Oocyte Quality, Fertilization, Embryo Assessment and Embryo Transfer

Welcome to chapter 9.
The following chapter is called "Oocyte Quality, Fertilization, Embryo Assessment
and Embryo Transfer".
The authors are Vanessa Guelman and Professor Pasquale Patrizio.
В этой главе представлен обзор параметров качества ооцитов и различных
классификаций, способов оценки оплодотворения, категории и качества
эмбрионов. Кроме того мы дадим представление о критериях, используемых
при отборе эмбрионов для переноса и о различных шагах и методиках,
применяемых для обеспечения успешного переноса эмбрионов.
2
2
На этом слайде схематически представлена классификация трех типов
ооцитов, различимых в момент их забора.
Зрелые ооциты находятся на стадии метафазы II и готовы к оплодотворению
или замораживанию.
Ооциты на стадии метафазы I находятся в состоянии промежуточной
зрелости, т.е. находятся в процессе развития до стадии МII. Обычно этот
процесс завершается в течение нескольких часов.
Ооциты на стадии зародышевого пузырька наименее зрелые; они еще не
прошли стадию первого мейоза. В целом на этой стадии развития находится
около 15% получаемых ооцитов.
Ооциты, выбранные для инъекции сперматозоида в цитоплазму (ИКСИ),
можно надлежащим образом классифицировать в день получения (поскольку
их кумулюсные клетки удаляются при обработке гиалуронидазой), а ооциты,
используемые для обычного ЭКО, можно классифицировать на следующий
день после инсеминации после отделения кумулюсных клеток.
3
3
Обратите внимание, что до начала мейоза созревание большого ядра
первичного ооцита завершено, полярные тельца сформированы. Этот ооцит
считается незрелым.
4
Пример зрелого ооцита в фазе MII после извлечения. Этот ооцит
морфологически идеален и в целом способен к оплодотворению. Обратите
внимание: кумулюсные клетки по-прежнему окружают ооцит, однако
образуемая ими оболочка сильно разрыхлилась, создавая типичный лучистый
эффект.
5
При традиционном ЭКО яйцеклетку помещают в чашку, содержащую около
150 000 сперматозоидов. На этом слайде видно, как множество
сперматозоидов пытается проникнуть через прозрачную оболочку, чтобы
оплодотворить ооцит.
6
Инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ) представляет собой
процесс, при котором в иглу забирают один сперматозоид, который затем
вводят в ооцит сквозь прозрачную оболочку. Эта процедура запускает процесс
оплодотворения; ее часто используют, когда по данным спермограммы
выявлено малое количество сперматозоидов, неполноценная морфология или
малая подвижность сперматозоидов. Слева показана микроприсоска, которая
используется для фиксации ооцита таким образом, чтобы полярное тельце
было расположено сверху ("на 12 часах"). Игла справа содержит один
сперматозоид, который инъецируют в ооцит на большом расстоянии от
полярного тельца. Обратите внимание на эластичность прозрачной оболочки.
.
7
Контроль оплодотворения и классификация эмбрионов
Признаком состоявшегося оплодотворения является присутствие двух
пронуклеусов (PN) и двух полярных телец в точный момент времени – через
16–18 часов после инсеминации.
Если это время для контроля было упущено, становится невозможным
выяснить, состоялось ли оплодотворение и, что наиболее важно, было ли оно
нормальным (присутствие только двух, а не большего числа пронуклеусов, как
это бывает при полиспермии).
9
9
На следующий день после инсеминации видны полярные тельца и два
пронуклеуса. В этот период записывают данные о размере и расположении
двух пронуклеусов и количестве ядрышек внутри них. На этой фотографии
представлена нормальная зигота с двумя пронуклеусами одинакового
размера, расположенными в центральной части ооплазмы и имеющими
нормальное число (от трех до пяти) ядрышек нормального размера и
расположения (напротив друг друга).
10
Присутствие в зиготе на момент контроля оплодотворения трех и более
пронуклеусов является патологическим состоянием.Наличие только одного
видимого пронуклеуса при проведении контроля оплодотворения в нужный
момент времени, т. е. через 16–18 часов после инсеминации или ИКСИ, тоже
является аномальным. В то же время следует иметь в виду, что необходимо
проводить повторный контроль таких ооцитов через 6 часов, поскольку около
20% из них могут проявить признаки оплодотворения (медленно
развивающиеся эмбрионы).
Первое митотическое деление (так называемое первое дробление) происходит
через 20–24 часа после инсеминации, и обычно каждые 24 часа число клеток
эмбриона удваивается.
11
Эмбрионы классифицируют по числу их клеток, размеру и форме бластомеров
(см. таблицу 1 на следующем слайде) и устанавливают их класс в
соответствии с характером и степенью фрагментации (см. таблицу 1).
После оценки бластомеров и степени их фрагментации устанавливают класс
эмбриона (класс 1 соответствует отличному качеству эмбриона, класс 5 –
неудовлетворительному качеству).
12
В таблице 1 приведены характеристики бластомеров и соответствующие им
классы. Например, эмбрион с бластомерами одинакового размера и
правильной формы относят к классу I, а в случае бластомеров разного
размера и неправильной формы – к классу IV.
В таблице 2 приведены два метода классификации для оценки фрагментации
эмбриона: а) по типу фрагментации и б) по степени фрагментации
(представленной как доля перивителлинового пространства и полости
дробления, занятая фрагментами цитоплазмы).
Например, если фрагменты маленькие и разбросаны по всей поверхности
эмбриона – это класс III; если фрагментами занято более 35% поверхности
эмбриона – это класс 5 (неудовлетворительно).
13
На данном слайде представлены различные классы эмбрионов,
предложенные Veeck в 1999. Она отнесла бластомеры одинакового размера
без фрагментации к классу 1, бластомеры с незначительной фрагментацией
цитоплазмы (занимающей менее 10%) к классу 2.
Бластомеры класса 3 имеют явно неодинаковый размер и различную степень
фрагментации.
Бластомеры одинакового или неодинакового размера с фрагментацией
цитоплазмы от умеренной до значительной (занимающей более 10%
поверхности эмбриона) были отнесены к классу 4.
Эмбрионы, отнесенные к классу 5, имеют малое число бластомеров любого
размера и сильно выраженную фрагментацию, занимающую более 50%
поверхности эмбриона.
14
Дополнительными характеристиками эмбрионов, на которые необходимо
обращать внимание, являются качество (грануляция) цитоплазмы и наличие
многоядерных клеток и вакуолей.
У эмбрионов с такими характеристиками частота имплантаций ниже, их
следует переносить только в случае отсутствия нормальных эмбрионов.
Эмбрионы, у которых остановилось дробление, переносить не следует.
15
На второй день оплодотворенный ооцит начинает делиться. Здесь в качестве
примера показан двухклеточный эмбрион на второй день. Поскольку
фрагментация отсутствует, это эмбрион класса 1.
16
Приведен пример четырехклеточного эмбриона класса 1 на второй день. У
эмбриона нет фрагментации, и бластомеры имеют одинаковый размер и
правильную форму.
17
На этой фотографии показаны три бластоцисты на 5-й день после
инсеминации. Эти бластоцисты полностью экспандированы, имеют
нормальную внутреннюю клеточную массу и ненарушенную целостность
трофобласта. Обратите внимание, что бластоциста, расположенная справа,
начинает "выклевываться" (освобождаться от внешней оболочки)
(направление на пять часов). Все три показанные бластоцисты были
перенесены, возникла трехплодная беременность, в результате которой
родилось три здоровых ребенка!
18
Основанная на морфологических параметрах классификация ооцитов и
оценка класса качества эмбрионов является не единственным методом
классификации эмбрионов. Преимплантационная генетическая диагностика
(ПГД) и преимплантационный генетический скрининг (ПГС) являются, пожалуй,
наиболее широко обсуждаемыми методами генетической оценки эмбрионов.
Научные исследования современных методов молекулярной генетики, таких
как полимеразная цепная реакция, флуоресцентная гибридизация in situ,
технология микрочипов и сравнительная геномная гибридизация, безусловно,
внесли вклад в быстрое развитие этих двух методик.
Процедуры ПГД и ПГС позволяют провести генетический анализ эмбриона до
его переноса для выявления аномального числа хромосом, дефектов
отдельных генов, мутаций, транслокаций, делеций и вставок нуклеотидных
последовательностей. Эти методики включают извлечение из ооцитов первого
и/или второго полярного тельца, одной или двух клеток из эмбрионов 3-го дня
или приблизительно десяти клеток из трофобласта эмбриона 5-го дня,
проведение генетического анализа и последующий выбор эмбрионов, которые
считаются наиболее подходящими для переноса – например, тех, у которых
отсутствуют определенные генетические заболевания.
ПГД и ПГС дают важные преимущества парам, являющимся носителями
хромосомных транслокаций, и парам с повышенным риском передачи
наследственных генетических заболеваний своим детям. Эти процедуры
потенциально полезны для пациенток старшего возраста и пациенток,
19
имевших неудачные имплантации в прошлом. Однако целесообразность
использования ПГД и ПГС для генетической оценки эмбриона в качестве
рутинных методик остается противоречивой по следующим двум причинам. Вопервых, отсутствуют доказательства того, что проводимый в настоящее время
ПГС увеличивает частоту родов живым плодом у пациенток с повторными
неудачными попытками ЭКО и матерей старшего возраста, проходящих ЭКО.
Во-вторых, метод ПГД имеет определенные технические ограничения, иногда
приводящие к неправильной диагностике (ложноотрицательный или
ложноположительный результат).
19
Для врача перенос эмбрионов является наиболее важной и критической
стадией, определяющей шансы на развитие беременности. Он требует опыта
(приемлемый объем обучения требует как минимум 30 переносов эмбрионов)
и должен выполняться с минимальной травматизацией. Следовательно,
методика переноса эмбрионов с касанием стенки матки не рекомендуется,
поскольку она травмирует эндометрий и вызывает нежелательные сокращения
матки. Использование мягких катетеров дает дополнительное преимущество,
поскольку они менее травматичны. Предпочтительнее проводить перенос под
ультразвуковым контролем, поскольку он позволяет визуализировать полость
матки для правильного определения места размещения эмбрионов (на
расстоянии около 1,5 см от дна матки) – 80% эмбрионов имплантируется там,
куда они были перенесены). Тема трудных переносов будет обсуждена
отдельно на следующих слайдах.
20
20
Рандомизированные исследования и мета-анализ не подтвердили влияния
следующих факторов – промывание канала шейки матки питательными
средами для удаления слизи (Sallam, 2005), нахождение катетера в месте
переноса в течение 30 секунд и рекомендации в отношении длительного
постельного режима после переноса эмбриона (Abou-Setta и соавт., 2009).
Сходным образом еще предстоит доказать, есть ли эффект от использования
малой дозы ацетилсалициловой кислоты (75-81 мг), антибиотиков, стероидов
и фибринового клея (Abou-Setta и соавт., 2005).
21
21
Имитация переноса эмбрионов или пробный переносполезен для получения
информации о том, как будет осуществляться перенос настоящего эмбриона.
Удобным для "тренировки" является момент после выполнения пункции
фолликулов. Катетер для имитации переноса эмбрионов похож на катетер,
используемый для настоящего переноса; его единственное отличие состоит в
том, что он имеет слепой конец (что делает его дешевле катетера,
используемого для настоящего переноса). Катетер вводят в полость матки и
продолжают вводить до тех пор, пока его наконечник не достигнет дна матки.
Глубина матки, на которую следует осуществлять настоящий перенос
эмбриона – от 1 до 1,5 см от дна.
22
22
Тип катетера, используемого для переноса эмбрионов, зависит от того, какие
данные были получены во время пробного переноса. Необходимо еще раз
указать на то, что для успешного исхода лечения стадия переноса эмбриона
является самой критичной. Принципиально важно минимизировать "стресс"
для матки и эндометрия. Некоторые врачи предпочитают, чтобы на поршень
шприца для высвобождения эмбрионов в матку давил эмбриолог,
большинство же спокойно выполняют эту процедуру сами.
Согласно опубликованному Abou-Setta и соавт. в 2005 г. мета-анализу в целом
предпочтение отдается мягким катетерам. В то же время различия
клинических результатов при использовании различных видов мягких
катетеров отсутствуют.
23
23
Здесь представлены три типа катетеров: Буквой А обозначен типичный
катетер для пробного переноса эмбрионов, главной характеристикой которого
является слепой конец. Буквой В обозначен типичный мягкий катетер,
полностью находящийся внутри белого наружного катетера-проводника.
Наружный катетер-проводник можно изогнуть таким образом, чтобы он
соответствовал углу между телом и шейкой матки. В случае если не удается
ввести мягкий катетер в полость матки, может потребоваться использование
стилета (рис. С). При достижении внутреннего зева шейки матки стилет
извлекают и через наружный катетер-проводник вводят внутренний катетер,
содержащий эмбрионы.
24
Существуют различные этапы переноса эмбрионов, которые должны быть
пройдены:
Во-первых, пациентка должна быть идентифицирована медсестрой и
эмбриологом, и должен быть подтвержден медицинский регистрационный
номер.
Должен быть проведен анализ эмбриологических данных, означающий
обобщение результатов процедур (т. е. число оплодотворенных яйцеклеток,
дробление и качество эмбрионов).
После этого следует принятие решения о числе переносимых эмбрионов. В
США многие центры следуют рекомендациям Американского общества
репродуктивной медицины (ASRM). В целом, решение о том, сколько и какие
эмбрионы переносить, принимается после совместного обсуждения с
участием врача, эмбриолога и пациентки.
Окончательным этапом является размещение пациентки в требуемом
положении и подготовка к переносу.
25
На этом слайде обобщены самые последние рекомендации, разработанные
Обществом вспомогательных репродуктивных технологий (SART), касающиеся
рекомендуемого числа переносимых эмбрионов в соответствии со стадией
дробления эмбрионов (например, перенос эмбрионов на 3-й день или наа
стадии бластоцисты на 5-й день), возрастом пациентки и благоприятным или
неблагоприятным прогнозом.
Примером благоприятного прогноза является пациентка 35 лет (впервые
проходящая ЭКО по причине бесплодия, вызванного трубным фактором),
которой проводят перенос эмбрионов 3-го дня и рекомендуется перенос
только двух эмбрионов. Для такой же возрастной группы и такого же переноса
эмбрионов 3-го дня, но с неблагоприятным прогнозом (повторное ЭКО или
эмбрионы посредственного качества) рекомендуется перенос трех эмбрионов.
26
26
Для переноса эмбрионов ноги пациентки помещают на подставки, а кровать
слегка наклоняют вперед (положение Тренделенбурга с небольшим уклоном).
Вводят вагинальное зеркало и, используя питательную среду или стерильную
воду, очищают шейку матки от избытка слизи и клеточных элементов. При
проведении абдоминального ультразвукового исследования для визуализации
верхней трети шейки и всей полости матки помогает ассистент.
27
Эмбрионы переносят в полость матки с помощью небольшого мягкого и
эластичного катетера под ультразвуковым контролем. Оптимальным является
размещение эмбрионов на расстоянии около 1,5 см от дна матки.
Ультразвуковой контроль позволяет визуализировать катетер и затем
определить местоположение пузырьков воздуха в месте высвобождения
эмбрионов.
28
Было показано, что ультразвуковой контроль при переносе эмбрионов снижает
число трудных переносов (9% трудных переносов эмбрионов с
ультразвуковым контролем и 15% с касанием стенки матки) (Sallam HN и
Sadek 2003). В последнем Кокрановском обзоре, опубликованном в 2007 г.
(Brown и соавт.,), представлено подтверждение более высокой частоты
наступления беременности и родов в случае применения ультразвукового
контроля при переносе эмбрионов.
Однако для достижения всеобщего консенсуса по преимуществу переноса
эмбрионов под ультразвуковым контролем необходимы дальнейшие
исследования.
29
29
После завершения переноса эмбрионов эмбриолог должен проверить катетер,
чтобы убедиться, что в нем не осталось ни одного эмбриона.
Если в катетере остался/остались эмбрион(ы), необходимо повторить перенос.
Если при первой попытке был перенесен только один эмбрион из двух,
обычной практикой при втором переносе является размещение оставшегося
эмбриона в 0,5 см от места размещения предыдущего эмбриона.
30
В целом, около 90% всех переносов эмбрионов являются легкими и около 10%
– трудными. Наиболее частыми причинами трудных переносов эмбрионов
являются стеноз цервикального канала (например у пациенток, имевших
хирургические операции на шейке матки, такие как клиновидная биопсия или
криодеструкция); анте- или ретрофлексия матки под острым углом; длинная и
изогнутая шейка и наличие фибромы шейки матки.
Справиться с трудным переносом помогают пробный перенос и
использование ультразвукового контроля. Ультразвуковой контроль помогает
убедиться в том, что катетер прошел внутренний зев шейки матки, и позволяет
провести катетер вдоль шейки матки и эндометрия. В таких случаях для
лучшей визуализации матки необходимо проводить процедуру при
наполненном мочевом пузыре.
31
31
На этом слайде приведены некоторые варианты решений при трудных
переносах, обусловленных анатомическими проблемами шейки матки. При
стенозе шейки матки можно расширить шейку вскоре после пункциии
фолликулов и наложить шов на переднюю губу шейки матки, чтобы
использовать его для оттягивания в день переноса эмбрионов (после
переноса эмбриона нить удаляют).
В случае анте- или ретрофлексии матки под острым углом также стоит
наложить шов на шейку матки; кроме того, важно переносить эмбрионы с
помощью катетера, имеющего некоторую жесткость, чтобы его можно было
предварительно согнуть, придав ему соответствие углу загиба матки. В случае
длинной и изогнутой шейки матки в дополнение к ранее приведенным
приемам важно также иметь длинный полужесткий катетер, чтобы можно было
придать внешнему катетеру-проводнику форму, соответствующую различным
изгибам и поворотам шейки матки.
32
32
Если, несмотря на предыдущую дилатацию, проникнуть через канал шейки
матки невозможно и у пациентки закрыты или отсутствуют обе фаллопиевы
трубы, можно попробовать выполнить перенос трансмиометриальным
доступом. Во время данной процедуры под ультразвуковым контролем иглу
Towako (калибр 18) вводят через задний свод и миометрий до тех пор, пока
она не войдет в полость матки. В этот момент извлекают стилет и катетер с
эмбрионом(ами) вводят через иглу, пока он не войдет в полость матки. Для
обезболивания и снятия дискомфорта достаточно проведения
парацервикальной блокады с 1% раствором лидокаина.
Ревизия канала шейки матки с помощью оперативной гистероскопии
сопровождается последующим более легким переносом эмбрионов (Pabuccu и
соавт., 2005).
Для пациенток с крайне выраженным стенозом цервикального канала перенос
эмбриона в маточную трубу является еще одним вариантом лечения, однако
он требует проведения общей анестезии и лапароскопических навыков для
канюлирования фимбриального конца фаллопиевой трубы с целью внесения
эмбриона в ампулу.
33
33
Обоснованием поддержки лютеиновой фазы ВРТ служит предположение о
том, что в момент забора ооцита из фолликула также удаляется подавляющее
большинство гранулёзных/лютеиновых клеток. В результате выработка
прогестерона становится недостаточной для адекватного созревания
эндометрия, необходимого для успешной имплантации. При поддержке
лютеиновой фазы прогестероном частота наступления беременностей выше,
чем в случае отсутствия поддержки или при использовании только ХГЧ (De
Mouzon J ESHRE, July 2002 abstr.). Обычно поддержку прогестероном
начинают в день пункции фолликулов и, если у пациентки наступает
беременность, продолжают до 10 недель беременности.
Существуют различные лекарственные формы (раствор в масле, гель, свечи,
компрессы) и способы введения (внутримышечные инъекции, вагинально или
перорально). Хотя в большинстве ЭКО-центров США по-прежнему
предпочитают использовать инъекции прогестерона, недавние публикации
(Dal Prato и соавт., 2008; Zarutskie и Phillips, 2009) показали отсутствие
различий в результатах при использовании вагинальной формы. Пероральное
введение прогестерона в циклах ЭКО не рекомендуется.
34
34
В заключение: ключевую роль в успехе ЭКО играет лаборатория.
Существуют различные методы классификации эмбрионов. Наиболее
широко используется оценка качества ооцитов и эмбрионов,
основанная на субъективных морфологических параметрах, которая
недостаточно оптимальна. В будущем оценка эмбрионов должна
основываться на объективных динамических морфометрических
данных, получаемых с помощью методов геномики, протеомики и
метаболомики. Повышению эффективности ЭКО будет способствовать
определение правильного набора генов, белков и метаболитов,
свойственных эмбрионам с высокой частотой имплантации.
35
ПЭ является критическим фактором, влияющим на успех ЭКО. Поскольку он
непосредственно влияет на долю успешных попыток, он должен быть как
можно менее травматичным.
Для выявления и прогнозирования трудностей при переносе эмбрионов важно
проведение пробного переноса; пробный перенос помогает также подобрать
оптимальный для данной пациентки тип катетера.
Во время переноса эмбрионов целесообразно использовать ультразвуковой
контроль, поскольку он обеспечивает визуализацию катетера при его
вхождении в полость матки и позволяет избежать прикосновения ко дну матки
до высвобождения эмбрионов.
Основой успешного исхода при трудных переносах является прогнозирование
трудного ПЭ и адекватная тактика.
36
36
В дополнение следует отметить, что поддержка лютеиновой фазы
прогестероном очень важна для эндометрия и наступления беременности.
Большинство центров США по-прежнему предпочитает внутримышечную
форму (которая эффективна, но вызывает дискомфорт и воспалительную или
аллергическую реакцию на масляный растворитель).
При использовании вагинальной формы результат не отличается (эффект
пресистемного метаболизма в матке, т.е. прогестерон сначала попадает в
матку).
37
38
39
40
41
42