Биотехнология
реклама
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Казахский агротехнический университет имени С.Сейфуллина А.К.БУЛАШЕВ УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС по дисциплине «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИИ В ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЕ И ЖИВОТНОВОДСТВЕ» для специальности 6N 0701 - Биотехнология АСТАНА, 2011 Рассмотрен и одобрен на заседании Методического совета Казахского агротехнического университета им.С.Сейфуллина Протокол №___ «___» _____________ 20___ года «УТВЕРЖДАЮ» Председатель Методического совета Казахского агротехнического университета им.С.Сейфуллина Первый вице-президент ________________ А.М.Абдыров «___» ______________20___ года Учебно-методический комплекс предназначен для проведения занятий по дисциплине «Современные проблемы биотехнологии в ветеринарной медицине и животноводстве» для магистрантов по специальности 6N 0701 – Биотехнология Разработчик УМК: Булашев Айтбай Кабыкешович, профессор кафедры морфологии, микробиологии и биотехнологии Казахского агротехнического университета им.С.Сейфуллина Рецензенты: доктор биологических наук, профессор Газизова А.И. доктор биологических наук, доцент Кухар Е.В. В учебно-методическом комплексе для проведения занятий по дисциплине «Современные проблемы биотехнологии в ветеринарной медицине и животноводстве» (для магистрантов по специальности 6N 0701 – Биотехнология) излагаются программа дисциплины, материалы лекций, описание лабораторно-практических занятий и вопросы для контроля знаний магистрантов. Учебно-методический комплекс составлен согласно требованиям кредитной технологии обучения. Казахский агротехнический университет им.С.Сейфуллина 2 СОДЕРЖАНИЕ I .ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ (СИЛЛАБУС)...................................4-12 II. ГЛОССАРИЙ…………………………………………………………...12-15 III. МАТЕРИАЛЫ ЛЕКЦИЙ Лекция №1: Биотехнология: история, состояние и перспективы……………………………………………….15-26 Лекция №2: Молекулярная диагностике в медицине и ветеринарии………………………………………….……26-35 Лекция №3: Совершенствование ИФА для диагностики болезней животных …………………………………….35-47 Лекция №4: Биотехнология вакцин … …………………………………47-65 Лекция №5: Биотехнология производства биопрепаратов и лекарственных веществ……………………………………65-76 Лекция №6: Микроманипуляция с эмбрионами животных..…………76-84 Лекция №7: Оплодотворение вне организма………………………..…..84-93 Лекция №8: Проблемы генетической инженерии в создании трансгенных животных…………………………….…….93-110 Лекция №9: Биотехнология кормовых препаратов…………………110-120 Лекция №10: Биотехнология и биобезопасность…………………...120-126 IV. ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ: Занятие №1: Приготовление реагентов, используемых в постановке ИФА…………………………………….….126-138 Занятие №2: Полимеразно-цепная реакция……………………………138-147 Занятие №3: Трансплантация эмбрионов………………………… …. 147-151 Занятие №4: Определение нуклеотидной последовательности образцов ДНК с помощью анализатора CEQ™ 8000……………………………………………….…151-155 V. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ………………………..…156-158 3 I.ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ (СИЛЛАБУС) ДИСЦИПЛИНА: СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИИ В ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЕ И ЖИВОТНОВОДСТВЕ 1 Данные о преподавателе: Булашев Айтбай Кабыкешович, д.в.н., профессор Занятия: ауд.0311 и лаборатория НИИ биотехнологии в соответствии с утвержденным расписанием; тел. 38-39-01, 38-36-57 2 Данные о дисциплине: Название: Современные проблемы биотехнологии в ветеринарной медицине и животноводстве Код SBVMZh 5304 Семестр – 2 Количество кредитов – 1 Количество часов – 75 Аудиторных – 15 СРМП – 30 СРМ – 30 Распределение учебного времени по семестрам Наименование Лекционные СРМП СРМ Итого 1 1 2 2 2 1 2 2 3 1 2 2 4 1 2 2 5 1 2 2 6 1 2 2 2 семестр Всего Дни недели 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 15 2 2 2 2 2 2 2 2 2 30 2 2 2 2 2 2 2 2 2 30 75 3 Пререквизиты: Иммунология человека и животных; Молекулярногенетические основы биотехнологии; Микробиологические основы биотехнологических производств; Основы селекции и биотехнологии разведения животных; 4 Постреквизиты: Современные методы в биотехнологии; Современные методы диагностики и профилактики зооантропонозных болезней; Ветеринарно-санитарная экспертиза и безопасность продукции животноводства; Биотехнология размножения сельскохозяйственных и декоративных животных; Технологические процессы получения вторичных метаболитов микроорганизмов. 4 5 Краткое описание дисциплины «Современные проблемы биотехнологии в ветеринарной медицине и животноводстве» является одной из элективных дисциплин учебного плана специальности 6N0701 «Биотехнология». Знания по данной дисциплине необходимы для правильного понимания места и роли биотехнологии в разработке: высокочувствительных и специфичных методов диагностики инфекционных и инвазионных болезней; лекарственных средств и вакцинных препаратов, получаемых на основе рекомбинантных микроорганизмов; тест-систем для экспресс-обнаружения возбудителей особо опасных инфекционных болезней в биологических материалах или образцах, взятых из окружающей среды; методов повышения продуктивности и качественного состава продуктов животноводства; стратегии использования трансгенных животных - продуцентов биологически активных веществ; производства кормовых белков, пробиотиков, витаминов, антибиотиков и др. метаболитов микроорганизмов методов контроля за производством и потреблением продуктов биотехнологии 5.1 Цель преподавания дисциплины: Целью дисциплины является изучение актуальных вопросов ветеринарной медицины и животноводства, определение современных проблем, при решении которых могут быть использованы методы и подходы традиционной и современной биотехнологии. 5.2 Задачи изучения дисциплины: дать магистранту основополагающие знания, практические навыки в области клеточной и генной инженерии, предусматривающие создания (разработки): а) диагностикумов нового поколения, позволяющие поднять эффективность борьбы с особо опасными инфекционными и инвазионными болезнями, наносящими большой экономический и социальный ущерб Республике Казахстан; б) высокоэффективных лекарственных препаратов и вакцин; в) природных и рекомбинантных микроорганизмов – продуцентов биологически активных веществ для нужд ветеринарии и животноводства; д) высокопродуктивных линии и пород скота или животных с отдельными полезными свойствами; е) мероприятий по биологической безопасности при производстве продуктов биотехнологии. В результате изучения данного курса магистрант должен знать: новейшие достижения мировой науки, а также ученых Казахского агротехнического университета им.С.Сейфуллина по 5 совершенствованию методов диагностики, лечения и профилактики инфекционных и инвазионных болезней, наносящих экономический и социальный ущерб стране; современные подходы в создании штаммов прокариотных и эукариотных микроорганизмов, а также млекопитающих – продуцентов биологически активных веществ; состояние, проблемы и тенденции развития клеточной и генной инженерии в сфере ветеринарной медицины и животноводства вопросы, связанные с биобезопасностью в современной биотехнологии Магистрант должен уметь: использовать современное лабораторное оборудование; проводить исследования по диагностике инфекционных и инвазионных болезней с использованием различных вариантов иммуноферментного анализа и полимеразно-цепной реакции; использовать достижения клеточной и генной инженерии в совершенствовании методов диагностики болезней, получении лечебных препаратов и вакцин, а также повышении продуктивности и устойчивости животных; самостоятельно определять актуальные задачи современной биотехнологии и разрабатывать заявки для участия в конкурсе научных проектов в области ветеринарной медицины и животноводства. 6 Содержание дисциплины «Современные проблемы биотехнологии в ветеринарной медицине и животноводстве» 6.1 Календарно-тематический план лекционных занятий № по р. 1 2 Тема лекций Биотехнология: история, состояние и перспективы Молекулярная диагностика в медицине и ветеринарии Содержание лекций Определение биотехнологии Этапы развития биотехнологии. Задачи генной и клеточной инженерии в сфере медицины, ветеринарии и животноводства Иммуноферментный анализ. Гибридизационные зонды. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) в разработке методов диагностики инфекционных болезней. 6 Колво часов Недел я проведения 1 1 1 2 Форма контроля Устный опрос, наличие конспекта Устный опрос, наличие конспекта 3 4 5 6 7 Использование и Совершен- моноклональных ствование ИФА в антиидиотипических антител в ИФА в диагностике разработке экспресс-тестов болезней диагностики инфекционных животных и инвазионных болезней животных. Итоги НИР сотрудников КазАТУ по совершенствованию методов диагностики бруцеллеза, туберкулеза, лейкоза, ящура, эхинококкоза и др. болезней на основе иммунобиотехнологии Вацины: рекомбинантные бактериальные; «субъединичные»; синтетические пептидные; Биотехнология антиидиотипические, ДНК-; вакцин «векторные»; «съедобные». Бактерий как системы доставки антигенов. Бычий соматотропин. Антибиотики. Биотехнология Моноклональные антитела производства биопрепаратов и как лекарственные средства и как средство адресной лекарственных доставки лекарственных веществ веществ. Производство антител с помощью кишечной палочки. Получение однояйцевых близнецов. Химерные Микроманипуляц животные. Клонирование ия с эмбрионами животных. Гомозиготные диплоидные потомки. домашних Трансплантация эмбрионов. животных Получение однополых эмбрионов. Созревание яйцеклеток вне Оплодотворение организма. Оплодоворение in vito. Культивирование in вне организма vito эмбрионов с.х. животных. 7 2 2 2 2 1 3-4 Устный опрос, наличие конспекта 5-6 Устный опрос, наличие конспекта 7-8 Устный опрос, наличие конспекта 9-10 Устный опрос, наличие конспекта 11 Устный опрос, наличие конспекта 8 9 10 Проблемы генной инженерии в создании трансгенных животных Биотехнология кормовых препаратов Биотехнология и биобезопасность Улучшение качества или состава продуктов животноводства с помощью генетической инженерии. Селекция животных по устойчивости к заболеваниям. Стратегия использования трансгенных животных в качестве биореакторов. Кормовые дрожжи, белковые концентраты из бактерий, кормовые белки из водорослей, белки микроскопических грибов, пробиотики, аминокислоты, витамины и др. Критерий, показатели и методы оценки генетически модифицированных организмов (ГМО) и получаемых из них продуктов на биобезопасность; стандартизация в биотехнологии; Государственное регулирование генноинженерной деятельности и контроль за биобезопасностью получения и использования ГМО. 12-13 Устный опрос, наличие конспекта 1 14 Устный опрос, наличие конспекта 1 15 2 Устный опрос, наличие конспекта 7 Календарно-тематический план лабораторно-практических занятий, проводимых во время СРМП № по р. 1. Тема практических занятий Приготовление реагентов, используемых в постановке ИФА Содержания работы Ферменты, применяемые в ИФА, приготовление конъюгата, получение IgG кролика против IgG быка, приготовление буферов, ИФА с применением ферментной метки через комплекс авидин-биотин, гистохимический метод ИФА. 8 Колво часов 16 Неделья проведения 1-4 Форма контроля Устный опрос, наличие конспекта 2. 3. 4. Ознакомление с оборудованием и помещениями, используемыми при постановке ПЦР. Постановка ПЦР. Трансплантаци Подготовка и осеменение коров-доноров; извлечение я эмбрионов и оценка биологической полноценности эмбрионов; пересадка и криоконсервация эмбрионов. Проведение циклического Определение секвенирования с нуклеотидной использованием красителей последовательн терминаторов WellRed на ости образцов ДНК с помощью CE8000. анализатора CEQ™ 8000 Полимеразноцепная реакция (ПЦР) 5-8 Устный опрос, наличие конспекта 12 9-11 Устный опрос, наличие конспекта 16 12-15 Устный опрос, наличие конспекта 16 8 График выполнения и сдачи заданий СРМ № Объпор ем Название темы . часов 1 Культивирование 2 микроорганизмов для производства биопрепаратов 2 Биотехнология лечебно3 диагностических и вирусных препаратов. 3. Биотехнология производства и 3 контроль качества вакцин 4 5 6 7 Микробиологическая трансформация органических соединений Гетерогибридомы и инженерия антител. Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих препаратов Биотехнологический контроль воспроизводства сельскохозяйственных животных 9 Литература Форма контроля Неделя сдачи Баллы 6,7,8 Опрос, Конспект СРМ 1 1,4 6 Опрос, Конспект СРМ 2-3 2,3 6 2 1 3 2,4,8 6 3 Опрос, Конспект СРМ Опрос, Конспект СРМ 2,3 4-5 6 1,4 Опрос, Конспект СРМ 7-8 2,3 8 Опрос, Конспект СРМ 9-11 4,5 11 Опрос, Конспект СРМ 12 2,3 8 9 10 Создание партеногенетических животных Ферменты и липиды микроорганизмов в кормлении животных Биоконверсия органических отходов Итого 3 9 Опрос, Конспект СРМ 3 10, 11 Опрос, Конспект СРМ 14 2,3 8,11 Опрос, Конспект СРМ 15 1,4 2 30 13 2,3 22,5 9 Список литературы 1. Алмагамбетов К.Х. Биотехнология микроорганизмов.- Астана: Изд-во ЕНУ им. Гумилева, 2008.- 244 с. 2. Алмагамбетов К.Х. Медицинская биотехнология. – Астана: Изд-во ЕНУ им. Гумилева, 2009.- 236 с. 3. Булашев А.К. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза. Акмола: Изд-во Акмолинского аграрного университета, 1995.-214 с. 4. Булашев А.К. курс лекций по дисциплине «Современная биотехнология» (электронное учебное пособие).- Астана, 2002 5. Булашев А.К. Иммуноферментный анализ в диагностике бруцеллеза и туберкулеза. Астана: Изд-во Казахского аграрного университета им.С.Сейфулина, 2003.- 52 с. 6. Булашев А.К., Кухарь Е.В. Ветеринарная биотехнология.- Астана: Изд-во КазАТУ им.С.Сейфуллина, 2009.- 222 с. 7. Васильев Д.А. и соавт. (Электронный ресурс).- Лекций по курсу:Биотехнология.- Ульяновск, 2005.-188 с. 8. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002.-583 с. 9. Завертяев Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Л.: Агропромиздат, Ленинградское отделение, 1989.-255 с. 10.Основы биотехнологии /Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина.- М:Издательсктй центр «Академия», 2003.-208 с. 11.Сельскохозяйственная биотехнология /В.С.Шевелуха, Е.А.Калашникова, Е.С.Воронин и др.; Под ред. В.С.Шевелухи – 2е изд., перераб. И доп.- М:Высш.шк., 2003.-469 с. 10 Информация по оценке знаний Текущий контроль – посещение и работа на лекционных занятиях, выполнение лабораторных и семинарских работ, выполнение заданий СРМ. 10 Промежуточный контроль – проводится в форме тестовых заданий, защиты рефератов, письменных работ и др. Проводится два раза в семестр. Итоговый контроль – экзамен по дисциплине (тесты и билеты) 11 Политика выставления оценок Виды занятий и работ магистрантов I Текущий контроль: Лекций Практические занятия (СРМП) СРМ (выполнение заданий) II III 1 2 3 Количество баллов min/max Итого Промежуточный контроль: В семестре два контроля по 10 баллов за каждый Итого Итоговый контроль: Экзамен Всего 3/7,5 (0,5х15 нед.=7,5) 7,5/15 (1х15 нед.=15) 11,5/22,5 (1,5х15 нед.=22,5) 22/45 10/20 (10х2=20) 32/65 18/35 50/100 баллов Схема оценки знаний магистрантов в баллах на экзамене Экзаменационная оценка Оценка в баллах (в%) 3 (удовлетворительно) 18/23 4 (хорошо) 24/29 5 (отлично) 30/35 Окончательная оценка знаний студента (сумма баллов по текущему, промежуточному и итоговому контролю) выставляется в соответствии с кредитной технологией на основании данных, приведенных ниже. Оценка по буквенной системе А Шкала оценки знаний студентов Цифровой Процентное Оценка по эквивалент содержание традиционной баллов баллов системе 4,0 95-100 отлично 11 АВ+ В ВС+ С СD+ D F 3,67 3,33 3,0 2,67 2,33 2,0 1,67 1,33 1,0 0 90-94 85-89 80-84 75-79 70-74 65-69 60-64 55-59 50-54 0-49 отлично хорошо удовлетворительно неудовлетворительно II. ГЛОССАРИЙ Антигены – вещества белковой или полисахаридной природы, несущие признаки генетической чужеродной информации, спосбные вызвать в организме формирование иммунных белков – антител и тем самым меняющие иммунологическую реактивность организма. Антисмысловая РНК – РНК-последовательность, комплементарная какому-то участку или всей молекуле специфической мРНК. Антитело – белок (иммуноглобулин), синтезируемый Влимфоцитами в ответ на попадание в организм различных антигенов и специфически с ними взаимодействующий Аффинность антител – мера прочности связывания активных зон антител с реакционноспособными группами антигена Белки теплового шока – белки, синтезируемые в ответ на резкое повышение температуры Биореактор – устройство, в котором протекают биохимические реакции при участии живых микроорганизмов, клеточных экстрактов или ферментов. Векторы – общее название, применяемое к молекуле ДНК, полученной из плазмиды или бактериовага, в которую могут быть вставлены или клонированы фрагменты ДНК; они содержат один или более уникальных сайтов рестрикции для встройки чужеродной ДНК и быть способным к автономной репликации в определенном хозяине, промежуточном организме таким образом, чтобы репродуцировалас клонированная последовательность Векторы ретровирусные – генные конструкции на основе РНКсодержащих вирусов; часто используются в генной терапии ex vivo для введения ДНК в пролифирующие клетки человека. Гаплоидный – термин, характеризующий организм (клетку), у которого имеется один набор хромосом. Гаптен – чужеродное или измененное вещество самого организма, которое вступает в реакцию специфического взаимодействия с 12 гомологичными антителами, но само по себе не способно индуцировать синтез антител вследствие отсутствия носителя. Гемагглютинация реакция (РГА) – реакция для обнаружения антигенов, искусственно связанных с мембраной эритроцитов. Гликозилирование – ковалентное присоединение сахарного остатка к белковой молекуле. ДНК-полимераза Taq – термостабильная ДНК-полимераза (сохраняет активность при 95С) бактерии Termus aqvaficus . Часто применяется в методе ПЦР. Идиотип – набор антигенных детерминант (идиотипов) вариабельного домена антител, образуемых одним клоном Влимфоцитов, или молекулы рецептора Т-лимфоцитов. Иммобилизация – физический или химический процесс, используемый для фиксации ферментов, клеток или клеточных органелл на твердом носителе Контрансфекция – введение в одну эукариотическую клетку двух разных молекул ДНК. С-конец – конец полипептидной цепи, содержащий аминокислоту со свободной карбоксильной группой (НО-С=О). N-конец – конец полипептидной цепи со свободной амино группой (первая аминокислота или несколько аминокислот в белковой молекуле); с него всегда начинается синтез полипептида в процессе трансляции Кэп – метилированный гуанозин на 5-конце многих мРНК эукариот. Линеаризация ДНК– преобразование кольцевой молекулы ДНК в линейную после единичного двухцепочного разрыва, например, в результате гидролиза плазмидной ДНК рестриктазами. Липополисахарид – сложный углеводосодержащий биополимер, макромолекулярное соединение, входящее в состав наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Липосома – искусственный мембранный пузырек, имеющий двойной сферический фосфолипидный слой. Молекулы (ДНК, лекарственных веществ и др.) могут проникать внутрь или связываться с поверхностью пузырка, а затем путем слияния липосомы с клеточной мембраной поступать в клетку. Маркерный ген – ген с известной хромосомной локализацией, имеющий четкое фенотипическое проявление (устойчивость к антибиотику, ферментативная активность и т.д.) Медиаторы иммунного ответа – факторы обеспечивающие локализацию клеток иммунной системы вблизи чужеродной субстанции и усиливающие или подавляющие функциональную активность клеток (Например, факторы активирующие или угнетающие макрофаги и лимфоциты, стимулирующий рост колонии и др.). Мейоз – два последовательных делений клетки, которым предшествуют лишь один цикл репликации хромосом, в результате 13 которых исходное число хромосом 2n уменьшается до 1n в каждой из четырех образовавшихся клеток. Эти клетки созревают и превращаются в гаметы (сперматозоиды или яйцеклетки). Метилирование – присоединение к макромолекуле метильной группы. Например, при метилировании ДНК происходит присоединение такой группы к специфическим остаткам цитозина, а иногда аденина. Полиаденилирование – ферментативное присоединение остатков аденина к 3-концу молекулы эукариотической мРНК. Этот богатый аденином 3-конец называется poly(A) –хвостом. Праймер – короткий олигонуклеотид, который гибридизуется с матрицей и служит затравкой при ее копировании. Пролиферация – размножение клеток – увеличение числа клеток, происходящее путем митотических делений. Промотор – участок ДНК, ответственный за связывание РНКполимеразы, инициирующей транскрипцию Протективные антигены – антигены микробов, индуцирующие при введении в организм развитие эффективного приобретенного иммунитета к микробу, к которому принадлежит этот антиген. Рекомбинантная ДНК – молекула ДНК, полученная объединением in vitro разнородных, вместе нигде в природе не существующих, фрагментов ДНК. Сайт рестрикции – нуклеотидная последовательность в молекуле ДНК, узнаваемая рестриктазой. Скрининг – метод или комплекс методов, позволяющий идентифицировать единичный объект исследований путем перебора большого числа объектов – особь в популяции, отдельную клетку с искомыми веществами, участок нуклеотидной последовательности и т.п. Тотипотентность – способность эмбриональных клеток давать начало целому организму. Транскрипция – матричный синтез информационной РНК, программируемой комплементарной нитью ДНК. Трансляция – заключительный этап реализации генетической информациисинтез полипептидных цепей рибосомами с использованием в качестве матрицы мРНК путем перевода на 20буквенный код (по числу аминокислот) Трансфекция – искусственное введение в эукариотические клетки изолированных молекул ДНК Фолдинг белков – процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру Фолликулы – сферическое образование в яичниках, в центре которых находится яйцеклетка, окруженная эпителиальными клетками и оболочкой. Одновременно с развитием яйцеклетки и ростом самого фолликула он синтезирует эстрогены. Экспрессия гена – реализация генетической информации, закодированной в дНК путем ее ее транскрибирования в иРНК. 14 Электрофорез – физический метод разделения белков (или других полимеров) в электрическом поле по их молекулярной массе и элетрическому заряду при определенной рНю Эмбриональные стволовые клетки – культуры тотипотентных клеток бластоцисты или первичных половых клеток ранних постимплантационных зародышей Эпитоп, антигенная детерминанта – группа аминокислотных остатков белкового антигена (или участок полисахаридной цепи), образующих на его поверхности участок, способный вступать во взаимодействия с комплементарным ему участком (активным центром) соответствующего антитела. III. МАТЕРИАЛЫ ЛЕКЦИЙ Лекция №1 Биотехнология: история, состояние и перспективы Со второй половины ХХ века научный прогресс получает стремительное развитие. За этот период были созданы две технологии, коренным образом изменившие мир, в котором мы живем. Это - ядерная технология и электроника. За последние три десятилетия в нашу жизнь входит новая третья технология – современная биотехнология, основанная на открытиях в области микробиологии, иммунологии, биофизики, молекулярной биологии, генетики, биоорганической химии, а также таких наук как физика, химия и технология. Корни биотехнологии уходят в далёкое прошлое и связаны с хлебопечением, виноделием и другими способами приготовления пищи, известными человеку еще в древности. Например, такой биотехнологический процесс, как брожение с участием микроорганизмов, был известен и широко применялся еще в древнем Вавилоне, о чем свидетельствует описание приготовления пива, дошедшее до нас в виде записи на дощечке, обнаруженной в 1981 г. при раскопках Вавилона. Историю становления биотехнологии условно подразделяют на пять основных периодов: 1. Допастеровский период (до 1865 г.). В этот период биотехнологическими методами получали пиво, вино, сыр, хлеб, йогурт, кефир, разного рода ферментированную пищу; 2. Пастеровский период (1865—1940 гг.). Стали известны микроорганизмы-продуценты, и это позволило создать производства этанола, бутанола, ацетона, глицерина, лимонной кислоты, многих вакцин, организовать процессы биологической очистки стоков аэробными микроорганизмами; 3. Период антибиотиков (1940—1960 гг.). Были открыты пенициллин, стрептомицин и многие другие антибиотики, разработана технология культивирования клеток животных и получение вирусных вакцин, технология биотрансформации стероидных гормонов; 15 4. Период управляемого биосинтеза (1960—1975 гг.). Созданы технологии получения аминокислот, микробиологического белка на парафинах нефти, а также ферментов, используемых в стиральных порошках; внедрены в производство методы иммобилизации ферментов (закрепления их на носителях) для получения глюкозо-фруктозных сиропов; разработана технология анаэробной обработки твердых отходов с получением биогаза; открыт микробиологический способ получения полисахаридов (начиная от ксантана для увеличения вязкости раствора нефтяных скважин до жевательной резинки); начато использование микроорганизмов для получения витаминов В3 и B12, а также микопротеина — мицелиального микроскопического гриба, используемого как заменитель мяса; ученые научились культивировать изолированные растительные клетки, что положило начало биотехнологическому производству многих ценных лекарственных веществ с использованием огромного потенциала лекарственных растений; создана основа биометаллургии — бактериального выщелачивания меди и цинка из руд; и др.; 5. Период современной биотехнологии (после 1975г.). Характеризуется разработкой генной инженерии, что позволило разработать микробиологическую технологию производства человеческого инсулина, интерферона, соматотропного и ростовых гормонов и многого другого; создана гибридомная технология производства моноклональных антител – мощного «инструмента» в разработке огромного разнообразия диагностических препаратов; появились, так называемые «трансгенные» растения и животные, в которых осуществлялось целенаправленное конструирование генома; и др. По мере развития биотехнологии появлялись различные определения самого термина. Причем, до сегодняшнего дня нет четкого, всеобъемлющего определения науки «биотехнология». Наиболее удачным, на наш взгляд, является определение академика В.С.Шевелухи (2003). Он рассматривает биотехнологию, как науку, в двух временных и сущностных измерениях: современном и традиционном, т.е. классическом. Новейшая биотехнология, по определению академика, это наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных (модифицированных) растений, животных и микроорганизмов в целях интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения. В традиционном, классическом смысле биотехнологию он определяет как науку о методах и технологиях производства, транспортировки, хранения и переработки сельскохозяйственной и другой продукции с использованием обычных, нетрансгенных (природных и селекционных) растений, животных и микроорганизмов, в естественных и искусственных условиях. Тем не менее, и эти определения не в полной мере отражают сущность как новейшей, так и классической биотехнологии. Во-первых, целью 16 новейшей биотехнологии, в первую очередь, является достижение доступности для потребителей уже известных продуктов, а не «получение новых видов продуктов». Во-вторых, продуцентами полезных продуктов могут быть не только «растения, животные и микроорганизмы», но и изолированные растительные и животные клетки. Например, «мощное оружие» иммунологов – моноклональные антитела, синтезируются штаммами плазмоцитомы мыши, крысы и др. млекопитающих, получаемых методами клеточной инженерии. Судя по определению акад. В.С.Шевелухи, традиционной или классической биотехнологии можно отнести получение не только полезных метаболитов микроорганизмов, но и производство любой продукции животноводства или растениеводства. Ни один из вышеназванных периодов развития биотехнологии не имеет никакого отношения к технологиям производства молока, зерновых культур и др. сельскохозяйственных продуктов, за исключением ее современного периода. Однако, в данном случае речь идет об использовании продуктов трансгенных животных и растений. В литературе немало примеров, когда отдельные разработки в сфере растениеводства и животноводства представляются как биотехнологические. С этой точки зрения заслуживает внимание определение биотехнологии как целенаправленное получение ценных продуктов, в процессе которого используется биохимическая деятельность микроорганизмов, изолированных клеток или их компонентов (Д.А.Васильев и соавт., 2005). Обосновывая это определение авторы пишут, что получение пшеницы из воды и удобрений на первый взгляд — биотехнология. Однако здесь используется биохимическая деятельность не изолированных клеток, а целого растения, макроорганизма, относящегося к высшим, многоклеточным организмам. Это, как справедливо подчеркивают авторы, — не биотехнология, а растениеводство. Точно так же получение лекарства из корня женьшеня — не биотехнология. А вот когда из этого корня берут отдельные клетки, отделяя их с помощью ферментов от многоклеточной растительной ткани, и разводят эти отдельные, изолированные клетки на специальном питательном растворе, как дрожжи, получая биомассу изолированных клеток женьшеня, из которой путем настаивания можно получить столь же ценное лекарство, как из целого корня, — это уже биотехнология. Другой пример — производство молока. Молоко получают от коровы, овцы или другого млекопитающего животного, т. е. это — работа макроорганизма. Значит, это не биотехнология. А вот получение из молока кефира, йогурта или другого кисломолочного продукта основано на биохимической деятельности молочнокислых бактерий — это вполне легитимная биотехнология. В производстве глюкозы из крахмала есть процесс гидролиза: раствор крахмала подкисляют, нагревают до определенной температуры и выдерживают некоторое время. В результате крахмал распадается на глюкозу, получается гидролизат — 17 грязноватый раствор глюкозы с примесями. Это — химический, а не биотехнологический процесс. Есть другой процесс — процесс ферментативного гидролиза крахмала. В этом случае к суспензии крахмала добавляют фермент, и под его действием также происходит расщепление крахмала до глюкозы, но в гораздо более мягких условиях и без образования нежелательных примесей, с меньшими потерями. Ферменты — это выделенные из клетки белковые вещества, компоненты клетки. Следовательно, по определению, этот процесс — биотехнология. Во всех приведенных примерах в качестве основания для отнесения процесса к биотехнологии или к химической технологии мы рассматривали то, посредством каких воздействий осуществляется обработка продукта. Иногда обращают внимание на другое: какое сырье обрабатывается — химическое или биологическое. Например, очень часто производство мясных продуктов относят к биотехнологии, обосновывая это тем, что исходное сырье — туши забитых животных, сырое мясо и так далее — являются продуктами биологического происхождения. С этой точки зрения, например, приготовление котлет — это биотехнология, хотя рабочий процесс заключается в измельчении мяса и затем в его тепловой обработке, т. е. нет биохимической деятельности микроорганизмов или клеток, а значит, это не биотехнология. А вот обработка мясного фарша определенными заквасками и последующий режим созревания, используемый при приготовлении дорогих сортов колбас, — это, конечно, биотехнология. Д.А.Васильев и соавт. (2005) также обращает внимание еще на одно важное слово в своем определении биотехнологии — «целенаправленно». Действительно, с точки зрения человека микроорганизмы работают в природе не всегда целенаправленно. Например, многие болезни вызываются действием микроорганизмов, и наоборот, многие микроорганизмы, населяющие человеческое тело, полезны. Вспомните, что после лечения антибиотиками, когда эти полезные микроорганизмы уничтожаются наряду с вредными, возникает такое заболевание, как дисбактериоз, которое приходится лечить введением в организм бактерий (например, бифидобактерий или молочнокислых бактерий). Это не биотехнология, а медицина. Существует биогеохимическая деятельность бактерий, в результате чего происходит переработка растительности и деревьев в торф, уголь, нефть, выщелачивание металлов и многие другие глобальные процессы. Эти процессы нельзя называть биотехнологическими, потому что они нецеленаправленные. Или, например, можно заметить, как после загрязнения почвы нефтью происходит естественное (не организованное человеком, т. е. не целенаправленное) биовосстановление — через 5-10 лет под воздействием микроорганизмов почва самоочищается. А вот когда мы специально организовываем технологию очищения почвы, вводя в нее дополнительные микроорганизмы или усиливая питание 18 естественных почвенных микроорганизмов, — это уже биотехнология, биотехнология очистки почвы от загрязнений. В лекциях Д.А.Васильев и соавт. (2005) дано общее определение биотехнологии, без разделения ее на традиционную (классическую) и современную. Но оно справедливо лишь для биотехнологии прокариотных и эукариотных клеток, и не учитывает производство полезных веществ трансгенными макроорганизмами. Причем, не всегда ценные продукты образуются в результате «биохимической деятельности» клеток. Например, белки и гормоны, синтезируемые клетками, в том числе модифицированными, не относятся к продуктам их ферментативной активности. Обобщая вышеизложенное, биотехнологию следует определить как науку об использовании природных и модифицированных прокариотных и эукариотных клеток, а также трансгенных растений и животных для производства ценных продуктов. Генная и клеточная инженерия - являются важнейшими методами (инструментами), лежащими в основе современной биотехнологии. Методы клеточной инженерии направлены на конструирование клеток нового типа. Они могут быть использованы для воссоздания жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток, для объединения целых клеток, принадлежавших различным видам с образованием клетки, несущей генетический материал обеих исходных клеток, и других операций. Генно-инженерные методы направлены на конструирование новых, не существующих в природе сочетаний генов. В результате применения генно-инженерных методов можно получать рекомбинантные (модифицированные) молекулы РНК и ДНК, для чего производится выделение отдельных генов (кодирующих нужный продукт), из клеток какого-либо организма. После проведения определенных манипуляций с этими генами осуществляется их введение в другие организмы (бактерии, дрожжи и млекопитающие), которые, получив новый ген (гены), будут способны синтезировать конечные продукты с измененными, в нужном человеку свойствами. Иными словами, генная инженерия позволяет получать заданные (желаемые) качества изменяемых или генетически модифицированных организмов или так называемых «трансгенных» растений и животных. Наибольшее применение генная инженерия нашла в сельском хозяйстве и в медицине. Люди всегда задумывались над тем, как можно научиться управлять природой, и искали способы получения, например, растений с улучшенными качествами: с высокой урожайностью, более крупными и вкусными плодами или с повышенной холодостойкостью. С давних времен основным методом, который использовался в этих целях, была селекция. Она широко применяется до настоящего времени и 19 направлена на создание новых и улучшение уже существующих сортов культурных растений, пород домашних животных и штаммов микроорганизмов с ценными для человека признаками и свойствами. Селекция строится на отборе животных (растений) с выраженными благоприятными признаками и дальнейшем скрещивании таких организмов, в то время как генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат клетки. Важно отметить, что в ходе традиционной селекции получить гибриды с искомой комбинацией полезных признаков весьма сложно, поскольку к потомству передаются очень большие фрагменты геномов каждого из родителей, в то время как генно-инженерные методы позволяют работать чаще всего с одним или несколькими генами. В результате, не теряя других полезных свойств растения, удается добавить еще один или несколько полезных признаков, что весьма ценно для создания новых сортов и новых форм растений. Стало возможным изменять у растений, например, устойчивость к климату и стрессам, или их чувствительность к насекомым или болезням, распространённым в определённых регионах, к засухе и т.д. Ведутся широкие исследования по улучшению пищевой ценности различных сельскохозяйственных культур, таких как кукуруза, соя, картофель, томаты, горох и др. Исторически, выделяют «три волны» в создании генномодифицированных растений. Первая волна (конец 1980-х годов) создание растений с новыми свойствами устойчивости к вирусам, паразитам или гербицидам. В растениях «первой волны» дополнительно вводили всего один ген и заставляли его «работать», то есть синтезировать один дополнительный белок, «Полезные» гены «брали» либо у вирусов растений (для формирования устойчивости к данному вирусу), либо у почвенных бактерий (для формирования устойчивости к насекомым, гербицидам). Вторая волна (начало 2000-х годов) создание растений с новыми потребительскими свойствами: масличные культуры с повышенным содержанием и измененным составом масел, фрукты и овощи с большим содержанием витаминов, более питательные зерновые и т.д. В наши дни ученые создают растения «третьей волны», которые в ближайшие годы появятся на рынке: растения-вакцины, растения-биореакторы для производства промышленных продуктов (компонентов для различных видов пластика, красителей, технических масел и т.д.), растения - фабрики лекарств и т.д. Генно-инженерные работы в животноводстве имеют другую задачу. Вполне достижимой целью при современном уровне технологии является создание трансгенных животных с определённым целевым геном. Например, трансгенные козы, в результате введения соответствующего гена, могут вырабатывать специфический белок фактор VIII, который препятствует кровотечению у больных, страдающих гемофилией, или фермент тромбокиназу, способствующий рассасыванию тромба в кровеносных сосудах, что 20 актуально для профилактики и терапии тромбофлебита у людей. Трансгенные животные вырабатывают эти белки намного быстрее, а сам способ значительно дешевле традиционного. Другим, не менее важным, направлением современной биотехнологии является “клеточная инженерия”, занимающаяся получением новых клеток с заданными свойствами путем слияния родительских клеток. В 1960 году французские ученые (Барски, Сорьель и Корнефор) установили, что при совместном культивировании двух линий опухолевых клеток мыши образуется новый тип клеток. Они отличались от родительских по морфологическим характеристикам и особенностям роста. Ядра новых клеток содержали число хромосом, являющееся суммарным числом хромосом родительских клеток. В нем также обнаруживали хромосомные маркеры родительских клеток. Позднее эти наблюдения получили свои подтверждения на нормальных клетках мыши. Эффективность слияния заметно возрастала в случае воздействия на родительские клетки японского гемагглютинирующего вируса (ЯГВ). Причем, Окаде и Тадокора (1962) доказали возможность использования вируса, полностью инактивированного ультрафиолетовыми лучами. В 1965 году Харис и Уоткинс для слияния клеток HeLa человека с опухолевыми клетками мыши использовали вирус Сендай, похожего на вирус ЯГВ. Позднее для получения соматических гибридов вместо вируса Сендай начал применяться полиэтиленгликоль. Причем была доказана возможность слияния клеток позвоночных, принадлежащих к различным отрядам, гибридизация растительных клеток разных видов и даже животных клеток с растительными. Разработка методов слияния соматических клеток дала возможность исследователям искать новые пути решения актуальных проблем медицины, ветеринарии и сельского хозяйства. В частности появился новый подход в получении однородных (гомогенных) антител против возбудителей инфекционных болезней или других антигенов, имеющих большую диагностическую значимость. Метод получения однородных антител получил название гибридомной техники. Суть ее заключается в следующем. В организме на определенное чужеродное вещество (антиген) образуются защитные тела - антитела, неоднородные по своим физико-химическим и биологическим свойствам. Антитела продуцируются разными линиями В-лимфоцитов и направлены к различным участкам (детерминантам) антигена. Если бы одну клетку лимфоцита можно было выделить и растить in vitro, то полученный клон вырабатывал бы один тип антител - моноклональные антитела. Однако, лимфоциты не могут расти вне организма. В то же время существуют злокачественные опухоли - миеломы, клетки которых продуцируют большое количество аномальных иммуноглобулинов. Они способны к неограниченному росту и синтезируют иммуноглобулины сходные по всем параметрам. Таким образом, исследования по 21 получению клеток-гибридов, способных вырабатывать моноклональные антитела в условиях in vitro имели теоретическую основу. В конце 1974 года Келеру и Милстейну удалось получить гибридому путем слияния клеток миеломы и лимфоцитов из селезенки мыши, иммунизированной эритроцитами барана. Они сумели изолировать клоны клеток, продуцирующие определенный тип молекул антител и расти в питательной среде вне организма. Клетки-химеры, названные гибридомами, наследовали способность к неограниченому росту в культуре и одновременно вырабатывать антитела идентичной специфичности, т.е. моноклональные антитела. Последние становятся мощным инструментом в разработке высокоэффективных методов диагностики и лечения болезней. Другой из методов клеточной инженерии - клонирование находит свое применение в животноводстве. Клонирование – это способ получения идентичных потомков при помощи бесполого размножения. Иначе клонирование можно определить как процесс воспроизводства генетически идентичных копий отдельного организма. В природе клонирование широко распространено у различных организмов. У растений естественное клонирование происходит при различных способах вегетативного размножения, у животных - при партеногенезе и различных формах полиэмбрионии (полиэмбриония: от «поли-» и греч. embrion - «зародыш» - образование у животных нескольких зародышей (близнецов) из одной зиготы в результате ее неправильного деления вследствие воздействия случайных факторов). У людей примером полиэмбрионии может служить рождение однояйцевых близнецов, которые являются естественными клонами. Широко распространено клональное размножение среди ракообразных и насекомых. Первым искусственно клонированным многоклеточным организмом стала в 1997 г. овца Долли. Сутью техники «ядерного переноса», используемой при клонировании, является замена собственного клеточного ядра оплодотворенной яйцеклетки на ядро, извлеченное из клетки организма, точную генетическую копию которого планируется получить. К настоящему времени разработаны не только методы воспроизведения того организма, из которого клетка была взята, но и того, от которого был взят генетический материал. Появилась потенциальная возможность воспроизведения умершего организма, даже в том случае, когда от него остались минимальные части необходимо только, чтобы из них можно было выделить ДНК. Клонирование открывает новые перспективы в сельском хозяйстве и животноводстве. Путём клонирования можно получать животных с высокой продуктивностью яиц, молока, шерсти или таких животных, которые выделяют нужные человеку ферменты (инсулин, интерферон и др.). Комбинируя методы генной инженерии с клонированием, можно вывести трансгенные сельскохозяйственные растения, которые смогут сами себя защищать от вредителей или будут устойчивы к 22 определённым болезням. Здесь были перечислены только некоторые из возможностей, которые открываются, благодаря применению этой новейшей технологии. Однако, при всех своих достоинствах и перспективах, столь важных для решения многих проблем человечества, клонирование является одной из самых обсуждаемых областей науки и медицинской практики. Это связано с нерешенностью целого комплекса морально-этических и правовых аспектов, связанных с манипуляциями с половыми и стволовыми клетками, судьбой эмбриона и клонированием человека. Клонирование организмов может быть полным или частичным. При полном клонировании воссоздаётся весь организм целиком, а при частичном - воссоздаются лишь те или иные ткани организма. Технология воссоздания целого организма крайне перспективна в случае необходимости сохранения редких видов животных или для восстановления исчезнувших видов. Частичное клонирование - может стать важнейшим направлением в медицине, поскольку клонированные ткани могут компенсировать недостаток и дефекты собственных тканей организма человека и, что особенно существенно, они не отторгаются при трансплантации. Такое терапевтическое клонирование изначально не предполагает получение целого организма. Его развитие сознательно останавливают на ранних стадиях, а получившиеся клетки, которые называются эмбриональные стволовые клетки (эмбриональные или зародышевые стволовые клетки - самые примитивные клетки, возникающие на ранних стадиях развития эмбриона, способные развиться во все клетки взрослого организма), используют для выработки нужных тканей или других биологических продуктов. Экспериментально доказано, что терапевтическое клонирование может быть также с успехом применено для лечения некоторых заболеваний человека, до сих пор считающихся неизлечимыми (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, инфаркт, инсульт, диабет, рак, лейкемия и др.), позволит избежать рождения детей с синдромом Дауна и другими генетическими заболеваниями. Ученые видят возможность успешного использования методов клонирования в борьбе со старением и для увеличения продолжительности жизни. Важнейшим приложением этой технологии является и область репродукции - при бесплодии, как женском, так и мужском. Массовое внедрение в медицинскую практику и коммерциализация принципиально новых технологий в области генной инженерии и клонирования, привело также к необходимости создания соответствующей правовой базы, регулирующей все юридические аспекты деятельности в этих направлениях. Современная биотехнология создает огромные возможности вмешательства в жизнедеятельность живых организмов и неизбежно ставят человека перед нравственным вопросом: до какого предела допустимо вторжение в природные процессы? Практика, существующая в современных демократических 23 обществах, показывает, что эти дискуссии абсолютно необходимы не только для более полного понимания всех «плюсов» и «минусов» применения методов, вторгающихся в личную жизнь человека уже на уровне генетики. Они позволяют также обсудить морально-этические аспекты и определить отдаленные последствия применения биотехнологий, что, в свою очередь, помогает законодателям создавать адекватную правовую базу, регулирующую данную сферу деятельности в интересах защиты прав личности. Остановимся на тех направлениях в биотехнологических исследованиях, которые напрямую связаны с высоким риском нарушения прав личности и вызывают наиболее острую дискуссию по поводу их широкого применения: пересадка органов и клеток в терапевтических целях и клонирование. В последние годы резко возрос интерес к изучению и применению в биомедицине эмбриональных стволовых клеток человека и техники клонирования с целью их получения. Как известно, эмбриональные стволовые клетки способны трансформироваться в разные типы клеток и тканей (кроветворные, половые, мышечные, нервные и др.). Они оказались перспективными для применения в генной терапии, трансплантологии, гематологии, ветеринарии, фармакотоксикологии, при тестировании лекарств и пр. Выделение этих клеток производят из эмбрионов и плодов человека 5-8 недель развития, полученных при медицинском прерывании беременности (в результате аборта), что порождает многочисленные вопросы относительно этической и юридической правомерности проведения исследований на эмбрионах человека. Все эти вопросы решались бы гораздо проще, если бы существовало универсальное понимание, что такое «начало жизни», с какого момента можно говорить о «личности, нуждающейся в защите прав» и что подлежит защите: половые клетки человека, эмбрион с момента оплодотворения, плод с какого-то определенного этапа внутриутробного развития или человек с момента его появления на свет? У каждого из вариантов есть свои сторонники и противники, и вопрос о статусе половых клеток и эмбриона не нашел своего окончательного решения еще ни в одной стране мира. В ряде стран запрещены любые исследования на эмбрионах (например, в Австрии, Германии). Во Франции права эмбриона защищаются с момента его зачатия. В Великобритании, Канаде и Австралии, хотя создание эмбрионов для исследовательских целей не запрещено, но разработана система законодательных актов, регулирующая и контролирующая подобные исследования. Ученые стараются четко разграничивать "репродуктивное" клонирование, цель которого - создание клона, то есть целого живого организма, идентичного другому организму по генотипу, и "терапевтическое" клонирование, применяемое для выращивания колонии стволовых 24 клеток. В случае стволовых клеток проблемы статуса эмбриона и клонирования приобретают новое измерение. Это связано с мотивацией данного рода научных исследований, а именно применение их для поиска новых, более эффективных способов лечения тяжелых и даже неизлечимых заболеваний. Поэтому в некоторых странах (США, Канада, Англия), где до последнего времени считалось недопустимым использовать эмбрионы и технологии клонирования в терапевтических целях, происходит изменение позиции общества и государства в сторону допустимости их применения в целях лечения таких заболеваний, как рассеянного склероза, болезней Альцгеймера и Паркинсона, постмиокардиального инфаркта, недостаточности регенерации костной или хрящевой ткани, при черепно-лицевых травмах, диабете, миодистрофии и др. В то же время терапевтическое клонирование многими рассматривается как первый шаг к репродуктивному клонированию, которое встречает крайне негативное отношение во всем мире, и на него повсеместно наложен запрет. Клонирование человека в настоящее время официально нигде не осуществляется. Опасность в его применении в репродуктивных целях видят в том, что техника клонирования исключает естественное и свободное слияние генетического материала отца и матери, что воспринимается как вызов достоинству человека. Нередко говорится о проблемах самоидентификации клона: кого он должен считать родителями, почему он является генетической копией кого-то другого? Кроме того, клонирование сталкивается с некоторыми техническими препятствиями, которые подвергают опасности здоровье и благополучие клона. Есть факты, свидетельствующие о быстром старении клонов, возникновении у них многочисленных мутаций. В соответствии с техникой клонирования, клон вырастает из взрослой - не половой, а соматической клетки, в генетической структуре которой на протяжении многих лет происходили так называемые соматические мутации. Если при естественном оплодотворении мутировавшие гены одного родителя компенсируются нормальными аналогами другого родителя, то при клонировании такой компенсации не происходит, что значительно увеличивает для клона риск заболеваний, вызываемых соматическими мутациями, и многих тяжелых заболеваний (рака, артрита, иммунодефицитов). Помимо прочего, у некоторых людей возникает страх перед клонированным человеком, перед его возможным превосходством в физическом, моральном и духовном развитии. В лекции приведены только некоторые из многочисленных проблем, которые возникают в связи с бурным развитием биотехнологий и вторжением их в жизнь человека. Безусловно, прогресс науки остановить нельзя и вопросы, которые она ставит, возникают быстрее, чем общество может на них найти ответы. Справиться с этим положением дел можно лишь понимая, насколько важно широко обсуждать в обществе этические и правовые проблемы, которые 25 появляются по мере развития и внедрения в практику биотехнологий. Наличие колоссальных идеологических расхождений по этим вопросам вызывает осознанную необходимость серьезного государственного регулирования в этой сфере. Предлагаемая дисциплина рассматривает современные проблемы ветеринарной медицины и животноводства (иммунои генодиагностика, новое поколение вакцин, производство лекарственных и кормовых препаратов, создание трансгенных животных, эмбриоинженерия, биотехнология и безопасность), которые решаются и впредь могут быть успешно решены с использованием методов современной биотехнологии. Контрольные вопросы: 1.Перечислите основные периоды развития биотехнологии; 2. Дайте определения классической и современной биотехнологии; 3.Назовите направления современной биотехнологии; 4. Какие задачи ставят перед собой генетическая инженерия в сфере животноводства? 5. Перспективные задачи клеточной инженерии в ветеринарии и животноводстве. Лекция №2 Молекулярная диагностика в медицине и ветеринарии Одной из актуальных проблем современной медицины и ветеринарии является разработка методов экспресс-обнаружения возбудителей инфекционных болезней в организме человека или животных, а также в воде, продуктах питания, кормах, почве и других объектах внешней среды. Профилактику и лечения инфекционных болезней значительно облегчает ранняя и точная диагностика. Каждый из методов, используемых в медицине и ветеринарии для идентификации патогенного возбудителя, имеет определенные недостатки. Так, например, микроскопический метод, хотя и является простым и доступным, не позволяет разграничить под микроскопом сходные микроорганизмы; изоляция чистой культуры возбудителя с помощью бактериологического метода – бесспорное доказательство инфекционной болезни, однако он требует длительного времени и не выявляют тех возбудителей, которые плохо растут на искусственных питательных средах либо вообще не поддаются культивированию; серологический метод, диагностирующий болезнь на основе обнаружения в крови специфических к возбудителю антител, не всегда специфичен. В этой связи подходы молекулярно-генетической диагностики, основанные на методах обнаружения специфической ДНК возбудителя болезни в исследуемом материале, нацелены на устранение указанных принципиальных ограничений, и, следовательно, имеют большую практическую значимость. Любой эффективный диагностический тест должен быть: 1) высокоспецифичным в отношении молекулы-мишени; 2) достаточно чувствительным для выявления небольшого количества мишени; 3)достаточно простым, позволяющим без труда получать однозначные 26 результаты. Существуют два типа методов молекулярной диагностики: один основан на сродстве антител к конкретному антигену (иммунологические методы), другой – на идентификации специфических нуклеотидных последовательностей с помощью гибридизации. Наиболее распространенным иммунологическим тестом является иммуноферментный анализ (ИФА). В этой тест-системе ферментная метка может быть введена в антивидовые или специфические антитела, либо в антиген, что зависит от схемы постановки анализа. Существует несколько вариантов постановки ИФА. Широкое применение нашел метод при котором специфические антитела в исследуемом образце обнаруживаются с помощью меченных ферментом антивидовых иммуноглобулинов (конъюгата). Принцип ИФА в данном случае заключается в специфическом взаимодействии конъюгата с антителами к испытуемому антигену, в результате чего достигается индикация образовавшегося комплекса антиген-антитело. Антивидовые иммуноглобулины, конъюгированные ферментом, представляют собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией животных-продуцентов иммуноглобулинами быка, кролика, мыши и других животных, меченную энзимами. В качестве твердой фазы используются полистироловые планшеты. Антиген в ИФА можно обнаружить и с помощью меченных специфических антител. Данный метод используется для определения антигенов, имеющих несколько детерминант. Возможность одновременного связывания антигена с антителами обоих типов зависит от того, является ли антиген бивалентным. Если же он моновалентен, то первые и вторые антитела должны обладать специфичностью к различным антигенным детерминантам одной и той же молекулы антигена. Название метода «сэндвич» обусловлено тем, что в процессе анализа антиген как бы «зажат» между антителами. Суть метода заключается в следующем. К твердой фазе с иммобилизированными антителами добавляют антиген. Затем проводят отмывку носителя от несвязавшихся компонентов и вносят меченные энзимом иммуноглобулины. После удаления избытка конъюгата определяют концентрацию метки, связанной с твердой фазой с помощью субстрата для данного фермента. В «сэндвич» методе могут применяться и антивидовые конъюгаты. При этом антиген, связанный с адсорбированными антителами, вступает в реакцию со специфическими немеченными иммуноглобулинами, которые в дальнейшем выявляются антивидовым конъюгатом, т.е. процедура исследований увеличивается на один этап. При постановке ИФА по указанной схеме следует испытать антитела, полученные от разных видов животных с целью предотвращения реакции иммобилизованных антител с антивидовым конъюгатом. 27 Метод «сэндвич» может быть использован для обнаружения перекреста антител. Для этого сначала лунки покрывают антигеном, после чего добавляют антитела, которые специфично с ними связываются. Избыток антител отмывают и добавляют антиген, сшитый с ферментом. Если связавшиеся антитела перекрестно реагируют и с антигеном, то связанный с ферментом антиген будет также сорбироваться на твердой фазе. Количественно это будет определяться как увеличение поглощения в результате проведения катализируемой ферментом реакции. Данный метод был использован для изучения перекрестных реакций антиидиотипических сывороток с двумя препаратами идиотипа, а также для обнаружения анти-антиидиотипических антител. Возможно и другие варианты взаимного расположения антител и антигена. Наличие в «сэндвич» дополнительных слоев может приводить к повышению чувствительности, однако оно вызывает увеличение фона и вариабельность получаемых результатов. Следующий вариант, получивший название конкурентный ИФА, позволяет выявлять антиген в образцах с помощью этого же антигена, меченного ферментом. Сущность метода заключается в следующем. К иммобилизованным антителам добавляют исследуемый образец и комплекс антигена с ферментом. При этом происходит конкуренция определяемого и меченного антигенов за антидетерминанты антител. Через некоторое время конъюгат перераспределяется между раствором и носителем. Концентрация метки, измеряемая на твердой фазе, пропорциональна исходному содержанию исследуемого антигена. Метод прост и быстро выполним, однако имеется трудность в получении конъюгатов антиген-фермент. В некоторых случаях химическая модификация фермента сопровождается ухудшением его активности, а антигена - снижением способности формировать прочный комплекс с антителами. В таких случаях определенный интерес представляет вариант ИФА в котором используются нековалентные комплексы фермента маркера с антителами. Наиболее эффективным подходом является включение ферментной метки через комплекс авидин-биотин. Он основан на использовании авидина - компонента яичного белка (мол.м. 66000) и биотина - витамина (мол.м. 228) образующих комплекс, константа связывания которого в десятки тысяч раз превышает прочность связи антиген-антитело. Адсорбированный антиген выдерживают с образцом, содержащим антитела, отмывают и вносят антивидовые иммуноглобулины, ковалентно связанные с биотином. Добавляют авидин, меченный пероксидазой, образующий прочный комплекс с биотином, удаляют излишек конъюгата и после введения в систему субстрата определяют концентрацию антигена. Одним из практичных и весьма чувствительных вариантов ИФА является пероксидазный тест. Сущность метода заключается в 28 соединении иммунопероксидазного конъюгата со специфическим антигеном и определении образовавшегося комплекса с помощью диаминобензидинового реактива. В ветеринарии он более широкое применение находит в диагностике вирусных инфекций (бешенства, ящура и др.). Пероксидазный тест, как твердофазный ИФА, проводится в двух вариантах; прямой и непрямой. Последний чувствительнее, чем первый и не требует набора специфических иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, против антигена. Выбор пероксидазы в качестве метки антител объясняется тем, что ее молекулярная масса меньше, чем у других ферментов, используемых в иммуноферментном анализе. Поэтому иммунопероксидазный конъюгат лучше проникает сквозь клеточную мембрану. Метод молекулярной гибридизации является первым тестом генетической диагностики в основе которого лежит использование так называемых ДНК-зондов, меченных изотопом, флюорохромом или ферментом. Последние представляют собой небольшой участок ДНК (или РНК), нуклеотидная последовательность которого специфична для определенного вида микроорганизма. При добавлении меченого зонда в образец, в котором содержится ДНК исследуемого микроорганизма, происходит комплементарное соединение нуклеотидных последовательностей. Образовавшийся комплекс в зависимости от вида использованной метки определяют радиоизотопным анализом, либо ИФА, либо реакцией иммунофлуоресценции. Здесь следует отметить, что метод ДНК-зонда позволяет выявлять нуклеиновые кислоты микроорганизмов при их довольно высокой концентрации. Специфичность зондов может быть различной. Например, они могут дифференцировать два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК; они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представлять собой продукт химического синтеза или их фрагменты. Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрикцирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и сапрофитного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизирующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что используемые зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах (Б.Глик, Дж.Пастернак, 2002). ДНК-зонды 29 получают и путем химического синтеза последовательностей нуклеотидов, ответственных за определенный признак микроорганизма. В качестве примера использования ДНК-зондов для диагностики заболеваний можно привести процедуру обнаружения Plasmodium falciparum. Этот паразит вызывает малярию, заболевание, угрожающее примерно трети населения. Для выявления ДНК возбудителя, в качестве основы используются высокоповторяющиеся последовательности ДНК Plasmodium falciparum. С его помощью можно обнаруживать всего 10 пг очищенной ДНК паразита или 1 нг той же ДНК в крови больного. С помощью гибридизации можно выявлять практически любые болезнетворные микроорганизмы. На сегодняшний день получены и охарактеризованы ДНК-зонды большинства патогенных микроорганизмов, вирусов и простейших. В числе первых возбудителей «заслуживших» свои ДНК-зонды Legionella pneumophila (респираторная болезнь), Salmonella typhi (пищевые отравления), Campylobacter hyointestinalis (гастриты), а также энтеротоксический штамм Esherichia coli, Mycobacterium tuberculosis (возбудитель туберкулеза) Brucella abortus (возбудитель бруцеллеза) и др. Молекулярную гибридизацию, как правило, проводят на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот. Например, можно провести гибридизацию с молекулами ДНК возбудителя, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, молока и в других материалах, а также в тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательностимишени в исследуемом материале слишком мала, ее можно значительно увеличить. Применение молекулярно-генетических подходов, основанных на обнаружении молекул ДНК патогена путем амплификации (размножения) их специфических участков, является новым направлением в диагностике инфекционных заболеваний. В 1983 году K.Mulles из биотехнологической компании «Cetus Corporations» предложил многократно размножить ДНК выявляемого микроорганизма, содержащегося в исследуемом образце, а затем провести детектирование комплекса ДНК-ДНК. Данный подход позже получил название полимеразно-цепной реакции (ПЦР). В основе ПЦР лежит многократное повторение циклов репликации ДНК. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при температуре 93-95 С происходит разделение комплементарных цепей двуцепочной молекулы ДНК (денатурация). Вторая стадия заключается во внесении в образец, содержащий ДНК выявляемого микроорганизма, пару праймеров, один из которых комплементарен одной цепи, а другой – противоположной. Праймеры – искусственно синтезируемые одноцепочные дезоксиолигонуклеотиды, состоящие, как правило, из 20-27 пар оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего фрагмента ДНК. При температуре 50-65 С протекает 30 синтез полинуклеотидных цепей путем удлинения праймеров с помощью дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. В процессе реакции праймеры отжигаются на этих цепях и инициируют ферментативный синтез ДНК по направлению друг к другу. По окончании синтеза новые цепи двухцепочной ДНК плавят, отжигают те же праймеры и вновь осуществляют синтез ДНК. Повторяя 3 стадии 30-40 раз за 1,5-3 часа получают миллионы копий специфического участка ДНК или РНК конкретного микроорганизма, т.е. нарабатывается нуклеиновая кислота в количестве, достаточном для ее визуализации с помощью электрофореза в агарозном геле без использования радиоизотопов. ПЦР имеет две главные недостатки: ложноположительные реакции, вызванные контаминацией фрагментами ДНК из ранее полученных продуктов (ампликонов), и ложноотрицательные, полученные в результате действия на Taq –полимеразу ингибиторов, присутствующих в биологических жидкостях и тканях. Кроме того, к недостаткам теста следует отнести и дороговизну реактивов, а также оборудования, используемых при ее постановке. В 1989 г. A. Brisson-Noel et al. были впервые опубликованы результаты экспериментальной работы по отработке экспрессдиагностики туберкулеза методом ПЦР. Ими было исследовано 35 клинических образцов (мокрота, содержимое желудка, содержимое абсцесса, периферическая кровь), из которых только два положительных в ПЦР не соответствовали отрицательным результатам, полученным стандартными методами (микроскопия, бактериологический анализ). ПЦР может оказать исследователям неоценимую помощь в дифференциации видов микобактерий. A. Bahrmand et al. (2000) при анализе 329 образцов мокроты методом ПЦР использовали праймеры, специфичные для М. bovis, и получили положительный результат в 274 случаях. 55 образцов, показавшие отрицательные результаты по ПЦР, были повторны исследованы праймерами, специфичными для атипичных видов микобактерий - М. fortuitum и М. kansasii. Наличие последних установлено в 21 (38%) образце. В данной работе микобактерии туберкулеза бактериологически были изолированы из 224 образцов. Высокоэффективные тест-системы ПЦР, позволяющие обнаруживать возбудителя туберкулеза в разнообразных тканях и жидкостях организма, предложены сотрудниками ВГНКИ (Россия)). Испытания показывают, что ПЦР способна заменить все применяющиеся методы лабораторной диагностики болезни. Результат теста может быть получен через несколько часов, при этом не имеет значения загрязнение материала другими видами микобактерий и любой другой микрофлорой. Интерес представляет также определение возможности применения ПЦР для прижизненной диагностики туберкулеза и выявления бактериовыделителей. 31 ПЦР для детекции бруцелл была впервые применена D.Fekete et al. (1990). Позднее она была успешно использована для родовой и видовой идентификации этих микроорганизмов при исследовании клеточных лизатов бактерий. Шумилов К.В. и соавт. (1996) изучили чувствительность и родовую специфичность метода ПЦР (в варианте двухшаговой реакции с вложенными праймерами, комплементарными гену BCPR 31 Brucella по сравнению с бактериологическим. В качестве патологического материала были взяты пробы молока и крови, контаминированные культурой Brucella abortus 19 с концентрацией бруцелл 1 млрд. м.к./мл; образцы селезенки, печени от морских свинок, убитых через 20 дней после иммунизации их культурами (Brucella abortus 19 и 104М в дозе 1 млрд. м.к.) Установлено, что ПЦР, подтверждают все положительные результаты бактериологического метода, а с учетом данных исследований проб печени чувствительность первого была в 2 раза выше. Авторы приходят к выводу, то метод ПЦР специфичен и высокочувствителен и позволяет в течение одного рабочего дня определить наличие или отсутствие возбудителя в исследуемом материале. В исследованиях А.Х.Найманова и соавт. (2004) ПЦР-система (senX3-regX3, RD2 и gyrB) позволяла идентифицировать М.bovis и M.tuberculosisот от других бактерий в 95,4-100% случаев. Результаты авторов свидетельствуют о том, что у экспериментально зараженных животных М.bovis может находиться в организме и в 83,3% случаев выделяться с мочой, но при этом возбудитель не обнаруживают в крови. Из патматериала таких животных рост культур М.bovis бактериологически выявляли в 33,3% случаев, а с помощью ПЦР не обнаруживали, хотя при исследовании ПЦР верхнего слоя питательной среды, засеянной суспензией обработанного патматериала, возбудитель туберкулеза выявляли в 100% случаев. В благополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании проб крови от реагирующих на туберкулин коров ПЦР дала ложно-положительные показания в 16,3% случаев. В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании патматериала от больных туберкулезом коров результаты теста были положительными в 42% случаев. Н.И.Потапова и соавт.(2006) для создания ПЦР тест-системы подобрали две пары олигонуклеотидных последовательностей (TubFTubR и BovF-BovR) и два зонда (TaqTub и TaqBov). Обе пары праймеров позволяли получать фрагменты размером 135 пар оснований. Пара праймеров TubF-TubR и зонд TaqTub специфичны гену, присутствующими только в геноме M.tuberculosisот, а пара праймеров BovF-BovR и зонд TaqBov комплементарны гену, имеющемуся в геномах М.bovis и M.tuberculosis. Данную тест-систему на основе ПЦР в реальном времени сравнили с тест-системой НПО НАРВАК – «гнездовой» ПЦР. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) позволяла измерять количество амплифицированных фрагментов искомой ДНК 32 непосредственно в ПЦР-пробирке во время и после окончания реакции. Метод основан на использовании молекул, способных флуоресцировать при определенной длине волны. Сравнительный анализ двух тест-систем показал высокую сходность результатов. При постановке ПЦР-РВ не было ложноположительных результатов, так как исключены стадия электрофореза и необходимость открытия пробирки после амплификации. Авторы предлагают использовать тест-систему для быстрой диагностики и типирования микобактерий в культурах и образцах биоматериала. Кроме того, в ходе одной ПЦР-РВ можно определить два вида возбудителя, что существенно сокращает время проведения анализа и делает этот метод незаменимым в лабораторной диагностике туберкулеза. Метод ПЦР-РВ был также разработан для диагностики гриппа птиц, который позволял специфически выявлять вирус различных подтипов, включая высокопатогенный H5N1 (В.Ю.Белоусов и соавт., 2008), для выявления ДНК (13-130 копий) вируса ларинготрахеита птиц (Е.В.Жолдыбаева и соавт., 2008) . Н.Л.Тупота и соавт. (2010) в своих исследованиях из 40 проб материала рост кислотоустойчивых микроорганизмов в виде колоний, имеющих различный пигмент и скорость роста, отмечали в 22 случаях. В ПЦР также 22 пробы дали положительные результаты. При этом положительный сигнал при культуральном исследовании на наличие микобактерий совпал с таковым ПЦР в 17 случаях и в 5 не подтвердился. Возможно это следствие роста микроорганизмов, сходных с микобактериями (нокардии, родококки и коринебактерии), и вызывающие ложноположительные результаты культивирования. Пять проб положительных в ПЦР, выделением культуры рода Mycobacterium и биопробой подтвердить не удалось. Это явление авторы объясняют существованием эпизоотически значимой части популяции возбудителя в виде «измененных» покоящихся форм, сенсибилизирующих организм животных к ППД-туберкулину для млекопитающих, но не способных к культивированию и, следовательно, не обнаруживаемых с помощью традиционных бактериологических методов. Самым существенным фактором, обеспечивающим успешное лечение больных туберкулезом людей, является контроль за эффективностью действия лекарственных препаратов. По данным С.Н.Радюк и соавт. (1998) метод ПЦР оказался одним из самых эффективных для оценки терапии. Так, например, после проведенной терапии, в то время как результаты культурального и микроскопического методов были отрицательными, путем ПЦР удалось обнаружить возбудителя туберкулеза в 27% образцов через 2 мес. после начала лечения, в 13% - через 3 мес и 7% 0 – через 6 мес лечения. Метод оказался полезным и для быстрого определения антибиотикоустойчивости клинических изолятов. В общей сложности, согласно данным литературы, обнаружены 7 генов, ассоциированных с антибиотикоустойчивостью у M.tuberculosis. 33 Тест-система для выявления микроорганизмов из рода Brucella методом ПЦР («ГЕН-БРУ») была разработана РосНИПЧИ «Микроб». А.А.Павловым (2002) была изучена эффективность данного диагностического набора в сравнении серологической диагностики бруцеллеза. Показано, что ПЦР превосходит по чувствительности РА и РСК в 2-2,4 раза. Выявлено, что наибольшая чувствительность ПЦР анализа достигается при использовании в качестве диагностического материала образцов крови животных. Установлена возможность детекции ДНК вакцинного штамма B.abortus 82 в поздние сроки после иммунизации, что свидетельствует о его длительной приживаемости в организме вакцинированных животных. Доказано, что данная тестсистема может быть применена для обнаружения ДНК бруцелл в молоке, как метод оценки санитарного благополучия пищевых продуктов животного происхождения. О.Д.Скляровым и соавт.(2004) разработана тест-система «БРУКОМ», основанная на применении ПЦР, которая позволяет выявлять ДНК бруцелл всех видов в молоке, крови, сперме, внутренних органов и лимфатических узлах инфицированных животных. Испытание ПЦР показало, что она достоверно превосходит по чувствительности бактериологический метод. Для диагностики бруцеллеза методом ПЦР авторы рекомендуют исследовать пробы нескольких объектов (примерно 5-6 крупных парных лимфатических узлов, селезенки и печени), так как изучение отдельных из них может отразиться на достоверности результата. Л.Ф.Зыкин и соавт. (2004) апробировали ПЦР-Иерсэнтеро амплитест, производимой фирмой «Ниармедик плюс» (Москва). Праймер, специфичный для фрагмента гена опреона Н Y.enterocolitica, размер 324 п.н. Как показали результаты, ПЦР была в два раза информативнее бактериологического метода, и в этой связи рекомендованы исследователями для индикации возбудителя кишечного иерсиниоза в молоке коров. Т.В.Гребенниковой и соавт. (2004) разработана диагностическая тестсистема на основе ПЦР для определения и дифференциации лейкоза типов A,B,C,D,E и J , а также показана возможность оздоровления поголовья птиц после своевременной диагностики и изоляции здоровых особей. Н.С.Юдин и соавт. (2008) для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота в лейкоцитах использовали ПЦР. Используемые праймеры были специфичны для последовательности оболочного гена env . Процент соответствия между РИД и ПЦР составлял 31%. При этом, 25 животных, позитивных по методу РИД, были ПЦР-негативными, в то время как 22 РИД-негативных животных были ПЦР-позитивными. Авторы рекомендуют ПЦР в качестве дополнительного метода для ранней диагностики лейкоза. Н.В.Кузнецова и соавт., используя ПЦР для выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, пришли к заключению, что эту реакцию можно использовать для определения источника инфекции 34 в стадах, при племенной продаже, профилактике и на заключительных этапах искоренения инфекции. По данным авторов, у животных с незначительно повышенными морфологическими показателями крови ПЦР позволяет достоверно отличать лейкемоидное состояние организма от ранней стадии лейкозного процесса. В.Л.Зайцевым (2005) отработан метод ПЦР для обнаружения вирусов оспы овец, контагиозной эктимы овец и коз, ящура в различных вируссодержащих материалах. Разработаны специфические праймеры, позволяющие проводить дифференциацию вирусов оспы овец и оспы коз. Тест наборы позволяли с высокой чувствительностью и специфичностью идентифицировать вирусы в количестве 2-5 пг геномной ДНК. По данным В.М.Строчкова и соавт.(2008) высокая степень чувствительности и специфичности ПЦР отмечается при использовании универсиальных праймеров LP3dAll и RP3dAll. А.О.Семенцовой и соавт. (2011) для исследования биологических образцов от больных людей и животных, а также переносчиков (клещей и насекомых) на наличие в них генетического материала флавивирусных болезней (клещевой энцефалит, лихорадки Западного Ниля, желтой лихорадки, Японского энцефалита) был разработан лабораторный вариант мультиплексной ПЦР (позволяющая выявлять сразу несколько патогенов в одной пробирке) с регистрацией результатов в реальном времени. Таким образом, методы молекулярной диагностики как высокочувствительные и специфичные тесты могут найти свое практическое применение в ветеринарной медицине для своевременного выявления инфицированных животных и обнаружения патогенов в биоматериале или объектах внешней среды. Контрольные вопросы: 1.Назовите преимущества молекулярной диагностики в сравнении с известными методами; 2. Расскажите о принципах постановки различных вариантов ИФА; 3. Чем отличается метод молекулярной гибридизации от полимеразно-цепной реакции (ПЦР)? 4.Расскажите о состоянии и перспективах использования ПЦР в ветеринарной практике. Лекция №3 Совершенствование ИФА для диагностики болезней животных В настоящее время в совершенствовании серологической диагностики заразных болезней широко используются методы, основанные на использовании ИФА. Это и понятно: ИФА является высокочувствительным тестом, позволяющим за короткое время исследовать большое количество образцов сыворотки крови. Однако высокая чувствительность теста, в первую очередь, требует применения в нем антигена, специфичного для возбудителя. Иначе, высокая чувствительность ИФА идет во вред его диагностической ценности, показывая ложноположительные результаты вследствие наличия у 35 возбудителя и некоторых микроорганизмов общих антигенных детерминант. Бруцеллез животных остается одной из главных проблем ветеринарии Казахстана. В ИФА-наборах, используемых в последнее время для серологической диагностики инфекции, в качестве антигена выступают липополисахариды (ЛПС) молекулы бруцелл. Известно, что ЛПС Brucella практически единтичны аналогичному антигену, полученному из Yersinia enterocolitica 0:9, и имеют гомологичные эпитопы с многими грамотрицательными микроорганизмами на которые в организме животных имеются антитела. Кроме того, иммунной системе вакцинированного организма более доступны ЛПС, расположенные поверхностно, и поэтому антитела в основном вырабатываются на детерминанты полисахаридной молекулы. В этой связи, нет сомнений в том, что использование данного антигена в ИФА приводит к необоснованному убою определенного поголовья здоровых животных, выработавших антитела в результате иммунизирующей субинфекции или вакцинации. В НИИ биотехнологии КазАТУ им. С.Сейфуллина (А.К.Булашев и соавт.) проведена работа по определению диагностической ценности белков внешней мембраны (БВМ) Brucella abortus 19. Выбор данного антигена основан на следующих положениях. Во-первых, грамотрицательные микроорганизмы, хотя и имеют большие сходства между собой по ЛПС, существенно различаются по антигенам БВМ. Вовторых, в иммунизированном организме вакцинные штаммы задерживаются, как правило, в течение короткого времени (1-3 мес.). Поэтому для иммунной системы вакцинированных животных более доступны ЛПС, расположенные на поверхности клетки, чем белковые антигены «замаскированные» сложным комплексом поверхностной структуры. В этой связи привитый организм успевает вырабатывать антитела в основном на ЛПС. В организме инфицированного животного происходит длительная персистенция бруцелл, сопровождающаяся реакцией иммунной системы на возбудителя болезни, пытающегося локализоваться в излюбленных им органах. Это приводит к накоплению в тканях большого количества продуктов распада бруцелл, среди которых имеются и БВМ, которые ранее были не доступными для иммунной системы. Тест-система ИФА для выявления противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота, разработанная сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина, основана на использовании БВМ бруцелл. Как показали результаты исследований, тест оказался более специфичным, нежели общеизвестные серологические реакций. Постановка ИФА проводилась в двух вариантах. В непрямом ИФА БВМ были иммобилизированы к твердой фазе неспецифически, а в «сэндвич» варианте – посредством моноклональных антител (МКА), имеющих специфичность к эпитопу белка с молекулярной массой 50 кД. 36 Сравнивая диагностическую значимость двух методов постановки ИФА, исследователи предпочтение отдают «сэндвич» варианту. Во-первых, в последнем случае белковый антиген, в составе которого имеется эпитоп моноклональных антител, фиксируется к твердой фазе специфически. При этом другие белковые компоненты БВМ бруцелл удаляются в процессе отмывки лунки планшеты. Таким образом, в ходе постановки «сэндвич» ИФА первые антитела осуществляют отбор антигенов, свойственных для бруцелл из состава БВМ бруцелл. Это, безусловно, повышает специфичность данного теста. Разработчик имеет научнотехническую документацию и опытные образцы иммуноферментного диагностикума (зарегистрирован в Государственном реестре ветеринарных препаратов за №РК-ВП-2-0126-04 от 27.01.2004.). Авторские права защищены патентом РК №14230 «Способ определения антител против возбудителя бруцеллеза» (Бюл.№4, опубл.15.04.2008.). Высокая специфичность белковых антигенов Leptospira, серогруппы Hebdomadis была отмечена нами при серологической ИФАдиагностике крупного рогатого скота на лептоспироз в сравнении с другими иммунологическими методами. (А.К.Булашев, 2005). Диагностикум существенно превосходил по чувствительности и специфичности реакцию микроагглютинации и лизиса (РМАЛ) и на 6% больше выявлял серопозитивных животных, чем его зарубежный аналог «IФА-лептоспiроз-ВРХ» (М.А.Куйбагаров, 2006). В литературе имеются сообщения о перспективности использования БВМ в диагностике других инфекционных болезней. Например, на основе БВМ Yersinia pseudotuberculosis сконструирован псевдотуберкулезный видоспецифический антигенный полимерный диагностикум для объемной реакции агглютинации. При этом чувствительность диагностикума составлял 100%, специфичность – 85,7-89,5% (Д.И.Симакова и др., 2011). Большую практическую значимость имеют и методы детекции антигенов возбудителей инфекционных болезней, предложенные учеными КазАТУ им.С.Сейфуллина. Так, диагностический набор, основой которого являются МКА штаммов гибридом БАМА и БИМА, позволяет обнаруживать Brucella abortus в патматериале, а именно в паренхиматозных органах и лимфатических узлах, а также в содержимом желудка аборт-плодов (А.К.Булашев, 1992). МКА упомянутых штаммов были использованы Н.А.Бызовой и соавт. (2011) для разработки экспрессных иммунохроматографических тестов (ИХТ) для детекции антигенов Brucella abortus и антител против данного патогена. Тесты для определения антигена Brucella abortus позволяют в течение 10-15 мин выявлять в биоматериале ЛПС в концентрациях до 5 нг/мл., единый стандартный бруцеллезный антиген до 1 млн.кл/мл. Результаты серологический исследований с помощью ИХТ полностью совпали с данными ИФА. 37 Экспресс-тест на основе МКА был апробирован нами и для обнаружения возбудителя туберкулеза в биологическом материале. Установлено, что «dot» ИФА с использованием антител к Mycobacterium bovis как в «сэндвич», так и в прямом варианте по чувствительности и специфичности, и, естественно, по времени проведения (3,5-4 часа) существенно превосходит классические методы исследований (микроскопический, бактериологический) и сопоставим с ПЦРдиагностикой. Данный тест, в отличие от других использованных, давал возможность дифференцировать Mycobacterium bovis от других видов, включая представителей атипичных микобактерий (А.К.Булашев и соавт., 2010; 2011). Заслуживает внимания и иммуноферментный диагностикум, предназначенный для серологического обследования крупного рогатого скота на туберкулез (A.K.Bulashev, 2003). По результатам апробации у всех животных, показавших позитивные результаты одновременно по ИФА и аллергической пробе, в легких и лимфатических узлах выявлены поражения, характерные для туберкулеза, тогда как у коров, реагировавших только на ППДтуберкулин, видимые изменения во внутренних органах не обнаруживались. В связи с неблагополучной эпизоотической ситуацией по сибирской язве, ящуру и бешенства ветеринарная служба Казахстана нуждается в эффективных экспресс-тестах для мониторинга санитарного состояния объектов внешней среды. Сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина и Национального центра биотехнологии РК (НЦБ РК) разработан высокоспецифичный метод индикации возбудителя B.anthracis в почве, основанный на использовании двух видов МКА в «dot» ИФА на нитроцеллюлозной бумаге (А.К.Булашев и соавт., 2005). Чувствительность теста составляла 4 500 м.кл./мл. Кроме того, его можно использовать для обнаружения сибиреязвенных бацилл и в других объектах внешней среды (вода, корма), а также в сырье животного происхождения. Учеными двух названных научных учреждений были созданы 3 штамма-продуцента МКА к вирусу ящура и 4 гибридомы, синтезирующие антитела к вирусу бешенства и предложены методы ИФА для лабораторной диагностики упомянутых вирусных болезней (А.К.Булашев и соавт., 2005). Тест-система для идентификации антигенов вируса бешенства методом ИФА разработана и НИИ проблем биологической безопасности РК (Е.С.Жилин и соавт.,2011) . В результате проведенных исследований в 13 из 15 исследованных полевых материалах (мозг и слюна), отобранных от коров, овец, лис и корсаков, имеющих клинические признаки заболевания бешенством, выявлен антиген вируса бешенства. Полученные результаты были подтверждены испытанием аналогичной панели проб полевых материалов с использованием коммерческого ИФА-набора для диагностики бешенства (Всероссийский научно-исследовательский 38 ветеринарный институт, г.Казань). НЦБ РК и НИИ Физико-химической медицины (г.Москва) получен штамм-продуцент E.coli рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура. ИФА на основе упомянутого антигена, обладая высокой специфичностью, выявляла антитела в сыворотке крови больных коров в разведении 1:320 (К.Н.Мукантаев и соавт., 2011). Одним из многообещающих подходов повышения специфичности ИФА является использование в этом тесте антиидиотипических антител (АИАТ), т.е. «внутренних образов» исходного антигена. При этом, однажды полученные моноклональные антитела к специфичному эпитопу определенного возбудителя могут быть использованы для получения моноклональных АИАТ, которые в последующем заменят исходный антиген и исключают тем самым необходимость работы персонала патогенными микроорганизмами. АИАТ способны имитировать любые, в том числе слабоиммуногенные и слабоантигенные детерминанты гаптенов, полисахаридов, липидов, зачастую выделяемых в деградированной форме и, следовательно, лишенных части эпитопов, присущих нативной молекуле, или же сохраняющих высокую токсичность за счет особенностей экстракции. АИАТ, выступающие в роли белкового «заменителя» определенного бактериального антигена, позволяют устранять подобные препятствия и эффективно презентировать атоксичные детерминанты клеткам иммунной системы. Именно поэтому АИАТ в настоящее время успешно применяются многими исследователями в качестве «суррогата» антигена или его отдельных детерминант для индукции протективного иммунного ответа против бактериальных ЛПС, токсинов, ряда внутриклеточных паразитов – возбудителей малярии, лейшманиоза, трипаносомоза, бактериальных и вирусных инфекций и т.д. Бесспорным преимуществом подобного подхода является отсутствие необходимости предварительного выделения изучаемой субстанции. Абсолютная специфичность МКА, использованных для получения АИАТ, предопределяет их гомологию исходному антигену. Сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина были получены АИАТ к идиотипу Ат2-бета моноклональных антител, направленных на поли-Б антиген бруцелл (С.Г.Оспанова и соавт, 2009). Одним из критериев характеристики АИАТ как Ат2-бета по сообщениям ряда авторов, является способность их взаимодействовать с ксеногенными антисыворотками, специфичными к исходному антигену, так как только этот идиотип, несущий «внутренний образ» антигена, могут связывать специфические антитела. Поэтому изучалось взаимодействие моноклональных АИАТ с кроличьей поликлональной моноспецифической антисывороткой и поликлональной позитивной сывороткой крупного рогатого скота в ИФА. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммами гибридом, проявляли активность по отношению к указанным ксеногенным сывороткам в титрах от 39 1:1600-1:3200. Одним из значимых свойств Ат2-бета является их способность индуцировать синтез гомологичных антител третьего порядка (анти-АИАТ), направленных против исходного антигена. Для этой цели были проведены серии иммунизаций линейных мышей препаратами АИАТ. Сыворотки мышей исследовали в непрямом ИФА на наличие антител третьего порядка, способных взаимодействовать с исходным поли-Б антигеном бруцелл. Как показали результаты, полученные АИАТ при введении в организм животных способны стимулировать синтез антител третьего порядка (Ат3), направленных против исходного антигена. Таким образом, исследователями доказана возможность применения АИАТ в качестве антигена при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез в ИФА. Феномен антиидиотипии в диагностике кровепаразитарных болезней (пироплазмозов, анаплазмозов, нутталиозов, трипаносомозов) изучалась и Г.С. Шабдарбаевой и соавт. (2009). Ими установлено, что АИАТ к антигенам различных кровепаразитов, полученные в результате двукратной иммунизации лабораторных животных – кроликов, достаточно информативны, специфичны и их вполне можно использовать в качестве диагностикумов в таких серологических тестах, как РНГА и ИФА. Иммуноферментный анализ с использованием F(ab)2-фрагментов антиидиотипических антител вместо нативных антигенов был предложен Б.Б. Гнеденко и соавт. (2006). Ими проведено определение сывороточного содержания аутоантител к трем группам белков в норме и у пациентов с шизофренией с помощью стандартных методов и тестсистем с иммобилизованными F(ab)2-фрагментами АИАТ. Уровни аутоантител ко всем белкам у пациентов с шизофренией были выше, чем в группе контроля. Е.С.Жилин и соавт. (2011) испытали поликлональные антиидиотипические иммуноглобулины и их конъюгаты с пероксидазой хрена в ИФА для выявления антирабических антител в сыворотках животных. В результате испытаний регистрировали положительные результаты со специфическими сыворотками в независимости от вида продуцентов антирабических антител при отрицательных результатах с нормальными и гетерологичными сыворотками. Чувствительность тестсистемы в 2-4 раза превышала непрямой и конкурентный вариант ИФА. Представляют большой интерес работы, посвященные проблемам адаптации ИФА тестов условиям практики за счет удлинения срока годности иммуноферментного конъюгата. При этом изучается возможность использования иммобилизованных ферментов, искусственно связанных с нерастворимым носителем и при этом сохраняющих свои свойства. Иммобилизованные ферменты в тысячи раз стабильнее свободных. Все это обеспечивает высокую экономичность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные препараты. Одним из существенных факторов, сдерживающих широкое 40 использование ИФА на производстве, является непродолжительный срок годности иммуноферментного конъюгата (6-12 мес. при надлежащем хранении в холодильнике). А.С.Геогджаян и соавт. (2011) получили иммобилизованные ферменты и применили их в разработке диагностических тест-систем для выявления возбудителей инфекционных болезней. Технология получения иммобилизованного иммунопероксидазного конъюгата состояла из нескольких этапов: активация пероксидазы хрена; включение фермента в липосомы (или иммобилизация на алюмосиликате); иммобилизация полученных препаратов с иммуноглобулинами; очистка от не связавшихся компонентов, лиофилизация и контроль. В качестве носителя необходимо было выбрать такой, который бы не препятствовал проникновению к нему субстрата и не лишал фермент подвижности, необходимой для выполнения присущей ему функции. Иммобилизованный в липосомах материал оказывается защищенным липидной мембраной от действия неблагоприятных факторов внешней среды, благодаря чему увеличивается срок его годности. Исследователями определены оптимальные условия получения высокостабильных и специфичных иммобилизованных иммунопероксидазных конъюгатов при использовании в качестве носителей липосом и алюмосиликата. Показана перспективность иммобилизации носителей с ферментом и иммуноглобулинами. Иммунопероксидазные конъюгаты апробированы при ИФА на гомо- и гетерологичных штаммах возбудителей туляремии и лептоспироза. Срок годности разработанных препаратов увеличивается до 5 лет для липосомных и до 3 лет для алюмосиликатных иммунопероксидазных конъюгатов без снижения чувствительности и специфичности. Заслуживают внимания практиков и методы диагностики инфекционных болезней, основанные на иммунохроматографии. Так, Н.А.Бызовой и соавт. (2010) предложена иммунохроматографическая детекция клеток Mycobacterium tuberculosis. Разработаны конкурентный и «сэндвич» варианты иммунохроматографического анализа, в которых контакт пробы и тест-полоски с нанесенными иммунореагентами непосредственно инициируют движение жидкости по мембранным компонентам тест-полоски, иммунохимическое взаимодействие и формирование визуально детектируемых окрашенных зон. Показано, что и конкурентный, и «сэндвич» варианты метода позволяют определять клетки возбудителя туберкулеза в концентрации до 10 тыс. кл./мл (50-100 кл. в пробе). Преимуществом «сэндвич» анализа является возможность качественной визуальной диагностики, когда окрашивание аналитической зоны независимо от его интенсивности свидетельствует о положительном результате анализа. Жердев и соавт. (2010) разработали иммунохроматографический способ определения антител к возбудителю туберкулеза. Для детекции антител используют два антигенных реагента – иммобилизованный в 41 аналитической зоне тест-полоски антиген Mycobacterium tuberculosis и антиген, конъюгированный с частицами коллоидного золота. Благодаря наличию у антител как минимум двух антигенсвязывающих сайтов при контакте тест-полоски с пробой в аналитической зоне происходит формирование иммунных комплексов, состоящих из иммобилизованных на мембране молекул антигена, содержащихся в пробе антител к антигену Mycobacterium tuberculosis и конъюгата антигена возбудителя с частицами коллоидного золота. Комплексы определяют визуально или с использованием оптического детектора. ИФА, особенно его точечный («dot») вариант, достаточно широко используют в диагностике таких паразитарных заболеваний, как амебиозы, бабезиозы, фасциолезы, лейшманиозы, гиподерматоз, эхинококкоз и токсоплазмоз. Эта реакция имеет очевидные преимущества перед другими иммуноферментными тестами, прежде всего, в возможности проведения большого числа анализов при значительно меньших объемах исследуемого образца, расходуемых реактивов, материалов и иммунореагентов. Антитела или антигены в иммунодоте наносятся в минимальных количествах на ограниченный участок полимерного листового материала, обладающего в 80-120 раз большей сорбционной емкостью на единицу площади, чем носители с гладкой поверхностью, используемых в панельных тестах. С другой стороны, при проведении иммунодота можно обойтись без электрооборудования, что немаловажно в период массовых исследований в полевых условиях. В.Г.Бережко и соавт. (2009) испытали точечный ИФА в диагностике трихинеллеза и эхинококкоза свиней. Специфичность иммунодота при первой инвазии составила 97,4%. Наибольшее количество ложноположительных ответов регистрировали у свиней с естественной инвазией E.granulosis . По мнению авторов, с одной стороны, такой результат можно объяснить наличием общих для трихинелл и эхинококков белковых эпитопов, а с другой – он мог быть спровоцирован различными заболеваниями печени, при которых ложноположительные ответы наблюдают на антигены самых различных возбудителей. Специфичность иммунодота при эхинококкозе составила 68%. Основная причина ложноположительных результатов с сыворотками крови свиней, инвазированных C.tenuicollis , - близкое антигенное родство этого паразита с E.granulosis доказано иммунохимическим методом. В течение последних трех лет (2009-2011 гг) НИР ученыхбиотехнологов нашего университета была направлена на совершенствование методов диагностики заразных болезней животных, таких как лейкоз, эхинококкоз и описторхоз. Выбор названных болезней является неслучайным. Анализ эпизоотической ситуации показывает, что лейкоз крупного рогатого скота регистрируется почти во всех странах с высокоразвитым молочным животноводством. Инфекция наносит большой урон селекции и племенной работе, 42 сокращает сроки эксплуатации животных, снижает молочную продуктивность, качества молока и мяса. По данным ветеринарной отчетности племенных хозяйствах Казахстана доля скота, положительно реагирующего на лейкоз доходит в среднем до 6%. Оздоровительные мероприятия основаны на своевременном выявлении и изоляции из стада инфицированных животных. Однако РИД и ИФА, наиболее чаще используемые для этой цели, не всегда дают объективные результаты. Первый тест имеет низкую специфичность, а второй из-за своей высокой чувствительности могут давать ложноположительные реакции в случае использования недостаточно очищенного антигена вируса. В этой связи перед нами была поставлена задача разработать тестсистему ИФА, позволяющей по ходу анализа избавляться от нежелательных компонентов вируссодержащего материала, и тем самым способствующей сенсибилизации твердой фазы антигенами, специфичными для возбудителя лейкоза. С целью придания тестсистеме такого селективного свойства, т.е. свойства отделять специфичный антиген от балластных веществ, были испытаны МКА один из популярных на сегодняшний «инструментов» иммунологов. Продуцентами МКА явились штаммы культивируемых клеток мышей, полученные нами методом гибридомной техники. Создание штаммов-продуцентов с желаемыми свойствами - дело не из легких, но, как показывает мировая практика, однажды полученные штаммы, позволяют с лихвой окупить все расходы, предоставляя исследователям весьма ценные препараты - однородные антитела со строгой специфичностью. Иммунизацию линейных мышей проводили гликопротеидным gp51 и полипептидным p24 антигенами вируса лейкоза. В результате слияния иммунных спленоцитов с миеломными клетками получены 3 штамма гибридных клеток, синтезирующих МКА к полипептидному антигену и 6 штамма гибридом, продуцирующие антитела к гликопротеидному антигену вируса. МКА, полученные в результате культивирования штамма-продуцента в брюшной полости сингенных мышей, характеризовались высокой активностью и аффинностью по отношению к исходным антигенам. В наших исследованиях МКА были испытаны в качестве лиганды для фиксации вирусспецифического антигена к твердой фазе при постановке «сэндвич» ИФА. Лунки планшет сначала сенсибилизировали МКА, пассировали активные центры полистирола, затем вносили вируссодержащий материал. При этом антитела избирательно связывались с теми антигенами, которые в своем составе имели специфичные для них эпитопы. Отмыв лунки планшет от не связавшихся компонентов, вносили образцы сыворотки крови или молока коров. При наличии в исследуемых пробах противовирусных антител, последние связываются с другими эпитопами антигена, фиксированного к твердой 43 фазе посредством антител, образуя иммунный комплекс. Этот комплекс выявляли с помощью антибычьего конъюгата. В результате многочисленных опытов нами были определены оптимальные параметры и условия постановки ИФА для диагностики лейкоза. По своей диагностической ценности наш метод не уступал коммерческим ИФА тест-системам. Итоги исследований легли в основу лабораторного регламента изготовления и применения компонентов диагностического набора. Метод скрининга поголовья крупного рогатого скота на маркеры вируса лейкоза на основе выявления интегрированного генома возбудителя в крови был разработан сотрудниками НЦБ РК (Е.Б.Евтыхова и соавт., 2011). Образцы выделенной из крови ДНК были протестированы на наличие провируса методом мультиплексной ПЦР с использованием смеси праймеров нацеленных на ген env и на фрагмент гена актина (внутренний контроль амплификации). Детекцию амплификаторов осуществляли электрофорезом в 2%-геле агарозы. Учеными этой же научной организации (К.К.Муканов и соавт., 2011) разработана ИФА на основе рекомбинантного р24 антигена вируса для серологической диагностики лейкоза. Среди паразитарных болезней животных наибольшую тревогу вызывает эхинококкоз, так как эта болезнь наносит не только экономический, но и социальный ущерб. Люди заражаются при непосредственном контакте с собаками – пораженными половозрелыми эхинококками Echinococcus granulosis, а также при поедании овощей и плодов, загрязненных яйцами гельминта. При этой инвазии в печени, реже в легких и других органах промежуточных хозяев (с.х.животные и человек) образуются множественные кистозные образования, содержащие личинки паразита. Лечение больных животных не разработано. В редких случаях отмечается самовыздоровление животных с образованием обызвествленных эхинококковых пузырков. По клинической картине диагностировать болезнь весьма трудно. Иногда используют серологические реакций, основанные на обнаружении антител в сыворотке крови животных, такие как реакция сколекспреципитация, непрямая гемагглютинация, РДСК, а также аллергический метод. Однако, ни один из них не нашел применения в ветеринарной практике в силу низкой специфичности. Это и понятно – в этих тестах используется сложнейшая смесь антигенов гельминта. Одним словом, для искоренения болезни нужны достоверные методы диагностики, позволяющие своевременно выявлять и выбраковывать больных животных с последующей утилизацией зараженных органов под контролем ветеринарных специалистов. В своей работе мы использовали четыре вида антигена: содержимое эхинококкового пузыря, протосколексы (продукт герминативной оболочки, свободно плавающий в полости капсулы), стенка пузыря и экскреторно-секреторный антиген (ЭС-АГ), 44 выделяемый протосколексами в питательную среду в результате моделирования инвазии in vitro. Все антигены в РИД и ИФА активно взаимодействовали с антителами сывороток крови, полученных от животных с эхинококкозными поражениями. Для дальнейшей работы мы отобрали ЭС-АГ по следующим соображениям. Во-первых, белковый состав продукта жизнедеятельности эхинококка, культивируемого в искусственной питательной среде, намного проще, чем у других видов антигенов, во-вторых, методику получения антигена в условиях in vitro можно стандартизировать, и, в третьих, в случае выздоровления животных с образованием обызвествленных пузырков, естественно, прекращается иммунный ответ организма на метаболиты паразита. Протосколексы были получены из эхинококковых пузырей животных во время убоя. ЭС-АГ гельминта выделяли в результате культивирования протосколексов в жидкой питательной среде. Антиген состоял из 11 белковых фракций с молекулярными массами в диапазоне 19-63 кД. Методом гибридомной техники были получены штаммы клеток, продуцирующие антитела к детерминанте экскреторного белка с молекулярной массой 21 кД, и изучены их свойства. Принцип обнаружения сывороточных антител, специфичных к эхинококкам, был основан на применении МКА в качестве первых антител в «сэндвич» ИФА. Эти антитела избирательно взаимодействуя с ЭС-АГ способствовали сенсибилизации твердой фазы метаболитами гельминта. Как показали результаты производственного испытания, во всех случаях обнаружения паталогоанатомических изменений, характерных для эхинококкоза, выявлялись и специфические антитела в образцах сыворотки крови. Результаты лабораторного и производственного испытания были использованы в разработке нормативно-технической документации на диагностическую тест-систему. Опытная партия диагностикума передана в МСХ для регистрации в государственном реестре ветеринарных препаратов. ИФА, основанный на использовании в качестве антигенов продуктов жизнедеятельности гельминта, был испытан нами для иммунодиагностики и другой инвазионной болезни - описторхоза широко распространенного природно-очагового паразитарного заболевания человека, вызываемое гельминтом Opisthorchis felineus. Гельминт локализируется в желчных протоках печени, желчном пузыре и поджелудочной железе. Заражение человека и плотоядных животных - окончательных хозяев данного паразита, происходит при употреблении в пищу инвазированной личинками гельминта рыб семейства карповых. Болезнь протекает хронически, без выраженных клинических признаков, не всегда в образцах фекалия пациентов, больных описторхозом, обнаруживаются яйца гельминта. Предложен аллергический метод, который, как и другие тесты, основанные на 45 повышенной чувствительности замедленного типа, часто дает фальшрезультаты. Для извлечения ЭС-АГ описторхиса сначала выделяли метацеркарий из поверхностных и глубоких спинных мышц рыб, обитающих в водоемах бассейна озера Тенгиз и реки Иртыш. Надо отметить, что степень зараженности рыб была довольно высокой, и у отдельных видов она достигала 26%. Затем заражали лабораторных животных (собак, кроликов и хомяков) метацеркариями. По истечении 60 суток животных забивали, изолировали половозрелые гельминты и культивировали их в неполной среде Игла для накопления метаболитов. Методом гибридомной техники получены два штамма-продуцента, МКА которых показали высокую активность по отношению к исходному антигену. При разработке метода ИФА-диагностики описторхоза нами определялась возможность использования МКА как в качестве агента, фиксирующего антиген описторхиса к твердой фазе, так и в роли антител, вступающих в реакцию с циркулирующими иммунными комплексами (ЦИК) сыворотки крови, состоящими из молекул специфического иммуноглобулина и антигена. По данным литературы, на поздних стадиях болезни антитела, активные центры которых заняты антигенами паразита, не выявляются в серологических реакциях. Такие иммунные комплексы могут быть определены другими антителами, специфичными к свободным эпитопам антигена. Предлагаемые тест-системы апробировались на образцах сыворотки крови людей, заведомо больных описторхозом в сравнении с коммерческой тест-системой Описторх-IgG-ИФА АО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Оба варианта ИФА дали вполне сопоставимые результаты как между собой, так и со сравниваемым аналогом. Экспертиза продуктов животного происхождения на наличие в них остаточного количества антибиотиков или других биологически активных веществ становится одной из важных задач практической ветеринарии в связи с вхождением Казахстана в Таможенный союз и предстоящим вступлением его в ВТО. Присутствие контаминантов вызывают у людей аллергические реакции, дисбактериоз и другие патологии. Для определения антибиотиков в продуктах животноводства предложен ряд методов. Наиболее широкое применение нашел микробиологический метод. Несмотря на относительную надежность, метод имеет ряд существенных недостатков. К ним относят низкий уровень чувствительности и воспроизводимости результатов, необходимость постоянной поддержки в лаборатории штаммов тестмикробов. В странах ЕС, США и Японии иммуноферментный анализ является рекомендованным методом для определения остаточных количеств ветеринарных препаратов в продуктах животного происхождения. 46 Получение антител к антибиотикам является трудновыполнимой задачей, поскольку по своей химической природе они являются гаптенами и не вызывают иммунный ответ. В этой связи в наших исследованиях антибиотики сшивались с высокомолекулярными носителями (БСА, овальбумин). Эти конъюгаты и служили антигеном в гибридомной технике. Осуществив семь слияний иммунных спленоцитов с миеломной линией клеток, нам удалось получить 3 штамма–продуцента антител к гидроксильной группе молекулы стрептомицина, и по 2 штамма, синтезирующие иммуноглобулины к антигенным детерминантам хлорамфеникола (левомицетина) и окситетрациклина. Метод, предлагаемый нами для определения остаточного количества антибиотиков, основан на конкуренции свободного антибиотика, содержащегося в исследуемой пробе и антибиотика, иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за активные центры антител. Диагностическая ценность тест-системы для определения остаточных количеств антибиотиков в животноводческой продукции апробирована на пробах молока и мяса в сравнении с коммерческими аналогами. Результаты испытания свидетельствуют о возможности использования ее для экспрессобнаружения антибиотиков в продуктах питания. Таким образом, ИФА имеет все основания для того, чтобы занять свою достойную нишу в лабораторной практике ветеринарии. Контрольные вопросы: 1. Расскажите об основных результатах научной работы НИИ биотехнологии КазАТУ им.С.Сейфуллина в области совершенствования диагностики инфекционных болезней животных; 2. Основные итоги работы НИИ биотехнологии КазАТУ им.С.Сейфуллина по совершенствованию методов диагностики инвазионных болезней; 3. Чем объясняется перспективность применения антиидиотипических антител в иммунодиагностике инфекционных болезней? Лекция № 4 Биотехнология вакцин В медицине и ветеринарии широко применяются разнообразные вакцины против инфекционных болезней человека и животных. К сожалению, ряд вакцин слабоиммуногенны, либо имеют побочные эффекты, либо требуют больших производственных расходов. Рекомбинантные бактериальные вакцины. Иммуногенные свойства патогенных микроорганизмов чаще определяются конкретным белком или полисахаридной молекулой возбудителя, который кодируется одним-единственным геном. В настоящее время достижения генной инженерии дают исследователям возможность заставить прокариотную или эукариотную клетку синтезировать определенный антиген патогена, который будет служить основой для создания генноинженерной вакцины. 47 Принцип создания генноинженерных вакцин заключается в том, что в структуру ослабленных вирусов, бактерий, дрожжей или клеток высших организмов встраивается ген, который отвечает за образование антигена того возбудителя, против которого будет направлена вакцина. При этом отпадает необходимость в использовании убитых или ослабленных бактерий и вирусов, обеспечивается безопасность работников предприятий по производству вакцин, отсутствует токсичный или инфекционный материал, который часто загрязняет микробный антиген, полученный из клеточных культур, улучшается экологическая обстановка. Основным объектом приложения для генноинженерных работ стали противовирусные вакцины, что объясняется простотой организации вирусных геномов. Более сложное строение бактериальных клеток и сравнительно низкая стоимость противобактериозных вакцин являются факторами, сдерживающими развитие генно-инженерных работ. В перспективе предполагается использовать векторы, в которые встроены не только гены, контролирующие синтез антигенов возбудителя, но и гены, кодирующие различные медиаторы (белки) иммунного ответа (интерфероны, интерлейкины и др.). Первым среди возбудителей бактериальных инфекций человека внимание исследователей, занимающихся созданием генно-инженерных вакцин, привлек Treponema pallidum - возбудитель сифилиса. И это неслучайно. Во-первых, несмотря на то, что в распоряжении современной медицины имеются эффективные методы диагностики и терапии, сифилис приобрел эпидемическое распространение как в развитых, так и развивающихся странах; во-вторых, получение чистых культур бледной трепонемы представляет большие трудности, так как она не растет в искусственной среде; в-третьих, невозможно получить вакцину против него с помощью общепринятых методов, основанных на экстракции и очистке антигенов. Ловетт с коллегами (Университет шт. Калифорния) в 1982 году, используя бактериофаг в качестве вектора, ДНК этой спирохеты клонировали в клетках кишечной палочки. Генетический материал для эксперимента был выделен из яичек специально зараженных кроликов. Они получили штамм E.coli, который содержал не менее семи специфических антигенов трепонемы. Эти исследования имели своей целью разработку более специфичных тестов для диагностики сифилиса и производства эффективной вакцины (цит. по А.Сассон, 1987). В ветеринарии первой генно-инженерной противобактерийной вакциной, нашедшей применение на практике, является вакцина против колибактериозов (эшерихиозов) поросят и телят, вызываемых патогенными штаммами E.coli. Разработчик этой вакцины - голландская ветеринарная фармацевтическая компания “Intervet international”. С целью выделения белка в количествах, достаточных для получения вакцины, они клонировали ген, ответственный за синтез адгезивных 48 антигенов кишечной палочки К88 и К99, в штамме E. coli К-12. Эти антигены в комбинации с адъювантом были использованы для получения вакцины. Иммунизация коров и свиней этой вакциной вызывала образование защитных антител, которые затем передавались новорожденным с молозивом и молоком. Аналогичные вакцины были разработаны и компанией “Цетус” совместно с “Норден лэборатриз” (США) и “Тек Америка груп”. Для конструирования живых генноинженерных (рекомбинантных) вакцин необходимы три составляющие их компонентов: бактериальный вектор - носитель гетерологических протективных антигенов, гены синтеза гетерологического антигена и генетические структуры, обеспечивающие стабильную и контролируемую экспрессию протективных антигенов, способных в свою очередь индуцировать эффективную защиту иммунизированного организма. В качестве бактериальных векторов находят применение сальмонеллы, эшерихии, микобактерии, бациллы, листерии, йерсинии, коринебактерии лактобактерии и франциселлы. При создании рекомбинантных вакцин для ветеринарной медицины наиболее приемлемыми на сегодня являются вакцинные штаммы S.typhimurium, S.choleraesuis, S.dublin, S. еnteritidis, S. аbortusovis, Mycobacterium bovis (шт.BCG), Bac.subtilis, Francisella tularensis (Э.А.Светоч и соавт., 2000). Большинство исследователей в качестве бактериального вектора используют генетически охарактеризованные штаммы сальмонелл, выдвигая в пользу этого следующие аргументы: сальмонеллы могут применяться как перорально, так и парентерально, стимулируя местный и системный иммунитет, включая выработку сывороточных антител и секреторных антител слизистых, клеточно- опосредованный иммунитет и антителозависимую цитотоксичность. В ГНПЦПМ (Россия) активно разрабатываются проблемы по изучению возможности использования в качестве бактериальных векторов вакцинных штаммов Bac.anthracis. Это обусловлено в первую очередь следующими причинами: показана принципиальная возможность секреции чужеродных белков клетками вакцинного штамма сибиреязвенного микроба, неприхотливость бациллы к питательным средам и, наконец, высокая устойчивость спор Bac.anthracis, что обеспечит повышенную сохраняемость и стабильность конечных форм вакцинных препаратов. К антигенам, обеспечивающим полноценную защиту, могут быть отнесены, например, антигены адгезии и термолабильный энтеротоксин патогенных эшерихий, О- и Vi-антигены сальмонелл, холерный и дифтерийный токсины, токсины возбудителей столбняка, ботулизма, газовой гангрены, злокачественного отека, капсульные антигены чумного микроба и др. Особенно актуальной для ветеринарии является разработка комбинированной вакцины против сибирской язвы и бруцеллеза (Шумилов К.В.). Получена генетическая конструкция, в 49 которой функционируют ген летального токсина сибиреязвенного микроба и ген поверхностного белка Brucella abortus с мол. массой 31 кД (А.П Померанцев). В РосНИПЧИ «Микроб» были сконструированы генно-инженерные штаммы с клонированным геном pag, кодирующим синтез протективного антигена – основного иммуногена возбудителя сибирской язвы. Вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют и «субъединичными». Субъединичные вакцины имеют свои достоинства и недостатки. Достоинства состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызывать нежелательные побочные эффекты в организмехозяине. Недостатки заключаются в том, что очистка специфического белка стоит дорого, а конформация выделенного белка может отличаться от той, которую он имеет in situ (т. е. в составе вирусного капсида или оболочки), что может приводить к изменению его антигенных свойств. Решение о производстве субъединичной вакцины принимается с учетом всех имеющих отношение к делу биологических и экономических факторов. В ветеринарной науке определенные успехи достигнуты в разработке субъединичной вакцины против ящура. Для защиты от этой инфекции используют вакцину, содержащую вирус, инактивированный формалином. В мире ежегодно производится примерно 1 млрд. доз этой вакцины. Основной антигенной детерминантой, индуцирующей образование антител, является вирусный капсидный белок 1 (VP1, viral protein 1). Это более слабый антиген, чем интактные вирусные частицы, но все же он индуцирует образование антител и обеспечивает защиту животных от инфекции. Поэтому были предприняты попытки клонировать VPl-ген. Геном вируса ящура представляет собой одноцепочечную РНК. Поэтому сначала синтезировали полноразмерную двухцепочечную кДНК длиной примерно 8000 п. н. Затем ее расщепили с помощью рестрицируюших эндонуклеаз и клонировали полученные фрагменты в экспрессирующем E.coli-векторе. Продукт кодирующей последовательности VPl-гена идентифицировали иммунологическими методами как часть слитого (химерного) белка, синтез которого контролируется системой pL-промотор—cl-peпpeccop. Белок состоит из 396 аминокислотных остатков, содержит часть молекулы репликазы бактериофага MS2 и полноразмерный VP1-белок вируса ящура, благодаря чему он и индуцирует выработку нейтрализующих вирус антител. Получить разрешение на применение вакцины, содержащей химерный белок, очень трудно, поэтому, вероятно, придется субклонировать VP1-последовательность в другом экспрессирующем векторе. Так или иначе, субъединичная вакцина против ящура скоро 50 будет готова для проведения доклинических испытаний. В последнее время интенсивно изучаются белки теплового шока Mycobacterium tuberculosis как основа для субъединичной противотуберкулезной вакцины. С помощью ИФА и моноклональных антител к HSP65 определено наличие белков теплового шока Mycobacterium tuberculosis в сыворотках крови у больных с подтвержденным туберкулезом и в сыворотках крови у пациентов с подозрением на туберкулез (И.А.Баснакьян и соавт, 2010). HSP65 Mycobacterium tuberculosis обнаруживали в цереброспинальной жидкости у больных туберкулезным менингитом, и наличие этого антигена может считаться диагностическим маркером туберкулезного менингита. Проведены исследования наличия сывороточных антител к HSP70 , HSP65 и HSP 16 Mycobacterium tuberculosis при туберкулезе и саркоидозе. При этом обнаружен значительно более высокий уровень указанных антител в сыворотках крови у пациентов с туберкулезом и саркоидозом, чем в сыворотках крови у здоровых людей. Таким образом, доказана важная роль белков теплового шока в стимуляции иммунитета. О.А.Шараповой и соавт.(2009) были отработаны методы получения рекомбинантного белка теплового шока HSP70M Mycobacterium tuberculosis, изучены его параметры и проведен анализ HSP70M на соответствие требованиям доклинических испытаний. Шевчик Ю.С. и соавт.(2009) установлено, что рекомбинантный HSP70M Mycobacterium tuberculosis усиливает активацию врожденного и адаптивного иммунитета при совместном введении с бактериальными антигенами в эксперименте. В попытках создания более безопасной и эффективной субъединичной противотуберкулезной вакцины были изучены иммуннопротективные свойства очищенных внеклеточных белков М. tuberculosis. Из жидкой бактериальной культуры были выделены и очищены шесть основных из 100 секретируемых белков, и каждый из них по отдельности, а затем различные их комбинации использовались для иммунизации морских свинок. Животным вводили в виде аэрозоля примерно 200 живых клеток М. tuberculosis, что является для них весьма высокой дозой. Через 9-10 нед животных умерщвляли и исследовали их легкие и селезенку на предмет присутствия этой патогенной бактерии. При введении некоторых комбинаций очищенных белков потеря веса, поражение легких и селезенки и уровень смертности были такими же, как и при иммунизации живой BCG-вакциной. Теперь нужно провести сравнение эффективности белков М. tuberculosis, полученных с помощью технологии рекомбинантных ДНК, с эффективностью секреторных белков и разработать безопасную и эффективную вакцину для профилактики туберкулеза у человека. Синтетические пептидные вакцины. Далее возникает следующий вопрос: может ли небольшой участок белковой молекулы (домен) служить эффективной субъединичной вакциной и индуцировать 51 выработку антител? Интуитивно кажется, что те домены, которые доступны для антитела (т. е. те, которые находятся на поверхности вируса), обладают иммуногенными свойствами, а внутренние домены несущественны, если только они не влияют на конформацию иммуногенного домена. Если это предположение верно, то короткие пептиды, имитирующие эпитопы (антигенные детерминанты), можно использовать для создания вакцин. Идея использования синтетических пептидов в качестве вакцин родилась при изучении клеточных и молекулярных механизмов развития иммунитета. В 1974 г. М.Села впервые описал искусственно полученный пептид, вызывающий образование антител к белку лизоцима. Синтезированы и испытаны полисахариды, аналогичные естественным антигенам, например, сальмонеллезным полисахаридам. Техника рекомбинантных ДНК для получения вакцин открыла новые перспективы в разработке синтетических вакцин. Производство последних может заменить имеющиеся бактериальные и вирусные вакцины, часто содержащие посторонние антигенные детерминанты, белки и другие вещества, вызывающие побочные эффекты. Одиберт с сотр. (1981) использовали синтетический антиген дифтерийного токсина для активной иммунизации. Данный токсин представляет собой полипептидную цепь с молекулярной массой 62 кД и имеет две дисульфидные связи. Токсичность и иммуногенность белка обусловлены петлей на N-конце молекулы, состоящей из 14 аминокислот, удерживающихся дисульфидным мостиком. Синтетический пептид, связанный с двумя различными носителями, иницировал синтез антител, которые связывались с токсином и предотвращали его дермонекротическое и летальное действие. Формирования иммунитета удалось также добиться при инъекции синтетического пептида белка М Streptococcus pyogenes длиной всего 20 аминокислот. Такие иммуногенные олигопептиды могут составить основу безопасных вакцин против стрептококковых инфекций, которые вызывают ревматизм и связанные с ним поражения сердца. Дрисман с коллегами (1982) синтезировали два пептида, аналогичные таковым на участке между 117-м и 137-м аминокислотными остатками полипептидной цепи поверхностного антигена вируса гепатита В (цит. по А.Сассон, 1987). Два пептида с последовательностями от 117-й до 137-й и от 122-й до 137-й аминокислоты вводили мышам внутрибрюшинно, используя различные адъюванты. В каждой группе у половины мышей через 7-14 дней после иммунизации были обнаружены антитела против поверхностного антигена вируса. Через три недели у большинства животных титры антител уменьшались. В Исследовательском институте клиники Скриппса и Институте вирусологии животных (США) синтезированы полипептиды, соответствующие нескольким участкам белка VP1 вируса ящура. В 52 дальнейших исследованиях они обнаружили, что один из полипептидов, включающий участок от 141-й до 160-й аминокислоты VP1, при инъекции с адъювантом и в комплексе с гемоцианином улитки (KLH) иницирует у морских свинок и кроликов синтез антител к вирусу. Причем, титры антител были в несколько раз выше, чем в случае иммунизации животных очищенным белком VP1. Эти животные проявляли устойчивость к последующему заражению (Bittle et al., 1982). Кроме того, преимущество синтетического пептида заключалось и в том, что однократное введение вызывало достаточный иммунный ответ. Данный пептид вызывал образование антител в количестве, достаточном для создания иммунитета у свиней и крупного рогатого скота против ящура. Создание вакцин против ящура на основе синтетических полипептидов могло бы устранить проблемы, возникающие в связи с недостаточной инактивацией вируса и нестабильностью инактивированных вакцин при рН ниже 7 и неблагоприятном температурном режиме внешней среды. Этот подход позволил бы использовать в качестве иммуногенов синтетические пептиды, соответствующие различным серотипам вируса. Эти результаты являются весьма многообещающими, однако количество (доза) пептидного материала, необходимого для индукции иммунного ответа, примерно в 1000 раз выше, чем в случае убитой вакцины. Чтобы решить эту проблему, фрагмент ДНК, кодирующий пептид из аминокислотных остатков 142-160 VP1, сшили с геном, кодирующим коровый белок гепатита В (HBcAg). При экспрессии этого химерного гена в Е. coli или культуре животных клеток его продукты — белковые молекулы - в процессе самосборки образовывали стабильные «27нм-частицы», на поверхности которых находился пептид из VP1 вирса ящура. Эти частицы обладали высокой иммуногенностью. Таким образом, HBcAg можно использовать в качестве эффективной молекулыносителя синтетических пептидов. Сравнение иммуногенности различных пептидных вакцин, содержащих домен 142-160 VP1-белка, проведенное на морских свинках, показало, что иммуногенность химерного белка, состоящего из HBcAg и указанного домена, в 10 раз ниже, чем у инактивированных вирусов, в 35 раз выше, чем у химерного белка, содержащего -галактозидазу Е. coli и домен 137-162 из VP1 вируса ящура, и в 500 раз выше, чем у свободного синтетического пептида, состоящего из аминокислотных остатков 142-160. Поскольку синтетический пептид, сшитый с HBcAg, образует 27нм-частицы, сходные с вирусом гепатита В, и они обладают почти такой же иммуногенностью, как и интактный вирус, на основе которого получен синтетический пептид, этот подход может стать основным способом доставки пептидных вакцин к месту их действия. И все же существует несколько ограничений на использование коротких пептидов в качестве вакцин: эпитоп, использующийся для создания эффективной пептидной вакцины, должен представлять собой 53 короткий, но непрерывный участок белковой молекулы, а это бывает не всегда; конформация пептида должна быть такой же, как у эпитопа в интактной вирусной частице; изолированный эпитоп может не обладать достаточной иммуногенностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоспецифичной, относительно недорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провести еще немало исследований. В процессе разработки находятся и другие антигены, нацеленные на создание иммунитета против вирусных инфекций. Например, антиидиотипические антитела, получаемые в ответ на иммунизацию противовирусными антителами (Lerner et al., 1985; Dreesman et al., 1985). Антитела, синтезированные против антител, способных узнавать определенные антигенные эпитопы, в свою очередь, сохраняют особенности структуры данных детерминант. Как известно, антиген и антитело соответствуют друг другу как ключ замку. Другими словами, активный центр антитела является как бы слепком детерминанты иммунизирующего антигена. В результате последовательных иммунизаций исходным антигеном, а затем и антителами первого и второго поколений можно получить антитела третьего поколения, по существу повторяющие исходные антитела первого поколения, полученные при иммунизации непосредственно вирусным антигеном. Возможность использования моноклональных антител для получения антиидиотипических антител с “образом” определенных антигенов открывает новые перспективы в конструировании вакцин нового типа. Это особенно важно в борьбе с вирусными инфекциями, возбудителей которых трудно получить в достаточном количестве для разработки вакцин, а также при работе с антигенными эпитопами конформационной природы, для которых невозможно или сложно создавать химические или генно-инженерные вакцины. Антиидиотипические вакцины обладают рядом преимуществ перед традиционными профилактическими препаратами. В первую очередь иммуноглобулиновая природа АИАТ исключает возможность реверсии живого аттенуированного микроорганизма в вирулентную форму. Имитация CDR-областью (Complementarity determining regionобласть, определяющая комплементарность) АИАТ конкретного протективного эпитопа антигена обеспечивает направленную индукцию защитных антител макроорганизма, устраняя синтез антител против слабоиммуногенных и неиммуногенных детерминант микроба или компонентов химических вакцин, что значительно влияет на эффективность иммунизации. Кроме того, как известно, синтетические пептиды, соответствующие участкам первичной аминокислотной последовательности, созданные путем химического синтеза или молекулярного клонирования, не всегда способны поддерживать нативную трехмерную структуру, необходимую для индукции антител нужной специфичности и иммуногенности, что было подтверждено и на 54 модели возбудителя чумы, в отличие от АИАТ, отбираемых именно по конформационной специфичности как «зеркальное отражающих» форму антигенного эпитопа. Перспективы создания экспериментальных антиидиотипических вакцин против чумы изучались Федоровым В.А. и Девдариани (2006). Ими получены мышиные АИАТ к белкам Y.pestis c мол. Массой 72, 54, 25 и 87 кД, кодируемым плазмидой вирулентности возбудителя чумы. Для этого мышей линии BALB/с иммунизировали по оригинальной схеме МКА к каждому из антигенов. Комплементарность исходным антигенам была подтверждена с использованием иммунохимического, функционального, иммунологического и иммунобиологического критериев оценки природы «внутреннего образа» соответствующих антител. Все АИАТ реагировали с ксеногенными (кролики, лошади, морские свинки и мыши) сыворотками к исходным антигенам, индуцировали высокий уровень специфических антител с серологическими свойствами, идентичными идиотипическим МКА, демонстрировали выраженную адъювантную активность и были классифицированы как принадлежащие к субтипу АТ2-бета. Наиболее важным свойством АИАТ была способность защищать от экспериментальной чумы не менее 77-80% мышей. Авторы полагают, что АИАТ являются перспективными компонентами при конструировании профилактических препаратов против чумы. Одним из существенных преимуществ антиидиотипических вакцин перед, например, аттенуированными или рекомбинантными живыми вакцинами является возможность их экстренного однонаправленного применения с антибактериальными препаратами при чрезвычайных ситуациях природного, техногенного или биотеррористического характера. ДНК-вакцины. Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животного-мишени гена, кодирующего белокантиген. В первых экспериментах такого рода Е. coli-плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 103-104 раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для создания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью 55 подвергаются правильной посттрансляционной модификации, чем белки, синтезируемые организмами-хозяевами. Этот метод, получивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных. Плазмидная ДНК представляет собой кольцевую ковалентнозамкнутую молекулу длиной 4-6 тысяч пар нуклеотидов. В ней имеется участок, ответственный за начало транскрипции (промотор), ген протективного белка, ген, обеспечивающий устойчивость клеток к антибиотику (ампициллину), и участок репликации плазмидной ДНК. Репликация плазмидной ДНК происходит только в бактериальных клетках, тогда как транскрипция гена протективного белка осуществляется только в клетках млекопитающих. Плазмидную ДНК реплицируют в клетках кишечной палочки в присутствии ампициллина, очищают и вводят внутримышечно животным в дозе 10 –12 млрд. молекул. Плазмидная ДНК поглощается клетками животных в небольшом количестве (0,01-1,0%), а большая часть ее быстро разрушается. Проникшая в клетку ДНК транспортируется в ядро и транскрибируется клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой 2 с образованием информационной РНК, которая в цитоплазме обеспечивает синтез протективного белка. Плазмидная ДНК длительное время (до 3-6 мес.) функционирует в клетках. В организме животного плазмидная ДНК не размножается, не встраивается в хромосомы, и на нее не образуются антитела. Синтезированный в клетках протективный белок расщепляется в цитоплазматических протеосомах на короткие пептиды (8-10 аминокислот). Последние связываются с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса 1 и транспортируются к клеточной поверхности. Синтезированный протективный белок может транспортироваться из клетки в межклеточное пространство в свободном нерасщепленном состоянии. Он связывается с антигенпрезентирующими клетками (макрофагами), проникает в них путем эндоцитоза и расщепляется в эндосомах на короткие фрагменты (10-20 аминокислот). Фрагменты белка объединяются с молекулами ГКГС класса 2 и встраиваются в поверхностную мембрану клетки. На поверхности клетки комплексы антиген +молекулы ГКГС 2 распознаются Т-хелперами. В-лимфоциты под воздействием протективного белка и антигенспецифических активированных Т-хелперов превращаются в антителопродуцирующие клетки. Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей вводили раствор с Е. соli-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А, транскрипция которой находилась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или цитомегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2 нед. после иммунизации в крови 56 мышей обнаруживались антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значительно выше, чем мышей из контрольной группы. Более того, они были нечувствительны и к другому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная защита не вырабатывается при введении традиционных противогриппозных вакцин, полученных на основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая вакцина специфична лишь к одному штамму вируса. Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остаются неизмененными поверхностные антигены. К сожалению, для генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. Коровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные антигены. ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена. Судьба введенной в клетку ДНК точно неизвестна. В принципе она может интегрировать в геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Однако такое развитие событий считается крайне маловероятным. Скорее всего такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицируюшегося внехромосомного элемента, а затем разрушится. Генную иммунизацию пока используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу гриппа А, вирусу иммунодефицита человека типа I, вирусу бычьего герпеса, вирусу бешенства, Plasmodium sp., вызывающему малярию, вирусу гепатита В у животных (но не у человека), а также возбудителям микоплазмоза, туберкулеза и сальмонеллеза. В опытах на лабораторных животных показана возможность применения ДНК-вакцинации для защиты от СПИДа и др. Появляются и работы по использованию ДНК-вакцин и в ветеринарии. P.J.Lewis (1997) показали возможность использования векторных плазмид для иммунизации против вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, а W.Jiang (1998) – эффективность ДНК-вакцинации при парвовирусной инфекции собак. Протективный иммунитет наблюдали у животных, вакцинированных плазмидой, кодирующей гликопротеин С вируса болезни Ауески (V.Gerdts et al., 1997). Получены результаты по ДНК-вакцинации против вирусной диареи телят ( S.Harpin et al., 1997). Плазмида, кодирующая Hbs-антиген вируса гепатита уток В защищала их от инфекции при заражении (M.Triyatni et al., 1998). Для облегчения доставки ДНК в клетки животных при проведении 57 генной иммунизации был создан модифицированный штамм Shigella flexneri. Эта бактерия проникает в эпителиальные клетки животных путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина, где и происходят транскрипция и трансляция переносимого ею гена, находящегося под контролем эукариотического промотора. Shigella — это патогенный микроорганизм, и как таковой он не может использоваться для доставки ДНК. Ее непатогенный штамм можно получить, введя делецию в ген asd, кодирующий фермент аспартат--полу-альдегид—дегидрогеназу, который участвует в синтезе компонента клеточной стенки диаминопимелиновой кислоты. Штаммы с мутацией в asd-гене растут только в присутствии диаминопимелиновой кислоты и их можно использовать для доставки плазмидной ДНК в эпителиальные клетки животных, поскольку они в них не пролиферируют. Эксперименты, в которых в качестве вектора для доставки ДНК в клетки использовались Shigella, были проведены на морских свинках, и хотя они оказались успешными, судить о безопасности данной системы можно будет лишь после проведения клинических испытаний. Огромным преимуществом этого подхода является возможность перорального введения. В настоящее время актуальным направлением в разработке генноинженерных вакцин является конструирование различных ДНКвакцин на базе одного плазмидного вектора. При этом меняют только ген, кодирующий протективный белок. Следует отметить, что ДНКвакцины обладают безопасностью инактивированных вакцин и эффективностью живых. В одну плазмидную ДНК можно встраивать гены протективных белков нескольких возбудителей и гены цитокинов – регуляторов иммунного ответа. Проходят экспериментальное изучение ДНК-вакцины, изготовленные из вирусов иммунодефицита человека, гриппа, бешенства, гепатита В и С, простого герпеса, папилломы, а также возбудителей туберкулеза и паразитарных заболеваний (малярий и лейшманиоза). Эффективность иммунизации ДНК-вакцинами очевидна, однако потребуется еще много усилий для практической реализации нового подхода к профилактике инфекционных болезней животных. Однако остаются не решенными проблемы безопасности для человека вакцин из плазмидной ДНК. Не определена степень риска мутагенных эффектов и иммунопатологических реакций в ответ на введение ДНК-вакцины. Отсутствуют четкие представления о побочных действиях образовавшихся антигенов и медиаторов иммунного ответа. «Векторные» вакцины. В качестве эффективной живой противооспенной вакцины широко используют вирус коровьей оспы (ВКО), относящийся к роду поксвирусов. Геном этого вируса полностью секвенирован; он представляет собой двухцепочечную ДНК длиной 187т.п.н., кодирующую примерно 200 разных белков. ДНК ВКО реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток, а не в ядре, 58 благодаря наличию у вируса генов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и ферментов, осуществляющих кэпирование, метилирование и полиаденилирование мРНК. Поэтому, если в геном ВКО встроить чужеродный ген, так чтобы он находился под контролем ВКОпромотора, то он будет экспрессироваться независимо от регуляторных и ферментных систем хозяина. ВКО имеет широкий спектр хозяев (позвоночных и беспозвоночных), остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофилизации (испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными свойствами, а потому может использоваться для создания так называемых векторных вакцин. С их помощью осуществляется доставка и экспрессия в организме-хозяине клонированных генов, кодирующих антигенные белки, которые индуцируют выработку протективных антител. Геном ВКО имеет большие размеры и не содержит уникальных сайтов рестрикции, что не позволяет встраивать в него дополнительные нуклеотидные последовательности. Однако нужные гены можно вводить в геном ВКО с помощью гомологичной рекомбинации in vivo следующим образом. Сегмент ДНК, кодирующий специфичный антиген (например, HBcAg), встраивают в плазмидный вектор непосредственно после клонированного ВКО-промотора, включенного в какой-либо несущественный ген ВКО, например ген тимидинкиназы. Далее, этой плазмидой трансформируют культуру дефектных по тимидинкиназе животных клеток, обычно фибробластов куриного эмбриона, предварительно инфицированных ВКО дикого типа, который синтезирует функциональную тимидинкиназу. В результате рекомбинации между нуклеотидными последовательностями, фланкирующими промотор и ген протективного антигена, и гомологичными последовательностями вирусного генома происходит встраивание клонированного гена в вирусную ДНК. Частота таких рекомбинаций невысока, однако популяцию клеток, содержащих рекомбинантный ВКО, можно обогатить, используя селективную среду с бромдезоксиуридином. Этот токсичный аналог тимидина в отсутствие тимидинкиназы не включается в синтезируемую ДНК и не оказывает токсического действия. Дефектные по тимидинкиназе клетки-хозяева, которые содержат обычный ВКО, в присутствии бромдезоксиуридина погибают, а клетки, несущие рекомбинантный ВКО с разрывом в гене тимидинкиназы, становятся устойчивыми к его токсическому действию. И, наконец, проводят окончательный отбор с помощью ДНК-зонда, гибридизующегося с геном антигенного белка. Поскольку дефектные по тимидинкиназе ВКО спонтанно возникают с относительно высокой частотой (примерно 1 на 103—104 вирусных частиц), нередко проводят котрансфекцию клеток каким-либо селективным маркером и нужным геном. Это облегчает разграничение спонтанных мутантов и мутантов, полученных с помощью 59 гомологичной рекомбинации. В качестве селективного маркера обычно используют ген пео, кодирующий фермент неомицин-фосфотрансферазу II и обеспечивающий устойчивость к аналогу канамицина G-418. Этот ген, в отличие от других селективных маркеров, остается стабильным при встраивании в геном ВКО. Разработана специальная система, позволяющая избежать прерывания рамки считывания генов ВКО при встраивании чужеродного гена. При этом отпадает необходимость в использовании селективных маркеров, поскольку каждый образующий бляшку рекомбинантный вирус будет содержать и экспрессировать ген-мишень. ДНК ВКО дикого типа несет ген vp37, отвечающий за образование бляшек при росте вируса в монослойной культуре животных клеток. Если заменить этот ген маркерным геном Е. coli, то образуется мутантный ВКО, который не формирует бляшки при выращивании его в течение 2—3 сут в культуре животных клеток. Ген-мишень вводят в этот мутантный вирус с помощью гомологичной рекомбинации его ДНК с вектором, несущим ген vp37 и ген-мишень. Мутантный ВКО, получивший ген vp37, приобретает способность к образованию бляшек, при этом в его геном встраивается ген-мишень, а маркерный ген утрачивается. Мутантный вирус с делегированным геном vp37 не может реверсировать к дикому типу, поэтому каждая вирусная частица, образующая бляшку, содержит желаемую конструкцию. Этот метод прост, применим для переноса и экспрессии любого гена-мишени, не требует каких-либо дополнительных маркерных генов и не прерывает рамку считывания генов ВКО. В геном ВКО уже удалось встроить и экспрессировать в культуре животных клеток несколько генов антигенных белков: G-белка вируса бешенства, поверхностного антигена гепатита В, поверхностных белков вируса Синдбис, NP- и НА-белков вируса гриппа, N- и G-белков вируса везикулярного стоматита, гликопротеинов вируса простого герпеса. Некоторые из полученных на основе ВКО рекомбинантных векторов можно использовать для создания эффективных вакцин. Так, рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген гликопротеина D вируса простого герпеса типа 1, предотвращает герпесные инфекции у мышей, а рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген поверхностного антигена вируса бешенства, индуцирует выработку протективных антител у лис, основных переносчиков вируса бешенства в Европе. Векторные ВКО-вакцины позволяют провести иммунизацию сразу от нескольких заболеваний. Для этого можно использовать рекомбинантный ВКО, который несет несколько генов, кодирующих разные антигены. В зависимости от используемого ВКО-промотора чужеродный белок может синтезироваться в ранней или поздней фазе инфекционного цикла, при этом его количество определяется силой промотора. Обычно для достижения высокого уровня экспрессии используют «поздние» 60 ВКО-промоторы: pll (промотор гена, отвечающего за синтез белка мол. массой 11 кДа) или рСАЕ (промотор гена интегрального белка вируса коровьей оспы типа А). При встраивании в одну ДНК ВКО нескольких чужеродных генов каждый из них помещают под контроль отдельного ВКО-промотора, чтобы предотвратить гомологичную рекомбинацию между различными участками вирусной ДНК, которая может привести к утрате встроенных генов. Живая рекомбинантная вирусная вакцина имеет ряд преимуществ перед неживыми вирусными и субъединичными вакцинами: 1) презентация аутентичного антигена практически не отличается от таковой при обычной инфекции; 2) вирус может реплицироваться в клетке-хозяине и увеличивать количество антигена, который активирует продукцию антител В-лимфоцитами (гуморальный иммунитет) и стимулирует выработку Т-клеток (клеточный иммунитет); 3) встраивание генов антигенных белков в один и большее число сайтов генома ВКО еще больше уменьшает его вирулентность. Недостаток живой рекомбинантной вирусной вакцины состоит в том, что при вакцинации лиц со сниженным иммунным статусом (например, больных СПИДом) у них может развиться тяжелая вирусная инфекция. Чтобы решить эту проблему, можно встроить в вирусный вектор ген, кодирующий человеческий интерлейкин-2, который стимулирует Т-клеточный ответ и ограничивает пролиферацию вируса. Нежелательные побочные эффекты пролиферации ВКО можно предупредить инактивацией вируса после вакцинации. Для этого был создан чувствительный к интерферону вирус (ВКО дикого типа относительно устойчив к его действию), пролиферацию которого можно регулировать в случае возникших при вакцинации осложнений. Механизм устойчивости ВКО к интерферону оставался неустановленным, пока не была обнаружена открытая рамка считывания K3L, кодирующая белок мол. массой 10,5 кДа. Этот белок содержит аминокислотную последовательность, гомологичную N-концевой части эукариотического фактора инициации elF-2 мол. массой 36,1 кДа. Nконцевые области обоих белков содержат 87 практически идентичных аминокислотных остатков, причем в положении 51 в обоих случаях находится серин, который в elF-2 фосфорилируется активируемой интерфероном Р1-киназой, что приводит к ингибированию синтеза белка в обработанных интерфероном клетках. K3L-белок действует как конкурентный ингибитор фосфорилирования elF-2альфа, обеспечивая устойчивость ВКО к интерферону, и если из генома ВКО удалить ген K3L или его часть, то вирус станет чувствительным к интерферону. С помощью ПЦР-мутагенеза гена K3L, находящегося в составе плазмиды, и последующей гомологичной рекомбинации между ДНК ВКО и плазмидой с целью замены К3L-последовательности дикого типа модифицированным вариантом был сконструирован мутантный ВКО K3L- . Этот штамм оказался в 10—15 раз более чувствительным к 61 интерферону, чем штамм дикого типа. Эта работа является важным этапом на пути создания более безопасных ВКО-векторов. Последовательности, сходные с K3L, могут содержать и другие устойчивые к интерферону вирусы, что позволит с помощью делеций создавать их штаммы, чувствительные к интерферону. Большинство работ по созданию живых вирусных вакцин проводились на ВКО, однако в качестве кандидатов на роль векторов для вакцинации рассматриваются и другие вирусы: аденовирус, полиовирус и вирус ветряной оспы. Вектор на основе живого аттенуированного полиовируса привлекателен тем, что позволяет проводить пероральную вакцинацию. Такие «слизистые» вакцины (вакцины, компоненты которых связываются с рецепторами, расположенными в легких или желудочно-кишечном тракте) пригодны для профилактики самых разных заболеваний: холеры, брюшного тифа, гриппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма. Но до любых клинических испытаний любого на первый взгляд безобидного вируса, как системы доставки и экспрессии соответствующего гена, необходимо убедиться в том, что он действительно безопасен. Например, повсеместно используемый ВКО вызывает у людей осложнения с частотой примерно 3,0-10-6. Поэтому из генома рекомбинантного вируса, который предполагается использовать для вакцинации человека, желательно удалить последовательности, ответственные за вирулентность. Бактерии как системы доставки антигенов. Антигены, находящиеся на наружной поверхности бактериальной клетки, обладают более высокой иммуногенностью, чем локализованные в цитоплазме. Поэтому один из подходов, используемых при создании вакцин, состоит в размещении протективного антигена патогенной бактерии на поверхности живой непатогенной бактерии. Многие бактерии имеют жгутики, состоящие из белка флагеллина; под микроскопом они выглядят как нити, отходящие от бактериальной клетки. Если сделать так, что жгутики непатогенного микроорганизма будут нести специфический эпитоп патогенного микроорганизма, то можно будет индуцировать выработку протективных антител. Именно такой подход использовали при создании противохолерной вакцины. Синтетический олигонуклеотид, кодирующий эпитоп субъединицы В холерного токсина, встроили в гипервариабельный участок гена флагеллина Salmonella и полученную конструкцию ввели в дефектный по флагеллину штамм Salmonella. При этом было известно, что эпитоп, включающий 50—64 аминокислотные остатки субъединицы В холерного токсина, индуцирует выработку антител к интактному холерному токсину. Химерный флагеллин нормально функционировал, а эпитоп холерного токсина размещался на поверхности жгутиков. Иммунизация мышей с помощью интраперитонеальной инъекции примерно 5-106 живых или убитых формалином бактерий с 62 модифицированным флагеллином индуцировала выработку большого количества антител как к пептиду (50—64 аминокислотным остаткам), так и к молекуле интактного холерного токсина. Аналогичным образом можно встраивать два и даже три разных эпитопа в один флагеллиновый ген Salmonella и создать поливалентную противобактериальную вакцину. С помощью перорального введения аттенуированных штаммов Salmonella можно осуществлять доставку в организм хозяина многих бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов. Большую роль при этом играет выбор промотора, контролирующего транскрипцию чужеродного гена. Если используется слишком сильный промотор, может возникнуть метаболическая «перегрузка», сдерживающая пролиферацию бактерий. В отличие от ферментера, организм животного-хозяина не является замкнутой системой и экспрессию чужеродного гена нельзя регулировать изменением температуры или добавлением специфических метаболитов. Регуляторную роль может играть только промотор, реагирующий на те или иные сигналы. Например, работу промотора nirB E. coli можно регулировать, изменяя содержание нитритов и кислорода в среде, а наиболее активен он в анаэробных условиях. В одном из экспериментов промотор nirB использовали для контроля экспрессии гена нетоксичного иммуногенного С-фрагмента столбнячного токсина в аттенуированном штамме Salmonella. В развивающихся странах инфекция Clostridium tetani уносит более 1 млн. жизней в год. Если генетически модифицированный штамм Salmonella выращивать в аэробных условиях, то С-фрагмент столбнячного токсина синтезироваться не будет. При пероральном же введении этой бактерии тестируемым мышам С-фрагмент синтезируется, и у животных вырабатываются антитела к нему. Таким образом, штамм Salmonella, в который встроен С-фрагмент столбнячного токсина, находящийся под контролем промотора nirB, можно использовать как живую пероральную противостолбнячную вакцину. Чтобы выяснить, насколько эффективен этот подход при вакцинации человека, необходимо провести дополнительные исследования. Съедобные вакцины. Успехи в области генетической инженерии открыли новые возможности для получения рекомбинантных белков. Для этой цели широко используются клетки бактерий, дрожжей, млекопитающих и насекомых. Однако они имеют ряд существенных недостатков. В клетках прокариот не происходит посттрансляционная модификация и правильная укладка полипептидных цепей многих эукариотных белков. Клетки млекопитающих и насекомых лишены подобных недостатков, однако использование в качестве биопродуцентов ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков. По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии растения имеют ряд особенностей и преимуществ. Прежде 63 всего необходимо отметить, что в высших растениях происходит гликозилирование и фолдинг белков, сходные таковым в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, в отличие от животных, растительные клетки не содержат в составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, служат безопасным источником рекомбинантных белков. В дополнение ко всему перенос фрагментов экзогенной ДНК в растительный геном и регенерация у растений происходит значительно проще по сравнению с животными. Революционным направлением в современной вакцинологии является разработка вакцин на основе трансгенных растений, в геном которых был встроен соответствующий фрагмент генома патогенного микроорганизма. Трансгенные растения-продуценты эпитопов болезнетворных агентов получили название «съедобных вакцин». Механизм иммунизации вакцинами основан на антигенпредставляющей способности перитонеальных макрофагов тонкого кишечника млекопитающих. Секреторные иммуноглобулины IgM транспортируются на поверхность слизистой оболочки, где они связываются с чужеродными агентами и препятствуют проникновению их в организм. Следует отметить, что мукозная вакцина стимулирует как иммунный ответ слизистых оболочек - первого защитного барьера на пути патогенных объектов, так и общий иммунный ответ организма. Первая такая вакцина была получена в 1992 год: трансгенное растение табака стало продуцировать «австралийский» антиген. Полученный из растений и частично очищенный антиген, введенный мышам, вызывал мощный иммунный ответ подобно вакцине против гепатита В. В 1998 году с помощью картофеля, продуцирующего В-субъединицу холерного анатоксина, была получена выраженная защита у поедавших его мышей при заражении их холерой. В том же году 10 из 11 добровольцев, получивших по 100 г сырого картофеля, продуцирующего антигены энтеропатогенной кишечной палочки, начали вырабатывать в слизистой кишечника антитела к этому возбудителю. Сейчас испытываются «картофельные» вакцины к возбудителю диареи и гепатита В с обнадеживающими результатами. На животных испытываются вакцины против бешенства, ящура. Исследования проводятся на основе трансгенных растений картофеля, салата, кукурузы, шпината, люцерны и др. Получен иммуногенный мембранный белок Brucella abortus Omp 16 в растительных клетках табака (А.А.Чистякова, 2010). С учетом необходимости использования эти «вакцинные продукты» в сыром виде, ведутся исследования по выращиванию вакцин на растениях, которые не требуют приготовления, например, на бананах, на моркови. А.А.Какимжановой и соавт.(2011) получены полноценные трансгенные растения моркови, несущие гены антигенов возбудителя туберкулеза M.tuberculosis esat6 и cfr 10. Проведен полный цикл выращивания трансгенных растений от индукции соматических зародышей из 64 трансформированных клеток, устойчивых к антибиотику канамицину в условиях in vitro, до получения полноценных растений, способных к формированию корнеплодов. На сегодняшний день получены трансгенные растения-продуценты различных типов антител к эпитопам ряда антигенов (стафилококки, стрептококки, вирус простого герпеса, раковый эмбриональный антиген). Трансгенные растения рассматриваются и как потенциальный недорогой источник иммуноглобулинов человека и животных. Контрольные вопросы: 1. Принципы создания генноинженерных вакцин; 2. Какие микроорганизмы находят применение в качестве бактериальных векторов при создании рекомбинантных вакцин? 3. Какие вакцины называют субъединичными, синтетическими, векторными и ДНК-? Лекция №5 Биотехнология производства биопрепаратов и лекарственных веществ До появления генной и клеточной инженерии многие лекарственные препараты удавалось получать только в небольших количествах, их производство обходилось очень дорого. Предполагалось, что с помощью новой технологии можно будет получать весь спектр таких препаратов в количествах, достаточных для применения на практике. И эти ожидания оправдались. На сегодняшний день клонировано сотни генов различных белков, гормонов и ферментов человека и животных. Большинство этих генов уже экспрессированы в клетках хозяев, и сейчас их продукты проходят проверку на возможность применения для лечения различных болезней и повышения продуктивности животных. Бычий соматотропин (гормон роста крупного рогатого скота). Еще в 1930-х гг. было показано, что введение гормона роста коровам в значительной степени повышает их удойность. Поскольку получение природного гормона в больших количествах весьма трудоемко и дорого, он не нашел широкого применения в молочной промышленности. С помощью технологии рекомбинантных ДНК ген соматотропина был клонирован в Е. coli, синтезированный рекомбинантный гормон выделен из бактериальных клеток и очищен. Как и ожидалось, удойность коров, которым был введен рекомбинантный препарат, увеличилась на 25— 30%. Соматотропин, содержащийся в молоке, был исчерпывающим образом проверен на безопасность. У коров, получавших рекомбинантный гормон, его концентрация в молоке была не выше, чем у контрольных животных. Более того, препарат неактивен в организме человека, и все тесты на токсичность не выявили никаких побочных эффектов. Используя все доступные результаты исследований, FDA пришла к выводу, что как мясо, так и молоко коров, получавших рекомбинантный препарат, безопасны для человека. Это заключение 65 поддержало Ведомство по оценке технологий США после того, как был проведен независимый анализ многочисленных данных по тестированию бычьего соматропина. Тем не менее, рекомбинантный бычий соматотропин не был принят обществом с распростертыми объятиями. Одна мощная лоббирующая группа выступила единым фронтом за то, чтобы разрешение к использованию рекомбинантного гормона, выданное FDA, было заблокировано. В основе ее действий лежали экономические соображения, касающиеся последствий применения рекомбинантного препарата для молочной промышленности. Члены группы считали, что это приведет к разорению многочисленных мелких молочных ферм, поскольку для получения того же количества молока понадобится меньше коров. Кроме того, высказывалась обеспокоенность, что молочная промышленность будет монополизирована крупными корпорациями в ущерб интересам независимых производителей. По-видимому, эти экономические аргументы были обоснованными и уж, конечно, любая группа людей имеет право протестовать против того, что может представлять угрозу для ее существования. Однако основной причиной рекламной кампании, развернувшейся против использования соматотропина, послужило соображение, что «гормоны, полученные генноинженерными методами», могут нанести вред человеку и вызвать образование злокачественных опухолей. То, что для получения гормона роста использовалась технология рекомбинантных ДНК, еще более повысило эмоциональный накал. Помимо экономических аргументов, противники соматотропина высказывали соображение, что его использование увеличит частоту бактериальных инфекций молочных желез (маститов) у коров. Это потребует применения большего количества антибиотиков, что приведет к повышению их концентрации в молоке и, в свою очередь, может вызвать аллергические реакции у людей, употребляющих такое молоко в пищу. Кроме того, повышение количества антибиотиков может привести к усилению давления отбора и к появлению устойчивых к ним патогенов. Однако Консультативный комитет по ветеринарии при FDA, проведя соответствующий анализ, пришел к выводу, что частота маститов у коров, получавших рекомбинантный соматотропин, не выше, чем у коров, не получавших этого препарата. Рекомбинантный соматотропин был лицензирован в США для применения в молочной промышленности в 1994 г. Однако во многих других страна до сих пор существует временный запрет на продажу молока от коров, получающих такой гормон. По-видимому, этот запрет обусловливается социально-экономическими причинами, а не обеспокоенностью возможным влиянием данного препарата на здоровье людей. Многие высказывавшиеся вначале опасения, связанные с производством и потреблением пищевых продуктов, полученных с 66 помощью технологии рекомбинантных ДН99999К, постепенно рассеялись после того, как FDA и аналогичные организации в других странах обеспечили выполнение всех процедур, необходимых для оценки возможного риска от использования таких продуктов. Производители предпочитают, чтобы число тестов, которые должен пройти тот или иной продукт — начиная с этапа разработки и заканчивая поступлением на рынок, было минимальным. Двойная ответственность при этом ложится на правительственные организации. Они должны заботиться об охране здоровья общества в целом и в то же время - об устранении лишних барьеров на пути внедрения новых разработок. Со временем, по мере накопления новых данных, жесткость существующих норм может быть ослаблена и приняты более простые тесты. Очень важно, чтобы все эти изменения не вводились для удобства, в ущерб безопасности. Антибиотики относятся к вторичным метаболитам – низкомолекулярным соединениям, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста, т.е. в идиофазе, благодаря чему их еще называют идиолитами. Биологическая роль антибиотиков обозначаются ролью в обеспечении конкурентного существования в среде обитания, путем подавления жизнедеятельности других групп микробов. Антибиотические вещества продуцируют в основном различные группы почвенных микроорганизмов, относящиеся к актиномицетам, бактериям, мицелиальным грибам. Это сапрофиты, аэробы, гетеротрофы. Среди почвенных анаэробов, ацетоно-бутиловых, дисульфатирующих, пропионовокислых бактерий редко встречаются антибиотикопродуценты, поскольку конкурентная среда анаэробами создаётся путём накопления метаболитов брожения: бутанола, пропионовой, уксусной кислоты, этанола, а также за счёт продукции сульфидов, сероводорода и др. Продуценты антибиотиков отсутствуют и среди уксусно-кислых, тиоловых, метилотрофных бактерий. Эти аэробы как бы вне конкуренции, так как окружающие микроорганизмы не используют их специфический субстрат либо не могут существовать в сильно кислых условиях, которые они создают. Доминирующее положение среди продуцентов антибиотиков занимают актиномицеты. Известно более 4000 антибиотиков, продуцируемых этой группой микроорганизмов. Только один вид актиномицетов Str. griseus продуцирует около 50 антибиотических соединений. Известно более 1000 антибиотиков бактериального происхождения, продуцируемые почвенными, спорообразующими бактериями из рода Bacillus. Мицелиальные грибы являются продуцентами беталактамных антибиотиков - пенициллина и цефалоспорина, а также их полусинтетических производных. Основные продуценты грибы родов Penicillium, Cephalosporium (Acremonium). 67 Антибиотики, синтезируемые актиномицетами подразделяются на: тетрациклины (хлор-, окситетрациклины и их производные (доксициклин, метациклин) - Str. rimosus, Str. aureofaciens); аминогликозиды (стрептомицин - Str. griseus, неомицин - Str. fradiae; канамицин - Str. kanamyceticus и др.); макролиды (эритромицин - Str. (saccharopolyspora) erythraeus, олеандомицин - Str. antibioticus); ароматические соединения (хлорамфеникол - Str. venezuelae); полиеновые (амфотеррицин В, нистатин - Str. neurasei); рифамицины (рифампицин - Str. (Nocardia) mediterranei); антрациклины и противоопухолевые (блеомицин - Str. verticillius). Тетрациклины, аминогликозиды, макролиды и ароматические соединения ингибируют трансляцию белка на рибосомах прокариот. Полиеновые антибиотики нарушают проницаемость цитоплазматической мембраны возбудителей лейкозов. Рифамицины ингибируют РНК - полимеразу бактерий. Антрациклины нарушают репликацию ДНК. Бактерии продуцируют антибиотики пептидной природы: Bacillus brevis -грамицидин С, Bacillus polymyxa - полимиксин В, Bacillus licheniformis - бацитрацины. Пептидные антибиотики нарушают проницаемость цитоплазматической мембраны прокариот. Мицелиальные грибы, продуцируют беталактамные антибиотики и их производные, ингибирующие синтез пептидогликана -компонента клеточных стенок грамотрицательных и ,особенно, грамположительных микроорганизмов: пенициллины (пенициллин и их полусинтетические производные, P. chrysogenum, P. notatum); цефалоспорины (цефалоспорин С и производные С.chrysogenum, С.acremonium); цефамицины (цефамицин С, цефоксин и др.). В мире ежегодно производится антибиотиков почти на 20 млрд долларов. К числу антибиотиков относятся важнейшие противомикробные и противоопухолевые препараты. Следовательно, они нашли широкое применение в медицине и ветеринарии, пищевой и консервной промышленности, сельском хозяйстве. В медицинской и ветеринарной практике они используются при лечении человека и животных от всевозможных инфекций. В пищевой и консервной промышленности используется низин (Str. lactis) с целью консервирования пищевых продуктов. Низин кроме обычных аминокислот, содержит лизин, гистидин, пролин, метионин, изолейцин, а также редко встречающиеся серосодержащие альфа - лактионин и бета - метиллантионин. Подавляет рост стрептококка, стафилококка, бацилл. Добавление его к консервированным продуктам позволяет снижать температуру и продолжительность стерилизации и тем самым сохранить их вкусовые и питательные качества. В животноводстве как кормовая добавка, стимулятор роста применяются более 20 антибиотиков (биомицин, террамицин, гризин, флавомицин и др.). 68 Микробиологический синтез начинается с подготовки среды культивирования. Субстрат должен давать хороший рост микроба, должна быть дешевым и доступным. Среда стерилизуется предварительно в биореакторе влажным паром под давлением. Одновременно идет подготовка посевного материала, чистая культура штамма-продуцента наращивается последовательно в колбах, лабораторных и опытно-промышленных ферментерах. Следующая этап – это аэробная, глубинная, периодическая ферментация в течение 7-10 суток. В процессе ферментации поддерживается температура, рН, рО2, происходит постоянное перемешивание культуральной среды, используются химические и механические способы пеногашения. Затем проводится обработка ферментативной биомассы: фильтрация, если антибиотики в культуральной жидкости; если антибиотики в клетках, то осаждение антибиотиков в осадок вместе с клетками, потом их выделение из клеток. В процессе выделения и очистки антибиотиков используются методы экстракции, ионообменной сорбции, осаждения и т.д. Выделенный в гомогенном состоянии антибиотик высушивается при помощи распылительной или лиофильной сушки, стабилизируется с целью сохранения биологической активности, придается лекарственная форма. Синтез новых антибиотиков. Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генноинженерные манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Один из первых экспериментов, в ходе которого был получен новый антибиотик, состоял в объединении в одном микроорганизме двух немного различающихся путей биосинтеза антибиотика. Одна из плазмид Streptomyces, рIJ2303, несущая фрагмент хромосомной ДНК S. coelicolor длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены ферментов, ответственных за биосинтез из ацетата антибиотика актинородина, представителя семейства изохроманхиноновых антибиотиков. Целую плазмиду и различные субклоны, несущие части 32,5 т.п.н.-фрагмента (например, рIJ2315), вводили либо в штамм АМ7161 Streptomyces sp., синтезиурующий родственный антибиотик медермицин, либо в штамм В1140 или Tu22 S. violaceoruber, синтезирующие родственные антибиотики гранатицин и дигидрогранатицин. Все указанные антибиотики являются кислотно-щелочными индикаторами, которые придают растущей культуре характерный цвет, зависящий от рН среды. В свою очередь рН (и цвет) среды зависят от того, какое соединение синтезируется. Мутанты родительского штамма S. coelicolor, не способные синтезировать актинородин, бесцветные. Появление окраски после трансформации штамма АМ-7161 Streptomyces sp. либо штаммов В1140 или Тu22 S. violaceoruber плазмидой, несущей все или несколько генов, кодирующих ферменты биосинтеза 69 актинородина, свидетельствует о синтезе нового антибиотика. Трансформанты штамма АМ-7161 Streptomyces sp. и штамма В1140 S. violaceoruber, содержащие плазмиду pIJ2303, синтезируют антибиотики, кодируемые и плазмидой, и хромосомной ДНК. Однако при трансформации штамма Tu22 S. violaceoruber плазмидой рIJ2303, наряду с актинородином синтезируется новый антибиотик — дигидрогранатиродин, а при трансформации штамма АМ-7161 Streptomuces sp. плазмидой pIJ2315 синтезируется еще один новый антибиотик — медерродин А. В структурном отношении эти новые антибиотики мало отличаются от актинородина, медермицина, гранатицина и гидрогранатицина и, вероятно, образуются в том случае, когда промежуточный продукт одного пути биосинтеза служит субстратом для фермента другого пути. Когда будут детально изучены биохимические свойства различных путей биосинтеза антибиотиков, появится возможность создавать новые уникальные высокоспецифичные антибиотики, манипулируя генами, которые кодируют соответствующие ферменты Усовершенствование производства антибиотиков. С помощью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью Streptomyces spp. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культуры Streptomyces его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется и выход антибиотика снижается. Чтобы решить эту проблему, можно, во-первых, изменить конструкцию биореакторов, в которых выращивается культура Streptomyces, а вовторых, используя методы генной инженерии, создать штаммы Streptomyces, более эффективно использующие имеющийся кислород. Эти два подхода не исключают друг друга. Одна из стратегий, используемых некоторыми аэробными микроорганизмами для выживания в условиях недостатка кислорода, состоит в синтезе гемоглобинподобного продукта, способного аккумулировать кислород и доставлять его в клетки. Например, аэробная бактерия Vitreoscilla sp. синтезирует гомодимерный гемсодержащий белок, функционально подобный эукариотическому гемоглобину. Ген «гемоглобина» Vitreoscilla был выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю гемоглобина Vitreoscilla приходилось примерно 0,1% всех клеточных белков S. coelicolor даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla, а не промотора Streptomyces. Трансформированные клетки S. coelicolor, растущие при низком содержании растворенного кислорода (примерно 5% от насыщающей концентрации), синтезировали в 10 раз больше 70 актинородина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую скорость роста, чем нетрансформированные. Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода. Моноклональные антитела как лекарственные средства. Возможность использования радиоактивных МКА в терапии рака была впервые показана в 1979-80 гг при лечении больных с неоперабельным первичным раком печени (Медицинская школа Университета Джона Гопкинса, шт. Мэрилэнд). Такое лечение оказалось эффективнее обычной химио- и радиотерапии. Одним из эффективных противораковых препаратов растительного происхождения является рицин - токсин из семян клещевины. В условиях in vitro этот токсин разрушает не только раковые, но и нормальные клетки, так как они обладают способностью связываться с поверхностью любых клеток. Поэтому, необходимым условием является именно селективность связывания. Рицин по своей структуре как бы создан для выполнения такой задачи. Он состоит их двух полипептидных цепей: А-цепь несет токсические детерминанты, а В-цепь содержит участок, распознающий галактозу, что и позволяет рицину связываться с клеточной мембраной. В НИИ Клен-Миди в Монпелье (Франция) были очищены А-цепи рицина с целью конъюгирования ее с противоопухолевыми МКА. Без Вцепи рицин приобретал специфичность связывания благодаря антителам и не попадал в нормальные клетки (Casellas P. and Gros P., 1982). Такие иммунотоксины распознавали антигены, свойственные для некоторых опухолей мышей и новообразований человека. Доказано, чтобы убить здоровую клетку, нужно в 1000-100000 раз больше яда, чем для уничтожения раковой клетки. В экспериментах на животных иммунотоксины показали высокую избирательность действия и убивали злокачественные клетки in vitro. МКА нашли применение в выделении биологически активных веществ (белков, гормонов, токсинов) из сложных смесей. Одним из первых препаратов, очищенных с помощью МКА, был интерферон. При этом антитела пришивались к углеводным гранулам и использовались для приготовления колонки с иммуносорбентом, на котором очищали грубый препарат интерферона. После одного пассажа через колонку с иммобилизованными МКА препарат очищался в 5000 раз. МКА способны также нейтрализовать действие лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантанта, и аутоантител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (некоторые формы диабета, рассеянный склероз, ревматические болезни). Они нашли применение и в усилении действия лекарственных средств на клеткимишени, устраняя при этом побочные явления, имеющие место при обычной химиотерапии рака. Например, МКА были встроены внутрь липосомных пузырков. Последние, пересекая клеточную мембрану, транспортируют молекулы лекарственного препарата до определенного 71 органа (в соответствии со специфичностью связанных с ними МКА), где и оставляют свое содержимое. Лекарственные вещества, проявляющие высокую активность при тестировании in vitro (обычно в культуре клеток), зачастую оказываются значительно менее эффективными in vivo. Kажущееся снижение их активности объясняется тем, что они не достигают органа или клеткимишени в нужной концентрации. Увеличение дозы принимаемого препарата не решает проблему, поскольку при этом часто возникают побочные эффекты. Более того, чтобы избежать таких эффектов, многие терапевтические cpедства заведомо вводят в дозах, не достигают оптимальных, что дополнительно снижает их эффективность. Для облегчения доставки лекарственного вещества к месту его действия используют несколько приемов: а) заключает его в особые частицы – липосомы, липидная оболочка которых имеет высокое сродство к нужным органам; б) встраивают гены специфических токсинов в инфильтрирующие опухоль лимфоциты, которые освобождают эти токсины непосредственно в опухоли; в) присоединяют молекулы лекарственных веществ к моноклональным антителам, специфичным по отношению к белкам, имеющимся на поверхности клеток, например опухолевых; г) используют лекарственные вещества в неактивной форме, переводя их в активное состояние при помощи ферментов. Для того, чтобы такое превращение происходило только вблизи клеткимишени, фермент присоединяют к моноклональному антителу, специфичному к поверхностному антигену этой клетки. Для эффективной работы последней из описанных приемов необходимо, чтобы а) моноклональное антитело, связанное с ферментом, переводящим лекарственное вещество в активную форму, было в достаточной степени очищено и имелось в нужном количестве; б) связывалось с высокоспецифичным для клетки-мишени белком: в) было стабильным в физиологических условиях, но в то же время быстро выводилось из кровотока; г) при необходимости могло проникать в опухолевую ткань, обеспечивая действие препарата на все ее клетки. В этом случае мишенями оказываются строго определенные клетки, что позволяет использовать лекарственное вещество в гораздо меньших дозах, чем при прямом введении. Применение в такой системе моноклональных антител мыши может приводить к развитию иммунного ответа, поэтому очень важно использовать фрагменты антител человека или антител, максимально сходных с ними по структуре. Приведем один пример из медицинской практики. Тромбоэмболия мозговых или сердечных артерий становится наиболее частой причиной смерти людей. Тромб состоит из молекул фибрина, фактора связывающей системы крови, образующего сеть в ответ на повреждение сосудистой стенки. В норме молекулы фибрина в образовавшемся тромбе расщепляются с помощью плазмина сериновой протеиназы, 72 который образуется из плазминогена под действием активатора. Однако нередко эта биологическая система работает недостаточно эффективно, что приводит к закупорке артерий. В таких ситуациях для повышения уровня плазмина в крови было предложено использовать активатор плазминогена в качестве терапевтического средства. Однако плазмин способен разрушать и предшественник фибрина фибриноген, и если уровень последнего в результате терапии с использованием активатора плазминогена снизится слишком сильно, могут произойти обширные внутренние кровотечения. Это привело к необходимости создания тромболитических препаратов, разрушающих только фибрин в тромбе. Ученые исходили из того, что если к активатору плазминогена «пришить» антитело, специфичное к фибрину, то будет происходить только локальное повышение концентрации плазмина вблизи тромба. Для проверки этой гипотезы тканеспецифичный активатор плазминогена был присоединен к моноклональному антителу, специфичному в отношении фибрина. Испытания на модельных системах показали, что комплекс присоединялся к сгусткам крови и лизировал их, не вызывая значительного разрушения фибриногена. Были созданы и другие типы конъюгатов антитело—активатор плазминогена, тоже приводящие к локальному образованию плазмина, разрушающего кровяные сгустки. Несмотря на кажущуюся перспективность иммунотерапии, этот метод имеет и ряд ограничений, связанных с применением моноклональных антител мышей. Применение МКА для лечения людей и сельскохозяйственных животных может привести к развитию аллергических реакций, поэтому очень важно использовать гомологичные иммуноглобулины. Мышиные МКА, как чужеродные белки, при многократном введении вызывают сенсибилизацию пациента. Создание видовых антител представляет собой довольно трудную задачу, поскольку получение антител человека или домашних животных путем традиционной гибридомной технологии сталкивается с рядом проблем (отсутствие эффективных клеточных линий миеломы, иммунизация человека не проводится по соображениям этического характера и др.). Для получения гибридом сельскохозяйственных животных необходимо иметь перевиваемые линии миеломных клеток, полученных от определенного вида скота. Описаны различные плазмоцитомы лошадей, коров, свиней, а также собак, кошек и кроликов (P.Pastoret, 1982), однако они не отвечают тем требованиям, предъявляемым для миеломных клеток. Например, известные до сегодняшнего дня перевиваемые линии сельскохозяйственных животных не имеют стабильных маркеров, обусловленных с генной мутацией клеток. Поэтому некоторыми исследователями проведена работа по получению гетерологичных МКА путем слияния мышиных плазмоцитомных клеток с лимфоцитами домашних животных. Так, S.Sricumaran et al.(1983) 73 получили гибриды из миеломы мыши и лимфоцитов быка, продуцирующие иммуноглобулины в большей степени похожие на Ig крупного рогатого скота. Описаны гибридомы мышь+бык, синтезирующие МКА против К99 антигена E.coli (D.V.Anderson et al., 1987) и коронавируса крупного рогатого скота (T.J.Raybould et al., 1985). D.J.Groves et al., (1987) получили гибридому мышь+овца, продуцирующую МКА к тестостерону, а T.J.Raybould et al.(1984) описали гибридому мышь+свинья. K.H.Nielsen and M.D.Henning (1989) путем слияния лимфоцитов периферической крови иммунизированной коровы с плазмоцитомой мыши получили гибридому-продуцента МКА крупного рогатого скота против липополисахаридов Brucella abortus. Антитела, вырабатываемые межвидовой гибридомой, слабо агглютинировали клетки бруцелл при нейтральном рН, однако в кислой среде их агглютинобельность заметно повысилась. Эти антитела не преципитировали ЛПС в РИД, однако проявляли активность в РСК и непрямом ИФА, хотя не могли конкурировать с гомологичными мышиными МКА. Тем не менее, межвидовые гибридомы, как и следовало ожидать, оказались не стабильными в части продуцирования МКА. Следовательно, для получения гомологичных для человека и животного МКА необходимо разрабатывать другие подходы. Производство антител с помощью Е. coli. Гибридомы, подобно большинству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела очень дороги, что не позволяет широко использовать их в клинике. Чтобы решить эту проблему, были предприняты попытки создания своего рода «биореакторов» на основе генетически модифицированных бактерий, растений и животных. Для эффективной доставки и функционирования некоторых иммунотерапевтических средств зачастую достаточно одной антигенсвязывающей области антитела (Fab- или Fv-фрагмента), т. е. присутствие Fc-фрагмента антитела необязательно. Суть методики получения функциональных антител с помощью Е. coli состоит в следующем: используя мРНК, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоцитов), синтезируют кДНК. Затем проводят раздельную ПЦР-амплифицикацию кДНК, кодирующих Н- и L-цепи. После чего амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага . кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей. Далее, кДНК 74 одной Н- и одной L-цепи встраивают в общий «комбинаторный» вектор, так что в бактериофаге синтезируются обе цепи и образуется «полноценный» Fv-фрагмент. Синтез Н- и L-цепей происходит во время литического цикла бактериофага , поэтому можно провести скрининг библиотеки клонов комбинаторных бактериофагов с целью определения их антигенсвязывающей активности. На этапе соединения кДНК Н- и L-цепей в одном векторе образуется широкий спектр генов различных антител. Некоторые из них кодируют уникальные сайты связывания, получить которые с помощью обычной гибридомной технологии было бы невозможно. Пул антител млекопитающих включает 106—108 разных антител. Фаговая библиотека содержит примерно столько же клонов, поэтому можно ожидать, что одна комбинаторная библиотека будет вырабатывать такое же количество различных антител (Fv-молекул), как любое млекопитающее. Кроме того, однажды создав исходную комбинаторную библиотеку, можно комбинировать L- и Н-цепи и получать Fv-фрагменты, распознающие необычные эпитопы. Еще большего разнообразия можно достичь, используя неспецифический мутагенез. Поскольку за относительно короткое время можно провести скрининг миллионов фаговых бляшек, идентификация Fv-фрагментов с нужной специфичностью занимает от 7 до 14 дней. Для сравнения: скрининг нескольких сотен гибридомных клеточных линий обычно занимает месяцы. Векторы на основе бактериофага не очень пригодны для получения больших количеств белковых молекул. Чтобы решить эту проблему, сконструировали такой вектор, в котором ДНК Н-и L-цепей встраиваются в сайт, фланкированный плазмидной ДНК. Такую плазмиду, содержащую ДНК Н- и L-цепи, можно вырезать из вектора и трансформировать ею Е. coli. Являясь частью плазмиды, ДНК Fvфрагментов будет многократно реплицироваться в клетках Е. coli образованием большого количества продукта, который можно использовать как в диагностических, так и в терапевтических целях. Скрининг комбинаторной библиотеки фрагментов антител можно провести при помощи ИФА. Суть метода состоит в следующем: образцы (аликвоты) из библиотеки помещают в ячейки планшеты, содержащие антиген-мишень. Ячейки промывают, чтобы удалить несвязанные фаговые частицы. В каждую ячейку вносят конъюгат, состоящий из антитела, связывающегося с белком фаговой оболочки и фермента. Ячейки промывают для удаления несвязанного конъюгата и добавляют в каждую из них хромогенный субстрат, который расщепляется ферментом, связанным с фагом, и окрашивает те ячейки, в которых находятся фаговые частицы, несущие антитела, к антигену-мишени. Выделив фаг, синтезирующий желаемый фрагмент антитела, можно экстрагировать кодирующую этот фрагмент ДНК и субклонировать ее в экспрессирующем векторе. Таким образом, методы биотехнологии 75 открывают новые обнадеживающие перспективы в создании уникальных лекарственных средств и биопрепаратов для нужд медицины и ветеринарии. Контрольные вопросы: 1. Назовите причины, сдерживающие применение в животноводстве гормона роста крупного рогатого скота? 2.Какие антибиотики, синтезируемые актиномицетами, нашли широкое применение в ветеринарии и животноводстве? 3. Расскажите о современных подходах в технологии производства антибиотиков; 4.Приведите примеры использования моноклональных антител в терапевтических целях; 5. Получение моноклональных антител с помощью кишечной палочки. Лекция №6 Микроманипуляция с эмбрионами животных Получение однояйцевых близнецов. Основной предпосылкой проявления естественного многоплодия у млекопитающих является одновременное оплодотворение не менее двух вышедших из фолликулов зрелых яйцеклеток разными сперматозоидами. Крупный рогатый скот характеризуется малой частотой двойневости – в среднем 0,025. Среди двойневых телят иногда встречаются однояйцевые двойни. Вероятность появления таких генетически идентичных близнецов составляет всего 0,01%. Низкие показатели частоты двойневости и ее наследуемости не позволяют рассчитывать на высокую эффективность селекции. Поэтому большую практическую значимость приобретает совмещение методов копирования генотипов высокопродуктивных животных на основе разделения ранних эмбрионов методами микрохирургии и микроманипуляции на два или более бластомеров, способных развиваться в процессе всего онтогенеза, т.е. способных проявить свою тотипотентность. Возможность микроманипулирования с отдельными эмбрионами была доказана еще в 1936 году G Pincus. Он вводил одиночные бластомеры из 2-клеточного эмбриона кролика в яйцевод ложнобеременной крольчихи. Эмбрионы нормально развивались с дифференциацией их клеток до стадии бластоцисты (стадии 2-х, 4-х и 8ми бластомеров; стадия морулы; стадия бластоцисты). Затем было получено потомство у кроликов и мышей из 2-клеточных эмбрионов (стадия 2-х бластомеров) с разрушением одного бластомера путем прокола его иглой. Эти исследования служили основой для дальнейшего совершенствования техники микроманипулирования с эмбрионами животных, и в частности для получения однояйцевых близнецов. Последнее имеет большое значение для интенсификации животноводства, так как способствует увеличению выхода молодняка от одного донора и позволяет получать генетически идентичные двойни. О получении однояйцевых двоен у овец путем разделения 2клеточного бластомера впервые сообщил S.M.Willadsen в 1979 году. Он 76 разделил бластомеры на две отдельные клетки, а нарушенную зону пеллюцида (образование, предотвращающее рассыпание бластомеров, а также контакт их с другими эмбрионами, чужеродными клетками, лейкоцитами, сперматозоидами и облегчающее прохождение эмбриона через яйцепровод) закупоривал агаром. Заключение разделенных бластомеров в агар, который практически нерастворим в половом тракте самки, позволяло им выживать и развиваться in vivo. Для культивирования заключенных в агар эмбрионов в качестве временных реципиентов использовались овцы (лигатированный яйцевод овцы является наиболее подходящим объектом и для развития эмбрионов коровы, лошади и свиньи вплоть до бластоцисты). Выживаемость ”половинок” эмбрионов на этой стадии развития после трансплантации реципиентам составила около 50%. У овец 2-клеточные бластомеры можно получить только в течение очень короткого периода времени. Так, спустя 60 часов большинство эмбрионов находятся на 4-клеточной стадии развития. Из-за значительных колебаний интервалов между инъекцией сыворотки жеребых кобыл (СЖК) и началом охоты, началом охоты и началом овуляции почти невозможно во время операции найти у овцы эмбрионы, находящиеся на 2-клеточной стадии. Поздние опыты показали, что генетически идентичные двойни могут быть также получены из 4- и 8- клеточных бластомеров путем разделения их на две группы. Такие “половинки” оказались одинаково жизнеспособными, как нормальные эмбрионы овец. Установлено, что эмбрионы, полученные из отдельных бластомеров 8-клеточных не обладают жизнеспособностью. Предполагают, что резкое уменьшение числа клеток эмбриона является основным фактором, понижающим их способность развиваться в жизнеспособные бластоцисты. Для получения однояйцевых близнецов была с успехом применена техника заключения в агар разделенных на части бластомеры эмбрионов крупного рогатого скота. Так, В 1981 году S.M.Willadsen со своими коллегами получили телят - однояйцевых близнецов. Исследования были проведены на 5-6-дневных эмбрионах на стадии морулы, поскольку у коров более целесообразно получать зародыши нехирургическим путем. Морулы были разделены на “половинки” или “четвертинки”, заключены в агар и перенесены в лигатированный яйцевод анэстральной овцы на 1-2 суток. Затем их извлекали и трансплантировали хирургическим способом реципиентам на 6-й и 7-й день полового цикла. При этом приживляемость “половинок” была достаточно высокой (75%), тогда как этот показатель у “четвертинок” был значительно ниже (41%). Причем, у последних приживляемость была ниже и той, которая была отмечена ранее после пересадки “четвертинок”, полученных из пары 8-клеточных бластомеров. Авторы приходят к выводу о том, что способность разделенных эмбрионов коровы регулировать свое развитие при уменьшении числа клеток в значительной степени сохраняется даже на стадии морулы. W.R. Allen и 77 R.L. Pashen (1984) в экспериментах на лошадях доказали возможность получения однояйцевых близнецов по аналогичному методу с использованием 2-8-клеточных бластомеров. G.Brem et al. (1983) разработали технологию получения однояйцевых близнецов с использованием 6-суточных эмбрионов (морул), полученных нехирургическим способом. Эмбрионы фиксировали пипетками. С помощью микроножа разрезали зону пеллюцида, а затем стеклянными иглами открывали разрез. Через отверстие вводили микронож или стеклянную нить для разрезания морулы на две половины. Одну половинку эмбриона оставляли в собственной зоне пеллюцида, а другую помещали в прозрачную зону неоплодотворенного ооцита крупного рогатого скота. По данным авторов, приживляемость разделенных эмбрионов составила 60%. Из всех имплантированных эмбрионов получено 50% пар близнецов; каждый третий разделенный эмбрион давал пару близнецов. Последующие эксперименты по получению монозиготных двоен были нацелены на использование поздних морул и бластоцист, поскольку на этих стадиях развития для эмбрионов большинства животных защита со стороны зоны пеллюцида несущественна. S.M.Willadsen и R.A.Godke (1984) осуществляли разделение эмбрионов овцы на стадиях поздней морулы, ранней, поздней и вылуплившейся бластоцисты на две равные половинки с разрезом зоны пеллюцида. При этом часть половинок эмбрионов оставалась внутри разорванной зоны пеллюцида, а другие были трансплантированы без нее. Половинки эмбрионов пересаживали тем же овцам, у которых их извлекали. 16 из 18 овец окотились: 7 гол. принесли одинцов, 8 гол. - однояйцевых двоен и 1 голова - неоднояйцевую двойню. Причем, не выявлено значение зоны пеллюцида в развитии разделенных бластоцист. Приживляемость половинок эмбрионов на стадии поздней морулы и ранней бластоцисты была почти вдвое ниже (42%), чем на стадии поздней и вылупившейся бластоцисты (79%). Исследователями не получено ни одной однояйцевой двойни после трансплантации эмбрионов, разделенных на стадии морулы, тогда как после пересадки бластоцист, разделенных на всех трех стадиях развития, получены однояйцевые близнецы. Имеются сообщения и о возможности использования эмбрионов коров и свиней на более поздних стадиях развития для получения однояйцевых близнецов (Willadsen, 1981; Zambeth et al., 1983; Baker et al., 1984; Rorie et al., 1985). Эффективным тестом для оценки выживаемости половинок эмбрионов является культивирование их в течение 2-4 часов в период между разделением и пересадкой. Культивирование половинок эмбрионов в течение ночи или более чем 12 ч сопровождалось заметным снижением их выживаемости. Получение химерных животных. Понятие химера означает составное животное. В современном понятии термин химера 78 используется главным образом при получении составных организмов, у которых генетически разные клеточные популяции происходят более чем от одной зиготы или более чем от одного зародыша. Получение химер или генетических мозаиков в настоящее время является одним из перспективных направлений биотехнологии. Сущность такого биотехнологического метода, основанного на достижениях клеточной инженерии и микроманипуляции на ранних эмбрионах, заключается в искусственном объединении эмбрионов клеток двух и более животных, относящихся не только к одной породе, но и к разным породам и даже видам. Животные-химеры несут признаки разных генотипов. Это достигается путем объединения бластомеров от двух или более эмбрионов или введения клеток одного эмбриона в полость бластоцисты другого эмбриона. Все до сих пор известные в науке экспериментальные химеры млекопитающих созданы методами агрегации двух (или более) генотипически разнородных зародышей или путем микроинъекции клеток внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона-реципиента. Первый метод получил название агрегационный, второй – инъекционный. Fehilly et al. (1984) получили сложные химерные эмбрионы овец путем объединения 2-, 4- и 8-клеточных бластомеров. Каждый из таких зародышей состоял из равного количества бластомеров эмбрионов от 2-8 родителей. Результаты обследования 48 ягнят в 2- мес. возрасте показали, что 36 гол. являются химерными по анализам крови, по внешним признакам или по тем и другим показателям. Спустя год Butter et al. получили химерных ягнят путем инъекции внутренней клеточной массы, выделенной из зародышей доноров, в бластоцисты эмбрионов реципиентов. Из полученных 15 ягнят 5 гол. были определены химерами по группам крови и 1 голова по внешним признакам. Brem et al. (1985) получили химеры у крупного рогатого скота путем соединения половинок 5-6-дневных эмбрионов. 2 теленка из 7 имели признаки химеризма. Один теленок по масти был химерой бурой швицкой и голштино-фризской, хотя группу крови он унаследовал у родителей голштино-фризской породы. Другой теленок был неопределенной химерой. Church et al. (1985) получили химерных телят путем слияния морул без зоны пеллюцида. Они установили, что передача химере каждого родительского типа носит случайный характер, т.е потомство может развиваться из клеток, происходящих или от любого эмбриона, или от сочетания эмбрионов. Наиболее показательно получение химер от слияния клеток зародышей разных видов животных. Известно, что ни овца, ни коза не вынашивают гибридное потомство до родов. Как правило, плоды от экспериментальной гибридной беременности у овец и коз к концу 2-го месяца погибают. Непосредственной причиной абортов при межвидовых беременностях считается усиление иммунологических реакций материнского организма на антигены плода, что ведет к нарушению 79 функции плаценты. Fehilly et al. (1984) показали, что бластомеры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 4-5 сут. в лигатированный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные бластоцисты, которые являются жизнеспособными и могут развиваться до рождения нормального потомства. В результате слияния по одному бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы и козы получено 17 бластоцист, трансплантация которых завершилась рождением 7 ягнят. Все они были похожи в основном на ягнят, но у 3 из них руно имело поперечные валики и лоскуты волос, резко контрастирующие с плотно вьющейся шерстью. Объединив 8-клеточные эмбрионы овцы и козы, исследователи получили 5 потомков, похожих на ягнят, но 2 из них были с аналогичными отклонениями по шерстному покрову, 2 потомка были похожи на козлят с некоторыми отклонениями в шерстном покрове у одного из них. Животные с внешними признаками химеры имели группы крови овцы, за исключением одного потомка, у которого определены группы крови родителей обоих видов. Приведенные результаты экспериментов свидетельствуют о возможности осуществления трансплантации химерных эмбрионов между близкими видами животных. Межвидовые трансплантации могут оказать неоценимую помощь в сохранении исчезающих видов от вымирания, поскольку обычная трансплантация эмбрионов может дать малую пользу, так как самки-реципиенты не всегда могут быть в достаточном количестве. Техника получения химер может найти применение и в выведении животных с желательными хозяйственными признаками, а также резистентных к определенным болезням. Химерные животные не передают потомкам характерную для них генетическую мозаичность. Подобно гетерозиготным или гибридным животным у потомков происходит расщепление, в результате чего нарушаются ценные генетические комбинации. Хотя химерные животные поддерживают хозяйственно важные признаки лишь на протяжении одного поколения, в разведении крупного рогатого скота они могут представлять большой практический интерес. Например, можно создать химерных животных, сочетающих такие признаки, как молочная и мясная продуктивность, которые являются антагонистами и несовместимы в одном организме. Создание инъекционных химер путем введения в эмбрион определенных линий клеток позволит улучшить иммунную систему и повысить устойчивость к ряду болезней. Получение клонированных животных. Клонирование животных - это получение идентичных потомков путем пересадки ядер эмбриональных клеток в половые клетки с удаленными ядрами. Получение от высокопродуктивной коровы-донора пяти 32-клеточного бластомера и пересадка каждого ядра в энуклеированную яйцеклетку позволяет получать от донора одновременно 160 эмбрионов. При повторении этой процедуры с полученными “вторичными” эмбрионами 80 открываются возможности получения неограниченного количества потомков. Впервые осуществили пересадку ядер на амфибиях Бриггс и Кинг в 1952 году. Они показали, что ядра из ранних эмбриональных клеток сохраняют способность к дальнейшему развитию после пересадки их в энуклеированные яйцеклетки. Ядра специализированных, т.е. прошедших глубокую дифференциацию, соматических клеток взрослых лягушек утрачивали тотипотентность (свойство клеток полностью реализовать свой потенциал развития с образованием целого организма), и в лучшем случае развитие генетических копий происходило до ранних стадий головастиков. Ими же установлено, что ядра из зародышей на более поздней стадии развития, а также из менее развитых эмбрионов при пересадке в яйцеклетку не дробятся. Newport и Korscher (1982) объясняют это дифференциацией эмбриональных клеток, которая проявляется на стадии перестройки мидбластулы, т.е. на стадии, при которой зародыш начинает продуцировать собственную РНК. Первое сообщение об успешной пересадке ядер млекопитающих на примере мышей появилось в 1981 году (Illmense and Hoppe). В данном эксперименте ядра извлекались из клеток внутренней массы бластоцисты и микропипеткой пересаживались в зиготу другой линии мышей. Этой же пипеткой удаляли из зиготы ее пронуклеусы. После культивирования зиготы in vitro до стадии бластоцисты эмбрионы трансплантировали реципиентам – мышам третьей линии. Полученные 3 потомка как по генотипу, так и по фенотипу были идентичны с линией мыши-донора. В 1986 году Willadsen осуществил пересадку ядер на овцах. Он извлекал неоплодотворенные яйцеклетки через 30-33 часа после обработки их хорионическим гормоном в начале охоты. Зона пеллюцида над полярным тельцем яйцеклетки разрезалась тонкой стеклянной иглой. Через час после выдерживания яйцеклетки в фосфатной среде с цитохалазином полярное тельце с окружающей его цитоплазмой отсасывалось. Таким образом удавалось разделить примерно 90% яйцеклеток на две части с интактными клеточными мембранами, каждая из которых содержала примерно половину цитоплазмы. Цитологический анализ показал, что примерно 75% тех половинок, которые были удалены с полярным тельцем, содержали хромосомы, т.е. были “ядерными” половинками яйцеклетки, тогда как другие половинки из тех же ооцитов не содержали ядерных структур, т.е. оказались энуклеированными. Одиночные бластомеры из 8- или 16клеточных эмбрионов вводились под зону пеллюцида энуклеированной яйцеклетки. Слияние ядра с цитоплазмой клетки осуществлялось с помощью вируса Сендай или электрического тока. Клетки заключались в агар и пересаживались в лигатированные яйцеводы овцы. Через 4-5 дней оценивали развитие эмбрионов. Стадии бластоцисты достигали от 33% до 48% эмбрионов. В данном опыте пересадка 3 из 4 бластоцист сопровождалась рождением потомства. Эти ягнята были получены из 81 эмбрионов, в которых бластомер из 8-клеточного зародыша был пересажен в энуклеированную половинку неоплодотворенной яйцеклетки. В другом эксперименте была достигнута суягность от пересадки эмбрионов из 16-клеточных бластомеров. Prather et al. (1987) пересаживали бластомеры из двух 32клеточных зародышей коров в энуклеированные ооциты после созревания in vivo и in vitro путем электрослияния. Ооциты, извлеченные через 36 часов после начала охоты и использованные в качестве реципиентов ядер эмбриональных клеток, чаще достигали стадии морулы или бластоцисты, чем яйцеклетки, созревшие in vitro или извлеченные через 48 часов после начала охоты. Достигнуто 7 стельностей после трансплантации 19 эмбрионов 13 телкам. У 2 телок родились живые телята. Приведенные данные дают основание полагать, что с совершенствованием эффективности техники пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные ооциты можно получать множественные копии из единичного эмбриона. Получение гомозиготных диплоидных потомков. При чистопородном разведении традиционно используют линейное разведение, целью которого является поддержание высокого генетического сходства с выдающимся родоначальником. Это достигается путем умеренного инбридинга и целенаправленного отбора. Животные таких линий, имея высокую степень гомозиготности, отличаются большим генетическим сходством. При этом внутри линии создается высокая фенотипическая однородность в отношении физиологических и морфологических признаков. К сожалению, создание инбредных животных требует много времени, так как это связано с расщеплением и рекомбинацией генов, низкой плодовитостью и большим интервалом между генерациями. Метод получения гомозиготных диплоидных потомков во многом сходен с технологией пересадки ядер из соматических клеток в энуклеированную зиготу. Однако в последнем случае получаются гетерозиготные животные, а не гомозиготные по всем генам одного из родителей. Сущность метода заключается в следующем. Из зиготы, находящейся на стадии двух пронуклеусов, микрохирургически удаляют мужской или женский пронуклеус, в результате чего в ней остается только один гаплоидный набор хромосом – мужской или женский. Для развития зиготы, содержащей гаплоидный набор хромосом, требуется ее активация или восстановление диплоидного набора. С этой целью проводят кратковременную инкубацию гаплоидной зиготы в растворе с цитохалазином В. Последний препятствует первому клеточному делению, но активизирует деление ядра и диплоидизацию оставшегося пронуклеуса. Как только произошло деление ядра, зародыш отмывают от него, чтобы не происходило увеличение числа наборов хромосом. Проведенные опыты с пересадками пронуклеусов между зиготами мыши показали, что у млекопитающих для нормального развития 82 эмбриона вплоть до рождения необходимы как мужские, так и женские пронуклеусы. Предполагают, что диплоидный геном, полученный только от одного из родителей одного пола, не может обеспечить нормальное развитие эмбриона. Считают, что отцовский геном требуется для формирования внезародышевых тканей, а материнский – для прохождения определенных стадий эмбриогенеза. Новые данные нуждаются в теоретическом осмыслении и экспериментальном подтверждении. Предстоят глубокие и многолетние исследования для преодоления методических трудностей в получении гомозиготных диплоидных животных. Определение и регулирование пола. Получение животных определенного пола является не только биологической, но и практической проблемой. Это особенно важно для молочного скота, у которого главный хозяйственно полезный признак – молочная продуктивность – относится к признакам, ограниченным полом. Поэтому возникает крайне важная задача регулирования соотношения полов, необходимого для эффективного разведения животных. Генетический механизм определения пола обеспечивает расщепление потомков по полу в соотношении 1:1. Известно, что парный набор гомологичных половых хромосом ХХ в кариотипе млекопитающих определяет развитие самки, а гетерогенных ХY-хромосом – самца. В течение многих лет ведутся работы по разделению сперматозоидов, несущих Х- и Y - половые хромосомы. С этой целью были испытаны разные методы: центрифугирование, седиментация, электрофорез, фильтрация, цитофлуорометрия, иммунологические и др. Наиболее перспективным из них является метод, основанный на применении лазера. Установлено, что спермии с Х- хромосомами содержат больше ДНК, чем спермии с Y- хромосомами, а положительные или отрицательные заряды клеток зависят от количества ДНК. При использовании лазера спермии вначале проходили флюоресцентную обработку, после чего их пропускали через лазерный луч и под воздействием отрицательно и положительно заряженных пластин они отклонялись в соответствующую сторону. В настоящее время данный метод внедряется в производство фирмой «Sexing Technologies Navasota Texas». По данным производителя однополой спермы при использовании флуоресцентного красителя и мощного фотоумножителя с помощью проточной скоростной лазерной цитометрии возможно выделить фракции содержащие до 92% клеток с Х- или Y-хромосомой. С 2008 года однополая сперма поставляется и в Казахстан. Контрольные вопросы: 1. Расскажите о методах получения однояйцевых близнецов, предложенных разными исследователями; 2. В чем практическая значимость химерных животных (генетических мозаиков)? 3. Чем отличается метод получения гомозиготных диплоидных потомков от технологии клонирования животных?; 4. Какой из методов регулирования пола животных внедряется в животноводство Казахстана? 83 Лекция №7 Оплодотворение вне организма С разработкой техники нехирургического извлечения эмбрионов у коров появилась возможность многократно получать зародыши без операционного вмешательства или убоя животного. Однако эффективность данного метода извлечения эмбрионов сравнительно низка (3-4 эмбриона за одно извлечение). К этому следует добавить, что данный прием позволяет получать эмбрионы, поступившие в матку на стадии морулы и бластоцисты. Для генетической и клеточной инженерии необходимы зародыши на стадии зиготы (одноклеточных эмбрионов), которые можно извлечь из яйцеводов только операционным путем. Существующие способы гормонального контроля времени овуляции у домашних животных не обладают точностью, следовательно, имеются большие трудности в получении зигот, необходимых для микрохирургии, путем естественного оплодотворения. В этой связи разработка техники оплодотворения вне организма имеет огромное значение в решении научных задач и практических вопросов, направленных на повышение эффективности разведения животных. С освоением техники оплодотворения in vitro появилась возможность развивать исследования по клеточной и генетической инженерии на млекопитающих и особенно на домашних животных. Какие практические задачи могут быть решены с помощью техники оплодотворения вне организма животного? Во-первых, проблема получения необходимого количества эмбрионов для трансплантации остается еще нерешенной, хотя трансплантация эмбрионов в настоящее время проводится достаточно успешно. Самки-доноры непредсказуемы в системе трансплантации эмбрионов, что объясняется высокой вариабельностью количества овулирующих животных и числа овуляций. Во-вторых, данный метод позволил бы получить значительно больше эмбрионов для трансплантации от животных с высоким генетическим потенциалом. Можно было бы создавать банки генетического материала путем сбора яичников у высокоценных самок во время убоя, что способствовало бы значительному ускорению селекции животных. В-третьих, метод оплодотворения in vitro намного быстрее и требует для работы значительно меньше спермы, а также может быть использован для объективной оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов и яйцеклеток. В-четвертых, метод помогает селекционерам в преодолении бесплодия вследствие нарушения функций яйцеводов и матки. Вызывание суперовуляции, по мнению ряда исследователей, служит причиной повышенной эмбриональной смертности из-за изменения концентрации и соотношения половых гормонов. И, наконец, рассматриваемая техника позволяет получить сколь угодно много однояйцевых двоен, повысить эффективность использования семени от высокоценных быков. 84 Созревание яйцеклеток вне организма. Экстракорпоральному оплодотворению предшествует культивирование ооцитов in vitro, во время которого происходит их созревание до метафазы 2. Спонтанное возобновление мейоза ооцитов, выделенных из фолликулов кролика и культивируемых в питательной среде, было открыто в 1935 г. Пинкусом и Энзманом. Причем ооциты проходили последовательно все стадии созревания до метафазы 2, то есть до стадии оплодотворения без какихлибо гормональных воздействий. Позже это явление было установлено у яйцеклеток других видов животных. К моменту рождения телки ее яйцеклетки достигают уже диплотенной стадии профазы мейоза (специфического вида клеточного деления), типичной лишь для половых клеток. При этом образованные половые клетки содержат одинарный (гаплоидный) набор хромосом. В диплотенной стадии гомологичные хромосомы расходятся, между ними образуется продольная щель. На этой стадии мейоза дальнейшее созревание ооцитов приостанавливается до физиологической зрелости особи. Важную роль в подавлении мейоза играют клетки гранулезы и некоторые компоненты фолликулярной жидкости. После подъема уровня лютенизирующего гормона in vivo или извлечения ооцитов из фолликулов ингибирующее действие прекращается и мейоз возобновляется. При этом, как было отмечено выше, продолжается процесс созревания яйцеклетки до метафазы 2, т.е. ооциты дозревают до стадии, пригодной для оплодотворения. Однако следует отметить, что этот процесс не равнозначен созреванию, которое проходит ооцит in vivo до его овуляции. В условиях культивирования ооцитов «в пробирке» происходит лишь созревание ядра без участия цитоплазмы. Вследствие этого in vitro созревшие ооциты не способны к дальнейшему развитию после оплодотворения, так как в этом процессе большую роль играют цитоплазматические факторы, ответственные за формирование структуры белков. Motlik, Fulka (1976) показали, что в процессе нормального развития ооцита после оплодотворения играют важную роль вещества, выделяемые из зародышевого пузырька в цитоплазму. Thibault et al. (1976) установлено, что для обеспечения полного физиологического созревания ооцита необходимы стероидные гормоны. Moor, Trounson (1977) отмечают, что культивирование яйцеклеток овец в среде 199 с добавлением фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и лютеинизирующего гормона (ЛГ) по сравнению со средой без гормонов обеспечивает достижение метафазы большим числом ооцитов. Аналогичные результаты были получены и на коровах Fukui et al. (1982) при использовании эстрадиола, прогестерона, лютеинизирующего и хорионического гормонов. Отмечено заметное влияние половых стероидных гормонов (эстрадиола, прогестерона, тестостерона) на эффектиность созревания яйцеклеток, тогда как влияние гонадотропинов (ФСГ, ЛГ) было незначительным. Исследования Dielman et al. (1983) показали, что в процессе созревания ооцитов содержание половых стероидных гормонов в 85 фолликулярной жидкости коров подвергается значительным изменениям. Так, в первые 6 часов после выброса ЛГ в фолликулярной жидкости отмечается высокая концентрация эстрадиола (гормона, вырабатываемого яичником, надпочечником, а также плацентой и семенниками), затем она резко снижается и к 20 часам уменьшается более чем в 10 раз по сравнению с исходной. Аналогичные изменения претерпевает и содержание тестостерона в фолликулярной жидкости. Более стабильный уровень в течение упомянутого периода отмечен у прогестерона. Содержание последнего резко повышалось непосредственно перед овуляцией. Эти данные доказывают необходимость создания нестатической концентрации половых гормонов в культуральной среде в процессе созревания яйцеклеток. Moor, Trounson (1977) для повышения полноценности развития ооцитов использовали метод культивирования их внутри интактных фолликулов. В их экспериментах после трансплантации осемененной овце культивируемых in vitro ооцитов в изолированных фолликулах развитие до бластоцисты происходило у 26-50% яйцеклеток. Пересадка бластоцист в 63% случаев завершалась рождением ягнят. Позже было установлено, что многие явления внутри фолликулярных клеток, включая биосинтез стероидов и синтез белков, регулируют гонадотропные гормоны. Поэтому последние должны быть обязательным компонентом среды при культивировании ооцитов с фолликулярными клетками. Staigmiller, Moor (1984) с целью выяснения роли фолликулярных клеток в созревании ооцит культивировали их вместе без кумулюса (клетки на поверхности блестящей оболочки яйцеклетки), ооциты с кумулюсом или ооциты с кумулюсом и фолликулярными клетками. Культивирование осуществляли в среде ТС 199 с 10% фетальной сывороткой плода и гонадотропинами (ЛГ, ФСГ и пролактин) и эстрадиолом. Ооциты культивировали при 37 С в течение 24 часов в СО2 - инкубаторе при медленном покачивании, а затем пересаживали в яйцевод овцы в охоте. Сперму вводили перед пересадкой яйцеклеток в оба рога маток. Через 10-12 дней эмбрионы извлекались из матки и классифицировались по категориям. Результаты показали, что культивируемые in vitro ооциты без кумулюса в дальнейшем не развивались. Добавление фолликулярных клеток в культуральную среду без кумулюса не улучшило способность яйцеклеток к развитию, так как 83% ооцитов остались на одноклеточной стадии. Ооциты с кумулюсом, но без фолликулярных клеток, в 87% случаев остались одноклеточными. Развитие до вылупившейся бластоцисты у 37% ооцитов отмечалось при добавлении фолликулярных клеток с кумулюсом. В другом опыте культивирование оплодотворенных ооцитов с кумулюсом и слоем подлежащих грануляционных клеток (клетки молодой незрелой соединительной ткани обеспечивают энергетический субстрат ооциту) обеспечило развитие 43% клеток до бластоцисты, а после пересадки их 86 реципиентам эмбриональная выживаемость достигала 63%. Добавление фолликулярных клеток к данному комплексу не оказало существенного влияния на развитие клеток. Результаты исследований свидетельствуют о том, что для развития оплодотворенных ооцитов требуется определенное критическое количество фолликулярных клеток, в то время как их присутствие для проявления мейоза не обязательно. Соматические клетки, служат не только энергетическим субстратом для ооцитов, но и участвуют в переносе некоторых предшественников аминокислот, нуклеотидов и фосфолипидов в ооцит. Фолликулярные клетки генерируют инструктивные сигналы, которые влияют на ядро и прямой синтез определенных структурных белков. Эти сигналы очень важны для созревания ооцитов в первые 6-8 часов после инициации мейоза. Изменение сигналов ведет к нарушениям в онтогенезе эмбриона. Неслучайно метод культивирования изолированных фолликулов признан многими исследователями как наиболее современный способ, применяемый для подготовки ооцитов к оплодотворению в условиях in vitro. Этот метод дает возможность сохранить естественные связи между ооцитом и соматическими элементами фолликула. В данном случае фолликул выступает в роли биофабрики стероидных гормонов. Сущность метода заключается в следующем. Фолликулы выделяют из яичников во время убоя скота и доставляют их в лабораторию в среде ТС-199. Яичники промывают стерильным физиологическим раствором, содержащим антибиотики, а затем разрезают скальпелем в месте вхождения в него сосудов. Фолликулы хорошо заметны на поверхности разреза. С помощью пинцета фолликулы отделяют от соединительной ткани и культивируют в СО2 – инкубаторе в упомянутой среде с добавлением 20% фетальной сыворотки плода и гормонов СЖК, ФСГ, ЛГ, эстрадиола и инсулина в течение 48 часов. В таких условиях примерно до 70% ооцитов созревают до стадии метафазы 2. Оплодотворение in vitro. Оплодотворение ооцитов «в пробирке» в настоящее время достигнуто у более 20 видов животных. В 1968 г. появилось первое сообщение о нормальном потомстве, полученном от мышей, в 1974 г. – от крыс, а в 1981-1984 гг – от крупного рогатого скота, свиней и овец. Оплодотворение ооцитов in vitro означает, что сложные физиологические процессы, протекающие в организме беременной самки, должны проходить в относительно простых и статических условиях. Важным этапом в разработке метода оплодотворения in vitro было открытие явления капацитации сперматозоидов Chang, Austin (1951). Ими установлено, что оплодотворение наступает только в том случае, если сперматозоиды предварительно в течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе самки. В это время они претерпевают определенные физиологические изменения и становятся способными к оплодотворению. Считают, что капацитация 87 сперматозоидов представляет собой прежде всего изменения или удаление протеина и других макромолекулярных субстанций в плазматической мембране спермия. Через плазматическую мембрану вымываются протеолитические ферменты, необходимые для пенетрации зоны пеллюцида. Продолжительность капацитации сперматозоидов мыши и хомяка в матке и in vitro составляет 1-2 ч, крыс - 5-6 ч, тогда как кроликов в матке - около 6 ч, а in vitro - около 10 ч. Chang (1959) впервые получил потомство после пересадки яйцеклеток, оплодотворенных in vitro сперматозоидами, капацитированными в матке кролика. После отработки условий капацитации сперматозоидов в половом тракте самки проводились опыты по капацитации in vitro. Для этой цели вначале в среду добавляли яйцеводную и фолликулярную жидкости или сыворотку крови. Позже была достигнута капацитация и оплодотворение in vitro у мышей в среде, содержащей бычий сывороточный альбумин и приуват натрия без добавок биологических жидкостей. Основной средой для капацитации сперматозоидов и оплодотворения in vitro у мышей крыс и хомяков был раствор КребсаРингера, содержащий глюкозу, сывороточный альбумин, лактат и пируват натрия. Oliphant, Brackett (1973) с помощью иммунологических методов показали, что процесс капацитации включает удаление или перестройку компонентов семенной плазмы, которые покрывают поверхность сперматозоидов. Эти же исследователи предложили метод капацитации сперматозоидов in vitro, который заключался в следующем. Сперматозоиды отмывали от семенной плазмы суспензированием в дефинитивной изотонической или гипертонической среде и центрифугировали. Надосадочную жидкость сливали, а осадок снова суспензировали в свежей среде. Затем их инкубировали в среде в течение 20 мин, после чего подвергали центрифугированию при комнатной температуре. В последующем сперматозоиды инкубировали в водяной бане при 38С. Оплодотворение in vitro проводилось следующим образом. Ооциты с кумулюсными клетками собирали с поверхности яичника и помещали в маленькие чашки Петри, содержащие дефинитивную среду. Оплодотворение проводили путем добавления примерно 1 млн. сперматозоидов в чашку, содержащую свежеовулировавшие яйцеклетки, после чего гаметы инкубировались во влажной камере с 5% СО2 в воздухе при 38С. Исследователями были пересажены 176 двух- и четырех-клеточных эмбрионов. Из них 24 эмбриона, или 13,1%, имплантировались, но большинство из них рассосалось. В дальнейших опытах была определена оптимальная концентрация сперматозоидов для оплодотворения in vitro ооцитов лабораторных животных. Установлено, что при оплодотворении in vitro головки сперматозоидов проникают через зону пеллюцида у хомяков за 3-7 мин. У мышей и крыс продолжительность проникновения 88 капацитированных сперматозоидов через зону пеллюцида и превращения головки сперматозоида в мужской пронуклеус составляет примерно 2 ч, а дробление оплодотворенной яйцеклетки наступает через 30 ч. Л.К.Эрнст и соавт. (1983) осуществили экстракорпоральное оплодотворение без предварительной обработки сперматозоидов. В этих опытах сперму быков дважды промывали в средах Бринстера или ТС 199. Авторы заключают, что главным в оплодотворении является полноценное созревание яйцеклеток. Процент дробящихся ооцитов был одинаковым, когда созревшие яйцеклетки осеменяли капацитированными и некапацитированными сперматозоидами. По мнению исследователей, капацитация сперматозоидов – естественный процесс, завершающийся при прохождении через клетки кумулюса у зоны пеллюцида яйцеклетки. Если яйцеклетка полноценна и окружена клетками кумулюса, то и капацитация сперматозоидов протекает нормально к моменту их контакта с зоной пеллюцида. Достигнутые результаты на лабораторных животных позволили ученым в начале 70-х годов приступить к разработке метода оплодотворения in vitro у домашних животных. Необходимо отметить, что если большинство экспериментальных исследований выполнялось на ооцитах после созревания in vivo, то аналогичные опыты с с.-х. животными проводились в основном на яйцеклетках, предварительно культивируемых in vitro с целью их дозревания. Sreenan (1970) и Trounson et al. (1977) не наблюдали проникновения сперматозоидов в яйцеклетки коров, пересаженные в яйцеводы кролика, куда введены сперматозоиды быка. Результат был положительным в случае использования в качестве инкубационной системы для ооцитов яйцеводов овцы. Iritani, Niwa (1977) оплодотворили ооциты коров in vitro сперматозоидами, выдержанными в течение 12-14 ч в яйцеводе эстрального кролика. Эти же исследователи проводили опыты по капацитации сперматозоидов быка в изолированном половом тракте эстральной коровы. Сперму помещали в изолированный половой тракт коровы (рог матки и яйцевод), предварительно отмыв ее раствором Кребса-Рингера. После введения сперматозоидов яичниковый конец яйцевода, маточно-трубное соединение и шеечный канал матки лигатировали и помещали половой тракт в физраствор на 3-4 ч при 37С. Затем промывали яйцеводы и рога матки с целью извлечения сперматозоидов, и последние вносили в среду с культивируемыми яйцеклетками на 18-21 ч. При этом оплодотворение яйцеклеток с образованием двух пронуклеусов было достигнуто в случае использования сперматозоидов, капацитированных как в яйцеводе (7%), так и в роге матки (6%). Дальнейшее совершенствование описанной техники позволило Iritani в 1980 году достичь оплодотворения 22-26% ооцитов. Эти яйцеклетки дробились до 2-4-клеточной стадии в условиях in vitro и in vivo. В этих опытах было установлено, что для капацитации 89 сперматозоидов быка в половом тракте коров или самок другого вида требуется от 4 до 6 ч. Оплодотворение яйцеклеток коров спрематозоидами, капацитированными in vitro, было достигнуто в конце 70-х годов. Для этой цели Bracett et al. (1978) использовали физиологическую среду с высокой ионной силой. В этих опытах, в отличие от предыдущих экспериментов, в которых применялись ооциты после дозревания in vitro, яйцеклетки извлекались из предовуляторных фолликулов или из яйцеводов вскоре после овуляции. По данным исследователей, 14 из 25 яйцеклеток оплодотворились, а 10 из них достигли 2-клеточной стадии за 24 ч и 4 из 7 ооцитов - 4-клеточной стадии за 48 ч. Позже Iritani et al. (1984) доказали, что сперматозоиды могут быть капацитированы не только в среде с высокой ионной силой, но и в изотонической среде. Причем, авторы пришли к заключению, что капацитация возможна в период хранения сперматозоида при температуре 20С. Эффективность оплодотворения in vitro в значительной степени зависит от факторов, связанных с яйцеклетками (Brackett et al., 1982). Так, проникновение сперматозоидов, капацитированных в среде с высокой ионной силой, в ооциты регистрировалось у 40% яйцеклеток, созревших в предовуляторных фолликулах или яйцеводах (так называемые тубальные ооциты), тогда как среди ооцитов, дозревших in vitro, только у 10% отмечено оплодотворение. Позже эффективность этого опыта подтвердилась авторами при получении двойни. 2 из 5 хирургических пересадок завершились двойневыми стельностями. Однако эффективность оплодотворения была невысокой -11-14%. Эмбрионы в условиях культивирования in vitro развивались до 4-8клеточной стадии, что не позволяло экспериментаторам осуществить нехирургическую трансплантацию (для нехирургической трансплантации и замораживания требуется эмбрионы довести до стадии компактизации). Однако даже если и будет разработана совершенная методика экстракорпорального оплодотворения тубальных ооцитов, огромный генетический материал ооцитов, содержащихся в фолликулах, останется не реализованным в воспроизводстве и селекции. Только разработка метода получения телят от экстракорпорального оплодотворения фолликулярных ооцитов (яйцеклеток, созревших in vitro) создаст реальную возможность существенного повышения эффективности трансплантации и создания крупных банков эмбрионов от генетически ценных коров. Такая методика обеспечит и более дешевое получение в достаточном количестве зигот и ранних эмбрионов, необходимых для переноса ядер и рекомбинантных ДНК, а также для получения трансгенных животных. Первый теленок из дозревшего «в пробирке» фолликулярного ооцита после его экстракорпорального оплодотворения родился в 1983 году (Л.К. Эрнст и соавт.). Исследователи для этой цели использовали ооциты, созревшие in vitro, и некапацитированные свежие или 90 замороженно-оттаянные сперматозоиды. Каждому реципиенту – телке хирургическим методом трансплантировали в яйцепровод по 1-7 эмбрионов, находящихся на 2-4-клеточной стадии дробления. Одному реципиенту пересадили 3 четырех клеточных эмбриона, полученных от экстракорпорального оплодотворения in vitro созревших фолликулярных ооцитов, взятых из яичников двух- и одномесячных телочек и одной половозрелой коровы. В результате такой трансплантации и родился живой теленок. Однако хирургическая трансплантация находящихся на первых стадиях развития эмбрионов в яйцепровод реципиента существенно усложняет биотехнологию трансплантации. Поэтому очень важно получение эмбрионов на стадиях морулы или бластоцисты, пригодных для трансплантации нехирургическим способом. Л.К.Эрнст и соавт. (1987) использовали яйцевод кролика для обеспечения ранних стадий развития эмбрионов коров как после оплодотворения in vitro, так и после оплодотворения в яйцеводе кролика (1987). Они извлекали ооциты из фолликулов и культивировали в среде 199 с 20% фетальной сывороткой плода при добавлении эстрадиола, прогестерона, тестостерона и лютеинизирующего гормона в течение суток при 38С во влажной камере, содержащей 5% СО2, 5% О2 и 90% N2. Капацитацию сперматозоидов проводили в среде с высокой ионной силой и в яйцеводе эстрального кролика за 4-5 ч до пересадки ооцитов. Через 19-20 ч после соединения яйцеклеток со сперматозоидами в яйцеводе кролика или in vitro ооциты пересаживали в лигатированный яйцевод ложнобеременного кролика для дальнейшего их развития на 4-5 суток. Оплодотворяемость при этом была 22-25%. Через 3 суток процент эмбрионов, достигших стадии морулы после оплодотворения в яйцеводе кролика, примерно в 4 раза превышает аналогичный показатель после оплодотворения в условиях in vitro. На 4 и 5 сутки эта разница несколько уменьшается, но по-прежнему остается значительной в пользу ооцитов, оплодотворенных в яйцеводе кролика. Это свидетельствует о том, что в яйцеводе кролика создаются более благоприятные условия для капацитации сперматозоидов быка и оплодотворения ооцитов, чем в известных пока культуральных средах. В результате хирургической и нехирургической трансплантации эмбрионов коров на стадии морулы было получено 6 стельностей, в том числе одна двойневая (5 из 6 стельностей дали ооциты, взятые из яичников коров, убитых на мясокомбинате). Родились по 2 живых теленка из ооцитов, оплодотворенных в яйцеводе кролика и “в пробирке”. Один теленок родился в результате нехирургической пересадки эмбриона, полученного после оплодотворения in vitro. Приживляемость эмбрионов, полученных в результате оплодотворения ооцитов в яйцеводе кролика, была почти в 6 раз выше, чем в случаях оплодотворения “в пробирке”. Для развития эмбрионов крупного рогатого скота до стадии морулы и бластоцисты Crister et al. (1986) использовали 91 лигатированные яйцеводы овцы. Весомых успехов в оплодотворении in vitro ооцитов коров достигли и ирландские ученые (Lu et al., 1987; 1988). В качестве временного реципиента для оплодотворенных клеток они использовали также яйцевод овцы. 80% ооцитов дробились до 2клеточной стадии и выше, и почти половина из них достигла стадии морулы и бластоцисты. Эксперименты по оплодотворению овец проводились по двум направлениям: “в пробирке” и введением фолликулярных ооцитов в яйцевод осемененной овцы. Как и у коров, эффективность оплодотворения ооцитов была выше, когда фолликулярные и овулировавшие клетки помещали в яйцевод со сперматозоидами, чем при использовании системы in vitro. Причем исследователи существенной разницы в развитии ооцитов до стадии бластоцист в случаях культивирования яйцеклеток in vitro и in vivo (в фолликулах) не наблюдали. В меньшей степени изучены вопросы оплодотворения “в пробирке” у свиней. Polge (1977) описал проникновение сперматозоидов в ооциты после созревания их in vitro и пересадки в яйцевод осемененной эстральной свиньи. Однако ни одна яйцеклетка не развилась до стадии бластоцисты, и у многих из них проявилась полиспермия. Культивирование in vitro эмбрионов сельскохозяйственных животных. Видовая сыворотка крови была первой средой, которая испытывалась на пригодность для культивирования эмбрионов коров и овец. В этой среде развитие оплодотворенных клеток ограничивалось одним делением и прекращалось после 48 ч культивирования. О возможности использования фолликулярной жидкости для культивирования эмбрионов сообщил Thibault в 1966 году. Он наблюдал в этой среде развитие зародыша коров с 1-4 клеточных бластомеров до морулы. Tervit et al. (1972) испытали синтетическую яйцеводную жидкость (СЯЖ). По данным авторов, 9% 8-клеточных бластомеров овец развивались до стадии ранней бластоцисты после 6-дневного культивирования в СЯЖ в атмосфере, состоящей из 5% СО2, 5% О2 и 90% N2. Более половины 8-клеточных эмбрионов, культивируемых в СЯЖ в течение 3 дней, после пересадки прошли путь онтогенеза до рождения потомства. Однако авторам не удалось получить стельности после культивирования одноклеточных эмбрионов. Bowan et al. (1975) отметили преимущественное развитие эмбрионов в средах СЯЖ и ХЭМ Ф-10 с осмотическим давлением 270 мосм по сравнению с 300 мосм. Последняя среда с добавлением фетальной сыворотки, по мнению ряда ученых, является наиболее благоприятной средой для культивирования эмбрионов “в пробирке”. Например, Wright et al. в 1976 году в среде ХЭМ Ф-10 наблюдали развитие эмбрионов коров с 1-2 клеточных бластомеров до вылупившейся бластоцисты. В следующем году Peters et al. аналогичных результатов достигли при использовании Среды Виттена с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Они 92 также отметили, что “в пробирке” развитие 1-4-клеточных эмбрионов ограничено по сравнению с 8-клеточными. Эта среда, но с повышенным содержанием бычьего сывороточного альбумина (15%) оказалась оптимальной для культивирования эмбрионов свиньи (Linder, Wright, 1978). В настоящее время научные поиски в области оплодотворения с.х. животных “в пробирке” получают дальнейшие развития. Они направлены на исключение из этой технологии временного реципиента (яйцеводы кролика, овцы и др.) для развития ранних эмбрионов. Подходящей заменой временного реципиента может быть монослой яйцеводных и грануляционных клеток. Контрольные вопросы: 1.В чем состоит практическая значимость техники оплодотворения вне организма?; 2. Расскажите о результатах исследований по совершенствованию процесса созревания яйцеклеток вне организма; 3. Принципы и подходы, используемые в оплодотворении вне организма. Лекция №8 Проблемы генной инженерии в создании трансгенных животных Для выведения улучшенных пород домашних животных и птиц (коров с более высокой удойностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой яйценоскостью и т. д.) проводят множество раундов скрещиваний и отбора, каждый раз используя в качестве производителей животных с наилучшими характеристиками. В результате со временем можно получать более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Стратегия скрещивания и отбора, требующая больших временных и материальных затрат, оказалась тем не менее исключительно успешной, и сегодня почти все аспекты биологических основ выведения новых пород домашнего скота могут быть к ней сведены. Однако после того как эффективная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещивания и отбора становится все труднее. Так, линия с новым «ценным» геном может нести также и «вредные» гены, вследствие чего потомки могут оказаться менее продуктивными. Чтобы быть уверенными в том, что новая, улучшенная линия сохранит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо разработать абсолютно новую стратегию. Для создания трансгенных линий животных решающее значение в животноводстве имеет получение таких особей, у которых все или часть половых клеток имеют трансген. Исследования родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показали, что, несмотря на введение ДНК на ранних стадиях (в пронуклеус оплодотворенного ооцита), могут появляться мозаики. Мозаики - это животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящих из одной зиготы, но имеющие различные генотипы. Такие животные, кроме клеточных линий с трансгеном, имеют 93 нетрансгенные клеточные линии. Поэтому, если половые клетки не содержат трансген, потомство не может наследовать чужеродный ген от трансгенной родительской формы. Установлено, что примерно 30% первичных трансгенных животных являются мозаиками. В этой связи трансген не передается потомству согласно законам Менделя с частотой 50%. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача по наследству. Трансгенные технологии разрабатывались и совершенствовались на лабораторных мышах. С начала 1980-х гг. в различные линии мышей были введены сотни генов. Эти исследования в значительной мере способствовали установлению механизмов генной регуляции и развития опухолей, природы иммунологической специфичности, молекулярной генетики роста и развития, других фундаментальных биологических процессов. Трансгенные мыши сыграли свою роль в исследовании возможности крупномасштабного синтеза лекарственных веществ, а также в создании трансгенных линий, позволяющих моделировать различные генетические болезни человека. Введение чужеродной ДНК мышам осуществлялось разными методами: 1) с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-реципиента; 2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйцеклетки; 3) введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития. Использование ретровирусных векторов. Преимущество метода, основанного на использовании ретровирусных векторов, перед другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Однако размер вставки в этом случае ограничивается 8 т. п. н., вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии. Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вирусапомощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК. может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. Метод микроинъекций ДНК. В настоящее время для создания трансгенных мышей чаще всего используют метод микроинъекций ДНК. Он заключается в следующем. Работу начинают со стимуляции 94 гиперовуляции у самок-доноров с целью увеличения числа яйцеклеток, в которых будет инъецирована чужеродная ДНК. Сначала самкам вводят сыворотку беременной кобылы, а спустя примерно 48 ч — хорионический гонадотропин человека. В результате гиперовуляции образуется примерно 35 яйцеклеток вместо обычных 5—10. Затем производят скрещивание с самцами самок с гиперовуляцией, после чего их умерщвляет, вымывают из яйцеводов оплодотворенные яйцеклетки, и сразу инъецируют ДНК в оплодотворенные яйцеклетки. Часто вводимая трансгенная конструкция находится в линейной форме и не содержит прокариотических векторных последовательностей. У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермин (мужской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как последнее заканчивает митотическое деление и становится женским пронуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронуклеус обычно гораздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроинъекции можно перемещать, ориентировать нужным образом и фиксировать. Опытный экспериментатор за день может инокулировать несколько сотен яйцеклеток. После введения ДНК от 25 до 40 яйцеклеток имплантируют микрохирургическим путем в «суррогатную» мать, у которой вызывают ложную беременность скрещиванием с вазэктомированным самцом. У мышей спаривание — это единственный известный способ подготовки матки к имплантации. Поскольку вазэктомированный самец сперматозоидов не продуцирует, ни одна из яйцеклеток «суррогатной» матери не оплодотворяется. Эмбрионы развиваются только из введенных яйцеклеток, и мышата рождаются спустя примерно 3 нед после имплантации. Для идентификации трансгенных животных выделяют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом ПЦР. Чтобы определить, находится ли трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно проводить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий. Описанный подход кажется на первый взгляд относительно простым, однако он требует четкой координации разных этапов. Даже высококвалифицированному специалисту удается получить жизнеспособных трансгенных животных в лучшем случае лишь из 5% инокулированных яйцеклеток. Ни один из этапов эксперимента не эффективен на все 100%, поэтому для микроинъекций необходимо использовать большое число оплодотворенных яйцеклеток. Например, при получении трансгенных мышей после инъекции ДНК выживают только 66% оплодотворенных яйцеклеток; мышата развиваются 95 примерно из 25% имплантированных яйцеклеток, причем трансгенными из них оказываются лишь 25%. Таким образом, из 1000 имплантированных оплодотворенных яйцеклеток развивается от 30 до 50 трансгенных мышат. Кроме того, введенная ДНК может интегрировать в любое место в геноме, и зачастую множество ее копий включаются в один сайт. И, наконец, не все трансгенные мышата будут обладать нужными свойствами. В организме некоторых особей трансген может не экспрессироваться из-за неподходящего окружения сайта интеграции, а в организме других число копий чужеродного гена может оказаться слишком большим, что может привести к гиперпродукции белка и нарушению нормальных физиологических процессов. И все же, несмотря на все это, метод микроинъекций используют для получения линий мышей, несущих функциональные трансгены, довольно часто. Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток. Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ES). ES-клетки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных. Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных систем. При трансфекции ES-клеток в культуре вектором, предназначенным для интеграции в специфический хромосомный сайт, в некоторых клетках ДНК встраивается случайным образом, в других встраивание происходит в нужный сайт, в большинстве же ES-клеток интеграции вообще не происходит. Для увеличения числа клеток первого типа используют так называемую позитивно-негативную селекцию. Эта стратегия состоит в позитивной селекции клеток, несущих векторную ДНК, встроившуюся в нужный сайт, и негативной селекции клеток с векторной ДНК, интегрировавшей в случайный сайт. Сайт-мишень должен находиться в такой области геномной ДНК, которая не кодирует важных белков, чтобы интеграция чужеродной ДНК не повлияла на процессы развития или клеточные функции. Кроме того, существенно, чтобы встраивание трансгена не блокировало трансляцию соответствующего участка генома. Поиск подобных сайтов ведется непрерывно. Более простой способ идентификации ES-клеток, несущих трансген в нужном сайте, основан на использовании ПЦР. В этом случае ДНК-вектор содержит два участка, гомологичных сайту-мишени, по 96 одному со стороны трансгена и со стороны клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) последовательности, отсутствующей в геноме мыши. После трансфекции ES-клеток этим вектором проводят скрининг трансфицированных клеток методом ПЦР. Один из ПЦР-праймеров комплементарен участку клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) нуклеотидной последовательности интегрировавшего вектора, а второй - участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных участков ДНК. При встраивании последовательности-мишени в случайный сайт ожидаемый продукт амплификации образовываться не будет, а при сайтспецифической интеграции в результате ПЦР-амплификации образуется фрагмент ДНК известного размера. Таким образом можно идентифицировать пулы ES-клеток, содержащих трансген в нужном сайте, а пересевая клетки из этих пулов — получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой. ES-клетки, в геном которых в нужном сайте встроен трансген, можно культивировать и ввести в эмбрион на стадии бластоцисты, а затем имплантировать такие эмбрионы в матку псевдобеременных «суррогатных» матерей. Мышата, у которых генетически модифицированные ES-клетки участвовали в образовании клеток зародышевой линии, могут дать начало трансгенным линиям. Для этого их нужно скрестить с особями той же линии, а затем скрестить их трансгенных потомков. В результате будут получены трансгенные мыши, гомозиготные по трансгену. В принципе подходы к созданию трансгенных животных с «улучшенными функциями» и с «потерей функций» сходны. К сожалению, плюрипотентные ES-клетки, аналогичные таковым у мышей, пока не обнаружены у крупного рогатого скота, овец, свиней и цыплят, но их поиск продолжается. Трансгенные мыши могут служить модельными системами для изучения болезней человека и тест-системами для исследования возможности синтеза продуктов, представляющих интерес для медицины. Используя целых животных, можно моделировать и возникновение патологии, и ее развитие. Однако мышь — не человек, хотя она тоже относится к классу млекопитающих, поэтому данные, полученные на трансгенных моделях, не всегда можно экстраполировать на человека в том, что касается медицинских аспектов. Тем не менее, в некоторых случаях они позволяют выявить ключевые моменты этиологии сложной болезни. Принимая во внимание все это, ученые разработали «мышиные» модели таких генетических болезней человека, как болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, образование опухолей, гипертония, нейродегенеративные нарушения, дисфункция эндокринной системы, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие. 97 Для создания трансгенных коров используют модифицированную схему трансгеноза мышей методом микроинъекций ДНК. Процедура включает следующие основные этапы: сбор ооцитов коров, забитых на скотобойне; созревание ооцитов in vitro; оплодотворение бычьей спермой in vitro; центрифугирование оплодотворенных яйцеклеток для концентрирования желтка, который в нормальных яйцеклетках мешает визуализации мужского пронуклеуса с помощью секционного микроскопа; микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус; развитие эмбрионов in vitro; нехирургическая имплантация одного эмбриона реципиентной самке во время течки; скрининг ДНК потомков на наличие трансгена. Перенос генов у сельскохозяйственных животных может быть использован в улучшении продуктивности и качества животноводческой продукции, повышении устойчивости к болезням и создании трансгенных животных - биореакторов ценных биологически активных веществ. Эрнст Л.К. (1996) сообщает, что у трансгенных свиней с геном гормона роста конечная живая масса была на 15,7% выше, чем у контрольных животных. По данным Брем Г. и др. (1991), у потомства трансгенных свиней, получавших соответствующий модифицированный кормовой рацион с повышенным содержанием протеина и дополнительным количеством лизина, отмечались более высокие среднесуточные привесы. В противоположность этим результатам нередки случаи эспрессии трансгенов без фенотипического эффекта. Это выяснилось уже в первой работе (R.E.Hammer et al., 1985) - при переносе гена гормона роста человека, когда были получены трансгенные кролики, свиньи и овцы, но ни в одном из случаев экспресии гормона роста человека не наблюдалось каких-либо фенотипических изменений у животных. V.G.Pursel et al. (1987) с этим же геном получили поросят с установленной экспрессией этого гена, но также без изменения скорости роста. Эти же исследователи (1988;1989) у трансгенных свиней с геном гормона роста также не регистрировали соответствующего ускорения роста. Трансгенные овцы с геном гормона роста имели повышенный его уровень, но не отличались от контрольных по интенсивности роста. Однако трансгенные свиньи имели более чем двукратное уменьшение толщины шпика, а у трансгенных овец содержание жира было примерно в 4-5 раз меньше, чем у контрольных аналогов. В связи с этим был высказан ряд предложений, одно из которых связывает отсутствие специфического фенотипического эффекта у животных со слабым узнаванием его рецепторами молекул чужеродного гормона или с посттрансляционными модификациями (K.A.Ward, C.D.Nancarrow, 1991). Это предположение вскоре получает экспериментальное доказательство на активно растущих свиньях, в геном которых были встроены дополнительные копии гена собственного гормона роста (V.D.Vize et al., 1988). Однако последующие опыты на овцах дали другой результат. Надежды на то, что в организме овцы ее собственный ген 98 будет “работать” лучше, чем чужеродный, не оправдались. Трансгенные овцы с высоким содержанием овечьего гормона роста демонстрировали слабый прирост живой массы и были физиологически ненормальны. Разницу по скорости роста между трансгенными мышами и трансгенными с.-х. животными некоторые исследователи объясняют следующим образом. Большинство свиней, использованных в экспериментах по переносу генов, происходили из популяций, в которых длительное время велась селекция по ростовой продуктивности, тогда как в линии мышей не велся отбор по этому показателю. Действительно, мыши, в популяции которых в течение 30 поколений осуществлялась селекция по скорости роста, имели незначительно меньшую живую массу по сравнению с трансгенными сверстниками. Следовательно, введение чужеродного гена в популяцию линий мышей, не подвергнутых селекции на скорость роста, вызывает скачок на более высокий ростовой уровень. Генетический потенциал роста в популяциях свиней, наоборот, находится недалеко от потенциального плато, и поэтому дополнительное введение гормона роста или перенос его гена не дает значительного эффекта в скорости роста. Другое объяснение отсутствия ускорения роста трансгенных животных связывают с необходимостью увеличения не только гормона роста, но и каких-то других, пока не известных стимуляторов роста. Нерегулируемая экспрессия гена гормона роста, как аутологичного, так и гетерологичного, может привести к сокращению продолжительности жизни трансгенных животных вследствие патологических нарушений обмена веществ, развития акромегалии (чрезмерное разрастание отдельных частей лица, конечностей и внутренних органов) и подверженности различным инфекционным заболеваниям. Например, у трансгенных овец с повышенным содержанием в крови гормона роста крупного рогатого скота развился сахарный диабет - типичный симптом акромегалии (С.E. Rexroad et al., 1990). В другой работе сахарный диабет был отмечен у трансгенных овец, активно экспрессирующих собственный гормон роста. Животные пали в течение первого года постнатальной жизни (C.D.Nancarraw et al., 1991; K.A.Ward et al., 1989). Трансгенные свиньи с гиперсекрецией гормона были меньше по живой массе при рождении, чем однопометное потомство, более вялые, с угнетенным аппетитом, склонностью к артритам, и большинство из них также не жило больше года (V.G.Pursel et al., 1987, 1989). Стало очевидным, что постоянно высокий уровень продукции гормона роста у животных не является положительным фактором их продуктивности. Анализ этих экспериментов свидетельствует о том, что использование трансгенной технологии для изменения роста и состава тканей домашних животных требует углубления понимания процессов генетической регуляции роста. По мнению Л.К.Эрнста и соавт. (1993), направленное воздействие на один гормон комплексного гормоноростового каскада не будет эффективным, 99 пока не будут созданы сложные конструкции генов с тонкой регуляцией процессов метаболизма. Создание трансгенных животных открывает реальные перспективы улучшения качества или состава продуктов животноводства. Например, появилась возможность уменьшения лактозы в молоке путем создания трансгенных коров и овец, которые имеют специфический для молочной железы промотор (участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза, чтобы начать синтез мРНК), сцепленный с геном лактозы. При этом уже в молоке коров (овец) лактоза может быть расщеплена на глюкозу и галактозу. Такое молоко могло бы быть использовано в питании новорожденных детей, страдающих наследственной непереносимостью лактозы. Таким детям в грудном возрасте молоко следует давать только после его обработки ферментными препаратами. Кроме того, молоко могло бы быть полезно при различных желудочно-кишечных заболеваниях человека, сопровождающихся снижением активности лактазы (бетагалактозидазы). Наличие в молоке разнообразной микрофлоры создает проблемы, связанные с хранением, переработкой, потреблением молока и здоровьем животных. В этой связи конструируются гены, ответственные за выработку антител против определенных патогенных микроорганизмов (R.D.Bremel et al., 1989; U.H. Weidle et al., 1991). Важной задачей является и получение молока и молочных продуктов, содержащих термостабильный фермент лизоцим микробного происхождения. При пастеризации молока такой фермент, обладающий выраженным антибактериальным свойством, не потеряет своей активности, что значительно увеличит сроки хранения молока и получаемых из него продуктов. В кислой среде желудочно-кишечного тракта лизоцим инактивируется. Рассматривается возможность введения генов, кодирующих антитела с протективными свойствами в отношении патогенных микробов - возбудителей маститов коров. Сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН (г.Новосибирск) и Института молекулярной генетики РАН (г.Москва) создана генетическая конструкция pGoatcasGMCSF, которая содержала регуляторный район гена альфа-S1-казеина козы, несущая ген гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека (И.А.Серова и соавт., 2011). В экспериментах по инъекции этой рекомбинантной ДНК в пронуклеусы зигот были получены 4 трансгенных мыши. Методом ПЦР показана тканеспецифичность экспрессии ГМ-КСФ человека только в молочной железе лактирующих самок. Поскольку упомянутая конструкция является тканеспецифичной, она подпадает под регуляцию физиологических сигналов беременности и лактации. Достижения генной инженерии могут быть использованы в изменении качества и выхода шерсти овец. Дальнейшее усовершенствование шерстных характеристик овец в определенной 100 степени зависит от степени снабжения волосяных фолликулов питательными веществами, необходимыми для их активного функционирования. Главным препятствием физиологи считают ограничение запаса энергии для обеспечения процессов клеточной пролиферации и аминокислот (лизина, метионина, аргинина, гистидина и цистеина) для синтеза кератинов фибринов шерсти. Ферментативные процессы, вызываемые микрофлорой рубца, не всегда полностью обеспечивают синтез необходимых аминокислот, так как при расщеплении протеинов корма большая часть их уходит на синтез микроорганизмами собственных белков, что снижает уровень важных для роста шерсти аминокислот. Поэтому первоочередной задачей технологии рекомбинантных ДНК, направленной на улучшение характеристик шерсти овец, является увеличение эффективности усвоения корма овцами. С целью увеличения количества серусодержащих аминокислот (например цистеина), необходимых для биосинтеза кератиновых белков шерсти овец, Rogers G.E. (1990) считает целесообразным создание трансгенных овец, имеющих в своем геноме бактериальные гены, кодирующие синтез цистеина. Эти гены должны экспрессироваться только в эпителии желудочно-кишечного тракта овцы и обусловливать использование серы, образующейся в результате ферментативных процессов микроорганизмов. Им получен первый трансгенный ягненок, содержащий в своем геноме гены серинацетилтрансферазы (SAT) и Оацетилсеринсульфгидрилазы (OAS) из Salmonella typhimurium. K.A.Ward et al. (1990) использовали SAT и OAS кишечной палочки, соединенные с генной конструкцией, состоящей из промотора металлотионина-1а овцы, вызывающего цинкзависимую экспрессию. Исследования в этом направлении продолжаются. Все более важное значение приобретает селекция животных по устойчивости к заболеваниям. В отличие от вакцинации, эффект действия которой проявляется в течение жизни конкретных индивидуумов, генно-инженерный иммунитет может иметь наследственный характер, что позволит вывести линии с.-х. животных, резистентных к определенным инфекционным болезням. Резистентность к ряду заболеваний является полигенным признаком. Например, устойчивость к трипаносомозу определенных африканских пород крупного рогатого скота наблюдается на фоне их жаровыносливости и нетребовательности к условиям кормления и содержания. Вместе с тем резистентность организма может основываться и на единичных генах. В качестве примера можно привести устойчивость к диарее у новорожденных поросят или резистентность к гриппу у мышей. Это послужило основанием для получения животных с трансгенами, которые, возможно, создадут иммунитет к отдельным инфекционным заболеваниям. В этом направлении генно-инженерных работ на первый план выступают исследования специфического антивирусного эффекта 101 генов моноклональных антител. Механизм действия последних должен быть в известной степени аналогичен специфической антивирусной иммунизации животных. Получены трансгенные мыши, продуцирующие антитела против специфических антигенов без предварительной иммунизации или контакта с инфекцией (Storb U., 1987). Гены легкой и тяжелой цепей моноклональных антител против 4гидрокси-3-нитрофенилацетата были интегрированы в геном кроликов и свиней (U.Weidle et al., 1991). Титр специфических антител в сыворотке крови трансгенных животных оказался равным соответственно 100 и 1000 мкг/мл. Имеются сообщения о получении трансгенных мышей, овец и свиней с генными конструкциями, кодирующими альфа- и хицепи антител против фосфорилхолина (D.Lo et al., 1991). Авторы наблюдали высокий уровень IgA мыши, но только у трансгенных мышей и свиней. Г.Брем и др. с 1991 года выделили и клонировали ген мышей Мх, ответственный за иммунитет к вирусу гриппа А, и ведут работу по получению трансгенных свиней на основе использования данного гена. Исследуется возможность получения трансгенных животных, имеющих повышенную концентрацию лактоферина в тканях молочной железы, с целью повышения устойчивости к маститу. Ведутся работы и по получению животных, имеющих в своем геноме трансген антисмысловой РНК. Экспрессия последней в клетках приводит к гибридизации со смысловой РНК, в результате чего подавляется репликация вирусного гена. Так, российскими учеными (Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев., Л.К. Эрнст., 1991) был сконструирован ген антисмысловой РНК против аденовируса и получены трансгенные кролики. Клеточные линии животных (культура клеток из почек), имеющие трансген, показали высокую резистентность против аденовируса по сравнению с контрольными линиями клеток. Эти же исследователи продемонстрировали устойчивость животных с трансгеном антисмысловой РНК против лейкоза крупного рогатого скота на организменном уровне к заражению вирусом - возбудителем этой болезни. Так, у трансгенных кроликов с упомянутым геном титр антител против антигена р24 был значительно ниже (1:500), чем у контрольных животных (1:8000). Показана возможность создания внутриклеточной иммунизации против некоторых вирусов. Получены трансгенные куры, клетки которых экспрессировали капсидный белок вируса лейкоза, что и способствоало устойчивости их к этой болезни. Известно о существовании пород с наследственной устойчивостью к бактериальным инфекционным заболеваниям — маститу (коровы), дизентерии (новорожденные поросята), холере (домашняя птица). Если в основе устойчивости к каждой из этих болезней лежит один ген, можно попытаться создать несущих его трансгенных животных. В настоящее время для борьбы с инфекционными заболеваниями домашних животных используют прививки и лекарственные препараты. Заболевших животных изолируют, за здоровыми ведут тщательное 102 наблюдение. Стоимость всех этих мероприятий может достигать 20% общей стоимости конечной продукции. Для выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций, можно использовать другой подход, заключающийся в создании путем трансгеноза наследуемых иммунологических механизмов. С этой точки зрения рассматривают самые разные гены, ответственные за работу иммунной системы: гены основного комплекса гистосовместимости, Т-клеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболее обнадеживающими на настоящее время являются предварительные результаты, полученные при введении мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих Н- и L-цепи какого-либо моноклонального антитела. Идея этого подхода заключается в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с помощью прививок. Введение в организм реципиента генов антител, которые связываются со специфическими антигенами, было названо иммунизацией in vivo. Для этого гены Н- и L-цепей иммуноглобулинов моноклонального мышиного антитела к антителу, связывающемуся с 4гидрокси-З-нитрофенилацетатом, вводили с помощью микроинъекций в оплодотворенные яйцеклетки мыши, кролика и свиньи. Во всех случаях в сыворотке трансгенных животных обнаруживалась соответствующая активность моноклонального антитела. Однако количество моноклональных антител, содержащих цепи Н- и L-, было невелико. Чтобы установить, можно ли решить эту проблему, необходимо протестировать различные трансгенные конструкции. Возможность включения в клетки организма генов, ответственных за синтез белков, имеющих большую значимость в медицине и ветеринарии, создало основу стратегии использования трансгенных животных в качестве биореакторов. Большинство таких белков и по сей день выделяются из тканей и биологических жидкостей человека. Например, фактор свертываемости, интерферон, альфа-1-антитрипсин и другие белки получают из крови, гормон роста - из гипофиза. Они производятся в малых количествах из-за дороговизны и трудности выделения человеческих тканей. Кроме того, они могут быть заражены патогенными микроорганизмами, такими как возбудители гепатита, СПИДа и др. Трансгенные животные, используемые для производства ценных биопрепаратов, имеют ряд преимуществ перед микроорганизмамипродуцентами, а также клеточными системами. В простых рекомбинантных системах микроорганизмов гликолизирование, Вгидроксилирование или карбоксилирование белков млекопитающих в большинстве случаев невозможно или возможно, но с недостаточной точностью. Это приводит к изменению структуры белков, что не может не отразиться на их биологической активности. Наряду с этим в препаратах, используемых человеком в качестве лечебных средств, 103 нежелательна примесь бактериальных белков. Основным недостатком генно-инженерных культуральных клеток является низкий выход белка. Промышленные реакторы, используемые для культивирования клетокпродуцентов, являются дорогими, как в отношении их стоимости, так и в отношении их обслуживания. Создание трансгенных животных также требует больших средств и к тому же дело не из легких, но однажды выведенная линия таких животных может продуцировать большое количество белков с низкой стоимостью, что позволит окупить все расходы за короткое время. Получение биологически активных белков человека от трансгенных с.-х. животных гарантирует их экологическую чистоту и экологическую чистоту самого производства, которое практически сводится к эксплуатации животных-продуцентов. Чужеродные белки могут быть синтезированы большинством тканей тела животного. Экспрессии трансгенов в определенных органах можно достичь путем комбинации структурных генов со специфическими регуляторными элементами. Весомые успехи в производстве биореакторов были достигнуты в целенаправленной экспрессии трансгенов в эпителиальных клетках молочной железы. Структурный ген, связанный с промотором гена молочного протеина (казеина, лактоальбумина, лактоглобулина), в первую очередь будет экспрессироваться в клетках молочной железы. Это позволяет получать полезную продукцию с молоком. Выбор молочной железы как места производства чужеродных протеинов обосновывается огромной ее белковой продуктивностью. Общее содержание молочных белков в зависимости от вида животного колеблется в пределах 2-10%, т.е. на уровне 20-100 граммов на литр. Для коммерческого производства белков, имеющих фармацевтическую значимость, уже достаточно одного и более граммов рекомбинантного белка. Наиболее эффективным «биореактором» является крупный рогатый скот, который ежегодно при удое 5 тыс л. молока, может давать примерно 35 г белка на 1 л. Если в молоке будет содержаться такое количество рекомбинантного белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать 50 кг такого белка в год. Образно говоря, достаточно по две коровы для того, чтобы полностью удовлетворить годовую потребность в белке С, использующегося для предотвращения тромбообразования, и фактора IX - (фактора Кристмаса) каскадного механизма свертывания крови. На сегодняшний день известен ряд рекомбинантных белков, таких как человеческий белок С, антигемофильный фактор 1Х, альфа-1антитрипсин, тканевой плазменный активатор, лактоферин, человеческий сывороточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназа, химозин и др., полученных из молока трансгенных животных. Работы по получению указанных белков, за исключением альфа-1-антитрипсина и химозина, находятся на уровне лабораторных исследований и не достигли стадии, которая бы представляла коммерческий интерес. Одна 104 из целей трансгеноза крупного рогатого скота — изменение содержания в молоке различных компонентов. Так, количество сыра, получаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нем к-казеина, поэтому весьма перспективным представляется увеличение количества синтезируемого к-казеина с помощью гиперэкспрсссии трансгена этого белка. В 1992 году ученые Великобритании получили трансгенных овец продуцентов человеческого альфа-1-антитрипсина, используемого для лечения людей, больных эмфиземой легких. Этот препарат получают исключительно из донорской крови (1г альфа-1-антитрипсина стоит 110 долл.США). У четырех голов концентрация данного белка была в пределах 1 г/л, а у одной достигала 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции одна овца в год даст столько белка, сколько необходимо для лечения 50 пациентов. Российские ученые (Л.К.Эрнст, Г.Брем, М.И.Прокофьев, И.Л.Гольдман и др.) получили трансгенных овец, секретирующих с молоком фермент химозин в концентрации 200-300 мг/1л. Химозин основной компонент в производстве сыра, получаемый из сычугов молочных телят и ягнят. При этом стоимость химозина, получаемого из нового источника, будет дешевле в 5-10 раз. По расчетам авторов из трех литров молока трансгенной овцы можно получить такое количество фермента, которое достаточно для производства одной тонны сыра из коровьего молока. Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не оказывала никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на вскармливаемое потомство. В отличие от этого при введении свиньям трансгена бычьего гормона роста под контролем промотора металлотионина неблагоприятные эффекты наблюдались. Количество гормона у разных особей в группе трансгенных свиней различалось, однако в целом вся эта группа быстрее прибавляла в весе. К сожалению, этот положительный результат частично обесценивался различными патологиями: у животных отмечались язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление перикарда, уменьшение подвижности суставов, предрасположенность к пневмонии. Причины этих симптомов неизвестны. Возможно, они связаны с долговременным присутствием в организме избытка гормона роста. В этих экспериментах трансген синтезировался более или менее непрерывно. Были созданы также трансгенные овцы с повышенной скоростью роста шерсти. Для этого кДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста I была помешена под контроль мышиного промотора гена кератина с высоким содержанием серы, что обеспечивало гиперэкспрссию кДНК. При этом у трансгенных овец в отличие от свиней никаких нежелательных побочных эффектов не наблюдалось. Положительные результаты были получены и в ходе экспериментов с трансгенными свиньями. Например, были созданы 105 здоровые трансгенные свиньи, в геноме которых присутствовала следующая генетическая конструкция: регуляторная область гена бетаглобина человека, два гена альфа 1- глобулина человека и один ген бета А - глобина человека. В результате ее экспрессии в клетках крови свиней синтезировался человеческий гемоглобин, при этом в результате замены человеческого промотора гена бета-глобина свиным человеческий гемоглобин синтезировался в значительно большем количестве. Человеческий гемоглобин, продуцируемый трансгенными свиньями, обладал такими же химическими свойствами, что и природный человеческий. Его можно было очистить от гемоглобина свиней обычной хроматографией. Эти результаты указывают на принципиальную возможность замены цельной крови, используемой при трансфузии, человеческим гемоглобином, полученным методом трансгеноза. Однако изолированный гемоглобин переносит кислород не так эффективно, как гемоглобин в составе эритроцитов. Более того, он быстро разрушается в организме животного, которому был введен, а продукты его распада токсичны для почек. Таким образом, получение заменителя человеческой крови с помощью трансгеноза — это дело далекого будущего. В последнее время большое внимание уделяется вопросу об использовании органов животных для трансплантации человеку. Основная проблема межвидовой трансплантации — это гиперострое отторжение. Гиперострое отторжение влечет за собой связывание антител организма-хозяина с углеводной антигенной детерминантой на поверхности клеток пересаженного органа. Связавшиеся антитела вызывают острую воспалительную реакцию (активацию каскада комплемента), происходит массовая гибель несущих антитела клеток и быстрая потеря пересаженного органа. В естественных условиях воспалительная реакция блокируется особыми белками на поверхности клеток, выстилающих стенки кровеносных сосудов. Эти белки ингибиторы комплемента видоспецифичны. Было высказано предположение, что если бы животное-донор несло один или несколько генов человеческого белка, ингибирующего комплемент, то пересаженный орган был бы защищен от первичной воспалительной реакции. С этой целью были получены трансгенные свиньи, несущие различные человеческие гены ингибитора комплемента. Клетки одного из этих животных оказались совершенно нечувствительными к компонентам системы каскада комплемента. Предварительные эксперименты по пересадке органов трансгенных свиней приматам показали, что ткани пересаженного органа повреждаются слабее, а сам орган не отторгается немного дольше. Возможно, трансгенные свиньи, несущие человеческий ген ингибитора комплемента и лишенные основного поверхностного белка клеток свиней, который вызывает острейшее отторжение, будут служить источником органов для трансплантации человеку. 106 Обнадеживающей оказалась первая работа по получению трансгенных животных - продуцентов интерлейкина-2. Последний, являясь растворимым фактором Т-лимфоцитов хелперов, участвующих в пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов киллеров, играет важную роль в обеспечении необходимого уровня иммунитета. С использованием генной конструкции, состоящей из ДНК бета-казеина кролика и структурного гена интерлейкина-2 человека, были получены кролики, секретирующие с молоком активную форму этого белка. Таким образом, достигнута интеграция одного или нескольких генов в эмбрионы млекопитающих и доказана их экспрессия, а также передача потомству. Однако следует подчеркнуть трудности и неясности, с которыми по-прежнему связана техника получения трансгенных животных. Все еще слабо изучен механизм интеграции гена в клетки млекопитающего. Эта интеграция происходит случайным образом и не связана с конкретной областью хромосомы. Другая сложность обусловлена нестабильностью клеток, в которые вводится ген (гены): он может быть утрачен или модифицирован и в результате стать неактивным. Наконец, активность генов определяется не только последовательностями нуклеотидов, которые обеспечивают транскрипцию гена с образованием мРНК, но также другими последовательностями нуклеотидов, которые зачастую далеко стоят от собственного гена, и, если требуется достичь полной экспрессии гена, эти последовательности нужно вводить вместе с геном. Например, ген, ответственный за синтез альфа-глобулина, регулируется последовательностью ДНК, расположенной перед ним. Достигнутые результаты генной инженерии в области получения трансгенных млекопитающих позволят углубить наши знания об экспрессии генов, что в перспективе облегчит перенос генов и определение факторов, способствующих более полному проявлению генетической информации, записанной в трансгенах. Кроме того, встраивание чужеродного гена в тот участок генома клетки, где в норме располагается гомологичный ген, возможно откроет путь для лечения генетических заболеваний, так как это позволит заменить дефектный или восполнить отсутствующий ген его активным аналогом. Трансгенные птицы. Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйцеклетки птиц с целью получения трансгенных линий — непростая процедура. Это связано с некоторыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бывает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подходит, поскольку в этом случае ДНК не интегрируется в геном оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микро-инъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, 107 поскольку у птиц яйцеклетка после оплодотворения достаточно быстро обволакивается прочной мембраной, покрывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками. Однако трансген можно вводить в область желтка (зародышевый диск), который содержит и женский, и мужской пронуклеусы и образуется раньше, чем скорлупа. После введения ДНК каждую яйцеклетку культивируют in vitro, и когда образуется зародыш, его помешают в суррогатное яйцо, чтобы имитировать вылупление. При помощи такой стратегии была получена одна линия трансгенных цыплят. Однако в настоящее время этот метод неэффективен и технически трудновыполним в обычных условиях. К тому времени, когда наружная известковая оболочка яйцеклетки птиц затвердевает, зародыш, находящийся на стадии бластодермы, состоит из двух слоев по 40 000 и 80 000 клеток. Проведены эксперименты по инокуляции такого зародыша ретровирусными векторами с нарушенной репликацией, несущими бактериальные маркерные гены. В результате были получены трансгенные цыплята и обыкновенные перепела, несущие чужеродные гены в клетках зародышевой линии. Обычно такие птицы не продуцируют свободных вирусных частиц и, тем не менее, применение ретровирусных векторов в качестве «поставщиков» чужеродных генов животным, которые затем могут использоваться в пищу, неизбежно вызывает вопросы относительно безопасности такого подхода. Кроме того, размер трансгена, который может быть введен в организм реципиента в составе ретровирусного вектора, не превышает 8 т. п. н., а в некоторых случаях интеграция в исходный сайт нестабильна. Все это заставило исследователей искать альтернативные способы трансгеноза. Никаких специфичных для птиц ES-клеток не обнаружено, поэтому подход, основанный на их использовании, для птиц неприменим. Более перспективным представляется метод с использованием рекомбинантных эмбриональных клеток. Он состоит в следующем. Выделяют клетки бластодермы из куриного эмбриона, трансфицируют их с помощью катионных липидов (липосом), связанных с трансгенной ДНК (липосомная трансфекция), и повторно вводят в подзародышевую область свежеотложенных яиц. Часть потомков будет нести в каком-то небольшом количестве клетки донора: таких животных называют химерами. У некоторых химер клетки, произошедшие от трансфицированных клеток, могут образовывать линии зародышевых клеток, и после нескольких раундов скрещиваний таких химер можно получить линии трансгенных животных. Чтобы увеличить вероятность создания химер, несущих чужеродные гены в клетках зародышевой линии, число донорских клеток в химерах можно увеличить облучением эмбрионов реципиента перед введением в них трансфицированных клеток. Под действием облучения некоторые (но не все) клетки бластодермы погибнут, и соотношение между 108 трансфицированными клетками и клетками реципиента увеличится в пользу первых. По-видимому, таким образом можно получать трансгенных цыплят, хотя и с малой эффективностью. Трансгенных цыплят можно использовать для улучшения генотипа уже существующих пород — для придания им (in vivo) устойчивости к вирусным инфекциям и заболеваниям, вызываемым кокцидиями, повышения эффективности усвоения пищи, снижения уровня жира и холестерола в яйцах, повышения качества мяса. Было предложено также использовать яйцо с его высоким содержанием белка в качестве источника белковых продуктов, использующихся в фармацевтической промышленности. Экспрессия трансгена в клетках репродуктивного пути курицы, где обычно секретируется большое количество овальбумина, может способствовать накоплению соответствующего белкового продукта в яйце, откуда его можно затем выделить. Трансгенные рыбы. По мере истощения природных рыбных запасов все большую роль будет приобретать разведение рыбы в искусственных условиях. Основная цель исследований в этой области — создание рекомбинантных рыб путем трансгеноза. До настоящего времени трансгены вводили микроинъекцией ДНК или электропорацией оплодотворенных яйцеклеток различных видов рыб — карпа, зубатки, форели, лосося и т. д. Поскольку у рыб пронуклеус в оплодотворенной яйцеклетке плохо различим в обычный микроскоп, линеаризованную трансгенную ДНК вводят в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток или клеток эмбрионов, достигших стадии четырех бластомеров. Эмбриогенез у рыб протекает в водной среде вне организма, поэтому в имплантации нет необходимости. Все дальнейшие процессы могут протекать в резервуарах с регулируемой температурой. Выживаемость эмбрионов рыб после микроинъекций довольно высока, от 35 до 80%, а доля трансгенных потомков колеблется от 10 до 70%. Трансген можно обнаружить с помощью ПЦР с использованием либо препаратов эритроцитов зародышей, либо суммарной ДНК. Скрещивая трансгенных рыб, можно вывести трансгенные линии. Большинство первых исследований в этой области было направлено на исследование влияния трансгена гормона роста на скорость роста. В одном из экспериментов в яйцеклетки атлантического лосося был введен трансген, состоящий из следующих элементов: промотора гена антифризного белка американской бельдюги, кДНК гормона роста лосося, сигналов терминации/полиаденилирования 3'конца гена антифризного белка американской бельдюги. Как правило, трансгенные лососи были крупнее и быстрее прибавляли в весе, чем контрольные нетрансформированные особи. В этом случае была выбрана система экспрессии с ускоренной транскрипцией гена гормона роста в холодной воде и пригодная для «всех рыб», что позволяло избежать биологической несовместимости, которая могла бы 109 возникнуть, если бы ген гормона роста происходил не из рыб. Годовалые трансгенные особи, полученные в результате введения в яйцеклетки генетической конструкции гормона роста, подходящей для «всех лососей», весили примерно в 11 раз больше, чем нетрансгенные. Физиологическая активность линий таких трансгенных лососей в естественных условиях вызывает значительный интерес. Предполагается, что в будущем гены устойчивости к болезням и стрессовым воздействиям, а также гены, обуславливающие другие биологические особенности, будут введены как рыбам умеренных широт, так и тропическим рыбам. Контрольные вопросы: Какие методы используются для введения чужеродной ДНК эмбрионам животных?; 2. Приведите примеры использования трансгенных животных для получения полезных продуктов; 3. Расскажите о достижениях генетической инженерии в селекции животных, устойчивых к различным заболеваниям; 4. Преимущества трансгенных животных перед микроорганизмамипродуцентами биопрепаратов; 5. Какие Вы знаете рекомбинантные белки, получаемые из молока сельскохозяйственных животных?; 6. Особенности методики создания трансгенных птиц и рыб. Лекция №9 Биотехнология кормовых препаратов В результате изучения различных организмов было выяснено, что высокой интенсивностью синтеза белков отличаются многие микроорганизмы, причем белки микробных клеток имеют повышенное содержание незаменимых аминокислот. В специальных опытах была проведена пищевая и токсикологическая оценка белковой микробной массы, которая показывает, что клетки некоторых микроорганизмов можно использовать в качестве концентрированных кормовых добавок, не уступающих по биологической ценности белков соевому шроту или рыбной муке. Микроорганизмы в качестве источников кормового белка имеют ряд преимуществ по сравнению с растительными и даже животными организмами. Они отличаются высоким (до 60 % сухой массы) и устойчивым содержанием белков, тогда как в растениях концентрация белковых веществ значительно варьирует в зависимости от условий выращивания, климата, погоды, типа почвы, агротехники и др. Наряду с белками в микробных клетках образуются и другие ценные в питательном отношении вещества: легкоусвояемые углеводы, липиды с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот, витамины, макро- и микроэлементы. При использовании микроорганизмов на ограниченной площади можно организовать промышленное производство и получать большое количество кормовых концентратов в любое время года, причем микробные клетки способны синтезировать белки из отходов сельского хозяйства и промышленности и, таким образом, позволяют одновременно решать другую важную проблему — утилизацию этих 110 отходов в целях охраны окружающей среды. Микроорганизмы имеют еще одно ценное преимущество — способность очень быстро наращивать белковую массу. Например, растения сои массой 500 кг в фазе созревания семян способны за сутки синтезировать 40 кг белков, бык такой же массы - 0,5-1,5 кг, а дрожжевые клетки массой 500 кг - до 1,5 т белков. В качестве источников кормового белка наиболее часто используются различные виды дрожжей и бактерий, микроскопические грибы, одноклеточные водоросли, белковые коагуляты травянистых растений. Кормовые дрожжи. Дрожжи выращивают на гидролизатах из отходов древесины и другого целлюлозосодержащего растительного сырья, которые при гидролизе образуют легкоусвояемые для микроорганизмов формы углеводов. В качестве исходного сырья при такой технологии получения кормового белка обычно используются отходы целлюлозной и деревообрабатывающей промышленности, солома, хлопковая шелуха, корзинки подсолнечника, льняная костра, стержни кукурузных початков, свекловичная меласса, картофельная мезга, виноградные выжимки, пивная дробина, верховой малоразложившийся торф, барда спиртовых производств, отходы кондитерской и молочной промышленности. Измельченное растительное сырье, содержащее большое количество клетчатки, гемицеллюлоз, пентозанов, подвергается кислотному гидролизу при повышенном давлении и температуре, в результате чего 60—65 % содержащихся в них полисахаридов гидролизуются до моносахаридов. Полученный гидролизат отделяют от лигнина, избыток кислоты, применяемой для гидролиза, нейтрализуют известковым молоком или аммиачной водой. После охлаждения и отстаивания в гидролизат добавляют минеральные соли, витамины и другие вещества, необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов. Полученная таким образом питательная среда подается в ферментерный цех, где осуществляется выращивание дрожжей. Для культивирования на гидролизатах растительных отходов наиболее эффективны дрожжи родов Candida, Torulopsis, Saccharomyces, которые способны использовать в качестве источника углерода гексозы, пентозы и органические кислоты. При оптимальных условиях из 1 т отходов хвойной древесины можно получить 200 кг кормовых дрожжей. Для получения кормовых дрожжей применяется технология их глубинного выращивания в специальных аппаратах — ферментерах, в которых обеспечивается режим постоянного перемешивания суспензии микробных клеток в жидкой питательной среде и оптимальные условия аэрации. Рабочий цикл выращивания культуры дрожжей длится около 20 ч. По окончании рабочего цикла культуральная жидкость вместе с суспендированными в ней клетками дрожжей выводится из ферментера, а в него вновь подается питательный субстрат и культура дрожжевых клеток для выращивания. 111 Выведенная из ферментера суспензия микробных клеток далее подается на флотационную установку, с помощью которой производится отделение биомассы дрожжей от культуральной жидкости. В процессе флотации происходит вспенивание суспензии, при этом микробные клетки всплывают на поверхность вместе с пеной, которая отделяется от жидкой фазы декантацией. После отстаивания дрожжевая масса концентрируется с помощью сепаратора. Для достижения лучшей перевариваемости дрожжей в организме животных проводится специальная обработка микробных клеток (механическая, ультразвуковая, термическая, ферментативная), обеспечивающая разрушение их клеточных оболочек. Затем дрожжевая масса упаривается до необходимой концентрации и высушивается, влажность готового продукта не должна превышать 8—10%. В сухой дрожжевой массе содержится 40-60 % сырого белка, 25-30 % усвояемых углеводов, 3-5 % сырого жира, 6-7 % клетчатки и зольных веществ, большое количество витаминов (до 50 мг%). Посредством обработки дрожжей ультрафиолетовыми лучами проводится их обогащение витамином D2, который образуется из содержащегося в них эргостерина. Для улучшения физических свойств готового продукта кормовые дрожжи выпускают в гранулированном виде. В России и некоторых других нефтедобывающих странах разработаны технологии получения кормовых дрожжей из н-парафинов нефти. Дрожжевые клетки могут использовать в качестве источников углерода для их роста неразветвленные углеводороды с числом углеродных атомов от десяти до тридцати. Они представляют собой жидкие фракции с температурами кипения 200-320°С, которые выделяют из нефти путем ее перегонки. Наиболее эффективны для выращивания на н-парафинах нефти отселектированные штаммы дрожжей Candida guilliermondii. Выделение и сушка дрожжевой массы проводится примерно по такой же технологии, как и в гидролизном производстве. Высушенная дрожжевая масса гранулируется и используется как белково-витаминный концентрат (БВК) для кормления сельскохозяйственных животных, содержащий до 50—60 % белковых веществ. В Национальном центре биотехнологии РК разработаны технологии получения микробиологического кормового белка для животных. Получено несколько вариантов кормовых добавок: кормовые дрожжи на основе Saccharomyces cerevise, Candida tropicalis шт. СК-4, а также микробиологический L-лизин, на основе продуцента лизина Brevibacterium sp. шт.92. Проведены эксперименты глубинного культивирования Candida tropicalis шт. СК-4 в fed-batch режиме в ферментере объемом 7 л с использованием в качестве углеродного субстрата глюкозы. Разработаны условия культивирования продуцента лизина в batch- режиме. Получена опытная партия кормовой добавки для животных на основе дрожжей Saccharomyces cerevise (С.К.Барбасова и соавт., 2011). 112 Белковые концентраты из бактерий. Наряду с получением кормовых дрожжей важное значение для кормопроизводства имеют также бактериальные белковые концентраты с содержанием сырого белка 60-80 % от сухой массы. Известно более 30 видов бактерий, которые могут быть использованы в качестве источников полноценного кормового белка. Бактерии способны наращивать биомассу в несколько раз быстрее дрожжевых клеток и в белке бактерий содержится значительно больше серосодержащих аминокислот, вследствие чего он имеет более высокую биологическую ценность по сравнению с белком дрожжей. Источником углерода для бактерий могут служить различные газообразные продукты (природный и попутный газы, газовый конденсат и др.), низшие спирты (метанол и этанол), водород. Чаще всего на газовых питательных средах выращивают бактерии рода Methylococcus, способные при оптимальных условиях утилизировать до 85-90 % подаваемого в ферментер метана. В связи с тем, что газовая среда из метана и воздуха взрывоопасна и для лучшей утилизации метана бактериями требует постоянной рециркуляции, производство кормового белка из газообразных продуктов является довольно сложным и дорогим. Более широкое применение находит технология выращивания бактериальной белковой массы на метаноле, который можно легко получить путем окисления метана. При культивировании на питательной среде, содержащей метанол, наиболее эффективны бактерии родов Methylomonas, Pseudomonas, Methylophillus. Выращивают эти бактерии в обычном ферментере с использованием жидкой питательной среды. Широкомасштабное производство кормовых белков на основе использования метанола впервые было организовано в Англии. Концерном «ICI» выпускается кормовой белковый препарат с коммерческим названием «Прутин». В России также разработана технология получения бактериальной белковой массы из метанола, коммерческое название препарата — «Меприн». Он содержит в своем составе до 70-74 % от сухой массы белков, до 5 % липидов, около 10 % минеральных веществ, 10-13 % нуклеиновых кислот. На основе культивирования бактерий рода Acinetobacter разрабатывается технология получения кормового белка из этанола (название препарата «Эприн»), который может иметь также и пищевое назначение. Высокой интенсивностью синтеза белков характеризуются водородокисляющие бактерии, способные накапливать в своих клетках до 80 % сырого белка в расчете на сухое вещество. Эти бактерии используют энергию окисления водорода для утилизации углекислоты, а некоторые штаммы и для усвоения атмосферного азота. Для культивирования водородокисляющих бактерий в составе газовой среды обычно содержится 70-80 % водорода, 20-30 % кислорода и 3-5 % углекислоты. Высокую эффективность при выращивании на такой газовой среде имеют бактерии родов Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, 113 Corinebacterium и др. Обычно водород для производства белковой массы получают из воды путем ее электролитического (электролиз) или фотохимического разложения. Углекислота может быть использована из газообразных отходов каких-либо промышленных производств, а также топочных газов, что одновременно решает проблему очистки газовой среды. Производство кормового белка на основе водородокисляющих бактерий может быть также организовано вблизи химических предприятий, где в качестве побочного продукта образуется водород. Кормовые белки из водорослей. В России и ряде других стран для производства кормового белка используются одноклеточные водоросли Chlorella и Scenedesmus, а также сине-зеленые водоросли из рода Spirulina, которые способны синтезировать белки и другие органические вещества из углекислоты, воды и минеральных веществ за счет усвоения энергии солнечного света. Для их выращивания необходимо обеспечивать определенные режимы освещения и температуры, а также требуются большие объемы воды. Чаще всего в естественных условиях водоросли выращивают в южных регионах с использованием бассейнов открытого типа, однако разрабатываются и технологии их культивирования в закрытой системе. Водоросли хлорелла и сценедесмус требуют для своего выращивания нейтральной среды, их клетки имеют довольно плотную целлюлозную оболочку, вследствие чего хуже перевариваются в организме животных. Для лучшей их переваримости проводится разрушение целлюлозных оболочек посредством специальной обработки. Клетки спирулины в 100 раз крупнее хлореллы, однако они не имеют прочной целлюлозной оболочки и поэтому лучше перевариваются в организме животных. Выращивается спирулина в щелочной среде (рН 10-11), при естественных условиях в щелочных озерах. По интенсивности накопления биомассы водоросли, хотя и уступают кормовым дрожжам и бактериям, значительно превосходят сельскохозяйственные растения. При их выращивании в культиваторах открытого типа с 1 га водной поверхности можно получать до 70 т сухой биомассы в год, тогда как при возделывании пшеницы – 3-4 т, риса - 5 т, сои - 6 т, кукурузы - 7 т. Технология получения белковой массы из клеток водорослей включает выращивание промышленной культуры в культиваторах открытого или закрытого типа, отделение водорослей от массы воды, приготовление товарного продукта в виде суспензии, сухого порошка или пастообразной массы. Процесс отделения клеток водорослей от массы воды энергоемкий, так как необходимо перерабатывать большие объемы жидкости. В России наиболее распространено выращивание хлореллы, которая применяется для кормления сельскохозяйственных животных в виде суспензии (1,5 г/л сухого вещества) или сухого порошка. Суточная норма суспензии хлореллы при кормлении молодняка крупного рогатого 114 скота – 3-6 л, взрослых животных - 8-10 л. При добавлении в корм жвачных животных муки хлореллы допускается замена 50 % растительного белка белком водоросли. Важное значение имеет выращивание водорослей на стоках промышленных предприятий, тепловых электростанций, животноводческих комплексов, так как в этих случаях наряду с получением кормового белка одновременно решаются проблемы, связанные с защитой окружающей среды. Так, например, выращивание культуры сценедесмус или хлореллы на стоках животноводческих комплексов в течение 15 сут позволяет почти полностью очистить их от органических веществ, исчезает запах и цвет. При культивировании водорослей на промышленных стоках или стоках тепловых станций используется отводимый с этих объектов избыток тепла, а также утилизируется углекислота, образуемая как побочный продукт технологических процессов и в результате сжигания различных отходов. Культиваторы для выращивания водорослей открытого типа имеются во многих странах. Крупнейшая фирма по выращиванию хлореллы «Хлорелла Сан Компани» имеется в Японии. В Болгарии на водах термальных источников культивируются водоросли хлорелла и сценедесмус, причем болгарским ученым удалось получить штаммы хлореллы без целлюлозной оболочки, вследствие чего биомасса таких клеток хорошо переваривается в организме животных. В значительном количестве белковые концентраты из водоросли спирулины производятся в странах центральной Африки и Мексике, где имеются щелочные озера. Крупнейшим производителем различной продукции из биомассы и белков спирулины является фирма «Coca Текскоко» (Мексика). В Италии разрабатывается технология выращивания клеток спирулины на морской воде и в культиваторах закрытого типа. В связи с тем, что биомасса водорослей рода Spirulina легко переваривается ферментами желудочного сока и характеризуется высоким содержанием белков (до 70% сухой массы), хорошо сбалансированных по аминокислотному составу, она в ряде стран используется для приготовления продуктов питания, главным образом кондитерских изделий, обогащенных белком. Учитывая важное значение вводимых в промышленную культуру водорослей как дополнительного источника полноценного белка для кормления сельскохозяйственных животных и питания людей, учеными разных направлений — селекционерами, генетиками, биохимиками — проводятся исследования по улучшению существующих промышленных штаммов одноклеточных водорослей и получению новых генотипов, которые должны сочетать в себе высокую интенсивность фотосинтеза, холодоустойчивость, хорошую переваримость, способность синтезировать большое количество белка лучшего качества (повышенное содержание незаменимых аминокислот) и полнее утилизировать субстрат. Важная 115 роль в реализации таких исследований отводится методам генетической инженерии. Белки микроскопических грибов. Ценным источником хорошо сбалансированных по аминокислотному составу белков являются клетки мицелия многих микроскопических грибов. По своим питательным свойствам белки грибов приближаются к белкам сои и мяса, вследствие чего могут использоваться не только для приготовления кормовых концентратов, но и как добавка в пищу человека. Сырьем для промышленного выращивания микроскопических грибов обычно служат растительные отходы, содержащие клетчатку, гемицеллюлозы, лигнин. При этом одновременно решаются две важные задачи — получение белковой массы и утилизация отходов растениеводства, деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности, которые могут быть источниками загрязнения окружающей среды. Особенно важно найти активные штаммы микроорганизмов, способные утилизировать углерод лигнина, обладающего высокой устойчивостью к разложению микрофлорой. В природе лигнин разлагается лишь грибами коричневой и белой гнили из родов Stropharia, Pleurotus, Aborkporus, Coriolus, Stereum и др. В настоящее время в процессе исследований отобраны атоксичные быстрорастущие штаммы мезо- и термофильных грибов для промышленного культивирования из родов Penicikium, Aspergillus, Fusarium, Trichoderma. Клетки мицелия этих грибов имеют тонкую клеточную оболочку, вследствие чего очень хорошо перевариваются в желудочно-кишечном тракте животных. Они содержат в своем составе комплекс ароматических веществ, улучшающих их вкусовые качества, богаты витаминами и легкоусвояемыми липидами. По сравнению с дрожжевыми белки микроскопических грибов отличаются повышенным содержанием серосодержащих аминокислот и лучшей усвояемостью. Концентрация нуклеиновых кислот в грибном мицелии (1-4 % от сухой массы) почти такая же, как в тканях растительного организма. Вместе с тем в биомассе грибов значительно меньше, чем в дрожжах, синтезируется белков (20-60 % от сухой массы) и у них относительно медленней происходит рост биомассы (удвоение биомассы через 4-16 ч, тогда как у дрожжей через 2-3 ч). Отдельные микроорганизмы представляют большой интерес и в качестве пробиотиков. Пробиотики – это биопрепараты, содержащие живые микроорганизмы – симбионты человека и животных, обладающие способностью восстанавливать нарушенную микроэкологию организмов. К ним относятся бифидобактерии, лактобациллы, стрептококки и др., присутствующие в организме с самого рождения. В ветеринарной практике при разработке пробиотиков, кроме названных родов бактерий, используются дрожжи и грибы (Saccharomyces cerevisiae, Candida pintolonesi, Aspergillus niger, Asp.oryzae). Пробиотики применяются с целью коррекции микроэкологии. 116 Сырье, используемое для приготовления среды культивирования, должно быть безвредным для человека и животных. Основной субстрат – обезжиренное молоко, гидролизованное молоко. Биомасса микробовсимбионтов концентрируется на сепараторах, далее вносятся компоненты поддерживающей среды при хранении (желатин, сахароза, обезжиренное молоко), разливаются в ампулы или флаконы, лиофилизируются. В технологии создания пробиотических препаратов в основном используются молочнокислые бактерии, реже бациллы, эшерихии и другие. Например, в состав бактолакта (Япония) входят Lactobacillus rhamnosum, Lactobacillus casei, Lactobacillus faecium, линекса (Россия) – Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, биосоприна (Украина) -Bacillus sibtilis, Bacillus cereus. В биотехнологии важную роль играют не только сами микроорганизмы, но и их метаболиты, а именно аминокислоты, витамины (первичные метаболиты), антибиотики и др. Аминокислоты. В мире ежегодно производится 700-800 тыс.тонн аминокислот (более половины составляет глютамин и лизин). Известно около 300 различных аминокислот, в живой природе используется 20, из них 8 незаменимые для человека (изолеицин, лейцин, лизин, метионин, треонин, валин, фенилаланин,триптофан). Последние поступают в организм с белком животного и растительного происхождения. Аминокислотный состав, их количество в клетках животного, растительного и микробного происхождения имеют определенные отличия. Так, в белках растений недостаточно лизина, метионина, триптофана, треонина. Большинство микроорганизмов в отличие от высших организмов способны синтезировать все 20 аминокислот, за исключением молочнокислых бактерий и некоторых других групп. В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают: гидролизом природного белоксодержащего сырья; химическим синтезом; микробиологическим синтезом; биотрансформацией предшнственников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов. Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот. Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности у некоторых микроорганизмов выделять в культуральную среду значительные количества какой-либо одной аминокислоты. При этом было подмечено, что большинство из нескольких тысяч проанализированных диких штаммов микроорганизмов продуцировали аминокислоты во внешнюю среду, но в очень незначительных количествах. Не зафиксировано никакой связи между таксономическим положением микроорганизмов и способностью к продуцированию той или иной аминокислоты. Так, среди возможных продуцентов глутаминовой кислоты отмечены организмы, из которых 30% - дрожжи, 30% - стрептомицеты, 20% - бактерий и 10% - микроскопические грибы. И лишь один из обследованных штаммов микроорганизмов 117 Corynebacterium glutamicum был способен к сверхсинтезу глутамата. Этот штамм и был использован при организации первого в мире крупномасштабного производства глутаминовой кислоты микробиологическим методом в Токио (1956). Данная аминокислота нашла широкое применение в пищевой промышленности с целью улучшения вкуса продукта. Перспективные продуценты постоянно улучшают посредством селекции мутантов с измененной генетической программой и регуляторными свойствами. К ним, кроме Corynebacterium, можно отнести штаммы таких микроорганизмов, как Brevibacterium, Micrococcus, Arthrobacter и др. Источником углерода для штаммов-продуцентов Corynebacterium glutamicum являются глюкоза, сахароза, реже фруктоза, мальтоза (в составе мелассы, молочной сыворотки, гидролизата казеина и др.). Источником азота могут быть мочевина, сульфат или фосфат аммония, кукурузный экстракт, гидролизат дрожжей. В качестве стимуляторов роста используют кукурузный экстракт, дрожжевой гидролизат, витамины группы В, макро- и микроэлементы (Са, Mg, Mn, Fe, Р). Лизин в промышленных масштабах синтезируется, прежде всего как кормовая добавка. В условиях производства лизин получают глубинной периодической ферментации Brevibacterium flavum или Corynebacterium glutamicum при 30-33°С, рН 7,0-7,2 в течение 2-3 суток. Лизин накапливается в культуральной жидкости к концу экспоненциальной фазы роста. По окончании ферментации культуральную жидкость отделяют от клеточной массы. Лизин выделяют из культуральной жидкости, смешивают с наполнителем (пшеничные отруби и др.), гранулируют либо в жидкой форме используют в качестве кормового концентрата. Гранулированный лизин содержит 7-10% лизина. В клетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного метаболического пути биосинтеза, общего для трех аминокислот – лизина, метионина и треонина. Витамины. Биологическая активность витаминов определяется тем, что они входят в состав активных центров ферментов в качестве кофакторов. Поэтому недостаток витаминов понижает биокаталитическую активность ферментов, влияет на обменные процессы, рост и развитие организма. Биосинтез витаминов в естественных условиях осуществляют растения и микроорганизмы. При обработке растительной пищи нередко наблюдается потеря витаминов. Так при получении муки высшего сорта теряется 80-90% витаминов. В качестве биопродуцентов используются одноклеточные микрорганизмы, актиномицеты, метанобразующие, фотосинтезирующие бактерии, в том числе более 10 видов пропионовокислых бактерий. Селекционирован штамм Propionibacterium ari, способный активно выделять В12 из клетки в отличие от других продуцентов данного рода, 118 накапливающих витамин внутри клетки. Продукт получают путем глубинного культивирования штаммов-продуцентов в анаэробных условиях на субстрате, содержащем кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония. Рибофлавин (витамин В2) синтезируют высшие растения, дрожжи, мицелиальные грибы и бактерии. Из 1 тонны моркови можно получить 1 г рибофлавина, из 1 тонны печени – 6 г., а при культивировании производственных штаммов – Eremothecium ashbyii или Ashbya gossipii в 1 тонне питательной среды накапливается 25 кг витамина. Также в качестве продуцентов используются мутантные штаммы B.subtillis и Asp.niger. Культивирование штаммов производят в ферментерах, при постоянной аэрации. В качестве субстрата используются соевая мука, меласса, молочная сыворотка, рыбная и кукурузная мука. В качестве продуцентов эргостерина (предшественника витамина D2 – кальциферол) используются Saccharomyces carlsbergensis и S.cerevisiae. Ферментация дрожжей осуществляется в условиях аэрации. Полученную биомассу гидролизуют раствором соляной кислоты, затем очищают спиртом, концентрируют и облучают УФЛ с длиной волны 280-300 нм. Излучение возбуждает отдельные химические связи в углеродных циклах, вызывает превращение эргостерина в витамин. Крупномасштабное производство другого, не менее важного для организма человека и животных, витамина С – L- аскорбиновой кислоты, представляет собой трудоемкий процесс, включающий одну микробиологическую стадию и несколько химических. Исходным субстратом для него является D- глюкоза. На последнем этапе этого процесса 2-кето-L-гулоновая кислота (2- KLG) превращается химическим путем в L-аскорбиновую кислоту. Биохимические исследования метаболизма различных микроорганизмов показали, что 2- KLG можно получить, включая совместное культивирование микроорганизмов Corynebacterium и Erwinica herbicola для превращения глюкозы в 2- KLG. Однако условия культивирования, оптимальные для одного организма, неприемлемы для другого, что влечет спонтанное «вымывание» из среды одного из них. В подобных случаях можно культивировать микроорганизмы последовательно, но такой процесс трудно сделать непрерывным, так как для роста микроорганизмов необходимы существенно разные среды. Наиболее простой способ – создание одного микроорганизма, способного превращать D-глюкозу в 2- KLG, состоит в выделении гена 2- KLG-редуктазы Corynebacterium и введении его в Erwinica herbicola. Трансформированные клетки Erwinica herbicola активно превращают D-глюкозу непосредственно в 2- KLG. При этом собственные ферменты Erwinica herbicola, локализованные во внутренней мембране бактериальной клетки, преобразуют глюкозу в 2,5-DKG (2,5дикетоглюкановая кислота), а 2,5-DKG-редуктаза, локализованная в цитоплазме, катализирует процесс превращения 2,5- DKG в 2- KLG. 119 Следовательно, с помощью генетических манипуляций удалось в одном организме осуществить метаболические реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный продукт комбинированного метаболического пути. Такой организм используется как фабрика для производства 2KLG, заменяющая три стадии в том процессе получения Lаскорбиновой кислоты, который доминирует и в настоящее время. Антибиотики, как и пигменты и токсины, относятся к вторичным метаболитам микроорганизмов, т.е. веществом не являющимся обязательным для роста или функционирования клетки, но синтезирующееся в стационарной фазе. Они применяются в животноводстве не только как лекарственный препарат, но и как кормовая добавка. Свойствами стимулирования роста животных обладают более 20 антибиотиков, синтезируемые мицелиальными грибами (биомицин и террамицин) и стрептомицинами (гризин, флавомицин, монензин, тилозин). Наполнителем кормовой добавки чаще всего используется соевая мука. Биосинтез антибиотиков, как и любых других вторичных метаболитов, возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции (конец трофофазы) и достигает максимума в стационарной фазе (идиофазе). Считают, что в конце трофофазы изменяется энзиматический статус клеток, появляются индукторы вторичного метаболизма, освобождающие гены вторичного метаболизма из-под влияния катаболитной репрессии. Поэтому любые механизмы, тормозящие клеточную пролиферацию и активный рост, стрессовые ситуации, активируют процесс образования антибиотиков. Процесс культивирования идиолитов проходит две фазы. На первой фазе происходит накопление достаточного количества биомассы, которая выращивается на среде для роста микроорганизма. Эта фаза должна быть быстрой, а питательная среда дешевой. На второй фазе осуществляется запуск и активный синтез антибиотика. На этой фазе ферментацию ведут на продуктивной среде. Контрольные вопросы: 1.Назовите исходное сырье и роды дрожжей, используемые для получения кормового белка; 2. Назовите источники углерода и виды бактерий, применяемые в производстве белковых концентратов; 3.В чем заключается технология получения белковой массы из клеток водорослей? 4. Расскажите о современном производстве пробиотиков, аминокислот, витаминов и кормовых антибиотиков. Лекция №10 Биотехнология и биобезопасность Встраивание в ДНК реципиентной клетки чужеродного донорского гена сопряжено с определенными трудностями, главными из которых являются обеспечение адресной вставки гена или группы генов, а также их нормального функционирования – экспрессии. Эта проблема 120 существует постоянно и ее решение во многих случаях пока имеет случайный характер. Еще более важной является проблема генетического риска, возможного получения мутантов с содержанием токсичных или аллергенных для человека белков или других опасных соединений. Реальный риск, связанный с поведением чужеродного гена в реципиентной клетке, гипотетически всегда существует. Это, прежде всего, может вызываться плейотропным эффектом при взаимодействии и взаимозаменяемости генов. По мнению К.Г. Газаряна, дестабилизация генома при трансгенозе может происходить не только за счет обогащения генома новыми генами или мутагенного эффекта вставки, а, возможно, в силу индуцирования эндогенных систем рекомбинации и активации «молчащих» генов. Все это дает основание считать теоретически возможным появление при трансгенозе опасных для здоровья и жизни человека генотипов. Риск получения таких мутантов значительно возрастает при использовании искусственных, синтетических генов для получения трансгенных растений, животных и микроорганизмов с улучшенными и принципиально новыми свойствами. Именно эти обстоятельства в определенной мере оправдывают тревогу многих людей, их настойчивое требование запретить создание и особенно использование генетически модифицированных организмов и получаемых из них пищевых и других продуктов или хотя бы ввести систему их обязательного маркирования. К двум причинам можно добавить и третью – спонтанный перенос с пыльцой генов-модификаторов в другие растения, их взаимодействие с генами третьих генотипов, что может привести к появлению новых генотипов с опасными свойствами для человека и окружающей среды. Известно, что начало дискуссии по проблеме биобезопасности в науке и обществе положили сами ученые – основатели нового направления – биоинженерии. В 1974 г. одиннадцать ведущих молекулярных биологов мира во главе с отцом генной инженерии американцем П. Бергом, создавшим первую рекомбинантную молекулу ДНК, обратились к мировому сообществу с письмом через журнал «Science», в котором предложили отказаться от экспериментов с рекомбинантными ДНК до проведения Международной конференции по этой проблеме. Однако уже в 1975 г. на конференции в Асиломаре (США) ученые пришли к выводу, что эксперименты в области генной инженерии, новейшей биотехнологии, не более опасны, чем аналогичные работы в других отраслях, но в них, как и везде, необходим строгий контроль за соблюдением мер биобезопасности. В 1976 г. в США были приняты первые правила, регламентирующие работу с рекомбинантными микроорганизмами. В них запрещалось выпускать их за стены лабораторий. В конце 70-х годов в большинстве стран мира было разработано соответствующее законодательство. Постепенно эти правила корректировались в сторону 121 смягчения жесткости требований. Тридцать лет интенсивных работ в мире по новейшей биотехнологии – генетической инженерии – подтвердили их безопасность. В лабораториях, осуществляющих генно-инженерные исследования и получение трансгенных организмов, не связанных с созданием биологических средств поражения людей и природы, не зарегистрировано случаев получения опасных для здоровья и жизни человека, а также для окружающей среды генотипов растений и животных. Микробиологи целенаправленно ведут работы по усилению или ослаблению вирулентных и других свойств бактерий, решая ряд важных проблем медицинской биобезопасности и защиты государств от бактериологического оружия и агрессии. К сожалению, мировой терроризм не останавливается перед выбором средств для своих преступлений. Он использует в этих целях и опасные для жизни людей биоресурсы. Мировому сообществу предстоит срочно выработать и осуществить систему самых эффективных мер по пресечению терроризма и недопущения использования достижений биологической науки в его зловещих целях. Ученые в состоянии обеспечить многолетнюю стабильность биобезопасности в биоинженерии. Ее можно объяснить следующими основными положениями. Во-первых, биоинженеры используют в своих работах природные гены, которые на протяжении всей эволюции участвовали и участвуют в рекомбиногенезе, подвергаются отбору и элиминации, вследствие чего выработались механизмы на всех уровнях организации биологических объектов, обеспечивающие устойчивый характер репарации процессов биосинтеза белков и их качества. Вовторых, во всех биоинженерных лабораториях разработаны и постоянно применяются эффективные методы мониторинга за качеством получаемых трансгенных организмов и, прежде всего, за качеством и свойствами белковых и других компонентов вновь созданных генотипов. Это позволяет заблаговременно, на этапе создания генетически модифицированных организмов (ГМО) в лаборатории, выявлять опасные для человека и окружающей среды генотипы и не допускать их выпуска из лаборатории для использования в производстве. По мнению большинства генных инженеров, методическая оснащенность мониторинга за созданием и использованием ГМО нуждается в дальнейшем совершенствовании. Должны быть разработаны новые методики для своевременного выявления токсичных и аллергенных веществ у трансгенных объектов, охватывающие группы и классы соединений низкомолекулярной природы. И, в-третьих, для создания генетически модифицированных организмов специалисты отбирают известные, проверенные природные гены и их регуляторные генетические структуры. Созданные на их основе векторы обеспечивают получение трансгенов с заданными свойствами. В конечном итоге это и обеспечивает создание безопасных 122 для людей и окружающей среды новых генотипов, получающих разрешение на использование в производстве. В целом ситуация с генно-инженерными исследованиями по трансгенозу должна оставаться под строжайшим контролем ученых и государства. По мнению ряда исследователей технология получения трансгенных животных далека от совершенства. Непредсказуемость результатов переноса чужеродных генов и наличие неожиданных эффектов ограничивает по их мнению практическое применение методов трансгеноза в животноводстве. Ученые биоинженерных центров – мировых и национальных – должны активно развивать работы по совершенствованию техники, методов, технологий и критериев биобезопасности ГМО. И только на такой основе они смогут ускорять процесс создания принципиально новых генотипов растений, животных и микроорганизмов для повышения устойчивости и продуктивности агропромышленного производства, решения сложных проблем современной медицины и других направлений науки и экономики. Критерий, показатели и методы оценки генетически модифицированных организмов и получаемых из них продуктов на биобезопасность. Важным этапом оценки биобезопасности генноинженерно-модифицированных организмов и полученных из них пищевых и других продуктов является санитарно-гигиеническая экспертиза. При этом должны проверяться: химический состав исходных и трансгенных растений; не ухудшилась ли биологическая ценность и усвояемость приготовленных из ГМО продуктов; не могут ли ГМО и полученные из них продукты вызывать аллергию или влиять на иммунную систему человека; не окажутся ли они токсичными, канцерогенными или мутагенными; не влияют ли чужеродные гены на репродуктивные функции животных и человека; не сможет ли введенный ген переноситься в другие организмы и будет ли передаваться потомкам растений; не влияет ли новый ген на поражаемость растений болезнями и повреждаемость вредителями; не влияют ли трансгенные растения на почвенную микрофлору и другие составляющие биоценоза и др. Обязательной и крайне важной является также медикобиологическая оценка пищевой продукции, полученной из ГМО. Например, в России разработаны методические указания «Медикобиологическая оценка пищевой продукции из генетически модифицированных источников». Методическими указаниями установлены порядок гигиенической экспертизы и государственной регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников. Утверждены методики медикогигиенической, медико-биологической оценки и клинических испытаний новых видов пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников. Методические указания являются официальным изданием и их выполнение должно строго кон123 тролироваться Минздравом РФ, а также соответствующими юридическими и правовыми органами. Особенности государственного регулирования генноинженерной деятельности и контроля за биобезопасностью получения и использования ГМО в США. Штаты занимают первое место в мире по объемам производства генетически модифицированной продукции. В стране приняты законы и постановления Конгресса и президента, разрешающие использование ГМО в производстве. Половина посевов сои и четвертая часть посевов кукурузы в фермерских хозяйствах заняты трансгенными сортами и гибридами. За государственную регистрацию генетически модифицированных организмов отвечают три ведомства – Министерство здравоохранения, Министерство сельского хозяйства и Министерство экологии. Принятие решения о регистрации или не регистрации модифицированных организмов каждое из этих министерств принимает самостоятельно, независимо. Положительное решение может быть принято только на основании согласия всех трех ведомств. Департамент сельского хозяйства (USDA), его Служба ветеринарной инспекции и защиты растений (APHIS) в соответствии с утвержденными правилами и процедурой уведомления (нотификацией) принимает решения о передвижении генетически модифицированных организмов между штатами, об импорте и выпуске их в окружающую среду. Эти правила впервые были опубликованы и вступили в силу еще в марте 1993 г. Своевременное создание эффективной нормативно-правовой базы биотехнологии и биоинженерии было еще одним фактором, обеспечивающим ускоренное развитие науки и практики в области генно-инженерной деятельности. Главное направление в биоинженерии – создание генетически модифицированных сортов и гибридов сои, кукурузы, хлопчатника, сахарной свеклы, картофеля, томатов, рапса и других культур, устойчивых к тотальному гербициду раундапу (глифосфату) грибным болезням и насекомым. Интенсивно также ведутся исследования по созданию сортов пшеницы и других культур, устойчивых к грибным и вирусным заболеваниям. Наибольшие успехи в создании устойчивых сортов и гибридов перечисленных выше культур, достигли ученые всемирно известной фирмы «Монсанто» (Сент-Луис, штат Миссури). Никаких проблем с выращиванием и реализацией семян и зерна генетически модифицированных сортов и гибридов сои, кукурузы и других культур фермеры не испытывают и не выдвигают. За их счет они получают существенную добавку к прибыли, сокращая затраты на гербициды и пестициды и уход за посевами. Обязательного маркирования продовольственных товаров, полученных из генетически модифицированных сортов и гибридов, в Штатах пока не вводили. По желанию покупателей его могут ввести на любом торговом предприятии в любое время. 124 Казахстан - подписант Картохенского Протокола. Изучение проблемы регулирования оборота ГМО на основе законодательства Картахенского Протокола (Cartagena Protocol of Biosafety), позволило Казахстану разработать проекты «Концепции государственного регулирования оборота и контроля ГМО в РК», а также ряда нормативных документов, и создать предпосылки для формирования системы их регулирования в РК. Проведенный анализ показал, что практически ни в одной стране нет законодательства, способного предотвратить непредсказуемые последствия при создании, использовании и распространении ГМО. Сегодня в мире существует два различных принципа при решении проблем регулирования ГМО: принцип «предосторожности», которого придерживается ЕС, и принцип «существенной эквивалентности», которого придерживаются США, Австралия, Канада и др.страны (Е.М.Раманкулов, 2011). Проведенный мониторинг показал, что на рынки РК бесконтрольно поступает пищевая продукция, содержащая ГМингридиенты. РК целесообразно придерживаться в своей политике принципа предосторожности, который основан на крайней осторожности в использовании ГМО и требует введения маркировки «Продукт содержит ГМО», что очень важно для обеспечения пищевой безопасности. Важным положением Картахенского Протокола является право проводить оценку рисков продуктов генноинженерной деятельности для принятия решения относительно их импорта. В рамках выполнения принятых на себя обязательств, Правительство РК назначило Министерство сельского хозяйства – национальным координационным центром, Министерство образования и науки – компетентным органом. При этом первое министерство является контактным органом между Казахстаном и Секретариатом Протокола, а второе – отвечает за выполнение административных функций. Национальный центр биотехнологии РК определен как центр по реализции механизма посредничества по биобезопасности (МПБ). Последний действует в качестве центрального рынка информации, на котором происходит оперативный взаимный обмен информацией по биобезопасности между всеми сторонами Протокола. В настоящее время разработан проект Закона РК «О государственном регулировании генно-инженерной деятельности», который в настоящее время находится на рассмотрении Парламента. Задачами данного законопроекта являются защита здоровья населения; охрана окружающей среды при использовании ГМО, сохранение биологического разнообразия; обеспечение безопасности страны при осуществлении генно-инженерной деятельности; развитие генноинженерной деятельности и др. Реакция мировой общественности на ускоренное развитие биотехнологии и биоинженерии в ведущих странах мира. Во многих 125 странах ЕЭС сложилось отрицательное отношение общественности к развитию биотехнологии, главным образом, к созданию и использованию генноинженерно-модифицированных организмов. Европарламент и правительство ЕЭС приняли ряд специальных документов, ограничивающих и далее запрещающих выпуск в окружающую среду генетически модифицированных растений и других организмов. В то же время в США, Великобритании, Франции, странах Восточной Европы приняты важные правительственные решения в поддержку биотехнологии и биоинженерии, разрешающие использование генномодифицированных сортов и гибридов сельскохозяйственных культур. Среди активных противников биоинженерных модификаций, как правило, ученых почти нет. В большинстве своем это политики, предприниматели, представители СМИ. Научно обоснованных, проверенных аргументов против создания и использования ГМО и полученных из них продуктов ими не выдвигаются. А названные ими факты о, якобы, имевших место случаях нанесения ущерба здоровью людей или их гибели от использования генно-модифицированной пищи на поверку оказались не имеющими никакого отношения к трансгенным организмам. Научно обоснованный прогноз событий вокруг проблемы трансгенных организмов свидетельствует о том, что общественная волна протеста в мире, в том числе и в России, уже достигает своего апогея и при строгом соблюдении всех требований законов и углубленном научном мониторинге всего биоинженерного процесса в дальнейшем будет постепенно затухать. По мнению специалистов-биотехнологов страны, которые искусственно выдвигают различные причины, задерживающие развитие биотехнологии и биоинженерии и использование их достижений в производстве, в конечном итоге понесут значительный экономический урон, так как объем важнейшей биотехнологической и генно-инженерной продукции на мировом рынке будет постоянно возрастать, и они вынуждены будут тратить значительную часть своих валютных средств на покупку этих товаров на мировом рынке. Контрольные вопросы: Назовите критерий, показатели и методы оценки генетически модифицированных организмов и получаемых из них продуктов на биобезопасность? Какие работы проводятся в Республике Казахстан в рамках Картохенского Протокола? IV. ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ Занятие №1: Приготовление реагентов, используемых в постановке ИФА Цель занятия: Освоить методы получения реагентов для постановки различных вариантов ИФА 126 Оборудование и материалы: Хроматографическая колонка с сефадексом G-200; диализные трубки; пероксидаза хрена; специфические иммуноглобулины или антивидовые антитела; 0,1 М периодат натрия; 0,001 М ацетатный буфер, рН 4,4; 0,2 М бикарбонатный буфер, рН 9,5; боргидрат натрия (4 мг/мл) в дистиллированной воде; 0,1 боратный буфер, рН 7,4; глицерин; антиген; 0,05 М бикарбонатный буфер, рН 9,6; забуференный физиологический раствор с 0,1% Твин-20 (ЗФР-Твин); антитела против испытуемого антигена; антивидовые иммуноглобулины, меченные пероксидазой; 1% лимонная кислота (перед использованием рН доводят до 4,5); субстрат-ортофенилендиамин; перекись водорода, 30%; 2,0 М серная кислота; полистироловые планшеты; автоматические пипетки с переменным или постоянным объемом от 5 до 200 мкл; промывочное устройство; считывающее устройство; термостат; 0,05% бычьей сыворотки альбумин (БСА) с 0,05% Твином-20; 1% раствор желатина в ЗФР; ЗФР с рН 7,2-7,3; нитроцеллюлозный фильтр или другой пленочный носитель; антивидовые иммуноглобулины, меченные биотином; авидин, меченный пероксидазой; диаминобензидин и перекись водорода, 30%; микродозатор; мазкиотпечатки или культура клеток, выращенная на покровных стеклах и инфицированная вирусом; сыворотка крови, специфическая к тестируемому вирусу; нормальная сыворотка крови; ацетон, охлажденный до -20°С; физиологический раствор; дистиллированная вода; диаминобензидинтетрахлорид; 0,05 М Трис-НС1-буфер, рН 7,5; перекись водорода, 0,5%; микроскоп световой. Содержание занятий. В последние годы наблюдается активное развитие методов иммунохимического анализа, которые обеспечили решение важных проблем биологии и находят практическое применение в медицине, ветеринарии и растениеводстве. Высокая специфичность и чувствительность этих методов анализа достигается применением специальных маркеров-изотопов, флуроресцирующих красителей, ферментов. Последние занимают особое место в иммунологических и гистологических исследованиях. Направление иммунохимии, разрабатывающее способы определения различных физиологически активных веществ с использованием ферментов в качестве метки антигенов и антител, вошло в литературу под названием иммуноферментного анализа (ИФА). По своей чувствительности ИФА приравнивается к радиоиммунологическому анализу и имеет ряд существенных преимуществ: стабильность реагентов, меченных ферментами; отсутствие контакта с радиоактивными веществами; простата учета результатов реакций (изменение окраски субстрата под действием фермента можно наблюдать и визуально). 127 Методы ИФА можно разделить на две группы: «гетерогенные» (твердофазные) и «гомогенные», отличающиеся по принципу проведения анализа. «Гетерогенные» методы ИФА (ELISA - enzyme linked immunosorbent assay) основаны на использовании антигена и антител, иммобилизованных ковалентно или адсорбционно на нерастворимых носителях (целлюлоза, се-фароза, 4В, сефадекс, биогель, пористое стекло, ацетатные и нитроцеллюлоз-ные мембранные фильтры, стекловолокнистые фильтры и др.). Особенно распространен метод физической адсорбции антител и антигена на поверхности полистироловых лунок и пробирок. ELISA-тест требует обязательную стадию разъединения комплекса (меченное ферментом вещества - связывающий объект) от свободно меченного соединения. Анализ проводится в двух вариантах: прямой метод с использованием меченной иммунной сыворотки против гомологичного антигена и непрямой - с помощью меченной антивидовой сыворотки против иммуноглобулинов исследуемого вида животного. При «гомогенных» методах ИФА (EMITenzyme multiplied immu-notest) фермент конъюгируют с антигеном, который не теряет свои свойства в процессе связывания. Эти методы основаны на том факте, что взаимодействие антител с меченным антигеном приводит к снижению ферментативной активности. Простота и легкость разделения двух фаз по завершению реакции способствовали более широкому использованию вариантов ELISA в здравоохранении и сельском хозяйстве по сравнению с гомогенными методами. В настоящее время разработаны оптимальные условия и техника постановки твердофазного ИФА для диагностики бактериальных, вирусных инфекций у людей, животных и растений. Эти методы по чувствительности значительно превосходят вирусологические и серологические реакции, сохраняя при этом высокую специфичность. ИФА используется также для определения гормонов, онкофетальных антигенов, наркотиков, антибиотиков, антител к ДНК, иммунных комплексов и в экспресс-диагностике отравлений. Твердофазный ИФА оказался очень удобным для выявления синтеза моно-клональных антител в тканевых культурах. В ветеринарной практике ИФА может быть использован для проведения массовых обследований в целях ранней диагностики инфекционных болезней, наносящих огромный экономический ущерб животноводству (бруцеллез, туберкулез, лейкозы, ящур и др.), а также в ветеринарносанитарной экспертизе продуктов животноводства и сырья животного происхождения. Кроме того, данный метод позволит контролировать иммунобиологическое состояние у животных и определить эффективность применения вакцин и сывороток. В общем объеме иммунохимических анализов, проводимых в нашей стране и за рубежом, методы иммуноферментного анализа в ближайшее время 128 займут одно из ведущих мест в практике лабораторных и клинических исследований. Ферменты, применяемые в ИФА. Используемые ферменты должны отвечать требованиям, вытекающим из специфики метода: - высокая стабильность и активность энзима при условиях, которые являются оптимальными для взаимодействия антигена с антителами; - доступность и устойчивость при хранении и после получения ферментного конъюгата (антиген-фермент или антитело-фермент); - простота и чувствительность методов определения продуктов ферментативной реакции. В таблице приведены ферменты и их субстраты, последовательность расположения которых отражает распространенность их применения в иммуноферментном анализе (табл.1) Табл.1 № Ферменты п/п 1. Пероксидаза Мол. масса 40 000 2. 3. Щелочная фосфатаза Р-галактозидаза 100 000 518 000 Глюкозооксидаза Глюкозамилаза Ацетилхолинэстераза Лизоцим Глюкоза-6 фосфатдегидрогеназа 9. Малат-дегидрогеназа 10. Люцифераза 150 000 90 000 250 000 14 000 - 120 000 4. 5. 6. 7. 8. 70 000 80 000 Субстраты Н2О2, ортофенилендиамин р-нитрофенилфосфат О-нитрофенил-р-Dгалактозид Глюкоза Декстран Ацетилхолин Клеточные стенки Глюкоза-6-фосфат НАД Малат, НАД АТФ, люцифин Приготовление ферментного конъюгата. Известны две группы методов введения ферментативной метки: ковалентное связывание фермента с антителами (антигеном) и нековалентные методы, в которых связь между ферментом и антителами (антигеном) осуществляется иммунологически - через взаимодействие антигена с антителом. Наиболее употребительны ковалентные методы получения иммуноферментных комплексов. Ниже приводится метод приготовления конъюгата фермент-иммуноглобулины (антииммуноглобулины) по Nakane and Kawoi (1974). В основе этого метода лежит окисление периодатом натрия углеводной части молекулы пероксидазы с образованием активных альдегидных групп, которые в дальнейшем взаимодействуют с NH2 - группами иммуноглобулинов. 129 Метод приготовления конъюгата фермент-иммуноглобулины (антииммуноглобулины) по Nakane and Kawoi (1974) 1. Растворяют 4 мг пероксидазы хрена в 1 мл дистиллированной воды 2. Прибавляют 200 мкл свежеприготовленного раствора периодата натрия и осторожно перемешивают в течение 20 минут при комнатной температуре 3. Диализуют против ацетатного буфера в течение 16-18 часов при температуре 4°С 4. Вносят 20 мкл бикарбонатного буфера и доводят рН среды до 9,0-9,5 и сразу же прибавляют 1 мл фракции иммуноглобулинов (антииммуноглобулинов) 5. Добавляют 100 мкл свежеприготовленного раствора боргидрата натрия и оставляют на 2 часа при 4°С 6. Диализуют против боратного буфера (16-18 ч, 4°С) 7. Прибавляют равный объем 60% глицерина в боратном буфере и хранят при 4°С Для освобождения от несвязанных иммуноглобулинов и фермента проводят гель-фильтрацию на сефадексе G-200. Конъюгат сохраняет ферментативные и иммунохимические свойства в течение одного года. Известны факты значительного увеличения стабильности иммунопероксидазных комплексов в результате предварительного термостатирования иммуноглобулинов при 50°С. Принципы и техника постановки твердофазного иммуноферментного анализа. Ферментная метка может быть введена, как было указано выше, в антивидовые или специфические антитела, либо в антиген, что зависит от схемы постановки анализа. Кроме того, разработаны варианты ИФА с использованием ферментной метки через комплекс авидин-биотин. Определение антител с использованием меченных антивидовых иммуноглобулинов. Принцип ИФА в данном случае заключается в специфическом взаимодействии антивидовых антител, меченных ферментом, с антителами к испытуемому антигену, в результате чего достигается индикация образовавшегося комплекса антиген-антитело. Антивидовые иммуноглобулины конъюгированные ферментом представляют собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией животных-продуцентов иммуноглобулинами быка, кролика, мыши и других животных, меченную энзимами. В качестве твердой фазы используются полистироловые плашки. Метод постановки ИФА для определения антител 1. Разводят антиген в бикарбонатном буфере до концентрации 1 мкг/мл, вносят по 100 мл в лунки полистироловой плашки и оставляют на ночь при 4°С 2. Отмывают лунки 5-6 раз ЗФР-Твин-20 130 3. Разводят антителосодержащий материал в растворе ЗФР-Твин-20 в объеме 100 мкл и плашку помещают в термостат на 1-1,5 час при температуре 37°С. 4. Повторяют процедуру отмывки с ЗФР-Твин-20 5. Готовят рабочее разведение антивидовых антител, меченных пероксидазой в ЗФР-Твин-20, вносят в каждую лунку по 100 мкл конъюгата и выдерживают в термостате (37°С) в течение 1 часа 6. Повторяют процедуру отмывки 7. Вносят в лунки раствор субстрата - ортофенилендиамина по 100 мкл. Его готовят непосредственно перед использованием следующим образом: 10 мг ортофенилендиамина растворяют в 10 мл 1/% лимонной кислоты (рН 4,5) и добавляют 5 мкл Н202. Инкубируют при температуре 37°С 15-30 минут до появления желтой окраски. В качестве субстрата для пероксидазы можно использовать и 0,08% водный раствор 5аминосалициловой кислоты, содержащий 0,005% Н202 8. Останавливают реакцию путем добавления в каждую лунку 100 мкл 2М серной кислоты 9. Измеряют оптическую плотность при 492 нм В качестве отрицательных контролей используют нормальную (негативную) сыворотку крови (контроль для антигена) и лунки несенсибилизированные испытуемым антигеном (контроль для антител) В случае использования антивидовых иммуноглобулинов, меченных щелочной фосфатазой, в качестве субстрата берут 0,06-0,1% раствор рнитрофенилфосфата в диэтаноламиновом буфере, который состоит из 97 мл диэтаноламина (C4H11N02); 700 мл дистиллированной воды; 0,2 г NaN3; 0,1 г MgCl2-6H20. Добавляют 1 Н HCI до тех пор рН не станет 9,8 и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл. Хранят при температуре 4°С в темном месте. Реакцию останавливают 3М NaOH и учитывают ее результаты колориметрически при длине волны 405 нм. Определение антигена с помощью меченных специфических антител по «сэндвич» методу ИФА. Данный метод используется для определения антигенов, имеющих несколько детерминант. Возможность одновременного связывания антигена с антителами обоих типов зависит от того, является ли антиген бивалентным. Если же он моновалентен, то первые и вторые антитела должны обладать специфичностью к различным антигенным детерминантам одной и той же молекулы антигена. Название метода «сэндвич» обусловлено тем, что в процессе анализа антиген как бы «зажат» между антителами. Суть метода заключается в следующем. К твердой фазе с иммобилизированными антителами добавляют антиген. Затем проводят отмывку носителя от несвязавшихся компонентов и вносят меченные энзимом иммуноглобулины. После удаления избытка иммуноферментного конъюгата определяют концентрацию метки, связанной с твердой фазой с помощью субстрата для данного фермента. 131 В «сэндвич» методе могут применяться и антивидовые конъюгаты. При этом антиген, связанный с адсорбированными антителами, вступают в реакцию со специфическими немеченными иммуноглобулинами, которые в дальнейшем выявляются антивидовым конъюгатом, т.е. процедура исследований увеличивается на один этап. При постановке ИФА по указанной схеме следует испытать антитела, полученные от разных видов животных с целью предотвращения реакции иммобилизованных антител с антивидовым конъюгатом. Метод «сэндвич» может быть использован для обнаружения перекреста антител. Для этого сначала лунки покрывают антигеном, после чего добавляют антитела, которые специфично с ними связываются. Избыток антител отмывают и добавляют антиген, сшитый с ферментом. Если связавшиеся антитела перекрестно реагируют и с антигеном, то связанный с ферментом антиген будет также сорбироваться на твердой фазе. Количественно это будет определяться как увеличение поглощения в результате проведения катализируемой ферментом реакции. Данный метод был использован для изучения перекрестных реакций антиидиотипических сывороток с двумя препаратами идиотипа, а также для обнаружения анти-антиидиотипических антител. Возможно и другие варианты взаимного расположения антител и антигена. Наличие в «сэндвиче» дополнительных слоев может приводить к повышению чувствительности, однако оно вызывает увеличение фона и вариабельность получаемых результатов. Использование меченного ферментом антигена в конкурентном ИФА. Сущность метода заключается в следующем. К иммобилизованным антителам добавляют определенный антиген и комплекс антигена с ферментом. При этом происходит конкуренция определяемого и меченного антигенов за антидетерминанты антител. Через некоторое время конъюгат перераспределяется между раствором и носителем. Концентрация метки, измеряемая на твердой фазе, пропорциональна исходному содержанию исследуемого антигена. Метод прост и быстро выполним, однако имеется трудность в получении конъюгатов антиген-фермент. Иммуноферментный анализ с применением ферментной метки через комплекс авидин-биотин на пленочных сорбентах. В некоторых случаях химическая модификация фермента сопровождается ухудшением его активности, а антигена - снижением способности формировать прочный комплекс с антителами. В этой связи твердофазные методы ИФА с использованием нековалентных комплексов фермента маркера с антителами представляют определенный интерес. Наиболее эффективным подходом является включение ферментной метки через комплекс авидин-биотин. Он основан на использовании авидина-компонента яичного белка (мол.м. 66000 Д) и биотина витамина (мол.м. 228 Д) образующих комплекс, константа связывания 132 которого в десятки тысяч раз превышает прочность связи антигенантитело. Адсорбированный антиген выдерживают с образцом, содержащим антитела, отмывают и вносят антивидовые иммуноглобулины, ковалентно связанные с биотином. Добавляют авидин, меченный пероксидазой, образующий прочный комплекс с биотином, удаляют излишек конъюгата и после введения в систему субстрата определяют концентрацию антигена. Широкие испытания твердофазного ИФА в диагностических и исследовательских целях показали, что при анализе ограниченного числа проб удобными являются его неавтоматизированные варианты, которые основаны на использовании пленочных носителей. Метод постановки 1. Готовят двукратные разведения антигена в ЗФР, содержащий 0,05% Твина-20 (1 мкг/мкл, 500 нг/мкл, 250 нг/мкл, 125 нг/мкл) и наносят на поверхность пленочного сорбента в количестве 1-2 мкл 2. После высыхания аликвоты носитель погружают в 1% раствор желатина в ЗФР и выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре 3. Отмывают носитель последовательно 3 раза ЗФР-Твином и ЗФР 4. Погружают его в рабочее разведение антителосодержащей жидкости и ставят в термостат (37°С) на 1 час, а затем оставляют на 16-18 ч. при 4°С 5. Повторяют процедуру отмывки 6. Готовят рабочее разведение антивидовых иммуноглобулинов, меченных биотином, в ЗФР-Твине и инкубируют носитель 1 ч при 37°С 7. Повторяют процедуру отмывки 8. Выдерживают сорбент в рабочем разведении авидина, меченного пероксидазой, при 37°С в течение 1 часа 9. Повторяют процедуру отмывки 10.Помещают носитель в раствор субстрата - диаминобензидина (5 мг субстрата растворяют 10 мл ЗФР и добавляют 5 мкл 30% Н2О2) до появления коричневых пятен на местах нанесения антигена (в качестве субстрата может быть использован 4-хлор-1 -нафтол (3-4 мг субстрата растворяют в 1 мл этанола или метанола, доводят объем до 10 мл ЗФР и добавляют 5 мкл 30% Н202) 11. Отмывают 3 раза ЗФР 12. Высушивают на воздухе 13. Учет реакции проводят визуально по интенсивности окрашивания точек на поверхности пленочного сорбента, куда внесены пробы антигенов. Гистохимический метод иммуноферментного анализа (пероксидазный тест). Сущность метода заключается в соединении иммунопероксидазного конъюгата со специфическим антигеном и определении образовавшегося комплекса с помощью 133 диаминобензидинового реактива. В ветеринарии он более широкое применение находит в диагностике вирусных инфекций (бешенства, ящура и др.). Пероксидазный тест, как твердофазный ИФА, проводится в двух вариантах; прямой и непрямой. Последний чувствительнее, чем первый и не требует набора специфических иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, против антигена. Выбор пероксидазы в качестве метки антител объясняется тем, что ее молекулярная масса меньше, чем у других ферментов, используемых в иммуноферментном анализе. Поэтому иммунопероксидазный конъюгат лучше проникает сквозь клеточную мембрану. Пероксидазный тест обладает высокой специфичностью и не уступает по чувствительности методу флуоресцирующих антител. Достоинством его является простота и быстрота выполнения. Ниже приводится техника постановки непрямого пероксидазного теста: 1. Фиксируют препарат в течение 10 минут охлажденным ацетоном 2. Высушивают на воздухе 3. Наносят на поверхность препарата 200-300 мкл сыворотки крови, содержащей специфические антитела к определенному антигену 4. Инкубируют при температуре 37°С 1-2 ч во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне) 5. Промывают 5 минут физиологическим раствором, споласкивают дистиллированной водой 6. Наносят на препарат 200-300 мкл антивидового пероксидазного конъюгата в рабочем титре и помещают в термостат (37°С) на 1-2 часа или оставляют на ночь при 4°С 7. Повторяют процедуру промывки 8. Наносят несколько капель раствора субстрата - диаминобензидинтетрахлорида, инкубируют 5-10 минут. Раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием: 6 мг субстрата растворяют в 25 мл 0,05 М Трис-НС1-буфере (рН 7,5) и добавляют 3 мл 0,5% Н202 9. Повторяют процедуру промывки 10. Учитывают результаты иммунопероксидазного теста с помощью светового микроскопа. Субстрат разлагается пероксидазой, образуя продукт реакции коричневого цвета. В контрольном препарате окрашивания не выявляют. Получение иммуноглобулинов кролика против иммуноглобулинов быка и приготовление буферов для постановки ИФА 1.1. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки крови быка фильтрацией на сефадексе G-200 Оборудование и материалы: Сефадекс G-200, забуференный физиологический раствор, рН 7,2-7,3., хроматографический комплекс приборов: колонка (100x2,5), денситометр, регистратор, коллектор фракции, перистальтический насос, сыворотка крови быка. 134 Метод 1. 17 г. сефадекса G-200 вносят в 750 мл забуференного физиологического раствора и кипятят на водяной бане 5 ч. Набухание гели при кипячении происходит быстрее, чем при комнатной температуре и способствует удалению воздуха из геля. 2. Охлаждают гель до температуры 4°С 3. Дегазируют гель под вакуумом (воздушные пузырьки мешают фракционированию белков). 4. Колонку заполняют по возможности в один прием, чтобы предотвратить разделение гранул по размерам в процессе оседания, предварительно установив ее строго вертикально. С этой целью используют суспензию объем которой не более чем в 2 раза превышает объем осевшего материала. После набивки колонки пропускают через несколько объемов буфера для уравновешивания. 5. Дают буферу впитаться в поверхность геля, закрывают зажим на выходной трубке и с помощью пастеровской пипетки аккуратно наносят сыворотку по периметру колонки. Когда весь объем сыворотки будет нанесен, зажим открывают и дают образцу впитаться в поверхность геля. Затем повторяют весь процесс, используя буфер (примерно тот же объем, что и объем сыворотки) и присоединяют к колонке перистальтический насос для непрерывной подачи буфера 6. Собирают образцы по 2,5-5,0 мл. В процессе элюирования белков сыворотки крови образуются три пика. Пик 1 содержит макроглобулины, иммуноглобулины М, а также липропротеины. Здесь присутствует комплекс гемоглобин-гаптоглобин и Ig А. Пик 2иммуноглобулины G и А. Пик 3-альбумины и небольшое количество глобулинов 7. Элюаты 2 пика концентрируют до 1 мг/мл 1.2. Иммунизация кролика иммуноглобулинами быка Оборудование и материалы: иммуноглобулины быка в концентрации 1 мг/мл., полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, шприцы, иголки, стерилизатор, ножницы, 70° этанол. Метод 1. Аликвоту иммуноглобулинов быка в количестве 1 мл смешивают с 1 мл полного адъюванта Фрейнда 2. Вводят эмульсию подкожно и внутримышечно по меньшей мере в 4-х местах 3. Повторяют иммунизацию через месяц, вводя 500 мкг иммуноглобулинов в неполном адъюванте Фрейнда 4. Спустя месяц кролика иммунизируют, вводя 100 мкг антигена 5. Берут кровь (50 мл) через неделю после последней иммунизации Повторные иммунизации проводят ежемесячно, вводя 100 мкг антигена 135 1.3 Выделение антибычьих иммуноглобулинов кролика с помощью аффинной хроматографии 1.3.1 Приготовление иммуносорбента с иммобилизованными иммуноглобулинами быка Оборудование и материалы: сефароза 4В, активированная BrCN, 0,001 М раствор НС1, 0,1 М карбонатный буфер с 0,5 М NaCl, рН 8,3., 0,2 М глициновый буфер, рН 8,0., 0,1 М ацетатный буфер с 0,5 М NaCl, рН 4,0., встряхиватель. Метод 1. Суспендируют лиофилизованный препарат BrCN-сефарозы 4В в 0,001 М растворе соляной кислоты и оставляют на 15 минут для набухания геля. 2. Промывают тем же раствором от консервирующих добавок. Количество сефарозы берут из расчета посадки 5-10 мг белка на 1 мл влажного сорбента с учетом того, что 1 г лиофилизованной сефарозы набухает до объема 3,5 мл. 3. Переводят сефарозу в карбонатный буфер и в этом растворе ее перемешивают с иммуноглобулинами быка в течение 2 ч на встряхивателе при комнатной температуре (или оставляют на ночь при 4°С). 4. Отсасывают надосадочную жидкость и гель обрабатывают глициновым буфером в течение 2 ч при постоянном перемешивании. 5. Отмывают обменник карбонатным буфером, затем ацетатным буфером и снова карбонатом 1.3.2 Аффинная элюция с обменника антибычьих иммуноглобулинов кролика Оборудование и материалы: хроматографический комплект приборов, забуференный физиологический раствор, рН 7,2-7,3., бромцианактивированная сефароза 4В с лигандой - иммуноглобулинами быка, 0,1 М глициновый буфер с 0,15 М NaCl, рН 2,5., 1,5М Трис-НС1, концентратор, диализные мешки. Метод Набивку колонки, ее уравновешивание и нанесение сыворотки крови осуществляют как было указано в разделе 1.1 1. Промывают колонку забуференным физиологическим раствором до полного удаления белков 2. Элюируют антивидовые иммуноглобулины кролика глициновым буфером. В каждый 1 мл элюата добавляют примерно 100 мкл 1,5 М Трис-НС1 3. Доводят рН элюата до 7,5-8,0 1,5 М Трис-НС1. 4. Концентрируют раствор иммуноглобулинов до содержания в 1 мл 1 мг белка. 5. Диализуют против забуференного физиологического раствора течение 16-18 часов на холоду (4°С). 2. Приготовление буферов 136 1. 0,001 М ацетатный буфер, рН 4,4 Материалы Натрий уксуснокислый - CH3COONa • ЗН20 Уксусная кислота – СНзСООН Метод 130 мг натрия уксуснокислого растворяют в 1000 мл дистиллированной водой и доводят рН уксусной кислотой. 2. 0,2 М бикарбонатный буфер, рН 9,5 Материалы Натрий углекислый кислый – Натрий углекислый – Na2СОз Метод 21,2 г натрия углекислого и 16,8 г натрия углекислого кислого растворяют по отдельности в 1000 мл дистиллированной воды. Добавляют раствор Na2СОз к раствору NaHCО3 до рН 9,5 (приблизительно 6,4 мл 18,6 мл соответственно). 3. 0,1 М боратный буфер, рН 7,4 Материалы Натрий тетраборнокислый - Na2B407 • 10Н2О Борная кислота - Н3ВО3 Метод 9,54 г натрия тетраборнокислого и 24,73 г борной кислоты растворяют соответственно в 250 мл и 4000 мл дистиллированной воды. Прибавляют раствор тетрабората (приблизительно 115 мл) к раствору борной кислоты до достижения рН 7,4. 4. 0,05 М бикарбонатный буфер, рН 9,6 Материалы Натрий углекислый – Na2СОз Натрий углекислый кислый - NaHСОз Метод 2,65 г натрия углекислого и 4,2 г натрия углекислого кислого растворяют соответственно в 500 мл и 1000 мл дистиллированной воды. (Раствор Na2СОз добавляют к раствору NaHСОз до рН 9,6). 5. Забуференный физиологический раствор, рН 7,2-7,3 Материалы Натрий фосфорнокислый 1-замещенный - NaH2P04-2H20 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный - NaHP04-12H20 Натрий хлористый – NaCl Метод 3,58 г натрия фосфорнокислого 2-замещенного, 1,56 натрий фосфорнокислого 1-замещенного и 8,77 г натрия хлористого растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Удобнее приготовить 10 кратный раствор буфера. 6. 0,1 М глициновый буфер с 0,15 М NaCl, рН 2,5 137 Материалы Глицин - NH2CH2COOH Натрий хлористый - NaCl Метод 7,51 г глицина и 8,77 г натрия хлористого растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, рН доводят до 2,5 соляной кислотой. 7. 0,1 М карбонатный буфер с 0,5 М NaCl, рН 8,3 Материалы Натрий углекислый кислый – NaHCO3 Натрий хлористый - NaCl Метод 8,4 г натрия углекислого кислого и 29,0 г натрия хлористого растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, рН буфера доводят NaOH. 8. 0,2 М глициновый буфер, рН 8,0 Материалы Глицин - NH2CH2OOH Натрий углекислый кислый – NaHCO3 Метод 15,01 г глицина и 8,4 г натрия углекислого кислого растворяют в 1000 мл дистиллированной воды и рН доводят до 8,0. 9. 0,1 М ацетатный буфер с 0,15 М NaCl, рН 4,0 Материалы Натрий уксуснокислый - СНзСОONa-3Н20 Натрий хлористый - NaCl Метод 13,0 г натрия уксуснокислого и 29,0 г натрия хлористого растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, рН доводят уксусной кислотой. Контрольные вопросы: 1.Расскажите о принципах и технике постановки ИФА; 2. В чем преимущество ИФА с использованием ферментной метки через комплекс авидин-биотин?; 3.Назовите этапы получения антивидовых иммуноглобулинов; 4. Какие буферные растворы используются при приготовлении реагентов ИФА и постановке самого анализа? Занятие №2: Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) (на примере тест-системы «БРУ-КОМ» для выявления возбудителя бруцеллеза методом полимеразно- цепной реакции ) Цель занятий: Приобрести практические навыки по постановке полимеразно-цепной реакций Оборудование: ПЦР-анализ проводят в три этапа с использованием оборудования, размещенного в трех зонах (помещениях): ЗОНА 1 служит для выделения ДНК из исследуемого материала. Для проведения данного вида исследований необходимо наличие следующего оборудования: ламинарный бокс; твердотельный термостат для пробирок типа «Eppendorf» от 25 до 100 °С; вакуумный отсасыватель 138 медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости; микроцентрифуга для микропробирок типа «Eppendorf» до 16 тыс об/мин; вортекс; набор электронных или механических дозаторов переменного объема; одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл; одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл; одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл; штативы для микропробирок объемом 1,5 мл и наконечников; холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С; специальный халат и одноразовые перчатки; емкость с дезинфицирующим раствором; ЗОНА 2 служит для проведения амплификации ДНК: амплификатор; ПЦР-бокс; набор электронных или механических дозаторов переменного объема; одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл; одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл; штативы для наконечников и микропробирок на 0,5 (0,2) мл; холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой; специальный халат и одноразовые перчатки; ЗОНА 3 служит для электрофоретического анализа продуктов ПЦР: камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл; источник постоянного тока с напряжением 150-460 В (например, ЕV243); ультрафиолетовый трансиллюминатор (с кабинетом для просмотра гелей) с видеосистемой и цифровой видеокамерой для регистрации результатов и передачи изображения; Аквадистиллятор; холодильник от 2 до 8 °С для хранения продуктов амплификации; микроволновая печь для плавления агарозы; колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ 21400-75) для плавления агарозы на 250 мл; мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 21400-75); штатив для микропробирок на 0,5 (0,2) мл; отдельный механический или электронный дозатор переменного объема 10-40 мкл; одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе; пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия. Материалы: комплект для выделения ДНК: Лизирующий раствор; Раствор для отмывки; Раствор для отмывки 2; Сорбент универсальный; ТЕ-буфер для элюции ДНК; «ПЦР-комплект»: ПЦР-смесь-1-R Brucella spp., в микропробирках под слоем воска; ПЦР-смесь-2 blue; минеральное масло для ПЦР; положительный контрольный образец (ПКО) ДНК Brucella; ДНК буфер; отрицательный контрольный образец (ОКО); внутренний контрольный образец (ВКО) Brucella spp.; комплект реагентов для электрофореза: трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с бромидом этидия; агароза для электрофореза ДНК Содержание занятий. Применение молекулярно-генетических подходов, основанных на обнаружении молекул ДНК патогена путем 139 амплификации (размножения) их специфических участков, является новым направлением в диагностике инфекционных заболеваний. В 1983 году K.Mulles из биотехнологической компании «Cetus Corporations» предложил многократно размножить ДНК выявляемого микроорганизма, содержащегося в исследуемом образце, а затем провести детектирование комплекса ДНК-ДНК. Данный метод позже получил название полимеразно-цепной реакции. В основе метода лежит многократное повторение циклов репликации ДНК. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 93-95° С происходит разделение комплементарных цепей двухцепочечной молекулы ДНК (денатурация). В образец, содержащий ДНК выявляемого микроорганизма, вносят пару праймеров, один из которых комплементарен одной цепи, а другой - противоположной. Праймерыискусственно синтезируемые одноцепочечные дезоксиолигонуклеотиды, состоящие, как правило, из 20-27 пар оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего фрагмента ДНК. При температуре 50-65°С протекает синтез полинуклеотидных цепей путем удлинения праймеров с помощью дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. В процессе реакции праймеры отжигаются на этих цепях и иницируют ферментативный синтез ДНК по направлению друг к другу. По окончании синтеза новые цепи двухцепочной ДНК плавят, отжигают те же праймеры и вновь осуществляют синтез ДНК. ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и их комплементарное дополнение. Причем, репликация ДНК начинается только в определенных стартовых блоках, которые представляют собой короткие двунитевые участки. Последовательность событий, включающая денатурацию матричной ДНК, отжиг праймеров и стадия ферментативной полимеризации называются циклом амплификации. Длина ампликонов (фрагменты ДНК, образованные в процессе амплификации), начиная с третьего цикла, становится стандартной, т.е. соответствует числу пар нуклеотидов фрагмента ДНКматрицы между 3' – концами смыслового и антисмыслового праймеров. Они накапливаются в геометрической прогрессии и начинают доминировать среди продуктов амплификации. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицированного участка. Процесс является цепным, т.к. синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Повторяя 3 стадии амплификации 30-40 раз, за 1,5-3 часа получают миллионы копий специфического участка ДНК или РНК конкретного микроорганизма, т.е. нарабатывается нуклеиновая кислота в количестве, достаточном для ее визуализации с помощью электрофореза в агарозном геле без использования радиоизотопов или гибридизации специфических ДНК140 зондов. Отметим, что при ПЦР размножению подвергается не патоген, а только ее ДНК, причем не вся молекула ДНК, а только определенный фрагмент, являющийся маркером данного возбудителя. Немаловажен и тот факт, что метод подготовки проб к ПЦР исключает их биологическую опасность для персонала. К достоинствам ПЦР относятся, во-первых, возможность прямого определения в исследуемом материале наличия возбудителя. Этим он выгодно отличается от многих традиционных методов диагностики, которые обнаруживают лишь косвенные признаки инфекции, такие как антитела, белки-маркеры и др. Во-вторых, метод характеризуется высокой специфичностью, обусловленной тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах (процессу биологической амплификации), при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 105-106 раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективными, поддерживающими рост только одного микроорганизма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микроорганизмов, так и праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые рода или семейства микроорганизмов. В третьих, к преимуществам ПЦР следует отнести его высокую чувствительность, позволяющую определить инфекционный агент непосредственно в биологическом материале с исключительно высокой чувствительностью - порядка 1-10 микроорганизмов. Исходный материал для теста может быть получен из биологической жидкости организма, а также из биопсийного материала, т.е. из любой ткани или жидкости, которые могут быть обеззаражены фенолом или нагреванием. Образцы могут храниться неограниченно долго, что не влияет на результаты исследования. ПЦР, как было уже сказано, не требует, подобно серологическим методам, иммунного ответа на проникновение возбудителя в организм хозяина, что дает возможность следить за ранними стадиями развития инфекции, выявлять ее латентные стадии и обнаруживать некультивируемые формы бактерий. Немаловажным достоинством метода является и высокая скорость получения результатов анализа, не требующая выделение и выращивание культуры возбудителя, занимающее большое количество времени. Унифицированный метод обработки материала и детекции продуктов реакции, автоматизация процесса амплификации дают 141 возможность провести полный анализ за 4-4,5 часа. При этом ДНК инфекционных агентов может быть достаточно эффективно экстрагирована из любой биологической жидкости или ткани, а также проб объектов окружающей среды и кормов. Этим он выгодно отличается от других лабораторных методов, которые дают замедленные результаты. Диагностические тесты, основанные на ПЦР, имеют две главные недостатки: ложноположительные реакции, вызванные контаминацией фрагментами ДНК из ранее полученных продуктов (ампликонов), и ложноотрицательные, полученные в результате действия на Taqполимеразу ингибиторов, присутствующих в биологических жидкостях и тканях. Поэтому дальнейшее технологическое совершенствование диагностических тест-систем на основе ПЦР в настоящее время ведется в направлении создания методических приемов, предохраняющих от возможности получения ложных результатов. Метод постановки ПЦР: ЭТАП 1 (зона 1). Выделение ДНК из исследуемого материала 1. Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 60-65 °С до полного растворения кристаллов 2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный и положительный контроли выделения) 3. Внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО Brucella spp. и по 300 мкл лизирующего раствора; промаркировать пробирки 4. В пробирки с лизирующим раствором и ВКО внести по 100 мкл пробы, используя наконечники с аэрозольным барьером; в пробирку отрицательного контроля выделения (ОК) внести 100 мкл ОКО 5. Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при температуре 65 °С. Центрифугировать 5 сек при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге (если проба растворилась не полностью, центрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при максимальных оборотах и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку) 6. Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе; в каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального; перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 мин, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 мин 7. Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 сек; удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы 8. Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1; перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента 142 универсального; осадить сорбент универсальный центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 30 сек; удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы 9. Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2; перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 30 сек при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге; удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы 10.Повторить процедуру отмывки раствором для отмывки 2; удалить надосадочную жидкость полностью 11.Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента универсального (при этом крышки пробирок должны быть открыты) 12.В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК; перемешать на вортексе; поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе 13.Центрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 мин; надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК и готова к постановке ПЦР (очищенную ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при температуре не выше - 16 °С). ЭТАП 2 (зона 2). Проведение ПЦР-амплификации. Общий объем реакции – 25 мкл, объем ДНК-пробы – 10 мкл. В комплекте реагентов для ПЦР-амплификации «ПЦР-комплект» применяется «горячий старт», который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит только при 95 °С, что значительно снижает количество неспецифически затравленных реакций. 1. Подготовка пробирок для проведения ПЦР Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-R Brucella spp. для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР- смесью-1-R Brucella spp. Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл). При использовании амплификатора с термостатируемой крышкой минеральное масло можно не добавлять. 2. Проведение амплификации В подготовленные для ПЦР пробирки внести по 10 мкл ДНК, выделенной из клинических проб или контролей этапа выделения. 143 Поставить контрольные реакции амплификации: отрицательный контроль (К-) - вместо ДНК-пробы внести в пробирку 10 мкл ДНКбуфера; положительный контроль (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК Brucella; внутренний контроль (ВК+) - внести в пробирку 10 мкл ВКО Brucella spp. разведенного в 10 раз ДНК-буфером. Запустить на амплификаторе программу (см. табл.2). Когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95С, поставить программу на паузу, поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы. Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе. Таблица 2 Программа для амплификации ДНК микроорганизмов рода Brucella цикл Температура время циклы 0 95°С пауза 1 95°С 2 мин 1 2 95°С 1 мин 42 65°С 1 мин 72°С 1 мин 3 72°С 1 мин 1 4 10°С хранение Время амплификации примерно 1 ч 20 мин. После окончания реакции собрать пробирки в специальный штатив и отправить в помещение для детекции продуктов ПЦР (в зону 3). Образцы после амплификации можно хранить 16 ч при комнатной температуре, в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и длительно при температуре не выше минус 16 °С (однако перед проведением электрофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для размягчения воска). ЭТАП 3 (зона 3). Детекция продуктов ПЦР-амилификации методом электрофореза в агарозном геле. Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельном помещении сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2. 1. Приготовление рабочих растворов и агарозного геля. Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трис-боратного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия, довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать. Агарозу для электрофореза ДНК из флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл 144 рабочего буфера, перемешать вращением колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой - 1,5 мин. Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с агарозой, время плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно перемешать, вращая колбу. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до 65-70 °С. Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры. Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга. Толщина геля должна быть около 0,6 см. После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху. 2. Порядок работы. Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать из-под слоя масла по 10-15 мкл проб и внести в лунки геля (если для нанесения разных проб используется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры после нанесения каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК. Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), и включить источник (напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза -18-20 мин). Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 10 В/см. По завершении времени электрофореза (краситель при этом пройдет примерно половину длины геля - 1,5 см), выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения, занести в базу данных. 3. Дезактивация буфера и гелей. Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и затем 1 объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч. Добавляют 1 объем 2,5 М натрия гидроксида, 145 аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию. 4. Учет и интерпретация результатов Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК. Длина амплифицированных специфических фрагментов ДНК: Микроорганизмов рода Brucella - 460 п.н. Внутреннего контрольного образца - 770 п.н. Учет результатов ПЦР-анализа следует начинать с результатов амплификации положительных и отрицательных контролей (см. табл.3 ). Таблица 3 Контроль «ОК» «К-» «К+» «ВК+» Контролируемый этап ПЦР-анализа Выделение ДНК ПЦР ПЦР ПЦР Специфическая полоса на электрофореграмме полоса 460 п.н. полоса 770 п.н. Нет Есть Нет Нет Есть Нет Нет Есть В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа выделении ДНК (ОК), должна быть только полоса внутреннего контроля на уровне 770 п.н.; в дорожке, соответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+), должна быть только полоса положительного контроля - 460 п.н., полоса внутреннего кот роля 770 п.н. должна отсутствовать. Возможно присутствие полос праймер-димеров, находящихся ниже уровня 100 п.н.; в дорожке, соответствующей положительному контролю амплификации ВКО (ВК+), должна быть только полоса внутреннего контроля 770 п.н. (возможно присутствие полос праймер-димеров, находящихся ниже уровня 100 п.н.); в дорожке, соответствующей отрицательному контролю этана ПЦР (К-), не должно быть никаких полос, за исключением возможных праймер-димеров, находящихся ниже уровня 100 п.н.; Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу на уровне 460 п.н. большей или меньшей интенсивности независимо от наличия полосы внутреннего контроля. Полоса внутреннего контроля может отсутствовать в пробах с высокой концентрацией ДНК микроорганизмов роди Brucella. Отрицательными считаются образцы, в дорожках которых отсутствует специфическая полоса 460 п.н. и присутствует полоса внутреннего контроля 770 н.н. большей или меньшей интенсивности (за исключением отрицательного контроля этапа ПЦР-«К-»). 146 Кроме полос на уровне 460 или 770 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 нуклеотидных пар. Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях: если результаты анализа контрольных точек не совпадают с приведенными в таблице 2, то соответствующий этап анализа следует переделать; если в дорожках, соответствующих отрицательным контролям («ОК» и «К-») или положительному контролю амплификации ВКО («ВК+») выявляется специфическая полоса 460 п.н., значит, произошла контаминация реактивов или проб (В этом случае результаты анализа считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб с первого этапа проведения анализа, а также принять меры по выявлению источника контаминации); если в дорожке какой-либо из исследуемых проб отсутствуют обе полосы, и 460 п.н. и 770 п.н. (Результат анализа по данной пробе считается недействительным, необходимо повторить исследование этой пробы с этапа выделения ДНК; возможная причина: ошибка в процедуре подготовки исследуемого материала, приведшая к потере ДНК или ингибированию ПЦР); в дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях (Возможные причины: отсутствие «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках амплификатора). Контрольные вопросы: 1.Какое оборудование и реагенты используются при постановке ПЦР? 2. Расскажите о достоинствах и недостатках ПЦР; 3. Назовите основные этапы постановки ПЦР; 4. Учет и интерпретация результатов ПЦР Занятие №3: Трансплантация эмбрионов Цель занятия: Ознакомить магистрантов с основными этапами пересадки эмбрионов животных. Оборудование и материалы: корова-донор; корова-реципиент; гонадотропин; фолликулостимулирующий гормон; доза семени (не менее 50 млн. живых сперматазоидов); эмбрионы, извлеченные не ранее 5-го дня после начала охоты; гибкий двухканальный катетер с надувной манжетой; фосфатный буфер Дюльбекко с лактатом; пируватом и бычьим сывороточным альбумином; пайеты; катетер Кассу; раствор криопротектора (1,5 М глицерин в фосфатном буфере; 1,08 М сахароза; жидкий азот. Содержание занятий. Разработка метода искусственного осеменения сельскохозяйственных животных и его практическое применение обеспечили большой успех в области улучшения генетики животных. Использование этого метода в сочетании с длительным хранением семени в замороженном состоянии открыло возможность получения десятков тысяч потомков от одного производителя в год. 147 Этот прием, по существу, решает проблему рационального использования производителей в практике животноводства. Что касается самок, то традиционные методы разведения животных позволяют получать от них лишь несколько потомков за всю жизнь. Низкий уровень воспроизводства у самок и длительный интервал времени между поколениями (6-7 лет у крупного рогатого скота) ограничивают генетический процесс в животноводстве. Решение этой проблемы ученые видят в применении метода трансплантации эмбрионов. Суть метода состоит в том, что генетически выдающиеся самки освобождаются от необходимости вынашивания плода и вскармливания потомства. Кроме того, их стимулируют с целью увеличения выхода яйцеклеток, которые затем извлекают на стадии ранних зародышей и пересаживают менее ценным в генетическом отношении реципиентам. Технология трансплантации эмбрионов включает такие основные звенья, как вызывание суперовуляции, искусственное осеменение донора, извлечение эмбрионов (хирургическое или нехирургическое), оценка их качества, кратковременное или длительное хранение и пересадка. Стимуляция суперовуляции и искусственное осеменение. Самки млекопитающих рождаются с большим (несколько десятков и даже сотен тысяч) числом половых клеток. Большинство из них постепенно погибают в результате атрезии фолликулов. Только небольшое число примордиальных фолликулов переходят в антральные в процессе роста. Однако практически все растущие фолликулы реагируют на гонадотропную стимуляцию, которая приводит их к конечному созреванию. Обработка самок гонадотропинами в фолликулярной фазе полового цикла или в лютеиновой фазе цикла в сочетании с индуцированием регрессии желтого тела простагландином Ф2 (ПГФ2) или его аналогами приводит к множественной овуляции или так называемой суперовуляции. Индукцию суперовуляции у самок крупного рогатого скота проводят обработкой гонадотропинами, ФСГ или СЖК, начиная с 9-14го дня полового цикла. Через 2—3 дня после начала обработки животным вводят простагландин Ф2а или его аналоги, чтобы вызвать регрессию желтого тела. Вводят 50 млн. живых сперматозоидов в начале охоты и через 12-20 ч осеменение повторяют. Принципы вызывания суперовуляции у овец те же, что и у крупного рогатого скота: СЖК или ФСГ вводят в конце лютеиновой фазы полового цикла (на 11-13-й день) или в лютеиновую фазу цикла — вместе с обработкой простагландином или во время окончания обработки прогестагенами. СЖК вводят в дозе 20-45 и.е. на кг массы тела, или до 2000 и.е. на одну овцу. Например, аналог простагландина простенол в дозе 100 мкг вводят между 4-м и 13-м днями полового цикла через 24-72 ч после обработки СЖК. Охота наступает через 2-4 дня после обработки простагландином. ФСГ предпочтительнее вводить два раза в день в 148 течение двух дней в уменьшающейся дозе (6,5-3,2 мг) по сравнению с обработкой равными дозами.. У свиней, являющихся многоплодными животными, большое число эмбрионов может быть получено без гормональной обработки. Однако число овуляций у свиней может быть увеличено после гормональной обработки. Еще не разработаны надежные методы индукции суперовуляции у кобыл, однако получение достаточного числа эмбрионов у них не составляет большого труда ввиду простоты нехирургического извлечения и повторного получения эмбрионов в каждый половой цикл. Извлечение эмбрионов. Эмбрионы крупного рогатого скота поступают из яйцевода в матку между 4-м и 5-м днем после начала охоты (между 3-м и 4-м днем после овуляции), хотя у суперовулировавших коров небольшая часть эмбрионов остается в яйцеводе до 7-го дня. Сроками продвижения эмбрионов в половом тракте коровы и определяется извлечение их из яйцевода или рогов матки. В связи с тем, что нехирургическое извлечение возможно только из рогов матки, то эмбрионы извлекают не ранее 5-го дня после начала охоты. Несмотря на то что при хирургическом извлечении эмбрионов у крупного рогатого скота достигнуты отличные результаты, этот метод неэффективен относительно дорогостоящий, неудобный для применения в условиях производства. Нехирургическое извлечение эмбрионов проводит следующим образом. Гибкий катетер с надувной манжеткой вводят во влагалище и через шейку матки в один из рогов матки. Манжетка надувается и закрывает каудальный выход рога матки, тем самым ограничивая промывную полость. Катетер может быть двухканальным, что позволяет проводить проточное прохождение промывной жидкости. При использовании одноканального катетера промывная жидкость вводится несколько раз (5-8 раз) и затем вытекает из рога матки. В обоих случаях вводят 200—300 мл фосфатного буфера Дюльбекко. Наиболее оптимальные сроки для извлечения эмбрионов - 6-8-й день после начала охоты, так как ранние бластоцисты этого возраста наиболее пригодны для глубокого замораживания и могут быть с высокой эффективностью пересажены нехирургическим способом. Корову-донора используют 6-8 раз в год, извлекая по 3-6 эмбрионов. У овец и свиней нехирургическое извлечение эмбрионов невозможно ввиду трудности прохождения катетера через шейку в рога матки. Однако хирургическая операция у этих видов животных относительно проста и непродолжительна. Доступ к репродуктивному тракту осуществляется лапаротомией по белой линии живота. У свиней 1-, 2- и 4-клеточные эмбрионы извлекают из яйцеводов в течение 40 ч после овуляции. При этом стеклянную канюлю вставляют в истмус через маленькое отверстие в верхушке рога матки. Через канюлю вводят 20-30 мл промывной жид149 кости и собирают ее из ампулярного конца яйцевода в чашку Петри. Для извлечения эмбрионов из матки промывают яйцевод и верхушку рога матки. Рог матки пережимают и канюлю вставляют в рог матки. Обычно для вымывания используют среду Дюльбекко с лактатом, пируватом и бычьим сывороточным альбумином. Эмбрионы свиней можно извлекать до 12-го дня после начала охоты. Эффективность извлечения эмбрионов обычно высокая (около 95 %). Можно делать 3-4 операции на одном животном (С. Полдж, 1982). При извлечении эмбрионов у овец в ампулярный конец яйцевода вводят стеклянную или полиэтиленовую канюлю и промывают из рога матки в яйцевод. Независимо от времени вымывания поле охоты эффективность извлечения эмбрионов составляет около 80 %. Пересадка эмбрионов. В пайету набирают свежую питательную среду (столбик длиной 1,0-1,3 см), затем небольшой пузырек воздуха (0,5 см) и далее основной объем среды с эмбрионом (2-3 см). После этого засасывают немного воздуха (0,5 см) и питательную среду (1,0-1,5 см). Пайету с эмбрионом помещают в катетер Кассу и до момента пересадки хранят в термостате при 37°С. Далее под ректальным контролем катетер пропускают через шейку матки коровы и осторожно вводят в рог матки на расстоянии 5—7 см от ее тела. Нажатием на шток катетера выдавливают содержимое пайеты вместе с эмбрионом в рог матки. Нехирургическая пересадка эмбрионов разработана также для кобыл. Высокая эффективность нехирургической пересадки эмбрионов у лошадей была достигнута между 6-м и 8-м днями после овуляции. У овец и свиней пересадку эмбрионов проводят только хирургическим способом. У реципиентов используется аналогичный хирургический подход, как и у доноров. Эмбрионы пересаживают в яйцевод или матку в зависимости от стадии развития. Эмбрионы овцы, извлеченные на 1-4-й день после охоты, пересаживают в яйцевод, а эмбрионы более старшего возраста - в матку. Приживляемость составляет 70-75 %. У свиней приживляемость эмбрионов не снижается, если двухклеточные эмбрионы извлекают из яйцевода и пересаживают в матку реципиента на той же стадии развития. Эмбрионы свиньи рекомендуется пересаживать только в один рог матки, так как они мигрируют и распределяются в обоих рогах матки. После пересадки 2-5 - дневных эмбрионов приживляемость составляет 60-70 %. Пересадка эмбрионов свиней на более поздних стадиях развития (7-8 -дневных) сопровождается либо отсутствием беременности, либо значительным снижением приживляемости (С. Полдж, 1982). Хранение эмбрионов. В производственных условиях эмбрионы обычно извлекают утром, а пересаживают в конце дня. Для хранения эмбрионов в течение этого времени используют фосфатный буфер с некоторыми модификациями при добавлении эмбриональной сыворотки 150 крупного рогатого скота и при комнатной температуре или температуре 37°С. Наблюдения показывают, что эмбрионы крупного рогатого скота можно культивировать in vitro до 24 ч без заметного снижения их последующей приживляемости. Для длительного хранения эмбрионов необходимо не только затормозить их развитие, но и значительно снизить или полностью остановить обменные процессы. Такое состояние эмбрионов достигается при температуре - 195°С или ниже. Эмбрионы крупного рогатого скота в первые дни развития особенно чувствительны к охлаждению, но когда они достигают стадии бластоцисты, то устойчивы к охлаждению в более широком диапазоне стадий развития. У свиней ни на одной стадии развития эмбрионы не выживают после охлаждения их до температуры ниже 10-15°С. Достигнуто успешное замораживание до - 196°С и оттаивание эмбрионов крупного рогатого скота, овец и лошадей на стадиях морулы и бластоцисты с получением живого потомства у всех трех видов животных. На практике этот прием используют пока при разведении крупного рогатого скота. Замороженные и оттаявшие эмбрионы могут быть успешно разбавлены одноступенчато в пайете, где они были заморожены. Сущность метода состоит в следующем. Замороженно-оттаянные эмбрионы переносят одноступенчато из раствора криопротектора, в частности 1,5 М глицерина в фосфатном буфере, в котором они были заморожены, в среду, содержащую гипертонический раствор не проникающего в клетку соединения, каким является сахароза. Это обеспечивает постепенное удаление криопротектора из эмбриона без нарушения осмотического равновесия в 0,02 мл 1,5 М глицерина. С помощью воздушных пузырьков пайету делят на три камеры: в первой — раствор криопротектора; во второй - эмбрион в растворе криопротектора; в третьей - растворитель (1,08 М раствор сахарозы). После замораживания и оттаивания содержимое пайеты перемешивают встряхиванием. Затем эмбрион может быть пересажен из пайеты нехирургическим способом реципиенту. Этот метод позволяет пересаживать замороженно-оттаянные эмбрионы по типу искусственного осеменения. Контрольные вопросы: 1. Оборудование и материалы, используемые в процессе трансплантации эмбрионов; 2. Какие звенья включают в себя технология трансплантации эмбрионов?; 3. Расскажите о нехирургическом методе извлечения эмбрионов крупного рогатого скота Занятие №4: Определение нуклеотидной последовательности образцов ДНК с помощью анализатора CEQ™ 8000 Цель занятий: Освоить методику определения нуклеотидной последовательности ДНК с помощью прибора CEQ™ 8000 Оборудование: анализатор ДНК CEQ™ 8000; 151 Материалы: Стандартный набор реагентов для циклического секвенирования с использованием красителей-терминаторов CEQ WellRED частично смешанный (CEQ DTCS – Quick Start Kit); Реакционный буфер, смеси dNTP, меченные красителями терминаторы и ДНК-полимераза поставляются в одной пробирке в виде основной смеси; контрольная матрица pUC18; высокоочищенный образец ДНК pUC18 (двухцепочечная плазмида длиной 2685 пар оснований); праймер для секвенирования-47; гликоген; раствор для нанесения образца (Sample Loading Solution, SLS); минеральное масло; деионизированная и стерилизованная вода; 95 % и 70 % раствор этанола в воде; 3М раствор ацетата натрия, рН 5.2; 100мМ раствор Na2EDTA, рН 8.0; второй компонент стоп-раствора; стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 0.5 мл; термоциклируемые тонкостенные пробирки объемом 0.2 мл или микропланшеты; термоциклер с обогреваемой крышкой. Содержание занятий. В системе генетического анализа CEQ™ 8000 для определения нуклеотидной последовательности ДНК используется технология капиллярного электрофореза. Фрагменты ДНК, имеющие результирующий отрицательный заряд, под действием приложенного поля перемещаются к аноду (+). При этом происходит разделение фрагментов ДНК, поскольку миграция сопровождается ситовым эффектом по размеру мигрирующих молекул. Детекция меченных красителями фрагментов осуществляется по сигналу флуоресценции, далее сигнал обрабатывается и фрагменты представляются в виде нуклеотидной последовательности. В качестве раствора электролита, представляющего собой среду разделения, широко используются полиакриламидные гели. Система генетического анализа CEQ™ 8000 является автономным комплексом, предназначенным для определения нуклеотидных последовательностей и размеров фрагментов ДНК в образцах, подготовленных к анализу с помощью реагентов Beckman Coulter, содержащих флуоресцентную метку-краситель. Для определения нуклеотидных последовательностей с использованием красителейтерминаторов используется набор четырехцветных реагентов, для анализа размеров фрагментов - праймеры, меченные красителем. Система состоит из трех основных частей: химической, аппаратной и программного обеспечения. В одном планшете можно разместить до 96 образцов, каждый из которых мечен четырьмя красителями. Восемь образцов (набор образцов) в каждом стрипе планшета, содержащие меченые фрагменты ДНК, автоматически денатурируются при нанесении. Затем проводится разделение с помощью капиллярного электрофореза. Гель автоматически заменяется после каждого разделения. Для заполнения капилляров гелем в прибор устанавливается специальный картридж, объем которого позволяет проанализировать один 96-луночный 152 планшет. Детекция индуцированных лазерами сигналов происходит по четырем спектральным каналам. Первичные данные для каждого капилляра обрабатываются автоматически. После завершения анализа пользователю предоставляется либо последовательность нуклеотидов в текстовом виде, либо список фрагментов. Ход работы по проведению циклического секвенирования с использованием красителей-терминаторов WellRED на CEQ 8000 Различные составляющие прибора отвечают за процесс подготовки образцов, выполнение разделения и фазу детекции сигнала. Крышка отделения образцов прозрачна. В этом отделении находится планшет для буфера, контейнер для увлажнения капилляров и планшет для образцов. Крышка отделения капилляров обеспечивает доступ к капиллярам. Данное отделение может закрываться термостатирующей крышкой. Термостатирующая крышка отделения капилляров позволяет создать необходимую температуру в отделении капилляров. Блок капилляров. Капилляры имеют длину 33 см при внутреннем диаметре 75 мкм. Для работы с капиллярами в комплект анализатора CEQ 8000 входит уникальный пленум. Блок капилляров состоит из: электродного блока, восьми капилляров и штуцера. Держатели планшетов используются для фиксации планшета с анализируемыми образцами, планшета для буфера разделения ДНК с крышкой, которая предохраняет от испарения, и контейнера для увлажнения капилляров. В контейнер для увлажнения капилляров, содержащий деионизированную воду, погружаются концы капилляров. В бутыли для использованного геля собирается гель из коллектора при очистке системы. Насос для геля используется для заполнения капилляров свежим гелем из картриджа, достаточного для анализа одного набора образцов или 96-луночного планшета. Картридж с гелем содержит свежий гель для разделения ДНК. Заполненный картридж содержит достаточное количество геля для выполнения 96 разделений (12 заполнений блока капилляров). Если картридж с гелем не установлен, например, при транспортировке или хранении прибора, в корпус насоса вставляется заглушка для предотвращения высыхание геля. Подготовка секвенирования ДНК Готовят компоненты стандартного набора реагентов для реакции секвенирования в тонкостенной термоциклируемой пробирке объемом 0,2 мл или в лунке микропланшета. Предварительная термообработка матрицы Предварительная термообработка матриц плазмидных ДНК усиливает сигнал и повышает стабильность тока. Термообработке следует подвергать только матрицу ДНК и воду. До завершения 153 термообработки к матрице не следует прибавлять какие-либо другие компоненты реакции секвенирования. Стандартный набор реагентов для циклического секвенирования Стандартный набор реагентов для циклического секвенирования с использованием красителей-терминаторов CEQ WellRED (частично смешанный), позволяет исключить многочисленные этапы отмеривания компонентов пипеткой и возможные ошибки. Поскольку объем прибавляемой «основной смеси» составляет только 8 мкл, остается больше свободного объема для внесения матрицы ДНК и праймера. Реакции можно проводить в тонкостенной пробирке объемом 0,2 мкл или в лунке микропланшета. Программа термоциклирования: 96°С 20 сек.; 50°С 20 сек.; 60°С 4 мин. В течение 30 циклов с последующим выдерживанием при 4°С. Условия термоциклирования. Для облегчения секвенирования матриц, менее чистых, чем контрольная матрица, продолжительность стадии удлинения цепи составляет 4 мин. Осаждение этанолом в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл 1. Для каждого образца готовят стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 0.5 мл, снабженную этикеткой 2. В каждую пробирку вносят 4 мкл стоп-раствора (1.5M NaOAc + 50мМ EDTA, приготавливаемого ежедневно из перечисленных ранее исходных растворов) и 1мкл гликогена концентрации 20 мг/мл (поставляется в наборе) 3. Переносят продукты реакции секвенирования в пробирку с соответствующей этикеткой и тщательно перемешивают 4. Прибавляют 60 мкл холодного раствора этанола в воде 95 % (об./об.), который находился в морозильной камере при -20°С, и тщательно перемешивают. Немедленно центрифугируют при 14 000 об/мин и 4°С в течение 15 мин. Тщательно удаляют надосадочную жидкость микропипеткой (капля осадка должна быть видна). Осаждение этанолом в планшете для образцов CEQ 1. После термоциклирования следует центрифугировать планшет с образцами CEQ на максимальной скорости в течение 30 секунд 2. В каждую пробирку, снабженную этикеткой, вносят по 4 мкл стопраствора (1.5M NaOAc + 50мМ EDTA, приготавливаемого ежедневно из исходных растворов, перечисленных ранее) и 1мкл гликогена концентрации 20 мг/мл 3. Прибавляют 60 мкл холодного раствора этанола в воде 95 % (об./об.), который находился в морозильной камере при -20°С, и накрывают микропланшет герметической крышкой и крышкой для образцов из алюминиевой фольги. Энергично встряхнуть микропланшет 5-10 раз 4. Немедленно центрифугировать микропланшет 154 5. После центрифугирования снять микропланшет и поместить на держатель микропланшета центрифуги бумажное полотенце, сложенное в 3-4 раза. Осторожно снять крышку и плавно перевернуть микропланшет для удаления надосадочной жидкости 6. Поместить перевернутый микропланшет на держатель микропланшета, выстеленный бумажным полотенцем, и центрифугировать при 300 об/мин в течение 20 сек 7. Промыть каплю осадка ДНК 200 мкл 70 % раствора этанола в воде (об./об.), который хранился в морозильной камере при -20°С. Не перемешивать и не встряхивать планшет 8. Немедленно центрифугировать микропланшет 9. После центрифугирования осторожно перевернуть микропланшет для удаления надосадочной жидкости. Поместить перевернутый микропланшет на выстеленный бумажным полотенцем держатель микропланшета и центрифугировать при 300 об/мин в течение 20 сек 10. Повторить промывку (этапы 7-8) 11. Сушить в вакууме в течение 10 мин. 12. Ресуспендировать капли осадка в 40 мкл раствора для нанесения образца (SLS). Подготовка образца для загрузки в CEQ 8000 1. Если осаждение проводили в пробирках, то ресуспендированные образцы следует перенести в соответствующие лунки микропланшета для образцов CEQ. В случае осаждения в микропланшете – перейти к этапу 2. 2. Нанесите на поверхность каждого из ресуспендированных образцов одну каплю светлого минерального масла (поставляется в наборе). 3. Загрузите планшет с образцами в CEQ 8000 и запустите выбранный метод. Подготовка матрицы ДНК Подготовить матрицу в объеме, достаточном для точного количественного определения и верификации чистоты. Качество матрицы ДНК будет зависеть от процедуры и от источника используемой ДНК. Затем приступить к разделению с помощью капиллярного электрофореза. Детекция индуцированных лазерами сигналов происходит по четырем спектральным каналам. После завершения анализа пользователю предоставляется последовательность нуклеотидов в текстовом виде. Контрольные вопросы: 1. Какие материалы необходимы для определения нуклеотидной последовательности ДНК с помощью анализатора CEQ 800?; 2. В чем заключен принцип определения нуклеотидной последовательности ДНК в системе генетического анализа CEQ 800?; 3.Назовите отдельные составляющие анализатора CEQ 800. 155 V. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ (примерные тестовые задания для текущего, промежуточного и итогового контроля знаний) 1. Трансгенные животные - индивидуумы: А) содержащие в своем геноме дефектные гены; Б) получившие инъекцию рекомбинантного гормона микробного происхождения; В) получившие инъекцию рекомбинантного гормона аналогичного происхождения; Г) содержащие в своем геноме чужеродный ген; Д) получившие инъекцию генно-инженерного препарата 2. ДНК вакцинация - это: А) иммунизация животных плазмидной ДНК с чужеродным геном; Б) иммунизация животных рекомбинантной вакциной; В) иммунизация организма бактериальным вектором, имеющим в своем составе чужеродную ДНК; Г) иммунизация животных цельновирионными вакцинами против ДНК-содержащих вирусов; Д) иммунизация животных субъединичным и вакцинами против ДНК содержащих вирусов. 3. Какой из нижеуказанных приемов не используется для доставки лекарственного вещества (ЛВ) к месту его действия: А) заключение ЛВ в особые частицы — липосомы, которые имеют высокое сродство к нужным органам; Б) встраивание генов специфических токсинов в инфильтрирующие опухоль лимфоциты, которые высвобождают эти токсины непосредственно в опухоли; В) присоединение молекулы ЛВ к моноклональным антителам, специфичным по отношению к белкам, находящимся на поверхности опухолевых клеток; Г) использование ЛВ в неактивной форме, переводя их в активное состояние при помощи ферментов, присоединенных к моноклональному антителу, специфичному к поверхностному антигену пораженной клетки; Д) инъекция ЛВ в непосредственной близости к пораженному органу? 3. Трансген: А) передается потомству согласно законам Менделя; Б) не передается потомству согласно законам Менделя с частотой 50%; В) не передается вообще; Г) передается всем потомкам гибрида F1; Д) нет правильного ответа 4. В чем преимущество клеточной системы животных по сравнению с клеточными системами дрожжей и бактерий при генноинженерном синтезе белкового антигена, например HBs-белка вируса гепатита В: А) правильный процессинг, модификация и сборка вирусного белка; Б) легкость культивирования клеток животных; В) антиген выделяется в культуральную жидкость, тогда как в бактериях и дрожжах он остается в клетках; Г) доступность клеток животных; Д) большой выход конечной продукции? 5. Для получения рекомбинантных вакцин обычно используют вирус: А) гриппа; Б) гепатита В; В) ящура; Г) коровьей оспы; Д) бешенства, в геном которого вводится чужеродные гены, кодирующие иммуногенные белки различных возбудителей. 156 6. Какой из препаратов, используемый в производстве сыра, был получен российскими учеными (Л.К.Эрнст и соавт.) из молока трансгенных овец: А) белок С; Б) урокиназа; В) лактоферин; Г) интерлейкин-2; Д) химозин? 7. Гены транспортируют эмбрионам на стадии: А) зиготы или 2-3 клеточных бластомеров; Б) морулы; В) бластоцисты; Г) в конце антенатального периода развития; Д) в середине антенатального периода развития. 8. Для трансплантации нехирургическим методом эмбрионы с проинъецированными чужеродными ДНК культивируют «в пробирке» до стадии: А) зиготы; Б)морулы; В) бластоцисты; Г) не культивируют, эмбрион, в пронуклеус которого был введен генетический материал, сразу переносят в яйцеводы синхронизированных реципиентов; Д) правильный ответ не указан. 9. Животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящих из одной зиготы, но имеющие различные генотипы называются: А) химерами; Б) мозаиками; В) клонированными; Г)гомозиготными); Д) гетерозиготными. 10. Какой из приведенных видов микроорганизмов как вектор генноинженерной вакцины может применяться как перорально, так и парентерально, стимулируя местный и системный иммунитет, включая выработку сывороточных антител и секреторных антител слизистых, клеточноопосредованный иммунитет и антителозависимую цитотоксичность: A) Bacillus anthracis; Б) Francisella tularensis; В) Bacillus subtilis; Г) Mycobacterium bovis; Д) Salmonella? 11. Процесс получения гомозиготных диплоидных потомков предусматривает: А) инкубирования эмбриона до стадии бластописты Б) удаление ядра из оплодотворенной яйцеклетки; В) оставление в зиготе только одного гаплоидного набора хромосом (мужского или женского; Г) инкубирование эмбриона до стадии морулы; Д) инкубирование эмбриона до стадии 8 клеточных бластомеров и разделение их на отдельные клетки . 12. Какие практические задачи могут быть решены с помощью техники оплодотворения вне организма животного: А) решение проблемы получения необходимого количества эмбрионов для трансплантации; Б) данный метод позволил бы получить значительно больше эмбрионов для трансплантации от животных с высоким генетическим потенциалом; В) требует для работы значительно меньше спермы; Г) помогает в преодолении бесплодия вследствие нарушения функций яйцеводов и матки; Д) все указанные задачи? 13. Химерные животные: А) передают потомкам характерную для них генетическую мозаичность; Б) не передают потомкам характерную для них генетическую мозаичность; В) передают потомкам первого поколения характерную для них генетическую мозаичность; Г) передают 157 потомкам F1 и F2 характерную для них генетическую мозаичность; Д) передают потомкам первого и второго поколений характерную для них мозаичность, а далее происходит расщепление признаков. 14. Какой из реагентов используется для активации или восстановления диплоидного набора хромосом у зиготы, содержащей гаплоидный набор хромосом, при создании гомозиготных диплоидных животных?: А) полиэтиленгликоль; Б) цитохалазин В; В) физиологический раствор; Г) колхицин; Д) ДМСО 15. Получение идентичных потомков путем пересадки ядер эмбриональных клеток в половые клетки с удаленными ядрами называется: А) гибридизацией; Б) слиянием клеток; В) клонированием; Г) трансформацией; Д) аггрегацией. 16. Метод молекулярной гибридизации осуществляется с помощью: А) моноклональных антител; Б) химерных антител; В) замещенных антител; Г) генетических зондов; Д) праймеров. 17. Для временного культивирования разделенных эмбрионов (бластомеров, морулы) овец, коров, лошади и свиньи вплоть до стадии бластоцисты используют: А) культуральную среду RPMI; Б) культуральную среду HEPES; В) лигатированный яйцевод овцы; Г) лигатированный яйцевод крольчихи; Д) разделенные эмбрионы с.х. животных не подлежат культивированию вне организма. 18. Метод полимеразно-цепной реакций основан на использовании: А) многократного размножения ДНК, выявляемого микроорганизма с последующим определением комплекса ДНК-ДНК; Б) генетических зондов; В) химерных, антител; Г) моноклональных антител; Д) замещенных антител. 19. Определите реагент, используемый в полимеразно-цепной реакций: А) химерные антитела; Б) генетические зонды; В) моноклональные антитела; Г) праймеры; Д) радиоизотопы. 20. Укажите метод, применяемый при получении химерных животных: А) агрегационный; Б) агглютинационный; В) адсорбционный; Г) гибридомный; Д) метод клонирования. 158 Булашев Айтбай Кабыкешович Учебно-методический комплекс по дисциплине: «Современные проблемы биотехнологии в ветеринарной медицине и животноводстве» 6N0701 – Биотехнология Редактор: Г.Е.Сулейменова Теруге берілді _____________ Пішіні ______________ Шартты баспа табағы _________ Басуға қол қойылды ___________. Тапсырыс № _______ Таралымы 100 дана. © С.Сейфуллин атындағы ҚазАТУ баспаханасы., 2012 ж. 010011, Астана, Жеңіс даңғылы, 62 а 159 160
