RNA
advertisement
Молекулярная биология Лекция 3. Структура и функции РНК. Скоблов Михаил Юрьевич Часть 1. Общие характеристики транскриптома Гипотеза мира РНК Joyce GF. The antiquity of RNA-based evolution. Nature. 2002 Jul 11;418(6894):214-21. Гипотеза мира РНК • В химическом синтезе, и в биохимических реакциях рибонуклеотиды предшествуют дезоксирибонуклеотидам. • В самых древних, универсальных процессах жизненного метаболизма широко представлены именно рибонуклеотиды, а не дезоксирибонуклеотиды, включая основные энергетические носители типа рибонуклеозидполифосфатов (АТФ и т.п.). • Репликация РНК может происходить без какого бы то ни было участия ДНК, а механизм редупликации ДНК даже в современном живом мире требует обязательного участия РНК-затравки в инициации синтеза цепи ДНК. • Обладая всеми теми же матричными и генетическими функциями, что и ДНК, РНК способна также к выполнению ряда функций, присущих белкам, включая катализ химических реакций. • Биосинтез белка почти целиком осуществляется с помощью различных видов РНК. Состав РНК в клетке Клетка млекопитающего содержит около 20-30 пикограмм РНК, что составляет около 1% массы клетки. Тотальная РНК Рибосомальная РНК Около 80% Транспортная РНК Около 15% мРНК Около 4% Основные понятия • Транскрипт — молекула РНК, образующаяся в результате транскрипции участка ДНК. • Транскрипто́м — совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой или группой клеток, включая мРНК и некодирующие РНК. • Транскриптомика изучает динамику транскриптома структуру и Транскрибирующаяся часть генома 3 May 2002 Vol 296 Science • по разным оценкам транскрибируется от 50% до 80% геномной ДНК • из которой 2% транслируется в белки • оставшиеся 98% являются не-кодирующими РНК (ncRNAs) Геном «любит» экспрессироваться • Промоторы расположены повсеместно, с большинства из них экспрeссируются некодирующие РНК, функции которых большей частью неизучены. • Наблюдение: в опухолях экспрессируется много некодирующих РНК, а также опухоль-специфичных изоформ известных генов. • Общая эпигенетическая «разболтанность» опухолевой клетки высока Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях Если взять любую ткань, то мы увидим, что половина генов человека вообще в ней не экспрессируется, а другая половина имеет следующее распределение по уровням экспрессии Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях разными наборами генов Исследования проекта FANTOM5 выявили 7523 генов домашнего хозяйства (house-keeping). Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях разными наборами генов и разными вариантами генов Альтернативный сплайниг альфа-тропомиозина. Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях разными наборами генов и разными вариантами генов Тканеспецифичная экспрессиия альфатропомиозина Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях разными наборами генов и разными вариантами генов на разных уровнях Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях разными наборами генов и разными вариантами генов на разных уровнях Транскриптом «ПолиА+» РНК «ПолиА-» РНК Транскрипты генов имеют разное время жизни в клетке Было исследовано время полужизни для 21,248 mRNA дрожжей Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Geisberg JV, Moqtaderi Z, Fan X, Ozsolak F, Struhl K. Cell. 2014 Feb 13;156(4):812-24. Транскриптом Белок-кодирующие РНК • К 2007 году из 7000 генов у дрожжей была известна функция только для 1000 генов. • У человека известна функция примерно для половины генов • Каждый год примерно для 100 генов открывают функцию Белок-некодирующие РНК • A non-coding RNA (ncRNA) is a functional RNA molecule that is not translated into a protein Заниматься исследованиями белокнекодирующих РНК – модно! Возраст транскриптома Белок-кодирующие РНК Возраст ДНК 3.5 миллиарда лет Белок-некодирующие РНК Из 14’682 белок-некодирующих РНК человека: • 81% - примато-специфичные lncRNA • 19% - произошли более 90 миллионов лет назад • 3% (425) - произошли более чем 300 миллионов лет назад Транскриптом Белок-кодирующие РНК Белок-некодирующие РНК Условное разделение Длинные: • • • • long ncRNA pseudogenes antisense …. Короткие: • • • • miRNA rasiRNA piRNA …. House-keeping: • • • • rRNAs snRNAs tRNAs …. Кодирует или не кодирует? – вот в чём вопрос! Экспериментатор получает нуклеотидную последовательность РНК …. Экспериментальная проверка Долгий путь, время и финансово затратный…. Биоинформатический анализ Два основных критерия: 1. 2. Кодирующая рамка более 300 нуклеотидов Консервативность аминокислотной последовательности Реализация кодирующего потенциала РНК • Корреляция между уровнями экспрессии белка и мРНК в клеточной линии VCaP достигает 0.61 – лучший результат на сегодня. • Существуют сотни мРНК у которых нет белка, и наоборот! • Цель проекта Протеом инвентаризация всех белков человека и выяснение взаимодействий между ними. • Российская часть проекта – определение протеома 18-й хромосомы человека. • Из 300 белок кодирующих генов с помощью масспектрометрических подходов идентифицировано 80% белков. neXtProt • В базе данных зарегистрировано 15’126 белков, чьё существование доказано экспериментально. • Всего «ожидается» 20’119 белков, изоформ (за счет сплайсинга) - 38’391. Часть 2. Описание и функции коротких некодирующих РНК Транскриптом Белок-кодирующие РНК Длинные: • • • • long ncRNA pseudogenes antisense …. Белок-некодирующие РНК Короткие: • • • • miRNA rasiRNA piRNA …. House-keeping: • • • • rRNAs snRNAs tRNAs …. Короткие белок-некодирующие РНК • • • • miRNA rasiRNA piRNA …. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 Andrew Z. Fire & Craig C. Mello "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" Nature 382, 713 - 716 (22 August 1996); Repression of gene expression in the embryonic germ lineage of C. elegans Geraldine Seydoux*†, Craig C. Mello‡§, Jonathan Pettitt§ , William B. Wood , James R. Priess‡ & Andrew Fire* THE distinction between soma and germline was recognized more than a century ago: somatic cells form the body of an organism, whereas germ cells serve to produce future generations1. In Caenorhabditis elegans, the separation of soma and germline occurs through a series of asymmetrical divisions, in which embryonic germline blastomeres divide unequally to produce one somatic daughter and one germline daughter2. Here we show that after each asymmetrical division, embryonically transcribed RNAs are detected in somatic, but not germline, blastomeres. This asymmetry depends on the activity of the germline-specific factor, PIE-1. In the absence of PIE-1, embryonically transcribed RNAs are detected in both somatic and germline blastomeres. Furthermore, ectopic expression of PIE-1 in somatic blastomeres can significantly reduce the accumulation of new transcripts in these cells. Taken together, these results suggest that germ-cell fate depends on an inhibitory mechanism that blocks new gene expression in the early embryonic germ lineage. RNA-интерференция – это подавление экспрессии генов у эукариот (замалчивание генов) на посттранскрипционном уровне, индуцированное короткими интерферирующими RNA (siRNA) Механизм RNA-интерференции RNA-интерференцию обнаружили у большинства эукариотических организмов в частности у простейших кишечнополостных насекомых грибов растений млекопитающих Биологическая роль RNA-интерференции Репрессия чужеродных последовательностей - ДНК- и RNA-содержащих вирусов - мобильных элементов Подобие иммунной системы на уровне последовательностей нуклеиновых кислот Молекулярные механизмы RNA-интерференции siRNA - двуцепочечные - 21-25 п. н. - 5’-фосфатный конец - 3’-гидроксильный конец - 2 неспаренных нуклеотида на 3’-конце микроРНК Оказалось, что некоторые гены могут сворачиваться в шпильки, тем самым образуя протяжённые двуцепочечные РНК, которые могут «нарезаться» в микроРНК схожим путём. Транскрипция miRNA miRNA экспрессируются в виде: отдельных генов - 60% в составе кластеров - 15% в интронах - 25% • Время полужизни miRNA в среднем более 24 часа, а для некоторых составляет до 220 часов. • Такая высокая стабильность является причиной высокой эффективности действия микроРНК miRNA и siRNA Регуляция экспрессии генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях происходит с помощью малых RNA • разрезание матричной RNA полная комплементарность к РНК • репрессия трансляции частичная комплементарность к РНК • ремоделирование хроматина комплементарность к ДНК Регуляция экспрессии генов с помощью miRNA CLASH method - Crosslinking, Ligation, and Sequencing of Hybrids Используя иммунопреципитацию за белок AGO1 были выявлены 18’514 miRNA-RNA взаимодействий в клеточной линии HEK293. Регуляция экспрессии генов с помощью miRNA Luo et al. BMC Medical Genomics 2012 5:3 RNA-интерференция “Эндогенные” последовательности Транспозоны Вирусы dsRNA siRNA Трансгены Гены, интроны + miRNA Метилирование (ДНК/гистоны) Репрессия трансляции Разрезание mRNA Замалчивание транспозонов Ремоделирование хроматина DNA-интерференция • Механизм РНК-интерференции осуществляется за счет очень консервативного семейства белков Argonaute (Ago) • Белки семейства Argonaute есть даже у прокариот, но механизма RNAинтерференции нет. • Оказалось, что у одной эубуктерии Thermus thermophilus белок TtAgo реализует механизм DNA-интерференции, аналогичным образом. • Затравкой для него являются 5’-фосфорилированные ДНК олигонуклеотиды длинной 13-25 нуклеотидов. • Считается, что бактерия тем самым защищается от чужеродной ДНК. Защита от ДНК Защита от РНК Регуляция экспрессии DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Swarts DC, Jore MM, Westra ER, Zhu Y, Janssen JH, Snijders AP, Wang Y, Patel DJ, Berenguer J, Brouns SJ, van der Oost J. Nature. 2014 Mar 13;507(7491):258-61. The microRNA (miRNA)-virus vaccine strategy Экзосомы Экзосомы и миРНК Норма – клеточное общение, взаимодействие…. Патология – инвазия опухолеспецифичного набора миРНК 2006 Нобелевская премия по Физиологии и Медицине за “их открытие РНК интерференции – генного замалчивания с помощью двухцепочечной РНК” Andrew Z. Fire Craig C. Mello На сегодняшний день по данным базы данных miRBase у человека описано 1100 miRNA (Release 14.0). • Одна miRNA может изменять экспрессию нескольких сотен mRNA (mRNA degradation) • Одна miRNA может блокировать трансляцию нескольких сотен mRNA (translation suppression) • Одна miRNA может регулировать белковый синтез нескольких тысяч генов (напрямую + опосредованно) Предсказание взаимодейств ия миРНК с мРНК Регуляция экспрессии за счет miRNA • Если одна miRNA может регулировать экспрессию сотен РНК, то экспрессия этих РНК оказывается связанной • ceRNA – competitive endogenous RNA – конкурентные эндогенные РНК piРНК • Piwi-interacting RNA (piRNA) – самый большой класс малых РНК, экспрессируемых в клетках животных. У мыши известно более 50’000 уникальных последовательностей piРНК, у Drosophila более 13’000. • Названы так потому что образуют комплексы с белками Piwi. • piРНК — одноцепочечные молекулы длиной в 24–30 нуклеотидов, закодированные в центромерных и теломерных областях хромосомы. • Последовательности многих из них комплементарны известным мобильным генетическим элементам (в основном транспозонам), однако есть множество других piРНК, совпадающих с участками рабочих генов или с фрагментами генома, функции которых неизвестны. • Обычно U на 5’ конце, 5’ монофосфат и 3’ O-метильная группа. • Значительное число идентифицированных piРНК имеет А в 10й позиции. piРНК • У млекопитающих встречаются только в мужских половых клетках, около 1млн. копий на клетку. • У беспозвоночных и в женских, и в мужских половых клетках. Визуализация piРНК– содержащих комплексов на хромосомах Drosophila piРНК • Главная функция piРНК — подавление активности мигрирующих генетических элементов. • piРНК активны только во время эмбриогенеза, когда непредсказуемые перетасовки генома особенно опасны и могут привести к гибели зародыша • Один из предполагаемых механизмов биогенеза –”Ping Pong” (не у всех объектов объектов): • Первичные piРНК узнают комплементарные им мишени (транскрипты с транспозонов и других повторов) и их комплекс привлекает белки Piwi. • Piwi расщепляет мишень в позиции 10 н. от 5’ конца первичной piРНК, образуется вторичная piРНК, которая включается в Piwi. rasiРНК Repeat associated small interfering RNA • Одноцепочечные короткие РНК - 24- 29 нук. • Выявлены у Drosophila и некоторых одноклеточных эукариот. У млекопитающих до сих пор не обнаружены. • Предполагается участие в формировании клеток зародышевого пути. • Предполагаемый предшественник – дцРНК, образующаяся в результате транскрипции с обеих цепей повторяющихся элементов генома. • Биогенез не требует участия Dicer, но требует белка Ago3 (Argonaute, Piwi и Piwi- подобный белок Aub (от Aubergine – мутация у Drosophila), у растений нет Piwi белков, но есть rasiРНК, образующиеся с участием Dcl-белков. • Мутации белков Piwi, ассоциированных с rasiРНК у Drosophila, приводят к стерильности и отсутствию формирования клеток зародышевого пути у особей обоего пола. Малые ядерные РНК ‐ мяРНК (snRNA) • • • • • • • Локализованы в ядре Размер от 90 до 300 нуклеотидов На 5’ конце имеют КЭП Участвуют в сплайсинге пре-мРНК Расщепляют полицистронные мРНК Поддерживают редупликацию теломер Регулируют транскрипцию. Часть 3. Описание и функции длинных некодирующих РНК Транскриптом Белок-кодирующие РНК Белок-некодирующие РНК Условное разделение Длинные: • • • • long ncRNA pseudogenes antisense …. Короткие: • • • • miRNA rasiRNA piRNA …. House-keeping: • • • • rRNAs snRNAs tRNAs …. The GENCODE Project ENCyclopedia of genes and gene variants ENCyclopedia Of DNA Elements long noncoding RNAs - lincRNA • Было найдено и проаннотировано 9277 генов экспрессирующих 14’880 длинных некодирующих транскриптов • Критерии lincRNA: • Транскрипт не должен содержать ORF • Длинна транскрипта должна быть более 200 н.п. Картирование lincRNA Genic lncRNA Intergenic lncRNA Характеристики lincRNA Анализ размеров транскриптов Анализ альтернативных изоформ Характеристики lincRNA Анализ повторов среди lncRNA и mRNA экзоны Консервативность lincRNA Многие lncRNA являются примато-специфичными Селективное давление на lncRNA человека слабее, чем на белоккодирующие гены Экспрессия lincRNA Экспрессия lincRNA • 21% lncRNA не были обнаружены ни в одной ткани • 11% lncRNA были обнаружены только в одной ткани Большинство белок-кодирующих генов (65%) были обнаружены во всех тканях по сравнению с 11% lncRNA Локализация lincRNA Во всех клеточных линиях, за исключением NHEK (Keratinocytes) наблюдалось обогащение lncRNA в ядре, по сравнению с белоккодирующими мРНК Трансляция lincRNA • Для клеточных линий K562 и GMI2878 были сделаны RNAseq и масспектропетрия MS/MS • Для lncRNA в 13 раз меньше находятся пептиды чем для mRNA • Для 9640 lncRNA было показано, что 92% lncRNA не транслируется в белок • Для 69 lncRNA было найдено 85 уникальных пептидов – неправильная аннотация как lncRNA Long noncoding RNAs are rarely translated in two human cell lines. Bánfai B, Jia H, Khatun J, Wood E, Risk B, Gundling WE Jr, Kundaje A, Gunawardena HP, Yu Y, Xie L, Krajewski K, Strahl BD, Chen X, Bickel P, Giddings MC, Brown JB, Lipovich L. Genome Res. 2012 Sep;22(9):1646-57. Трансляция lincRNA • В статье проводился анализ данных экспериментов по рибосомному профайлингу. • Авторы показали, что рибосома связывается с lincRNA также хорошо, как и с мРНК. • Пробуя применять различные подходы, авторы разработали формулу позволяющую различить РНК способную транслироваться (мРНК) от неспособной (lincRNA). • Она учитывает количество рибосом в кодирующей части относительно 3’UTR, уровни экспрессии данных участков, а так же частоту замен в кодонах. Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins. Mitchell Guttman, Pamela Russell, Nicholas T. Ingolia, Jonathan S. Weissman, Eric S. Lander. Cell. Vol. 154, Issue 1, 240-251, 27 June 2013 Время жизни транскриптов в клетке Для 800 некодирующих РНК и 12’000 кодирующих мРНК мыши были определены времена полужизни. Genome-wide analysis of long noncoding RNA stability. Clark MB, Johnston RL, Inostroza-Ponta M, Fox AH, Fortini E, Moscato P, Dinger ME, Mattick JS. Genome Res. 2012 May; 22(5):885-98. Результаты 1 контрольной Герои Елизарова Анна Власёнок М Конина Д Пинигин Константин Потапов Анатолий 3113 3113 3112 3113 3111 9 8 8 8 8 Приз лекторской симпатии Пикунов Андрей 3114 7 Слабое звено Бальков А Ворошилова Вика Иджилова Курилович Анна Тураев Ческидова Е.И. Бурдакова Ольга Ивченко Дмитрий Пашкова Мария 3111 3114 3114 3112 3112 3111 3113 3111 3 3 3 3 3 3 2 2 2 Часть 4. Примеры реализации функции длинных некодирующих РНК Некодирующая XIST РНК Тельце Барра — свёрнутая в пло́ тную структуру неактивная X-хромосома, наблюдаемая в интерфазных ядрах соматических клеток самок плацентарных млекопитающих, включая человека. Некодирующая XIST РНК • XIST (X-inactive specific transcript) ген экспрессирующий некодирующую РНК с Ххромосомы плацентарных млекопитающих, которая участвует в инактивации Ххромосомы. • XIST РНК – транскрипт длинной около 17 kb (у человека), экспрессирующийся только с неактивной хромосомы. • XIST РНК процессируется как и любая обыкновенная мРНК. • TSIX РНК – некодирующая РНК, длинной около 37 Kb. • Транскрипт TSIX является антисмысловым к транскрипту гена XIST, и является негативным регулятором гена XIST. • X-хромосомы, не экспрессирующие TSIX и имеющие поэтому повышенный уровень экспрессии XIST, инактивированы намного чаще, чем обычные хромосомы Некодирующая XIST РНК • Гены XIST и TSIX находятся в X хромосоме локуса XIC (X inactivation centre) • Встраивание этого района в ЛЮБУЮ хромосому ведет к её сайленсингу • Транскрипт гена XIST покрывает неактивную Х хромосому Xi, что в конечном счете приводит к ее инактивации • В яйцеклетках и их предшественников обе Х активны • На стадии 4 клеток пришедшая от отца X инактивируется • Все клетки экстраэмбриональных тканей (амнион, плацента и т.п.) сохраняют этот импринт и содержат инактивированную отцовскую X, что обусловлено импринтингом локуса XIST Процессированные псевдогены Виды Количество генов Количество процессированных псевдогенов Arabidopsis 33583 4260 Caenorhabditis elegans 21187 2445 Drosophila melanogaster 22372 2208 Danio rerio 34291 16357 Gallus gallus 22720 5539 Canis lupus familiaris 24953 12852 Rattus norvegicus 42743 13962 Mus musculus 58433 19119 Pan troglodytes 32989 16785 13 12 10 48 24 52 33 33 51 Homo sapiens 42000 17609 42 % ? функциональность • Образованы десятью процентами кодирующих генов • Около 80% примато-специфичные • До 20% псевдогенов человека транскрипционно активно Псевдогены и miRNA “PTEN is a functionally haploinsufficient tumour suppressor gene”. • В нормальных образцах и рака простаты найдена прямая корреляция экспрессии между PTEN и PTENP1 • Локус PTENP1 селективно теряется при раке • 3’ UTR PTENP1 проявляет активность опухолевого супрессора miR-17 miR-21 miR-214 miR-19 miR-26 Псевдогены и miRNA Позитивная регуляция генов за счет посредника miRNA Псевдогены и miRNA sponge RNA • lincRNA-RoR (Regulator of Reprogramming) - 2.6kb, 4 экзона • Последовательности РНК linc-RoR и транскрипционных факторов Oct4, Sox2 и Nanog имеют общие сайты посадки с miRNA • Таким образом linc-RoR способна предотвращать эти ТФ от miRNAопосредованной супрессии в самообновляющихся ESC человека. • linc-RoR, miRNAs, and коровые ТФ образуют регуляторную схему состоящую из авторегуляторных и двух негативных цепей с обратной связью для регулирования поддержания и дифференциации ESC Endogenous miRNA sponge lincRNA-RoR regulates Oct4, Nanog, and Sox2 in human embryonic stem cell self-renewal. Wang Y, Xu Z, Jiang J, Xu C, Kang J, Xiao L, Wu M, Xiong J, Guo X, Liu H. Dev Cell. 2013 Apr 15;25(1):69-80. sponge RNA Вопрос Является ли функция lncRNA в качестве губки для miRNA уникальной характеристикой lncRNA? Присущей только lncRNA, а не mRNA? Кольцевые РНК – circular RNA Кольцевые РНК – circular RNA • В локусе гена CDR1 была обнаружена кольцевая антисмысловая некодирующая РНК. • Показано, что miR-671 расщепляет эту кольцевую РНК, что приводит также к уменьшению уровня мРНК гена CDR1 • Авторы справедливо замечают, что это их работа является первой по исследованию некодирующего антисмыслового транскрипта как мишени для miRNA, что определяет новый механизм позитивной регуляции между смысловой мРНК и антисмыслово кольцевой РНК Кольцевые РНК – circular RNA • Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency (Германия) • Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges (Дания) 21 March 2013 Volume 495 Было найдено: • 1’950 circRNA у человека • 1'903 circRNA у мыши • 724 circRNA у C.elegans А где были кольцевые РНК раньше? Кольцевые РНК – circular RNA РНК CDR1as человека содержит 74 сайта для miR-7, 63 из которых консервативны miR-7 Кольцевые РНК – circular RNA ciRS-7 - circular RNA sponge for miR-7 Но это только одна охарактеризованная РНК, остальные ждут своего часа… Вопрос Может ли кольцевая РНК содержать в себе открытую рамку считывания? Что тогда? Кольцевые РНК – circular RNA • Эукариотическая рибосома может осуществить трансляцию белка с кольцевой РНК при наличии IRES элемента в её последовательности • В результате получается длинный повторяющийся полипептид содержащий протяжённые открытые рамки считывания Initiation of protein synthesis by the eukaryotic translational apparatus on circular RNAs. Chen CY1, Sarnow P. Science. 1995 Apr 21; 268(5209):415-7. Некодирующая sno-lncRNA РНК • • • • snoRNA – small nucleolar RNA малые ядрышковые РНК – семейство консервативных ядерных РНК, длинной от 70 до 200 нуклеотидов Обычно локализуются в тельцах Кахаля (Cajal bodies) или в ядрышках Участвуют в модификациях (метилировании и псевдоуридилировании) рибосомных РНК, а также тРНК и малых ядерных РНК. Известно около нескольких сотен snoRNA, основная доля которых закодирована в интронах белок-кодирующих генов. У большинства больных синдромом Прадера-Вилли делетирован импринтированный локус q11-q13 отцовской хромосомы 15 • Среди неполиаденилированных РНК были найдены длинные некодирующие РНК (от 1200 до 2900 нуклеотидов) содержащие в себе последовательности snoRNA Long noncoding RNAs with snoRNA ends. Yin QF, Yang L, Zhang Y, Xiang JF, Wu YW, Carmichael GG, Chen LL. Mol Cell. 2012 Oct 26;48(2):219-30. Некодирующая sno-lncRNA РНК После сплайсинга SNORD116 интрон, содержащий последовательности snoRNA, подвергается дальнейшему процессингу Каждая sno- lncRNA содержит множество сайтов связывания Fox2, регулятора альтернативного сплайсинга. Long noncoding RNAs with snoRNA ends. Yin QF, Yang L, Zhang Y, Xiang JF, Wu YW, Carmichael GG, Chen LL. Mol Cell. 2012 Oct 26;48(2):219-30. Некодирующая MALAT1 РНК • MALAT1 известна также под другим названием NEAT2 (nuclearenriched abundant transcript 2) • MALAT1 является lncRNA длинной более 8000 нуклеотидов. • В геноме человека находится в районе q13 хромосомы 11, имеющему отношение к онкогенезу и метастазированию. • В первые была обнаружена в 2003 году как РНК, ассоциированная с раком лёгких • MALAT1 является высоко консервативной среди млекопитающих и широко экспрессируется в нормальных тканях человека и мыши • Позже было найдено, что MALAT1 оверэкспрессирована при раке легкого, груда, толстой кишки, печени. • Оверэкспрессия MALAT1 в различных клеточных линиях приводила к увеличению клеточной пролиферации, а в «голых мышах» увеличенный уровень MALAT1 приводил к образованию опухоли. Некодирующая MALAT1 РНК Уникальный 3’ концевой процессинг 3' end processing of a long nuclear-retained noncoding RNA yields a tRNA-like cytoplasmic RNA. Wilusz JE, Freier SM, Spector DL. Cell. 2008 Nov 28;135(5):919-32. Некодирующая MALAT1 РНК • В нормальных клетках MALAT1 ассоциирована с SR белками факторов сплайсинга в интерхроматиновых гранулах (nuclear speckles) и в нуклеоплазме, регулируя привлечение pre-mRNA, и тем самым регулируя альтернативный сплайсинг. • При нокдауне MALAT1, увеличивается клеточный уровень SR белков причем преимущественно в дефосфорилированной форме, что приводит к изменениям альтернативного сплайсинга pre-mRNA. • В случае SAT1 pre-mRNA, нокдаун MALAT1 приводит к включению альтернативного экзона содержащего слабый сайт сплайсинга. The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Tripathi V, Ellis JD, Shen Z, Song DY, Pan Q, Watt AT, Freier SM, Bennett CF, Sharma A, Bubulya PA, Blencowe BJ, Prasanth SG, Prasanth KV. Mol Cell. 2010 Sep 24;39(6):925-38. Некодирующая NEAT1 РНК • An Architectural Role for a Nuclear Noncoding RNA:NEAT1RNA Is Essential for the Structure of Paraspeckles (США), Molecular Cell 2009 • MENε/β noncoding RNAs are essential for structural integrity of nuclear paraspeckles (Япония), PNAS 2009 Обе изоформы локализованы в ядре Некодирующая NEAT1 РНК • «Paraspeckle» - пара-гранулы – названы так из-за их распределения в ядре; "para" – сокращение от параллельный, а "speckle" – как указание на схожесть с «splicing speckles» (интерхроматиновым гранулам) к которым они очень близки • Функция их до сих пор неизвестна. • Известно что они могут участвовать в контроле экспрессии генов через сохранение в ядре РНК содержащих двуцепочечные участки подвергнувшиеся аденозин-инозин редактированию. Некодирующая NEAT1 РНК • Методами включения и выключения экспрессии NEAT1 РНК, было показано что она отвечает за сборку пара-гранул • Критичным является 3’-район 23Kb изоформы, с которым происходит взаимодействие DBHS белков. • Интересно что формирование пара-гранул происходит рядом с местом транскрипции NEAT1 РНК. • Помимо NEAT1 РНК у мышей в пара-гранулах есть ещё и Ctn кодирующая РНК (cationic amino acid transporter 2), которая в отличии от NEAT1 транспортируется сперва в цитоплазму, а оттуда после аденозин-инозин редактирования возвращается в пара-гранулы. Некодирующая RMST РНК • Авторы нашли lincRNA и назвали её как RMST (rhabdomyosarcoma 2-associated transcript). • RMST экспрессируется специфично в мозге, и регулируется транскрипционным репрессоров REST, увеличивая экспрессию в течении нейрональной дифференциации. • Было показано, что RMST взаимодействует с транскрипционным фактором SOX2, основного нейронального регулятора, тем самым изменяя сайт связывания SOX2, он становится более вырожденным. • В присутствии RMST SOX2 связывается с 5668 промоторами, в отсутствии с 2483. • Анализ показал, что это взаимодействие необходимо для связывания SOX2 с промоторами последующих нейрогенных транскрипционных факторов. The Long Noncoding RNA RMST Interacts with SOX2 to Regulate Neurogenesis. Shi-Yan Ng, Gireesh K. Bogu, Boon Seng Soh, Lawrence W. Stanton. Molecular Cell, Volume 51, Issue 3, 8 August 2013, Pages 349–359. Некодирующая Y РНК • Работа была сделана на бактерии Deinococcus radiodurans, в которой был известен белок Ro (ортолог белка Rsr), принимающий участие в созревании рибосомальной РНК и её распаде при различных стрессовых условиях. • Было показано, что в этих процессах также принимает участие некодирующая РНК, длинной 100 нуклеотидов, имеющая несколько больших петель и длинный участок с которым связывается белок Ro. • В этой работе установили, что Y РНК связывает экзорибонуклеазу и белок Ro, тем самым формируя активный рибонуклеопротеиновый комплекс, способный селективно деградировать РНК со вторичной структурой. An RNA Degradation Machine Sculpted by Ro Autoantigen and Noncoding RNA Xinguo Chen, David W. Taylor, Casey C. Fowler, Jorge E. Galan, Hong-Wei Wang, and Sandra L. Wolin. Cell 153, 166–177, March 28, 2013 Резюме • Длинные некодирующие РНК – регуляторные РНК, способные принимать участие в большом спектре различных регуляторных механизмов на разных уровнях. • Но значит ли это что кодирующие РНК – мРНК не способны к проявлять такие же свойства? Кодирующий потенциал молекулы РНК это лишь одна из известных и очевидных нам функций, имеет ли она еще какие-то – это вопрос… • Из десятка тысяч lincRNA пока известна информация для меньше сотни функционально исследованных lincRNA. • Поэтому сейчас интересно исследовать регуляторные свойства РНК, механизмы по которым они осуществляются, в не зависимости от их белоккодирующего потенциала. Анализ генетических заболеваний Транскриптом Белок-кодирующие РНК Мутация в гене Замена в белке Объяснение патогенеза Белок-некодирующие РНК Мутация в гене ? Функция вторичной структуры РНК Структурная Транспортная Рибосомальная РНК тРНК Ферментативная Регуляторная Рибозимы Разные РНК Потенциал вторичной структуры РНК Более чем для 3000 транскриптов определены элементы вторичной структуры, что составляет около 50% всех генов Saccharomyces cerevisiae. Потенциал вторичной структуры РНК Метод основан на модификации РНК диметил сульфатом, в результате чего модифицируются неспаренные аденин и цитозин Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Rouskin S, Zubradt M, Washietl S, Kellis M, Weissman JS. Nature. 2014 Jan 30;505(7485):701-5.
