Технология ДНК-биочипов в анализе генетических маркеров

Болезнь Паркинсона и расстройства движений
Технология ДНК-биочипов в анализе
генетических маркеров болезни Паркинсона
М.И. Шадрина 1, Е.В. Филатова 1, Т. Никопенсиус 2, И.А. Иванова-Смоленская 3,
С.Н. Иллариошкин 3, С.А. Лимборская 3
Института молекулярной генетики РАН (Москва);
Институт молекулярной и клеточной биологии Тартуского Университета (Тарту);
3
Научный центр неврологии РАМН (Москва)
1
2
Для широкомасштабного анализа спектра точковых мутаций и полиморфизмов в генах, вовлеченных в патогенез болезни Паркинсона (БП), нами была использована ДНК-чиповая технология. При создании чипа были выбраны наиболее часто (более чем в двух семьях) встречающиеся точковые мутации в генах моногенных форм БП
и целый ряд однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), расположенных в генах, вовлечённых в патогенез данного
заболевания. Таким образом, мы проанализировали 68 точковых мутаций и 29 ОНП в генах PARK2, PARK7,
LRRK2, PINK1, STH/Tau haplotype, MAPT, UCHL1, NR4A2 (NURR1), PSEN1, SNCB. Необходимо отметить, что
большинство мутаций и ОНП, представленных на чипе, располагается в генах PARK2 и LRRK2, что составляет
соответственно более 58% и 19% от всех мутаций и ОНП на чипе.
Работа проводилась на двух выборках пациентов с БП с ранним началом развития, поскольку считается, что
именно у этой группы пациентов генетический фактор в развитии заболевания выражен сильнее. Именно поэтому
в первую выборку вошёл 21 пациент с ювенильной формой БП (возраст начала до 25 лет), наследуемой по аутосомно-рецессивному типу. Выбор именно этих пациентов для анализа точковых мутаций и ОНП объясняется большой представленностью на чипе точковых мутаций гене PARK2, которые приводят к развитию именно
ювенильного паркинсонизма. Во вторую выборку вошёл 41 пациент со спорадической формой БП с ранним началом развития (от 26 до 45 лет) – в генезе этих случаев также предполагается большой вклад мутаций PARK2.
Из 68 изученных нами точковых мутаций мы обнаружили только три различных миссенс- мутации в гетерозиготном состоянии в гене PARK2 у трёх различных пациентов со спорадической БП с ранним началом развития.
Ранее было показано, что эти три миссенс-мутации (M1L, A82G и C253Y) в гене PARK2 приводят в гомозиготном
состоянии к развитию ювенильной формы БП с наследованием по аутосомно-рецессивному типу [4, 11, 12]. Таким
образом, частота проанализированных нами точковых мутаций в гене PARK2 у больных с ранними формами БП
(из российской популяции составила 5%.
Нам также удалось выявить 12 ОНП (из 29 представленных на чипе) в генах PARK2, NR4A2, LRRK2 и PARK7.
Частоты генотипов выявленных ОНП отражены в таблице 22. Для оценки возможного вклада выявленных нами
ОНП в развитие БП мы провели сравнительный анализ распределения генотипов по этим ОНП в центрально-европейской популяции (данные по популяции CEU, central Europe, из проекта по картированию гаплотипов
HapMap) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) с полученными нами результатами (таблица 1).
Таблица 1. Частоты генотипов и аллелей выявленных ОНП.
Генотипы и аллели по ОНП
Европейская популяция
Пациенты с ювенильной формой
БП из России
Пациенты со спорадической формой БП из России
PARK2
S167N (rs1801474) (GG/GA/AA)
0,967/0,033/0
0,952/0,048/0
0,951/0,049/0
V380L (rs1801582) (CC/CG/GG)
0,683/0,300/0,017
0,81/0,19/0
0,927/0,073/0
D394N (rs1801334) (CC/CT/TT)
0,883/0,117/0
1/0/0
0,902/0,098/0
14
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
Генотипы и аллели по ОНП
Европейская популяция
Пациенты с ювенильной формой
БП из России
Пациенты со спорадической формой БП из России
NR4A2 (NURR1)
N16PinsG (AA/AG/GG)
Нет данных
0,524/0,476/0
0,634/0,366/0
LRRK2
N551K (rs7308720) (CC/CG/GG)
0,883/0,117/0
0,952/0,048/0
0,927/0,073/0
P1542S (rs33958906)
(CC/CT/TT)
Нет данных
0,762/0,238/0
0,805/0,195/0
L153L (rs10878245) (CC/CT/TT)
0,367/0,467/0,167
0,667/0,333/0
0,366/0,341/0,293
I723V (rs10878307) (AA/AG/GG)
0,833/0,150/0,017
1/0/0
0,927/0,073/0
rs7966550 (TT/TC/CC)
0,750/0,200/0,050
0,952/0,048/0
0,951/0,049/0
R1514Q (rs35507033)
(G/A)
G = 0,980;
A = 0,020 (24)
G = 0;
A=0
G = 0,976;
A = 0,024
S461S (rs35847451)
(TT/TC/CC)
Нет данных
0,952/0,048/0
0,976/0,024/0
G = 0,976;
A = 0,024
G = 0,988;
A = 0,012
PARK7 (DJ-1)
R98Q
(rs71653619)
(GG/GA/AA)
G = 0,980;
A = 0,020
Как видно из таблицы 1, частоты, как аллелей, так и генотипов большинства выявленных нами ОНП в проанализированных выборках больных БП из России совпадают с таковыми в популяции Центральной Европе (CEU).
Только для двух ОНП – rs1801582 (V380L) и rs7966550 в генах PARK2 и LRRK2, выделенных в таблице 1 жирным
шрифтом, были обнаружены отличия в распределении генотипов между данными выборками. Следовательно,
можно предположить, что эти два ОНП в генах LRRK2 и PARK2 (rs7966550 и rs1801582 (V380L), соответственно)
могут влиять на риск развития БП в российской популяции. В связи с этим был проведен анализ данных ОНП на
более представительной выборке больных со спорадической формой БП и в популяционной выборке. Результаты
более детального анализа ОНП rs1801582 и rs7966550 в генах LRRK2 и PARK2 представлены в таблице 2.
Как видно из представленных данных, частоты и аллелей, и генотипов по обоим ОНП rs1801582 (PARK2) и
rs7966550 (LRRK2) у больных со спорадической формой БП совпадают с таковыми в популяционной выборке.
Таким образом, проведённый нами более детальный анализ не подтвердил наличие ассоциаций ОНП rs1801582 и
rs7966550 в генах PARK2 и LRRK2 с БП.
Согласно данным полногеномных исследований ассоциаций для двух генов − SNCA и MAPT− были выявлены
строгие ассоциации с БП практически во всех исследованиях [5]. В связи с этим мы также решили провести анализ
ОНП расположенных в этих генах. Были выбраны по одному ОНП в гене SNCA и в гене WNT3, расположенном
рядом с геном MAPT – rs2736990 и rs415430 соответственно [13]. Полиморфизм rs2736990 расположен в самом
длинном интроне гена SNCA, и, вероятно, может влиять на регуляцию экспрессии этого гена. Функция гена WNT3
пока неизвестна, но белок, кодируемый этим геном, относят к семейству секретируемых сигнальных белков, принимающих участие в некоторых процессах при эмбриогенезе [7]. Однако, несмотря на то, что полиморфизм
rs415430 расположен в гене WNT3 его ассоциируют с локусом гена MAPT.
Результаты, полученные нами в ходе этого этапа работы, представлены в таблице 3. Как видно из представленных данных, наличие аллеля С в ОНП rs2736990 в гене SNCA достоверно повышает риск развития БП. Таким образом, нам удалось показать чёткую ассоциацию полиморфизма rs2736990 в гене SNCA с риском развития
спорадической формы БП в российской популяции. Мы получили соотношение шансов OR = 1,75 (ДИ95% = 1,19
2,58; p = 0,004), что отражает повышение риска развития БП у носителей аллеля С почти в два раза. [3, 13].
Как уже было упомянуто раньше, в локусе гена MAPT были выявлены различные ОНП, влияющие на риск развития БП. Тем не менее, несмотря на обнадёживающие результаты Simon-Sanchez и др. [13], нам не удалось выявить ассоциацию полиморфизма rs415430 в гене WNT3 с риском развития БП в российской популяции.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
15
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
Таблица 2. Частоты аллелей и генотипов ОНП в генах LRRK2 и PARK2.
АЛЛЕЛИ
N (%)
ГЕНОТИПЫ
N (%)
Отношение
шансов (95%
доверительный
интервал (CI))
P value
LRRK2 rs7966550
Т
С
ТТ
ТС
СС
Спорадические больные с ранним началом развития БП
227 (88,7%)
29 (11,3%)
101 (78,8%)
25 (19,5%)
2 (1,6%)
0,87 (0,51-1,51)
0,62
Спорадические больные с
поздним началом развития БП
327 (89,3%)
39 (10,7%)
146 (79,8%)
35 (19,1%)
2 (1,1%)
0,84 (0,51-1,38)
0,49
Общая выборка спорадических
больных БП
554 (89,1%)
68 (10,9%)
247 (79,4%)
60 (19,3%)
4 (1,3%)
0,85 (0,55-1,31)
0,47
Популяционная выборка
386 (87,7%)
54 (12,3%)
169 (77,2%)
48 (21,9%)
2 (0,9%)
-
-
PARK2 rs1801582
G
C
GG
GC
CC
Спорадические больные с ранним началом развития БП
210 (79,6%)
54 (20,4%)
82 (62,1%)
46 (34,9%)
4 (3,0%)
1,21 (0,78-1,97)
0,36
Спорадические больные с
поздним началом развития БП
314 (85,8%)
52 (14,2%)
133 (72,7%)
48 (26,2%)
2 (1,1%)
0,79 (0,51-1,24)
0,31
Общая выборка спорадических
больных БП
524 (83,2%)
106 (16,8%)
215 (68,3%)
94 (29,8%)
6 (1,9%)
0,96 (0,66-1,41)
0,96
Популяционная выборка
363 (81,4%)
83 (18,6%)
148 (66,4%)
67 (30,0%)
8 (3,6%)
-
-
Таблица 3. Частоты аллелей и генотипов ОНП в генах SNCA и MAPT/WNT3 .
АЛЛЕЛИ
N (%)
ГЕНОТИПЫ
N (%)
Отношение
шансов (95%
доверительный
интервал (CI))
P value
SNCA rs273699
C
T
CC
CT
TT
(CC+CT)/TT
Спорадические больные с ранним началом развития БП
149 (55,7%)
116 (44,3%)
44 (33,6%)
58 (44,3%)
29 (22,1%)
1,77 (1,05-2,85)
0,03
Спорадические больные с
поздним началом развития БП
181 (49,5)
185 (50,5%)
38 (20,8%)
105 (57,4%)
40 (21,8%)
1,74 (1,05-2,76)
0,01
Общая выборка спорадических
больных БП
327 (52,1%)
327 (52,1%)
301(47,9%)
163 (51,9%)
69 (22,0%)
1,75 (1,19-2,58)
0,004
Популяционная выборка
198 (44,2%)
250 (55,8%)
48 (21,4%)
102 (45,6%)
74 (33,0%)
-
-
MAPT/WNT3 rs 415430
A
G
AA
AG
GG
(AA+AG)/GG
Спорадические больные с ранним началом развития БП
232 (87,2%)
34 (12,8%)
100 (75,2%)
32 (24,1%)
1 (0,7%)
0,19 (0,0084,87)
0,19
Спорадические больные с
поздним началом развития БП
326 (89,1%)
40 (10,9%)
145 (79,2%)
36 (19,7%)
2 (1,1%)
0,16 (0,0083,39)
0,11
Общая выборка спорадических
больных БП
558 (88,3%)
74 (11,7%)
245 (77,5%)
68 (21,5%)
3 (1,0%)
0,87(0,14-5,24)
0,87
Популяционная выборка
402 (89,7%)
46 (10,3%)
178 (79,5%)
46 (20,5%)
0 (0%)
-
-
16
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
Одним из наиболее распространенных на сегодняшний день подходов для поиска новых генов и ДНК маркеров, влияющих на риск развития мультифакторильных заболевания, является анализ ассоциаций с использованием
чиповых технологий. При этом используются ДНК-чипы, позволяющие анализировать, как полиморфные варианты в целом геноме, так полиморфные варианты в ограниченном числе генов, связанных с определенными метаболическими путями.
Для поиска новых генов-кандидатов и ДНК-маркеров, которые могут быть вовлечены в патогенез БП, нами был
выбран чип, содержащий 50 ОНП в 19 генах, белки которых вовлечены в передачу нервного импульса (таблица 4).
Таблица 4. Гены-кандидаты, представленные на ДНК-чипе.
ГЕН
ОНП
Ген холецистокинина (ССK)
2
Ген рецептора холецистокинина А (CCKAR)
3
Ген рецептора холецистокинина В (CCKBR)
4
Ген рецептора дофамина 1 (DRD1)
5
Ген рецептора дофамина 2 (DRD2)
6
Ген рецептора дофамина 3 (DRD3)
3
Ген рецептора дофамина 4 (DRD5)
1
Ген тирозингидролазы (TH)
1
Ген рецептора серотонина 1А (HTR1A)
1
Ген рецептора серотонина 1В (HTR1B)
3
Ген рецептора серотонина 2А (HTR2A)
3
Ген рецептора серотонина 2С (HTR2C)
1
Ген транспортера дофамина (SLC6A4)
1
Ген триптофангидролазы 1 (TPH1)
2
Ген опиоидного рецетора µ (OPRM1)
3
Ген опиоидного рецетора δ (OPRD1)
2
Ген проопиомеланокартина (POMC)
3
Ген проэнкефалина (PENK)
1
Ген вольфрамина (WFS1)
6
Было проанализировано 97 пациентов со спорадической формой БП с поздним началом развития (средний возраст 60,1 ± 12,3 лет). В отобранную группу больных не включались больные с идентифицированными мутациями
в генах PARK2 и LRRK2. Контрольную группу составили 100 индивидуумов из популяционной выборки, не страдающих неврологическими заболеваниями, соответствующих по полу, возрасту обследованной группе больных БП.
При анализе полученных результатов было обнаружено, что распределение генотипов и аллелей для 4 ОНП,
расположенных в трех различных генах, отличается между выборкой спорадических больных БП и популяционным контролем (таблица 5).
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
17
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
В гене рецептора серотонина типа 2A (HTR2A) было проанализировано три ОНП, но только для одного из них
– rs6311 (–1438G/A) была выявлена ассоциация с БП у наших больных. Было показано, что носительство аллеля
А повышает риск развития БП почти в два раза (OR=1,81, ДИ 95% = 1,05 3,24, p =0,04) (таблица 5). Рецептор серотонина типа 2A играет важную роль в обмене серотонина дисбаланс которого может привести к нарушению обмена дофамина в стриатуме. Было так же показано, что связывание лигандов с рецептором серотонина 2А
препятствует синаптическому выбросу дофамина, оказывая тем самым негативное воздействие на дофаминергические нейроны [10]. Кроме того, в нейрохимических исследованиях было установлено, что у больных БП наблюдается снижение концентрации серотонина в стриатуме, коре и цереброспинальной жидкости [1]. В ряде
исследований проведенных ранее была выявлена ассоциация БП с полиморфизмами в генах рецептора серотнина
типа 6 (HTR6) и транспортера серотонина SLC6A4 [8, 9]. При анализе спорадических больных из России было изучено шесть генов (HTR1A, HTR1B, HTR2А, HTR2C, SLC6A4), вовлеченных в обмен серотонина. Для одного из
них, гена HTR2A, была выявлена ассоциация БП с полиморфизмом rs6311 (–1438G/A). Эти данные позволяют
предположить, что рецептор серотонина типа 2A может играть роль в патогенезе БП в российской популяции.
Еще одна ассоциация с БП в российской популяции была выявлена для одного из 6 исследованных ОНП в гене
вольфрамина (WFS1) – rs1801211 (C1645T), расположенного в экзоне 8. Было обнаружено, что у лиц имеющих аллель Т, риск развития БП повышен более чем в два раза (OR=2,34, ДИ95%=1,29 4,24, p =0,005). Как известно, мутации гена WFS1 обусловливают развитие редкого аутосомно-рецессивного нейродегенеративного заболевания –
вольфрам-синдрома, характеризующегося диабетом, атрофией зрительного нерва и нейросенсорной тугоухостью
[6]. Белковый продукт гена, вольфрамин, является мембранным гликопротеином эндоплазматического ретикулума
и предположительно участвует в формировании синаптических везикул [14]. Полученные нами данные, позволяют
предположить, что ОНП rs1801211 гена WFS1 может влиять на риск развития БП в российской популяции.
В гене проопиомеланокортина РОМС было проанализировано три ОНП – rs28930368 (C282T), rs2071345
(C585T), расположенные в кодирующей области экзона 3, и полиморфизм rs1042571 (С866Т), расположенный в
3’-нетранслируемой области. Для двух ОНП, расположенных в кодирующей области экзона 3 гена РОМС была
выявлена ассоциация с БП.
Было установлено, что наличие аллеля Т по обоим ОНП повышает риск развития заболевания в 5 раз (OR=5,0,
ДИ 95%=1,05 23,83, p =0,03) в российской популяции (таблица 5).
Следовательно, полученные данные еще раз подтверждают, что носительство аллеля Т по ОНП rs28930368
(C282T) и ОНП rs2071345 (C585T) в гене РОМС значительно повышает риск развития БП в российской популяции.
Кроме того был проведен поиск корреляций между различными генотипами по ОНП rs28930368 (C282T) и
ОНП rs2071345 (C585T) в гене РОМС и различными клиническими характеристиками больных. Корреляционный
анализ проводился с использованием ранговой корреляции по Спирмену, и для обоих ОНП в гене РОМС была
выявлена одинаковая корреляция с одним клиническим признаком – формой заболевания (Коэффициенты ранговой корреляции по Спирмену для ОНП rs28930368 (C282T) – 0, 24 и для ОНП rs2071345 (C585T) – 0,25.
С целью более детального анализа выявленной корреляции и оценки влияния «неблагоприятных» аллелей исследованных ОНП были произведены следующие модификации:
• все больные были подразделены на 2 подгруппы: 1) группа больных с преобладанием тремора (n=61), в которую вошли больные с дрожательной и дрожательно-ригидной формой БП; 2) группа больных с преобладанием мышечной ригидности (n=36), в которую вошли больные с акинетико-ригидной и
ригидно-дрожательной формой.
• гетерозиготы и гомозиготы по аллелям Т для обоих ОНП были объединены в единый (комбинированный)
генотип.
Для обоих полиморфизмов были обнаружены идентичные корреляции между формой болезни и комбинированным генотипом (гамма-корреляция: Гамма=0,5787, Z=2,8532, P=0,0043 для rs28930368 (C282T) и Гамма=0,5893,
Z=2,8967, P=0,0038 для rs2071345 (C585Т)). При этом у больных с преобладанием мышечной ригидности имело
место значимое повышение частоты комбинированного генотипа CT+TT (частота = 0,78) – одинаковое для обоих
ОНП, тогда как у пациентов с преобладанием тремора – гомозиготного СС-генотипа (частота = 0, 68), также одинаковое для обоих ОНП.
Таким образом, можно утверждать, что два полиморфизма в кодирующей области гена POMC ассоциированы
с БП: носители редкого Т-аллеля по обоим SNP имеют достоверно более высокий риск БП, а наличие этого аллеля
у пациентов коррелирует с развитием более тяжелой ригидной формы БП. Функциональная роль указанных полиморфизмов неясна. Эти ОНП приводят к синонимическим заменам S94S (rs28930368 (C282T)) и А195A
(rs2071345 (C585Т)) и вряд ли могут влиять непосредственно на риск развития БП. Однако эти замены могут быть
сцеплены с каким-либо другим функционально значимым вариантом, непосредственно влияющим на риск развития БП. Белок проопиомеланокортин является предшественником большого числа регуляторных пептидов,
включая адренокортикотропный гормон (АКТГ) и α-меланотропин. Проведенные нами исследования показали,
что пептидный препарат семакс, являющийся синтетическим аналогом АКТГ(4−10), может изменять экспрессию
мРНК мозгового нейротрофического фактора (BDNF) как в первичных глиальных клетках мозга новорожденных
крыс, так в нейронах гиппокампа и лобной коры. Кроме того было установлено, что α-меланотропин может повышать экспрессию мРНК BDGF и в нейронах среднего мозга крыс [2]. АКТГ и α-меланотропин кодируются
последовательностью экзона 3, в которой расположены ассоциированные с БП полиморфизмы. Известно также,
18
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
Таблица 5. Частоты аллелей и генотипов ОНП в генах HTR2A, WFS1, POMC.
АЛЛЕЛИ
N (%)
ГЕНОТИПЫ
N (%)
Отношение
шансов (95%
доверительный
интервал (CI))
HTR2A rs6311
G
A
GG
GA
AA
Спорадические больные с
поздним началом развития БП
113 (58,2%)
81 (41,8%)
31 (31,9%)
51 (52,6%)
15 (15,5%)
1,81 (1,05-3.24)
Популяционная выборка
135 (67,5%)
65 (32,5%)
46 (46,0%)
43 (43,0%)
11 (11,0%)
-
WFS1 rs1801211
C
T
CC
CT
TT
CC/(CT+TT)
Спорадические больные с
поздним началом развития БП
147 (75,8%)
47 (24,2%)
52 (53,6%)
43 (43,4%)
2 (2,1%)
2,34 (1,29-4,24)
Популяционная выборка
173 (86,5%)
27 (13,5%)
73 (73,0%)
27 (27,0%)
0 (0,0%)
-
POMC rs28930368
C
T
CC
CT
TT
CC/(CT+TT)
Спорадические больные с
поздним началом развития БП
180 (92,8%)
14 (7,2%)
88 (90,7%)
4 (4,1%)
5 (5,2%)
5,01 (1,0523,83)
Популяционная выборка
197 (98,5%)
3 (1,5%)
98 (98,0%)
1 (1,0%)
1 (1,0%)
-
POMC rs2071345
C
T
CC
CT
TT
CC/(CT+TT)
Спорадические больные с
поздним началом развития БП
178 (91,7%)
16 (0,3%)
88 (91,7%)
2 (2,1%)
7 (7,2%)
5,01 (1,0523,83)
Популяционная выборка
194 (99,0%)
2 (1,0%)
96 (98,0%)
2 (2,0%)
0 (0,0%)
-
P value
GG/(GA+AA)
0,04
0,005
0,03
0,03
что РОМС как нейропептид ответственен за пролиферацию, дифференцировку и выживание нейронов. Эти данные, возможно, частично объясняют выявленную ассоциацию между полиморфизмами гена РОМС и БП.
Суммируя полученные нами результаты можно предположить, что ген РОМС играет роль в патогенезе спорадической БП и является новым геном-кандидатом данного заболевания. Можно также предположить, что ген
РОМС являться геном модификатором, в определенной степени ответственным за фенотипическую вариабельность БП в российской популяции.
Литература
1.
D’Amato R.J., Zweig R.M., Whitehouse P.J. et al. Aminergic systems in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Ann. Neurol. 1987; 22: 229–236.
2.
Dolotov O.V., Seredenina T.S., Levitskaya N.G. et al. The heptapeptide SEMAX stimulates BDNF expression in different areas of the rat brain in vivo. Dokl. Biol. Sci. 2003; 391: 292-297.
3.
Edwards T.L., Scott W.K., Almonte C. et al. Genome-wide association study confi rms SNPs in SNCA and the MAPT region as common risk factors for Parkinson disease. Ann. Hum. Genet.
2010; 74: 97–109.
4.
Hedrich K., Kann M., Lanthaler A.J. et al. The importance of gene dosage studies: mutational analysis of the parkin gene in early-onset parkinsonism. Hum Mol Genet. 2001; 10: 1649-1656.
5.
International Parkinson Disease Genomics Consortium. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association
studies. Lancet 2011; 377: 641-649.
6.
Khanim F., Kirk J., Latif F., Barrett T.G. WFS1/wolframin mutations Wolfram syndrome, and associated diseases. Hum. Mutat. 2001; 17: 357–367.
7.
Liu P., Wakamiya M., Shea M.J. et al. Requirement for Wnt3 in vertebrate axis formation // Nat. Genet. 1999; 22: 361-365.
8.
McCann S.J., McManus M.E., Johnson A.G. et al. The serotonin transporter gene and Parkinson's disease. Eur. Neurol. 2000; 44: 108 111.
9.
Messina D., Annesi G., Serra P. Association of the 5-HT6 receptor gene polymorphism C267T with Parkinson's disease. Neurology 2002; 58: 828–829.
10. Ng N.K., Lee H.S., Wong P.T. Regulation of striatal dopamine release through 5-HT1 and 5-HT2 receptors. J. Neurosci. Res. 1999; 55: 600–607.
11. Oliveira S.A., Scott W.K., Martin E.R. et al. Parkin mutations and susceptibility alleles in late-onset Parkinson’s disease. Ann. Neur. 2003; 53: 624-629.
12. Rawal N., Periquet M., Lohman E. et al. New parkin mutations and atypical phenotypes in families with autosomal recessive parkinsonism. Neurology 2003; 60: 1378-1381.
13. Simon-Sanchez J., Schulte C., Bras J.M. et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 2009; 41: 1308–1312.
14. Takeda K., Inoue K., Tanizawa Y. et al. WFS1 (Wolfram syndrome 1) gene product: predominant subcellular localization to endoplasmic reticulum in cultured cells and neuronal expression in
rat brain. Hum. Mol. Genet. 2001; 10: 477–484.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
19
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
Особенности клинического течения болезни
Паркинсона, ассоциированной с мутациями
в гене LRRK2
А.Ф. Якимовский 1, 3, О.Н. Иванова 1, А.К. Емельянов 1, 2, С.Н. Пчелина 1, 2
1
Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова;
2
Петербургский институт ядерной физики им Б.П. Константинова РАН;
3
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург)
Современная неврология – клиническая и экспериментальная – невозможны без изучения заболеваний ЦНС
на молекулярно-клеточном уровне. Достижения современной генетики позволяют по-новому взглянуть на этиологию нейродегенеративных заболеваний, в частности на болезнь Паркинсона (БП). Однако это не отменяет и не
снижает актуальность клинических наблюдений, где невролог, по сути, имеет дело с фенотипом заболевания. Возможность обнаружения взаимосвязи нарушения молекулярного и системного уровней, выявления возможных
корреляций генетических нарушений и особенностей течения БП – один из путей выяснения основ этиопатогенеза заболевания.
Нами обследовано более тысячи пациентов с БП и вторичным («симптоматическим») паркинсонизмом. Работа
проводилась при реализации консультативно-диагностических мероприятий в МКДЦ СПбГМУ им. акад. И.П.
Павлова, в клинической группе Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (на базе больницы № 20) и в поликлинических отделениях медицинских учреждений города. В этой популяции нами был определен спектр мутаций
в гене LRRK2 среди семейных форм БП, выявлен ряд семей с LRRK2-ассоциированной БП и проведена молекулярная диагностика БП в этих семьях [14, 15]. В ходе исследования нами выявлены как ранее идентифицированные
мутации (G2019S, R1441C) [3, 13], так и новая мутация V1613A, приводящая к развитию БП с преобладающим
тремором [15].
Накопленный материал позволил провести сопоставление фенотипа LRRK2-ассоциированной БП и БП отличной этиологии. Целью данной работы было описание возможных особенностей паркинсонизма у 13 пациентов
с мутациями в гене LRRK2 и сопоставление фенотипа LRRK2-ассоциированной БП с группой пациентов с БП, у
которых мутации в гене LRRK2 выявлено не было. Диагноз БП выставлялся при наличии как минимум двух из
четырех признаков паркинсонических нарушений: тремора покоя, ригидности скелетной мускулатуры пластического типа, брадикинезии и постуральных нарушений [1, 4]. При необходимости использовались инструментальные методы, в частности проводилась компьютерная тензо-треморография. В исследование вошли пациенты с
чёткой симптоматикой, установленным диагнозом БП и без других дегенеративных заболеваний головного мозга.
Забор крови для последующего молекулярно-генетического анализа был осуществлен у 330 пациентов (230 спорадических случаев, 100 семейных случаев) и 14 родственников (11 с БП и 3 с отсутствием заболевания). У 75 пробандов с семейной формой БП проведен полный сиквенс кодирующей области гена LRRK2 [19]. У остальных
пациентов проведен скрининг ряда мутаций в гене LRRK2 (мутации G2019S, R1441C, R1441G) разработанными
нами ранее методами на основе ПЦР и рестрикционного анализа [3, 14]. В настоящем исследовании скрининг
вышеуказанных мутаций был проведен у 25 пациентов с семейной формой БП и у 40 пациентов со спорадической
БП, впервые включенных в исследование.
Большая часть пациентов находилась под нашим наблюдением длительное время (10-15 лет). Для выявления
особенностей клинического течения LRRK2-ассоциированной БП были сформированы две группы сравнения:
13 пациентов с LRRK2-ассоциированной БП (7 муж., 6 жен.; 71,0±9,3 лет (средний возраст ± SD)), а также 80 пациентов с течением БП более 7 лет (70,6±5,3 лет) и не имеющих мутаций в гене LRRK2 (далее – группа сравнения).
Группа пациентов с LRRK2-ассоциированной БП и пациенты группы сравнения были сопоставимы по полу, возрасту и длительности заболевания. Все они являлись жителями Санкт-Петербурга. Данное исследование одобрено
этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Для сравнения исследуемых характеристик между группами использовался критерий . Сравнение среднего
возраста пациентов проводилось с помощью критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия
при P < 0,05. Средние значения приведены со стандартным отклонением.
Результаты и их обсуждение
В группе пациентов из 100 обследованных семейных случаев БП в шести семьях LRRK2-ассоциированная БП
была выявлена нами ранее [3, 14, 15] и двух семьях (родословные PD6 и PD7) – в настоящем исследовании. Также
два носителя мутаций LRRK2 выявлены среди 230 пациентов со спорадической БП. Таким образом, частота
20
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
LRRK2-ассоциированной БП среди семейных форм заболевания (8%), значительно выше, чем среди спорадических случаев (0,9%).
Эффективность терапии
Л-ДОФА
Побочные эффекты терапии Л-ДОФА
67
Б
-
+
+
+
Не принимал
-
2
G2019S
PD1*
(III-1)
м
53
35
Б,Р
+
+
+
+
хорошая
Психические изменения
3
G2019S
PD2
(II-1)
м
70
50
Т
+
+
+
+
хорошая
нет
4
G2019S
PD3*
(III-1)
ж
54
39
Б
+
+
+
+
хорошая
Гиперкинез
5
G2019S
PD4*
(III-4)
м
78
59
Т
+
+
+
+
хорошая
нет
6
G2019S
PD5*
(II-2)
ж
78
68
Т
+
-
-
+
Не принимал
-
7
G2019S
PD6
(II-2)
м
72
65
Т
+
+
+
+
хорошая
галлюцинации
8
G2019S
PD7
ж
76
74
Т
+
+
+
+
Не принимал
-
9
G2019S
PD7
ж
74
69
Т
+
+
+
+
хорошая
нет
10
V1613A
PD8*
(II-3)
м
79
60
Т
+
-
-
+
плохая
нет
11
V1613A
PD8
(II-1)
ж
79
70
Т
+
-
-
+
Не принимал
-
12
G2019S
сБП
ж
60
47
Р
+
+
+
+
хорошая
Дискинезии
13
R1441C
сБП
м
75
61
Т
+
+
-
+
Не принимал
-
Симптомы заболевания
на момент осмотра
Симптомы БП на момент начала
заболевания
75
Возраст
м
Пол
PD1
(II-1)
Семья
G2019S
Мутации
1
Пациент
Возраст начала заболевания
Таблица 1. Характеристики пробандов-пациентов с БП – носителей мутаций в гене LRRK2.
Т
Р
Б
П.Н.
Обозначения: Т – тремор, Р – ригидность, Б – брадикинезия, П.Н. – постуральная нестабильность, сБП – спорадическая форма,
БП* – пациенты, у которых длительность наблюдения за течение заболевания в настоящем исследовании составили 5-15 лет.
Характеристики пациентов с БП, у которых была обнаружена мутация в гене LRRK2, представлены в таблице 1.
Известно, что тремор покоя вомногих случаях является дебютным признаком БП, после чего добавляются остальные компоненты триады. Именно эта закономерность обнаружена у данной группы – дебютным признаком тремор был у 9 пробандов. При развитии болезни у 3 из них (23%) он остался единственным признаком (наряду с
нарушением позных реакций), в то время как у 8 пациентов (61%) сформировалась развёрнутая картина БП с классической триадой. В связи с этим уместно заметить, что симптоматический профиль заболевания в популяции
наших пациентов за 10 лет наблюдений несколько видоизменился. В период 1998-2000 из 230 человек с установленным диагнозом БП половина (50,4%) имела полный набор симптомов триады, а остальные (с акинетико-ри-
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
21
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
гидной и дрожательной формами) распределились примерно поровну. Повторный анализ, охвативший период
2008–2010 г.г. (256 человек) показал, что доля пациентов с акинетико-ригидно-дрожательной формой БП увеличилась (до 55,5%), доля пациентов с акинетико-ригидной формой заметно уменьшилась (до 5,5%), а с дрожательной,
напротив – увеличилась до 39%. В группе сравнения, о которой пойдёт речь ниже (таблица 2), созданной по другим
критериям, обнаружена та же закономерность, что говорит о явной тенденции в целом и о том, что симптоматически группа пациентов с LRRK2-ассоциированной БП практически не отличается от общей популяции и характеризуется гетероморфностью признаков.
Учитывая приведённые факты, рассмотрим основные характеристики клинического течения в семьях пациентов
с LRRK2-ассоциированной БП. Нами выявлено семь семей (родословные PD1–PD7 на рисунке 1), в которых БП
обусловлена наличием мутации G2019S, одна семья с БП, обусловленной мутацией V1613A (PD8), а также два спорадических случая с мутациями G2019S и R1441C. В настоящем исследовании при скрининге мутаций LRRK2 среди
дополнительно обследованных 25 пациентов с семейной формой БП в двух семьях выявлена мутация G2019S. В
семье PD6 мутация G2019S выявлена только у пробанда (муж., начало заболевания в возрасте 65 лет). В семье PD7
этаже мутация была обнаружена у пробанда (жен., начало заболевания в возрасте 74 лет) и ее сестры, также больной
БП (начало заболевания в 69 лет). Все трое ранее не описанных пациентов с мутацией G2019S имели БП с классической триадой симптомов (акинетико-ригидно-дрожательная форма) с поздним началом заболевания.
Оба пациента с мутацией V1613A (семья PD8 пациенты II-1 II-3) имели вариант течения БП с преобладанием
тремора покоя – в их клинической картине отсутствовала ригидность скелетной мускулатуры пластического типа
и брадикинезия. Несмотря на длительное течение болезни (17 и 19 лет заболевания) у пробанда и его сестры тремор
(наряду с нарушениями в системе позных рефлексов) оставался единственным признаком из триады симптомов
заболевания. Дрожательная форма заболевания зарегистрирована и у ещё одного пациента с мутацией G2019S
(семья PD5, пациент II-2) с длительностью заболевания 10 лет, в то время как остальные пациенты с мутацией
G2019S и R1441C имели классическую картину идиопатической БП с наличием классической триады признаков.
Анализ возраста начала заболевания показал, что в среднем он был ниже у пациентов с мутацией G2019S, локализованной в киназном районе LRRK2 – по сравнению с мутациями, локализованными в других районах, однако
различия между группами не достигали статистической значимости. Проблема «омоложения» действительно актуальна и возвращаясь к анализу популяции наших пациентов можно отметить, что основным «поставщиком» заболевания – и десять лет назад и сейчас – является возраст 50–69 лет (в этот период заболели, соответственно, 66% и
68% пациентов). Пациенты, заболевшие после 70 лет, составили 14,8% и 15,6%, а вот доля заболевших в 49 лет и
ранее снизилась с 19,2% (т.е. ранний паркинсонизм обнаруживался десять лет назад у каждого пятого) до 16,4%.
Молекулярно-генетическое исследование, проведенное нами в семьях пациентов, оказалось полезным в плане
исключения наследования данного заболевания у некоторых членов семей (родословные PD1–PD3). В то же время
был выявлен один бессимптомный носитель мутации в возрасте 40 лет. Показателен случай, зарегистрированный
в семье PD3, где у пробанда III-1 проявления заболевания в дебюте (больна с 39 лет) были крайне нечёткими, смазанными: ригидность мускулатуры отсутствовала, тремор рук был мелким, усиливающимся при пробах на напряжение, но не на положение конечности, гипокинезия носила неясный характер. В течение долгого времени диагноз
не выставлялся (фигурировал эссенциальный тремор или амиостатический синдром), пациентка не получала антипаркинсонической терапии, хотя её дееспособность прогрессивно снижалась. При проведении тщательной диагностики в МКДЦ СПбГМУ с последующим назначением фармакотерапии с минимальными дозами Л-ДОФА
(200 мг в сутки) был получен хороший устойчивый результат, существенно улучшивший качество жизни, самообслуживание пациентки. Если бы генетическое исследование было проведено раньше (а не в возрасте 49 лет),
сомнения неврологов были бы сняты, и адекватная терапия была бы начата своевременно.
С целью изучения общей клинической картины LRRK2-ассоциированной БП нами проведено сопоставление
возраста начала болезни, симптоматики БП в указанной группе пациентов с ещё одной группой сравнения. В
группу сравнения вошли пациенты с БП, не имеющие мутаций в гене LRRK2, сопоставимые с группой LRRK2ассоциированной БП по полу, возрасту и длительности заболевания. При сравнении двух вышеуказанных групп
по формам заболевания и возрасту начала заболевания достоверных отличий не выявлено (таблица 2).
Другой, не менее важной причиной создания дополнительной группы сравнения стало изучение другого актуального клинического вопроса – эффективности лечения, в частности леводопотерапии. Большинство пациентов,
вошедших в наше исследование, проходили комплексную лекарственную антипаркинсоническую терапию (сочетание холинолитиков, аналогов амантадина, постсинаптических активаторов дофаминовых рецепторов, препаратов Л-ДОФА, ноотропов и проч.). Восемь из 13 пациентов с LRRK2-ассоциированной БП и 46 пациентов из
группы сравнения получали терапию препаратами Л-ДОФА. Суточная доза обычно колебалась в пределах 200 –
800 мг. Положительный ответ на Л-ДОФА (полное купирование или существенное снижение гипокинезии и уменьшение ригидности мускулатуры) зарегистрирован у 87,5% пациентов с LRRK2-ассоциированной БП и у 78% пациентов группы сравнения, что соответствует эффективности, характерной для данной группы препаратов [8].
Семь из восьми пациентов принимающих Л-ДОФА с мутациями в гене LRRK2 имели хороший ответ на проводимую терапию. Все они являлись носители мутации G2019S и принимали препараты Л-ДОФА более пяти лет. Слабый ответ на терапию препаратами Л-ДОФА наблюдался у одного пациента с мутацией V1613A с преобладающим
паркинсоническим тремором. Учитывая тот факт, что побочные эффекты препаратов коррелируют с длительностью
их приема, при анализе частоты побочных осложнений от проводимой Л-ДОФА терапии в группу сравнения были
22
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
Таблица 2. Сопоставление клинического течения БП у лиц с мутациями в гене LRRK2 и у лиц с БП отличной этиологии.
Клинические характеристики пациентов БП
Пациенты с мутацией в гене
LRRK2
(13 человек)
Пациенты с БП, c отсутствием
мутации в гене LRRK2 (80 человек)
P
Мужчины/женщины
7(53,8%)/6(46,2%)
34(42,5%)/46(57,5%)
0,4
Д. ф.
3 (23,1%)
28 (35%)
0,7
А-Д. ф.
0
1 (0,1%)
0,7
А-Р-Д. ф.
6 (61,5%)
41 (51,3%)
0,9
А-Р. ф.
1 (7,7%)
5 (6,3%)
0,7
Р-Д. ф.
1 (7,7%)
5 (6,3%)
0,7
Длительность
течения заболевания
12,2±5,9 (2–19)
14,8±7,9 (3–36)
0,4
Средний возраст больных БП
(лет)
71,0±9,3
65,5± 8,8
0,1
Средний возраст начала БП (лет)
58,8± 12,4
50,7± 8,7
0,1
Примечание: Д. ф. – дрожательная форма, А-Д. ф. – акинетико-дрожательная форма, А-Р-Д. ф. – акинетико-ригидно-дрожательная
форма, А-Р. ф. – акинетико-ригидная форма, Р-Д. ф. – ригидно-дрожательная форма.
отобраны 35 пациента с БП, не имеющие мутаций в гене LRRK2 и принимающие препараты Л-ДОФА более 5 лет
с положительным эффектом. Была выявлена повышенная частота побочных эффектов при приеме препаратов ЛДОФА в группе с наследственной формой БП, обусловленной мутацией G2019S (OR 6,4, p<0,02) (таблица 3). У
большинства пациентов с G2019S-БП, получающих препараты Л-ДОФА, наблюдались побочные эффекты в виде
тяжелых дискинезий, гиперкинезов, психических расстройств. Вместе с тем, время наступления и сам характер побочных эффектов существенно варьировали. Так у пациентки III-1 из семьи PD3 уже на втором году приема препаратов Л-ДОФА (суточная доза около 600 мг) появился двойной гиперкинез на «включение» (развивался через
10-15 мин после приема очередной дозы препарата) и на «выключение» – в конце действия препарата, примерно в
Таблица 3. Ответ на терапию Л-ДОФА-содержащими препаратами у пациентов с LRRK2-ассоциированной
БП (носители мутации G2019S) и БП отличной этиологии.
Пациенты с LRRK2-ассоциированной БП*
Пациенты с отличной этиологией
БП*
Р
Хороший эффект терапии
7 из 8 (87,5%)
35 из 42 (83,3)
0,87
Побочные эффекты
4 из 7 (57,1%)
6 из 35 (17,1%)
0,02
Дистонии
0
3 из 6
Дискинезии
2 из 4
2 из 6
Психопатология
2 из 4
0
*Все пациенты получали терапию препаратами Л-ДОФА более пяти лет.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
23
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
конце четвертого часа. Гиперкинез нижних конечностей носил императивный характер и представлял собой отрывистые размашистые движения обеими ногами и правой руки с захватом (в стадии генерализации) мимической и
жевательной мускулатуры лица и мышц плечевого пояса. Длительность гиперкинеза варьировала от 5 до 30 мин,
гиперкинез «выключения», как правило, был короче и имел дистонический компонент. Коррекция медикаментозной терапии (в частности добавка минимальных доз церукала) позволила ослабить и даже полностью исключить
эти проявления (гиперкинез «выключения»), но полностью ликвидировать их не удалось. У другой пациентки, с
отсутствием семейного анамнеза, с той же мутацией, на высоте действия препарата развивался гиперкинез головы,
напоминающий хореический и постоянным фоном стала дистония мышц дистальных отделов нижних конечностей.
Совершенно другими были проявления побочных эффектов Л-ДОФА у пациента III-1 из семьи PD1. Терапия
препаратами Л-ДОФА началась у него на втором году заболевания (дебют болезни – в 35 лет) и проводилась практически непрерывно. Несмотря на достаточно большие дозы (более 1 г в сутки), побочные эффекты проявились
только к 55 годам, не имели моторных компонентов и выражались в усилении психо-эмоциональной нестабильности, психотических реакциях, напоминающими инволюционные проявления, в итоге ставшими предметом внимания психиатрической службы. У пациента II-2 из семьи PD6 Л-ДОФА также не вызывала двигательных
нарушений, но приводила к периодическим сумеречным зрительным галлюцинациям.
Итак, в настоящем исследовании мы сопоставили клиническое течение заболевания у 13 пациентов с LRRK2ассоциированной БП и 80 пациентов с БП без мутации в гене LRRK2 в популяции Северо-Западного региона России. Сопоставление в обеих группах возраста начала заболевания и набора моторных нарушений не выявило
существенных различий. Это, в согласии с мнением других авторов [2, 5, 7, 10], позволяет нам сделать вывод о
сходности симптомов и характера течения LRRK2-ассоциированной формы и БП иной этиологии. Но очевидно
и другое – широкий фенотипический полиморфизм внутри группы с БП, связанной с мутацией в гене LRRK2.
Более того, в одной семье, у носителей одной и той же мутации, но в разных поколениях (родители, дети), могут
быть различными возраст начала заболевания, динамика течения и манифестность отдельных симптомов. В нашем
исследовании в семье PD1 у пациента II-1 носителя мутации G2019S наблюдалось течение болезни с началом заболевания в 67 лет с нарушением походки и содружественных движений, сгорбленности и легкой ригидности скелетной мускулатуры. Требовалась минимальная терапия, основанная на холинолитиках и препаратов из группы
мидантана. Клиническая картина, дебют заболевания и характер развития у его сына (III-1) были другими. Дебютным признаком был мелкий тремор кистей рук, расцениваемый (учитывая возраст – 35 лет) как психогенный.
Добавка гипомимии и перерождение тремора рук в типичный низкоамплитудный тремор покоя с симптомом «зубчатого колеса» и постепенной добавкой ригидности скелетной мускулатуры – сделали клиническую картину более
рельефной. Подобное разнообразие в клинической картине LRRK2-ассоциированной БП отмечалось и ранее [12,
14], но остаётся актуальным вопрос – с чем связана такая вариабельность?
Высказывается мнение о том, что различия в клинической картине G2019S-ассоциированной БП связаны с
особенностями течения заболевания в различных этнических группах. В нашей работе все выявленные носители
мутации G2019S сообщали о происхождении, связанны с евреями-ашкенази, что не удивительно, принимая во
внимание высокую частоту этой мутации среди данной популяции [10]. Носители мутаций R1441C и V1613A имели
славянское происхождение, но вряд ли этот факт помогает в анализе вариабельности проявлений заболевания.
Разнообразие в клинической картине LRRK2-ассоциированной БП не объясняется и локализацией наследуемой мутации, хотя было отмечено более раннее проявление БП у носителей мутаций, локализованных в киназном
домене LRRK2, по сравнению с мутациями, расположенными в других районах белка [6]. В настоящем исследовании также отмечена тенденция к снижению возраста начала заболевания при наличии мутацией G2019S (киназный домен), чем при наличии мутации R1441C и V1613A. Большинство исследований, посвященных возрасту
начала заболевания LRRK2-ассоциированной БП касаются мутации G2019S. Оценки пенетрантности мутации
G2019S сильно варьируются в различных исследованиях. Показано, однако, что пенетрантность данной мутации
не зависит от пола и расовой принадлежности и составляет по оценкам различных авторов в возрасте до 59 лет –
13-45%, в возрасте до 69 лет – 21-85% и в возрасте 79 лет – 74-100% [5, 8]. При этом описан случай бессимптомного
носительства мутации в возрасте 80 лет [9].
Разнообразие фенотипического проявления БП у носителей мутаций в гене LRRK2 позволяют предположить
модифицирующее влияние средовых или генетических факторов на возраст начала и тяжесть течения данной
формы заболевания. Было бы неверным сбрасывать со счетов и влияние дополнительных, не только провоцирующих, но и модифицирующих факторов – экологических. Возможно и влияние разнообразной соматической патологии. С целью выяснения значимости этих факторов для вариативности симптомов заболевания, возраста её
возникновения и тяжести течения LRRK2-ассоциированной БП необходимы дальнейшие исследования.
Значимым итогом нашего исследования является демонстрация более частой встречаемости осложнений при
приеме препаратов Л-ДОФА у пациентов с G2019S-БП (57,1% против 17,1% в группе сравнения). Аналогично высокая частота (58%) возникновения побочных эффектов у пациентов с мутациями в гене LRRK2 сообщается в работе Healy с соавт [8]. В данном исследовании, однако, частота осложнений при терапии L-ДОФА превышала 50%
и в группе сравнения. В нашем исследовании курация пациентов с БП в обеих группах осуществлялась по единой
парадигме, где основным является назначение комплексной терапии с набором препаратов из различных фармакологических групп, сообразно форме заболевания. Опыт показывает, что возникновению побочных явлений при
Л-ДОФА терапии зависит не только от дозы препарата, но и от режима их приема и, не в последнюю очередь – от
24
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
того, на какой стадии заболевания они были введены. Мы старались как можно дольше лечить пациентов минимальной эффективной дозой Л-ДОФА с ее последующим постепенным увеличением. Следует напомнить, что в
данном исследовании большинство больных являлись амбулаторными пациентами и больные с 4-й и 5-й стадией
БП (по классификации M.Hoehn и M.Yahr) практически не фигурируют в нашем анализе. Это позволяет утверждать, что появление побочных эффектов L-ДОФА хоть и связано с действием препарата, вероятно, базируется
на эндогенных особенностях патогенеза LRRK2-ассоциированной БП. Ещё раз подчеркнём, что частота побочных
эффектов в группе сравнения составила 17,1%, что достоверно ниже, чем в группе пациентов с LRRK2-ассоциированной БП, принимающих препараты L-ДОФА. Повышенная частота L-ДОФА-индуцированных дискинезий
при LRRK2-ассоциированной БП была выявлена также в работах зарубежных авторов [10, 11].
Учитывая широкое распространение мутации G2019S среди семейных форм БП в России, следует рекомендовать скрининг этой мутации среди пациентов с БП, сообщающих о положительном семейном анамнезе заболевания. Генетическое тестирование на наличие мутации G2019S LRRK2 может быть в первую очередь полезно в ряде
случаев в качестве дополнительного диагностического теста. Следует отметить, что пока не будут отработаны чёткие принципы комплексной (прежде всего – медикаментозной) нейропротекторной терапии, досимптоматическое
тестирование мутации останется избыточным и лишенным цели. При проведении медико-генетического консультирования досимптоматических носителей мутаций в гене LRRK2 следует принимать во внимание неполную пенетрантность мутаций. С другой стороны, относительная распространенность LRRK2-ассоциированных форм
БП среди семейных случаев заболевания впервые дает возможность исследования репрезентативных групп пациентов с однородной этиологией заболевания, что, несомненно, подчеркивает научную важность проведения ДНКдиагностики пациентам с семейной формой БП. Выделение групп риска развития БП дает неврологам шанс
Рисунок 1. Родословные семей с LRRK2-ассоциированной БП.
А. G2019S-ассоциированная БП (n-норма; m-мутация G2019S в гетерозиготном состоянии, указан возраст на момент обследования, в скобках
– возраст начала заболевания).
Б. V1613A-ассоциированная БП (m-мутация V1613A в гетерозиготном состоянии, указан возраст на момент обследования, в скобках –
возраст начала заболевания).
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
25
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
подбора терапии, способной отодвинуть клиническое проявления болезни. При скрининге мутаций в гене LRRK2
в первую очередь целесообразно проводить идентификацию мутации G2019S, частота которой среди семейных
форм БП в России достигает 7%.
Полученные нами данные говорят о сходности клинического течения LRRK2-ассоциированной БП и БП, не
связанной с мутациями в этом гене, а также позволяют предполагать повышенную частоту осложнений при терапии
Л-ДОФА у пациентов с мутацией G2019S. Дальнейшее развитие исследований в сфере молекулярной генетики наследственных форм БП в сочетании с тщательным неврологическим анализом позволит не только улучшить курацию
данной группы пациентов, но существенно продвинуться во всё ещё нерешенных вопросах этиопатогенеза БП.
Литература
1.
Голубев В.Л., Левин Я.И., Вейн А.М. Болезнь Паркинсона и синдром паркинсонизма. М.: МЕДпресс-информ, 2000.
2.
Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование в неврологии. М.: МИА, 2002.
3.
Пчелина С.Н., Иванова О.Н., Емельянов А.К. и др. Мутации в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России. Мед. генетика 2006; 5: 48-51.
4.
Скоромец А.А., Скоромец А.П., Скоромец Т.А. Нервные болезни. М.: МЕДпресс-информ, 2005.
5.
Elbaz A. LRRK2: bridging the gap between sporadic and hereditary Parkinson's disease. Lancet Neurol. 2008; 7: 562-564.
6.
Golub Y., Berg D., Calne D.B. et al. Genetic factors influencing age at onset in LRRK2-linked Parkinsons disease. Parkinsonism Relat. Disord. 2009; 15: 539-541.
7.
Haugarvoll K., Rademakers R., Kachergus J.M., et al. LRRK2 R1441C parkinsonism is clinically similar to sporadic Parkinson disease. Neurology 2008; 70: 1456-1460.
8.
Healy D.G., Falchi M., O'Sullivan S.S. et al. Phenotype, genotype, and worldwide genetic penetrance of LRRK2-associated Parkinson's disease: a case-control study. Lancet Neurol. 2008; 7:
583-590.
9.
Kay D.M., Kramer P., Higgins D. et al. Escaping Parkinson's disease: a neurologically healthy octogenarian with the LRRK2 G2019S mutation. Mov. Disord. 2005; 20: 1077-1078.
10. Lasage S., Brice A. Parkinson’s disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Hum. Mol. Genet. 2009; 18: R48-R59.
11. Nishioka K., Kefi M., Jasinska-Myga B. et al. A comparative study of LRRK2, PINK1 and genetically undefined familial Parkinson's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 2010; 81: 391395.
12. Paisan-Ruiz C., Jain S., Evans E.W. et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 2004; 44: 595-600.
13. Payami H., Larsen K., Bernard S., Nutt J. Increased risk of Parkinson's disease in parents and siblings of patients. Ann. Neurol. 1994; 36: 659-661.
14. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Ivanova O.N. et al. G2019S LRRK2 mutation in familial and sporadic Parkinson’s disease in Russia. Mov. Disord. 2006; 21: 2234-2236.
15. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Emelyanov A.K., et al. Screening for LRRK2 mutations in patients with Parkinson's disease in Russia: identification of a novel LRRK2 variant. Eur. J. Neurol.
2008; 15: 692-696.
26
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
Молекулярно-генетический анализ и факторы
риска болезни Паркинсона у лиц
узбекской национальности
Х.М. Халимова 1, Р.С. Мухамедов 2, М.М. Раимова 1, Р.Ж. Матмуродов 1,
Е.В. Жмырко 2, Ш.С. Пулатова 3
Ташкентская медицинская академия; 2 Институт Биохимии АН РУз;
Республиканская клиническая больница №1 Минздрава Республики Узбекистан (Ташкент)
1
3
В настоящее время актуальность изучения различных аспектов болезни Паркинсона (БП) не вызывает сомнения. Распространенность данной патологии увеличивается с каждым годом, и данная тенденция будет сохраняться
в связи с увеличением продолжительности жизни населения, особенно в развитых странах [2, 9]. В Республике Узбекистан в течение последних 10-15 лет также наблюдается учащение случаев регистрации новых случаев БП, как
среди городского, так и особенно среди сельского населения. Данную тенденцию можно частично объяснить улучшением качества диагностики заболевания. Однако имеются и другие причины повышения частоты случаев БП,
которые нуждаются в тщательном изучении.
Сегодня является общепризнанным значимый вклад генетических факторов в развитие БП [1-4, 11, 13]. Риск
развития болезни, как было показано в больших популяционных исследованиях, среди ближайших родственников
пациентов с болезнью Паркинсона достигает 4-10%, что существенно превышает общепопуляционный риск. Анализ многочисленных независимых результатов исследований БП позволяет сделать вывод, что БП является мультифакториальной патологией, в развитии которого определенную роль играют различные гены. При
аутосомно-доминантных формах БП были идентифицированы мутации в генах альфа-синуклеина (SNCA),
LRRK2, и убиквитин-С-концевой гидролазы L1 (UCH-L1) [4-6, 8, 15, 16, 18, 20]. При аутосомно-рецессивных
формах идентифицированы мутации в генах паркин (PARK2), PINK1 и белка DJ-1 [1, 3, 6-8, 17]. Кроме того, определен целый ряд генов предрасположенности к БП (гены систем клеточной детоксикации и антиоксидантной защиты, гены транспорта и метаболизма дофамина, митохондриальный геном и другие), носительство
неблагоприятных аллельных вариантов которых достоверно повышает риск заболевания [6, 7, 10, 14, 20, 22]. Для
понимания наследственных основ БП, как и других мультифакториальных заболеваний, необходимо установить,
какие именно «неблагоприятные» полиморфизмы генов и их сочетания приводят к высокой вероятности развития
патологии. Учитывая немаловажную роль системы детоксикации в обезвреживании вредных веществ, поступающих в организм человека в процессе бытовой и производственной деятельности, поиск генетических маркеров
индивидуальной чувствительности больных, подвергающихся воздействию вредных веществ, на основе анализа
полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при паркинсонизме, представляется актуальным [5, 7, 10, 14, 21, 23-25]. В ряду факторов, способствующих развитию БП, большое значение придается подверженности населения неблагоприятным эколого-средовым воздействиям. Наиболее вероятными кандидатами
на роль токсинов при БП являются некоторые пестициды, которые в условиях in vitro способны вызывать конформационные изменения молекулы α-синуклеина и ускорять формирование патологических включений в нейронах [5, 7]. Предполагается, что агрессивное агрохимическое производство и соответствующая экологическая
обстановка могут явиться серьезным фактором, способствующим общему росту заболеваемости БП, а также при
особенно неблагоприятном развитии событий – накоплению более ранних случаев болезни в определенных субпопуляциях [5].
В этой связи авторами данного сообщения были разработаны проекты исследований молекулярно-генетических, клинико-анамнестических и санитарно-гигиенических аспектов БП среди коренного населения Республики
Узбекистан. Данные проекты были поддержаны государственными грантами ФЕСС-005, ИДСС-31.16 согласно
программе «Охрана здоровья населения на основе совершенствования имеющихся и создания новых методов и
технологий в медицине». Эти исследования в нашей республике проводятся с 2007 года по настоящее время. В
данном сообщении приводятся первичные результаты исследований.
Цель исследования: анализ молекулярно-генетических, санитарно-гигиенических аспектов БП среди коренного
населения Республики Узбекистан.
Пациенты и методы исследования
Под нашим наблюдением находились 210 пациентов с БП. Нозологическая диагностика паркинсонизма проводилась с использованием клинических диагностических критериев банка мозга Общества болезни Паркинсона
Великобритании (Hughes et al., 1992). Оценку тяжести неврологического дефицита проводили при помощи уни-
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
27
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
фицированной рейтинговой шкалы проявлений паркинсонизма (UPDRS), стадию заболевания определяли по
шкале Хен и Яра в модификации Lindval и соавт. (1989).
Молекулярно-генетические исследования проведены на образцах ДНК 180 больных БП, из них 88 женщин и 92
мужчины, в возрасте от 29 до 82 лет, средний возраст 54,8±11,8 лет. В качестве контрольной группы обследованы 80
неврологически здоровых лиц сопоставимого возраста и пола. При отборе конкретных лиц учитывали их национальную принадлежность: были выбраны неродственные лица узбекской национальности. Молекулярно-генетические исследования проведены в Центре геномных технологий (ЦГТ) при Институте Генетики и
Экспериментальной Биологии Растений (ИГиЭБР) и в Институте Биохимии Академии Наук Республики Узбекистан (АН РУз). К настоящему времени нами проведен анализ на наличие ассоциаций с БП: мутации Ala53Thr в гене
PARK1, мутаций T240M и T240R гена PARK2, мажорной мутации G2019S в гене LRRK2; полиморфизмов генов
GSTM1 (нулевой аллель), GSTT1 (нулевой аллель) методом полимеразной цепной реакции с использование специфических олигонуклеотидных маркеров для отдельных участков геномной ДНК человека. Материалом для ДНК
служила венозная кровь из локтевой вены объемом 1 мл. Выделение ДНК из цельной крови осуществлялось набором реагентов Diatom™ DNA Prep 200 (ООО «Лаборатория ИзоГен», Москва) по стандартному протоколу. Супернатант с ДНК далее подвергался непосредственно генотипированию путем предварительного лигирования, а затем
ПЦР-амплификации. Типирование образцов ДНК по генам PARK1, PARK2 и LRRK2 производили с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров к участкам соответствующих генов. ПЦР-анализ проводили
с использованием набора реагентов для ПЦР амплификации ДНК GenePak™ PCR Core («Лаборатория ИзоГен»).
Далее проведен ПДРФ анализ с использованием рестриктаз:
1. Tsp45I («NEB», Англия) – для определения Ala53Thr мутации в гене PARK1;
2. HpyCH4IV («NEB», Англия) – для детекции T240M/T240R мутации в гене PARK2;
3. BstSFI («СибЭнзим», Россия) – для определения мутации G2019S в гене LRRK2.
Рестрицированные ПЦР-продукты амплификации фракционировали в 2–3% агарозном геле или 6% полиакриламидом геле в течение 60–90 мин при напряжении 100-120 В, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете.
Типирование образцов ДНК по генам GSTM1 и GSTT1 проводили с использованием двух пар специфических
олигонуклеотидных праймеров с участками генов GSTM1 (F: 5’-tgs-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc; R: 3’-gtt-ggg-ctc-aaatat-acg-gtg-g) и GSTT1 (F: 5’-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg; R: 3’-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg).
Гомозиготность по нулевым аллелям (0/0) GSTM1 и GSTT1 определяли по отсутствию на электрофореграммах
фрагментов размером 131 и 114 п.н., соответственно. Наличие этих фрагментов свидетельствовало о присутствии,
по крайней мере, одной нормальной (без делеции) копии генов (гомо- и гетерозиготы, +/+ и +/0). Нулевые аллели
генов GSTM1 и GSTT1 свидетельствовали в свою очередь о предрасположенности объекта к БП. Для определения
размера фрагментов ДНК использовался маркер с начальной отметкой 100 п.н.
Санитарно-гигиенические исследования проведены с помощью специально разработанной и утвержденной
анкеты-опроса (интервьюирования), состоящего из 64 пунктов, наиболее полно охватывающих все основные факторы как биологического, так и санитарно-гигиенического характера, а также клинико-анамнестические данные,
которые позволяют определить их роль в развитии БП.
Результаты и обсуждение
Клиническая характеристика обследованных больных показала преобладание пациентов со смешанной формой
заболевания – 45%; по тяжести заболевания превалировали больные во II стадии; возраст дебюта заболевания и
возраст пациентов на момент заболевания чаще соответствовал среднему (45-59 лет, по классификации ВОЗ) и их
удельный вес составил 40% и 43,3% соответственно. Средняя продолжительность заболевания составила 6,4±3,8
лет; темпы прогрессирования БП чаще соответствовали умеренным (55,5%). Средние баллы по шкале UPDRS (II
и III подшкалы – дневная активность и двигательная активность) составили в среднем 21,3±2,2 и 43,5±4,3 баллов
соответственно (таблица 1).
Анализ мутации в гене PARK1 (Ala53Thr)
Мутация Ala53Thr в гене PARK1 в исследуемой выборке больных не была выявлена ни у одного из 180 обследованных больных. По-видимому, данная мутация не ассоциирована с развитием БП у пациентов узбекской национальности. Эти результаты согласуются с данными других авторов и свидетельствуют о том, что для
Узбекистана, как и для большинства других популяций мира, первичные синуклеинопатии не типичны.
Скрининг мутации T240M/T240R гена PARK2
Нами был проведен ПДРФ-анализ мутации T240M/T240R в гене PARK2 у всех 180 пациентов БП и в контрольной группе. По результатам этих анализов гена PARK2 в исследуемой выборке наблюдается отсутствие данной мутации у всех пациентов как в группе с БП, так и в контрольной группе.
28
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
Таблица 1. Клиническая характеристика больных.
Клинический признак
Форма заболевания
Стадия заболевания
Темпы прогрессирования
Возраст больных
Возраст дебюта заболевания
n (%)
Акинетико-ригидная
54 (30)
Дрожательная
45 (25)
Смешанная
81 (45)
I
39 (21,7)
II
86 (47,8)
III
40 (22,2)
IV
15 (8,3)
Медленный
25 (13,9)
Умеренный
100 (55,5)
Быстрый
55 (30,6)
Молодой (18–29 лет)
7 (3,9)
Зрелый (30–44 лет)
42 (23,3)
Средний (45–59 лет)
78 (43,3)
Пожилой (60–74 лет)
49 (27,2)
Старческий (75–89 лет)
4 (2,2)
Молодой (18–29 лет)
12 (6,7)
Зрелый (30–44 лет)
50 (27,8)
Средний (45–59 лет)
72 (40)
Пожилой (60–74 лет)
46 (25,5)
Старческий (75–89 лет)
0
Продолжительность заболевания
6,4±3,86
Баллы по шкале UPDRS
Подраздел II
21,3±2,2
Подраздел III
43,5±4,3
Анализ мажорной мутации в гене LRRK2 (G2019S)
При обследовании 155 пациентов с БП были выявлены случаи гетерозиготного носительства мутации G2019S
в гене LRRK2. Всего из 155 больных БП было выявлено 32 случая (20,6%) (p=0,0045) гетерозиготного носительства
мутации G2019S в гене LRRK2. Двадцать четыре носителя G2019S мутации не имели семейного анамнеза, а восемь
были членами семей с четким аутосомно-доминантным наследованием БП. Таким образом, суммарная частота
данной мутации составила 20,6% в общей группе обследованных пациентов с БП, 18,6% среди больных со спорадической формой БП и 30,8% – среди аутосомно-доминантных случаев заболевания. Ни у кого из лиц контрольной
группы мутация G2019S в гене LRRK2 выявлена не была.
Мы провели анализ клинических данных и течения БП у носителей мутации G2019S в гене LRRK2 и сопоставили их с данными больных без данной мутации. Данные сопоставления показали достоверное преобладание в
группе больных с мутацией мужчин (p=0,04). Также достоверным было преобладание в данной группе по сравнению с группой без мутации смешанной формы заболевания (54,8% и 34,7% соответственно), тогда как во второй
группе отмечается преобладание больных со смешанной формой заболевания. Оценка эффективности леводопатерапии, которую получали в первой группе 23 пациента, а во второй группе 50 пациентов, показала более высокую
эффективности её в первой группе (69,5% против 40% во второй группе). Во второй группе в 24% случаев наблюдалось отсутствие эффекта от леводопатерапии, тогда как в группе с мутацией G2019S отсутствие эффекта отмечалось лишь в одном случае (4,34%). При этом в группе больных с обнаруженной мутацией в 6 случаях (26,1%)
наблюдалось развитие побочных эффектов от длительной леводопатерапии.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
29
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
Анализ на наличие ассоциаций БП с нулевыми аллелями генов системы
детоксикации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1
В группе больных БП частота встречаемости 0/0 полиморфизма для гена GSTТ1 составила 54,4% (98 больных),
а для гена GSTМ1 – 62,8% (113 больных); в группе здоровых лиц частота встречаемости 0/0 полиморфизма составила для гена GSTТ1 – 25% (20), для гена GSTМ1 – 42,5% (34).
Анализ распределения комбинированных генотипов GSTT1/GSTM1 показал статистически значимые различия
между группами БП и контроля ввиду преобладания комбинаций генотипов GSTT1(+/+)/GSTM1(+/+) в группе
контроля и комбинаций генотипов GSTT1(0/0)/GSTM1/(0/0) в группе БП.
Таблица 2. Частоты генотипов GSTT1 и GSTM1 в группе БП и в контроле.
Показатель
Контроль (n=80)
Болезнь Паркинсона (n=180)
χ2
р
ОR
18,2
0,0005
2,18
(1,46–3,40)
8,46
0,005
1,48
(1,12–2,01)
28,9
10,09
0,002
3,6 (1,56–8,84)
46
25,6
3,16
0,07
2,04 (0,94–
4,56)
32,5
61
33,8
1,14
0,28
1,4 (0,77–2,65)
42,5
21
11,7
3,66
0,05
0,49 (0,24–1,01)
Частоты генотипов
n
%
n
%
GSTT1 (0/0)
20
25
98
54,4
GSTT1 (+)
60
75
82
45,6
GSTM1 (0/0)
34
42,5
113
62,8
GSTM1 (+)
46
57,5
67
37,2
GSTT1(0/0)/G
STM1(0/0)
8
10
52
GSTT1(0/0)/G
STM1(+/+)
12
15
GSTT1(+/+)/G
STM1(0/0)
26
GSTT1(+/+)/G
STM1(+/+)
34
Гено-фенотипические сопоставления по генам GSTT1 и GSTM1 показали достоверно более ранний дебют заболевания (р<0,001), преобладание развернутой смешанной формы (р<0,006) в группе больных с «нулевыми» генотипами генов GSTT1 и GSTM1 по сравнению с больными без мутаций в этих генах. По течению заболевания
медленный темп прогрессирования симптомов превалировал в группе больных без мутаций в генах GSTT1 и GSTM1
(р<0,02), тогда как быстрый темп прогрессирования заболевания преобладал в группе с мутациями в генах GSTT1
и GSTM1 (32,8% против 14,3%), хотя эти различия и не достигали уровня статистической значимости (табл. 3).
Анализ данных санитарно-гигиенических исследований
По данным ВОЗ, здоровье каждого человека на 25-30% зависит от состояния окружающей природной среды.
БП является мультифакториальным заболеванием, в патогенезе которого важную роль играет взаимодействие внутренних (генетических) и внешних факторов, в связи с чем одним из приоритетных направлений в настоящее время
является изучение молекулярной природы БП в ассоциации с анализом воздействия эколого-средовых факторов.
В 60-е годы прошлого века на территории Узбекской республики шло расширение сельскохозяйственного производства и его интенсификация. Интенсификация сельского хозяйства требовала и повышения использования
пестицидов на протяжении всего вегетационного периода. Использование пестицидов в Узбекистане на 1 га пашни
превышало среднюю по СССР величину в 15 раз, а на душу населения в 3,5 раза (1977 год). По этим показателям
республика занимала одно из первых мест в СССР.
Токсическое действие ксенобиотиков удалось проследить на сельских жителях, постоянно контактирующих с
пестицидами. В районах интенсивной химизации сельский житель болеет в 2 раза чаще и умирает на 7-10 лет
раньше, чем городской. Сельскохозяйственные рабочие и жители сел получали отравления при опылении посевов,
стирке рабочей одежды, при использовании пестицидов в домашнем хозяйстве или тары из–под пестицидов для
30
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
Таблица 3. Данные клинико-генотипического анализа по генам GSTT1 и GSTM1.
Клинический признак
I группа
(n=159)
II группа
(n=21)
Р
Средний возраст дебюта (годы)
48,2±10,3 (от 22 до 76)
55,1±12,1 (от 24 до 74)
0,001
•
•
•
Форма заболевания:
дрожательная
акинетико-ригидная
смешанная
37 (23,3%)
44 (27,7%)
78 (49,0%)
8 (38,1%)
10 (47,6%)
3 (14,3%)
0,2
0,1
0,006
•
•
•
•
Стадия заболевания:
I
II
III
IV
30 (18,9%)
77 (48,4%)
37 (23,3%)
15 (9,4%)
9 (42,8%)
9 (48,9%)
3 (14,3%)
0 (0%)
0,02
0,8
0,5
0,3
•
•
•
Темпы прогрессирования:
медленный
умеренный
быстрый
18(11,3%)
89(55,9%)
52(32,8%)
7(33,3%)
11(52,4%)
3(14,3%)
0,02
0,9
0,1
•
•
Баллы по шкале UPDRS:
подраздел II
подраздел III
22,7±3,2
48,5±5,3
19,5±2,1
39,6±4,7
0,1
0,05
хранения пищи и воды, употреблении загрязненной воды для питья. В 70-е — начале 80-х годов широко применялось опрыскивание хлопковых полей пестицидами с воздуха. Уровень загрязнения почвы, сельскохозяйственных
аэродромов превышал норму более чем в 100 раз, усиленно использовались ДДТ и другие пестициды (данные Государственного комитета по охране природы Республики Узбекистан, 2002 год). Но и через 10-15 лет после официального запрета ДДТ его содержание в почве зон интенсивного хлопководства превышало ПДК (в Ферганской
области более чем в 8 раз). Так как воздействие пестицидов на здоровье не проявляется мгновенно, то люди часто
не воспринимают эту угрозу всерьез. Важно отметить, что зачастую трудно или даже невозможно установить причинно-следственную связь, так как, по мнению многих специалистов, в большинстве случаев надо говорить прежде
всего о хроническом отравлении пестицидами, результат воздействия которого может проявиться по истечении
длительного (измеряемого десятилетиями) времени. И хотя за последние десятилетия политика применения пестицидов в нашей стране, как и во всем мире, изменилась (сократились объемы их применения и нормы расхода
на гектар, на смену старым препаратам в республику стали ввозить новые, эффективные при малых дозах применения, обладающие хорошей избирательной способностью, малостойкие в окружающей среде), все же воздействие
пестицидов даже 25–30-летней давности даёт о себе знать и в наше время повышенной частотой хронических заболеваний органов дыхания, желудочно-кишечного тракта, аллергических и кожных заболеваний среди населения,
имевшего контакт с ними. Общеизвестно, что развитие доклинической стадии БП – длительный процесс, протекающий в ряде случаев в течение нескольких десятилетий, и не исключено, что увеличение частоты случаев БП
связано с воздействием внешних факторов как в настоящем, так и в отдаленном прошлом.
Мы в нашем исследовании поставили цель оценить роль экологических и профессиональных факторов в развитии БП на основании анализа анкетирования. Результаты анкетирования пациентов с БП среди коренного населения Узбекистана показали, что наиболее значимыми факторами риска развития паркинсонизма являлись
работа с пестицидами (р=0,001), питье воды из открытых водоемов (р=0,002) и работа в химической промышленности (р=0,002).
Воздействие вредных факторов являлось не только фактором риска развития заболевания, но и модифицировало клиническую картину заболевания, так, средний возраст пациентов – сельских жителей составил 53,08±9,14,
пациентов – городских жителей – 58,5±10,7, также наблюдалась тенденция к более раннему дебюту заболевания
у сельского населения по сравнению с городскими жителями (48,8±9,9 и 53,6±9,9, соответственно). При рассмотрении частоты БП в зависимости от половой принадлежности выявлено, что среди сельских жителей отмечается
преобладание мужчин – 59,7%, тогда как среди городских жителей отмечается преобладание женщин – 60,5%.
Данные тенденции, возможно, объясняются большей занятостью в сельском хозяйстве мужчин, а, следовательно
и большей подверженностью влиянию вредных воздействий пестицидов, инсектицидов по сравнению с женским
населением в сельской местности.
Мы провели анализ зависимости тяжести заболевания от места проживания больных. Выявлено, что среди городских жителей преобладают больные в более легких стадиях заболевания – I и II (32,6% и 54,6% соответственно),
тогда как среди сельских жителей наблюдается количественное преобладание больных во II и III стадиях заболе-
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
31
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
вания (39,5% и 33,1% соответственно), что может быть связано как с более поздней обращаемостью пациентов за
медицинской помощью, так и с более тяжелым течением заболевания у сельских жителей. В связи с этим мы вычислили среднюю продолжительность заболевания отдельно у сельских и городских жителей. Данные вычисления
показали, что она практически одинакова в обеих группах больных (6,35±3,0 и 6,4±4,4 лет, соответственно) и указывает на возможно более быстрые темпы прогрессирования заболевания у сельских жителей.
Далее мы проанализировали средний возраст дебюта БП в зависимости от профессии. Данный анализ показал,
что отмечается тенденция к более раннему дебюту заболевания у работников химической промышленности
(47,8±8,4 лет) и сельскохозяйственных работников (50,2±7,8 лет). Более ранний дебют заболевания у работников
химической промышленности и сельскохозяйственных работников ещё раз подтверждает большое значение в развитии заболевания влияния неблагоприятных эколого-средовых факторов.
Анализ встречаемости различных клинических форм БП у сельских и городских жителей, показал, что развернутая смешанная форма БП наблюдается в 53,2% случаев у больных сельских жителей, тогда как у пациентов городских жителей чаще встречается акинетико-ригидная форма (44,2%).
При анализе взаимодействий генотипа и факторов окружающей среды выявлено наличие более ранней манифестации симптомов заболевания в группе больных с сочетанием нулевых генотипов по генам GSTT1 и GSTM1 и
воздействием гербицидов и фосфороорганических соединений по сравнению с пациентами без данных мутаций
Таким образом, проведенный нами молекулярно-генетический анализ БП позволил идентифицировать молекулярную основу болезни у лиц узбекской национальности, определить гено-фенотипические ассоциации у носителей отдельных мутаций и их сочетаний. Полученные данные ещё раз подтверждают влияние различных средовых
факторов на развитие и течение БП, и показывают необходимость дальнейших исследований в направлении изучения влияния факторов окружающей среды на развитие БП, а также необходимость комплексного изучения взаимодействия внешних (эколого-средовых) и внутренних (генетических) факторов при данной патологии.
Литература
1.
Багыева Г.Х. Клинико-генетический и биохимический анализ болезни Паркинсона: механизмы предрасположенности, экспериментальные модели, подходы к терапии.
Автореф. дис. … докт. мед.наук. М., 2009.
2.
Бойко А.Н., Петров С.В. Регистр больных болезнью Паркинсона. В кн.: Болезни движений: медицинские и социальные аспекты. М., 2010: 297-302.
3.
Загоровская Т.Б., Иллариошкин С.Н., Сломинский П.А. и др. Клинико-генетический анализ ювенильного паркинсонизма в России. Журн. неврол. и психиатрии 2004; 8: 66-72.
4.
Иванова-Смоленская И.А., Багыева Г.Х., Иллариошкин С.Н. и др. Мутация G2019S в гене LRRK2 при семейной форме болезни Паркинсона. Мед. генетика 2006; 12: 19 21.
5.
Иллариошкин С.Н. Паркинсонизм с ранним началом. Атмосфера. Нервные болезни 2006; 3: 14-20.
6.
Иллариошкин С.Н. Молекулярные основы болезни Паркинсона. В кн.: Болезнь Паркинсона и расстройства движений. Рук. для врачей по мат–лам I Национального конгресса. М., 2008: 8-17.
7.
Иллариошкин С.Н., Джурич Г.М., Багыева Г.Х. и др. Генетическая предрасположенность к болезни Паркинсона. Мед. генетика 2005; 5 (мат-лы V съезда Российского общества
медицинских генетиков, часть II): 196.
8.
Иллариошкин С.Н., Загоровская Т.Б., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д./ Генетические аспекты болезни Паркинсона. Неврол. журн. 2002; 5: 47-51.
9.
Литвиненко И.В. Болезнь Паркинсона. М.: Миклош, 2006.
10. Якимовский А.В., Пушнова Е.А., Ахмедова С.Н., Автономов В.В. Молекулярно-генетические и токсико-экологические основы этиологии и патогенеза болезни Паркинсона
(паркинсонизма). Журн. неврол. и психиатрии им. С.С.Корсакова 1997; 4: 69-73.
11. Benamer H.T., de Silva R. LRRK2 G2019S in the North African population: a review. Eu.r Neurol. 2010; 63: 321-325.
12. Broussolle E., Thobois S. Genetics and environmental factors of Parkinson disease. Rev. Neurol. (Paris) 2002; 158 (Spec. №1): S11-S23.
13. Chan Daniel K.Y., Mellick G., Hua Cai et al. The a-synuclein gene and Parkinson disease in a Chinese population. Arch. Neurol. 2000; 57: 501-503.
14. Defebvre L. Parkinson's disease: role of genetic and environment factors. Involvement in everyday clinical practice. Rev. Neurol. (Paris) 2010; 166: 764-769.
15. Deng H., Le W.D., Guo Y.I. et al. Genetic and clinical identification of Parkinson’s disease patients with LRRK2 G2019S mutation. Ann. Neurol. 2005; 57: 933-934.
16. Floris G., Cannas A., Solla P. et al.Genetic analysis for five LRRK2 mutations in a Sardinian parkinsonian population: importance of G2019S and R1441C mutations in sporadic Parkinson's
disease patients. Parkinsonism Relat. Disord. 2009; 15: 277-280.
17. Foroud T., Uniacke S.K., Liu L. et al. Heterozygosity for a mutation in the parkin gene leads to later onset Parkinson disease. Neurology 2003; 60: 796-801.
18. French Parkinson’s Disease Genetics Study Group. Alpha-synuclein gene and Parkinson’s disease. Science 1998; 279: 1116-1117.
19. Haugarvoll K., Wszolek Z.K. Clinical features of LRRK2 parkinsonism. Parkinsonism Relat. Disord. 2009; 15 (Suppl. 3): S205-S208.
20. Klein C., Schlossmacher M.G. Parkinson disease, 10 years after its genetic revolution: Multiple clues to a complex disorder. Neurology 2007; 69: 2093-2104.
21. Kiyohara C., Miyake Y., Koyanagi M. et al. GST polymorphisms, interaction with smoking and pesticide use, and risk for Parkinson's disease in a Japanese population. Parkinsonism Relat.
Disord. 2010; 16: 447-452.
22. Kumari U., Tan E.K. LRRK2 in Parkinson's disease: genetic and clinical studies from patients. FEBS J. 2009; 276: 6455-6463.
23. Peng J., Oo M.L., Andersen J.K. Synergistic effects of environmental risk factors and gene mutations in Parkinson's disease accelerate age-related neurodegeneration. J. Neurochem. 2010;
115: 1363-1373.
24. Sanyal J., Chakraborty D.P., Sarkar B. et al. Environmental and familial risk factors of Parkinsons disease: case-control study. Can. J. Neurol. Sci. 2010; 37: 637-642.
25. Vance J.M., Ali S., Bradley W.G. et al. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology 2010; 31: 598-602.
32
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
Механизм клеточной гибели при
LRRK2-ассоциированной болезни Паркинсона
С.Н. Пчелина 1, 2, Т.С. Усенко 1, 2, Н.А. Боганькова 3, А.Ф. Якимовский 2, А.К.Емельянов 1, 2,
А.С. Дроздова 1, Т.В. Вавилова 3, А.Л. Шварцман 1
Петербургский Институт Ядерной Физики им. Б. П. Константинова РАН;
Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П.Павлова;
3
Санкт-Петербургская Государственная медицинская академия им. И.И.Мечникова
(Санкт-Петербург)
1
2
Болезнь Паркинсона (БП) – распространенное прогрессирующее нейродегенеративное заболевание. В большинстве развитых стран в возрасте старше 65 лет БП страдает до 2% населения. При этом в настоящее время в 20%
случаев начало заболевания приходится на трудоспособный возраст – до 50 лет. Заболевание может носить как
спорадический, так и семейный характер. Независимо от этиологии БП, симптомы заболевания коррелируют с
гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции мозга [5].
В настоящее время в качестве основного звена патогенеза БП рассматривается формирование нейротоксических агрегатов небольшого пресинаптического белка альфа-синуклеина [1, 13]. Однако механизмы нейродегенерации остаются недостаточно изученными. В силу этого сегодня не существует лекарственных средств, способных
предотвратить или замедлить процесс нейродегенерации.
Достижения молекулярной генетики последних лет позволили по-новому взглянуть на проблемы этиопатогенеза,
нозологической принадлежности и диагностики БП. Хотя в большинстве случаев БП носит мультифакторный характер, по разным данным, около 10–15% больных БП имеют семейную форму БП, когда заболевание имело место
у нескольких родственников из одного или разных поколений. В настоящее время идентифицировано шесть генов,
мутации в которых приводят к развитию наследственных форм БП [20]. Мутации в гене обогащенной лейциновыми
повторами киназы 2 (LRRK2) были выявлены в семьях с аутосомно-доминантной формой БП [25]. Они обнаруживаются также при спорадической форме заболевания и являются наиболее частой генетической причиной развития
БП известной сегодня. Изучение наследственных форм заболевания с известной молекулярной этиологией является
одним из наиболее перспективных подходов к выяснению молекулярных механизмов нейродегенерации при БП.
Наши исследования посвящены изучению механизмов клеточной гибели при LRRK2-ассоциированной БП.
Распространенность LRRK2-ассоциированной БП в России
Открытие мутаций в гене LRRK2, достаточная распространенность LRRK2-ассоциированных форм БП, наличие мажорных мутаций в гене LRRK2 у пациентов с БП и простота их скрининга впервые дают возможность
исследования репрезентативных групп пациентов с однородной этиологией заболевания. Сегрегация мутаций в
гене LRRK2 c БП впервые была выявлена в 2004 году [25]. Ген LRRK2 содержит 41 экзон и кодирует большой белок
(2 527 ак), содержащий ряд функциональных доменов, в том числе киназный и ГТФ-азный домены (рис. 1). Шесть
мутаций LRRK2 в настоящее время признаны определенно патогенными: G2019S, R1441C, R1441G, R1441H,
Рисунок 1. Локализация мутаций в различных функциональных районах LRRK2.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
33
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
Y1699C и I2020T, из которых наиболее распространенной является мутация G2019S (85% от всех LRRK2-ассоциированных случаев БП). На втором месте по частоте выявления – мутация R1441C (около 10%) [15]. В зависимости
от популяции частота G2019S-ассоциированной БП (G2019S-БП) составляет 2-40% [20].
ANK (putative ankyrin-like) – домен, подобный анкирину; LRR – повторы, обогащенные лейцином; ROC (Ras
Of Complex proteins) – ГТФазный домен; COR (С-концевой домен ROC); kinase – киназный домен). Домены ANK,
LRR и WD40 отвечают предположительно за связь с белками и мембранами. Домены ROC, COR и kinase – за каталитические функции фермента. Жирно выделены мутации, патогенетическая значимость которых подтверждена
во многих исследованиях. Курсивом – мутации, выявленные у пациентов, вошедших в настоящее исследование.
Симптомы БП на момент начала
заболевания
Эффективность терапии
Л-ДОФА
Побочные эффекты
терапии Л-ДОФА
м
75
67
Б
-
+
+
+
не принимал
-
2
G2019S
PD1
(III-1)
м
53
35
Б,Р
+
+
+
+
хорошая
психические
изменения
3
G2019S
PD2
(II-1)
м
70
50
Т
+
+
+
+
хорошая
нет
4
G2019S
PD3
(III-1)
ж
54
39
Б
+
+
+
+
хорошая
гиперкинез
5
G2019S
PD4
(III-4)
м
78
59
Т
+
+
+
+
хорошая
нет
6
G2019S
PD5
(II-2)
ж
78
68
Т
+
-
-
+
не принимал
-
7
G2019S
PD6
(II-2)
м
72
65
Т
+
+
+
+
хорошая
галлюцинации
8
G2019S
PD7
(II-1)
ж
76
74
Т
+
+
+
+
не принимала
-
9
G2019S
PD7
(II-2)
ж
74
69
Т
+
+
+
+
хорошая
нет
10
V1613A
PD8
(II-3)
м
79
60
Т
+
-
-
+
плохая
нет
11
V1613A
PD8
(II-1)
ж
79
70
Т
+
-
-
+
не принимал
-
12
G2019S
сБП
ж
60
47
Р
+
+
+
+
хорошая
дискинезии
13
R1441C
сБП
м
75
61
Т
+
+
-
+
не принимал
-
Возраст
PD1
(II-1)
Пол
G2019S
Семья
1
Мутации
Т
Пациент
Возраст начала заболевания
Симптомы заболевания на
момент осмотра
Таблица 1. Клинические характеристики пациентов с LRRK2-ассоциированной БП.
Р
Б
П.Н.
Обозначения: Т – тремор, Р – ригидность, Б – брадикинезия, П.Н. – постуральная нестабильность,
сБП – спорадическая форма БП.
34
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
Нами проведено прямое секвенирование кодирующей области гена LRRK2 у 85 пробандов с семейной формой
БП, что позволило впервые определить спектр мутаций в гене LRRK2 среди семейных форм БП в России [27]. На
расширенной выборке пациентов (100 пробандов с семейной формой БП, 14 родственников пробандов и 230 пациентов со спорадической БП) нами дополнительно проведен скрининг наиболее распространенных мутаций
LRRK2 (G2019S, R1441C). В ходе исследования нами выявлены как ранее идентифицированные мутации (G2019S,
R1441C), так и новая мутация V1613A, приводящая к развитию БП с преобладающим тремором [2, 27, 28]. Всего
нами выявлено 13 пациентов с LRRK2-ассоциированной БП (таблица 1). Суммарно, частота LRRK2-ассоциированной формы БП среди семейных форм БП составила 8%. Наиболее распространенной являлась мутация G2019S
(7% среди семейной БП и 0,5% среди спорадической БП). Аналогичные данные по распространенности мутаций
LRRK2 среди пациентов с БП получены в Европе и в Москве [6, 15]. Находившаяся под нашим наблюдением в
период с 2006 по 2011 год группа пациентов с мутациями в гене LRRK2 вошла в дальнейшее исследование по выявлению особенностей патогенеза LRRK2-ассоциированной БП. В качестве объекта исследования были использованы лимфоциты периферической крови пациентов. В силу сходства процессов, связанных с обменом дофамина
в нейронах и лимфоцитах, выявляемые в лимфоцитах пациентов с БП молекулярные нарушения могут отражать
особенности патогенеза заболевания [11, 12].
LRRK2 и альфа-синуклеин
В настоящее время считается, что в основе молекулярных механизмов БП лежит нарушение фолдинга и полимеризация альфа-синуклеина (SNCA) [1, 13, 33]. Альфа-синуклеин является основным компонентом телец Леви,
как при наследственных, так и при спорадических формах БП (сБП) [29, 35]. Точечные мутации в гене SNCA, а
также дупликация и трипликация гена SNCA приводят к развитию БП с ранним началом заболевания [22, 31].
Нейротоксичность агрегатов альфа-синуклеина была многократно продемонстрирована in vitro, а также на трансгенных животных (мыши и дрозофила) [15]. Известно, что альфа-синуклеин, обнаруживаемый в тельцах Леви,
фосфорилирован по серину 129 и серину 87 [14, 26]. Нейротоксичность фосфорилированных форм альфа-синуклеина продемонстрирована in vitro [24]. Предполагается, что фосфорилирование альфа-синуклеина может влиять
на формирование его агрегатов.
LRRK2 является мультидоменной протеинкиназой. Локализация мутаций, приводящих к развитию БП, в функциональных районах LRRK2 предполагает нарушение функциональной активности данного фермента. Мутация
G2019S, локализованная в киназном домене LRRK2, повышает киназную активность LRRK2. До настоящего момента физиологические субстраты LRRK2 не известны, и функции LRRK2 остаются мало изученными [16]. Неизвестным остается наличие функциональной связи между аномальной функцией LRRK2 и агрегацией
Рисунок 2. Относительный уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови
в обследованных группах пациентов с БП и в контроле.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
35
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
альфа-синуклеина. Всего одно исследование показало фосфорилирование рекомбинантного альфа-синуклеина
лизатом клеток с гиперэкспрессией LRRK2 [32], в то время как нет данных о прямом участии LRRK2 в фосфориллировании альфа-синуклеина в клетках или на модельных животных. Неизвестно также, оказывают ли влияние
мутации LRRK2 опосредованное влияние на метаболизм альфа-синуклеина.
Нами впервые оценен уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП (носители мутаций G2019S и V1613A) [3]. Исследование уровня альфа-синуклеина проводили методом
вестерн-блоттинга. Уровень мРНК гена SNCA оценивали при помощи количественной ПЦР в режиме реального времени. У всех пациентов с БП, включенных в исследование, была исключена мультипликация гена SNCA. Нами показано снижение альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП (в
том числе и в группе носителей мутации G2019S) по сравнению с пациентами со сБП и контролем (рис.2).
Carballo-Carbajal и соавторы показали in vitro способность белка LRRK2 регулировать транскрипцию гена SNCA
[10]. Выявленное нами снижение уровня альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2 нельзя объяснить влиянием LRRK2 на транскрипцию гена SNCA, поскольку мы не наблюдали снижения уровня мРНК гена
SNCA у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП. Полученные результаты скорее позволяют предположить изменения на посттрансляционном уровне. В нашем исследовании мы использовали антитела к альфа-синуклеину
человека (BD Transduction Labs, США), иммуногенные к 15-123 аминокислотам, позволяя выявлять формы альфасинуклеина, содержащие все известные на сегодняшний день сайты фосфорилирования (y125, s129, y133, s136),
кроме белка, фосфорилированного по серину в позиции 87 (s87). Нельзя исключить накопление фосфорилированной формы s87 или агрегатов альфа-синуклеина. С другой стороны, влияние LRRK2 на уровень альфа-синуклеина
может быть опосредованным. В частности, показана активация аутофагии при изменении активности LRRK2 (при
наличии мутации G2019S) [30], что может приводить к усилению деградации альфа-синуклеина в клетках [39].
Ранее в ряде исследований было высказано предположение о возможности использования оценки уровня периферического альфа-синуклеина (альфа-синуклеина плазмы, цереброспинальной жидкости, клеток крови) в качестве прогностического маркера развития БП [21]. Наблюдаемые нами значения уровня альфа-синуклеина в
группе пациентов со спорадической формой БП неизвестной этиологии были крайне вариабельны и не отличались
от контрольной группы, как и в некоторых исследованиях зарубежных авторов. Полученные результаты предполагают, что измерение альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови не может быть использовано в качестве прогностического маркера БП, так как зависит от этиологии заболевания.
LRRK2 и апоптоз
Нарушение регуляции апоптоза дофаминергических нейронов черной субстанции рассматривается как один
из возможных механизмов их гибели при БП. Признаки апоптоза обнаруживаются как при анализе аутоптатов у
пациентов с БП, так и в экспериментах, выполненных на модельных животных [36, 40]. Следует, однако, отметить,
что не все посмертные исследования мозга пациентов с БП выявляют морфологические признаки апоптоза [23].
Таким образом, вопрос о механизме гибели нейронов черной субстанции при БП остается открытым.
Изменение маркеров апоптоза неоднократно выявлялось в лимфоцитах периферической крови у пациентов с
БП [8, 19]. Повышенный апоптоз лимфоцитов был показан также у пациентов с мутациями в гене SNCA [7]. Нами
Рисунок 3. Уровень мРНК гена FAS лимфоцитов периферической крови в исследуемых группах.
(а) исследования 2007 года; (б) исследования 2010 года. Указаны относительные значения уровня мРНК гена
FAS, нормированные на референсный ген GNB2L1 (guanine nucleotide binding protein (G protein) ± SE.
36
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
впервые проведена оценка апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов с мутациями в гене LRRK2.
Исследование уровня мРНК генов FAS и BCL2 проводилось методом количественной ПЦР в режиме реального
времени. Оценку спонтанного апоптоза проводили на проточном цитометре с двойным окрашиванием клеток
(Annexin V-FITC+PI) после инкубации лимфоцитов (5% СО2, 37 С) в течение 1, 24 и 48 часов[4].
Длительное наблюдение пациентов с LRRK2-ассоциированной БП в СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова позволило
осуществить повторный забор периферической крови и оценить уровень мРНК гена FAS у носителей мутаций LRRK2
c интервалом в три года. Исследования, проведенные в 2007 году, выявили повышение уровня мРНК гена FAS лимфоцитов периферической крови у пациентов с мутациями LRRK2 (5 пациентов с мутацией G2019S, 1 – с мутацией
V1613A) по сравнению как с группой пациентов со спорадической формой БП с отсутствием мутаций в гене LRRK2
(сБП), так и с контрольной группой (рис. 3а). При этом изменений в уровне мРНК гена BCL2 между исследуемыми
группами не наблюдалось. Повторный забор периферической венозной крови у тех же пациентов через три года и повторное измерение уровня мРНК гена FAS в указанной группе также выявило достоверное увеличение уровня мРНК
гена FAS у пациентов с LRRK2- ассоциированной БП по сравнению с контролем (рис.3б). Таким образом, нами выявлено стабильное увеличение экспрессии гена FAS у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП.
Исследования изменения уровня мРНК гена FAS при культивировании лимфоцитов периферической крови в
стандартных условиях (5% СО2, 37 С) в течение 48 часов показали возрастание экспрессии гена FAS после 24 часов
инкубации как в группе пациентов с мутациями в гене LRRK2, так и в контроле (рис.4). При этом достоверное
повышение уровня мРНК гена FAS в группе пациентов с LRRK2-ассоциированной БП наблюдались как через 1
час, так и через 24 часа инкубации.
Для оценки количества лимфоцитов, находящихся на ранних и поздних стадиях апоптоза, использовали проточную цитофлуорометрию с двойным флуоресцентным окрашивании клеток конъюгированным с флуорохромом
– флуоресцеин изотиоционатом аннексином V (Annexin V-FITC) и пропидиум йодидом (PI) (FITC ANNEXIN V
Рисунок 4. Уровень мРНК гена FAS лимфоцитов периферической крови пациентов
с мутациями в гене LRRK2 и в контроле при инкубации лимфоцитов.
Указаны относительные значения уровня мРНК гена FAS, нормированные на референсный ген GNB2L1(guanine nucleotide binding protein (G protein) ± SE.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
37
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
APOPTOSIS DETECTION KITI, BD Pharmingen, USA). Данный метод основан на способности белка аннексина
V связывать фосфатидилсерины, транслоцируемые на мембрану клеток на ранних стадиях апоптоза [38]. Использование параллельного окрашивания PI позволяет выявлять некротические клетки, а также клетки, находящиеся
на поздних стадиях апоптоза. Нами проведена оценка уровня спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической
крови после 1, 24 и 48 часов инкубации в трех группах: пациенты с мутациями LRRK2 (3 пациента с мутацией
G2019S, 1 – с мутацией V1613A), пациенты со спорадической формой БП, с отсутствием мутацией в гене LRRK2
(сБП) и в контроле. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2. Уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов в исследуемых группах.
Группа
Уровень апоптоза (%), Р**
1ч
24 ч
48 ч
БП-LRRK2*
n=4
6,18±4,48
9,875±3,31
p=0,02
10,25±3,09
p=0,03
сБП
n=9
4,40±2,44
8,87±3,18
p=0,01
8,39±2,87
Контроль
n=9
3,33±2,00
4,76±2,40
6,42±3,34
*Пациенты с мутациями LRRK2 (3 – c мутацией G2019S, 1 – с мутацией V1613A). **Указан процент клеток, находящихся на ранних и
поздних стадиях апоптоза от общего количества клеток (±SD). р – достоверность отличий при сравнении с контролем.
После 24 часов инкубации лимфоцитов по сравнению с контролем нами выявлено достоверное повышение
уровня спонтанного апоптоза как в группе пациентов с LRRK2-ассоциированной БП, так и в группе пациентов
со спорадической формой БП. В качестве пример, на рисунке 5 представлены цитограммы, полученные при исследовании апоптоза лимфоцитов пациента с мутацией G2019S и индивидуума контрольной группы. Повышение
уровня спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови при спорадической БП отмечалось ранее [9].
Необходимо отметить, что в отличие от группы пациентов со спорадической БП неизвестной этиологии, в группе
пациентов с мутациями в гене LRRK2 достоверные различия в уровне спонтанного апоптоза лимфоцитов по
сравнению с контролем сохранялись и после 48 часов инкубации. Учитывая наблюдаемый нами повышенный уровень экспрессии гена FAS (при отсутствии изменений в экспрессии гена BCL2) и повышенный спонтанный апоптоз лимфоцитов у пациентов с LRRK2-ассоциированной формой БП можно предположить, что мутации в гене
LRRK2 приводят к предпочтительной активации внешнего пути апоптоза.
Рисунок 5. Пример цитограмм спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациента
с мутацией G2019S (а) и у нормального индивида (б).
Левый нижний квадрат – клетки, находящиеся на ранних стадиях апоптоза (Annexin-V+ /PI-). Левый верхний
квадрат – поздний апоптоз (Annexin-V+ /PI+).
38
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
Секция 1. Болезнь Паркинсона
Механизм влияния мутантной формы LRRK2 на жизнедеятельность и гибель клеток остается малоизученным.
В экспериментах in vitro было показано, что экспрессия мутантной LRRK2 (мутация G2019S) вызывает индукцию
апоптоза и гибель клеток [34]. Позднее было продемонстрировано взаимодействие белкового продукта LRRK2 с
белком FADD (Fas-associated death domain) [17]. Известно, что FAS-FADD комплекс взаимодействует с каспазой
8, активируя тем самым каскад внутриклеточных протеаз (каспаз) и приводя к апоптотической гибели клетки [37].
Вопрос о предпочтительной активации внешнего пути апоптоза при аномальной работе LRRK2 остается открытым, поскольку, в частности, исследование Iaccarino и др. продемонстрировало влияние экспрессии мутантной
формы LRRK2 на процесс высвобождения цитохрома С и активацию внутреннего пути апоптоза [18]. Все цитируемые данные получены в экспериментах in vitro. Нами впервые показана активация спонтанного апоптоза и повышение уровня мРНК гена FAS в лимфоцитах пациентов, имеющих мутации в гене LRRK2. Полученные нами
результаты согласуются с гипотезой об активации внешнего пути апоптоза при наличии мутантных форм LRRK2.
Заключение
Сегодня мутации в гене LRRK2 остаются наиболее распространенной причиной развития наследственных
форм БП. Нами показано, что в популяции северо-западного региона России наиболее распространенной среди
семейных форм БП мутацией является мутация G2019S. При этом частота мутации G2019S выше среди пациентов
с семейной формой БП (7%), чем среди пациентов со спорадической формой заболевания (0,4%). Учитывая широкое распространение мутации G2019S среди семейных форм БП в России, следует рекомендовать скрининг этой
мутации среди пациентов с БП, сообщающих о положительном семейном анамнезе заболевания. Генетическое тестирование на наличие мутации G2019S LRRK2 может быть в первую очередь полезно в ряде случаев в качестве
дополнительного диагностического теста. Следует, однако, отметить, что в отсутствие нейропротекторной терапии
досимптоматическое тестирование мутации остается дискутабельным. С другой стороны, выделение групп риска
развития БП дает неврологам шанс подбора терапии, способной отодвинуть клиническое проявления болезни.
Кроме того, относительная распространенность LRRK2-ассоциированных форм БП среди семейных случаев заболевания впервые дает возможность исследования репрезентативных групп пациентов с однородной этиологией
заболевания, что, несомненно, подчеркивает научную важность проведения ДНК-диагностики пациентам с семейной формой БП.
Нами впервые проведено исследование уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови и оценен
спонтанный апоптоз лимфоцитов у пациентов с мутациями в гене LRRK2. Выявленное снижение уровня альфасинуклеина лимфоцитов и усиление спонтанного апоптоза наряду с повышением уровня экспрессии гена FAS в
лимфоцитах периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП может отражать нарушение обменных механизмов при данной форме заболевания.
Литература
1.
Иллариошкин С.Н. Конформационные болезни мозга. М.: Янус-К, 2002.
2.
Пчелина С.Н., Иванова О.Н., Емельянов А.К. и др. Мутации в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России. Мед. генетика 2006; 2: 48-51.
3.
Пчелина С.Н., Емельянов А.К., Якимовский А.Ф. и др. Сниженный уровень альфа-синуклеина в лейкоцитах периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной
болезнью Паркинсона. Бюл. экспер. биол. мед. 2010; 12: 619-621.
4.
Пчелина С.Н., Усенко Т.С., Боганькова Н.А. и др. Повышенный спонтанный апопотоз лимфоцитов у пациентов с болезнью Паркинсона. Мед. иммунол. 2011 (в печати).
5.
Скоромец А.А., Скоромец А.П., Скоромец Т.А. Нервные болезни. М.: МЕДпресс-информ, 2005.
6.
Шадрина М.И., Иллариошкин С.Н., Багыева Г.Х. и др. Журнал неврол. и психиатрии им. C.C. Корсакова 2007; 107: 46-50.
7.
Battisti C, Formichi P, Radi E, Federico A. Oxidative-stress-induced apoptosis in PBLs of two patients with Parkinson disease secondary to alpha-synuclein mutation. J. Neurol. Sci. 2008;
267: 120-124.
8.
Blandini F., Mangiagalli A., Cosentino M., Marino F. Peripheral markers of apoptosis in Parkinson's disease: the effect of dopaminergic drugs. Ann. NY Acad. Sci. 2003; 1010: 675-678.
9.
Calopa M., Bas J., Call n A., Mestre M. Apoptosis of peripheral blood lymphocytes in Parkinson patients. Neurobiol. Disю 2010; 38: 1-7.
10. Carballo-Carbajal I., Weber-Endress S., Rovelli G. et al. Leucine-rich repeat kinase 2 induces alpha-synuclein expression via the extracellular signal-regulated kinase pathway. Cell Signal.
2010; 22: 821-827
11. Caronti B., Antonini C., Calderaro C. Dopamine transporter immunoreactivity in peripheral blood lymphocytes in Parkinson’s disease . J. Neural. Transm. 2001; 108: 803-807.
12. Carotini B., Tanda G., Colosimo C. Reduced dopamine in peripheral blood lymphocytes in Parkinson’s disease. NeuroReport 1999; 10: 2907-2920.
13. Cookson M.R., van der Brug M.Cell systems and the toxic mechanism(s) of alpha-synuclein. Exp. Neurol. 2008; 209: 5-11.
14. Fujiwara H., Hasegawa M., Dohmae N. et al. alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions. Nat. Cell. Biol. 2002; 4 (2): 160-164.
15. Giasson B.I., Van Deerlin V.M. Mutations in LRRK2 as a cause of Parkinson's disease. Neurosignals 2008; 16: 99-105.
16. Greggio E., Bisaglia M., Civiero L., Bubacco L. Leucine-rich repeat kinase 2 and alpha-synuclein: intersecting pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease? Mol. Neurodegener. 2011;
6: 6.
17. Ho C.C., Rideout H.J., Ribe E., Troy C.M. The Parkinson disease protein leucine-rich repeat kinase 2 transduces death signals via Fas-associated protein with death domain and caspase-8 in
a cellular model of neurodegeneration. J. Neurosci. 2009; 29: 1011-1020.
18. Iaccarino C., Crosio C., Vitale C., Sanna G. Apoptotic mechanisms in mutant LRRK2-mediated cell death. Hum. Mol. Genetic. 2007; 16: 1319-1326.
19. Kim S., Beom S., Jeon Alpha-synuclein induces apoptosis by altered expression in human peripheral lymphocyte in Parkinson’s disease. FASEB J. 2009; 13: 1615-1618.
20. Lesage S., Brice A., Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Hum. Mol. Genet. 2009; 15 (R1): R48-59.
21. Li Q.X., Mok S.S., Laughton K.M. et al. Plasma alpha-synuclein is decreased in subjects with Parkinson's disease. Exp. Neurol. 2007; 204: 583-588
22. Miller D.W., Hague S.M., Clarimon J. et al. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson disease with SNCA locus triplication. Neurology 2004; 62: 1835-1838.
23. Moos T., Jensen P.H. Absence of prostate apoptosis response-4 protein in substantia nigra of Parkinson's disease autopsies. Acta Neuropathol. 2004; 1: 23-26.
24. Nonaka T., Watanabe ST., Iwatsubo T., Hasegawa M. Seeded aggregation and toxicity of {alpha}-synuclein and tau: cellular models of neurodegenerative diseases. J. Biol. Chem. 2010; 285:
34885-34898.
25. Paisan-Ruiz C., Jain S., Evans E.W. et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron 2004; 44: 595-600.
26. Paleologou K.E., Oueslati A., Shakked G., et al. Phosphorylation at S87 is enhanced in synucleinopathies, inhibits alpha-synuclein oligomerization, and influences synuclein-membrane interactions. J. Neurosci. 2010; 30: 3184-98
27. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Ivanova O.N., et al. G2019S LRRK2 Mutation in Familial and Sporadic Parkinson’s Disease in Russia. Mov. Disord. 2006; 21: 2234-2236.
28. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Emelyanov AK., et al. Screening for LRRK2 mutations in patients with Parkinson's disease in Russia: identification of a novel LRRK2 variant. Eur. J. Neurol.
2008; 15: 692-696.
29. Periquet M., Fulga T., Myllykangas L. et al. Aggregated alpha-synuclein mediates dopaminergic neurotoxicity in vivo. J. Neurosci. 2007; 27: 3338-3346.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ
39
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
40
Polwey E.D., Cherra S.J., Liu Y., Chu C.T. Role of autophagy in G2019S-LRRK2-associated neurite shortenibg in differentiated SH-SY5Y cells. J. Neurocem. 2008; 105: 1048-1056.
Polymeropoulos M.H., Lavedan C., Leroy E. et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identifi ed in families with Parkinson’s disease. Science 1997; 276: 2045–2047.
Qing H., Winne Wong, Edith G McGeer, Patrick L. McGeer, Lrrk2 phosphorylates alpha-synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. BBRC 2009; 387: 149-152
Singleton A.B. Altered a-synuclein homeostasis causing Parkinson’z disease: the potential roles of dardarin. Trends Neurosci. 2005; 28: 416-421.
Smith W.W., Pei Z., Jiang H., Dawson V.L. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 2006; 10: 1231-1233.
Spillantini M.G., Schmidt M.L., Lee V.M.Y. et al. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature 1997; 388: 839–840.
Tatton N.A. Incresed caspase 3 and BAX immunoreactivity accompany nuclear GAPGH translocation and neuronal apoptosis in Parkinson disease. Exp. Neurol. 2000; 166: 29-43.
Vaux D.L., Flavell R.A. Curr. Opin. Immunol. 2000; 12: 719-724.
Vermes I., Haanen C., Reutelingsperger C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J. Immunol. Methods 2000; 243: 167-190.
Xilouri M., Stefanis L. Autophagic pathways in Parkinson disease and related disorders. Expert. Rev. Mol. Med. 2011; 13: e8.
Yamada M., Kida K., Amutuhaire W., Ichinose F., Kaneki M. Gene disruption of caspase-3 prevents MPTP-induced Parkinson's disease in mice. Biochem Biophys. Res. Commun. 2010; 402:
312-318.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ