Модификация генома трипронуклеарных зигот человека с

Protein Cell 2015, 6 (5):363-72 (ИФ=3,247)
CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human
tripronuclear zygotes
Модификация генома трипронуклеарных зигот
человека с помощью системы CRISPR/Cas9
Puping Liang, Yanwen Xu, Xiya Zhang, Chenhui Ding, Rui Huang, Zhen
Zhang, Jie Lv, Xiaowei Xie, Yuxi Chen, Yujing Li, Ying Sun, Yaofu Bai,
Zhou Songyang, Wenbin Ma, Canquan Zhou, Junjiu Huang
Впервые группа ученых из Китая опубликовали результаты
редактирования генома эмбрионов человека
Статья была опубликована в журнале Protein cell, после того
как Nature и Science отказали авторам в публикации статьи
Как минимум 4 исследовательские группы в Китае сегодня
проводят эксперименты по редактированию генома
эмбрионов человека
В 40 странах мира запрещены любые эксперименты,
затрагивающие модификацию генома эмбрионов человека
CRISPR/Cas9 – таргетная система модификации генома,
созданная на основе адаптивной иммунной системы
Streptococcus Pyogenes
CRISPR (Clustered
Regularly Interspaced
Short Palindromic
Repeats) - короткие
повторы нуклеотидов,
которые совместно с
Cas – генами и
ферментами (CRISPRassociated genes)
обеспечивают защиту
клетки (бактерий) от
чужеродных
генетических элементов
(вирусов)
CRISPR/Cas9 применяется для:
- создания генномодифицированных растений
- редактирования генома эмбрионов млекопитающих
- редактирования генома соматических клеточных линий
млекопитающих и человека
- исследования функций отдельных генов
Цель исследования: коррекция гена β-глобина на
соматической клеточной линии, а затем на аномальных
эмбрионах человека (трипронуклеарных зиготах)
Ген β-глобина состоит из 5 субъединиц - HBE, HBG2, HBG1, HBD, HBB
HBB и HBD очень близки по последовательности нуклеотидов
I этап исследования: клеточная линия T293
Синтез трех систем РНК: G1, G2, G3 (gRNA-Cas)
и трансфекция (введение нуклеиновой кислоты)
в клеточную линию Т-лимфоцитов
Контроль осуществляли через 48 часов после
трансфекции с помощью системы Т7Е1 – системы,
распознающей гетеродуплексы в молекуле ДНК: G1 и G2
были эффективны
Синтез ПЦР праймеров для 7 наиболее часто
встречающихся сайтов нетаргетных мутаций при
коррекции гена HBB:
G2 – небольшое число нетаргетных мутаций, но отмечено повреждение в участке интрона
G1 –не отмечено нетаргетных мутаций (G1 – лучший кандидат для дальнейшей работы)
I этап исследования: клеточная линия T293
Синтез одноцепочечных олиго-ДНК, содержащих «молчащие» мутации
Трансфекция в клеточную линию:
- с использованием олиго-ДНК
- с использованием олиго-ДНК и gRNA-Cas9
В экспериментальной группе 48,3% клонов соответствовали олиго-ДНК,
что свидетельствует о высокой эффективности созданной модели
II этап исследования:
зиготы человека с тремя пронуклеусами
Трансфекция системы, содержащей G1-RNA, Cas9 мРНК, олиго-ДНК,и GFP мРНК,
в зиготы в различных комбинациях (86 эмбрионов)
71 эмбрион (82,6%) развивались после трансфекции
Для дальнейшего анализа были отобраны 59 GFP-позитивных эмбрионов
ПЦР-амплификация произведена для 54 GFP-позитивных эмбриона
Эффективность CRISP-Cas9 составила 51,9%
(28 эмбрионов из 54)
Эффективность встраивания олиго-ДНК составила всего 14,3%
(4 эмбриона из 54)
II этап исследования:
зиготы человека с тремя пронуклеусами
В 7 из 28 (25%) эмбрионов отмечалась замена гена HBB на ген HBD
Все трансгенные эмбрионы (n=4+7) были мозаичны по гену HBB или HBD
Для эмбриона №16 произведено клонирование ДНК гена HBB –
получено 5 различных аллелей гена у одного эмбриона
II этап исследования:
зиготы человека с тремя пронуклеусами
Оценка семи наиболее часто встречающихся
сайтов нетаргетных мутаций гена β-глобина у 28 эмбрионов
Отмечены нетаргетные мутации в двух интронах
(OPCML-интрон и TULP1-интрон) не отмечалось для соматической клеточной линии
II этап исследования:
зиготы человека с тремя пронуклеусами
Полноэкзомное секвенирование для 6 эмбрионов,
редактированных с помощью системы CRISPR-Сas9
(3 эмбриона из 4 репарированных с помощью олиго-ДНК и
3 эмбриона из 7 репарированных с помощью HBD)
• Таргетная замена отмечена в 100% эмбрионов
• Были отмечены нетаргетные мутации в генах C1QC и TTR
(транстиретина)
• Нуклеотидные последовательности данных генов близки к G1
Выводы для трипронуклеарных
эмбрионов человека
1. Достаточная эффективность системы
CRISPR-Cas9 (52%)
2. Низкая эффективность системы CRISPR-Cas9 с
заменой олиго-ДНК (14,3%)
3. Высокая доля рекомбинации другим геном (HBB на
HBD) (25%)
4. Высокая доля мозаицизма у трансгенных эмбрионов
(100%)
5. Наличие нетаргетных мутаций, не характерных для
соматических клеток
Ограничения исследования, отмеченные авторами
1. Исследование проводилось на аномальных зиготах
2. Не полногеномное, а полноэкзомное секвенирование
Нерешенные вопросы
модификации
эмбрионов человека
Edward Lanphier - president and
chief executive officer of Sangamo
BioSciences in Richmond, California,
USA, and chairman of the Alliance
for Regenerative Medicine in
Washington DC, USA
Fyodor Urnov - senior scientist at
Sangamo BioSciences in Richmond,
California, USA
Sarah Ehlen Haecker - director of
technology sections at the Alliance
for Regenerative Medicine in
Washington DC, USA.
Michael Werner - executive director
of the Alliance for Regenerative
Medicine in Washington DC, USA
• Высокий риск нетаргетных мутаций
• Высокий риск мозаицизма
• Отсроченные эффекты генетической
модификации эмбрионов могут быть
уточнены только после рождения
ребенка
• Безопасность генетической модификации
может быть признана только после
рождения нескольких поколений людей
• Модификации генома может быть
использована не только в
терапевтических целях (евгеника)
Спасибо за внимание