Известно давно, что в отличие от млекопитающих, мозг

Пущина Е.В.
Кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории Цитофизиологии,
Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН
УЧАСТИЕ РАДИАЛЬНОЙ ГЛИИ В ПРОЦЕССАХ НЕЭМБРИОНАЛЬНОГО
НЕЙРОГЕНЕЗА У КОСТИСТЫХ РЫБ
Работа выполнена при поддержке гранта ДВО РАН (№ 09-III-B-06-266).
Известно давно, что в отличие от млекопитающих, мозг взрослых рыб продолжает
расти в течение всей жизни, однако механизмы этого явления все еще остаются
малоизученными. У разных видов рыб, включая и нейрогенетическую модель – данио
Danio rerio, в головном мозге показано наличие пролиферативных перивентрикулярных
областей [20]. Результаты недавних исследований на Danio rerio [5] и молоди осетров
Acipenser сshrenсki [22] показали, что, новообразованные клетки в течение времени
двигаются по направлению от желудочка в глубь мозга, где они дифференцируются в
нейроны. Несмотря на имеющиеся в литературе сведения, участие радиальной глии в
процессе нейрогенеза взрослых животных мало изучено [21]. Одной из причин недостатка
такой информации является отсутствие надежного маркера радиальной глии рыб.
Иммуногистохимические маркеры астроцитарной глии млекопитающих, такие как
глиальный фибриллярный кислый протеин (GFAB), виментин или протеин S-100
маркирует лишь отдельные клетки радиальной глии рыб, а окрашивание часто
ограничивается либо телом клетки, либо ее длинным отростком.
У взрослых представителей костистых рыб в мозге обнаружена высокая активность
фермента ароматазы [14], но функциональный смысл этого явления в настоящее время до
конца не ясен. Фермент ароматаза, конвертирующий превращение ароматизированных
андрогенов в эстрогены, синтезируется в результате транскрипци гена cyp19b, одного из
двух генов cyp19, образовавшихся в результате дупликации первоначального гена у
ранних представителей телеостей [15]. В результате транскрипционной активности гена
cyp19b синтезируется ароматаза В (AroB) преимущественно в головном мозге, тогда как
экспрессия гена cyp19а приводит к синтезу в гонадах ароматазы А (AroA) [19]. Недавно
было обнаружено, что в клетках радиальной глии взрослых рыб осуществляется
экспрессия mРНК, а также синтез протеина AroB [15]. В наших исследованиях
распределения ароматазы В (AroB) в головном мозге взрослых представителей симы
Onchorhynchus masu было обнаружено, что AroB селективно маркирует клетки
радиальной глии с их длинными отростками в промежуточном мозге (рис. А),
среднемозговом тегментуме (рис. Б) и продолговатом мозге (рис. В). У данио AroBиммунопозитивные клетки в большом количестве обнаружены в переднем мозге,
особенно в обонятельных луковицах, паллиальных и субпаллиальных зонах,
преоптической области и медиобазальном гипоталамусе а также частично вдоль
латерального и заднего желудочков [10]. Характерной особенностью таких клеток
является наличие у них мелких ядер, расположенных рядом с просветом желудочка, а
также длинных цитоплазматических выростов заканчивающихся концевыми «ножками»
на поверхности мозга [18].
Результаты наших исследований на симе показали, что в спинном мозге и тектуме
годовалой молоди симы иммуногистохимическим маркером радиальной глии является
тирозингидроксилаза (рис. Г, Д) – фермент биосинтеза катехоламинов в нейронах. Этот,
обнаруженный нами феномен, экспрессии катехоламинсинтезирующих энзимов в клетках
радиальной глии тектума и спинного мозга симы, ранее не был описан ни у одного вида
рыб, но у данио было показано наличие ТН-ир радиальной глии в теленцефалоне [1,5].
Характерно также то, что TH-иммунопозитивные клетки РГ локализованы в ростральных
областях спинного мозга, где наиболее отчетливо представлены главные
1
нейроморфологические признаки клеток этого типа по классификации Ракича [18]. У
взрослых особей симы тирозингидроксилаза маркирует популяцию радиальной глии в
области zona limitans конечного мозга – границе отделяющей паллиальную часть
конечного мозга от субпаллиальной (рис. Е), а в перивентрикулярных областях
промежуточного мозга маркирование тирозингидроксилазы позволяет идентифицировать
границы прозомеров (рис. Ж), в продолговатом мозге взрослых представителей симы ТН
маркирует клетки радиальной глии с их длинными отростками (рис. И).
Другим нейрохимическим маркером радиальной глии в мозге костистых рыб
является NADPH-диафораза, впервые описанная в перивентрикулярной зоне мозга
солнечника [9]. В результате наших исследований в области центрального серого слоя
продолговатого мозга у 3-х годовалой симы Oncorhynchus masu были выявлены клетки
радиальной глии с высокой активностью NADPH-диафоразы (Рис. Е). В отличие от ТН- и
АroB-иммуногенных клеток РГ в этих же областях, NADPH-d-позитивные клетки имели
отростки различной длины, а некоторые клетки вообще не имели отростков (рис. Е).
Таким образом, идентифицированные нами субпопуляции радиальной глии у симы
вполне подтверждали
представления о морфологической и нейрохимической
гетерогенности таких клеток. Эксперименты с маркированием клеток-предшественников
вентрикулярных зон млекопитающих показали, что предшественниками радиальной глии
являются именно клетки имеющие длинные, направленные к базальной поверхности
отростки [6]. Обнаружение того, что клетки радиальной глии рыб экспрессируют AroB,
ТН и NADPH-диафоразу очень интересно еще и потому, что у птиц и млекопитающих в
норме эти энзимы экспрессируется в нейронах [8]. Физиологическая значимость наличия
и высокой активности AroB, ТН и NADPH-диафоразы в клетках до настоящего времени
не понятна, но возможную функциональную роль можно предполагать, основываясь на
описанных в настоящее время функциях радиальной глии, ее участии в процессах
эмбрионального и постэмбрионального нейрогенеза [11], а также связью между наличием
вышеперечисленных энзимов в клетках радиальной глии и высокой нейрогенетической
активностью в мозге взрослых рыб [10,15]. Интерес к исследованию астроглиальных
клеток обусловлен еще и тем, что эти клетки, рассматриваются в качестве стволовых во
время нейрогенеза у взрослых животных. Участие радиальной глии в эмбриональном
нейрогенезе в настоящее время хорошо доказано [11]. Долгое время считалось, что клетки
радиальной глии прокладывают «транспортные дорожки», по которым мигрируют вновь
образованные нейроны вдоль длинных цитоплазматических выростов в глубокие слои
мозга [18]. Однако, совсем недавно наши классические представления о функциях
радиальной глии существенно изменились, когда стало известно, что радиальные клетки
не только обеспечивают поддержку вновь образованным нейронам, но способны также
участвовать в воспроизведении нейронов путем ассиметричного деления [12]. Принято
считать, что у млекопитающих по окончании нейрогенеза радиальные клетки
трансформируются в астроциты, поскольку мозг взрослых млекопитающих радиальной
глии не содержит [11]. Напротив, радиальная глия в большом количестве присутствует в
мозге других позвоночных, в особенности у птиц [15] и рыб [18], мозг которых
продолжает расти на протяжение всей жизни. В настоящее время механизмы этого
явления лишь частично исследованы [21]. Установлено, что нейрогенез продолжается
также в мозге взрослых млекопитающих и птиц [2,11], в особенности в
субвентрикулярной зоне, зубчатом ядре и гиппокампальной формации [4]. Считается, что
стволовые клетки взрослых животных из этих областей представляют собой продукт
трансформации радиальной глии в астроциты [13]. Таким образом, возможен вывод о том,
что клетки радиальной глии являются предшественниками большинства нейронов
головного мозга, не только в период эмбрионального нейрогенеза, но также и у взрослых
животных.
2
Локализация ароматазы (AroB), тирозингидроксилазы (ТН), NADPH-диафоразы и
ядерного антигена пролиферации (PCNA) в клетках радиальной глии Тихоокеанской симы
Oncorhynchus masu. А - иммунофлюоресценция ароматазы 6-месячной молоди (А-В) в
волокнах радиальной глии (показаны стрелками) преоптической области (фазовый и
дифференциальный контраст), среднемозговом тегментуме (Б) и продолговатом мозге (В),
ПОм – мелкоклеточная часть преоптического ядра, ТеО – оптический тектум, Тег –
тегментум, ПТ – полулунный торус, ЦА – церебеллярный акведук, МПП – медиальный
продольный пучок, МРФ - медиальный столб ретикулярной формации, IV – четвертый
желудочек; иммунолокализация тирозингидроксилазы в клетках радиальной глии (Г, Д у
3-х месячной молоди, Ж, З, И – у 3-х годовалой симы), спинного мозга – Г, оптическом
тектуме – Д, zona limitans конечного мозга – Ж, перивентрикулярной области
промежуточного мозга - З, продолговатого мозга – И; Вл – вентро-латеральная область
теленцефалона, ГН – участок, в котором отсутствует ТН-иммунолокализация,
соответствующий границе между P2 и P3 прозомерами, НПТ – нисходящий пучок
3
тройничного нерва, Е - гистохимическая активность NADPH-диафоразы в радиальной
глии (стрелки) центрального серого (ЦС) слоя продолговатого мозга; иммунолокализация
ядерного антигена пролифереции (PCNA) в центральном сером слое продолговатого мозга
взрослой симы – К, в преоптической области 6-месячной симы – Л, участок, в котором
отсутствует PCNA-иммунолокализация соответствует границе между P2 (дорсальный
таламус) и P3 (вентральный таламус) прозомерами; пт – претектальная область, ДТ –
дорсальный таламус, ВТ – вентральный таламус. Увеличение: А, Ж, З – ок. 10, об. 40; Б, В
–ок. 10, об. 3; Г, Д, Е, И, К – ок. 10, об. 20; Л – ок. 10. об. 10.
Поскольку у низших позвоночных нейрогенетические процессы сохраняется во
взрослом мозге, радиальные клетки имеют доступ к пролиферативным областям
желудочка также и во взрослом состоянии [1,17]. Интересно, что «устойчивость» клеток
радиальной глии может также определять успех аксональной регенерации в ЦНС у немлекопитающих позвоночных, поскольку клетки радиальной глии обеспечивают хороший
субстрат для роста аксонов во время развития [7]. Радиальная глия сохраняется во
многих регионах головного мозга у не-млекопитающих позвоночных и может
рассматриваться как источник постэмбрионального нейрогенеза у птиц, рептилий,
амфибий и рыб [1,2,17]. Показано, что у амфибий и рыб во взрослом состоянии особая
эпендимальная обкладка мозгового желудочка не формируется, и клетки,
экспрессирующие молекулярные маркеры радиальной глии (RC2, GLAST, BLBP) с
длинными радиальными отростками покрывают всю поверхность желудочка [1,5,17].
Такие клетки радиальной глии гетерогенны в морфологическом и нейрохимическом
отношении [1,3]. Морфогенетический анализ и маркирование бромдезоксиуридина
показали, что во взрослом мозге данио среди клеток радиальной глии встречаются
единичные клетки-предшественники нейронов [1,3]. В обонятельных луковицах, взрослых
представителей данио были выявлены клетки, порождающие долгоживущие нейроны,
подобные
клеткам
млекопитающих,
которые
генерируют
нейрональные
предшественники, мигрирующие из теленцефалической вентрикулярной зоны в
обонятельную луковицу в составе ростральной миграционной волны (РМВ) [1]. Подобная
РМВ незрелых нейронов также была описана у черепахи [16] и различных видов
позвоночных [4], включая человека [17]. В наших исследованиях на разновозрастной
симе, маркирование ядерного антигена пролифереции (PCNA) показало, что у взрослой
симы в центральном сером слое ромбэнцефалона представлена обширная популяция
пролиферирующих клеток (рис. К), а в промежуточном мозге расположение
пролиферативных PCNA-иммуногенных зон соответствует паттерну прозомерной
конструкции переднего мозга (рис. Л). Гетерогенность клеток радиальной глии
окружающих мозговой желудочек у взрослых рыб, по существу может соответствовать
различным линиям дифференцировки, наблюдаемым в эмбриогенезе коры большого
мозга крыс [17]. На уровне переднего и продолговатого мозга данио, вдоль
вентрикулярного просвета сосуществуют быстро и медленно пролиферирующие
субпопуляции клеток радиальной глии [1,5,15, 21], отличающиеся по характеру
маркирования BrdU [3].
Таким образом, функциональная (пролиферативная)
неоднородность реализована во взрослом мозге данио в виде быстро и медленно
пролиферирующих субпопуляций радиальной глии, напоминающих нейрогенетическую и
самовозобновляющуюся субпопуляции клеток радиальной глии в эмбриональной коре
млекопитающих [17]. Постэмбриональный нейрогенез у данио
включают
воспроизведение нейрохимически гетерогенных субпопулляций нейронов, включающих
ТН- и серотонин-позитивных клетки, а также интернейроны и проекционные клетки [1,5].
Результаты ИГХ маркирования клеток перивентрикулярной области Тихоокеанской симы
подтверждают наличие нейрохимически гетерогенных популяций радиальной глии. На
уровне переднего мозга распределение ТН-ир клеток радиальной глии соответствует
нейромерной конструкции мозга, подтверждающейся также при маркировании
4
пролиферативных зон с помощью ядерного антигена пролиферации PCNA. На границе
между дорсальными прозомерами Р2-Р3 иммуномаркирование ТН и PCNA отсутствует. В
центральном сером слое ромбенцефалона
симы, показано наличие гетерогенных
популяций ТН-, АroB-, и NADPH-d позитивных клеток радиальной глии, расположенных
в области PCNA-иммуногенной ромбэнцефалической пролиферативной зоны.
Литература
1. Adolf B., Chapouton P., Lam C.S., et al. 2006. Conserved and acquired features of adult
neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev. Biol. V.295. P. 278–293.
2. Alvarez-Buylla A., Seri B., Doetsch F., 2002. Identification of neural stem cells in the adult
vertebrate brain. Brain Res. Bull. V. 57. P. 751–758.
3. Chapouton P., Adolf B., Leucht C., et al. 2006. Her 5 expression reveals a pool of neural stem
cells in the adult zebrafish midbrain. Development. V.133. P. 4293–4303.
4. Doetsch F., Scharff C., 2001. Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in
birds and mammals. Brain Behav. Evol. V. 58. P. 306–322.
5. Grandel H, Kaslin J, Ganz J, et al. 2006. Neural stem cells and neurogenesis in the adult
zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. V. 295. P. 263–
277.
6. Hartfuss, E., Forster, E., Bock, H.H., et al. 2003. Reelin signaling directly affects radial glia
morphology and biochemical maturation. Development. V. 130. P. 4597–4609.
7. Hasegawa, K., Chang, Y.W., Li, H., et al. 2005. Embryonic radial glia bridge spinal cord
lesions and promote functional recovery following spinal cord injury. Exp. Neurol. V. 193. P.
394–410.
8. Lephart ED. 1996. A review of brain aromatase cytochrome P 450. Brain Res. Brain Res. Rev.
V. 22. P. 1–26.
9. Ma P.M. 1993. Tanycytes in the sunfish brain: NADPH-diaphorase histochemistry and
regional distribution. J. Comp. Neurol. V. 336. P. 77-95.
10. Menuet A, Pellegrini E, Brion F., et al. 2005. Expression and estrogen-dependent regulation
of the zebrafish brain aromatase gene. J Comp Neurol. V. 485. P. 304–320.
11. Mori, T., Buffo, A., Gotz, M. 2005. The novel roles of glial cells revisited: the contribution of
radial glia and astrocytes to neurogenesis. Curr. Top. Dev. Biol. V. 69. P. 67-99.
12. Noctor, S.C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., et al. 2004. Cortical neurons arise in symmetric
and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. V. 7. P.
136-144.
13. Spassky N, Merkle FT, Flames N., et al. 2005. Adult ependymal cells are ostmitotic and are
derived from radial glial cells during embryogenesis. J. Neurosci V. 25. P. 10 – 18.
14. Pellegrini E, Menuet A, Lethimonier C. 2005. Relationships between aromatase
and estrogen receptors in the brain of teleost fish. Gen Comp Endocri- nol. V.142. P. 60–66.
15. Pellegrini E, Mouriec K, Anglade I., et al. 2007. Identification of aromatase-positive radial
glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J Comp
Neurol. V. 501. P. 150-67.
16. Perez-Canellas M.M., Font E., Garcia-Verdugo J.M. 1997. Postnatal neurogenesis in the
telencephalon of turtles: evidence for nonradial migration of new neurons from distant
proliferative ventricular zones to the olfactory bulbs. Brain Res. Dev. Brain Res. V. 101. P. 125–
137.
17. Pinto L., Götz M. 2007. Radial glial cell heterogeneity—The source of diverse progeny in
the CNS. Progress in Neurobiology V. 83. P. 2–23.
18. Rakic P. 1978. Neuronal migration and contact guidance in the primate
telencephalon. Postgrad Med J V. 54 (Suppl 1), P. 25–40.
19. Wong K.K., Chang Y.M., Tsang Y.T., et al. 2005. Expression analysis of juvenile pilocytic
astrocytomas by oligonucleotide microarray reveals two potential subgroups. Cancer Res V. 65.
P. 76–84.
5
20. Zupanc G.K., Horschke I. 1995. Proliferation zones in the brain of adult gymnotiform fish: a
quantitative mapping study. J Comp Neurol V. 353. P. 213–233.
21. Zupanc GK. 2006. Neurogenesis and neuronal regeneration in the adult fish brain. J Comp
Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. V. 192. P. 649–670.
22. Пущина Е.В., Флейшман М.Ю., Тимошин С.С. 2007. Пролиферативные зоны мозга
молоди амурского осетра Acipencer sberenki. Взаимоотношение с нейромерами и
миграцией вторичных матричных зон. Онтогенез. № 5 . C. 345-354.
6