XXXII Научно-практический семинар ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ СЕГОДНЯ: НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ Москва, 9 декабря 2015 года Биологические основы и возможности выявления устойчивости вируса гепатита С к прямым противовирусным препаратам. Булатова К.В. ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора Референс-центр по мониторингу за вирусными гепатитами Hepatitis C virus (HCV) • Сферическая частица диаметром около 50 нм, покрыта липидной оболочкой + димеры E1-E2 • Геном: оцРНК положительной полярности, 9600 нт, 1 ORF = 10 вирусных белков • 7 известных генотипов и несколько десятков субтипов. В РФ преобладают 1b, 3a, 2. Жизненный цикл HCV 1. Взаимодействие с рецептором 8. Экзоцитоз 2. Экзоцитоз 5. Разрезание полипротеина 7. Сборка 4. Трансляция 3. Высвобождение РНК 6. Репликация NB! В ЖЦ нет ДНК-формы Feeney ER, Chung RT, Antiviral treatment of hepatitis C, BMJ. 2014 Jul 7;348:g3308. doi: 10.1136/bmj.g3308. Review. Процессинг полипротеинового предшественника Feeney ER, Chung RT, Antiviral treatment of hepatitis C, BMJ. 2014 Jul 7;348:g3308. doi: 10.1136/bmj.g3308. Review. Возникновение нуклеотидных замен связано с нормальной работой РНК-полимеразы • Низкая точность и отсутствие редактирующей способности • Два обязательных раунда репликации (+ РНК →-РНК, -РНК→+РНК) для одного генома • 1012 новых вирионов HCV ежедневно продуцируются в гепатоцитах лиц, не получающих лечение • Частота ошибок µ= 10−4 на 1 нт или 1 ошибка на геном • Согласно математическому распределению для РНК вирусов: Вероятность возникновения в ходе цикла репликации WT 1 замена 2 замены 3 замены 91% 8,7% 0,42% 0,013% Число потенциальных мутантов Rong L et al., Rapid emergence of protease inhibitor resistance in hepatitis C virus. Sci Transl Med. 2010 May 5;2(30):30ra32. doi: 10.1126/scitranslmed.3000544. Концепция квазивида применима к HCV • Анализ кДНК-клонов единичного изолята HCV продемонстрировал неоднородность вирусной популяции (до 10% различий). • 25-30% различий в пределах субтипа, 30-35% внутри генотипа • Манфред Эйген описал концепцию квазивида в 1971г. • «Квазивид – группа реплицирующихся с низкой точностью РНК-молекул, различающихся по последовательности, но в то же время сильно схожих». Концепция квазивида применима к HCV Репликация вирусной РНК Мутантный спектр Репликация вирусной РНК Репликация вирусной РНК Концепция квазивида применима к HCV • В ходе репликации вирусного генома появляются измененные варианты вируса • Популяция состоит из исходного вируса и окружающего его «облака» измененных вариантов • Разные по значимости мутации • Возможность быстро приспособиться к изменившимся условиям Элиминация ранее преобладавшего вируса Чувствительный Устойчивый Антивирусная терапия Размножение устойчивого вируса Чего ожидать от квазивида ? • Возникновение мутаций, приводящих к ускользанию вируса от иммунного ответа • Смена клеточного тропизма • Появление вариантов, устойчивых к существующим вакцинам • Появление устойчивости к противовирусным препаратам DAAs - Direct-acting antiviralsПрепараты прямого противовирусного действия • ПППД - высоко эффективные средства лечения • Ингибируют функциональную активность неструктурных белков NS3, NS5A, NS5B HCV • Сокращение курса лечения до 24-12недель • Связаны с развитием устойчивости DAAs - Direct-acting antiviralsПрепараты прямого противовирусного действия Класс препарата Мишень Чувствите льные генотипы Барьер устойчивости Название Симепревир (2013) Паритапревир (2014) Телапревир, Боцепревир (2011) NS3 ингибиторы NS3 1 (и 4) Ближе к среднему Нуклеотидные NS5B ингибиторы NS5B 1-6 Очень высокий Софосбувир (2013) Ненуклеотидные NS5B ингибиторы NS5B 1 Низкий Дасабувир(2014) Очень низкий Ледипасвир, Омбитасвир (2014) Даклатасвир (2015) NS5А ингибиторы NS5A 1, 4-6 Белок NS3 и его ингибиторы Боцепревир Телапревир • NS3 – сериновая протеаза, разрезает полипротеин на белки NS4A, NS4B, NS5A, NS5B. • Необходим кофактор NS4A (прикрепление к мембане, повышение стабильности и каталитической активности) • Ингибиторы, блокирующие ССЦ : -Линейные пептидомиметики, ков.св. (Телапревир, Боцепревир) -Линейные пептидомиметики, неков.св. (Асунапревир, Фалдапревир) -Макролитические пептидомиметики, неков.св. (Симепревир, Ванипревир) Welsch C et al., Peptidomimetic escape mechanisms arise via genetic diversity in the ligand-binding site of the hepatitis C virusNS3/4A serine protease. Gastroenterology. 2012 Mar;142(3):654-63. doi: 10.1053/j.gastro.2011.11.035. Аминокислотные замены, связанные с устойчивостью к ингибиторам NS3(1) NS3 протеаза (180 aa) Боцепревир Телапревир Симепревир Генотип/субтип HCV: 1a – красный, 1b – синий, 2 – коричневый, 3a – зеленый, 4 – оранжевый. Lontok E et al., Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: State of the art summary/ Hepatology. 2015 Nov;62(5):1623-32. doi: 10.1002/hep.27934. Epub 2015 Jul 30. Аминокислотные замены, связанные с устойчивостью к ингибиторам NS3(2) NS3 протеаза (180 aa) Асунапревир Паритапревир Ванипревир Генотип/субтип HCV: 1a – красный, 1b – синий, 2 – коричневый, 3a – зеленый, 4 – оранжевый. Lontok E et al., Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: State of the art summary/ Hepatology. 2015 Nov;62(5):1623-32. doi: 10.1002/hep.27934. Epub 2015 Jul 30. Аминокислотные замены, связанные с устойчивостью к ингибиторам NS3 Телапревир, 1а Телапревир, 1b K Боцепревир, 1а Боцепревир, 1b Фалдапревир Данопревир Ванипревир Симепревир Асунапревир R155K: частота развития резистентности к ингибиторам протеазы зависит от субтипа HCV (1a или 1b) AGG→AAG CGG→CAG→AAG 1a 1b Vermehren, Sarrazin, Best Practice & Research Clin Gast 26 (2012) 487-503 Белок NS5A и его ингибиторы • Низкая консервативность (вариабельней только E2) • NS5A 2 формы: р56 (отвечает за репликацию) и р58 (переключение с репликации на сборку вирусных частиц) • Взаимодействует с клеточными белками: ApoE (липопротеин), Annexin (мембранный сортинг), липидкиназа, PI4KIIIα • 3 домена Ингибиторы: Механизм действия ингибиторов не совсем ясен (РНК-св.? Димеры?) • Несимметричные (BSM-824, IRBM-521) • Палиндромные (Даклатасвир, Ледипасвир, Омбитасвир) Аминокислотные замены, связанные с устойчивостью к ингибиторам NS5А NS5A 1ый домен (213 aa) Даклатасвир Ледипасвир Омбитасвир Генотип/субтип HCV: 1a – красный, 1b – синий, 2 – коричневый, 3a – зеленый, 4 – оранжевый. Lontok E et al., Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: State of the art summary/ Hepatology. 2015 Nov;62(5):1623-32. doi: 10.1002/hep.27934. Epub 2015 Jul 30. Белок NS5B и его ингибиторы • Классическая структура «правой руки» • Консервативный активный центр в «ладони», подпись GDD (правильная ориентация 2 Mg++) • Синтез + и – РНК цепей, низкая точность, нет редактирующей способности 2 класса ингибиторов • Нуклеотидные (Софосбувир) «Ошибочный субстрат»-блок АЦ и обрыв цепи, очень высокий барьер и широкий спектр действия. • Ненуклеотидные (Дасабувир) связывают один из менее консервативных регионов и препятствуют конформационным изменениям фермента в ходе каталитического акта. Pingzu Jiao,a Weiwei Xue,b Yulin Shen,c Nengzhi Jinc and Huanxiang Liu*ad Show Affiliations Understanding the drug resistance mechanism of hepatitis C virus NS5B to PF-00868554 due to mutations of the 423 site: a computational study Mol. BioSyst., 2014,10, 767-777 Аминокислотные замены, связанные с устойчивостью к ингибиторам NS5В • S282T найдена у пациента с HCV 2g., у которого наблюдался вирусологический прорыв через 4 недели после окончания курса лечения софосбувиром • Несколько пациентов с HCV 3g в. течение клин.испытаний софосбувира L159F, V321A NS5B Полимераза (591 a.о.) – Нуклеотидные ингибиторы Софосбувир 591 ак NS5B Полимераза (591 a.о.) – Ненуклеотидные ингибиторы Дасабувир 591 ак Генотип/субтип HCV: 1a – красный, 1b – синий, 2 – коричневый, 3a – зеленый, 4 – оранжевый. Lontok E et al., Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: State of the art summary/ Hepatology. 2015 Nov;62(5):1623-32. doi: 10.1002/hep.27934. Epub 2015 Jul 30. Некоторые аминокислотные замены – естественные полиморфизмы, встречающиеся в вирусной популяции • Жизнеспособность мутантных форм сравнима с WT • Мутантный вирус способен запустить инфекционный процесс в новом организме • Замены присутствуют в белках-мишенях ПППД: NS3, NS5A, NS5B • Выявляются у пациентов с ХГС, ранее не получавших ПППД. • Их определение крайне важно для начала терапии ПППД. Естественные полиморфизмы, встречающиеся в NS3 HCV 1a sub. Welsch C1, Zeuzem S. Clinical relevance of HCV antiviral drug resistance. Curr Opin Virol. 2012 Oct;2(5):651-5. doi: 10.1016/j.coviro.2012.08.008. Epub 2012 Sep 21. • Устойчивость к симепревиру в NS3 Q80K среди пациентов с HCV 1a в 18.5% случаев + 11% дополнительные замены V36L и V55A (Beloukas A. et al., Clinical Microbiology and Infection, 11.2015) • Устойчивость к ингибиторам NS3. HCV 1a = 0.7% V36M, 0.7% V36L, 6.85% T54S, 3.42% V55A, 13.7% Q80K (Samantha J. Shepherd et al., Journal of Clinical Virology, 02.2015) • Устойчивость к ингибиторам в NS5A Q30H, Y93N среди пациентов с HCV 1a в 5.4% случаев + Y93N в 2.8% случаев с HCV 3a (Lindström I. et al., Infectious Diseases, 08.2015) • Устойчивость к ингибиторам в NS5A. HCV 1a = M28T, Y93H 13.5%. HCV 1b = Y93H 3.7% (Peres-da-Silva A. et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 03.2015) Мутации устойчивости к препаратам ППД в NS3, NS5Aрегионах HCV у наивных пациентов в Москве A156S 4% R30Q L28T 7% 4% wt 96% NS3 N=27, 1b HCV Y93H 7% wt 82% NS5A Методы обнаружения устойчивости • Генотипирование: обнаружение мутации устойчивости в геноме вируса при помощи секвенирования • Фенотипирование: определение in vitro подавляющей концентрации (IC) противовирусного препарата и влияния на это определенных мутаций (по сравнению с IC50 WT) • Виртуальное фенотипирование: моделирование фенотипа исследуемого штамма на основании анализа генотипа при сравнении со штаммами со сходным профилем мутаций и известным фенотипом Способы выявления генотипической резистентности Метод Чувствительность (минимальная доля мутантной популяции, которая может быть обнаружена) Особенности Прямое секвенирование 20% Выявляет как известные, так и новые мутации ≥ 10% Выявляет как известные, так и новые мутации; трудоемкий <1% Выявляет как известные, так и новые мутации; высокая стоимость Клонированиесеквенирование NGS «АмплиСенс HCV-Resist-seq» 1 • ПЦР-амплификация кДНК NS3, NS5A и NS5B регионов генома HCV • Прямое секвенирование продукта амплификации 2 3 • Анализ электрофореграммы при помощи программного обеспечения «ДЕОНА» • Интерпретация результатов 4 Заключение • РНК-зависимая-РНК полимераза вируса гепатита С (белок NS5B) обладает низкой точностью и не имеет редактирующей способности • Вирус существует в организме в виде гетерогенной популяции – квазивида • Среди различных вариантов вируса присутствуют устойчивые к действию лекарственных препаратов • ПППД – высоко эффективные средства лечения, однако в ряде случаев вирусы могут быть устойчивы к их действию • Получены подробные карты аминокислотных замен в NS белках, связанных с развитием устойчивости к ПППД • Замены, приводящие к резистентности, могут присутствовать в геноме исходного варианта вируса до начала терапии • Своевременное выявление мутаций и полиморфизмов крайне важно для выбора стратегии или корректировки терапии с использованием ПППД • Прямое секвенирование – доступный и эффективный метод выявления замен, приводящих к лекарственной устойчивости Благодарю за внимание Дополнительный слайд Дополнительный слайд Номер позиции и аминокислота «дикого» типа < 10% пациентов не достигших УВО ≥ 10% пациентов не достигших УВО Генотип/субтип HCV: 1a – красный, 1b – синий, 2 – коричневый, 3a – зеленый, 4 – оранжевый. Lontok E. et al. Hepatology. 2015, Jun 10 Аминокислотные замены, связанные с устойчивостью к ингибиторам NS3 NS3 протеаза (180 aa) Боцепревир Телапревир Симепревир Асунапревир Паритапревир Lontok E et al., Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: State of the art summary/ Hepatology. 2015 Nov;62(5):1623-32. doi: 10.1002/hep.27934. Epub 2015 Jul 30.