Молекулярная диагностика, готовые решения
advertisement
Готовые решения для лабораторной диагностики молекулярными методами Каширина Мария Молекулярный биолог ЗАО «БиоХимМак» • Исследование фрагментов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) • Основные этапы: В клетке содержатся ДНК, РНК, белки, липиды и т.д. Чем мешает РНК? Служит праймером для ПЦР = неспецифика в реакции амплификации Чем мешает белок? Связывается с ДНК и фермент, проводящий амплификацию, натыкаясь на белок, сваливается = низкий уровень амплификации, побочные продукты меньших размеров Следовательно, все лишнее нужно убрать! РНК расщеплять специальным ферментом – РНКазой Белок – осаждать, расщеплять ферментом, отмывать. Избавление от белка – сложная задача!!! Классический Колоночный Метод метод осаждения метод выделения на магнитных частицах Ручная работа или автомат? За и против…. Метод выделения на магнитных частицах Колоночный метод •Длительность процедуры выделения 20-30 минут •Производительность: 1-12 образцов за 1 цикл +1 положительный контроль •Инсталляционные карты с предустановленными протоколами выделения ДНК и РНК Образцы: Ткани Кровь Слюна Смывы Соскобы Образцы судебной медицины •Все реагенты для проведения выделения раскапаны в картриджи и запечатаны •Открывание картриджа происходит в приборе автоматически, в результате чего резко снижается риск загрязнения реагентов •В наборе содержатся все необходимые расходные пластиковые материалы Можно ли оценить результат? • • • • • • Оценить качество: спектрофотометрически… A260 – поглощение ДНК А280 – поглощение белка А230 – поглощение РНК Соотношения А260/А280 и А260/А230 Хорошее выделение А260/А280 > 1,6 Готовые наборы предполагают что праймеры подобраны за Вас, раскапаны в пробирки, и поставляются в наборе. Достаточно просто раскапать ДНК и запрограммировать амплификатор как написано в методике. Царство детекции… Как не утонуть??? Онкодиагностика Онкогематология Диагностика наследственных болезней и болезней с предрасположенностью HLA-диагностика Пренатальная диагностика Инфекционная диагностика ПЦР-диагностика инфекций с экспрессдетекцией (Vircell) •Быстрые результаты за 1 час •Визуальное бесприборное детектирование •Одновременное обнаружение в образце нескольких патогенов (мультиплексный анализ) Новый набор для диагностики свиного гриппа ПЦР диагностика с детекцией, аналогичной методу ИФА • Результат демонстрирует гомо- или гетерозиготность по определяемой мутации, а не только её наличие; • Возможно одновременное определение нескольких мутаций; • Детектирование происходит аналогично широко распространённой процедуре иммуноферментного анализа, без проведения электрофореза, визуально, или при помощи видеокамеры, или с использованием стандартного микропланшетного спектрофотометра; диагностика муковисцидоза и гемохроматоза диагностики семейных видов рака – молочной железы и яичников предрасположенность к тромбофилии предрасположенности к болезни Альцгеймера и коронарных сосудов предрасположенность к остеопорозу, онкологическим и сердечно-сосудистым заболеваниям индивидуальная чувствительность к варфарину (антикоагулянт орального применения) Микрочиповый анализатор Prodigy -HLA-генотипирование Low и High Resolution -Определение HLA антител -Диагностика маркеров раннего отторжения трансплантата •Один микрочип содержит более 500 олигонуклеотидных проб •Гибридизация и считывание в автоматическом режиме •1 фотография одного биочипа, содержащего ДНК-зонды для всех аллельных вариантов данного локуса •1 измерение, кол-во измерений не зависит от кол-ва аллельных вариантов •и Самая высокопроизводительная адаптированная к открытиям новых HLA-аллелей трансплантации солидных органов трансплантации костного мозга диагностики невынашивания беременности HLA ассоциированных заболеваний Выявления гиперчувствительности к абакавир-содержащим препаратам у ВИЧ инфицированных больных * Определение количества копий транскриптов химерных генов В препарате общей РНК проводится реакция обратной транскрипции, синтезированная кДНК амплифицируется с использованием пары специфических праймеров в присутствии специфичного зонда, меченного красителями FAM и TAMRA. Зонд гибридизуется с ампликоном на каждой стадии отжига ПЦР. Taq-полимераза наращивает праймер, замещая зонд. Отщепление нуклеотидов продолжается, пока редуцированный зонд не диссоциирует из комплекса с ампликоном. В результате флуорофор и ловушка переходят в раствор, их пространственное разобщение приводит к возрастанию флуоресценции FAM (флуорофор). Для аллельной дискриминации используется детекция флуоресценции по конечной точке. Зонды на дикий тип и мутацию мечены разными флуорофорами (VIC и FAM, соответственно), что позволяет выявлять наличие того или другого аллеля единовременно в одной пробирке. Онкогематология
