатская д.17, стр.3
121614, Москва, Россия.
тел. + 7 495 784 74 74
факс + 7 495 784 74 75
www.3MRussia.ru
www.3MCuno.ru
www.3mpartners.ru
© 3M Company, 2001. ВСЕ ПРАВА ЗАЩИЩЕНЫ.
LITCABZPS1.1101