Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
advertisement
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук На правах рукописи Менчинская Екатерина Сергеевна Молекулярные механизмы противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов кукумариозида А2-2 и фрондозида А 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н. Аминин Дмитрий Львович Владивосток – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................. 5 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .............................................................................................................. 11 1.1. Тритерпеновые гликозиды ........................................................................................................... 11 1.1.1. Химическое строение тритерпеновых гликозидов голотурий .............................................. 11 1.1.2. Распространение тритерпеновых гликозидов в природе ....................................................... 12 1.1.3. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов голотурий ...................................... 12 1.1.3.1. Цитотоксические свойства и противоопухолевая активность................................................ тритерпеновых гликозидов ................................................................................................................. 16 1.1.3.2. Влияние на множественную лекарственную устойчивость ................................................ 24 1.1.3.3. Взаимодействие тритерпеновых гликозидов с биомембранами ........................................ 26 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................................................ 32 2.1. Исследуемые соединения ............................................................................................................. 32 2.2. Лабораторные животные .............................................................................................................. 32 2.3. Получение клеток .......................................................................................................................... 33 2.3.1. Получение клеток асцитной карциномы Эрлиха .................................................................... 33 2.3.2. Культивирование опухолевых клеток человека ...................................................................... 33 2.4. Определение жизнеспособности клеток ..................................................................................... 33 2.4.1. Определение цитотоксической активности (окрашивание трипановым синим) ................. 33 2.4.2. Измерение активности неспецифической эстеразы................................................................ 34 2.4.3. Определение цитотоксической активности (МТТ тест) ......................................................... 34 2.5. Определение индукции апоптоза................................................................................................. 35 2.5.1. Изучение инверсии фосфатидилсерина ................................................................................... 35 2.5.2. Исследование индукции апоптоза в клетках асцитной карциномы Эрлиха с помощью флуоресцентных зондов PI и Hoeсhst 33342 ...................................................................................... 35 2.5.3 Определение каспазы-3 и -9, PARP-1........................................................................................ 36 2.5.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии ......................................................................................................................................... 38 2.5.5. Исследование влияния на активность белка р53..................................................................... 38 2.6. Исследование клеточного цикла.................................................................................................. 39 2.6.1. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии .................... 39 2.6.2. Определение включения 3Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток ...................................... 41 2.7. Исследование колониеобразования опухолевых клеток ........................................................... 41 2.8. Определение множественной устойчивости .............................................................................. 42 3 2.8.1. Исследование блокирования множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM ................................................................................................... 42 2.8.2. Изучение динамики накопления доксорубицина в клетках асцитной карциномы Эрлиха 42 2.8.3. Исследование выброса доксорубицина из опухолевых клеток ............................................. 42 2.9. Протеомный анализ РС3 клеток (2D-PAGE) .............................................................................. 43 2.10. Верификация белков (2D-вестерн-блоттинг) ........................................................................... 44 2.11. Функциональный анализ белков методами биоинформатики ................................................ 45 2.12. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида А2-2 в экспериментах in vivo ........................................................................................................................ 45 2.13. Влияние кукумариозида А2-2 на противоопухолевую активность доксорубицина в экспериментах in vivo........................................................................................................................... 46 2.14. Статистический анализ ............................................................................................................... 47 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................................. 48 3.1. Цитотоксическая активность тритерпеновых гликозидов ........................................................ 48 3.1.1. Определение жизнеспособности с помощью красителя трипановый синий ....................... 48 3.1.2. Определение активности неспецифической эстеразы ............................................................ 49 3.1.3. Определение жизнеспособности опухолевых клеток с помощью метода МТТ .................. 50 3.2. Изучение индукции апоптоза ....................................................................................................... 52 3.2.1. Изучение инверсии фосфатидилсерина ................................................................................... 52 3.2.2. Исследование конденсации хроматина .................................................................................... 55 3.2.3. Исследование активности казпазы-3, -9 и PARP-1 ................................................................. 57 3.2.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии ......................................................................................................................................... 61 3.2.5. Влияние на активность белка р53 ............................................................................................. 63 3.3. Исследование клеточного цикла.................................................................................................. 64 3.3.1. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии .................... 64 3.3.2. Определение включения 3Н-тимидина в ДНК клеток ............................................................ 69 3.4 Влияние тритерпеновых гликозидов на колониеобразование опухолевых клеток ................. 70 3.5. Исследование влияния кукумариозида А2-2 и фрондозида А на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток ............................................................................ 73 3.5.1. Изучение множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM .................................................................................................................................. 73 3.5.2. Изучение транспорта доксорубицина в опухолевых клетках ................................................ 75 3.6. Исследование влияния тритерпеновых гликозидов на протеом опухолевых клеток человека ................................................................................................................................................. 77 4 3.6.1. Протеомный анализ белков с помощью 2D-PAGE и MALDI-MS......................................... 77 3.6.2. Биоинформационный анализ .................................................................................................... 96 3.6.3. Верификация экспрессии белков методом вестерн-блоттинг и 2D-вестерн блоттинг ....... 98 3.7. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида А2-2 in vivo......................... 102 3.8. Влияние кукумариозида А2-2 на противоопухолевую активность доксорубицина in vivo . 104 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................. 107 ВЫВОДЫ ............................................................................................................................................ 110 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................. 112 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................. 113 5 ВВЕДЕНИЕ Онкологические заболевания в настоящее время, безусловно, являются одной из наиболее значимых причин смертности населения земного шара независимо от пола, возраста и качества жизни человека. Для терапии разных типов опухолевых заболеваний выработано множество подходов, в которых используются современные достижения в области молекулярной и клеточной биологии, молекулярной генетики и иммунологии. Особое внимание уделяется разработке таких способов, как избирательная доставка цитостатиков и антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые клетки за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза (включая наносомальные системы доставки), поиск подходов к целенаправленному ингибированию опухолевого ангиогенеза, применение индукторов апоптоза, избирательная активация иммунного ответа, в том числе и разработка методологий, основанных на использовании дендритных клеток, обладающих уникальной способностью представлять опухолеспецифические антигены нативным Т-клеткам и вызывать их дифференцировку в цитотоксические лимфоциты (Северин, Родина, 2006). В то же время неотъемлемой частью химиотерапии онкологических заболеваний продолжает оставаться применение широкого спектра противоопухолевых соединений. Несмотря на впечатляющие достижения современной мировой науки, следует отметить, что у многих противоопухолевых фармакологических препаратов имеются существенные недостатки, связанные, главным образом, с их высокой токсичностью, приводящей к нарушению функционирования многих органов и расстройству иммунной системы. Еще одним существенным недостатком применения различных по структуре и механизму действия лекарственных препаратов, используемых при интенсивной химиотерапии, является развитие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Был обнаружен ряд различных по химической природе соединений (блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы кальмодулина, некоторые стероиды, антибиотики и иммуносупрессоры), способных преодолевать МЛУ. Однако они не нашли применения в клинической практике из-за их высокой токсичности (Germann, Harding, 1995). В связи с этим, проблема терапии рака, своевременности и безопасности ее применения, а также повышения эффективности действия противоопухолевых препаратов в отношении резистентных к химиотерапии опухолевых клеток, является попрежнему крайне острой, а поиск природных и синтетических соединений, обладающих противоопухолевой активностью, и создание на их основе новых перспективных лекарственных средств представляет значительный интерес для предупреждения развития и лечения злокачественных новообразований. 6 Известно, что ряд тритерпеновых гликозидов голотурий обладает цитотоксическими, проапоптотическими и иммуномодулирующими свойствами, а на основе одного из них − кукумариозида А2-2, выделенного из голотурии Cucumaria japonica, в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН создан иммуномодулирующий препарат кумазид, проявляющий противоопухолевый эффект (Стоник и др., 2004; Aminin et al., 2010). В настоящее время тритерпеновые гликозиды голотурий привлекают внимание онкологов в качестве потенциальных противоопухолевых соединений. Результаты исследований, проводимых научно-исследовательскими группами США, Южной Кореи и Китая, демонстрируют высокий потенциал некоторых тритерпеновых гликозидов голотурий как природных соединений, обладающих не только цитотоксическим и антипролиферативным действием по отношению к опухолевым клеткам in vitro, но и вызывающих в них апоптоз, ингибирование формирования тубул, адгезии, миграции и инвазии опухолевых клеток и подавление ангиогенеза. Кроме того, ряд тритерпеновых гликозидов голотурий проявляет выраженную противоопухолевую активность in vivo в отношении не только опухолей животных, таких как мышиная саркома, гепатокарцинома, мышиная подкожная опухоль, карцинома Эрлиха и азоксиметан- индуцируемый рак толстой кишки крыс, но и эффективно ингибируют опухолевый рост и метастазирование на моделях опухолей человека в бестимусных мышах (ксенографтах): карцинома простаты человека, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легких человека, лейкемия и ряд других типов опухолей. Однако, физиологической несмотря на активности большое количество тритерпеновых работ, гликозидов связанных голотурий, с изучением механизм их противоопухолевого действия на клеточном и субклеточном уровне недостаточно изучен. Имеющиеся в литературе данные о противоопухолевой активности тритерпеновых гликозидов голотурий не дают четкого представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе проявления этого эффекта и о внутриклеточных мишенях действия гликозидов, а также об их способности преодолевать множественную лекарственную устойчивость. Целью исследования являлось установление и изучение молекулярных механизмов противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов, кукумариозида А2-2 и фрондозида А, выделенных из голотурий Cucumaria japonica и Cucumaria frondosa соответственно. В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи: 1. Провести сравнительное изучение и установление концентрационных диапазонов цитотоксической активности тритерпеновых гликозидов кукумариозида А2-2 и фрондозида А in vitro в отношении опухолевых клеток мыши и человека, включая устойчивые к цитостатикам клетки; 7 Провести сравнительное изучение влияния этих соединений на индукцию апоптоза, 2. фазы клеточного цикла, активность белка р53 и биосинтез ДНК опухолевых клеток мыши; Исследовать 3. влияние тритерпеновых гликозидов на пролиферацию, колониеобразование, фазы клеточного цикла и индукцию апоптоза в опухолевых клетках репродуктивной системы человека; Изучить влияние тритерпеновых гликозидов на протеом клеток рака простаты человека 4. линии РС3 и выявить белки-мишени, экспрессия которых регулируется под действием гликозидов; Изучить влияние тритерпеновых гликозидов на множественную лекарственную 5. устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток мыши. Оценить способность гликозидов блокировать МЛУ и изменять скорость накопления в клетках и выброса из клеток цитостатика доксорубицина; 6. Исследовать противоопухолевую активность тритерпеновых гликозидов in vivo на моделях асцитной карциномы Эрлиха мышей, соответствующих различным стадиям заболевания, в том числе при комбинированном действии с доксорубицином. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Взаимодействие кукумариозида А2-2 и фрондозида А с различными типами опухолевых клеток, включая устойчивые к цисплатину клетки, приводит к индукции в них апоптоза по каспазо-зависимому пути. 2. Действие гликозидов на опухолевые клетки сопровождается арестом клеточного цикла, ингибированием биосинтеза ДНК и подавлением формирования и роста колоний опухолевых клеток человека, свидетельствующим о способности гликозидов тормозить процессы пролиферации и метастазирования. 3. В клетках опухоли простаты человека линии РС3 выявлены белки-мишени, экспрессия которых изменяется под воздействием кукумариозида А2-2 и фрондозида А. Эти белки относятся к регуляторам метаболизма белков и углеводов, к белкам цитоскелета, участвующим в клеточной подвижности и делении, принимают участие в иммунном ответе, в ответе на стресс, в мРНК процессинге, а также в структурно-функциональной организации ядра клеток. 4. Кукумариозид А2-2 и фрондозид А достоверно блокируют множественную лекарственную устойчивость в опухолевых клетках карциномы Эрлиха мышей, что приводит к усилению накопления в опухолевых клетках противоопухолевого цитостатика доксорубицина и увеличению времени его задерживания в клетках. 5. Кукумариозид А2-2 вызывает in vivo достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных с инокулированной асцитной карциномой Эрлиха 8 при моделировании ранних стадий заболевания и при проведении комбинированной терапии с доксорубицином. Научная новизна и практическая значимость. В ходе данной работы было проведено сравнительное изучение взаимодействия тритерпеновых гликозидов кукумариозида А2-2 и фрондозида А с опухолевыми клетками репродуктивной системы человека и опухолевыми клетками мыши. Получены новые ценные данные о способности тритерпеновых гликозидов вызывать индукцию апоптоза и блокировать клеточный цикл, а также ингибировать колониеобразование опухолевых клеток. Показано, что восприимчивость устойчивых к цисплатину опухолевых клеток человека к действию гликозидов сопоставима с чувствительностью не резистентных к цисплатину опухолевых клеток. Впервые с помощью методов протеомики, основанных на двумерном электрофорезе с последующим массспектрометрическим анализом дифференциально регулируемых белков, в опухолевых клетках человека линии РС3 были выявлены белки, экспрессия которых существенно меняется при воздействии гликозидов на клетки. Эти молекулярные мишени играют ключевую роль в функционировании опухолевых клеток и принимают активное участие в механизмах развития и регулирования митоза и пролиферации опухолевых клеток, миграции клеток и инвазии опухолей, и контролируют процессы программируемой гибели опухолевых клеток. Впервые были получены данные о способности гликозидов блокировать множественную лекарственную устойчивость в опухолевых клетках. Обнаруженный эффект ингибирования резистентности опухолевых клеток к цитостатикам вызывает увеличение накопления в клетках противоопухолевых соединений и, как следствие, усиление противоопухолевого действия этих соединений. Полученные результаты вносят значимый вклад в понимание молекулярных механизмов противоопухолевого действия кукумариозида А2-2 и фрондозида А и углубляют существующие представления о влиянии низкомолекулярных биорегуляторов на опухолевые клетки животных и человека. Фундаментальные знания, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, создают методологическую основу для изучения механизма действия новых лекарственных средств, созданных на основе тритерпеновых гликозидов голотурий. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Научнопрактической конференции «Фундаментальная наука – медицине» (Владивосток, 2011), 9th IST Asia pacific meeting on animal, plant and microbial toxins (Владивосток, 2011), XIII и XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ, 2011, 2012), VIII Дальневосточном региональном Конгрессе «Человек и лекарство» с международным участием (Владивосток, 2011), 2nd Bi-Annual International Practical Cytometry Workshop (Москва, 2011), 2nd International workshop on marine bioresources of Vietnam 9 (Ханой, Вьетнам, 2013), 38th FEBS Congress “Mechanisms in Biology” (Санкт-Петербург, 2013), FEBS EMBO 2014 Conference (Париж, Франция, 2014), Annual Meeting of the German, Austrian and Swiss Associations for Hematology and Medical Oncology (Гамбург, Германия, 2014). Личный вклад автора. Автором самостоятельно были проведены исследования цитотоксической активности кукумариозида А2-2 и фрондозида А на различных типах опухолевых клеток, изучено влияние гликозидов на индукцию апоптоза, проведена оценка каспазы-3, -9 и расщепленного PARP-1 с помощью метода вестерн-блоттинг, исследование клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии, включения 3Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток методами радиоизотопного анализа, изучение колониеобразования опухолевых клеток человека, исследование множественной лекарственной устойчивости и динамики накопления и выброса доксорубицина в опухолевых клетках методами спектрофлуориметрии и конфокальной микроскопии, и проведение противоопухолевой терапии in vivo. Исследование влияния кукумариозида А2-2 и фрондозида А на протеом опухолевых клеток рака простаты методом 2D-электрофореза с последующим MALDI-MS/MS анализом выполнено совместно с к.х.н. Дышловым С.А. (лаборатория химии морских природных соединений, ТИБОХ ДВО РАН), Т. Рульфинг (лаборатория экспериментальной онкологии, Университетская клиника Гамбург-Эппендорф, Германия) и С. Венц (Департамент медицинской биохимии и молекулярной биологии, институт генетики и функциональной геномики, Университет Грайсфальда, Германия). Изучение влияния на активацию мышинного р53 с использование двухгибридной дрожжевой тест-системы проведено совместно с к.б.н. Ковальчук С.Н. (лаборатория морской биохимии, ТИБОХ ДВО РАН). Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии проведено вместе с д.б.н Реуновым А.А. и д.б.н. Реуновым А.В. (лаборатория клеточной дифференциации, ИБМ ДВО РАН и группа фитоиммунитета, ТИБОХ ДВО РАН соответственно). Исследования с помощью конфокальной микроскопии проводили в ЦКП «Биотехнология и генетическая инженерия» БПИ ДВО РАН (к.б.н. Горпенченко Т.Ю.). Работа с клетками карциномы Эрлиха мыши выполнена в Лаборатории биоиспытаний и механизма действия биологически активных веществ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН при финансовой поддержке гранта РФФИ (№ 11-04-01084-а), грантов Дальневосточного отделения Дальневосточного и РАН (№ 12-III-В-05-022 Уральского отделений РАН и № 14-III-В-05-098), (№ 09-II-УО-05-002), гранта гранта Дальневосточного отделения РАН и Национального научного совета Тайваня (№ 12-ННС-006), программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и гранта Президента РФ 10 для поддержки ведущих научных школ НШ-546.1012.4. Исследование противоопухолевой активности в отношении опухолевых клеток репродуктивной системы человека и влияние на протеом клеток рака простаты выполнено в лаборатории экспериментальной онкологии при Университетской клинике Гамбург-Эппендорф (Германия) при финансовой поддержке грантов Eppendorfer Krebs- und Leukämiehilfe и DAAD - A/11/85854. Публикации. По материалам исследования опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, 1 патент и 11 тезисов докладов конференций. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 186 публикаций. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 39 рисунков. Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю к.б.н. Дмитрию Львовичу Аминину. Автор выражает признательность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН: к.х.н. Александре Сергеевне Сильченко и д.х.н. Сергею Анатольевичу Авилову за любезное предоставление кукумариозида А2-2 и фрондозида А, к.х.н. Виктории Николаевне Давыдовой за помощь при проведении исследований методом проточной цитофлуориметрии, к.б.н. Светлане Николаевне Ковальчук за работу с двухгибридной дрожжевой тест-системой, д.б.н Аркадию Анатольевичу Реунову и д.б.н. Анатолию Васильевичу Реунову за помощь при проведении фазово-контрастной и электронной микроскопии. Автор выражает глубокую признательность к.х.н. Сергею Анатольевичу Дышловому за неоценимую помощь в организации и проведении исследований протеома опухолевых клеток человека, а также ценные консультации. Автор также выражает глубокую признательность своим немецким коллегам из Университетской клиники Гамбург-Эппендорф (Германия), и, в частности, доктору Фридману Хонекеру, доктору Гунхильд фон Амсберг, доктору Кристин Якобсен и профессору Карстену Букамаеру, а также всем сотрудникам лаборатории биоиспытаний и механизма действия БАВ ТИБОХ ДВО РАН. 11 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Тритерпеновые гликозиды 1.1.1. Химическое строение тритерпеновых гликозидов голотурий Тритерпеновые гликозиды – это низкомолекулярные соединения природного происхождения. Они состоят из углеводной цепи и агликона тритерпеновой природы. В зависимости от химического строения, тритерпеновые гликозиды могут быть отнесены к урсановому, олеановому, лупановому, гопановому, даммарановому, ланостановому и другим рядам (Деканосидзе и др., 1982, 1984; Stonik, Elyakov, 1988). Моносахаридные остатки могут образовывать одну или две углеводные цепи линейной либо разветвленной структуры, в состав которых могут входить от 1 до 11 различных моносахаридных остатков (пентоз и гексоз). В таких гликозидах углеводные цепи присоединены к тритерпеновому агликону О-гликозидной или ацилозидной связями. В состав некоторых тритерпеновых гликозидов входят также остатки органических кислот (например, ангеликовой, тиглиновой, коричной, уксусной и др.), этерифицирующих преимущественно агликон (Shibata, 1985; Stonik, 1986). Тритерпеновые гликозиды различаются по многим признакам по числу и расположению двойных связей, гидроксильных, ацетатных и других функциональных групп в агликонах, положению и природе моносахаридных остатков, числу и положению сульфатных групп в углеводных цепях (Калинин, 1992; Kalinin et al., 1992). Основная масса гликозидов голотурий имеет голостановый агликон, то есть ланостановый углеводородный скелет с 18 (20)-лактоном (Habermehl, Volkwein, 1971). В 90-х годов прошлого столетия были обнаружены и новые структурные типы агликонов ланостанового и норланостанового типа, не содержащие 18 (20)-лактон (Авилов и др., 1991 а, б, Kitagawa et al., 1989). Углеводные цепи гликозидов голотурий имеют от двух до шести моносахаридных остатков включающих ксилозу, хиновозу, глюкозу и 3-О-метилглюкозу и иногда 3-О-метилксилозу, 3-О-метилхиновозу, 3-О-метилглюкуроновую кислоту и 6-Оацетилглюкозу, которые могут содержать одну, две или три сульфатные группы (Еляков, Стоник, 1986; Калинин, 1992). Гликозиды голотурий биохимической эволюции являются и чрезвычайно удобной структурно-функциональных моделью для изучения взаимодействий природных соединений. Они имеют сложное строение, поскольку биосинтезируются как из углеводных, так и тритерпеновых предшественников и варьируют по многим относительно независимым признакам. Поэтому тритерпеновые гликозиды голотурий являются хемотаксономическими 12 маркерами различных систематических групп голотурий и используются для уточнения систематического положения животных и их родственных связей в том или ином таксоне (Калинин и др., 1989; Kalinin et al, 2005). 1.1.2. Распространение тритерпеновых гликозидов в природе Тритерпреновые гликозиды широко представлены во многих высших растениях и морских беспозвоночных. Они обладают различными видами биологической активности в отношении животных и человека, а также характеризуются большим разнообразием структур (Mahato et al., 1988). Тритерпеновые гликозиды являются действующим началом, определяющим, физиологические эффекты экстрактов из многих лекарственных растений. Более чем у 500 семейств растений описано содержание этих соединений. К наиболее важным семействам, содержащим тритерпеновые гликозиды, относятся лилейные, гвоздичные, лютиковые, бобовые, аралиевые, сложноцветные и некоторые другие (Деканосидзе и др., 1984). Кроме источников растительного происхождения, тритерпеновые гликозиды распространены в иглокожих Мирового океана. Тритерпеновые гликозиды были относительно недавно обнаружены в губках (Стоник, 2001). Изучение морских объектов привело к созданию обширной коллекции тритерпеновых гликозидов из голотурий и к установлению их биологической активности. 1.1.3. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов голотурий Ихтиотоксические свойства и токсичность. На начальных этапах исследования биологической активности тритерпеновых гликозидов голотурий была изучена их общая токсичность, ихтиотоксичность и гемолитическая активность. В 50−60-х гг. ХХ в. Т. Яманоучи и Р. Нигрелли показали наличие ихтиотоксических веществ в 30 видах голотурий. Гистологический анализ показал, что причиной гибели рыб является повреждение жаберных капилляров гликозидами (Nigrelli, 1952, Yamanouchi, 1955). Позже было показано, что тритерпеновые гликозиды способны ингибировать рост патогенной грибковой микрофлоры, блокировать деление и последующее развитие эмбрионов морского ежа и подавлять пролиферацию разных типов опухолевых клеток (Kalinin et al., 2008). Было установлено, что одним из проявлений токсического действия тритерпеновых гликозидов голотурий является их влияние на ранний эмбриогенез морских ежей (Ruggieri, Nigrelli, 1960). Так, было показано, что голотурин и голотурин А из Actinopyga agassizi вызывают остановку дробления или лизис бластомеров эмбрионов морского ежа Arbacia 13 punctilata. Позднее сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН было установлено, что голотоксин А1 из Apostichopus japonicus, кукумариозид С и кукумариозид G1 из Eupentacta fraudatrix, а также гликозиды из Holothuria mexicana оказывают аналогичное действие на оплодотворенные клетки морского ежа Strongylocentrotus intermedius. Был сделан вывод, что цитотоксическое действие тритерпеновых гликозидов голотурий в отношении эмбрионов морского ежа связано с ингибированием синтеза ДНК, РНК и белков, обусловленным уменьшением в клетках концентрации предшественников этих биополимеров из-за нарушения мембранного транспорта (Anisimov et al., 1979). Яманоучи определил летальные дозы голотурина из Holothuria leucospilota (=H. vagabunda) для земляных червей, лягушек и мышей. Так LD50 для мышей равнялась 0,75, 70 и 400 мг/кг при внутривенном, подкожном и пероральном введении соответственно (Yamanouchi, 1955). LD50 фракции кукумариозидов из голотурии Cucumaria japonica для мышей составила 200 мкг/мышь (или 10 мг/кг) при перитонеальном способе введения (Поликарпова и др., 1990). Острая токсичность фрондозида А из голотурии Cucumaria frondosa, определенная методом Кербера, составляла 9,9 мг/кг (LD50) при однократном внутрибрюшинном введении (Aminin et al., 2008). Гемолитическая активность. Было обнаружено, что многие тритерпеновые гликозиды голотурий, принадлежащих к разным родам и семействам, обладают выраженной гемолитической активностью и эффективно разрушают эритроциты теплокровных животных (Nigrelli, Jakowska, 1960; Yamanouchi, 1955). Было показано, что гемолитический индекс для «голотурина» превышал в 6−7 раз таковой сапонинов (смесь растительных тритерпеновых гликозидов), а холестерин, добавленный в инкубационную среду, значительно понижал гемолитическое действие «голотурина» (Thron, 1964). В ходе изучения гемолитической активности серии тритерпеновых гликозидов и их производных из голотурий отряда Dendrochirotida сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН было установлено, что данный вид активности зависит от структуры, как агликона, так и углеводной цепи. Наибольшие значения были у гликозидов, имеющих линейный тетрасахаридный фрагмент в углеводных цепях и 18 (20)-лактон в агликонной части (Kalinin et al., 1992). Противогрибковое и антимикробное действие. Отмечено, что тритерпеновые гликозиды голотурий обладают антифунгальным действием. Так, голотоксин, выделенный из Apostichopus japonicus проявлял активность в отношении грибов в концентрации 2,78−16,7 мкг/мл, но был не токсичен для большинства бактерий. Антифунгальные свойства гликозидов голотурий связывают с их взаимодействием со стеринами клеточных мембран грибов (Анисимов и др., 1972). Было показано, что голотоксин А1 оказывает ингибирующее действие на биосинтез РНК в Candida albicans и Saccharomyces carlbergensis, что было зарегистрировано по уменьшению 14 С-уридина в кислотонерастворимой фракции клеток (Баранова и др., 1973). Было установлено, 14 что способность подавлять рост грибков в культуре характерна для гликозидов, выделенных из голотурий родов Bohadshia, Holothuria, Actinopyga, Stichopus, Thelenota и Eupentacta (=Cucumaria) (Анисимов и др., 1972; 1973; Анисимов, Чирва, 1980; Щеглов и др., 1979; Shimada, 1969; Kuznetsova et al., 1982). Антипротозойная активность. Было показано, что «голотурин» достаточно эффективно подавляет in vitro жизнедеятельность простейших Amoeba proteus (Nigrelli, Jakowska, 1960), а голотоксины из голотурии Apostichopus japonicus активны против Trichomonas vaginalis (Kitagawa et al., 1976). Антипротозойная активность совпадает с противогрибковой активностью гликозидов (Miyamoto et al., 1990). Показано, что крысы, предварительно инъецированные культурой Tripanosoma lewisi, были менее заражены патогенами после предварительного или одновременного введения голотурина, чем контрольные животные (Styles, 1970). В то же время, если гликозид вводили после инокуляции культуры Trypanosoma duttony, то у инъецированных гликозидом животных наблюдался более высокий уровень заражения (Sen, Lin, 1975; 1977). Контрацептивный эффект. Было установлено, что подкожная инъекция крысам смеси гликозидов голотурии Apostichopus japonicus в дозах 0,1 и 1 мг/кг вызывала выраженный контрацептивный эффект на 50 и 28% соответственно (Мац и др., 1990). Митогенная активность. Было показано, что «голотурин» из голотурии A. agasssizi стимулировал гемопоэз в костном мозге лягушек (Nigrelli, Jakowska, 1960). Установлено, что минимальная иммуномодулирующая доза 0,05 мкг/кг суммы кукумариозидов из голотурии Cucumaria japonica вызывала задержку митоза клеток печени крыс в период с 28 по 32 ч после гепатоэктомии, но после 40 ч наблюдалось компенсаторное увеличение митотической активности клеток, что может отражать регулирование процесса пролиферации клеток гликозидами (Турищев и др., 1991). Установлено, что голотурины А, В и А2 из голотурий семейства Holothuriidae и голотоксин А1 из голотурии Apostichopus japonicus в диапазоне концентраций 0,01–0,1 мкг/мл стимулировали включение 3H-Thd в Т- и В-лимфоциты селезенки или усиливали бласт-трансформацию спленоцитов, вызываемую ConA или фитогемагглютинином (Попов и др., 1994). В то же время препарат кумазид в нанограммовых концентрациях не вызывал существенного увеличения пролиферативной активности лимфоцитов крови человека в сравнении с фитогемагглютинином, но усиливал ее в 1,2–2 раза при концентрации 0,1 и 1 мкг/мл (Aminin et al., 2006; Стоник и др., 2004). Радиозащитное действие. Было изучено радиозащитное действие кукумариозида А2-2 из голотурии C. japonica и препарата «трепангин» из гликозидов Apostichopus japonicus. Установлено, что наиболее эффективный гликозид, кукумариозид А2-2, в дозе 1 мкг/кг 15 увеличивал выживаемость мышей на 40% после их радиационного облучения цезием 137 Cs (γ- радиация, доза облучения 7,7 Гр, 5–10 мин) и усиливал гемопоэз в красном косном мозге у облученных животных (Поверенный, 1990). Показано, что препарат кумазид, введенный мышам линии CD-1, облученным с использованием гамма-терапевтического аппарата с источником излучения обладает 60 умеренными Co (доза облучения составляла 6,5 Гр, мощность дозы 1,14 Гр/мин), радиозащитными свойствами. Радиопротекторный эффект сопровождался увеличением процента выживаемости и средней продолжительности жизни (СПЖ) радиоактивно облученных животных, увеличением скорости восстановления показателей клеточного состава периферической крови, функции кроветворения, клеточности кроветворных (костный мозг бедренной кости), лимфоидных (тимус, селезенка) органов и количества полипотентных стволовых кроветворных клеток. Наибольшую эффективность препарат проявлял в дозе 1 мкг/кг при профилактическом подкожном введении за 4 дня до облучения животных (Aminin et al., 2011). Противовирусное действие. Для некоторых гликозидов голотурий была отмечена противовирусная активность. Механизм противовирусной активности гликозидов может быть связан с антивирусной защитой на стадии взаимодействия вирус-клетка. Этот тип активности для гликозидов был подтвержден экспериментами по ингибированию цитопатического эффекта вируса везикулярного стоматита, полиомиелита и других вирусов в культуре клеток (Grishin et al., 1991). Было показано, что кукумариозид А2-2 из C. japonica более активен, чем кукумариозид А4-2, тогда как кукумариозид G1 из E. fraudatrix был полностью не активен. Голотуринозиды А, C и D из голотурии Holothuria forskali в концентрации 20 мкг/мл вызывали 20%-ное ингибирование цитопатического эффекта, индуцированного вирусом везикулярного стоматита в культуре эмбриональных клеток почек хомяка (Rodriguez et al., 1991). Показано, что трисульфатированные гликозиды лиувиллозид А и B, выделенные из антарктической голотурии Staurocucumis liouvillei, эффективно ингибировали цитопатический эффект вируса герпеса Herpes simplex тип 1 (HSV-1) в концентрациях ниже 10 мкг/мл (Maier et al., 2001). Кроме того, для тритерпеновых гликозидов голотурий отмечены такие активности, как мутагенная, нейротоксическая, способность ингибировать Na+, К+АТФ-азы, определенные хемокиновые рецепторы (CCR-5) и ингибирование роста корней проростков некоторых сельскохозяйственных растений (Kalinin et al., 2008). Показано, что в очень низких наномолярных концентрациях некоторые из этих соединений активируют целый ряд внутриклеточных процессов, что приводит к усилению таких клеточных функций, как клеточное деление, фагоцитоз, синтез некоторых клеточных эффекторов (Aminin et al., 2006; 2008). Этим, вероятно, объясняются такие свойства тритерпеновых гликозидов как иммуномодулирующая, адъювантная и ранозаживляющая активности (Aminin, 2013). 16 Поскольку данная работа связана с изучением противоопухолевой активности гликозидов, то далее обзор будет посвящен детальному описанию цитотоксической и противоопухолевой активности тритерпеновых гликозидов голотурий. 1.1.3.1. Цитотоксические свойства и противоопухолевая активность тритерпеновых гликозидов Исследования тритерпеновых гликозидов голотурий показали, что эти соединения могут ингибировать рост патогенной грибковой микрофлоры, блокировать деление и развитие эмбрионов морского ежа, подавлять пролиферацию различных типов клеток опухолей человека in vitro, включая лейкемию P-388, KB, лимфоидную лейкемию L 1210, Schabel, A-549, HT-29, Mel-28, MICF-1, IA9, CAKI-1, U-87-MG, PC-3, SK-MEL, HCT-8, MCF-7, MKN-28, HCT-116, U87MG, HepG2, HeLa, THP-1, KB-VIN, HCT-8, C33A, и некоторые другие типы опухолевых клеток (Федоров и др., 2009; Sun et al., 2007; Wu et al., 2007; Zhang et al., 2007; Avilov et al., 2008; Liu et al., 2008; Althunibat et al., 2009; Fan et al., 2009; Han et al., 2010). Эти соединения обладают широким диапазоном фармакологических свойств. Считается, что в голотуриях они являются основным защитным механизмом от хищников и патогенных микроорганизмов. В течение последнего десятилетия было опубликовано несколько обзоров об исследовании цитотоксической активности тритерпеновых гликозидов. В этих обзорах показана корреляция между структурой тритерпенового сапонина и его цитотоксичноской активностью, связанной с молекулярным механизмом действия (Kalinin et al., 2008; Podolak et al., 2010; Osbourn et al., 2011; Kim ,Himaya, 2012). Впервые противоопухолевые свойства гликозидов голотурий были описаны в 1952 году Нигрелли (Nigrelli, 1952). Он показал, что инъекция голотурина, представляющего гликозидную фракцию из голотурии Actinopyga agassizi, в зону опухоли Sarcoma-180 ингибировала рост опухоли и вызывала ее регрессию. Противоопухолевый эффект показал патагоникозид А, основной тритерпеновый гликозид из голотурии Psolus patagonicus, имеющий сульфатную группу в углеводной цепи, и его десульфатированный аналог. Был исследован антипролиферативный эффект, цитотоксическая и гемолитическая активность этих соединений, а также способность активировать ядерный фактор NF-κB. Три опухолевые линии Hep3B, MDA-MB231 и A549 были выбраны для определения антипролиферативного эффекта патагоникозида А и его десульфатированного аналога. После 24 ч инкубирования процент выживших клеток понижался с повышением концентрации гликозидов. EC50 для патагоникозида А в отношении клеток линий Hep3B, MDA-MB231 и A549 была равна 15, 89, 19,62 и 15,04 мкМ 17 соответственно. Десульфатированное производное показывало менее сильный антипролиферативный эффект на опухолевые клетки линий Hep3B и MDA-MB231 (EC50 был 5,09 и 5,39 мкМ соответственно), хотя в концентрации 16,53 мкМ вызывало гибель более 50% клеток аденокарциномы человека линии A549. Эти результаты показывают, что данные тритерпеновые гликозиды способны подавлять рост различных опухолевых клеток (Careaga et al., 2009). Недавно было показано, что индукция апоптоза в опухолевых клетках является одним из основных механизмов противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов. Так например, филинопсид А, моносульфатированный сапонин из голотурии Pentacta quadrangularis, влиял на ангиогенез, а также на рост опухолевых клеток. Эти исследования были проведены в сериях экспериментов на моделях in vitro и in vivo. В результате этих исследований было продемонстрированно, что филинопсид А значительно ингибирует пролиферацию, миграцию и формирование тубул в микроваскулярных эндотелиальных клетках человека в зависимости от концентрации изучаемого гликозида с IC50 1,4±0,17, 0,89±0,23 и 0,98±0,19 мM соответственно. В экспериментах на хориоаллантоисной мембране куриных эмбрионов филинопсид А в концентрации 2−10 нМ/яйцо значительно ингибировал ангиогенез. Филинопсид А также проявил выраженную противоопухолевую активность как in vitro так и in vivo. Установлено что, это вещество сокращает объем опухоли мышиной саркомы 180, индуцируя апоптоз опухоли и эндотелиальных клеток, ассоциированных с опухолью. При исследовании влияния филинопсида А на рецепторы тирозинкиназ (RTKs), принимающих участие в росте опухоли и патологическом ангиогенезе, было показано, что филинопсид А достоверно ингибировал все тестируемые RTKs, включающие рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), рецептор1 фактора роста фибробластов, рецептор-β тромбоцитарного фактора роста и рецептор эпителиального фактора роста (EGFR), с IC50 в диапазоне значений от 2,6 до 4,9 мкМ. На основании этих данных было сделано заключение, что филинопсид А является многообещающим противоопухолевым соединением, которое обладает цитотоксическим и антиангиогенным эффектом, что происходит в результате ингибирования RTKs (Tong et al., 2005). В другом исследовании были изучены противоопухолевая активность и влияние на ангиогенез филинопсида Е, еще одного сульфатированного сапонина из голотурии P. quadrangularis. Ингибирование ангиогенеза было оценено in vitro. Кроме того, исследовали влияние этого гликозида на пролиферацию, миграцию и адгезию, формирование тубул и индукцию апоптоза в кожных капиллярных эндотелиальных клетках человека, обработанных филинопсидом Е и в эндотелиальных клетках пупочной вены. Результаты показали, что гликозид ингибирует пролиферацию в кожных капиллярных эндотелиальных клетках человека 18 и в эндотелиальных клетках пупочной вены в концентрации IC50 2,22±0,31 и 1,98±0,32 мкM, индуцирует апоптоз в эндотелиальных клетках в концентрации меньше 2 мкM, индуцирует дозозависимую супрессию клеточной миграции, клеточную адгезию и формирование тубул в этих клетках, а также показывает антипролиферативную активность против различных опухолевых клеточных линий (IC50 ~ 4 мкM). В экспериментах in vivo филинопсид Е подавляет спонтанный ангиогенез в хориоаллонтоисной мембране (5 нМ/яйцо) и проявляет заметное ингибирование роста опухолевых клеток на клеточных моделях мышиной саркомы 180 и гепатомы 22. В частности, обработка филинопсидом Е мышиной саркомы 180 уменьшает объем опухоли, вызывая апоптоз как в самой опухоли, так и в эндотелиальных клетках, ассоциированных с опухолью. Кроме того, обработка филинопсидом Е подавляет активность (фосфорилирование) VEGF рецептора, VEGF2, KDR/Flk-1, Akt (регулирующего жизнеспособность клеток), ERK (требующегося для митогенетической активности VEGF в эндотелиальных клетках) и паксиллина (связанного с FAK и играющего важную роль в клеточной адгезии и миграции и вовлеченного в выживание, пролиферацию, адгезию и миграцию эндотелиальных клеток). Результаты показали, что филинопсид Е воздействует на ангиогенез, ассоциированный с ингибированием сигналов VEGFR2, и проявляет выраженную противоопухолевую активность, связанную с уменьшением пролиферации опухолевых клеток и увеличением апоптоза как в эндотелиальных, так и в опухолевых клетках. Было показано, что филинопсид Е специфически взаимодействует с KDR внутриклеточным доменом, блокирует его связывание с VEGF и последующую передачу сигнала в ядро клетки (Tian et al., 2005; 2007). Были проведены эксперименты in vitro и in vivo по установлению влияния Ds-эхинозида А – несульфатированного тритерпенового гликозида, выделенного из голотурии Pearsonothuria graeffei на адгезию, миграцию и инвазию опухолевых клеток и ангиогенез опухоли. В этом исследовании было обнаружено, что Ds-эхинозид А ингибирует пролиферацию клеток гепатоцеллюлярной карциномы печени человека Hep G2 с IC50 = 2,65 мкМ/л и подавляет клеточную адгезию, миграцию и инвазию в клетках карциномы печени Hep G2, в зависимости от используемой дозы. Ds-эхинозид А также редуцирует формирование тубул в эндотелиальных клетках человека ECV-304 в матриксном геле in vitro и уменьшает неоваскуляризацию в аллантоисной мембране куриного эмбриона in vivo. Иммуноцитохимический анализ показал, что Ds-эхинозид А значительно понижает экспрессию матриксной металлопротеазы-9 (ММР-9), которая играет важную роль в деградации базальной мембраны, ассоциированной с метастазами опухолей и ангиогенезом. Ds-эхинозид А также повышает уровень экспрессии тканевого ингибитора металлопротеазы-1 (TIMP-1), важного регулятора активации ММР-9 (Zhao et al., 2011). 19 Было установлено, что эхинозид А и Ds-эхинозид А существенно блокируют клеточный цикл в G0/G1 фазе. При помощи полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТПЦР) было показано, что эхинозид А и Ds-эхинозид А в значительной степени повышают экспрессию генов регуляторов клеточного цикла, таких как р16, р21 и c-myc, и понижает экспрессию циклина D. Оба гликозида понижают экспрессию Всl-2 и усиливают митохондриальный выброс цитохрома с, активацию каспазы-3 и расщепление поли(АДФрибозы)-полимеразы (PARP). Показано, что экспрессия NF-kβ значительно понижалась под действием Ds-эхинозида А, но не изменялась под влиянием эхинозида А. Терапия мышей с гепатокарциномой Н22 эхинозидом А и Ds-эхинозидом А (2,5 мг/кг) уменьшала объем опухоли на 49,8 и 55,0% соответственно (Zhao et al., 2012). Кроме того было показано, что эхинозид А ингибирует рост опухоли у бестимусных мышей с карциномой простаты человека (Li et al., 2010). Схожие результаты были получены авторами в исследованиях двух сульфатированных тритерпеновых гликозидов − голотурина А и 24-дегидроэхинозида А, выделенных из голотурии Р. graeffei. Оба этих гликозида продемонстрировали выраженное ингибирующее влияние на метастазирование как in vitro, так и in vivo. Иммуноцитохимический анализ показал, что оба соединения существенно подавляют экспрессию ММР-9, а также усиливают уровень экспрессии тканевого ингибитора TIMP-1. В соответствии с данными по вестерн-блоттингу, оба гликозида сильно подавляли экспрессию VEGF, значительно уменьшали адгезию клеток линий HepG2 и ECV-304 на матриксный гель, а также ингибировали миграцию и инвазию клеток HepG2 в зависимости от дозы. Обработка клеток голотурином А приводила к даунрегулированию уровня экспрессии NF-kβ, которое может быть связано с определенной антиметастатической активностью тритерпеновых гликозидов, выделенных из Р. graeffei (Zhao et al., 2010). Было обнаружено, что колохирозид А, выделенный из голотурии Colochirus anceps, существенно ингибировал антинеопластическую активность in vivo и in vitro, в то же время не уменьшая иммунорегуляторную функцию у мышей. Исследования цитотоксической активности колохинозида А показали выраженный цитотоксический эффект против шести типов культивируемых опухолевых клеточных линий, таких как P-388, HL60, A-549, SpC-A4, MKN-28 и SGC-7901 со значением полумаксимальной ингибирующей концентрации IC50 3,61±0,55 мг/л. Эксперименты по изучению противоопухолевой активности колохирозида А показали, что этот гликозид ингибирует рост опухолевых клеток печени линии Н22 и клеток саркомы S180 мыши. Было установлено, что колохинозид А не влияет на развитие тимуса и селезенки (Zhang et al., 2011). 20 Три тритерпеновых олигогликозид, охотозид В1, В2 и В3, были выделены из голотурии Cucumaria okhotensis вместе с известными соединениями, такими как фрондозид А, фрондозид А1, кукумариозид А2-5 и кореозид А. Охотозиды В1, В2 и В3 были умеренно токсичны в отношении клеток линии HeLa. Фрондозид А проявил большую токсичность против опухолевых клеток линий THP-1 и HeLa (с IC50 равными 4,5 и 2,1 мкг/мл соответственно). В схожих концентрациях фрондозид А понижал транскрипционную активность опухолевого супрессора р53 в неактивированных JB6-Lucp53 клетках и ингибировал формирование колоний JB6 P (+) Cl 41 клеток, активированных EGF (INCC50 = 0,8 мкг/мл) (Silchenko et al., 2008). Значительный вклад в понимание молекулярных механизмов противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов был сделан при исследовании фрондозида А и его аналогов, выделенных из голотурии Cucumaria frondosa. Была исследована хемопревентивная эффективность фронданола А5, которую оценивали на модели азоксиметан-индуцируемого рака толстой кишки крысы, используя очаги с аномальной морфологией как биомаркер опухолеобразования. Крыс содержали на диете AIN76А, включающей 5% кукурузного масла, а очаги с аномальной морфологией вызывали с помощью азоксиметана. На третий день после введения азоксиметана, начинали использовать фронданол А5. Было показано, что диета с введением 150 и 450 ррм фронданола А5 значительно подавляет формирование очагов с аномальной морфологией под воздействием азоксиметана, примерно на 34−55% в зависимости от дозы введенного препарата. После терапии крыс фронданолом А5 в очагах с аномальной морфологией была обнаружена выраженная ап-регуляция белка р21EAF1/CIP1 и даун-регуляция ядерного антигена пролиферирующих клеток, по сравнению с контрольной группой. Фронданол А5 блокировал клеточный цикл и вызывал накопление клеток в S и G2/M фазах с понижением экспрессии Cdc25c и повышением экспрессии p21WAF1/CIP1. Кроме того, препарат вызывал апоптоз, ассоциированный с фосфорилированием гистона Н2АХ и расщеплением каспазы-2 в НСТ116 клетках. Авторы пришли к выводу, что фронданол А5 обладает выраженными хемопревентивными свойствами при индуцировании рака толстой кишки (Janakiram et al., 2010). Осадок полярной фракции фронданола А5 (фронданол-А5Р) был исследован на противоопухолевую активность в отношении клеточных линий S2013 и AsPC-1 рака поджелудочной железы человека. Было показано, что фронданол-А5Р ингибировал пролиферацию и индуцировал арест клеточного цикла в фазе G2/M в обеих клеточных линиях с понижением экспрессии циклинов А и В и циклинзависимой киназы cdc25c. Фронданол-А5Р инициировал также фосфорилирование стресс-зависимой протеинкиназы, Janus-киназы (SAPK/JAK) и р38 митоген-активированной протеинкиназы (МАР) в течение 5 минут, а также 21 значительно повышал экспрессию р21waf1 матричной РНК и белка в течение 3 ч в обеих клеточных линиях. Данный эффект фронданола-А5Р снижался при использовании ингибитора р38 киназы - препарата SB203580. Кроме того, фронданол-А5Р значительно повышал связывание анексина V и активацию каспазы-3 (Roginsky et al., 2010). Было показано, что индивидуальный гликозид фрондозид А выражено ингибировал рост клеток рака поджелудочной железы и индуцировал апоптоз in vitro и in vivo. Были проведены эксперименты по сочетанному действию фрондозида А и гемцитабина на пролиферацию двух клеточный линий рака поджелудочной железы человека AsPC-1 и S2013. Для изучения возможного синергетического эффекта были использованы различные комбинации этих соединений в низких концентрациях в течение 72 ч in vitro. Ингибирование роста было значительнее при комбинировании фрондозида А и гемцитабина, чем их одиночные эффекты. В экспериментах на бестимусных мышах in vivo также использовались различные концентрации фрондозида А и гемцитабина. У животных, получавших плацебо, отмечался более быстрый рост опухоли. Во всех группах животных, получавших лечение, наблюдалось значительное снижение опухолевого роста. Наибольший эффект был при сочетанном действии самой низкой дозы гемцитабина (4 мг/кг/день) и фрондозида А (100 мкг/кг/день) (Shemaili et al., 2014). В последующих исследованиях было установлено, что фрондозид А ингибировал пролиферацию клеток рака поджелудочной железы человека AsPC-1 в зависимости от концентрации и времени инкубирования клеток с веществом. Помимо ингибирования клеточного роста фрондозид А индуцировал значительные морфологические изменения, связанные с апоптозом. Его активность приводила к повышению популяции апоптотических клеток в фазе sub-G0/G1, понижению экспрессии Bcl-2 и Mcl-1, повышению экспрессии Вах, активации каспаз-7, -3 и -9 и повышению экспрессии р21, ингибитора циклин-зависимой киназы. Эти результаты показывают, что фрондозид А индуцирует апоптоз в клетках рака поджелудочной железы человека через митохондриальный путь и активацию каспазного каскада. В очень низких концентрациях фрондозид А (10 мкг/кг/день) ингибировал рост опухоли поджелудочной железы человека AsPC-1 в бестимусных мышах (Li et al., 2008). Влияние фрондозида А на клетки линии MDA-MB-231 рака молочной железы человека было исследовано в сравнении с неопухолевой клеточной линией MCF10-A, полученной из нормального эпителия молочной железы человека, используемой в качестве контроля. Фрондозид А (0,01−5 мкМ) снижал жизнеспособность клеток рака молочной железы, в зависимости от используемой концентрации и времени инкубирования, с полуэффективной ингибирующей концентрацией ЕС50, равной 2,5 мкМ (за 24 ч). Клетки MCF10-A были более устойчивы к цитотоксическому эффекту фрондозида А (ЕС50 выше 5мкМ за 24 ч). В клетках MDA-MB-231 фрондозид А эффективно увеличивал количество опухолевых клеток в фазе sub- 22 G0 (анэуплоидные клетки) через активацию р53, каспаз-9 и -3/7 и последующую гибель клеток. Фрондозид А индуцировал также концентрационно-зависимое ингибирование MDA-MB-231, мигрирование клеток и их инвазию. В экспериментах in vivo фрондозид А (100 мкг/кг/день при интраперитонеальном введении в течение 24 дней) существенно понижал рост опухоли в бестимусных мышах без значительного токсического эффекта. Более того, фрондозид А усиливал антипролиферативный эффект паклитокселя in vivo в этой модели рака молочной железы (Al Marzouqi et al., 2011). Было проведено исследование влияния фрондозида А на выживание, миграцию и инвазию in vitro клеток немелкоклеточного рака легких человека линии LNM35, а также на опухолевый рост, метастазирование и ангиогенез in vivo, как одного, так и в комбинации с цисплатином. Фрондозид А вызывал концентрационно-зависимое сокращение жизнеспособности клеток линий LNM35, A549, NCI-H460-Luc2, MDA-MB-435, MCF-7 и HepG2 после 24 ч через активацию гибели клеток по каспаза-3/7-зависимому пути. Полумаксимальная ингибирующая концентрация IC50 (за 24 ч) составила от 0,7 до 2,5 мМ для фрондозида А. Это соединение также индуцировало время- и концентрационно-зависимое ингибирование клеточной миграции, инвазии и ангиогенеза in vitro. Фрондозид А (0,01 и 1 мг/кг/день интраперитонеально в течение 25 дней) значительно понижал рост, ангиогенез и метастазирование в лимфатические узлы немелкоклеточного рака легких человека LNM35 в бестимусных мышах без наблюдаемого токсического эффекта. Фрондозид А (0,1−0,5 мМ) также выраженно предотвращал основной и bFGF-индуцированный ангиогенез в хориоаллонтоисной мембране куриного эмбриона. Более того, фрондозид А при сочетанном действии с хемотерапевтическим препаратом цисплатином, усиливал ингибирование роста опухоли легких (Attoub et al., 2013). В следующей серии экспериментов было показано, что фрондозид А и кукумариозид А22, выделенный из C. japonica, выраженно индуцировал апоптоз в клетках лейкемии линий HL60, NB4, and THP-1. Фрондозид А-индуцированный апоптоз был более выраженным, чем кукумариозид А2-2-индуцированный. Кукумариозид А2-2-индуцированный апоптоз был каспазо-зависимым в отличие от фрондозид А-индуцированного. Это дает возможность сделать предположение, что тритерпеновые гликозиды из голотурий, в зависимости от их химической структуры, могут индуцировать апоптоз в клетках лейкемии по каспазо-зависимому и независимому пути. Было показано, что фрондозид А вызывает апоптоз в опухолевых клетках линии HL-60 и THP-1 в концентрациях 0,5–5 мкМ при инкубировании в течение 6 ч. Кукумариозид А2-2 в концентрации 3 мкМ увеличивает количество апоптотических клеток в линии HL-60 на 60–80%, в то время как кукумариозид А4-2 только на 15%. Было установлено, 23 что при инкубировании HL-60 в течение 24 ч с кукумариозидом А2-2 или А4-2 увеличивается количество клеток в стадии subG1 (Jin et al., 2009). Была изучена активность in vitro тритерпеновых гликозидов голотурий с различными химическими структурами в отношении клеточных линий лейкемии. Кукумариозиды А2-2 и А42, выделенные из C. japonica, и стихопозиды С и D из Thelenota anax в цитотоксических дозах показали способность индуцировать апоптоз в клетках лейкемии человека Hl60, THP-1, NB-4 и K562 in vitro по каспазо-зависимому механизму. Таким образом, тритерпеновые гликозиды голотурий, несмотря на различные молекулярные структуры, могут оказывать значительное влияние на опухоли человека (Jin et al., 2009; Yun et al., 2012). Новое иммуномодулирующее лекарственное средство кумазид было создано на основе тритерпеновых гликозидов, выделенных из дальневосточной голотурии Cucumaria japonica. Кумазид − это комплекс моносульфатированных гликозидов (преимущественно кукумариозид А2-2) с холестерином в приблизительном молярном соотношении 1:2 (Стоник и др., 2004). Недавно было обнаружено, что кумазид обладает значительно меньшей цитотоксической активностью в отношении эмбрионов морских ежей и клеток карциномы Эрлиха, чем индивидуальные гликозиды. Было показано, что препарат кумазид уменьшал рост асцитной формы карциномы Эрлиха при его введении по комбинированной схеме в течение 14 дней (7 дней до и 7 дней после инокуляции опухоли). Методом магнитно-резонансной томографии было установлено, что при совместном введении кумазида с известным цитостатиком 5фторурацилом значительно уменьшались размеры солидной формы карциномы Эрлиха, и скорость роста подавлялась на 43% (Aminin et al., 2010). Были изучены проапоптотическая активность и способность подавлять рост опухоли различных водорастворимых гликозидных фракций из голотурии Apostichopus japonicus. 70%этанольная фракция, полученная после очистки на колонке с макропористой смолой и фракции pSC-2 и pSC-3, очищенные на колонке с силикагелем, подавляли рост клеток рака шейки матки HeLa, клеток рака легких А-549, клеток рака желудка SGC-7901 и клеток рака печени Bel-7402. Фракции рSC-2 и SC-3, очищенные с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом LH20 с чистотой около 99,6%, имели все свойства тритерпеновых гликозидов. Очищенная SC-2 фракция подавляла рост опухолевых клеток линии HeLa, в зависимости от концентрации и проявляла выраженную цитотоксическую активность в отношении мышиной солидной опухоли S180. Было показано также, что эта фракция индуцировала апоптоз в HeLa клетках и вызывала в них фрагментацию ДНК в концентрации 10 и 50 мг/л после 12 ч обработки (Fan et al., 2009). Были исследованы молекулярные механизмы, посредством которых стихопозид С из голотурии Telenota аnax индуцировал апоптоз в опухолевых клетках. Стихопозид Синдуцированный апоптоз в клетках человеческой лейкемии и колоректальных опухолевых 24 клетках был исследован в контексте митохондриального повреждения и нарушения сигнального пути. Был исследован противоопухолевый эффект стихопозида С на бестимусных моделях с мышиной подкожной опухолью СТ-26 и HL-60 лейкемией. Было обнаружено, что стихопозид С индуцирует апоптоз в этих клетках в зависимости от дозы через активациию Fas и каспазы-8, разрушение митохондрий и активацию каспазы-3. Стихопозид С активировал кислую сфингомиелиназу (SMase) и нейтральную SMase, что приводило к образованию церамида. Специфическое ингибирование кислой или нейтральной SMase и применение миРНК частично блокировало стихопозид С-индуцированный апоптоз. Более того, стихопозид С значительно ингибировал рост опухоли в бестимусных мышах с HL-60 лейкемией и подкожной опухолью СТ-26 и повышал синтез церамида in vivo. Был сделан вывод о том, что синтез церамида под воздействием стихопозида С происходит через активацию кислой или нейтральной SMase и может способствовать индукции апоптоза и противоопухолевой активности соединения (Yun et al., 2012). Недавно методами компьютерного моделирования была исследована способность ряда природных тритерпеновых гликозидов голотурий, проявляющих цитотоксический эффект в отношении различных опухолевых клеток, взаимодействовать с топоизомеразой II альфа человека, играющей ключевую роль в репликации ДНК и являющейся мишенью для различных химиотерапевтических препаратов. Показано, что бивиттозид А, голотурин А, голотоксин А, голотуринозид А и кукумариозид А способны связываться с указанным ферментом. Были установлены сайты связывания для этих гликозидов. Все исследуемые лиганды по данным моделирования обладали противоопухолевым эффектом. Наиболее выраженным этот эффект проявлялся у кукумариозида А (Patil, Thakare, 2012). 1.1.3.2. Влияние на множественную лекарственную устойчивость Устойчивость опухолевых противоопухолевым препаратам, клеток с одновременно помощью которых ко многим проводится токсическим химиотерапия онкологических больных, несходных по химической структуре и механизму действия, достаточно давно известный феномен, получивший название множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Клетки, обладающие МЛУ или приобретающие ее в ходе химиотерапии (путем искусственного отбора под действием ядов), становятся устойчивыми к действию лекарственных средств, а их уничтожение или ингибирование их пролиферации требует использования химиотерапевтических препаратов-цитостатиков, таких как циклофосфамид, доксорубицин, винбластин, цисплатин, фторурацил, в столь больших дозах, которые зачастую несовместимы с выживанием пациентов (Северин, Родина, 2006). 25 Наиболее часто встречающимся механизмом МЛУ является активация трансмембранных транспортных белков, выводящих различные вещества из клетки. Основным белком такого типа является Р-гликопротеин (Endicott, Ling, 1989). P-гликопротеин выполняет роль насоса, который, используя энергию АТФ, может откачивать из клетки самые разнообразные вещества, включая разнообразные противоопухолевые цитостатики и цитотоксины, свободно проникающие через клеточные мембраны. В литературе отсутствуют сведения о влиянии тритерпеновых гликозидов голотурий на множественную устойчивость опухолевых клеток. В то же время существует целый ряд публикаций по изучению цитотоксических свойств ряда тритерпеноидов растительного происхождения в отношении опухолевых клеток, устойчивых к действию определенных цитостатиков. Так, недавно были опубликованы результаты исследования биологической активности серии новых природных тритерпеноидов (29-нор-циклоартанов), выделенных из листьев растения Sinocalycanthus chinensis. Была исследована цитотоксическая активность этих соединений в отношении опухолевых клеток человека линии КВ (человеческая эпидермоидная карцинома носоглотки), K562 (лейкемия), MCF-7 (карцинома молочной железы) и линии опухолевых клеток с выраженной множественной устойчивостью KB-C2 (устойчивость к колхицину), K562/Adr (линия К562, устойчивая к доксорубицину). Вся группа тестируемых тритерпеноидов оказалась малоэффективной в отношении панели опухолевых клеток, и только один тритерпеноид, синокаликанхинезин Е, проявил селективную выраженную цитотоксическую активность против линии KB-C2, обладающей МЛУ, при сочетанном действии с колхицином с IC50 = 1,51 мкг/мл. Поскольку сам по себе колхицин не проявлял ингибирующего эффекта на рост клеток линии KB-C2 при тестируемой концентрации, то было высказано предположение в пользу блокирования МЛУ опухолевых клеток тритерпеноидом синокаликанхинезином Е (Kashiwada et al., 2011). Два новых тринортритерпеноида, аглаяббревиатины А и В, и новый тетрациклический гексанортритерпен кетол, аглаяббревиатин С, были выделены из древесины дерева Aglaia abbreviate. Была исследована цитотоксическая активность этих соединений в отношении опухолевых клеток человека, таких как К562 (лейкемия), SMMC-7721 (гепатоцеллюлярная карцинома), MCF-7 (рак молочной железы) и КВ (рак эпителия ротовой полости), а также в отношении клеток с множественной устойчивостью MCF-7/ADM и KB/VCR. Аглаяббревиатины А и В были малоактивны по отношению ко всем клеточным линиям (IC50 > 10 мM), в то время как аглаяббревиатин С эффективно подавлял рост клеточной линии KB/VCR (IC50 = 1,1 мкM), в связи с чем авторы отнесли это соединение к ингибиторам МЛУ (Zhang et al., 2010). 26 Олеаноловая кислота (ОК) является пентациклическим тритерпеноидом, представленным в некоторых растениях, фруктах и овощах. ОК была описана как фармацевтический препарат для лечения нелимфотической лейкемии, и она рекомендованна в Японии при лечении рака кожи. ОК проявляет цитотоксическую активность в отношении некоторых опухолевых линий, таких как рак ротовой полости, пищевода, печени, толстой кишки, яичников, молочной железы, легких, кожи и лейкемии (Muto et al., 1990; Liu, 1995; Kim et al., 2000; Taniguchi et al., 2002; Li et al., 2002; Ovesna et al., 2006; Paszel et al., 2007; Yan et al., 2010; Shan et al., 2011). Было обнаружено, что ОК способна индуцировать клеточную гибель опухолевых клеточных линий с природной устойчивостью к химиотерапевтическим лекарствам (Lucio et al., 2011). ОК индуцировала апоптоз в клеточной линии Lucena 1, винкристинустойчивой линии, выведенной из К562, показывая различную активность в отношении клеток с МЛУ (Fernandes et al., 2003). Было обнаружено, что ОК ингибирует активность белка МЛУ ABCC1 (MRP1), но не ABCB1 (P-гликопротеин) (Braga et al., 2007). AKR1B10 является альдокеторедуктазой, которая сверхэкспрессируется в различных карциномах (Cao et al., 1998; Satow et al., 2010). Предполагается, что белок AKR1B10 вовлечен в развитие устойчивости к цитомицину С в опухолях толстой кишки человека (Liu et al., 2009). Было выявлено, что ОК ингибирует белок AKR1B10 с полумаксимальной ингибирующей концентрацией IC50 0,09 M путем селективного связывания субстрата с ферментом (Takemura et al., 2011). Таким образом, было показано, что ряд соединений тритерпеновой природы способен ингибировать МЛУ в опухолевых клетках и подавлять рост опухолевых клеток, обладающих устойчивостью к противоопухолевым средствам. 1.1.3.3. Взаимодействие тритерпеновых гликозидов с биомембранами Некоторые авторы связывают высокую биологическую активность тритерпеновых гликозидов голотурий с их выраженным мембранотропным действием, а именно с изменением проницаемости мембран и с влиянием гликозидов на различные ферментные комплексы, входящие в состав мембранолитической этих мембран. активности В настоящее тритерпеновых время гликозидов считается, лежит что их в основе способность взаимодействовать с компонентами биологических систем, в первую очередь со стеринами, входящими в структуру биомембран. В результате этого взаимодействия значительно изменяются физико-химические свойства биомембран, в том числе стабильность, избирательная проницаемость и микровязкость. При этом проницаемость биомембран, содержащих стерины, увеличивается весьма значительно. Мембранные ферменты, в особенности различные АТФазы, как правило, уменьшают свою активность из-за влияния 27 гликозидов на белок-липидные взаимодействия. Изменения в активном транспорте и образование в мембранах пор способствуют потере клетками части ионов и небольших молекул (Анисимов, 1987; Попов, 2006). Так, было показано, что при низких концентрациях (10-7 М) голотурин из Holothиria grisea и гликозиды из C. japonica ингибируют активность Са2+-АТФазы без заметного изменения проницаемости мембран. Авторы считают, что снижение АТФазной активности связано с взаимодействием гликозидов с белковыми компонентами мембран саркоплазматического ретикулума, либо с близлежащими к АТФазе липидами (Рубцов и др., 1980). Сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН подробно исследовалось ингибирование Na+,К+АТФазы мозга крыс тритерпеновыми гликозидами (Gorshkov et al., 1982). Для целого ряда тритерпеновых гликозидов морского происхождения показана их способность ингибировать активность мембранных ферментов. Установлено, что бивиттозиды А и В, стихопозид С, голотурины А, В и С, кукумариозид G1, теленотозид В, псолюсозиды А и В и ряд астеросапонинов необратимо ингибировали Na+,K+-АТФазу микросомальной фракции мозга крыс в относительно низких концентрациях с ЭД50 порядка 10-4 М. Кроме того, эти соединения оказывали существенное влияние на липидное окружение фермента, резко меняя микровязкость биомембран. Было высказано предположение, что механизм ингибирования активности фермента связан со способностью гликозидов образовывать комплексы с холестерином в липидном окружении АТФазы, что приводит к изменению конформации соответствующих белков (Gorshkovа et al., 1989; 1999; 2000). Было установлено, что в основе мембранотропного и мембранолитического действия тритерпеновых гликозидов голотурий лежит их способность взаимодействовать с 5(6)ненасыщенными стеринами, главным образом с холестерином, и формировать с ними ионпроводящие комплексы. Формирование таких комплексов приводит к изменению ионной проницаемости и избирательности биомембран, нарушению барьерных свойств и изменению ионного гомеостаза и осмолярности клеток. Это, в свою очередь, приводит в конечном итоге к лизису клеток и их гибели (Анисимов, 1987). Уменьшение мембранотропной активности гликозидов голотурий в отношении различных биологических тест-систем при добавлении в инкубационную среду холестерина является еще одним подтверждением того, что мембранотропное действие этих веществ основано на их способности образовывать комплексы со стеринами мембран. Для мембранотропного действия тритерпеновых гликозидов необходимо наличие в ланостановом агликоне 18 (20)-лактона и хотя бы одной кислородной функциональной группы в непосредственной близости от него. В углеводных цепях определяющим является линейный тетрасахаридный фрагмент, причем наиболее активны 28 гликозиды, содержащие хиновозу в качестве второго моносахаридного остатка (Калинин и др., 1994). Было проведено сравнительное изучение цитотоксической активности серии тритерпеновых гликозидов голотурий по отношению к оплодотворенным яйцеклеткам морского ежа Strongylocentrotus nudus и дальневосточной голотурии Stichopus japonicus. Установлено, что оплодотворенные яйцеклетки дальневосточной голотурии не чувствительны к действию тритерпеновых гликозидов в высоких мембранолитических концентрациях, в то время как дробление яйцеклеток морского ежа ингибировалось этими гликозидами в значительно меньших концентрациях. Установлено, что в яйцеклетках голотурий содержится свободных стеринов в 80 раз меньше, чем в яйцеклетках морских ежей. Доля свободных стеринов от общей липидной фракции у голотурии составляет 0,06%, у ежа – 4,8%. Именно низким содержанием стеринов в мембранах авторы объяснили феномен устойчивости клеток голотурий к действию собственных эндогенных и других экзогенных гликозидов (Аминин и др., 1986). При исследовании стеринзависимых свойств цитотоксических тритерпеновых гликозидов голотурий было показано, что целый ряд этих соединений проявлял выраженную ингибирующую активность в отношении роста дрожжеподобных грибов. В то же время, эти соединения оказались практически не активными по отношению к культивируемым in vitro бактериям (Kuznetsova et al., 1982; Анисимов и др., 1983; Мальцев и др., 1985). Была установлена прямая зависимость между количественным содержанием стеринов в грибах и эффективностью действия гликозидов. Отсутствие антибактериального эффекта авторы объяснили тем, что дрожжеподобные грибы содержат свободные стерины в составе цитоплазматических мембран, а бактерии не содержат (Olsen, 1973 a, b). Значение количественного содержания холестерина в биомебранах для проявления цитотоксического действия гликозидов было успешно продемонстрировано в экспериментах по включению экзогенного холестерина в состав липосомальных мембран. Было установлено, что такое «обогащение» стеринового состава мембран клеток дополнительным холестерином существенно увеличивает чувствительность опухолевых клеток к цитотоксическому действию тритерпеновых гликозидов (Попов и др., 1981). Детальное исследование механизмов стеринзависимого мембранотропного действия гликозидов активно изучалось с привлечением искусственных мембран – липосом и бислойных липидных мембран (БЛМ). Так, методом микрокалориметрии было изучено взаимодействие голотурина А с модельными мембранами липосом. Результаты этих исследований показали, что голотурин А в диапазоне концентраций от 1×10-7 до 8×10-6 М не оказывал существенного влияния на фазовый переход основного липида липосом, не содержащих стерин. Введение 29 холестерина в бислой вызывало уширение и уменьшение интенсивности пика фазового перехода липида. При добавлении голотурина А к липосомам, содержащим холестерин, происходило частичное восстановление пика. Максимальный эффект наблюдался при молярном отношении гликозид:холестерин, равном 1:2. При более высоких концентрациях гликозида интенсивность пика уменьшалась, что, по-видимому, связано с возмущающим действием гликозида, не вошедшего в комплекс с холестерином, на фазовый переход липида. Таким образом, тритерпеновые гликозиды, как показали эксперименты с голотурином А, способны образовывать комплекс со стеринами, входящими в состав мембран (Лихацкая и др., 1985). Было показано, что один из гликозидов E. fraudatrix, кукумариозид G1, нарушал ионную проводимость БЛМ из фосфатидилхолина и холестерина. Если состав БЛМ менялся на общие липиды голотурии или в стериновый состав входили стерины из голотурии, мембранолитическое действие кукумариозида не проявлялось (Аминин и др., 1990). В цикле работ Попова А.М. было изучено мембранотропное действие большого набора тритерпеновых гликозидов с использованием различных биологических и модельных липидных мембран, содержащих разнообразные стерины. Показано, что механизм действия этих гликозидов связан с образованием в мембранах различных каналов и пор. Было показано, что изменение клеточной проницаемости, вызванное действием тритерпеновых гликозидов, пропорционально связыванию гликозидов с мембранами и в значительной степени зависит от условий инкубирования: температуры, рН, ионного состава среды, а также от вида биологической модели. Определено, что для тритерпеновых гликозидов из голотурий характерен «ступенчатый» механизм нарушения проницаемости мембран, содержащих холестерин. Выявлено, что «рецепторами» исследуемых тритерпеновых гликозидов являются стерины, входящие в структуру биомембран, а способность основных природных стеринов взаимодействовать с исследуемыми тритерпеновыми гликозидами падает в ряду: холестерин, βситостерин, стигмастерин, эргостерин (Попов и др., 1983; 1984). В работах Лихацкой Г.Н. впервые были изучены ионоселективные каналы и неселективные поры, образованные гликозидами различного строения в стеринсодержащих модельных мембранах. Было проведено систематическое исследование влияния гликозидов голотурий и их производных на термотропное поведение модельных мембран и ионную проницаемость клеточных и модельных мембран. Установлена связь между химическим строением и мембранной активностью исследуемых соединений. Показана роль структуры агликона (строения и степени окисленности боковой цепи, наличие различных функциональных групп), роль размера и строения углеводной цепи (сульфатных, метильных и ацетатной групп в углеводной цепи) в проявлении мембраннолитической активности морских и 30 растительных тритерпеновых микрокалориметрии было гликозидов. показано, что Методом дифференциальной взаимодействие гликозидов сканирующей с мембранами, локализация и ориентация молекул в мембране определяются структурными особенностями агликона, строением углеводных цепей, их количеством и местом присоединения к агликону. Калориметрически показано образование комплексов одинаковой стехиометрии тритерпенового гликозида и его свободного агликона с мембранным холестерином. Было показано, что механизм изменения проницаемости клеточных и модельных мембран состоит в образовании ион-селективных каналов при действии низких концентраций гликозидов и неселективных водонаполненных пор при действии высоких концентраций. Было продемонстрировано, что свойства ионных каналов и пор, образованных в мембранах тритерпеновыми и стероидным гликозидами, зависят от структуры гликозидов и структуры стеринов (Лихацкая, 2006; 2011). Большой цикл работ по исследованию тритерпеновых гликозидов голостанового, βамиринового, даммаранового и лупанового рядов, был выполнен в ТИБОХ ДВО РАН рядом сотрудников под руководством Анисимова М.М. Было проведено масштабное изучение противомикробной активности тритерпеноидов, стероидов и их гликозидов, мембранотропной и противоопухолевой активности тритерпеновых гликозидов и биологической функции гликозидов голотурий в организме-продуценте). В исследованиях были использованы культуры различных микроорганизмов, включая патогенные бактерии и грибы, эмбрионы морских ежей и голотурий, эритроциты и опухолевые клетки теплокровных животных. Было изучено влияние на биологическую активность гликозидов разнообразных факторов, таких как композиционный состав, рН и температура инкубационной среды, концентрация тестируемых клеток, время инкубирования и способы введения гликозидов. Была изучена цитотоксическая, гемолитическая и противомикробная активность в рядах структурных аналогов природных тритерпеновых гликозидов, различающихся особенностями строения как агликона, так и углеводной части. Изучали влияние гликозидов на биосинтез стеринов, жирных кислот, белков и нуклеиновых кислот, на проницаемость биомембран для УФ-поглощающих соединений и ионов К+ (Аминин и др., 1990а; Анисимов, 1987; Анисимов и др., 1972; 1973; 1974; 1979; 1983; 1999; 2000; Анисимов, Чирва, 1980; Гришин, Анисимов, 1987; Мальцев и др., 1985; Стехова и др., 1998; Прокофьева и др., 1987; 1992; Шенцова и др., 1989; Anisimov et al.,1973, 1974; Anisimov, Chirva, 1980; Kuznetsova et al., 1982). Эти исследования позволили выявить общие закономерности связи между химическим строением и биологической активностью тритерпеновых гликозидов, как животного так и растительного происхождения, и определить основные принципы и индивидуальные особенности действия этих соединений как 31 модификаторов структурно-функциональных свойств биологических и модельных липидных мембран. Формирование комплекса гликозид-холестерин было также показано с помощью рентгеноструктурного анализа для голотурина А2 и астихопозида С. Рентгенографические исследования комплекса тритерпеновых гликозидов со свободным холестерином показали, что происходит молекулярное взаимодействие этих соединений. Так, на рентгенограмме модельного комплекса гликозид-холестерин заметно появление новых узких рефлексов и отсутствие рефлексов, характерных для дифракционных картин холестерина и гликозидов. На рентгенограммах мембранного препарата, обработанного гликозидами, появлялись рефлексы, идентичные рефлексам модельного комплекса гликозид-холестерин и характерные для каждого исследуемого гликозида. Эти эксперименты являются прямым доказательством того, что тритерпеновые гликозиды голотурий взаимодействуют с мембранным холестерином в клетках (Gorshkova et al., 1989). В то же время известно, что биологическое действие некоторых растительных гликозидов даммаранового ряда, к которым относятся гликозиды женьшеня и моноглюкозиды протопанаксадиола, не зависит от присутствия холестерина в мембране. Агликоны этих гликозидов слабо взаимодействовали с гидрофобной областью липидных мембран, не образовывали комплексы с холестерином, а гликозиды изменяли проницаемость мембран гораздо менее эффективно, чем гликозиды голотурий голостанового ряда. Ряд авторов связывает физиологические эффекты гликозидов женьшеня с определенным структурным подобием между данными гликозидами и стероидными гормонами глюкокортикоидного типа и формированием ими комплексов со стероидными рецепторами (Odashima et al., 1985; Попов и др., 1994). 32 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Исследуемые соединения Кукумариозид А2-2 из кукумарии Cucumaria japonica и фрондозид А из кукумарии Cucumaria frondosa были получены и любезно предоставлены сотрудниками лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН д.х.н., в.н.с. Авиловым С.А. и к.х.н., н.с. Сильчено А.С. Химическую чистоту препарата подтверждали методами 13 С ЯМР спектроскопии и ESI масс-спектрометрии и сравнивали с ранее опубликованными данными (Авилов и др., 1990). Структуры кукумариозида А2-2 и фрондозида А представлены на рисунке 1. O O O O O OAc O O O OH O NaO3SO CH2OH O OMe HO CH3 O CH2OH O O NaO3SO CH 2OH O OH O O OH O O O OH HO HO OH O CH 3 O O OCH 3 HO OH OH O OH O OH O OH HO HO OH OH А Б Рис. 1 - Химические структуры кукумариозида А2-2 (А) и фрондозида А (Б). 2.2. Лабораторные животные Мыши линии CD-1 весом 18–20 г были приобретены в питомнике РАМН «Столбовая» (Московская область, Россия) и в дальнейшем содержались в виварии ТИБОХ ДВО РАН при свободном доступе к воде и пище. Все эксперименты были проведены с соблюдением правил, этических норм и международных рекомендаций Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.). 33 2.3. Получение клеток 2.3.1. Получение клеток асцитной карциномы Эрлиха В экспериментах использовали музейный тетраплоидный штамм клеток мышиной асцитной карциномы Эрлиха, полученный из Всесоюзного онкологического центра РАМН (г. Москва). Клетки асцитной карциномы Эрлиха пассировали в брюшной полости мышей линии CD-1 обоего пола весом 18−20 г (Софьина, 1976). Для эксперимента клетки отбирали на 7-8 день после инокуляции опухоли. Для этого мышей забивали методом перивисцеральной дислокации и с помощью шприца собирали асцитическую жидкость, содержащую опухолевые клетки. Клетки трижды отмывали от экссудата центрифугированием при 1500 об/мин (450 g) в течение 5 мин с помощью центрифуги Heraus Labofuge 400R (Германия) в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Конечная концентрация клеток в инкубационной среде составляла 1−2×106 клеток/мл. 2.3.2. Культивирование опухолевых клеток человека В экспериментах использовали различные типы опухолевых клеток человека, в том числе клетки рака простаты РС3, клетки эмбриональной тератокарциномы NT2 и их цисплатин − устойчивую линию NT2-R, клетки эмбриональной карциномы 2102ЕР и их цисплатин − устойчивую линию 2102ЕР-R. Клетки линий РС3, NT2, NT2-R, 2102ЕР и 2102ЕР-R выращивали при стандартных условиях (370С, 5 % СО2) в среде DMEM (Lonza, Бельгия) или RPMI-1640 (Gibco by Life Technologies, США), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, США) и 1 % пенициллин-стрептомицина (Gibco by Life Technologies, США). 2.4. Определение жизнеспособности клеток 2.4.1. Определение цитотоксической активности (окрашивание трипановым синим) Цитотоксическое действие исследуемых веществ определяли при помощи прижизненного красителя трипановый синий. Для эксперимента брали 96-луночные планшеты, в каждую лунку добавляли 20 мкл раствора исследуемого вещества и 200 мкл суспензии клеток, после чего ставили планшеты в термостат на 1 ч при 370С. После инкубирования отбирали по 20 мкл суспензии клеток из лунки, наносили на обезжиренное предметное стекло, добавляли 20 34 мкл раствора красителя трипановый синий (Flow, США, концентрация 0,4 %), накрывали покровным стеклом, помещали на предметный столик микроскопа AXIO Imager A1 (Zeiss, Германия) и фотографировали клетки с помощью цветной CCD видеокамеры (AxioCam MRc, Zeiss, Германия). Подсчет живых (неокрашенных) клеток и погибших (окрашенных трипановым синим) клеток производили при помощи программы Image Tool Version 3.00 (UTHSCSA, США). Цитотоксическую активность вещества выражали как концентрацию ЕС50, при которой количество погибших клеток равно 50%. 2.4.2. Измерение активности неспецифической эстеразы Активность неспецифической эстеразы в клетках АКЭ определяли с помощью флуоресцентного зонда флуоресцеин диацитат (Fluorescein diacetate, FDA) на клетках асцитной карциномы Эрлиха. Во все лунки 96-луночной планшеты добавляли по 20 мкл растворителя (0,9% NaCl), 20 мкл исследуемых веществ и 200 мкл суспензии клеток. Ставили в термостат на 24 ч при 370С. Затем добавляли зонд FDA (200 мкг/мл), и инкубировали при 370С 15 мин. После чего измеряли флуоресценцию при λеx = 485 нм, λеm = 518 нм с помощью спектрофлуориметра планшетного формата Fluoroskan Ascent (Thermo Labsystems, Финляндия). Цитотоксическую активность вещества выражали как концентрацию ЕС50, при которой активность фермента эстераза клеток ингибируется на 50% . 2.4.3. Определение цитотоксической активности (МТТ тест) Цитотоксическую активность исследуемых соединений определяли методом МТТ. В лунки 96-луночной планшеты вносили по 20 мкл раствора тестируемого соединения различных концентраций и по 200 мкл клеточной суспензии (7 х 103 клеток/лунку), и затем инкубировали в течение 24 ч или 48 ч при 370C и 5% CO2. После инкубирования отбирали по 200 мкл супернатанта и добавляли по 100 мкл чистой среды. Затем по 10 мкл раствора MTT (Sigma, США, 5 мкг/мл в ФСБР) добавляли в каждую лунку и инкубировали 4 ч, после чего добавляли по 100 мкл раствора SDS-HCl и инкубировали при 370C на протяжении 4-18 ч. Поглощение измеряли при длине волны 570 нм с помощью спектрофотометра Wallac 1420 Victor (PercinElmer, США) или Multiskan FС (Thermo Scientific, Канада). Цитотоксическую активность вещества выражали как концентрацию ЕС50, при которой метаболическая активность клеток ингибируется на 50%. 35 2.5. Определение индукции апоптоза 2.5.1. Изучение инверсии фосфатидилсерина Суспензию клеток асцитной карциномы Эрлиха инкубировали в 24-луночных планшетах в среде RPMI-1640, содержащей раствор L-глютамина (2 мM), гентамицина (50 мкг/мл) и раствор кукумариозида А2-2 или фрондозида А. Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе при 370С на протяжении определенного времени (1−24 ч). Для измерения количества фосфатидилсерина на поверхности клеток использовали стандартные тест-наборы (ApoTarget™ Annexin-V FITC Apoptosis Kit, Molecular Probes, США). Процедура измерения проводилась согласно протоколу производителя. После инкубирования клетки осаждали путем центрифугирования при 1500 об/мин 5 мин и полученный осадок ресуспендировали в Annexin V связывающем буферном растворе (100 мкл), содержащем 10 мМ HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 мM NaCl, 2.5 мM CaCl2. Затем аликвоту (100 мкл) клеточной суспензии помещали в пробирку для FACS анализа, добавляли 5 мкл раствора зонда Annexin V-FITC и 5 мкл раствора зонда PI, и инкубировали при комнатной температуре в темноте 15 мин. Анализ клеток, вступивших в апоптоз, проводили методом проточной флуоресцентной цитометрии на лазерном клеточном анализаторе FACS Calibur (“Becton Dickinson”, США), используя программное обеспечение BD CellQuest Pro. Процентное содержание апоптотических клеток определяли по двумерному графику (дот-плот) с использованием программы WinMDI 2.9 (Joseph Trotter), рассчитывая количество клеток с увеличенным содержанием фосфатидилсерина на поверхности мембран, интенсивно окрашиваемых зондом Annexin V-FITC (ранний апоптоз) и клеток, одновременно интенсивно окрашиваемых зондами Annexin V-FITC и PI (поздний апоптоз/некроз). 2.5.2. Исследование индукции апоптоза в клетках асцитной карциномы Эрлиха с помощью флуоресцентных зондов PI и Hoeсhst 33342 После инкубирования клеток асцитной карциномы Эрлиха с исследуемыми веществами в 96-луночных планшетах в течение определенного времени в каждую лунку добавляли по 20 мкл раствора зонда Hoeсhst 33342 (Molecular Probes, США, 10 мкМ конечная концентрация). Затем к этой суспензии клеток добавляли раствор PI (Molecular Probes, США, 50 мкг/мл конечная концентрация). Микропланшеты ставили на инкубирование в течение 10 мин в термостат при 370С. Затем отбирали по 100 мкл суспензии в камеру для анализа изображения клеток и анализировали флуоресценцию клеток с помощью инвертированного флуоресцентного 36 микроскопа Axiovert 200 (Zeiss, Германия), объектив Fluar 40×/1.30 Oil, с использованием системы регистрации флуоресценции клеток (Cairn Research Ltd., Англия). Флуоресценцию зондов Hoeсhst 33342 и PI в клетках вызывали облучением при λex = 352 нм и λex = 536 нм, и набора фильтров FITC и Tex Red filter-block (Chroma Technology Corp., США), соответственно. С помощью программного обеспечения AQM Advance 6 software (Kinetic Imaging Ltd., Англия) и Imaging Tools 3.00 (UTHSCSA, США) рассчитывали количество клеток, у которых наблюдалась конденсация и фрагментация хроматина в ядрах (интенсивная синяя флуоресценция), и количество некротических клеток с ядрами, интенсивно флуоресцирующими в красной области. Для расчета во внимание принимали флуоресценцию порядка 100 случайно выбранных клеток (Belloc et al., 1994). 2.5.3 Определение каспазы-3 и -9, PARP-1 Для измерения концентрации каспазы-3 в цитоплазме клеток использовали стандартные тест-наборы (EnzChek. Caspase-3 Assay Kit #1, Molecular Probes, США). Процедура измерения проводилась согласно протоколу производителя. Суспензию клеток асцитной карциномы Эрлиха (1×106 клеток/мл) инкубировали в 24-луночных планшетах в среде RPMI 1640, содержащей раствор L-глютамина (2 мM), гентамицина (50 мкг/мл), и раствор кукумариозида А2-2 или фрондозида А в концентрациях 0,001−1 мкM. Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе при 370С на протяжении определенного времени. Затем опухолевые клетки собирали и отмывали методом центрфугирования (1500 об./мин при 40С, 5 минут) в ФСБР. Для разрушения клеточных мембран готовили лизирующий буферный раствор: добавляли 50 мкл 20× Cell Lysis Buffer (компонент С из набора) к 950 мкл дист. H2O. Затем ресуспендировали каждый клеточный образец и контроли в 50 мкл лизирующего буферного раствора. Для оптимального лизиса клетки инкубировали на льду ~ 30 минут. Лизированные клетки центрифугировали при 5000 об/мин 5 минут для удаления гранул и клеточного дебриса, и 50 мкл супернатанта переносили от каждого образца в лунки 96-луночной планшеты черного цвета (Microtiter) для измерения флуоресценции. В каждую лунку к образцам добавляли по 50 мкл раствора, содержащего заранее приготовленный реакционный буферный раствор и 10 мM субстрата ZDEVD-AMC (из набора). Планшеты инкубировали 30−60 минут при комнатной температуре в темноте, а затем проводили измерение флюоресценции образцов при параметрах λex = 355 нм и λex = 460нм с использованием флуоресцентного фотометра планшетного формата Fluoroskan Ascent (Thermo Labsystems, Финляндия). Для определения белков каспазы-3, -9, и PARP-1 методом вестерн-блоттинга клетки различных линий были посеяны на чашках Петри в количестве 1×106 в 5 мл полной ростовой 37 среды и поставлены в СО2 инкубатор на 24 ч для адгезии. После чего среда была заменена на свежую с добавлением веществ в исследуемых концентрациях. Через 24 ч или 48 ч клетки обрабатывали раствором Трипсин-ЭДТА (Gibco by Life technologies, США) и отмывались ФСБР три раза. Далее клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл лизирующего буферного раствора (0,88% NaCl, 50 мM Tris-HCl (pH 7.6), 1% NP-40, 0,25 % NaClO2, 1 мM PFMS, 1 мM Na3VO4) и инкубировали 40 мин на льду, после чего оставляли на ночь при -200С. Лизированные клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин, 14000 об/мин и 40C. Концентрация белков была измерена по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Образцы с белками были нагреты до 990С в течение 5 мин. Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лаэммли (Laemmli, 1970) в 10%-ном ПААГ при напряжении 80 В первые 30 мин и при 120 В оставшееся время. После электрофоретического разделения белки были перенесены из геля на PVDF мембрану (0,45 µm, Millipore Corporation, США) при 25 В в течение 1 ч с помощью аппарата Trans-blot SD Semi-dry transfer cell (Bio-rad, США). Перед инкубированием с первичными антителами в течение ночи при 40С мембрана была заблокирована при помощи 5%-ного раствора БСА в 0,05%-ном растворе TBS-Tween 20 в течение 1 ч. Затем мембрану отмывали от первичных антител раствором TBS-Tween 20 три раза по 5 мин и инкубировали в течение 1 ч со вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена при комнатной температуре. После чего к мембранам добавляли по 1 мл растворов Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo scientific, США), прикладывали рентгеновскую пленку СL-XPosureТМ Film 5x7 inches (Thermo scientific, США), и сигнал был визуализирован на рентгеновской пленке после ее проявления при помощи проявочной машины (AGFA CP 1000, Германия). Зоны интересующих белков определяли с использованием первичных поликлональных и моноклональных антител: поликлональные кроличьи антитела против PARP-1, титр 1:1000 (Cell signaling, США); моноклональные кроличьи антитела против каспазы-3, титр 1:1000 (Cell signaling, США); моноклональные мышиные антитела против каспазы-9, титр 1:1000 (Cell signaling, США); поликлональные кроличьи антитела против ГАФД (Abcam, США). Использовали вторичные козьи антитела, меченные пероксидазой хрена, против кролика, титр 1:5000 (Abcam, США) и вторичные кроличьи антитела против мыши, титр 1:10000 (Abcam, США). 38 2.5.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии В экспериментах использовали клетки мышиной асцитной карциномы Эрлиха в конечной концентрации 2-5×106 клеток/мл. 1 мл клеточной суспензии добавляли в лунки 24-луночной пластиковой культуральной планшеты, содержащие 0,1 мл водного раствора тестируемого вещества. Планшеты встряхивали и инкубировали в CO2-инкубаторе при 370С в течение 24 ч. Для индукции клеточной деструкции клетки инкубировали в культуральной среде DMEM, содержащей L-глютамин (2 мМ), FВS (эмбриональная телячья сыворотка,10%), гентамицин (100 мкг/мл) и кукумариозид А2-2 (0,1 мкM). Через 24 ч суспензию клеток отбирали, переносили в пробирки типа эппендорф и осаждали центрифугированием при 1500 об/мин (400 g) в течение 5 мин. Для микроскопического анализа клетки фиксировали в 2,5%-ом глютаральдегиде на 0,1 М какодилатном буфере. После фиксации клетки были помещены в 1×ФСБР. Для изучения клеточной суспензии методом фазово-контрастной микроскопии использовался микроскоп Axiovert 200M Apotome (Zeiss, Германия). Для исследования методом сканирующей электронной микроскопии суспензию клеток помещали на поверхность покровных стекол Thermanox Plastic Coverslips (США), выдерживали до их оседания 30 мин и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне. После этого образцы окончательно высушивали в диоксиде углерода, используя прибор фирмы BAL-TEC (critical point dryer 030, Германия), помещали на поверхность алюминиевых столиков и напыляли углеродом. Анализировали образцы на сканирующем электронном микроскопе EVO 40 (Zeiss, Германия). Для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии клеточная суспензия была дофиксирована в 2%-ом растворе OsO4 на 0,1 М какодилатном буфере. После обезвоживания в спиртах и ацетоне материал заключали в Аралдит. Ультратонкие срезы толщиной 80 нм были получены с использованием ультрамикротома Ultracut UC6 (Leica, Германия) и помещены на медные бленды, покрытые формваровой подложкой. Срезы окрашивали растворами уранилацетата и цитрата свинца и изучали в электронном микроскопе Libra 120 (Zeiss, Германия). 2.5.5. Исследование влияния на активность белка р53 Для этой работы использовалась двугибридная дрожжевая тест-система MATCHMAKER Two-Hybrid System 3, сконструированная согласно протоколу фирмы Клонтек (Clontech, США). С этой целью использовали штамм Saccharomyces cerevisiae Y187 (MATα, ura3-52, his3-200, 39 ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, MEL1, URA3::GAL1UAS –GAL1TATA-lacZ) и плазмиды pGBKT7-53 и pGADT7-T, экспрессирующие мышиный р53 и SV40 large T-antigen, соответственно (Kovalchuk et al., 2006). Трансформацию дрожжевых клеток плазмидами проводилисогласно ранее опубликованной работе с использованием литий-ацетатного метода, а отбор колоний, трансформированных экспрессирующими плазмидами, проводили на чашках с селективными средами, дефицитными по аминокислотам в соответствии с вводимыми плазмидами. Определение активности β-галактозидазы, экспрессируемой в дрожжевых клетках, трансформированных плазмидами, под действием тестируемых химических соединений с использованием ONPG (О-нитрофенил-β-D-галактозида) в качестве субстрата проводили согласно протоколу фирмы Клонтек (Clontech, США). Культуру дрожжевых клеток (250 мкл) смешивали с раствором тестируемого соединения (2,5 мкл) и инкубировали 4 ч при 300C. Затем отбирали 150 мкл суспензии дрожжевых клеток для измерения оптической плотности (O.D.600). Оставшиеся клетки отмывали в Z-буферном растворе (0,1 М фосфат натрия, pH 7.0, 10 мМ KCl, 1 мМ MgSO4 и 0,27% β-меркаптоэтанол) и дезинтегрировали в жидком азоте путем процедуры замораживания-оттаивания. Клеточный лизат смешивали с 4 мг/мл ONPG (40 мкл) и после появления желтого окрашивания раствора (обычно через 30 мин) останавливали реакцию добавлением 1 M Na2CO3 (100 мкл). Аливоты (150 мкл) помещали в 96-луночные микропланшеты и измеряли поглощение при 420 и 570 нм с помощью спектрофотометра планшетного формата µQuant (Bio-Tek Instruments, США). Активность β-галактозидазы подсчитывали по формуле: U=1000 × (O.D.415 - 1.75 × O.D.570 / (O.D.600 × V × t), где t – время реакции, мин; V – объем культуры дрожжей, мл; O.D.600 – плотность суспензии в начале эксперимента; O.D.415 – поглощение O-нитрофенола в конце реакции; O.D.570 – дисперсия суспензии в конце реакции. 2.6. Исследование клеточного цикла 2.6.1. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии В работе использовались клетки асцитной карциномы Эрлиха, выделенные на 7 день после инокуляции опухоли. Клетки отмывали центрифугированием при 1500 об./мин, 40С, 5 мин и ресуспендированием в ФСБР (рН 7,4). Конечный осадок клеток ресуспендировали в культуральной среде RPMI-1640 в концентрации 1×106 кл/мл. Затем переносили по 1 мл 40 суспензии клеток в лунки 24-луночной планшеты (Orange Scientific, ЕС), содержащие по 100 мкл водного раствора исследуемых соединений, взятых в концентрации 0,001–1 мкМ. Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе при 370С в течение 24 ч. Анализ клеточного цикла с помощью проточной цитофлуориметрии проводили согласно протоколу фирмы Cytometry Research, LLC (США). С этой целью клеточную суспензию переносили в полистироловые пробирки для проточной цитофлуориметрии и центрифугировали при 1500 об./мин, 40С. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл ФСБР, центрифугировали 1500 об./мин, 40С и ресуспендировали в 0,3 мл ФСБР. Для фиксации клеток, аккуратно вводили 0,7 мл холодного этанола (70%) по каплям в 0,3 мл суспензии клеток в ФСБР при перемешивании. Оставляли клетки на 1 ч на льду (или на несколько дней при 40С). Затем клетки отмывали от этанола центрифугированием при 1500 об./мин, 40С, 5 мин, 2 раза, ресуспендировали клетки в 0,25 мл ФСБР, добавляли 5 мкл фермента РНКаза A (Fermentas, Латвия, исходная концентрация 10 мг/мл) и инкубировали 1 ч при 370С. Затем добавляли 10 мкл иодида пропидия (Sigma-Aldrich, США, исходная концентрация 1 мг/мл). Клеточную суспензию хранили в темноте и при 40С до анализа. Анализировали на проточном цитофлуориметре FACScalibur (Becton-Dickinson, США) при возбуждении 488 нм в канале FL2. Оценку гистограмм проводили с помощью программы WinMDI 2.9 Ink (США). Кроме того, исследовали клеточный цикл опухолевых клеток человека линии РС3. Клетки в количестве 2х106 кл/мл высевали на чашки Петри в полной ростовой среде и инкубировали 24 ч для адгезии (5% СО2, 370С). После чего меняли среду и добавляли растворы веществ в разных концентрациях по 100 мкл и ставили в инкубатор на 48 ч. Затем клетки обрабатывали раствором трипсин-ЭДТА (Gibco by Life technologies, Канада), подсчитывали общее количество клеток и отбирали по 1×106 клеток из каждой пробы. Клеточный осадок ресуспендировали в 300 мкл холодного фосфатно–солевого буферного раствора (ФСБР), фиксировали в 700 мкл 100%-ного этилового спирта и оставляли на 24 ч при -200С. Далее клетки дважды отмывали от этанола и ресуспендировали в 200 мкл раствора иодида пропидия (Sigma-Aldrich, США, 5 мг/мл в ФСБР), РНКаза 20 мг/мл (Carl Roth, Германия). Затем клетки переносили в пробирки для проточной цитометрии и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Перед анализированием к суспензии клеток добавляли по 500 мкл холодного ФСБР. Исследование проводили с помощью проточного цитометра FACScalibur (Becton Dickinson, США) при возбуждении 488 нм в канале FL2. Оценку гистограмм проводили с помощью программы WinMDI 2.9 Ink (США). 41 2.6.2. Определение включения 3Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток Клетки асцитной карциномы Эрлиха ресуспендировали в среде RPMI-1640 (2×106 кл/мл), содержащей L-глютамин 2 мМ и гентамицин 100 мкг/мл. Затем 1 мл суспензии вносили в лунки 24-луночных плоскодонных планшет (Nunс), содержащих 100 мкл раствора тестируемых соединений и инкубировали планшеты при 370С в атмосфере 5% СО2 в течение 24 ч. За 2−4 ч до окончания инкубирования в каждую лунку вносили 20 мкл раствора метил-3Нтимидина в конечной концентрации 2 мкКи/мл. По окончании инкубирования в каждую лунку добавляли по 200 мкл холодного раствора 50%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ, 10% конечная концентрация) и клетки оставляли на холоду для преципитации в течение 30 мин. Далее суспензию фильтровали через стекловолоконные фильтры MGB (Munktell Filter AB, Швеция), фильтры трижды промывали раствором ледяной 5%-ной ТХУ, дважды дистиллированной водой и однократно 96%-ным этиловым спиртом. Фильтры высушивали, переносили в сцинциляционные флаконы с 3 мл сцинциляционной жидкости Ultima Gold AB (PerkinElmer, США) и производили подсчет включения радиоактивной метки с помощью сцинтилляционного счетчика Tri-Carb 2800 TR liquid scintillation counter (PerkinElmer/Packard, США). Результаты экспериментов подсчитывали в импульсах в минуту (cpm) и затем выражали как процент от контрольного уровня включения радиоактивно-меченого тимидина в ДНК (Адамс, 1983; Вильсон, 1989). 2.7. Исследование колониеобразования опухолевых клеток Опухолевые клетки репродуктивной сферы человека высевали на маленькие чашки Петри d=35 мм, в концентрации 3×105 в 5 мл среды и инкубировали 24 ч для адгезии при 5%, СО2, 370С. После чего в клетки добавляли растворы исследуемых соединений по 50 мкл в различных концентрациях и помещали в СО2 инкубатор на 48 ч. Затем клетки обрабатывали трипсином (0,25% трипсин в 1 мM растворе ЭДТА, Gibco by Life technologies, США) и отмывали центрифугированием 5 мин, 1500 об/мин. Далее клетки ресуспендировали в ФСБР на холоду, считали количество живых и мертвых клеток с помощью автоматического счетчика клеток ViCell (Beckman coulter, США) и высевали в 6-луночные планшеты в концентрации 100 живых клеток в 3 мл полной ростовой среды. После 10 дней инкубирования отбирали среду, фиксировали клетки 1 мл метанола в течение 25 мин, промывали ФСБР, высушивали и добавляли 1 мл раствора Гимза (Merck, Германия), инкубировали 25 мин при комнатной температуре и промывали дистиллированной водой. Затем клетки высушивали на воздухе и считали количество колоний. Результаты выражали в количестве выросших колоний на лунку. 42 2.8. Определение множественной устойчивости 2.8.1. Исследование блокирования множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM Клетки асцитной карциномы Эрлиха в концентрации 5×105 кл/мл по 100 мкл добавляли в каждую лунку 96-луночной планшеты, содержащей 50 мкл исследуемых веществ в концентрации от 0,04 мкг/мл до 120 мкг/мл и инкубировали в течение 15 мин при 370С. Затем добавляли по 50 мкл зонда Calcein AM (Molecular Probes, США, 0,25 мкМ конечная концентрация) и инкубировали 15 мин при 370С. После чего планшеты центрифугировали по 5 мин при 40С, 1500 об./мин 3 раза, каждый раз сливая супернатант и добавляя по 200 мкл культуральной среды в каждую лунку. Измеряли флуоресценцию с помощью спектрофлуориметра планшетного формата Fluoroscan Accent (Финляндия) при λеx = 494 нм, λеm = 517 нм. 2.8.2. Изучение динамики накопления доксорубицина в клетках асцитной карциномы Эрлиха В эксперименте использовались клетки асцитной формы карциномы Эрлиха, полученные на 7 день после инокуляции, в конечной концентрации 2 млн/мл. К 1 мл клеток добавляли по 100 мкл раствора кукумариозида А2-2 (финальная концентрация 0,001–0,1 мкМ) и ставили в термостат при 370С на 30 мин. Затем добавляли по 100 мкл раствора доксорубицина (Фармахеми Б.В., Нидерланды, финальная концентрация 5 мкМ). После чего измеряли динамику изменения флюоресценции клеток в течение 2-х часов с помощью конфокального микроскопа LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия) в режиме реального времени. Клетки облучали светом с длиной волны λex = 470 нм, флуоресценцию регистрировали при λem = 590 нм. 2.8.3. Исследование выброса доксорубицина из опухолевых клеток Для исследования удерживания доксорубицина в клетках асцитной карциномы Эрлиха под действием кукумариозида А2-2 клетки АКЭ ресуспендировали в среде RPMI-1640 в концентрации 2×106 кл/мл и переносили в 24-луночную планшету. В каждую лунку добавляли различные концентрации кукумариозида А2-2 (0,001–0,1 мкМ) и инкубировали при 370С в течение 30 мин для блокирования МЛУ. Затем вносили доксорубицин (5 мкМ конечная 43 концентрации) и инкубировали еще 2 ч при 370С для накопления доксорубицина в клетках. Через 30, 60 и 120 мин отбирали аликвоты по 100 мкл суспензии клеток в эппендорфы, осаждали центрифугированием и отмывали дважды холодным ФСБР. Далее переносили суспензию клеток по 100 мкл в черную планшету и измеряли флуоресценцию доксорубицина с помощью спектрофлуориметра планшетного формата Fluoroscan Accent (Финляндия) при λex = 485 нм и λem = 620 нм. 2.9. Протеомный анализ РС3 клеток (2D-PAGE) Эксперименты по анализу экспрессии белков с помощью протеомного подхода были проведены на клетках линии РС3 методом двумерного электрофореза (2D-PAGE) и последующего анализа структуры белков методом масс-спектрометрии. Клетки были высеяны во флаконы в концентрации 5×106 в 30 мл полной ростовой среды и поставлены на 24 ч в СО2инкубатор для адгезии. Затем к клеткам добавляли растворы тритерпеновых гликозидов, и клетки инкубированли в течение 48 ч. После чего клетки собирали и дважды отмывали центрифугированием в растворе ФСБР. Клеточный осадок ресуспендировали в 500 мкл лизирующего буфера следующего состава: 9 M мочевина, 4% CHAPS (Sigma Aldrich, США), 1% Pharmalyte (Sigma Aldrich, США), 1% DTT, бромфеноловый синий 10 мкг/мл) и оставляли на ночь при -200С. Затем образцы были осаждены центифугированием 10 мин, 40С, 14000 об/мин и аликвоты объемом 450 мкл с 1 мг белков были нанесены на стрипы для изоэлектрофокусирования (Immobiline Dry Strip pH 4−7, 24 cm, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Швеция) на 24 ч для регидратации при комнатной температуре. Далее было проведено первое разделение с помощью прибора для изоэлектрофокусирования Protean IEF cell (Bio-Rad, Hercules, CA, США). После первого разделения стрипы были уравновешены в растворе 1% DTT с добавлением 6 M мочевина, 4% SDS, 50 мM Tris-HCl pH 8,8 в течение 15 мин, а затем алкилированы с помощью 4,8%-ного раствора йодацетамида в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее стрипы были перенесены в 15% SDS-PAGE гель (27 cм × 21 cм × 1.5 мм) и покрыты раствором 0,6%-ной агарозы. Второе электрофоретическое разделение было проведено в SDS-буферном растворе следующего состава: 1,44% глицин, 0,3% Tris base, 0,1% SDS при 200С в течение 14 ч. Гели были зафиксированы и окрашены раствором кумасси: 400 мл/гель, содержащий 0,13% Coomassie Brilliant Blue G 250 (Thermo scientific, США), 3,6% H2SO4, 1,44 M NaOH, 20,3% CCl3COOH) в течение ночи, после чего гели были отмыты dН20 трижды. Гели были отсканированы с помощью денситометра GS-800 Calibrated Densitometer (Bio-Rad, США). Оптическую плотность сигналов белковых пятен на гелях анализировали с помощью программного обеспечения Delta 2D 4.0 (Decodon, Германия). Пятна белков, 44 количественное содержание которых менялось в экспериментальных гелях по отношению к контрольным в два и более раза, вырезали из гелей и направляли для установления структуры белков методом MALDI-TOF-MS/MS в аналитическую лабораторию протеомики (Department of Medical Biochemistry and Molecular Biology, University of Greifswald, г. Грайсфальд, Германия). 2.10. Верификация белков (2D-вестерн-блоттинг) Двумерный вестерн-блоттинг (2D-вестерн-блоттинг) применяли для подтверждения результатов 2D-PAGE электрофореза. Аликвоты белковых экстрактов, содержащие по 30 мкг белка, разбавляли с помощью 2D-PAGE-лизисного буферного раствора до объёма 125 мкл, а затем загружали на иммобилизированные pH-градиентные (IPG) полоски Immobiline Dry Strip (pH 4−7, 7 см, GE Healthcare Bio-sciences, Швеция). IPG полоски инкубировали в течение ночи при комнатной температуре для регидратации. Далее IPG полоски подвергали изоэлектрическому фокусированию (IEF) с использованием ячейки Protean IEF (Bio-Rad, Германия). Разделение белков в первом измерении (изоэлектрическая фокусировка) проводили последовательно в 4 стадии: 1−30 мин при 500 В; 2−5 кВ/ч при 5 кВ («линейная фокусировка»); 3−5 кВ/ч при 5 кВ («быстрая фокусировка»); 4−2 ч при 500 В. После стадии IEF, IPG полоски хранили при -800C. После первого разделения стрипы были уравновешены в растворе 1% DTT с добавлением (6 M мочевина, 4% SDS, 50 мM Tris-HCl pH 8,8) в течение 15 мин, а затем алкилированы с помощью 4,8%-ного раствора йодацетамида в течение 15 мин при комнатной температуре и загружали на SDS-полиакриламидные гели, содержащие 15% акриламида и приготовленные, как описано для Вестерн-блоттинга, но без концентрирующего геля. Маркер (Spectra multicolor Broad Range Protein Ladder, Fermentas, Финляндия) в количестве 10 мкл наносили на фильтровальную бумагу 0,5 см2, помещали на гель рядом с IPG полоской и заливали 0,6% раствором агарозы в dH2O, содержащей 0,001% (w/v) бромфенолового синего в качестве красителя. Разделение белков проводили в камере для электрофореза Mini-PROTEAN 3 (Bio-Rad, США) в буферном растворе для разделения белков в полиакриламидном геле. Электрофорез проводили ~ 3 ч при 65 В при комнатной температуре до необходимой степени разделения белков, контролируемой по маркеру. Последующий перенос белков на мембрану, блокирование мембраны, инкубирование с первичными и вторичными антителами, а также детектирование сигнала выполняли так же, как описано для одномерного вестерн-блоттинга (см. п. 2.5.3). Полиакриламидные гели после стадии переноса окрашивали коллоидным раствором кумасси бриллиантового синего G-250 (20 мл/гель), с последующей отмывкой dH2O, 45 как описано для 2D-PAGE (см. п. 2.10). После отмывки гели сканировали с помощью сканера GS-800 Calibrated Densitometer (BioRad, США). Цифровые картинки гелей использовали в качестве контроля загрузки одинакового количества белка для метода 2D-Вестерн-блоттинга. Относительную оптическую плотность сигналов белковых пятен количественно анализировали с помощью программы Bio 1D 15.01 (Vilber Lourmat, Франция). 2.11. Функциональный анализ белков методами биоинформатики Для поиска функций белков использовали следующие базы данных: UniProtKB/Swiss-Prot Ontology (http://www.uniprot.org); Consortium GeneCards (http://www.genecards.org); (http://www.geneontology.org); Bioinformatic Gene Harvester (http://www.embl.de/services/bioinformatics); PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed). Анализ клеточных функций белков (GO, Gene Ontology, cellular components) опухолевых клеток выполнен с помощью программного пакета Cytoscape 2.5.1 и приложения BiNGO 2.0 (Maere et al., 2005). 2.12. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида А2-2 в экспериментах in vivo В эксперименте использовали мышей линии CD-1 весом 20−22 г, по 6−7 мышей в группе. В первой серии экспериментов мышам внутрибрюшинно вводили клетки асцитной карциномы Эрлиха (20×106 клеток на мышь). Водный раствор кукумариозида А2-2 в комплексе с холестерином в молярном соотношении 1:2 для уменьшения цитотоксического эффекта гликозида (Aminin et al., 2010) вводили внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл в дозе 0,2 мкг/мышь в течение 7 дней до и 7 дней после инокуляции опухоли (комбинированная схема). В следующей серии экспериментов животным внутрибрюшинно вводили 2×106 клеток карциномы Эрлиха на мышь. Препарат вводили внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл в дозе 0,2 мкг/мышь (за 4 и 1 день до и на 1-й и 4-й день после инокуляции опухоли, комбинированная схема). В обоих экспериментах формировали 2 группы животных: 1 группа – контрольная. В данной группе животным вводили по 0,5 мл дистиллированной воды; 2 группа – экспериментальная. В данной группе животным вводили по 0,5 мл водного раствора кукумариозида А2-2. Наблюдение за животными продолжали на протяжении 30−40 дней. Противоопухолевый эффект оценивали по числу мышей с отсутствием опухоли (оценка на 10-ые сутки визуально), 46 по средней продолжительности жизни (СПЖ, сутки) и по увеличению средней продолжительности жизни (УПЖ, %). 2.13. Влияние кукумариозида А2-2 на противоопухолевую активность доксорубицина в экспериментах in vivo Влияние кукумариозида А2-2 на противоопухолевую активность доксорубицина проводили используя метод Доненко с соавторами (Donenko et al., 1991) с небольшими модификациями. Клетки асцитной карциномы Эрлиха инокулиловали в концентрации 2×106 клеток на животное внутрибрюшинно мышам линии CD-1. На следующий день мышам вводили водный раствор кукумариозида А2-2 внутрибрюшинно, ежедневно, на протяжении 5 дней, в объеме 0,5 мл, в дозе 0,2 мкг/мышь (10 мкг/кг). Контрольная группа мышей получала такой же объем физиологического раствора. Через 7 дней мышей умертвляли, выделяли опухолевые клетки и после подсчета концентрации клеток и определения их жизнеспособности инокулировали клетки последующим группам мышей внутрибрюшинно в концентрации 2×106 клеток на животное. Через 24 ч начинали противоопухолевую терапию доксорубицином в дозе 2 мг/кг, через день всего три раза. В эксперименте формировали 4 группы животных по 5 мышей в группе: 1 группа – контрольная. Данной группе животных были инокулированы интактные опухолевые клетки. Животным вводили по 0,5 мл физиологического раствора; 2 группа – контрольная. Данной группе животных были инокулированы опухолевые клетки после предварительной обработки кукумариозидом А2-2. Животным вводили по 0,5 мл физиологического раствора; 3 группа – экспериментальная. Данной группе животных были инокулированы интактные опухолевые клетки. Животным вводили по 0,5 мл раствора доксорубицина; 4 группа – экспериментальная. Данной группе животных были инокулированы опухолевые клетки после предварительной обработки кукумариозидом А2-2. Животным вводили по 0,5 мл раствора доксорубицина. Наблюдение за животными продолжали на протяжении 70 дней. Противоопухолевый эффект оценивали по числу мышей с отсутствием опухоли (оценка на 10-ые сутки визуально), по средней продолжительности жизни (СПЖ, сутки) и по увеличению средней продолжительности жизни (УПЖ, %). 47 2.14. Статистический анализ Полуэффективные концентрации (ЕС50), средние значения, средняя ошибка эксперимента и среднеквадратичные отклонения, а также определение статистически значимой достоверности различий между группами данных рассчитывались с помощью программы SigmaPlot 3.02 (Jandel Corporation, США). Статистически значимыми считали различия по tкритерию Стьюдента р < 0,05. Все эксперименты проводились в трех повторностях. Статистический анализ данных противоопухолевой активности препаратов проводился методами описательной статистики, частотного анализа и анализа выживаемости (метод Каплан-Мейера, лог-ранговый критерий). Обработка данных проводилась с использованием пакета программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Ink., США). 48 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Цитотоксическая активность тритерпеновых гликозидов 3.1.1. Определение жизнеспособности с помощью красителя трипановый синий Для определения влияния исследуемых веществ на жизнеспособность опухолевых клеток мыши использовали краситель трипановый синий. Погибшие клетки интенсивно окрашивались в синий цвет, так как краситель свободно проникает в цитоплазму таких клеток через мембрану с нарушенной проницаемостью. В то же время, живые клетки оставались неокрашенными в течение 3–5 мин. Такой методологический подход позволяет быстро подсчитать количество живых и погибших клеток после инкубирования их с исследуемым веществом и найти полумаксимальные эффективные концентрации (ЕС50) цитотоксического действия вещества. Рис. 2 Влияние кукумариозида А2-2 на жизнеспособность клеток асцитной карциномы Эрлиха мыши, исследованное с помощью красителя трипановый синий. Концентрации гликозида – 2,5 мкМ (А) и 8 мкМ (Б). Было установлено, что тритерпеновые гликозиды голотурий, кукумариозид А2-2 и фрондозид А, влияют на жизнеспособность опухолевых клеток. При окрашивании клеток асцитной карциномы Эрлиха мышей трипановым синим и последующим подсчетом процента их жизнеспособности было обнаружено, что инкубирование клеток с кукумариозидом А2-2 уже при концентрации порядка 2,5 мкМ гликозида приводит к гибели практически 50% клеток (ЕС50 = 2,7 мкМ), а при более высоких концентрациях процент погибших клеток достигает 100%, причем часть клеток лизирует (рис. 2 А, Б и 3 А). Фрондозид А проявляет схожую цитотоксическую активность. Полумаксимальная эффективная концентрация для фрондозида А, оцененная после окрашивания клеток трипановым синим и подсчетом окрашенных клеток, составила 2,5 мкМ. Дальнейшее увеличение концентрации гликозида в инкубационной среде 49 приводило к увеличению числа погибших клеток и достигало 100% при концентрации 8 мкМ и выше (Рис. 3 Б). Рис. 3. Цитотоксическая активность кукумариозида А2-2 (А) и фрондозида А (Б) по отношению к клеткам асцитной карциномы Эрлиха мышей, исследованная с помощью окрашивания клеток красителем трипановый синий. 3.1.2. Определение активности неспецифической эстеразы Одним из показателей цитотоксического действия препаратов служит оценка их ингибирующего действия на активность цитоплазматического фермента неспецифическая эстераза, являющейся одним из индикаторов жизнеспособности клеток. Активность фермента оценивали при помощи молекулярного флуоресцентного зонда флюоресцеин диацетат (FDA). Зонд не является флуоресцентным, однако при попадании в цитоплазму клетки в присутствии неспецифической эстеразы происходит отщепление молекулы диацетата и образование флуоресцентного продукта − флюоресцеина. Интенсивность зеленой флуоресценции флюоресцеина пропорциональна его количеству и, соответственно, активности фермента и жизнеспособности клетки. На рисунке 4 показаны клетки асцитной карциномы Эрлиха после инкубирования с кукумариозидом А2-2, окрашенные флуоресцентными зондами флюоресцеин диацетатом (живые клетки, зеленая флуоресценция) и пропидиумом иодидом (погибшие клетки, красная флуоресценция). 50 Рис. 4. Влияние кукумариозида А2-2 на жизнеспособность клеток асцитной карциномы Эрлиха мыши. Концентрации гликозида – 2 мкМ. Окрашивание флюоресцеин диацетатом (FDA) и пропидиумом иодидом (PI). Было установлено, что при инкубировании клеток асцитной карциномы Эрлиха мышей с кукумариозидом А2-2 или с фрондозидом А, применяемых в микромолярном диапазоне концентраций, происходит ингибирование активности неспецифической эстеразы, что свидетельствует об угнетении жизнеспособности опухолевых клеток. Эффект носит концентрационно-зависимый характер. При концентрации гликозидов в культуральной среде 10 мкМ и выше наблюдается 100%-ная гибель клеток. ЕС50 для кукумариозида А2-2 составила 2,1 мкМ (Таблица 1). В то же время, никакого существенного влияния на активность неспецифической эстеразы и, соответственно, жизнеспособность опухолевых клеток не наблюдалось при концентрации исследуемых соединений в диапазоне 1 нМ−1 мкМ на протяжении 1−24 ч инкубирования. 3.1.3. Определение жизнеспособности опухолевых клеток с помощью метода МТТ Принцип метода МТТ основан на способности фермента сукцинатдегидрогеназы митохондриальной мембраны клеток млекопитающих восстанавливать желтую соль 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) до кристаллов формазана фиолетового цвета, накапливающихся в результате этой реакции в цитоплазме живых клеток. Таким образом, по интенсивности накопления кристаллов формазана в цитоплазме можно судить об уровне митохондриального дыхания клетки, что является показателем ее жизнеспособности. Количество образующегося формазана в клеточном монослое пропорционально имеющемуся количеству живых клеток. Эксперименты по исследованию цитотоксической активности тритерпеновых гликозидов кукумариозида А2-2 и фрондозида А на клетках асцитной карциномы Эрлиха показали, что изучаемые соединения подавляют жизнеспособность опухолевых клеток в 51 микромолярном диапазоне концентраций. Полумаксимальная эффективная концентрация цитотоксического действия кукумариозида А2-2, полученная с помощью метода МТТ, составляет 2,7 мкМ (Рис. 5 А), а для фрондозида А – 1,9 мкМ (Рис. 5 Б). Рис. 5. Цитотоксическая активность кукумариозида А2-2 и фрондозида А по отношению к клеткам асцитной карциномы Эрлиха мышей (А и Б) и клеток РС3 (В и Г), оцененная методом МТТ. Время инкубирования клеток с гликозидами – 24 и 48 ч. Было установлено, что эффективность цитотоксического действия кукумариозида А2-2 и фрондозида А по отношению к клеткам опухоли простаты человека линии РС3 не существенно отличалась от эффективности действия исследуемых гликозидов на клетки асцитной формы карциномы Эрлиха. В экспериментах на клетках линии РС3 было показано, что наблюдается концентрационная зависимость ингибирующего действия гликозидов в микромолярном диапазоне. Было обнаружено, что ЕС50 для кукумариозида А2-2 составила 2,0 мкМ, а для фрондозида А – 2,2 мкМ. На рисунке 5 В, Г представлены графики по влиянию исследуемых гликозидов на жизнеспособность опухолевых клеток линии РС3. 52 Полумаксимальные эффективные концентрации цитотоксического действия кукумариозида А2-2 и фрондозида А по отношению к различным типам опухолевых клеток, полученные с помощью окраски клеток трипановым синим, по оценке ингибирования активности неспецифической эстеразы и методом МТТ представлены в сводной таблице 1. Таблица 1. Влияние кукумариозида А2-2 и фрондозида А на жизнеспособность клеток асцитной карциномы Эрлиха мышей и опухолевых клеток репродуктивной сферы человека. Указаны полумаксимальные эффективные концентрации (EC50). Вещество Кукумариозид EC50, мкМ АКЭ PC3 NT2 NT2-R 2102ЕР 2102ЕР-R 2,7*; 2,1**; 2,0*** 1,4*** 1,5*** 1,0*** 2,05*** 2,2*** 2,3*** 2,75*** 1,6*** 2,1*** А2-2 2,7*** Фрондозид А 2,5*; 2,4**; 1,9*** * окрашивание трипановым синим; ** оценка активности неспецифической эстеразы; *** МТТ метод Таким образом, установлено, что кукумариозид А2-2 и фрондозид А проявляют сопоставимую цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам мыши и опухолевым клеткам репродуктивной сферы человека. Более того, оба тритерпеновых гликозида проявляют сходное цитотоксическое действие по отношению к различным опухолевым клеткам человека, как чувствительным к эффективному цитостатику цисплатин (линии NT2 и 2102ЕР), так и резистентных к действию этого противоопухолевого препарата (линии NT2-R и 2102ЕР-R). 3.2. Изучение индукции апоптоза 3.2.1. Изучение инверсии фосфатидилсерина Одним их характерных признаков (маркеров) раннего апоптоза, позволяющих отличить его от некроза, цитоплазматической является инверсия мембраны в фосфатидилсерина наружный монослой. из В внутреннего биомембранах монослоя клеток фосфатидилсерин (ФС) обычно распределен асимметрично и присутствует только во внутреннем липидном слое. Такое распределение обусловлено действием особой транспортной ATФазы, переносящей ФС из внешнего липидного слоя плазматической мембраны во внутренний. Инактивация ATФазы на ранних стадиях апоптоза ведет к появлению ФС во 53 внешнем слое плазматической мембраны. По-видимому, существует специальный рецептор, обнаруживающий ФС в наружном липидном слое. Связывание этого рецептора с ФС инициирует внутриклеточный сигнал апоптоза. Исследование индукции апоптоза в клетках АКЭ под действием тритерпеновых гликозидов и количественное определение выхода на поверхность цитоплазматической мембраны фосфатидилсерина проводилось с помощью флуоресцентного зонда Anexin V-FITC. Выход ФС на внешнюю поверхность цитоплазматической мембраны характеризуется появлением яркой зеленой флуоресценции в виде ободка, являющейся следствием связывания Anexin V-FITC с ФС (Рис.6А). При исследовании индукции апоптоза методом проточной цитофлуориметрии при действии гликозида на дотограмме в правом нижнем квадранте появляются ярко флуоресцирующие клетки, оцениваемые как клетки в стадии раннего апоптоза (Рис. 6В). Появление клеток в правом верхнем квадранте, окрашенных двумя флуорохромами (Anexin VFITC и PI) одновременно, идентифицируется, что клетки находятся в стадии позднего апоптоза или некроза (Рис. 6Г). Рис. 6. Влияние кукумариозида А2-2 на инверсию фосфатидилсерина в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Флуоресцентное изображение клеток, инкубированных с кукумариозидом А2-2 в концентрации 0,01 мкМ и окрашенных Annexin V-FITC (А). Дотограммы контрольных клеток (Б) и клеток, инкубированных с кукумариозидом А2-2 в концентрации 0,001 мкМ (В) и 1 мкМ (Г). Время инкубирования с гликозидом – 3 ч. Окрашивание PI и Annexin V-FITC. 54 Было установлено, что инверсия ФС на внешний монослой плазматической мембраны опухолевых клеток зависит от времени инкубирования клеток с гликозидом. Кукумариозид А2-2 индуцировал инверсию ФС в первые 6 часов инкубирования с максимальным эффектом за 3 ч; самый выраженный эффект наблюдался при концентрации 0,001 мкМ (Рис. 7А), однако процент клеток, вступающих в ранний апоптоз, не превышал 10% от общего количества клеток. Для всех исследуемых концентраций кукумариозида А2-2 наблюдалось постепенное значительное уменьшение числа апоптотических клеток, инкубированных с гликозидом в течение 12 и 24 ч (Рис. 7). Рис. 7 Зависимость влияния кукумариозида А2-2 на инверсию фосфатидилсерина в клетках асцитной карциномы Эрлиха от времени инкубирования. Окрашивание Annexin V-FITC и PI. Регистрация методом проточной цитофлуориметрии. Черным цветом обозначен ранний апоптоз, серым цветом поздний апоптоз/некроз. Концентрация кукумариозида: 0,001 мкМ (А); 0,01 мкМ (Б); 0,1 мкМ (В) и 1,0 мкМ (Г). Указаны средние значения. В то же время при увеличении времени инкубирования клеток с кукумариозидом А2-2 до 12–24 ч наблюдалось увеличение количества клеток, которые одновременно красятся PI и Annexin V-FITC. Это свидетельствует в пользу того, что с увеличением времени инкубирования возрастает количество клеток, вступивших в стадию позднего апоптоза или некроза. Вероятно, 55 что увеличение количества некротических клеток происходит вследствие того, что ранее индуцированные апоптотические клетки со временем теряют жизнеспособность, барьерная функция их биомембран нарушается, и такие клетки становятся доступнее для их окрашивания двумя зондами. При концентрации кукумариозида 1 мкМ динамика изменения количества клеток, вступивших в ранний апоптоз, и количество клеток в позднем апоптозе (или некрозе) была практически одинакова. Максимальный эффект гликозида наблюдался в интервале 3–6 ч инкубирования (Рис. 7 Г). 3.2.2. Исследование конденсации хроматина Конденсация хроматина и его фрагментация является одной из стадий и маркеров апоптоза. Принцип измерения конденсации хроматина заключается в окрашивании клеток с помощью двух флуоресцентных зондов Нoechst 33342 и PI. Флуоресцентный зонд Нoechst 33342 способен проникать в живые клетки и специфически связываться с А=Т парами нуклеотидов ДНК, и при конденсации хроматина интенсивность его флуоресценции в ядрах увеличивается в десятки раз. Количество некротических клеток определяется с помощью окрашивания PI. Таким образом, клетки, у которых произошла конденсация хроматина, интенсивно светятся в синей области спектра, а мертвые некротические клетки, окрашенные PI, светятся в красной области спектра. На рисунке 8 показаны клетки АКЭ после инкубирования с кукумариозидом А2-2 в стадии конденсации и фрагментации хроматина (ярко-синие фрагментированные ядра) и некроза (красные ядра). Рис. 8. Влияние кукумариозида А2-2 (0,1 мкМ) на конденсацию хроматина в клетках асцитной карциномы Эрлиха, окрашенных зондами Нoechst 33342 и PI. Время инкубирования – 1 ч. Регистрация методом анализа флуоресцентного изображения клеток. При инкубировании опухолевых клеток АКЭ с кукумариозидом А2-2 происходит индукция конденсации хроматина в первые 6 ч, с максимальным эффектом, развиваемым за 1 ч. 56 Наиболее выраженный эффект наблюдался при концентрации 0,001 мкМ; он составил порядка 40% от общего количества клеток (Рис. 9 А). В то же время при увеличении времени инкубирования клеток с кукумариозидом А2-2 наблюдалось увеличение числа клеток, окрашенных PI, что свидетельствует о некрозе клеток. Наиболее четко этот эффект проявлялся при максимальной концентрации гликозида 1 мкМ и за 6 ч инкубирования (Рис. 9 Г). Рис. 9. Влияния кукумариозида А2-2 на конденсацию и фрагментацию хроматина в клетках асцитной карциномы Эрлиха в зависимости от времени инкубирования. Окрашивание Нoechst 33342 и PI. Концентрация кукумариозида А2-2: 0,001 мкМ (А); 0,01 мкМ (Б); 0,1 мкМ (В) и 1,0 мкМ (Г) Регистрация методом анализа флуоресцентного изображения клеток. * р < 0,05 по сравнению с контролем Ho 33342; ** р < 0,05 по сравнению с контролем PI. Влияние фрондозида А на конденсацию хроматина в клетках АКЭ несколько отличается от действия кукумариозида А2-2. Так, при инкубировании этого гликозида с опухолевыми клетками максимальное число клеток с конденсированным хроматином в ядрах наблюдалось при концентрации 0,001 мкМ в первый час инкубирования и составило около 60% от общего числа клеток (Рис. 10 А). При десятикратном увеличении концентрации гликозида конденсация хроматина наблюдалась также после 6 ч инкубирования. При концентрации фрондозида А 1 мкМ наблюдался выраженный цитотоксический эффект гликозида. Так, после 3 ч 57 инкубирования с гликозидом количество некротических клеток, окрашенных PI, достигало порядка 50%, а к 6 ч практически все клетки окрашивались иодидом пропидия (Рис. 10 Г). Рис. 10. Влияния фрондозида А на конденсацию и фрагментацию хроматина в клетках асцитной карциномы Эрлиха в зависимости от времени инкубирования. Окрашивание Нoechst 33342 и PI. Концентрация фрондозида А: 0,001 мкМ (А); 0,01 мкМ (Б); 0,1 мкМ (В) и 1,0 мкМ (Г) Регистрация методом анализа флуоресцентного изображения клеток. * р < 0,05 по сравнению с контролем Ho 33342; ** р < 0,05 по сравнению с контролем PI. 3.2.3. Исследование активности казпазы-3, -9 и PARP-1 Поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP) − ферменты, катализирующие поли-АДФрибозилирование, один из видов посттрансляционной модификации белков. Наиболее известным представителем суперсемейства является фермент PARP-1, участвующий в репарации повреждений ДНК и ремоделировании хроматина за счет поли-АДФ- рибозилирования гистонов. Поскольку при апоптозе ДНК подвергается расщеплению, каспазы расщепляют и тем самым инактивируют PARP-1, предотвращая репарацию расщепляемой при апоптозе ДНК (Ruggieri et. al., 1990). Каспаза-9 − одна из каспаз человека, кодируемая геном CASP9 на 1-й хромосоме. Каспаза-9 играет важную роль в сигнальной цепочке апоптоза, вероятно, представляя наиболее 58 «верхний» узел протеазного каскада этой цепочки после сборки апоптосомы. После активации апоптосомой каспаза-9 в свою очередь активирует ряд других молекул, что в конечном счёте и вызывает запрограммированную клеточную смерть (Li et. al., 1997). Каспаза-3 активируется другими каспазами. Вместе с каспазами-8 и -9 каспаза-3 отвечает за ключевые события в процессах апоптоза. Установлено, что каспаза-3 усиливает сигналы инициации каспаз-8 и -9 для завершения процесса апоптоза (Мартынова, 2003). На сегодняшний день известно, что апоптоз может идти разными метаболическим путям: каспазному и в обход активации каспаз. Для того чтобы определить, какой путь апоптоза запускают тритерпеновые гликозиды голотурий, была проведена регистрация наличия каспазы-3 после индукции апоптоза в цитоплазме опухолевых клеток АКЭ. Измерение количества вышедшей в цитоплазму активированной каспазы-3 определялось спектрофлуориметрически путем регистрации расщепления субстрата Z-DEVD-AMC, который специфически расщепляется каспазой-3 с образованием конечного флуоресцентного продукта. Было установлено, что кукумариозид А2-2 наиболее эффективно индуцирует выход активированной каспазы-3 в минимальной исследуемой концентрации 0,001 мкМ в первые 1−3 ч; выход каспазы-3 в цитоплазму при этом составлял порядка 20−25% от контроля (Рис. 11 А). При максимальной исследуемой концентрации кукумариозида А2-2 равной 1 мкМ, выход каспазы-3 в цитоплазму также наблюдался через 1−3 часа инкубирования, однако он был менее выражен при сравнении с концентрацией 0,001 мкМ. В то же время, наблюдалось присутствие активной каспазы-3 в цитоплазме (порядка 15%) через 24 ч инкубирования гликозида с клетками (Рис. 11 Б). В случае инкубирования опухолевых клеток АКЭ с фрондозидом А, максимальный выход каспазы-3 происходил также при концентрации 0,001 мкМ после 1−3 ч инкубирования и превышал уровень содержания каспазы-3 в цитоплазме интактных клеток на 30%. Инкубирование клеток с фрондозидом А в концентрации 1 мкМ приводило к выраженному увеличению уровня каспазы-3 уже в первый час инкубирования (Рис. 11 В). Кроме того, так же, как и в случае с кукумариозидом А2-2, наблюдалось присутствие активной каспазы-3 в цитоплазме (порядка 15% по сравнению с контролем) через 24 ч инкубирования гликозида с клетками (Рис. 11 Г). Была исследована способность гликозидов голотурий инициировать активацию каспаз в опухолевых клетках репродуктивной сферы человека, чувствительных и резистентных к цитостатику цисплатин. На рисунке 12 А, Б и В показано, что при инкубировании опухолевых герминальных клеток линии NT2, чувствительных к цисплатину, с гликозидами в течение 24 ч и 48 ч, наблюдалась индукция апоптоза в клетках, выражающаяся в расщеплении PARP-1. Был установлен дозозависмый эффект влияния исследуемых соединений на появление фрагмента 59 расщепленного белка PARP-1 (89 кДа) в опухолевых клетках линии NT2. Максимальную эффективность препараты проявляли при концентрации 2 мкМ, наименьшую − 0,1 мкМ. Рис. 11. Выход каспазы - 3 в цитоплазму клеток асцитной карциномы Эрлиха после индукции апоптоза кукумариозидом А2-2 (А, Б) и фрондозидом А (В, Г). * р < 0,05. Установлено, что помимо клеток NT2 фрондозид А вызывал появление расщепленного фрагмента PARP-1 в клетках линии NT2-R, устойчивых к цисплатину (Рис.12 Г), а также в клетках рака простаты линии РС3. Кукумариозид А2-2 оказался менее эффективным по отношению к этим типам опухолевых клеток. Он вызывал расщепление PARP-1 только в клетках линии NT2 за 24 (Рис. 12 А) и 48 ч инкубирования и был неэффективен в отношении остальных исследуемых опухолевых клеток человека NT2-R и РС3. 60 Рис. 12. Влияние тритерпеновых гликозидов кукумариозида А2-2 и фрондозида А на расщепление белка PARP-1. Показана регистрация апоптоза в NT2 клетках после обработки кукумариозидом А2-2 в течение 24 ч (А); апоптоз в клетках NT2, инкубированных с фрондозидом А в течение 24 ч (Б) и 48 ч (В); апоптоз в клетках NT2-R, инкубированных с фрондозидом А в течение 48 ч (Г). Рис. 13. Влияние тритерпеновых гликозидов на активацию каспазы-3 и каспазы-9. Иммуноблоттинг лизатов клеток РС3, инкубированных с кукумариозидом А2-2 и фрондозидом А в течение 48 ч. Кук – кукумариозид А2-2; фрон – фрондозид А. 61 Методом иммуноблоттинга с применением специфических антител было установлено, что кукумариозид А2-2 и фрондозид А активируют каспазу-3 и каспазу-9 в концентрациях 2 и 1 мкМ после 48 ч инкубирования с опухолевыми клетками репродуктивной сферы человека линии РС3. На рисунке 13 стрелками показана увеличенная экспрессия интересующих белков (каспаза-3 и каспаза-9), по сравнению с контролем, что свидетельствует об индукции этих ферментов под воздействием тритерпеновых гликозидов (Рис. 13). 3.2.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии При исследовании клеточной деструкции в клетках АКЭ при их инкубировании с кукумариозидом А2-2 и последующем применении фазово-контрастной микроскопии, а также трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии, было установлено, что в эксперименте встречаются клетки, разрушающиеся двумя способами: апоптозом и некрозом. В первом случае для разрушающихся клеток характерны такие морфологические особенности, как прогрессирующее сморщивание (Рис. 14 А), фрагментация хроматина (Рис. 14 Б), выраженный “блеббинг” клеточной поверхности, происходящий вследствие формирования апоптотических телец (Рис. 14 В), и, наконец, разъединение этих телец (Рис. 14 В, вставка). Данный способ деструкции соответствует критериям апоптоза (Реунов, Реунов; 2008; Saraste, Pulkki, 2000; Zong, Thomson, 2006; Chaabane et.al., 2013). Кроме того, были обнаружены клетки, разрушающиеся без формирования апоптотических телец и фрагментации хроматина. Для таких клеток характерна рыхлая губчатая поверхность с разрывами клеточной мембраны (Рис. 14 Г) и вакуолизация цитоплазмы при наличии внешне нормального ядра (Рис. 14 Д). На следующем этапе происходит рассеивание остатков цитоплазмы с органоидами, сопровождаемое появлением электронно-светлых литических зон в ядре (Рис. 14 Е). Прогрессирующее формирование литических зон приводит к полному рассеиванию ядерного материала, происходящему вслед за разрушением цитоплазмы. Данный способ разрушения соответствует описанию некроза (Реунов, Реунов; 2008; Zong, Thomson, 2006; Kung et.al., 2011; Chaabane et.al., 2013). 62 Рис. 14. Клетки карциномы Эрлиха, подвергающиеся деструкции под действием кукумариозида А2-2 (0,1 мкМ). А – апоптоз; сморщивающаяся клетка; фазово-контрастная микроскопия (ФКМ). Масштаб: 5 мкм. Б – апоптоз; звездочками показаны раздельные участки ядерного материала, сформировавшиеся в процессе фрагментации хроматина; трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Масштаб: 1 мкм. В – апоптоз; клетка, фрагментирующаяся на апоптотические тельца (АТ); сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Масштаб: 1 мкм. В (вставка) – апоптотические тельца, сохраняющие колокализацию после распада клетки; ФКМ. Масштаб: 5 мкм. Г – некроз; характерная губчатая поверхность разрушающейся клетки; стрелкой показан разрыв клеточной поверхности; СЭМ. Масштаб: 1 мкм. Д – некроз; звездочками показаны вакуоли, возникающие в цитоплазме (Ц); ядро (Я) не имеет явных признаков деструкции; ТЭМ. Масштаб: 1 мкм. Е – некроз; клеточное ядро еще сохраняет форму, но в нем уже видны электронно-светлые литические зоны (обозначены шестилучевыми звездочками); вокруг ядра видны остатки цитоплазмы с органоидами; ТЭМ. Масштаб: 1 мкм. Ж – переход от апоптоза к некрозу, часть поверхности клетки покрыта сформировавшимися апоптотическими тельцами (АТ), тогда как другая часть имеет губчатую поверхность (показана наконечниками); СЭМ. Масштаб: 1 мкм. 63 Наряду с двумя описанными выше способами деструкции, выявлен переходный вариант клеточной гибели, морфологически соответствующий комбинированному способу деструкции, включающему в себя как элементы апоптоза, так и некроза. Около половины поверхности таких “гибридных” клеток покрыта сформировавшимися апоптотическими тельцами, тогда как остальная их часть имеет губчатую поверхность, характерную для клеток, подвергающихся некрозу (Рис. 14 Ж). Так как апоптоз происходит при сохранении жизнеспособности клетки, а некроз часто является следствием ее утраты, мы предполагаем, что в клетках АКЭ переход от апоптоза к некрозу происходит вследствие гибели опухолевых клеток, индуцированной применением кукумариозида А2-2. 3.2.5. Влияние на активность белка р53 Белок р53 является одним из ключевых белков в клетках. Это транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл и выполняющий функцию супрессора образования злокачественных опухолей. Основной функцией этого белка является отслеживание физиологических и биохимических нарушений в клетках, главным образом клеток с дефектной ДНК. В таких клетках р53 инициирует апоптоз, который через выход цитохрома с из митохондрий запускает каскад последовательных активаций каспаз, заканчивающийся активацией каспазы-3. Для выяснения участия р53-зависимого сегмента в индукции апоптоза под действием гликозидов была сконструирована трансгенная двугибридная система на основе дрожжевых клеток, в которые были встроены ген р53 мыши и ген репортерного белка β-галактозидазы. Эта тест-система позволяет надежно фиксировать влияние различных препаратов на уровни экспрессии и активности белка р53 (Рис. 15). Рис. 15. Двугибридная тест-система с репортерным геном β-галактозидазы. 64 В результате анализа было выяснено, что кукумариозид А2-2 и фрондозид А в диапазоне концентраций 0,001−0,1 мкМ фактически не оказывали никакого достоверного влияния на активацию р53 в клетках по сравнению с контролем (Табл. 2). Таблица 2. Влияние кукумариозида А2-2 и фрондозида А на активность р53, оцененное с помощью двугибридной тест-системы. Указана активность репортерного гена β-галактозидазы (m ± se, n=3). Вещество Активность β-галактозидазы, о.е. Концентрация гликозида, мкМ 0 0,001 0,01 0,1 Кукумариозид А2-2 473,25±38,98 502,50±103,50 444,50±105,50 552,50±113,50 Фрондозид А 673,50±102,50 653,00±125,00 480,00±87,00 473,25±38,98 Таким образом, было установлено, что тритерпеновые гликозиды голотурий способны индуцировать запрограммированную гибель опухолевых клеток различных типов, выражающуюся в инверсии фосфатидилсерина на внешнюю поверхность, активации каскада каспаз, включая каспазы-3 и -9, и в конденсации и фрагментации хроматина. Мы исключили участие р53-зависимого сегмента в метаболическом каспазном пути, по которому происходит индукция апоптоза в опухолевых клетках под воздействием кукумариозида А2-2 и фрондозида А. 3.3. Исследование клеточного цикла 3.3.1. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии Оценка распределения клеток по фазам клеточного цикла проводилась путем отбора и анализа флуоресценции клеток методом проточной цитофлуориметрии. На рисунке 16 представлены дотограмма контрольных клеток АКЭ, окрашенных PI, и гистограмма распределения клеток по фазам клеточного цикла. Из дотограммы видно, что популяция опухолевых клеток неоднородна и состоит как минимум из трех субпопуляций, различаемых по размеру клеток и форме их поверхности. Для оценки распределения клеток по фазам клеточного цикла отбирались все субпопуляции. Было показано, что количество клеток в стадии SubG0 в контроле колеблется в пределах 7% от общего числа клеток. В фазе G0/G1 регистрировалось примерно 62%, тогда как в фазах S и G2/M по 15% и 16% соответственно. Было установлено, что субцитотоксические концентрации гликозидов вызывают резкое увеличение количества клеток в фазе SubG0, что соответствует анэуплоидным клеткам и, 65 следовательно, выраженной индукции апоптоза в этих клетках. На рис. 16 В и Г показана гистограмма клеток АКЭ, инкубированных в течение 24 ч с кукумариозидом А2-2 и фрондозидом А в концентрации 1 мкМ, у которых существенно увеличивается процент клеток в фазе SubG0 и наблюдается блокировка (увеличение процента клеток) в фазе S. Положительная тенденция к увеличению количества апоптотических клеток под воздействием тритерпеновых гликозидов наблюдалась практически при всех тестируемых концентрациях. Показано, что при инкубировании клеток с кукумариозидом А2-2 во всем исследуемом диапазоне концентраций в течение 24 ч наблюдалось увеличение клеток в фазе SubG0 с 14,3% в контроле до примерно 19−20% (0,01−0,1 мкМ) или до 23,3% (1,0 мкМ). Такая же тенденция отмечена и для действия фрондозида А. Максимальное количество анэуплоидных клеток 26,94% отмечалось при концентрации фрондозида А 1 мкМ, в то время как в контроле оно составляло 16,03% (Табл. 3). Рис. 16. Дотограмма (А) и гистограмма (Б) клеток асцитной карциномы Эрлиха в контроле. Влияние кукумариозида А2-2 (В) и фрондозида А (Г) на распределение клеток по фазам клеточного цикла. Время инкубирования – 24 ч. Концентрации гликозидов 1 – мкМ. При действии кукумариозида А2-2 в диапазоне концентраций 0,01–0,1 мкМ было отмечено понижение количества клеток, находящихся в стадии G0/G1 и G2/M, но увеличивалось количество клеток в фазе S. Так, при концентрации кукумариозида А2-2 0,01 мкМ наблюдалось увеличение количества клеток в фазе S с 17,20% в контроле до 20,69%. В контроле количество клеток в фазе G2/M было 9,88% от общего числа, а при действии кукумариозида А2-2 в 66 концентрации 0,1 мкг/мл снизилось до 7,29%. В то же время инкубирование клеток АКЭ с кукумариозидом А2-2 в концентрации 1 мкМ приводило к заметному снижению количества клеток в фазе S и существенному увеличению клеток в фазе G2/M (Табл. 3). Инкубирование клеток АКЭ с фрондозидом А в диапазоне концентраций 0,01−0,1 мкМ также приводило к понижению количества клеток в фазах G2/M и G0/G1 и увеличению количества клеток в фазе S при инкубировании в течение 24 ч (Табл. 3). Таким образом, эксперименты по исследованию влияния тритерпеновых гликозидов кукумариозида А2-2 и фрондозида А на клеточный цикл клеток АКЭ показали, что в диапазоне концентраций 0,001–0,1 мкМ соединения вызывают следующие нарушения в прохождении фаз цикла: увеличение клеток в фазе SubG0, что отражает индукцию апоптоза и арест клеточного цикла в фазе S, по сравнению с контролем, что отражает блокирование клеточного деления. Уменьшение клеток в фазах G0/G1 и G2/M отражает перераспределение клеток в другие фазы и их накопление в фазе апоптотических клеток (SubG0) и фазе синтеза (S) соответственно. В то же время инкубирование клеток АКЭ с гликозидами в концентрации 1 мкМ приводит к блокированию клеточного цикла в фазе G2/M. Таблица 3. Исследование влияния кукумариозида А2-2 и фрондозида А на клеточный цикл клеток асцитной карциномы Эрлиха, инкубированных с гликозидами в течение 24 ч Вещество, мкМ Кукумариозид А2-2 Контроль 0,001 0,01 0,1 1 Фрондозид А Контроль 0,001 0,01 0,1 1 SubG0 14,39±4,73 15,61±2,91 19,80±1,24 19,44±0,14 23,26±10,91 16,03±3,73 22,31±3,93 20,79±2,62 23,09±3,71 26,94±5,30 Фазы клеточного цикла G0/G1 S G2/M 51,07±7,70 46,15±3,72 42,17±4,62 44,53±1,21 42,18±5,30 17,20±1,51 19,52±0,21 20,69±0,32 20,62±0,30 15,61±2,70 9,88±1,12 8,29±0,72 7,66±0,33 7,29±0,10 11,50±2,70 45,65±6,73 38,56±1,04 42,56±2,64 41,14±4,72 40,18±0,51 20,48±0,73 22,55±0,04 21,38±0,62 20,43±0,41 17,71±2,62 8,50±0,21 5,19±0,31 7,33±0,20 7,09±0,50 7,27±1,71 Было установлено, что инкубирование опухолевых клеток репродуктивной сферы человека линии РС3 с тритерпеновыми гликозидами кукумариозидом А2-2 и фрондозидом А также приводит к увеличению количества клеток в фазе SubG0, что соответствует появлению анэуплоидных клеток и индукции апоптоза. Выявлено выраженное накопление клеток в фазе митоза (G2/М), что свидетельствует о блокировании клеточного цикла в данной фазе (Рис. 17). В качестве положительного контроля для визуализации апоптоза и выявления анэуплоидных 67 клеток были использованы клетки РС3, инкубированные с анизомицином (Cell signaling, США) в концентрации 1 мкМ в течение 48 ч. Анизомицин − это антибиотик, продуцируемый микроорганизмами Streptomyces griseolus и S. roseochromogenes. Известно, что он способен ингибировать белок-белковый синтез на уровне трансляции (Hazzalin et al., 1998). Кроме того, показано, что анизомицин индуцирует апоптоз во многих опухолевых клеточных линиях (Kochi et al.,1993; Törocsik,. Szeberényi, 2000; Curtin, Cotter, 2002). На рисунке 17 и в таблице 4 показано распределение опухолевых клеток линии РС3 по фазам клеточного цикла. Так, кукумариозид А2-2 достоверно увеличивал количество клеток в фазе SubG0, что свидетельствует о значительном повышении числа апоптотических клеток после инкубировании в течение 48 ч с гликозидом (Табл. 4). Кукумариозид А2-2 в исследуемых концентрациях снижал количество клеток в фазе G0/G1. В контроле процент клеток в данной фазе был 63,5%, в то время как после инкубирования с сапонином снизился до 29% при концентрации 2 мкМ и до 37% при 1 мкМ. Концентрация клеток в синтетической фазе S практически не изменялась по сравнению с контролем. Кукумариозид А2-2 вызывал блокирование клеточного цикла в опухолевых клетках линии РС3 в фазе митоза G2/M, так как наблюдалось достоверное увеличение числа клеток в этой фазе. Рис. 17. Гистограммы распределения клеток РС3 по фазам клеточного цикла: контрольные клетки (А), клетки инкубированные с анизомицином (Б), кукумариозидом А2-2 (В) и фрондозидом А (Г) в течение 48 ч. Концентрация анизомицина 1 мкМ и гликозидов 2 мкМ. 68 Рис. 18. Распределение клеток линии РС3 по фазам клеточного цикла в контроле (А), под воздействием анизомицина (Б) и при инкубировании с кукумариозидом А2-2 (В) и фрондозидом А (Г). Время инкубирования 48 ч. Концентрация анизомицина 1 мкМ и гликозидов 2 мкМ. Было установлено, что фрондозид А достоверно увеличивает процент апоптотических клеток с 6,2% в контроле до 34% при концентрации гликозида 2 мкМ (Табл. 4, Рис.18). Инкубирование опухолевых клеток с фрондозидом А приводило к резкому снижению клеток в фазе G0/G1 и накоплению в фазе G2/М, что свидетельствует о блокировании клеточного цикла в фазе митоза. Изменений в синтетической фазе S не наблюдалось. Таким образом, тритерпеновые гликозиды кукумариозид А2-2 и фрондозид А, достоверно увеличивают число апоптотических (анэуплоидных) клеток, а также блокируют клеточный цикл в фазе митоза (G2/M) в опухолевых клетках человека линии РС3 (Табл. 4, Рис. 17, 18). 69 Таблица 4. Влияние кукумариозида А2-2, фрондозида А и анизомицина на клеточный цикл клеток линии РС3, инкубированных с веществами в течение 48 ч. Вещество, мкМ Контроль Кукумариозид А2-2 (2мкМ) Кукумариозид А2-2 (1мкМ) Фрондозид А (2мкМ) Фрондозид А (1мкМ) Анизомицин *р < 0,05 SubG0 2,59±0,08 16,92±1,10* 8,78±0,23* 34,33±4,11* 9,11±1,12* 12,71±4,32* Фазы клеточного цикла G0/G1 S 63,54±1,01 29,19±3,11* 36,87±1,53* 23,75±2,42* 37,17±1,41* 39,63±4,34* 9,85±2,05 9,43±0,20 9,22±0,04 8,26±1,33 8,24±0,70 9,81±1,09 G2/M 15,22±1,71 32,56±2,72* 32,14±0,30* 23,84±1,11* 34,35±0,12* 29,62±9,04 3.3.2. Определение включения 3Н-тимидина в ДНК клеток Определение скорости синтеза ДНК в популяции клеток используется в качестве меры скорости роста клеток или при изучении клеточного цикла, или при непосредственном изучении метаболизма ДНК. Широко используемым методом оценки клеточной пролиферации и антипролиферативных свойств биологически активных препаратов является сравнительное определение включения 3 Н-тимидина в ДНК клеток (в кислотонерастворимую фракцию клеток), инкубированных с исследуемыми веществами, и контрольных. На рисунке 19 показано включение 3Н-тимидина в контрольные клетки и клетки, инкубированные с кукумариозидом А2-2 в концентрации 10 мкМ. На этом графике продемонстрировано, что гликозид в цитотоксической концентрации практически полностью блокирует биосинтез ДНК в клетках. 5000 контроль 4000 CPM 3000 2000 кукумариозид A2-2 10 мкМ 1000 0 Рис. 19. Включение 3Н-тимидина (cpm) в контрольные клетки и клетки, инкубированные с кукумариозидом А2-2 в концентрации 10 мкМ. На рисунке 20 представлены комбинированные графики по цитотоксической активности исследуемых соединений и их влиянию на включение 3Н-тимидина в клетки АКЭ. На графиках показано, что цитотоксическая активность гликозидов, оцененная по включению в клетки красителя трипановый синий, практически мало меняется в диапазоне концентраций 0,001–1,0 мкМ, в то же время гликозиды вызывают довольно существенное ингибирование биосинтеза 70 ДНК. Максимальный ингибирующий эффект (наименьшее включение 3 Н-тимидина) наблюдался для обоих гликозидов при концентрации 0,01 мкМ и составил 50,17% для кукумариозида А2-2 и 53,19% для фрондозида А соответственно. Рис. 20. Цитотоксический и цитостатический эффект гликозидов кукумариозида А2-2 (А) и фрондозида А (Б) в отношении клеток асцитной карциномы Эрлиха, инкубированных с веществами в течении 24 ч. Указаны средние значения. Таким образом, было показано, что исследуемые соединения в нецитотоксическом диапазоне концентраций обладают выраженным цитостатическим эффектом, они блокируют включение 3Н-тимидина в опухолевые клетки, что отражает ингибирование биосинтеза ДНК, блокирование клеточного цикла и торможение клеточной пролиферации. В результате проведенных исследований можно сделать заключение, что влияние тритерпеновых гликозидов голотурий на опухолевые клетки сопровождается индукцией апоптоза, выражающейся в увеличении количества анэуплоидных клеток в фазе SubG0, накоплением клеток в фазах клеточного цикла S или G2/M (в зависимости от типа опухолевых клеток), и блокировкой синтеза ДНК. Это, в свою очередь, приводит к блокированию клеточного цикла, митоза и к ингибированию пролиферации клеток. 3.4 Влияние тритерпеновых гликозидов на колониеобразование опухолевых клеток Исследование колониеобразования опухолевых клеток in vitro основано на способности одной клетки превращаться в колонию, которая должна состоять, по крайней мере, из 50 клеток. Таким образом, исследование колониеобразования − это метод, позволяющий изучить каждую клетку на способность к неограниченному росту. В живом организме такая тенденция к неконтролируемому росту опухолевых клеток приводит к метастазированию опухоли (Franken et. al., 2006). 71 Было проведено исследование влияния кукумариозида А2-2 и фрондозида А на процесс формирования колоний различных типов опухолевых клеток человека, включая линии NT2, РС3 и 2102ЕP, и клеток, устойчивых к цисплатину, NT2-R и 2102ЕР-R. На рисунке 21 представлены изображения 6-луночных планшет с колониями, окрашенными красителем Гимза. Видно, что при концентрации ЕС50 цисплатин полностью подавляет рост колоний, чувствительной клеточной линии NT2, и слабее ингибирует колониеобразование устойчивых клеток линии NT2-R. Было установлено, что тритерпеновый гликозид кукумариозид А2-2 в концентрации 1 мкМ эффективно блокирует рост опухолевых колоний. Наблюдалось ингибирование порядка 30% от контроля для всех исследуемых линий клеток (Рис. 22). Наибольший ингибирующий эффект, составляющий порядка 35%, был показан при инкубировании гликозида с клетками 2102ЕР, как чувствительными, так и устойчивыми к действию цисплатина 2102ЕР-R (рис. 22 В и Г). Рис. 21. Влияние тритерпеновых гликозидов кукумариозида А2-2 и фрондозида А на колониеобразование опухолевых клеток линий NT2 (А) и NT2-R (Б). Концентрация гликозидов 1 мкМ. Тритерпеновый гликозид фрондозид А также проявил выраженное ингибирующее действие на колониеобразование опухолевых клеток (Рис. 22). Так, величина ингибирования роста колоний были сопоставимы с данными по кукумариозиду А2-2 и составили приблизительно 40% от контроля в отношении опухолевых клеток линии NT2 (Рис. 22 А). 72 Максимальное торможение колониеобразования было выявлено при инкубировании клеток линии 2102ЕР в течение 48 ч, и оно составило 70% (Рис. 22 В). В то же время отмечено, что резистентные к цисплатину клеточные линии NT2-R и 2102ЕР-R оказались более устойчивы к действию фрондозида А по сравнению с чувствительными к цисплатину клетками линий NT2 и 2102ЕР. Рис. 22. Влияние тритерпеновых гликозидов на образование колоний клеток линий NT2 (А) и NT2-R (Б), 2102ЕP (В), 2102ЕР-R (Г) и РС3 (Д). * р < 0,05. В качестве положительного контроля использовали клетки, обработанные цисплатином в концентрациях, равных его ЕС50. Так, для клеток линии РС3 эта величина составила 5 мкМ, для NT2 и NT2-R, − 0,2 и 0,9 мкМ, для линии 2102ЕP − 0,6 и для линии 2102ЕР-R − 1,2 мкМ соответственно. Было установлено, что цисплатин проявляет выраженный эффект, который выражается в значительном ингибировании роста колоний всех исследуемых клеточных линий, как чувствительных, так и устойчивых. 73 В результате экспериментов было установлено, что тритерпеновые гликозиды голотурий, кукумариозид А2-2 и фрондозид А, способны блокировать рост колоний опухолевых клеток во всех исследуемых клеточных линиях, включая клеточные линии, устойчивые к цитостатику цисплатин. 3.5. Исследование влияния кукумариозида А2-2 и фрондозида А на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток 3.5.1. Изучение множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM Устойчивость опухолевых противоопухолевым препаратам, клеток с одновременно помощью ко которых многим цитотоксическим проводится химиотерапия онкологических заболеваний, несходным по химической структуре и механизму действия, достаточно давно известный феномен, получивший название множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Известно, что важнейшим следствием МЛУ опухолевых клеток является пониженное накопление препаратов в клетке, обусловленное их активным выведением во внеклеточную среду посредством Р-гликопротеина, локализованного в плазматической мембране, за счет энергии гидролиза АТФ. Обнаружено, что многие известные блокаторы Р-гликопротеина, например, блокатор потенциал-чувствительных кальциевых каналов верапамил, способны ингибировать эффект МЛУ и тем самым увеличивать чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам и цитотоксинам. Однако практически все известные блокаторы Р-гликопротеина имеют ряд недостатков (в частности, блокаторы кальциевых каналов обладают высокой кардиотоксичностью), что не позволяет использовать данные препараты в клинике. Поэтому поиск новых эффективных блокаторов МЛУ является актуальным при создании противоопухолевых препаратов и проведении сочетанной противоопухолевой терапии. На первом этапе было проведено изучение влияния тритерпеновых гликозидов кукумариозида А2-2 и фрондозида А на мультилекарственную устойчивость клеток АКЭ с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM и спектрофлуориметрии. В неопухолевых клетках зонд легко проникает через плазматическую мембрану в цитоплазму и под действием эстераз превращается в неэтерефицированную форму − Calcein, интенсивно флуоресциирующий в зеленой области спектра. Установлено, что в клетках с МЛУ наблюдается усиленная экспрессия Р-гликопротеина, благодаря активности которого Calcein АМ быстро удаляется из клеток и не накапливается в цитоплазме (Рис. 23 А). 74 Рис. 23. Механизм возникновения МЛУ в клетках и принцип исследования МЛУ (MDR) с помощью зонда Calcein AM (А, цит. по Haugland, 2002). Влияние верапамила (Б), кукумариозида А2-2 (В) и фрондозида А (Г) на множественную лекарственную устойчивость клеток карциномы Эрлиха. * р < 0,05. Было установлено, что исследуемые тритерпеновые гликозиды эффективно блокировали активность Р-гликопротеина в исследуемом диапазоне концентраций 0,001–0,1 мкМ, вследствие чего увеличивалось количество зонда Calcein в цитоплазме. Оба гликозида примерно в равной степени блокировали МЛУ в клетках АКЭ, и увеличение интенсивности флуоресценции накопленного в цитоплазме зонда Calcein составило порядка 56% по отношению к контролю (Рис. 23 В, Г). В качестве препарата сравнения использовали верапамил в диапазоне концентраций от 0,012 до 120 мкг/мл (Рис. 23 Б). Было показано, что максимальная эффективная концентрация верапамила составила 0,012 мкг/мл. Это соответствовало увеличению флуоресценции зонда приблизительно на 45−50% относительно контроля. Таким образом, было установлено, что тритерпеновые гликозиды кукумариозид А2-2 и фрондозид А способны достоверно блокировать феномен МЛУ в опухолевых клетках мышиной карциномы Эрлиха в нецитотоксическом диапазоне концентраций. Эффективность блокирования МЛУ в опухолевых клетках была сопоставима с эффективностью стандартного блокатора МЛУ верапамила. 75 3.5.2. Изучение транспорта доксорубицина в опухолевых клетках Доксорубицин – это противоопухолевый антибиотик антрациклинового ряда. Он оказывает антимитотическое и антипролиферативное действие. Механизм противоопухолевого действия заключается во взаимодействии с ДНК, образовании свободных радикалов и подавлении синтеза нуклеиновых кислот. С помощью метода конфокальной микроскопии нами было показано, что доксорубицин способен накапливаться в клетках АКЭ, локализуясь преимущественно в ядрах при практически полном его отсутствии в цитоплазме (Рис. 24). Рис. 24. Конфокальные изображения клеток АКЭ, нагруженных доксорубицином в течение 2-х ч. Изображение в проходящем свете (А), флуоресцентное изображение (Б) и совмещенное изображение (В). Локализация доксорубицина в ядре одиночной клетки (Г). Было установлено, что инкубирование клеток АКЭ с кукумариозидом А2-2 в диапазоне концентраций 0,001–0,1 мкМ в течение 2 ч приводит к заметному усилению динамики входа доксорубицина и его накоплению в ядрах опухолевых клеток (Рис. 25 А, Б). На рисунке 25 В и Г хорошо видно, что через 2 ч от начала эксперимента конечная концентрация накопленного в ядрах доксорубицина существенно выше в клетках, обработанных кукумариозидом А2-2 по сравнению с контрольными клетками. Отмечена обратнопропорциональная зависимость ингибирующего МЛУ эффекта от концентрации гликозида. Было показано, что 76 предварительное инкубирование клеток с кукумариозидом А2-2 в концентрации 0,001 мкМ приводило к максимальному накоплению доксорубицина в ядрах клеток АКЭ (Рис. 26 А). Рис. 25. Влияние кукумариозида А2-2 (0,01 мкМ) на динамику накопления доксорубина в ядрах клеток асцитной карциномы Эрлиха. Контрольные клетки (А) и клетки, предварительно инкубированные с кукумариозидом А2-2 (Б). Показаны записи изменения флуоресценции ядер индивидуальных клеток в монослое. Стрелками указано время введения доксорубицина (Dox). Изображения контрольных клеток (В) и клеток, предварительно инкубированных с кукумариозидом А2-2 (Г), получены через 2 ч после введения доксорубицина в инкубационную среду с клетками. Исследование выброса доксорубицина из опухолевых клеток проводили с помощью спетрофлуориметрии. Было установлено, что в нецитотоксических концентрациях кукумариозид А2-2 способен задерживать выход доксорубицина из цитоплазмы опухолевых клеток после его первоначального накопления в ядрах. Заметный эффект ингибирования наблюдался при концентрации гликозида 0,001 и 0,1 мкМ после предварительного инкубирования клеток с гликозидом и последующего накопления доксорубицина в клетках АКЭ в течение 2 ч. Наибольший эффект задержки выхода флуоресцентного противоопухолевого антибиотика наблюдался через 1 ч после отмывки клеток при концентрации гликозида 0,001 мкМ (Рис. 26 Б). 77 Рис.26. Влияние кукумариозида А2-2 на накопление и выброс доксорубицина. Показано содержание доксорубицина в ядрах опухолевых клеток АКЭ после его накопления в течение 2 ч (А) и его остаточное содержание в ядрах через 1 час после отмывки клеток (Б). * р < 0,05. Таким образом, было установлено, что кукумариозид А2-2 блокирует множественную лекарственную устойчивость, что проявляется в увеличении как накопления противоопухолевого цитостатика доксорубицина в опухолевых клетках, так и к увеличению времени задерживания доксорубицина в клетках. Такое блокирование множественной лекарственной устойчивости может приводить к повышению чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам за счет их накопления в клетках и проявлению синергизма при сочетанной противоопухолевой терапии с помощью гликозидов и известных цитостатиков, как это ранее было продемонстрировано для препарата кумазид и 5-фторурацила (Aminin et al., 2010). 3.6. Исследование влияния тритерпеновых гликозидов на протеом опухолевых клеток человека 3.6.1. Протеомный анализ белков с помощью 2D-PAGE и MALDI-MS Для идентификации белков-мишеней в клетках широко применяются протеомные методы исследования. 2D-элекрофорез с последующим масс-спектрометрическим анализом пятен регулируемых белков является одним из основных современных средств изучения воздействия биологически активных соединений на протеом или на совокупность всех белков определенных клеток или органов. Таким способом при сравнении белковых профилей контрольных клеток и клеток, обработанных исследуемым соединением, можно выявить белкимишени или биомаркеры действия исследуемого препарата. 78 Был проведен протеомный анализ белков, экспрессия которых регулируется при инкубировании клеток рака простаты человека линии РС3 с кукумариозидом А2-2 или фрондозидом А. С этой целью опухолевые клетки инкубировали с изучаемыми соединениями в течение 48 ч, после чего из клеток выделяли белки и проводили их разделение методом двумерного электрофореза. На рисунке 27 показаны изображения отсканированных гелей после проведенного 2D-элекрофореза белков из контрольных и обработанных кукумариозидом А2-2 клеток. На геле 27 А цифрами отмечены белки, экспрессия которых снижалась в результате инкубирования с гликозидом (даун-регуляция), а на геле 27 Б представлены ап-регулируемые белки. Аналогичные данные, полученные при инкубировании опухолевых клеток с фрондозидом А, продемонстрированы на Рис. 29 А и Б. С помощью дифференциального анализа изображения 2D-гелей белков, выделенных из контрольных и инкубированных с гликозидами опухолевых клеток, было обнаружено, что общее число белковых пятен, полученных на гелях из экстрактов клеточных культур, равнялось 946. В клеточных культурах, инкубированных с кукумариозидом А2-2, было обнаружено 20 пятен дифференциально экспрессированных белков, экспрессия которых изменялась относительно контроля более чем в два раза. Из них 13 белков было сверхэкспрессировано, а экспрессия 7 белков была блокирована (даун-регулирована) в два и более раза (Табл. 5, Рис. 31). При обработке результатов в случае с опухолевыми клетками линии РС3, инкубированных с фрондозидом А, было выявлено порядка 30 пятен белков, экспрессия которых менялась в два и более раза, причем экспрессия 12 белков была ап-регулирована, а экспрессия 18 белков была даун-регулирована (Табл. 6, Рис. 31). В обоих случаях инкубирования опухолевых клеток РС3 с гликозидами не было обнаружено пятен белков, появившихся на экспериментальных гелях, при их полном отсутствии в контрольных гелях. Кроме того, не были выявлены белковые пятна, присутствующие только на контрольных 2D-гелях и полностью отсутствующе экспериментальных гелях (т.е. белки, экспрессия которых полностью блокирована). на 79 Рис. 27. Изображения 2D-гелей клеток линии РС3 в контроле (А) и после инкубирования в течение 48 ч с кукумариозидом А2-2 (Б). На геле А отмечены пятна с даун-регуляцией, а на геле Б - пятна с ап-ругляцией. 79 80 Рис 28. Увеличенные изображения пятен на 2D-геле, соответствующие регулируемым белкаммишеням, под действием кукумариозида А2-2 (время инкубирования клеток с веществом - 48 ч). Знаком «+» на рисунке обозначены пятна, соответствующие белкам, экспрессия которых менялась под действием кукумариозида А2-2. Знаком «-» обозначены белки-мишени контрольных клеток. Рис. 30. Увеличенные изображения пятен на 2D-геле, соответствующие регулируемым белкаммишеням, под действием фрондозида А (время инкубирования клеток с веществом – 48 ч). Знаком «+» на рисунке обозначены пятна, соответствующие белкам, экспрессия которых менялась под действием фрондозида А. Знаком «-» обозначены белки-мишени контрольных клеток. Рис. 29. Изображения 2D-гелей клеток линии РС3 в контроле (А) и после инкубирования в течение 48 ч с фрондозидом А (Б). На геле А отмечены пятна с даун-регуляцией, а на геле Б - пятна с ап-ругляцией. 81 82 Рис. 31. Влияние кукумариозида А2-2 и фрондозида А на экспрессию белков в опухолевых клетках простаты человека линии РС3. Цифрами указано количество обнаруженных белковых пятен на 2D-геле. Стрелками указаны направления регулирования экспрессии. В ходе дальнейшего анализа пятна дифференциально экспрессирующихся белков вырезали из гелей и белки подвергали последующему протеолизу трипсином. Затем полученные смеси пептидов анализировали с помощью метода MALDI-TOF-MS/MS массспектрометрии. В результате этого исследования было идентифицировано порядка 50 белков. Список идентифицированных белков клеток рака простаты человека линии РС3, экспрессия которых регулируется тритерпеновыми гликозидами кукумариозидом А2-2 и фрондозидом А, содержится в таблицах 5 и 6 соответственно. На рисунках 28 и 30 представлены увеличенные изображения некоторых белков, экспрессия которых значительно изменялась под действием кукумариозида А2-2 и фрондозида А соответственно. Все белки, для которых была обнаружена регуляция тритерпеновыми гликозидами голотурий, могут быть сгруппированы в определенные группы согласно функциям, выполняемым этими белками в клетке. Например, те белки, экспрессия которых в опухолевых клетках меняется под влиянием кукумариозида А2-2, могут быть отнесены к регуляторам метаболизма белков и углеводов, к белкам цитоскелета, принимающим участие в клеточной подвижности и делении, к белкам, принимающим участие в иммунном ответе, ответе на стресс, мРНК процессинге, а также в структурно-функциональной организации ядра клеток. Большая часть этих белков имеет существенную значимость в функционировании именно 83 трансформированных опухолевых клеток, а некоторые из них являются общеизвестными онкомаркерами, по которым идентифицируют тот или иной тип опухолей. 84 Таблица 5. Белки, регулируемые под действием кукумариозида А2-2 в опухолевых клетках человека линии РС3. Номера даун-регулируемых белков соответствуют номерам пятен на рисунке 27 А, номера ап-регулируемых белков соответствуют номерам пятен на рисунке 27 Б. Номер пятна на геле Степень и направление Название Название белка гена регуляции экспрессии Метаболизм белков, ферментативная активность Функция белка PDIA1 Protein disulfide-isomerase 2,44↑ Катализирует формирование и разрушения дисульфидных связей при сворачивании белков 1 CATB Cathepsin B 3,2 ↓ Принимает участие в апоптозе, является медиатором лизосомального пути клеточной гибели 6 GRP78 78 kDa protein glucose-regulated 2,43↑ Контролирует воспаления процессы инвазии, апоптоза, Метаболизм углеводов 5 PGP Phosphoglycolate phosphatase 2,12↓ Принимает участие в метаболизме углеводов 84 4 85 Продолжение Таблицы 5 Организация цитоскелета, клеточная подвижность и деление K2C1 Keratin, type II cytoskeletal 1 2,35↑ Принимает участие в промежуточных филаментов образовании 11 KRT81 Keratin, type II cuticular Hb1 2,96↑ Принимает участие в промежуточных филаментов образовании 10 KRT81 Keratin, type II cuticular Hb1 2,52↑ Принимает участие в промежуточных филаментов образовании 7 STMN1 Stathmin 2,16↓ Регулирует быструю реконструкцию цитоскелета в ответ на потребности клетки 5 KINH Kinesin-1 heavy chain 2,22↑ Поддерживает митоз, мейоз внутриклеточных молекул 13 CALD1 Caldesmon 2,18↑ Связывает кальмодулин, ингибирует АТФазную активность миозина 12 CRK II Adapter molecule crk 2,93↑ Вовлечен в фагоцитоз апоптотических клеток, может регулировать передачу сигналов EFNA5EPHA3 и транспорт Иммунный ответ 9 IL1B Interleukin-1 beta 3,32↑ Развитие и регуляция организма на патоген защитной реакции 3 IL1B Interleukin-1 beta 3,09↑ Развитие и регуляция организма на патоген защитной реакции 85 2 86 Продолжение Таблицы 5 мРНК процессинг 4 ROAA Heterogeneous nuclear 2,04↓ ribonucleoprotein A/B Регулирует образование теломер и/или их стабилизацию, а также принимает участие в контроле за апоптозом 8 HNRL2 Heterogeneous ribonucleoprotein protein 2 Процессинг гетероядерной РНК в зрелые мРНК, регуляция экспрессии генов nuclear 2,27↑ U-like Ответ на стресс 3 NDRG1 Protein NDRG1 2,2 ↓ Участвует в формировании ответа на стресс и гормоны, участвует в клеточном росте и дифференцировке 86 Структурно-функциональная организация ядра 6 CRABP2 Cellular retinoic acid-binding 2,16↓ protein 2 Является внутриклеточным липид-связывающим белков, взаимодействует с циклином D 1 NPM Nucleophosmin 2,16↑ Принимает участие в биогенезе транспорте протеинов к ядру 2 LMNB1 Lamin-B1 4,01↓ Выполняет структурные функции, принимает участие в регуляции транскрипции 7 SYNE1 Nesprin-1 2,15↑ Принимает участие в ядерной организации и структурной целостности ядра, взаимодействует с F-актином и с ядерной оболочкой рибосом, 87 Таблица 6. Белки, регулируемые под действием фрондозида А в опухолевых клетках человека линии РС3. Номера даун-регулируемых белков соответствуют номерам пятен на рисунке 29 А, номера ап-регулируемых белков соответствуют номерам пятен на рисунке 29 Б. Номер пятна на геле Название гена Название белка Степень и направление регуляции экспрессии Функция белка Иммунный ответ 2 ILB1 Interleukin-1 beta 2,96↑ Развитие и регуляция организма на патоген защитной реакции Метаболизм белков, ферментативная активность 9 18 14 TPIS TPIS TPIS Ubiquitin-conjugating enzyme 2,68↓ E2 variant 1 Вовлечен в контроль за дифференцировкой, участвует в репарации ДНК Triosephosphate isomerase 2,48↑ Катализирует обратимое взаимное преобразование триозо фосфат изомеров – дигидроксиацетон фосфата и D-глицераль-3фосфата. 2,12 ↓ Катализирует обратимое взаимное преобразование триозо фосфат изомеров – дигидроксиацетон фосфата и D-глицераль-3фосфата. 2,15↓ Катализирует обратимое взаимное преобразование триозо фосфат изомеров – дигидроксиацетон фосфата и D-глицераль-3фосфата. Triosephosphate isomerase Triosephosphate isomerase 87 10 UB2V1 88 Продолжение Таблицы 6 9 ODP2 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of 3,23↑ pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial 10 PHS Pterin-4-alpha-carbinolamine dehydratase 7 CATB Cathepsin B 2,04 ↓ 3,24 ↓ Катализирует полное преобразование пирувата в ацетил-СоА и СО Участвует в гидроксилировании фенилаланина и переработке тетрагидробиоптерина Играет важную роль в внутриклеточной деградации физиологической белков Участвует в производстве электрохимического потенциала, соединенного с синтезом АТФ UCRI Cytochrome b-c1 complex 2,39↑ subunit Rieske, mitochondrial 17 CATC Dipeptidyl peptidase 1 2,8 ↓ Катализирует вырезание концевого участка белка PHGDH D-3-phosphoglycerate dehydrogenase 2,1 ↓ Ключевой интермедиат метаболизма гексоз во многих биохимических процессах: гликолиз, глюконеогенез, фотосинтез 16 дипептидов от N- Ответ на стресс 7 HYOU1 Hypoxia up-regulated protein 1 2,64↑ Вовлечен в стресс - зависимую индукцию, играет важную роль в фолдинге белков 5 HS90B Heat shock protein HSP 902,64↓ beta Принимает участие в фолдинге, деградации и стабилизации белков 88 11 89 Продолжение Таблицы 6 DNJC3 DnaJ homolog subfamily C 2,52↓ member 3 Является кошапероном HSPA8/HSC70 2 ENPL Endoplasmin 2,32↓ Является паралогом HSP90, играет важную роль в фолдинге Toll-like рецепторов и интегринов 3 ENPL Endoplasmin 2,6 ↓ Является паралогом HSP90, играет важную роль в фолдинге Toll-like рецепторов и интегринов 4 K1C10 Организация цитоскелета, клеточная подвижность и деление Keratin, type I cytoskeletal 10 2,56↓ Образование промежуточных филаментов 11 K2C1 Keratin, type II cytoskeletal 1 2,76↓ Образование промежуточных филаментов 12 COF1 Cofilin-1 2,59↑ Является актин - связывающим белком, участвует в стабилизации цитоскелета 17 K1C9 Keratin, type I cytoskeletal 9 2,04↓ Образование промежуточных филаментов 4 KRT81 Keratin, type II cuticular Hb1 2,37↑ Образование промежуточных филаментов 5 KRT81 Keratin, type II cuticular Hb1 2,65↑ Образование промежуточных филаментов 2,24↑ Является белком, связывающим терминальный домен тяжелой цепи клатрина и стимулирующий собрание оболочки окаймлённых пузырьков из клатрина при эндоцитозе 8 EPN4 Clathrin interactor 1 89 12 90 Продолжение Таблицы 6 Структурно-функциональная организация ядра HNRPC Heterogeneous nuclear 2,17↑ ribonucleoproteins C1/C2 Связывает пре-мРНК, регулирует стабильность и уровень транскрипции связанных молекул мРНК 6 TIF1B Transcription factor 1-beta 3,68↓ Является посредником в молчании генов путем привлечения субъединицы CHD3 (Chromodomainhelicase-DNA-binding protein 3) 13 ROAA Heterogeneous nuclear 2,2 ↓ ribonucleoprotein A/B Связывает одно цепочную РНК, имеет высокое сродство к G- и U-богатым участкам гяРНК 8 PSME2 Proteasome activator complex 2,24↓ subunit 2 Вовлечен в сборку протеасом и требуется для эффективной обработки антигена 2,39↑ Вовлечен в фагоцитоз апоптотических клеток, может регулировать передачу сигналов EFNA5EPHA3 nuclear U-like 4,16↓ Процессинг гетероядерной РНК в зрелые мРНК, регуляция экспрессии генов intermediary 6 CRK II Adapter molecule crk 1 HNRL2 Heterogeneous ribonucleoprotein protein 2 1 NPM Nucleophosmin 2,93↑ Биогенез рибосом, транспорт протеинов к ядру 90 3 91 Рис. 32. Распределение белков, регулируемых тритерпеновыми гликозидами голотурий, по их функциям в опухолевых клетках линии РС3. Обращает на себя внимание тот факт, что наибольшее количество белков, регулируемых кукумариозидом А2-2, относится к группе белков, вовлеченных в структурную организацию цитоскелета и принимающих участие в движении клеток и клеточной пролиферации (32%), и, кроме того, играющих важную роль в функционировании клеточного ядра (21%) (Рис. 32 А). Такая же тенденция по распределению по функциям наблюдается и для белков, регулируемых фрондозидом А. Регулируемые им белки можно также распределить по группам, принимающим участие в регуляции и функционировании клеточного ядра (28%) и в клеточной пролиферации и подвижности (24%). По сравнению с действием кукумариозида А2-2 для фрондозида А увеличилось количество белковферментов и белков, принимающих участие в метаболизме ряда клеточных белков (до 28%) и ответе на стресс (до 17%) (Рис. 32 Б). К регулируемым гликозидами белкам цитоскелета относятся, прежде всего, кератины (type II cytoskeletal 1 и type II cuticular Hb1), принимающие участие в образовании промежуточных филаментов в клетках. Совсем недавно были обнаружены другие клеточные свойства и функции кератинов, включающие их участие в апико-базальной поляризации, подвижности, изменении размера клеток, в синтезе белка и мембранном сигналинге. Об их роли в опухолевых клетках речь пойдет ниже. Известно, что статмин (Stathmin) выполняет важную функцию в регулировании быстрой реконструкции цитоскелета и изменении динамики микротрубочек. Другое название белка - онкопротеин-18 (op18). Статмин играет ответственную роль в регулировании клеточного цикла. Повреждения или мутации этого белка приводят к его неправильной работе, что вызывает неконтролируемую пролиферацию клеток. Отсутствие у мутантного статмина способности связаться с тубулином приводит к постоянной сборке микротрубочек и митотического веретена и, следовательно, к бесконтрольному клеточному циклу, митозу и пролиферации, что является характеристическим признаком опухолевых 92 клеток (Cassimeris, 2002). Кинезины (Kinesin-1 heavy chain) являются АТФазами, принадлежащими к классу двигательных белков, двигающихся вдоль по микротрубочковым филаментам благодаря гидролизу АТФ. Эти белки поддерживают различные клеточные функции, такие как митоз, мейоз и транспорт клеточных молекул. Кинезины служат потенциальными мишенями при создании противоопухолевых лекарств. Некоторые соединения, которые ингибируют два митотических кинезина (EG5 (известный как KIF11) и центромер-ассоциированный белок Е (CENPE)) находятся на I и II фазах клинических исследований. Они используются как в монотерапии, так и в комбинации с другими лекарствами. (Rath, Kozielski, 2012). Кальдесмон (Caldesmon) − это кальмодулинсвязывающий белок и ингибитор АТФазной активности миозина в гладкой мускулатуре. Этот белок является основным регулятором формирования подосом и принимает активное участие в инвазии трансформированных и опухолевых клеткок (Yoshio et al., 2007). Клатрин (Clathrin interactor 1), также известный как эпсин (EPSIN4) является белком, обеспечивающим эндоцитоз и транспорт рецепторов нейромедиаторов и ряда других белков в составе покрытых клатрином везикул между аппаратом Гольджи и эндосомами. Кофилин (Cofilin-1) является актин-модулирующим белком, связывающим и деполимеризующим F-актиновые филаменты и ингибирующим полимеризацию G-актина. В составе комплекса с актином он транспортируется к ядру. Установлено, что кофилин является одним из главных звеньев метаболического пути в клетках рака легких, регулирующих инвазию и метастазирование опухолей и являющихся одной из мишеней в борьбе с метастазированием (Wang et al., 2007). В перечень регулируемых гликозидами белков, принимающих участие в структурнофункциональной организации ядра клеток, входит белок 2, связывающий клеточную ретиноевую кислоту (Cellular retinoic acid-binding protein 2, CRABP2), кодируемый геном CRABP2. Предполагается, что эта изоформа является важной в регуляции роста и дифференцировки клеток кожи. Было показано, что CRABP2 взаимодействует с циклином D3 и является внутриклеточным липид-связывающим белком, ассоциированным с ретиноевой кислотой. Показано, что изменение экспресии CRABP2 в клетках карциномы молочной железы MCF-7 значительно меняет их чувствительность к ингибированию опухолевого роста, индуцированного ретиноевой кислотой (Budhu, Noy, 2002). Нуклеофозмин (Nucleophosmin, NPM1), известный как ядерный фосфопротеин В23 или нуматрин, ассоциирован с ядерными нуклеопротеиновыми структурами и связывает одноцепочечные и двуцепочечные нуклеиновые кислоты. NPM1 участвует в биогенезе рибосом и способствует транспорту малых основных протеинов к ядру. Были найдены хромосомные абберации, в которые вовлечен NPM1 у пациентов с неходжскинской лимфомой, острой промиелоцитарной лимфомой, миелодиспластическим синдромом и острой миелогенной лимфомой (Falini et al., 2007). 93 Ядерные ламины (Lamin-B1) являются фибриллярными белками, обеспечивающими структурное функционирование и регуляцию транскрипции в клеточном ядре. Они участвуют в разрушении и преобразовании ядерной оболочки во время митоза, а также в расположении ядерных пор в животных клетках. Ламины часто неправильно экспрессируются или локализуются в опухолевых клетках и используются как опухолевые биомаркеры для диагностики и характеристики опухолей и прогнозирования выживания пациентов (Prokocimer et al., 2009; Foster et al., 2010). Несприн-1 (Nespirin-1, Enaptin), также известный как энаптин, участвует в поддержании ядерной организации и структурной целостности, взаимодействуя с ядерной оболочкой и F-актином в цитоплазме, а также актиновыми филаментами. Несприн-1 селективно взаимодействует с ламином или другими группами белков промежуточных филаментов, которые формируют фибриллярную матрицу на внутренней поверхности ядерной оболочки. Не так давно было обнаружено, что несприн-1 играет существенную роль в клеточной реакции на повреждения ДНК и является «новым игроком» в онкогенезе и проявлении геномной нестабильности (Sur et al., 2014). Было установлено, что фрондозид А регулирует экспрессию ряда белков – гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2, A/B и U-like protein 2). Известно, что рибонуклеопротеины С1/С2 связывают пре-мРНК и регулируют стабильность и уровень трансляции связанных молекул мРНК, а рибонуклеопротеин U-like protein 2 играет важную роль в нуклеоцитоплазматическом транспорте РНК. Кроме того, он способен связываться с MLF1 (миелоедный фактор лейкемии 1) и сохранять его в ядре. Транскрипционные корегуляторы (Transcription intermediary factor 1-beta) являются белками, взаимодействующими с транскрипционными факторами для активации либо подавления транскрипции определенных генов. Механизм действия транскрипционных корегуляторов заключается в модификации структуры хроматина, делающей ассоциированную ДНК более или менее доступной для транскрипции (Semaan et al., 2011). Одной из отличительных особенностей влияния фрондозида А на протеом опухолевых клеток РС3, в сравнении с действием кукумариозида А2-2, является регулирование (преимущественно даун-регулирование) экспрессии ряда шаперонов, принимающих участие в сборке белков и являющихся одним из элементов защитного механизма клетки в условиях стресса и неблагоприятных воздействий. Если в ответ на действие кукумариозида А2-2 наблюдается изменение экспрессии только одного белка, NDRG1, формирующего ответ на стресс и играющего ключевую роль в механизмах защиты клетки, например, в условиях кислородного голодания, то влияние фрондозида А сопровождается регулированием целого ряда "защитных" белков, таких как hypoxia up-regulated protein 1 (вовлечен в стрессзависимую индукцию, играет важную роль в фолдинге белков), heat shock protein HSP 90-beta 94 (принимает участие в фолдинге белков, стабилизирует белки в условиях теплового стресса и принимает участие в деградации белков), dnaJ homolog subfamily C member 3 (является кошапероном HSPA8/HSC70) и endoplasmin (является паралогом HSP90, играет важную роль в фолдинге Toll-like рецепторов и интегринов). Такое воздействие может свидетельствовать о более сильном подавляющем влиянии фрондозида А на жизнеспособность опухолевых клеток. В результате сравнительного анализа полученных данных нами был дополнительно установлен целый ряд белков, одинаковым образом экспрессирущихся в опухолевых клетках после их инкубирования с тритерпеновыми гликозидами. Наиболее значимыми белками были признаны белки, кодируемые генами IL1B, KRT81 и CRK II (ап-регулируемые в культуре опухолевых клеток линии РС3), так же как и белки, кодируемые генами CATB и ROAA (даунрегулируемые в опухолевых клетках линии РС3) (Табл. 5, 6). Методом поиска функциональной активности этих белков в базах данных было установлено, что эти белки принимают непосредственное участие в регуляции пролиферации опухолевых клеток, инвазии опухолей, метастазировании и апоптозе. Так, ген IL1B кодирует белок интерлейкин-1β (IL-1β). IL-1β – медиатор острого и хронического воспаления. Установлено, что IL-1β может влиять на опухолевый рост, метастазирование и ангиогенез за счет активации факторов транскрипции NF-κB и AP-1, выработки матриксных металлопротеиназ, ростовых факторов и молекул адгезии (Lewis et al., 2006; Streicher et al., 2007) и способствовать продукции цитокина IL-6, который, в свою очередь, стимулирует пролиферацию опухолевых клеток. В то же время IL-1 может ингибировать опухолевую пролиферацию, индуцируя такие цитокины, как TNF-α, IL-12, а также образование кислородных радикалов (Kaler et al., 2009; 2010). IL-1β может модулировать ангиогенез, непосредственно взаимодействуя с клетками эндотелия сосудов, или паракринно - через индукцию проангиогенных факторов. Этот цитокин стимулирует миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, экспрессию молекул адгезии, продукцию медиаторов воспаления и лейкоцитарную инфильтрацию в опухолевом очаге (Nakao et al., 2005). Другим белком, экспрессия которого одинаковым образом регулируется кукумариозидом А2-2 и фрондозидом А, является кератин тип II кутикулярный Hb1 (кодирующий ген KRT81). Исследуемые гликозиды снижали экспрессию данного белка более чем в два раза. Кератины являются структурными фибриллярными белками: α-кератины (часто их называют просто кератины) − основной тип белков, из которых образуются наружные защитные покровы позвоночных. В настоящий момент описано 28 кератинов типа I и 26 кератинов типа II. При онкологических заболеваниях кератины широко используются как диагностические маркеры, особенно в случаях эпителиальных опухолеобразований. Недавно были опубликованы данные о том, что кератины принимают активное участие в инвазии и 95 метастазировании раковых клеток, а также в чувствительности опухолей к противоопухолевой терапии, что служит поводом для дальнейшего изучения роли кератинов как многофункциональных регуляторов эпителиального опухолеобразования (Karantza, 2011). Показано, что оба тритерпеновых гликозида снижали экспрессию катепсина B (кодирующий ген CATB), который вовлечен в развитие раковых опухолей. Высокий уровень экспрессии катепсина В предложен как надежный диагностический маркер для плохого прогноза течения онкологического заболевания (Kos, Lah, 1998). Показано, что фармакологическое ингибирование активности цистеиновых катепсинов при моделировании рака поджелудочной железы у мышей подавляло рост опухоли, ее васкуляризацию и инвазивность (Joyce et al., 2004). Это хорошо согласуется с результатами исследований на модели глиобластомы мыши, где подавление экспрессии катепсина B и MMP-9 значительно снижало инвазию раковых клеток, рост опухоли и ангиогенез (Lakka et al., 2004). Установлено, что катепсины активируют классический путь апоптоза, по-видимому, путем расщепления белка Bid, который является членом проапоптотического семейства Blc-2 (Cirman et al., 2004). Важным является тот факт, что катепсины способны также вызывать независимую от каспаз программируемую клеточную гибель даже в опухолевых клетках с многочисленными дефектами в классической метаболической схеме апоптоза (Jaattela, 2004). Эти данные могут послужить основой для создания нового метода противоопухолевой терапии, основанного на увеличении проницаемости лизосомальных мембран, высвобождении катепсинов в цитозоль и активизации опосредованного катепсинами апоптоза (Erdal et al., 2005). Четвертым белком, на экспрессию которого влияют исследуемые гликозиды голотурий, оказался гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин А/В (hnRNP, кодирующий ген ROAA). Сверхэкспрессия этого белка описывалась в некоторых типах опухолей. Например, hnRNP A1 является сверхэкспрессированным в клетках олигодендроглиомы, при хронической миелогенной лейкемии и при немелкоклеточном раке легких. Хотя причина сверхэкспрессии hnRNP A/B до сих пор не ясна, было показано, что этот белок является частью молекулярного аппарата, регулирующего образование теломер и/или их стабилизацию, а также принимает участие в контроле за апоптозом (He et al., 2005; Yaowu et al., 2005). Пятым белком является Crk II. Эти белки играют важную роль в клеточной сигнализации, участвуя в формировании белковых комплексов. Увеличенный уровень белков семейства Crk наблюдается у некоторых опухолей человека, а их сверхэкспрессия в культурах эпителиальных клеток приводит к увеличению клеточной подвижности и инвазии. Эти белки являются важнейшими интеграторами сигнальных путей инвазии и миграции опухолевых клеток и формировании метастазов (Rodrigues et al., 2005). 96 3.6.2. Биоинформационный анализ На основании биоинформационного анализа функциональной активности регулируемых тритерпеновыми гликозидами голотурий белков можно заключить, что кукумариозид А2-2 и фрондозид А практически сходным образом влияют на клеточные компоненты клеток линии РС3. Установлено, что среди клеточных компонентов опухолевых клеток рака простаты человека главными мишенями действия кукумариозида А2-2 являются прежде всего элементы внутриклеточного цитоскелета (промежуточные филаменты цитоскелета) и элементы функционирования клеточного ядра (ядерная ламина, ламиновые филаменты) (Рис. 33 А), что напрямую связано с таким функциями клеток, как деление клеток (клеточный цикл, митоз, пролиферация) и клеточное движение (метастазирование, инвазия). Для фрондозида А это влияние выражено наиболее ярко. Кроме того, установлено влияние фрондозида А на функции митохондрий, главным образом на митохондриальный комплекс III (коэнзим Q-цитохром Средуктаза) дыхательной цепи митохондрий, что может свидетельствовать об вызываемом им вызываемом им ингибировании клеточного дыхания и гибели митохондрий (Рис. 33 Б). 97 Рис. 33. Результаты анализа клеточных функций белков (GO, Gene Ontology, cellular components) клеток линии РС3, экспрессия которых регулируется кукумариозидом А2-2 (А) и фрондозидом А (Б), выполненного с помощью программного пакета Cytoscape 2.5.1. и приложения BiNGO 2.0. 98 3.6.3. Верификация экспрессии белков методом вестерн-блоттинг и 2D-вестерн блоттинг После проведенного протеомного исследования опухолевых клеток линии РС3 с использованием 2D-электрофореза и последующего MALDI-MS анализа было определено 20 белков, экспрессия которых изменялась после инкубирования с кукумариозидом А2-2, и 30 белков, экспрессия которых регулировалась под воздействием фрондозида А, в два и более раза. В результате проведенных работ по анализу регулируемых белков, мы отобрали 4 белка для их верификации методом вестерн-блоттинга и 2D-вестерн-блоттинга кератин-81, катепсин В, интерлейкин-1β и Crk II, экспрессия которых одинаково регулируется как кукумариозидом А2-2, так и фрондозидом А. Экспрессия белка CRK II увеличивалась при инкубировании клеток с кукумариозидом А2-2 (Рис. 34 Б). Эксперименты по верификации белков методом иммуноблоттинга показали, что кукумариозид А2-2 достоверно увеличивает экспрессию обеих изоформ интерлейкина-1β, но в то же время экспрессия белка кератин 81 находится на уровне контроля (Рис. 34 А и В). Для подтверждения ап-регуляции кератина 81 был проведен 2D-вестерн-блоттинг. Этот эксперимент показал достоверное увеличение экспрессии данного белка по сравнению с контролем (Рис. 35 А, Б). Методом 2D-электрофореза и последующего MALDI-MS было установлено, что экспрессия катепсина В снижается после инкубирования опухолевых клеток человека линии РС3 с гликозидом в течении 48 ч. Эти данные были подтверждены только после выполнения верификации при помощи метода 2D-вестерн-блоттинг (Рис. 35 В, Г), так как при использовании одномерного иммуноблоттинга достоверных различий между контрольными клетками и клетками, инкубированными с кукумариозидом А2-2, обнаружено не было (Рис. 34 Г). Вероятнее всего это связано с тем, что при одномерном иммуноблоттинге не удается разделить изоформы интересующего белка по их изоэлектрическим точкам. 99 Рис. 34. Результаты анализа методом вестерн-блоттинг изменений в экспрессии кератина 81 (А), CrkII (Б), IL-1β (В) и катепсина В (Г) под влиянием кукумариозида А2-2 на клетки линии РС3 в течение 48 ч. Рис. 35. Результаты анализа методом 2D-вестерн-блоттинг изменений в экспрессии кератина 81 (А − контроль и Б − кукумариозид А2-2) и катепсина В (В − контроль и Г − кукумариозид А2-2) в клетках РС3 под влиянием кукумариозида А2-2 (2 мкМ) в течение 48 ч. Стрелками на гелях указаны пятна, соответствующие исследуемым белкам. 100 С помощью специфических антител методом вестерн-блоттинг был проведен анализ и верификация белков, экспрессия которых увеличивается или снижается под воздействием фрондозида А. Помимо этого, для белков кератин 81 и катепсин В была сделана верификация при помощи 2D-вестерн-блоттинга. На рисунке 36 В показано, что экспрессия интерлейкина-1β значительно повышается при инкубировании клеток РС3 с тритерпеновым гликозидом фрондозидом А. В тоже время, при использовании одномерного иммуноблотинга не заметна разница в экспрессии белка кератин 81 (Рис. 36 А). Ап-регуляция данного протеина подтверждена двумерным вестерн-блоттингом (Рис. 37 А и Б). На рисунке отчетливо видно увеличение количества кератина 81 под влиянием фрондозида А, по сравнению с контролем. Ап-регуляция наблюдалась также для белка CRK II после инкубирования опухолевых клеток человека линии РС3 с фрондозидом А в течении 48 ч. Даун-регуляция активной изоформы катепсина В была подтверждена как одномерным, так и двумерным вестерн-блоттингом (Рис. 36 Г и Рис. 37 Г). Рис. 36. Результаты анализа методом вестерн-блоттинг изменений в экспрессии кератина 81 (А), CrkII (Б), IL-1β (В) и катепсина В (Г), под влиянием фрондозида А на клетки линии РС3 в течение 48 ч. 101 Рис. 37. Результаты анализа методом 2D-вестерн-блоттинг изменений в экспрессии кератина 81 (А − контроль и Б − фрондозид А) и катепсина В (В − контроль и Г − фрондозид А) в клетках РС3 под влиянием фрондозида А (2 мкМ) в течение 48 ч. Стрелками на гелях указаны пятна, соответствующие исследуемым белкам. Таким образом, впервые был зарегистрирован ответ опухолевых клеток на воздействие тритерпеновых гликозидов на молекулярном уровне с использованием методических подходов, применяемых в протеомике. Было показано, что кукумариозид А2-2 и фрондозид А вызывают изменение экспрессии ряда белков, играющих ключевую роль в процессах функционирования опухолевых клеток. Эти молекулярные/субмолекулярные процессы участвуют в механизмах развития и деления опухолевых клеток, инвазии опухолей и контролируют процессы программируемой гибели опухолевых клеток. Следовательно, результаты, полученные с помощью методов протеомики, хорошо согласуются с предположениями, что фармакологические принципы противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов связаны со способностью гликозидов тормозить пролиферацию блокировать клеточный цикл и индуцировать апоптоз опухолевых клеток. опухолевых клеток, 102 3.7. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида А2-2 in vivo Для исследования противоопухолевой активности кукумариозида А2-2 было проведено два типа экспериментов, в которых были смоделированы поздняя и ранняя стадии заболевания мышей асцитной формой карциномы Эрлиха. Кукумариозид А2-2 вводили в виде комплекса с холестерином для того, чтобы уменьшить цитотоксическую активность этого тритерпенового гликозида. В первом типе экспериментов по моделированию поздней стадии заболевания мышам внутрибрюшинно инокулировали опухолевые клетки в количестве 20 млн клеток на мышь. Препарат вводили ежедневно внутрибрюшинно в течение 7 дней до и в течение 7 дней после инокуляции опухоли (комбинированная схема). На протяжении последующих 30 дней ежедневно проводился подсчет количества погибших животных. Схема эксперимента и результаты по подсчету средней продолжительности жизни (СПЖ) представлены в таблице 7. В результате проведенных экспериментов было показано, что в контрольной группе животных последние 2 мыши погибли на 17 день эксперимента. Средняя продолжительность жизни в контрольной группе составила 16 дней. При применении кукумариозида А2-2 увеличения СПЖ мышей не наблюдалось. В группе с использованием кукумариозида А2-2 первые 4 животных погибли на 15 день после введения опухоли, а оставшиеся 2 мыши на 16 день, СПЖ в данной группе составило 15,33 дня. Таким образом, в экспериментах с инокуляцией большого количества опухолевых клеток (20 млн клеток на одно животное), которое может соответствовать поздним стадиям развития заболевания, кукумариозид А2-2, вводимый по комбинированной схеме, не показал достоверного увеличения средней продолжительности жизни животных. Таблица 7. Зависимость влияния кукумариозида А2-2 на среднюю продолжительность жизни мышей с асцитной формой карциномы Эрлиха от количества инокулированных опухолевых клеток. Вещество 20×106 кл / мышь 2×106 кл / мышь СПЖ, сутки УПЖ, % СПЖ, сутки УПЖ, % Контроль 16,0±0,89 - 24,6±2,08 - Кукумариозид А2-2 15,33±0,52 - 29,0*±1,7 17,3±7,5 * (р < 0,05) На рисунке 38 А показана динамика выживаемости мышей с карциномой Эрлиха (20 млн клеток на животное) в контрольной группе и в группе, получавшей кукумариозид А2-2 по комбинированной схеме. 103 Рис. 38. Выживаемость мышей с асцитной карциномой Эрлиха (20 млн клеток на животное (А) и 2 млн клеток на животное (Б) в контрольной группе и в группе, получавшей кукумариозид А2-2. В следующей серии экспериментов проводили оценку противоопухолевого эффекта кукумариозида А2-2, применяемого по комбинированной схеме на животных, которым прививали 2 млн клеток на мышь. Анализ результатов проведенного исследования влияния препарата на развитие опухоли у мышей показал, что препарат в дозе 0,2 мкг/мышь тормозит развитие опухоли в течение первых 10-ти суток после инокуляции опухоли. Примерно в 25-30% случаев развитие опухоли визуально не выявлялось, в то время как в контрольной группе животных развитие опухоли констатировалось в 100% случаев. Тем не менее, к 20 дню развитие опухоли наблюдалось уже во всех группах мышей. СПЖ для контрольной группы составило 24,67 дня, в то время как при применении препарата наблюдалось статистически достоверное (р < 0,05) увеличение продолжительности жизни до 29 дней. В этом случае УПЖ составило 17,33% по отношению к контрольным животным (Табл. 7). В качестве примера на рисунке 38 Б показана динамика выживаемости мышей с карциномой Эрлиха (2 млн клеток на животное) в контрольной группе и в группе, получавшей кукумариозид А2-2 по комбинированной схеме. Статистический анализ полученных данных методом оценки лог-рангового критерия Каплан-Мейера выявил статистически значимые различия в показателе медианы выживаемости для контрольной группы животных (медиана = 22,0±0,2) и группой животных, получавших комплекс кукумариозида А2-2 и холестерина (медиана = 29,0±0,2). Таким образом, в экспериментах с инокуляцией опухолевых клеток в количестве 2 млн клеток на одно животное, что соответствует ранним стадиям заболевания, кукумариозид А2-2 показал достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных. Противоопухолевый эффект препарата может быть связан как с иммуномодулирующими свойствами тритерпенового гликозида, так и со способностью препарата индуцировать в 104 опухолевых клетках апоптоз, ингибировать в них биосинтез ДНК и блокировать клеточный цикл и пролиферацию. 3.8. Влияние кукумариозида А2-2 на противоопухолевую активность доксорубицина in vivo В экспериментах по исследованию влияния кукумариозида А2-2 на мультилекарственную устойчивость клеток АКЭ in vivo использовали методический протокол, предложенный Доненко с соавторами (Donenko et al., 1991). На первом этапе исследований животным, которым предварительно была инокулирована асцитная карцинома Эрлиха, на протяжении недели ежедневно внутрибрюшинно вводился раствор кукумариозида А2-2 для блокирования МЛУ опухолевых клеток. Контрольные животные получали физиологический раствор. Затем опухолевые клетки извлекали и инокулировали их следующей группе животных, которым в дальнейшем проводили противоопухолевую терапию доксорубицином. Было установлено, что ежедневные внутрибрюшинные инъекции раствора кукумариозида А2-2 на протяжении 5 дней вызвали уменьшение объема асцита опухоли и концентрации опухолевых клеток в асците. Концентрация опухолевых клеток карциномы Эрлиха, отобранных у контрольных мышей на 7-й день после инокуляции, составила 165±5,56×106 кл/мл. В то же время концентрация опухолевых клеток, отобранных у экспериментальных мышей, получавших гликозид, составила 36,7±3,85×106 кл/мл. Жизнеспособность клеток, оцененная в тесте с красителем трипановым синим, в обеих группах была практически 100%-ной. Одинаковое количество клеток, полученных из этих групп животных, было инокулировано последующим группам мышей для проведения противоопухолевой терапии цитостатиком доксорубицином. В результате дальнейших исследований было показано, что в контрольной группе мышей, инокулированых опухолевыми клетками от мышей, получавших только физиологический раствор, отмечалась минимальная средняя продолжительность жизни, составляющая 21,5 день. Во второй группе контрольных животных, получавших только физиологический раствор, но у которых введенные опухолевые клетки подвергались in vivo предварительному воздействию кукумариозида А2-2 на протяжении 5 дней, наблюдалось увеличение продолжительности жизни мышей по сравнению с контрольной группой. Так, последнее животное в этой группе погибло на 36-й день, в то время как в контрольной группе на 23-й день эксперимента. Средняя продолжительность жизни мышей в этой группе составила 29,8 дней (Таблица 8, Рис. 39). При применении доксорубицина в дозе 40 мкг/мышь (2 мг/кг) наблюдалось значительное увеличение продолжительности жизни. Первая мышь в данной группе погибла только на 42-й 105 день после инокулирования опухоли, вторая мышь пала на 52-й день, а оставшиеся в группе животные оставались живы вплоть до 70-го дня наблюдений. СПЖ в этой группе составила 60,8 дней, а выживаемость к 70 дню составила 60%. В группе животных, опухолевые клетки которых предварительно подвергались воздействию кукумариозида А2-2, а впоследствии обрабатывались доксорубицином, выживаемость составила 100% за весь период наблюдений в 70 дней (Таблица 8, Рис. 39). Таблица 8. Влияние кукумариозида А2-2 и доксорубицина на выживаемость мышей с асцитной формой карциномы Эрлиха (2,0×106 клеток на животное). Кук - кукумариозид А2-2, Докс доксорубицин. Группа Кукумариозид мкг/мышь А2-2, Доксорубицин, мкг/мышь - СПЖ, сутки Выживаемость, живые/общее количество 0/5 Выживаемость ,% Контроль - Контроль (Кук) 0,2 - 29,8 0/5 0 - 40 60,8 3/5 60 0,2 40 70 5/5 100 Докс Докс (Кук) 21,5 0 Доксорубицин является известным коммерческим препаратом, применяемым в терапии различных типов опухолей. Одним из отмечаемых недостатков применения доксорубицина является возникновение у опухолевых клеток резистентности к этому цитостатику вследствие активации механизма мультилекарственной устойчивости. В то же время было показано, что ряд соединений (например, блокаторы кальциевых каналов верапамил и дилтиазем) способны усиливать противоопухолевый эффект доксорубицина благодаря подавлению МЛУ опухолевых клеток (Osman et al., 2012). 106 Рис. 39. Влияние предварительной обработки кукумариозидом А2-2 мышей с асцитной карциномой Эрлиха на противоопухолевую активность доксорубицина в экспериментах in vivo. Кук - кукумариозид А2-2, Докс - доксорубицин. Было установлено, что предварительная обработка опухолевых клеток in vivo тритерпеновым гликозидом доксорубицином приводит кукумариозидом к существенному А2-2 и последующая усилению терапия противоопухолевого мышей эффекта доксорубицина. Это усиление может быть обусловлено подавлением МЛУ в клетках АКЭ, накоплению доксорубицина и усилению его цитостатического эффекта в отношении опухолевых клеток. Кроме того, нельзя исключать, что кукумариозид А2-2 может индуцировать в клетках АКЭ апоптоз и вызывать блокировку клеточного цикла и митоза (как это было показано нами в предыдущих главах), противоопухолевого эффекта доксорубицина. что может также приводить к усилению 107 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Тритерпеновые гликозиды голотурий характеризуются широким спектром биологической активности, проявление которой во многом зависит от применяемых концентраций этих соединений. С одной стороны, это ярко выраженные мембранолитические свойства, обуславливающие такие активности как гемолитическая, цитотоксическая, противомикробная и эмбриотоксическая, которые проявляются в высоких концентрациях гликозидов и, практически, не зависят от типа тестируемых клеток. С другой стороны – проявление стимулирующей активности в наномолярных концентрациях, отражается, в активировании иммуннокомпетентных клеток (Пислягин, 2013) или индукции апоптоза в опухолевых клетках и блокировании их клеточного цикла и пролиферации. Было установлено, что инкубирование опухолевых клеток мышей с тритерпеновыми гликозидами голотурий, кукумариозидом А2-2 или с фрондозидом А в нецитотоксическом диапазоне концентраций, приводит к появлению в клетках ряда маркеров апоптоза, а именно: инверсии фосфатидилсерина на внешнюю поверхность биомембран, конденсации хроматина в ядрах, появлению апоптотических телец, появлению в цитоплазме активированной каспазы-3 и увеличению количества анэуплоидных (апоптотических) клеток, соответствующих фазе клеточного цикла SubG0. Полученные данные позволяют заключить, что развитие апоптоза в клетках асцитной карциномы Эрлиха под действием гликозидов протекает по каспазозависимому пути, минуя активацию р53-зависимой стадии. Кроме того, действие гликозидов сопровождается арестом клеточного цикла в синтетической фазе S и блокированием встраивания 3Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток, что свидетельствует об ингибировании биосинтеза ДНК, торможении клеточной пролиферации, проявлении цитостатического эффекта, приводящих к последующей гибели опухолевых клеток. Индукция апоптоза под действием исследуемых гликозидов была впервые установлена в опухолевых клетках репродуктивной сферы человека, таких как клетки рака простаты, эмбриональной карциномы и тератокарциномы, известных своей агрессивностью. Было установлено, что гликозиды вызывают апоптоз не только этих клеток, но и устойчивых к цисплатину клеток. Он характеризуется активацией ряда проапоптотических каспаз (каспаза-3 и -9) и появлением продукта расщепления субстрата активированных каспаз – расщепленного белка PARP-1. Эффект кукумариозида А2-2 и фрондозида А сопровождался достоверным увеличением числа анэуплоидных клеток в фазе SubG0 и блокированием клеточного цикла в фазе митоза G2/M. Было установлено, что исследуемые тритерпеновые гликозиды способны эффективно блокировать образование и рост колоний опухолевых клеток человека, включая устойчивые к цисплатину клетки. 108 Впервые в клетках опухоли простаты человека линии РС3 были выявлены белки-мишени, экспрессия которых регулируется кукумариозидом А2-2 и фрондозидом А. Эти белки могут быть отнесены к регуляторам метаболизма белков и углеводов, к белкам цитоскелета, принимающих участие в клеточной подвижности и делении, к белкам, принимающим участие в иммунном ответе, в ответе на стресс, мРНК процессинге, а также в структурно-функциональной организации ядра клеток. Выявленные мишени, такие как статмин, кинезин, кальдесмон, клатрин, CRABP2, нуклеофозмин, ламин-В1, несприн-1, CRK II и целый ряд других, играют ключевую роль в функционировании опухолевых клеток и принимают активное участие в механизмах развития и регулирования митоза и пролиферации опухолевых клеток, миграции клеток и инвазии опухолей, и контролируют процессы программируемой гибели опухолевых клеток. Выявлено 5 белков-мишеней, экспрессия которых одинаковым образом регулируется в РС3 клетках под действием гликозидов, что может свидетельствовать об общем метаболическом пути, посредством которого гликозиды голотурий регулируют клеточное деление и пролиферацию и активируют механизмы запрограммированной гибели опухолевых клеток. Эти результаты являются крайне важными в понимании тонких молекулярных механизмов противоопухолевого действия гликозидов голотурий. Кроме того, было установлено, что тритерпеновые гликозиды, кукумариозид А2-2 и фрондозид А, в нецитотоксическом диапазоне концентраций способны достоверно блокировать множественную лекарственную устойчивость в опухолевых клетках. Такое блокирование приводит к усилению накопления в опухолевых клетках противоопухолевого цитостатика доксорубицина и увеличению времени его задерживания в клетках. Это, в свою очередь, может приводить к повышению чувствительности опухолевых клеток к цитостатическому действию доксорубицина и усилению его противоопухолевого эффекта, как это было показано в данном исследовании, а также к проявлению синергизма при сочетанной противоопухолевой терапии с помощью гликозидов и известных цитостатиков, как это ранее было продемонстрировано для препаратов кумазид и 5-фторурацил (Aminin et al., 2010). В экспериментах по изучению противоопухолевой активности кукумариозида А2-2 in vivo нами установлено, что препарат вызывает достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных с инокулированной опухолью, что проявлялось только при моделировании ранних стадий заболевания. Мы предполагаем, что противоопухолевый эффект препарата может быть связан со способностью кукумариозида А2-2 индуцировать в опухолевых клетках апоптоз, ингибировать в них биосинтез ДНК и блокировать клеточный цикл и пролиферацию. Не исключено, что дополнительный опосредованный вклад в противоопухолевый эффект может быть также внесен иммуномодулирующими свойствами гликозидов и их способностью активировать в клетках иммунной системы синтез некоторых 109 цитокинов (интерлейкины, интерферон-γ, ФНО-α), лизосомальную активность и синтез АФК (Aminin et al., 2006; 2008), что может приводить к увеличению туморогенной активности макрофагов и цитотоксических лимфоцитов. Однако, данное предположение требует дальнейшего экспериментального подтверждения. Обобщая полученные результаты и литературные данные, можно сделать вывод о том, что выделенные из голотурий Cucumaria japonica и C. frondosa тритерпеновые гликозиды, кукумариозид А2-2 и фрондозид А, являются низкомолекулярными биорегуляторами, способными индуцировать в опухолевых клетках апоптоз по каспазо-зависимому пути и блокировать клеточный цикл. Одним из главных установленных звеньев во взаимодействии гликозидов с опухолевыми клетками является изменение экспрессии некоторых внутриклеточных белков-мишеней, участвующих в ключевых этапах физиологии опухолевых клеток. Регулирование экспрессии этих белков гликозидами приводит к индукции апоптоза, ингибированию деления и миграции опухолевых клеток in vitro и, как следствие, проявлению противоопухолевого эффекта in vivo. Обнаруженный эффект ингибирования резистентности опухолевых клеток к цитостатикам вызывает увеличение накопления в клетках противоопухолевых соединений и, как следствие, усиление противоопухолевого действия этих соединений. 110 ВЫВОДЫ 1. Показано, что кукумариозид А2-2 и фрондозид А проявляют практически одинаковую цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам мыши и опухолевым клеткам репродуктивной системы человека, как чувствительных, так и устойчивых к цисплатину. Гликозиды подавляют формирование и рост колоний опухолевых клеток человека, в том числе устойчивых к действию цисплатина, что свидетельствует об их способности тормозить процесс метастазирования. 2. Установлено, что прямое взаимодействие кукумариозида А2-2 и фрондозида А с различными типами опухолевых клеток, включая устойчивые к цисплатину клетки, приводит к индукции в них апоптоза, что выражается в инверсии фосфатидилсерина на внешнюю поверхность биомембран, конденсации и фрагментации хроматина в ядрах, появлении апоптотических телец, появлении в цитоплазме каспазы-3, -9 и расщепленного PARP-1, увеличении количества анеуплоидных (апоптотических) клеток в фазе клеточного цикла SubG0. Показано, что в опухолевых клетках мышей апоптоз протекает по каспазозависимому пути, минуя активацию р53-зависимой стадии. 3. Обнаружено, что действие гликозидов на опухолевые клетки сопровождается арестом клеточного цикла в синтетической фазе S или фазе митоза G2/M в зависимости от типа опухолевых клеток и блокированием встраивания 3 Н-тимидина в опухолевые клетки, свидетельствующим об ингибировании биосинтеза ДНК. 4. В клетках опухоли простаты человека линии РС3 выявлено 20 белков-мишеней, экспрессия которых изменяется в 2 и более раза при инкубировании клеток с кукумариозидом А2-2, а также 30 белков-мишеней, экспрессия которых изменяется под воздействием фрондозида А. Эти белки относящиеся к регуляторам метаболизма белков и углеводов, к белкам цитоскелета, участвующим в клеточной подвижности и делении, принимают участие в иммунном ответе, в ответе на стресс, в мРНК процессинге, а также в структурнофункциональной организации ядра клеток. Причем экспрессия 5 белков менялась под воздействием обоих гликозидов одинаковым образом. 5. Показано, что кукумариозид А2-2 и фрондозид А в нецитотоксическом диапазоне концентраций достоверно блокируют множественную лекарственную устойчивость в опухолевых клетках карциномы Эрлиха мышей. Такое блокирование приводит к усилению накопления в ядрах опухолевых клеток противоопухолевого цитостатика доксорубицина и увеличению времени его задерживания в клетках. 6. Установлено, что применение кукумариозида А2-2 in vivo вызывает достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных с инокулированной асцитной 111 карциномой Эрлиха, что проявлялось только при моделировании ранних стадий заболевания. При проведении противоопухолевого комбинированной эффекта терапии доксорубицина отмечено после кукумариозидом А2-2 мышей с асцитной карциномой Эрлиха. выраженное предварительной усиление обработки 112 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 2D-вестерн-блоттинг – двумерный вестерн-блоттинг, 2D-PAGE – дмумерный электрофорез в полиакриламидном геле, АКЭ – асцитная карцинома Эрлиха, МЛУ – множественная лекарственная устойчивость, СПЖ – средняя продолжительность жизни, ТХУ – трихлоруксусная кислота, УПЖ – увеличение продолжительности жизни, ФДА – флуоресцеин диацетат, ФС – фосфатидилсерин, ФСБР – фосфатно-солевой буферный раствор, ЯМР – ядерный магнитный резонанс, DMEM – среда Игла, модифицированная Дульбекком, EC50 – полумаксимальная эффективная концентрация, ERK и FAK – киназы, участвующие в контроле за клеточной жизнеспособностью, пролиферацией, дифференцировкой, подвижностью и миграцией, FBS – эмбриональная телячья сыворотка, FITC – флуоресцеин изотиоционат, IC50 – полумаксимальная ингибирующая концентрация, IL – интерлейкин, LD50 – полулетальная доза, MALDI-MS – MALDI времяпролетная масс-спектрометрия. Масса молекулы оценивается по времени пролета от источника ионизации до детектора, MMP-9 – металлопротеиназа-9, принимающая участие в метастазировании опухолей, MTT – 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид, PARP – поли (АДФ-рибоза)-полимераза, PI – пропидиум иодид, PVDF-мемрана – мембрана из поливинилиденфторида, TNF-α – фактор некроза опухоли - α. 113 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Авилов С.А., Стоник В.А., Калиновский А.И. Строение четырех новых тритерперовых гликозидов из морской голотурии Cucumaria japonica // Химия природ. соед. 1990. № 6. C. 787–798. 2. Авилов С.А., Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А. Кукумариозид G2 – минорный тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix // Химия природ. cоед. 1991а. № 3. C. 438–439. 3. Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Два новых тритерпеновых гликозида из голотурии Duasmodactyla kurilensis // Химия природ. cоед. 1991б. № 2. C. 221–226. 4. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир, 1983. 264 c. 5. Аминин Д.Л., Анисимов М.М., Мокрецова Н.Д., Стригина Л.И., Левина Э.В. Влияние тритерпеновых и стероидных гликозидов на овоциты, яйца и эмбрионы голотурии Stichopus Japonicus и морского ежа Strongylocentrorus nudus // Биол. моря. 1986. № 3. C. 49–52. 6. Аминин Д.Л., Анисимов М.М., Попов А.М., Корепанова Е.А., Осипов А.Н., Калиновская Н.И., Афиятуллов Ш.Ш. Влияние тритерпеновых гликозидов голотоксина А1 и кукумариозида G1 на липидные бислои, содержащие стерины // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1990. № 5. С. 657–662. 7. Аминин Д.Л., Лебедев А.В., Левицкий Д.О. Влияние голотоксина А1 на перенос ионов кальция через липидные модели биологических мембран // Биохимия. 1990a. Т. 55, № 2. C. 270–275. 8. Анисимов М.М. Тритерпеновые гликозиды и структурно-функциональные свойства мембран // Биологические науки. 1987. № 10. С. 49–63. 9. Анисимов М.М., Стригина Л.И., Баранова С.И., Кульга А.Л., Четырина Н.С. Об антимикробной активности тритерпеновых гликозидов из Caulophyllum robustum Maxim. // Антибиотики. 1972. № 9. С. 834–837 10. Анисимов М.М., Щеглов В.В., Кузнецова Т.А., Еляков Г.Б. Чувствительность клеток Candida albicans к действию тритерпеновых гликозидов дальневосточного трепанга Stichopus japonicus Selenka // Микробиология. 1973. В. 4. С. 667–671. 11. Анисимов М.М., Щеглов В.В., Дзизенко С.Н., Стригина Л.И., Уварова Н.И., Ошипок Г.И., Кузнецова Т.А., Четырина Н.С, Сокольский И.Н. Влияние некоторых стеринов на антимикробную активность тритерпеновых гликозидов растительного и животного происхождения // Антибиотики. 1974. № 7. С. 625–628. 12. Анисимов М.М., Щеглов В.В., Стригина Л.И., Четырина Н.С., Уварова Н.И., Ошиток Г.И., Аладьина Н.Г., Вечерко Л.П., Зорина А.Д., Матюхина Л.Г., Салтыкова И.А. Химическое 114 строение и антигрибковая активность некоторых тритерпеноидов // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1979. № 4. С. 570–575. 13. Анисимов М.М., Чирва В.Я. О биологической роли тритерпеновых гликозидов. // Успехи современной биологии. 1980. Т 6, № 3. C. 351–364. 14. Анисимов М.М., Аминин Д.Л., Ровин Ю.Г., Лихацкая Г.Н., Попов А.М., Кузнецова Т.А., Калиновская Н.И., Еляков Г.Б. Об устойчивости клеток голотурии Stichopus japonicus к действию эндотоксина — стихопозида А // Докл. АН СССР. 1983. T. 270, № 4. C. 991–993. 15. Анисимов М.М., Лихацкая Г.Н., Прокофьева Н.Г., Стехова С.И., Шенцова Е.Б., Стригина Л.И. Свободные и гликозилированные тритерпеноиды как модификаторы структурнофункциональных свойств биологических и модельных мембран // Успехи в изучении природных соединений. Владивосток: Дальнаука, 1999. С. 124–140. 16. Анисимов М.М., Стригина Л.И., Горовой П.Г., Аминин Д.Л., Агафонова И.Г. Химический состав и медико-биологические свойства тритерпеновых гликозидов дальневосточного растения Caulophyllum robustum (семейство Berberidaceae) // Раст. ресурсы. 2000. № 1. С. 107–129. 17. Баранова С.И., Кульга А.Л., Анисимов М.М., Стоник В.А., Левина Э.В., Левин В.С., Еляков Г.Б. Сравнительное изучение влияния гликозидных фракций тихоокеанских голотурий на биосинтез РНК в культуре дрожжевых клеток // Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1973. № 2. С. 284–286. 18. Вильсон Э. Тесты на цитотоксичность и жизнеспособность. Культура животных клеток. Методы (Под ред. Фрейшни Р). М.: Мир, 1989. 335 с. 19. Гришин Ю.И., Анисимов М.М. Тритерпеновые гликозиды и структурно-функциональные свойства мембран // Биол. науки. 1987. № 10. С. 49–63. 20. Деканосидзе Г.Е., Чирва В.Я., Сергиенко Т.В., Уварова Н.И. Исследование тритерпеновых гликозидов (установление строения и синтез). (Кемертелидзе Э.П. Ред.). Тбилиси: Мецниереба, 1982. 151 с. 21. Деканосидзе Г.Е., Чирва В.Я. Сергиенко Т.В. Биологическая роль, распространение и химическое строение тритерпеновых гликозидов. (Кемертелидзе Э.П. Ред.). Тбилиси: Мецниереба, 1984. 352 c. 22. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Тритерпеноиды морских организмов. М.: Наука. 1986. 270 с. 23. Калинин В.И., Калиновский В.И., Стоник В.А., Дмитренок П.А., Елькин Ю.Н. Структура псолюсозида В – неголостанового тритерпенового гликозида из голотурии рода Psolus // Химия природ. cоед. 1989. № 3. C. 361–368. 24. Калинин В.И. Морфологические закономерности в эволюции тритерпеновых гликозидов голотурий (Holothurioidea, Echinodermata) // Ж. общ. биол. 1992. Т. 53, № 5. C. 672–688. 115 25. Калинин В.И., Левин В.С., Стоник В.А. Химическая морфология: тритерпеновые гликозиды голотурий (Holothurioidea, Echinodermata). Владивосток: Дальнаука. 1994, 284 с. 26. Лихацкая Г.Н., Яровая Т.П., Руднев В.С., Попов А.М., Анисимов М.М., Ровин Ю.Г. Образование комплекса тритерпенового гликозида голотурина А с холестерином в липосомальных мембранах // Биофизика. 1985. T. 30, №. 2. C. 358–359. 27. Лихацкая Г.Н. Механизмы взаимодействия тритерпеновых и стероидных гликозидов с липидными мембранами: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук: 03.00.02 / Владивосток, 2006. 23 с. 28. Лихацкая Г.Н. Тритерпеновые и стероидные гликозиды и мембраны. Молекулярные механизмы взаимодействия гликозидов с мембранами. Владивосток: LAP LAMBERT Academic Publishing GmbH & Co. KG. 2011. 115 с. 29. Мальцев И.И., Стехова С.И., Шенцова Е.Б., Анисимов М.М., Стоник В.А. Противомикробная активность гликозидов из голотурий семейства Stichopodidae // Хим.фарм. журн. 1985. № 1. C. 54–56. 30. Мартынова E.A. Регуляция активности каспаз в апоптозе // Биоорг. Химия. 2003. Т. 29. № 5. С. 518–543. 31. Мац М.Н., Корхов В.В., Степанов В.Р., Купера Е.В., Олейникова Г.К., Анисимов М.М. Контрацептивная активность тритерпеновых гликозидов-суммы голотоксинов А1 и В1 и голотурина А в эксперименте //Фармакология и токсикология. 1990. Т.53. № 2. С. 45–47. 32. Пислягин Е.А. Молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия кукумариозида А2-2: автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.01.04 / Пислягин Евгений Александрович. Владивосток, 2013. 24 с. 33. Поверенный А.М. Вероятные причины высокой радиочувствительности системы кроветворения // Радиобиология. 1990. Т. 30, №. 4, С. 538. 34. Поликарпова С.И., Волкова О.Н., Седов A.M., Стоник В.А., Лиходед В.Г. Цитогенетическое изучение мутагенности кукумариозида// Генетика. 1990. Т 26, № 9. С. 1682–1684. 35. Попов А.М., Лоенко Ю.Н., Анисимов М.М. Изменение чувствительности опухолевых клеток к действию тритерпеновых гликозидов липосомами // Антибиотики. 1981. T. 26, № 3. C. 127–129. 36. Попов А. М., Калиновская Н. И., Кузнецова Т. А., Агафонова И. Г., Анисимов М. М. Роль стеринов в мембранотропной активности тритерпеновых гликозидов // Антибиотики. 1983. № 9. C. 656–659. 37. Попов А.М. Изучение мембранотропной активности некоторых тритерпеновых гликозидов: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.00.04 / Попов Александр Михайлович. – Владивосток, 1984. 24 с. 116 38. Попов A.M., Атопкина иммуномодулирующей Л.Н., активности Самошина Н.Ф., тетрациклических Уварова Н.И. тритерпеновых Изучение гликозидов даммаранового и голостанового ряда // Антибиотики и химиотерапия. 1994. Т. 39. С. 19–25. 39. Попов А.М. Механизмы биологической активности гликозидов женьшеня: сравнение с гликозидами голотурий // Вестник ДВО РАН. 2006. № 6. С. 92–104. 40. Прокофьева Н.Г., Анисимов М.М., Стригина Л.И., Киселева М.И., Гафуров Ю.М. Влияние реакции среды на цитотоксическую и противоопухолевую активность тритерпенового гликозида каулозида С. // Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей. Черноголовка. 1987. С. 37. 41. Прокофьева Н. Г., Лихацкая Г. Н., Волкова О. В., Анисимов М. М., Киселева М. И., Ильин С. Г., Будина Т. А., Похило Н. Д. Действие бетулафолиентетраола на эритроцитарные и модельные мембраны // Биологические мембраны. 1992. Т. 9, №. 9. С. 954–960. 42. Реунов А.В., Реунов А.А. Литическая функция клетки. М.: Наука, 2008. 181 с. 43. Рубцов Б.В., Ружницкий А.О., Клебанов Г.И., Седов А.М., Владимиров Ю.А. Влияние некоторых тритерпеновых гликозидов морских беспозвоночных на проницаемость биологических и искусственных мембран // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1980. № 3. C. 436– 445. 44. Северин Е.С., Родина А.В. Проблемы и перспективы современной противоопухолевой терапии // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 43–64. 45. Софьина З.П. Модели и методы, применяемые для отбора противоопухолевых препаратов в СССР и за рубежем // Вопр. онкологии. 1976. T. 22, № 4. C. 82–96. 46. Стехова С.И., Анисимов М.М., Атопкина Л.Н., Самошина Н.Ф., Похило Н.Д., Уварова Н.И. Связь между химическим строением и антистафилококковой активностью полиолов даммаранового ряда и их глюкозидов // Раст. ресурсы. 1998. Вып. 1. С. 51–56. 47. Стоник В.А. Морские полярные стероиды // Успехи химии. 2001. T. 70, № 8. C. 763–807. 48. Стоник В.А., Аминин Д.Л., Богуславский В.М., Авилов С.А., Агафонова И.Г., Сильченко А.С., Понамаренко Л.П., Прокофьева Н.Г., Чайкина Е.Л. Иммуномодулирующее средство Кумазид и фармацевтическая композиция на его основе» // Патент РФ № 2271820, Заявка № 2004120434 от 15, 02.07.2004, приоритет 02.07.2004. 49. Турищев C.H, Большакова Г.Б, Саканделидзе О.Г. Влияние комплексов тритерпеновых гликозидов из голотурий на регенерацию печени // Изв. АН СССР Сер.биол. 1991. № 2. С. 306–310. 50. Федоров С.Н., Шубина Л.К., Капустина И.И., Авилов С.А., Стоник В.А, Квак Я.Й., Парк Д.Ин., Джин Д.О., Квон Я.Х. Средство стимулирующее апоптоз клеток лейкемии человека // Патент РФ № 2360692, Бюл. № 9 от 10.07.09. 117 51. Шенцова Е. Б., Анисимов М. М., Лоенко Ю. Н., Атопкина Л. Н., Самошина Н. Ф., Уварова Н. И. Влияние гликозидов бетулафолиентриола и его 3-эпимера на рост опухолевых клеток in vitro // Антибиотики и химиотерапия. 1989. Т. 34, №. 11. С. 831–833. 52. Щеглов В.В., Баранова С И., Анисимов М.М, Антонов А.С., Афиятуллов Ш.Ш., Левина Э.В., Шарыпов В.Ф., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Изучение антимикробного спектра действия некоторых тритерпеновых и стероидных гликозидов // Антибиотики. 1979. № 4. С. 270–273. 53. Al Marzouqi N., Iratni R., Nemmar A., Arafat K., Ahmed Al Sultan M., Yasin J., Collin P., Mester J., Adrian T.E., Attoub S. Frondoside A inhibits human breast cancer cell survival, migration, invasion and the growth of breast tumor xenografts // Eur. J. Pharmacol. 2011. V. 668, No 1-2. P. 25–34. 54. Althunibat O.Y., Ridzwan B.H., Taher M., Jamaludin M.D., Ikeda M.-A., Zali B.I. In vitro antioxidant and antiproliferative activities of three Malaysian sea cucumber species // Eur. J. Sci. Res. 2009. V. 37, No. 3. P. 376–387. 55. Aminin D. Immunomodulatory properties of sea cucumber triterpene glycosides // Handbook of Toxinology, Marine and Freshwater Toxins / Ed. P. Gopalakrishnakone. Springer, 2013. - Chap. 3. Article ID: 364655. 56. Aminin D.L., Pinegin B.V., Pichugina L.V., Zaporozhets T.S., Agafonova I.G., Boguslavski V.M., Silchenko A.S., Avilov S.A., Stonik V.A. Immunomodulatory properties of cumaside // Int. Immunopharmacol. 2006. No. 6/7. Р. 1070–1082. 57. Aminin D.L., Agafonova I.G., Kalinin V.I., Silchenko A.S., Avilov S.A., Stonik V.A., Collin P.D., Woodward C. Immunomodulatory properties of frondoside A, a major triterpene glycoside from the north atlantic commercially harvested sea cucumber Cucumaria frondosa // J. Med. Food. 2008. V. 11, No. 3. P. 443–453. 58. Aminin D.L., Chaykina E.L., Agafonova I.G., Aviliv S.A. Antitumor activity of the immunomodulatory lead Cumaside // Int. Immunopharmacol. 2010. No. 10. P. 648–654. 59. Aminin D.L., Zaporozhets T.S., Adryjashchenko P.V., Avilov S.A., Kalinin V.I., Stonik V.A. Radioprotective properties of cumaside, a complex of triterpene glycosides from the sea cucumber Cucumaria japonica and cholesterol // Nat. Prod. Commun. 2011. V. 6, No. 5. P. 587–592. 60. Anisimov M.M., Fronert E.B., Kuznetsova T.A., Elyakov G.B., The toxic effect of triterpene glycosides from Stichopus japonicus Selenka on early embryogenesis of the sea urchin // Toxicon. 1973. V. 11. P. 109–111. 61. Anisimov M. M., Shcheglov V. V., Stonik V. A., Fronert E. B. and Elyakov G. B. The toxic effect of cucumarioside C from Cucumaria fraudatrix on early embryogenesis of the sea urchin // Toxicon. 1974. V. 12. P. 327–329. 118 62. Anisimov M.M, Popov A.M., Dzizenko S.N. The effect of lipids from sea urchin embryos on cytotoxic activity of certain triterpene glycosides // Toxicon. 1979. V. 17, No 3. P. 319 – 321. 63. Anisimov M.M., Cirva V.J. Die biologische Bewertung von Triterpenglykosiden // Pharmazie. 1980. V. 35, No. 12. P. 731–738. 64. Attoub S., Arafat K., Gelaude A., Al Sultan M.A., Bracke M., Collin P., Takahashi T., Adrian T.E., De Wever O. Frondoside A suppressive effects on lung cancer survival, tumor growth, angiogenesis, invasion, and metastasis // PLoS One. 2013. V. 8, No. 1. e53087. 65. Avilov S.A., Silchenko A.S., Antonov A.S., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Smirnov A.V., Dmitrenok P.S., Evtushenko E.V., Fedorov S.N., Savina A.S., Shubina L.K., Stonik V.A. Synaptosides A and A1, triterpene glycosides from the sea cucumber Synapta maculata containing 3-O-methylglucuronic acid and their cytotoxic activity against tumor cells // J. Nat. Prod. 2008. V. 71, No. 4. P. 525–531. 66. Belloc F., Patrice Dumain P., Boisseau M.R., Jalloustre C., Reiffers J., Bernard P., Lacombe F. A flow cytometric method using Hoechst 33342 and propidium iodide for simultaneous cell cycle analysis and apoptosis determination in unfixed cells // Cytometr. 1994. V. 17, No. 1. P. 59–65. 67. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical biochemistry. 1976. V. 72. P. 248–254. 68. Braga F., Ayres-Saraiva D., Gattass C.R., Capella M.A.M. Oleanolic acid inhibits the activity of the multidrug resistance protein ABCC1 (MRP1) but not of the ABCB1 (P-glycoprotein): Possible use in cancer chemotherapy // Cancer Lett. 2007. V. 248, No. 1. P. 147–152. 69. Budhu A.S., Noy N. Direct channeling of retinoic acid between cellular retinoic acid-binding protein II and retinoic acid receptor sensitizes mammary carcinoma cells to retinoic acid-induced growth arrest // Mol. Cell. Biol. 2002. V. 22, No. 8. P. 2632–2641. 70. Cao D., Fan S.T., Chung S.S.M. Identification and characterization of a novel human aldose reductase-like gene // J. Biol. Chem. 1998. V. 273, No. 19. P. 11429–11435. 71. Careaga V.P., Bueno C., Alché C.M.L., Maier M.S. Antiproliferative, Cytotoxic and Hemolytic Activities of a Triterpene Glycoside from Psolus patagonicus and Its Desulfated Analog // Chemotherapy. 2009. No. 55. P. 60–68. 72. Cassimeris L. The oncoprotein 18/stathmin family of microtubule destabilizers // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. V. 14, No. 1, P. 18–24. 73. Chaabane W., User S.D., El-Gazzah M., Jaksik R., Sajjadi E., Rzeszowska-Wolny J., Łos M. Autophagy, apoptosis, mitoptosis and necrosis: interdependence between those pathways and effects on cancer // Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 2013. V. 61. P. 43–58. 119 74. Cirman T., Oresić K., Mazovec G.D., Turk V., Reed J.C., Myers R.M., Salvesen G.S., Turk B. Selective disruption of lysosomes in HeLa cells triggers apoptosis mediated by cleavage of Bid by multiple papain-like lysosomal cathepsins // J. Biol. Chem. 2004. V. 279, No. 5. P. 3578–3587. 75. Curtin. J.F., Cotter T.G., Anisomycin activates JNK and sensitises DU 145 prostate carcinoma cells to Fas mediated apoptosis // Br. J. Cancer. 2002. V. 87. P. 1188–1194. 76. Donenko F.V., Efferth T., Mattern J., Moroz L.V., Volm M: Resistance to doxorubicin in tumor cells in vitro and in vivo after pre-treatment with verapamil // Chemotherapy. 1991. V. 37. P. 57– 61. 77. Endicott J., Ling V. The biochemistry of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance // Annu. Rev. Biochem. 1989. V. 58. P. 137–171. 78. Erdal H., Berndtsson M., Castro J., Brunk U., Shoshan M.C., Linder S. Induction of lysosomal membrane permeabilization by compounds that activate p53-independent apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102, No. 1. P. 192–197. 79. Falini B., Nicoletti I., Bolli N., Martelli M.P., Liso A., Gorello P., Mandelli F., Mecucci C., Martelli M.F. Translocations and mutations involving the nucleophosmin (NPM1) gene in lymphomas and leukemias // Haematologica. 2007. V. 92, No. 4. P. 519–532. 80. Fan T.-J., Yuan W.-P., Cong R.-S., Yang X.-X., Wang W.-W., Jing Z. Studies on the purification of water-soluble holothurian glycosides from Apostichopus japonicus and their tumor suppressing activity // Yaoxue Xuebao. 2009. V. 44, No. 1. P. 25–31. 81. Fernandes J., Castilho R.O., da Costa M.R., Wagner-Souza K., Kaplan M.A.C., Gattass C.R. Pentacyclic triterpenes from Chrysobalanaceae species: cytotoxicity on multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines // Cancer Lett. 2003. V. 190, No. 2. P. 165–169. 82. Foster C.R., Przyborski S.A., Wilson R.G., Hutchison C.J. Lamins as cancer biomarkers // Biochem. Soc. Trans. 2010. V. 38. P. 297–300. 83. Franken N.A., Rodermond H.M., Stap J., Haveman J., van Bree C. Clonogenic assay of cells in vitro // Nat. Protoc. 2006. V. 1, No. 5. P. 2315–2319. 84. Germann U.A., Harding M.W. Chemosensitizers to overcome and prevent multidrug resistance // J. Nat. Cancer Inst. 1995. V. 87. P. 1573–1575. 85. Gorshkov B.A., Gorshkova I.A., Stonik V.A., Elyakov G.B. Effect of marine glycosides on adenosine triphospatase activity // Toxicon. 1982. V. 20, No. 3. P. 655–658. 86. Gorshkova I.A., Kalinovsky A.I., Ilyin S.G., Gorshkov B.A., Stonik V.A. Physicochemical characteristics of interaction of toxic triterpene glycosides from holothurians with rat brain Na+K+-ATPase // Toxicon. 1989. Vol. 27, No. 8. P. 937–945. 120 87. Gorshkova I.A., Kalinin V.I., Gorshkov B.A., Stonik V.A. Two different modes of inhibition of the rat brain Na+-K+-ATPase by triterpene glycosides, psolusosides A and B, from the holothurian Psolus fabricii // Comp. Biochem. Physiol. 1999. V. 122, No. 1. P. 101–108. 88. Gorshkova I.A., Ilyin S.G., Stonik V.A. Physicochemical characteristics of interaction of saponins from holothurians (sea cucumber) with cell membranes // Saponins in food, feedstuffs and medicinal plants. Proceedings of the Phythochemical Society of Europe. 2000. V. 45. P. 219–225. 89. Grishin Y., Morozov E., Avilov S. Preliminary studies of antiviral activity of triterpene glycosides from holothurians // In 8th conference of young scientists on organic and bioorganic chemistry; Latvian Academy of Sciences, Institute of Organic Synthesis: Riga, 1991. P. 181. 90. Habermehl G., Volkwein G. Aglycones of the toxins from the cuvierian organs of Holothuria forskali and a new nomenclature for the aglycones from Holothurioideae // Toxicon. 1971. V. 9, No. 4. P. 319–326. 91. Han H., Xu Q-Z., Tang H-F., Yi Y-H., Gong W. Cytotoxic holostane-type triterpene glycosides from the sea cucumber Pentacta quadrangularis // Planta Med. 2010. V. 76. P. 1900–1904. 92. Haugland R.P. Handbook of fluorescent probes and research products // Molecur Probs Inc. Ed. Gregory J. 9th edition. USA. 2002. 966 p. 93. Hazzalin C.A., Le Panse R., Cano E., Mahadevan L.C. Anisomycin selectively desensitizes signalling components involved in stress kinase activation and fos and jun induction // J. Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18, No. 4. P. 1844–1854. 94. He Y., Brown M.A., Rothnagel J.A., Saunders N.A., Smith R. Roles of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A and B in cell proliferation // J. Cell Sci. 2005. V. 118. P. 3173–3183. 95. Jaattela M. Multiple cell death pathways as regulators of tumour initiation and progression // Oncogene. 2004. V. 23, No. 16. P. 2746–2756. 96. Janakiram N.B., Zhang Y., Choi C.-I., Woodward C., Peter Collin, Steele V.E., Rao C.V. Chemopreventive effects of Frondanol A5, a Cucumaria frondosa extract, against rat colon carcinogenesis and inhibition of human colon cancer cell growth // Cancer Prev. Res. 2010. V. 3. P. 82–91. 97. Jin J.-O, Shastina V.V., Shin S.-W., Xu Q., Park J.-I., Rasskazov V.A., Avilov S.A., Fedorov S.N., Stonik V.A., Kwak J.-Y. Differential effects of triterpene glycosides, frondoside A and cucumarioside A2-2 isolated from sea cucumbers on caspase activation and apoptosis of human leukemia cells // FEBS Letters. 2009. V. 583, No. 4. P. 697–702. 98. Joyce J.A., Baruch A., Chehade K., Meyer-Morse N., Giraudo E., Tsai F.Y., Greenbaum D.C., Hager J.H., Bogyo M., Hanahan D. Cathepsin cysteine proteases are effectors of invasive growth and angiogenesis during multistage tumorigenesis // Cancer Cell. 2004. V. 5, No. 5. P. 443–453. 121 99. Kaler P, Godasi B.N., Augenlicht L., Klampfer L. The NF-κB/AKT-dependent induction of Wnt signaling in colon cancer cells by macrophages and IL-1β // Cancer Microenvironment. 2009. V. 2, No. 1. P. 69–80. 100. Kaler P., Galea V., Augenlicht L., Klampfer L. Tumor associated macrophages protect colon cancer cells from TRAIL-Induced apoptosis through IL-1β- Dependent stabilization of snail in tumor cells // PLoS One. 2010. V. 5, No 7. e11700. 101. Kalinin V.I., Volkova O.V., Likhatskaya G.N., Prokofieva N.G., Agafonova I.G., Anisimov M.M., Kalinovsky A.I., Avilov S.A., Stonik V.A. Hemolytic activity of triterpene glycosides from the Cucumariidae family holothurians and evolution of this group of toxins // J. Nat. Toxins. 1992. V. 1, No. 2. P. 17–30. 102. Kalinin V.I., Silchenko A.S., Avilov S.A., Stonik V.A., Smirnov A.V. Sea cucumbers triterpene glycosides, the recent progress in structural elucidation and chemotaxonomy // Phytochem. Rev. 2005. V. 4, No. 2–3. P. 221–236. 103. Kalinin V.I., Aminin D.L., Avilov S.A., Silchenko A.S., Stonik V.A. Triterpene glycosides from sea cucumbers (Holothurioidae, Echinodermata), biological activities and functions // Studies in Natural Product Chemistry (Bioactive Natural Products). Ed. Atta-ur-Rahman. Amsterdam, Elsevier Science Publisher. 2008. V. 35. P. 135–196. 104. Karantza V. Keratins in health and cancer: more than mere epithelial cell markers // Oncogene. 2011. V. 30, No. 2. P. 127–138. 105. Kashiwada Y., Nishimura K., Kurimoto S.-I., Takaishi Y. New 29-nor-cycloartanes with a 3,4- seco- and a novel 2,3-seco-structure from the leaves of Sinocalycanthus chinensis // Bioorg. & Med. Chem. 2011. V. 19, No. 9. P. 2790–2796. 106. Kim S.K., Himaya S.W. Triterpene glycosides from sea cucumbers and their biological activities // Adv. Food Nutr. Res. 2012. V. 65. P. 297–319. 107. Kim Y.K., Yoon S.K., Ryu S.Y. Cytotoxic Triterpenes from Stem Bark of Physocarpus intermedius // Planta Med. 2000. V. 66, No. 5. P. 485–486. 108. Kitagawa I., Sugawara T., Yosioka I. Antifungal glycosides from the sea cucumber Stichopus japonicus Selenka. Structures of holotoxin A and holotoxin B // Chem. Pharm. Bull., 1976. V. 24. P. 275–284. 109. Kitagawa I., Kobayashi M., Hori M., Kyogoku Y. Marine Natural Products. XVIII. Four lanostane-type triterpene oligoglycosides, bivittosides A, B, C and D from the okinava sea cucumber Bohadsia Mitsukuri // Chem. Pharm. Bull. 1989. V. 37. No. 1. P. 61–67. 110. Kochi S.K.,Collier R.J. DNA fragmentation and cytolysis in U937 cells treated with diphtheria toxin or other inhibitors of protein synthesis // Exp Cell Res. 1993. V. 208, No. 1. P. 296–302. 122 111. Kos J., Lah T.T. Cysteine proteinases and their endogenous inhibitors: target proteins for prognosis, diagnosis and therapy in cancer (review) // Oncol Rep. 1998. V. 5, No. 6. P. 1349–1361. 112. Kovalchuk S.N., Kozhemyako V.B., Atopkina L.N., Silchenko A.S., Avilov S.A, Kalinin V.I., Rasskazov V.A., Aminin D.L. Estrogenic activity of triterpene glycosides in Yeast Two-Hybrid Assay // J. Steroid Biochem. and Mol. Biol. 2006. V. 101, No. 4–5. P. 226–231. 113. Kung G., Konstantinidis K., Kitsis R.N. Programmed necrosis, not apoptosis, in the heart // Circulation Research. 2011. P. 1017–1036. 114. Kuznetsоva T.A., Anisimov M.M., Popov A.M., Baranova S.I., Afiyatullov Sh.Sh., Kapustina I.I., Antonov A.S., Elyakov G.B. A comparative study in vitro of physiological activity of triterpene glycosides of marine invertebrates of Echinoderm type // Comp. Biochem. Physiol. 1982. V. 73, No. 1. P. 41–43. 115. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227, No. 5259. P. 680–685. 116. Lakka S.S., Gondi C.S., Yanamandra N., Olivero W.C., Dinh D.H., Gujrati M., Rao J.S. Inhibition of cathepsin B and MMP-9 gene expression in glioblastoma cell line via RNA interference reduces tumor cell invasion, tumor growth and angiogenesis // Oncogene. 2004. V. 23, No 27. P. 4681–4689. 117. Lewis A.M.,Varghese S., Xu H., Alexander H.A. Interleukin-1 and cancer progression: the emerging role of interleukin-1 receptor antagonist as a novel therapeutic agent in cancer treatment // J Transl Med. 2006. V. 4. P. 48. 118. Li M., Miao Z.H., Chen Z., Chen Q, Gui M., Lin L.-P., Sun P., Yi Y.-H., Ding J. Echinoside A, a new marine-derived anticancer saponin, targets topoisomerase2α by unique interference with its DNA binding and catalytic cycle // Ann. Oncol. 2010. V. 21. P.597–607. 119. Li P., Nijhawan D., Budihardjo I., Srinivasula S.M., Ahmad M., Alnemri E.S., Wang X. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade // Cell. 1997. V. 91. P. 479–489. 120. Li J., Guo W.-J., Yang Q.-Y. Effects of ursolic acid and oleanolic acid on human colon carcinoma cell line HCT15 // World Journal of Gastroenterology. 2002. V. 8, No. 3. P. 493–495. 121. Li X., Roginsky A.B., Ding X-Z., Woodward C., Collin P., Newman R.A., Bell R.H., Adrian T.E. Review of the apoptosis pathways in pancreatic cancer and the apoptotic effects of the novel sea cucumber compound, frondoside A // Ann. NY Acad. Sci. 2008. P. 181–198. 122. Liu B.S., Yi Y.H., Li L., Sun P., Han H., Sun G.Q., Wang X.H., Wang Z.L. Argusides D and E, two new cytotoxic triterpene glycosides from the sea cucumber Bohadschia argus Jaeger // Chem. Biodivers. 2008. V. 5, No. 7. P. 1425–1433. 123 123. Liu J. Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid // J. Ethnopharmacol. 1995. V. 49, No. 2. P. 57–68. 124. Liu J., Wen G., Cao D. Aldo-Keto reductase family 1 member B1 inhibitors: old drugs with new perspectives // Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery. 2009. V. 4, No. 3. P. 246–253. 125. Lúcio K.A., da Graça Rocha G., Monção-Ribeiro L.C., Fernandes J., Takiya C.M., Gattass C.R. Oleanolic acid initiates apoptosis in non-small cell lung cancer cell lines and reduces metastasis of a B16F10 melanoma model in vivo // PLoS ONE. 2011. V. 6, No. 12. e28596 126. Maere S., Heymans K., Kuiper M. BiNGO: a Cytoscape plugin to assess overrepresentation of Gene Ontology categories in Biological Networks // Bioinformatics. Applications note. 2005, V. 21, No. 16, P. 3448–3449. 127. Mahato S.В., Sarkar S.K., Poddar G. Triterpenoid saponins // Phytochemistry. 1988. V. 27, No. 10. P. 3037–3067. 128. Maier M.S., Roccatagliata A.J., Kurriss A., Chludil H., Seldes A.M. Two new cytotoxic and virucidal trisulfated glycosides from the Antharctic sea cucumber Staurocucumis liouvillei // J. Nat. Prod. 2001. V. 64. P. 732–736. 129. Miyamoto T., Togawa K., Higuchi R., Komori T., Sasaki T. Constituents of Holothurioidea, II. Six newly identified biologically active triterpenoid glycoside sulfates from the sea cucumber Cucumaria echinata II // Liebigs Ann. Chem. 1990. P. 453–460. 130. Muto Y., Ninomiya M., Fujiki H. Present status of research on cancer chemoprevention in Japan // Japanese Journal of Clinical Oncology. 1990. V. 20. No. 3, P. 219–222. 131. Nakao S., Kuwano T., Tsutsumi-Miyahara C., Ueda S.-Ii., Kimura Y.N., Hamano S., Sonoda K.-H., Saijo Y., Nukiwa T., Strieter R.M., Ishibashi T., Kuwano M., Ono M. Infiltration of COX2–expressing macrophages is a prerequisite for IL-1β–induced neovascularization and tumor growth // J Clin Invest. 2005. V. 115, No. 11. P. 2979–2991. 132. Nigrelli R.F. The Effects of Holothurin on Fish and Mice with Sarcoma 180 // Zoologica (New York). 1952. V. 37. P. 89–90. 133. Nigrelli R.F., Jakowska S. Effects of holothurin, a steroid saponin from the Bahamian sea cucumber (Actinopyga agassizi), on various biological systems // Annals of the New York Academy of Sciences. 1960. V. 90. P. 884–892. 134. Odashima S., Ohta T., Kohno H., Matsuda T., Kitagawa I., Abe H., Arichi S. Control of phenotypic expresion of cultured B16 melanoma cels by plant glycosides // Canc. Res. 1985. No. 45. P. 2781–2784. 135. Olsen R.A. Triterpene glycosides as inhibitors of fungal growth and metabolism. Role of the sterol contents of some fungi // Physiol. Plant. 1973a. V. 28. P. 507–515. 124 136. Olsen R.A. Triterpene glycosides as inhibitors of fungal growth and metabolism. The effect of aescin on fungi with reduced sterol contents // Physiol. Plant. 1973b. V. 29. P. 145–149. 137. Osbourn A., Goss R.J.M., Field R.A. The saponins-polar isoprenoids with important and diverse biological activities // Nat. Prod. Rep. 2011. V. 28, No. 7. P. 1261–1268. 138. Osman A.-M.M., Bayoumi H.M., Al-Harthi S.E., Damanhouri Z.A., ElShal M.F. Modulation of doxorubicin cytotoxicity by resveratrol in a human breast cancer cell line // Cancer Cell Int. 2012. V. 12, No. 1. P. 47. 139. Ovesná Z., Kozics K., Slameňová D. Protective effects of ursolic acid and oleanolic acid in leukemic cells // Mutation research/fundamental and molecular mechanisms of mutagenesis. 2006. V. 600, No. 1–2. P. 131–137. 140. Paszel A., Hofmann J., Zaprutko L., Bednarczyk-Cwynar B., Bock G., Rybczynska M. Antitumor activity and reversal of multidrug resistance by the newly synthesised oleanolic acid derivative – methyl-3, 11-dioxoolean-12-en-28-oate // Eur. J. Cancer Suppl. 2007. V. 5, No. 4. P. 115. 141. Patil T.D., Thakare S.V. In silico evaluation of selected triterpene glycosides as a human dna topoisomerase II alpha (α) inhibitor // International journal of pharmacy and pharmaceutical sciences. 2012. V. 4, No. 4, P. 201–204. 142. Podolak I., Galanty A., Sobolewska D. Saponins as cytotoxic agents: A review // Phytochemistry Reviews. 2010. V. 9, No. 3. P. 425–474. 143. Prokocimer M., Davidovich M., Nissim-Rafinia M., Wiesel-Motiuk N., Bar D.Z., Barkan R., Meshorer E., Gruenbaum Y. Nuclear lamins: key regulators of nuclear structure and activities // J. Cell. Mol. Med. 2009. V. 13, No. 6. P. 1059–1085. 144. Rath O., Kozielski F. Kinesins and cancer // Nature Reviews Cancer. 2012. V. 12. P. 527–539. 145. Rodriguez J., Castro R., Riguera R. Holothurinosides: new antitumor non sulphated triterpenoid glycosides from the sea cucumber Holothuria Forskali // Tetrahedron. 1991. V. 47. P. 4753–4762. 146. Rodrigues S.P., Fathers K.E., Chan G., Zuo D., Halwani F., Meterissian S., Park M. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells // Mol. Cancer Res. 2005. V. 3, No. 4. P. 183–194. 147. Roginsky A.B., Ding X.-Z., Woodward C. Anti-pancreatic cancer effects of a Polаr extract from the edible sea cucumber, Cucumaria frondosa // Pancreas. 2010. V. 39. P. 646–652. 148. Ruggieri G.D., Nigrelli R.F. The effects of Holothurin, a steroid saponin from sea cucumber, on the development of the sea urchin // Zoologica (New York). 1960. V. 45. P. 1–16. 125 149. Ruggieri S., Gregori L., Natalini P., Vita A., Emanuelli M., Raffaelli N., Magni G. Evidence for an inhibitory effect exerted by yeast NMN adenylyltransferase on poly (ADP- ribose) polymerase activity // Biochemistry. 1990. V. 29, No. 10. P. 2501–2506. 150. Saraste A., Pulkki K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis // Cardiovascular Research. 2000. V. 45. P. 528–537. 151. Satow R., Shitashige M., Kanai Y., Takeshita F., Ojima H., Jigami T., Honda K., Kosuge T., Ochiya Y., Hirohashi S., Yamada T. Combined functional genome survey of therapeutic targets for hepatocellular carcinoma // Clin. Cancer Res. 2010. V. 16. P. 2518–2528. 152. Semaan S.M., Wang X., Stewart P.A., Marshall A.G., Amy Sang Q.-X. Differential phosphopeptide expression in a benign breast tissue, and triple-negative primary and metastatic breast cancer tissues from the same African-American women by LC-LTQ/FT-ICR mass spectrometry // Biochem. Biophy. Res. Comm. 2011. V. 412. P. 127–131. 153. Sen D.K., Lin V.K. Effect of holothurin on Trypanosoma duttoni in swiss Webster mal mice // J. Protozool. 1975. V. 22. P. 25–26. 154. Sen D.K., Lin V.K. Effect of holothurin on Trypanosoma duttoni in mice response of trypanosomes to biotoxin // Virginia J. Sc. 1977. V. 28. P. 9–11. 155. Shan J.-Z., Xuan Y.-Y., Ruan S.-Q., Sun M. Proliferation-inhibiting and apoptosis-inducing effects of ursolic acid and oleanolic acid on multi-drug resistance cancer cells in vitro // Chin. J. Integr. Med. 2011. V. 17, No. 8. P. 607–611. 156. Shemaili J.A., Mensah-Brown E., Parekh K., Thomas S.A., Attoub S., Hellman B., Nyberg F., Adem A., Collin P., Adrian T.E. Frondoside A enhances the antiproliferative effects of gemcitabine in pancreatic cancer // Eur. J. of Cancer. 2014. V. 50, No. 7. P. 1391–1398. 157. Shibata S. Resent studies on biologically active constituents of medicinal plants-biologically active saponins and sapogenins and their chemical modifications // In: Third International Conference on Chemistry and Biotechnology of Biologically Active Natural Products. Sofia, Bulgaria.1985. V. 1. P. 148–167. 158. Shimada S. Antifungal steroid glycoside from sea cucumber // Science. 1969. V. 163, No. 874. P. 1462. 159. Silchenko A.S., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Fedorov S.N., Stepanov V.G., Dong Z., Stonik V.A. Constituents of the sea cucumber Cucumaria okhotensis. Structures of okhotosides B1–B3 and cytotoxic activities of some glycosides from this species // J. Nat. Prod. 2008, V. 71, No. 3. P. 351–356. 160. Stonik V.A. Some terpenoid and steroid derivatives from echinoderms and sponges // Pure and Appl. Chem. 1986. V. 58, No. 3. P. 423–436. 126 161. Stonik V.A., Elyakov G.B. Secondary metebolites from echinoderms as chemotaxonomic markers // Bioorganic Marine Chemistry Ed. Scheuer P.J.: Springer-Verlag: Berlin. 1988. V. 2. P. 43–86. 162. Streicher K.L., Willmarth N.E., Garcia J., Boerner J.L., Dewey T.G., Ethier S.P. Activation of a nuclear factor kappaB/interleukin-1 positive feedback loop by amphiregulin in human breast cancer cells // Mol. Cancer Res. 2007. V. 5, No. 8. P. 847–861. 163. Styles T.J. Effect of holothurin on Trypanosome lewisi infections in rats // J. Protozool. 1970. V. 17. P. 196–198. 164. Sun P., Liu B.-S., Yi Y.-H., Li L., Gui M., Zhang D.-Z., Zhang S.-L. A New cytotoxic lanostane-type triterpene glycoside from the sea cucumber Holothuria impatiens // Chem. Biodivers. 2007. V. 4. P. 450–457. 165. Sur I., Neumann S., Noegel A.A. Nesprin-1 role in DNA damage response // Nucleus. 2014. V. 5, No. 2. P. 173–191. 166. Takemura M., Endo S., Matsunaga T., Soda M., Zhao H.-T., El-Kabbani O., Tajima K., Iinuma M., Hara A. Selective inhibition of the tumor marker aldo-keto reductase family member 1B10 by oleanolic acid // J. Nat. Prod. 2011. V. 74, No. 5. P. 1201–1206. 167. Taniguchi S., Imayoshi Y., Kobayashi E., Takamatsu Y., Ito H., Hatano T., Sakagami H., Tokuda H., Nishino H., Sugita D., Shimura S., Yoshida T. Production of bioactive triterpenes by Eriobotrya japonica calli // Phytochem. 2002. V. 59, No. 3. P. 315–323. 168. Thron C.D. Hemolysis by holothurin A, digitonin and quiiaia saponin: estimates of the requared cellular lysin uptakes and free lysin concentrations // J. Pharm. Exp.Therap. 1964. V. 145, No. 2. P. 194–202. 169. Tian F., Zhang X., Tong Y., Yi Y., Zhang S., Li L., Sun P., Lin L., Ding J. PE, a new sulfated saponin from sea cucumber, exhibits anti-angiogenic and anti-tumor activities in vitro and in vivo. Cancer Biol. Ther. 2005. V. 48. P. 874–882. 170. Tian F., Zhu C. H., Zhang X. W., Xie X., Xin X. L., Yi Y.H., Lin L.P., Geng M.Y., J. Ding J. Philinopside E, a new sulfated saponin from sea cucumber, blocks the interaction between kinase insert domain-containing receptor (KDR) and αvβ3 integrin via binding to the extracellular domain of KDR // Mol. Pharmacol. 2007. V. 72, No. 3. P. 545–552. 171. Tong Y., Zhang X., Tian F., Yi Y., Xu Q., Li L., Tong L., Lin L., Ding J. Philinopside A, a novel marine-derived compound possesing dual anti-angiogenetic and anti-tumor effects // Int. J. Cancer. 2005. No. 114. P. 843–853. 172. Torocsik B., Szeberenyi J. Anisomycin affects both pro- and antiapoptotic mechanisms in PC12 cells // Biochem Biophys Res Commun. 2000. V. 278, No. 3. P. 550–556. 127 173. Wang W., Eddy R., Condeelis J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis // Nat. Rev. Cancer. 2007. V. 7. P. 429–440. 174. Wu J., Yi Y.H., Tang H.F., Wu H.M., Zhou Z.R. Hillasides A and B, two new cytotoxic triterpen glycosides from the sea cucumber Holoturia hillа // J. Asian Nat. Prod. Res. 2007. V. 9. P. 609–615. 175. Yamanouchi T. On the poisonous substance contained in holothurians // Publ. Seto. Marine Biol Lab. 1955. V. 4. P. 183–203. 176. Yan S.-L., Huang C.-Y., Wu S.-T., Yin M.-C. Oleanolic acid and ursolic acid induce apoptosis in four human liver cancer cell lines // Toxicology in vitro. 2010. V. 24, No. 3. P. 842–848. 177. Yaowu H., Brown M.A., Rothnagel J.A., Saunders N.A., Smith R. Roles of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A and B in cell proliferation // J. Cell Sci. 2005. V. 118, P. 3173–3183. 178. Yoshio T., Morita T., Kimura Y., Tsujii M., Hayashi N., Sobue K. Caldesmon suppresses cancer cell invasion by regulating podosome/invadopodium formation // FEBS Lett. 2007. V. 581, No. 20. P. 3777–3782. 179. Yun S.-H., Park E.-S., Shin S.-W., Na Y.-W., Han J-Y., Jeong J.-S., Shastina V.V., Stonik V.A., Park J.-I., Kwak J.-Y. Stichoposide C induces apoptosis through the generation of ceramide in leukemia and colorectal cancer cells and shows in vivo antitumor activity // Clin. Cancer Res. 2012. V. 18. P. 5934–5948. 180. Zhang S.Y., Tang H.F., Yi Y.H. Cytotoxic triterpene glycosides from the sea cucumber Pseudocolochirus violaceus // Fitoterapia. 2007. V. 78. P.283–287. 181. Zhang F., Wang J.S., Gu Y.C., Kong L.Y. Triterpenoids from Aglaia abbreviate and their cytotoxic activities // J. Nat. Prod. 2010. V. 73, No. 12. P. 2042–2046. 182. Zhang Y., Yi Y. Studies on antitumor activities of triterpene glycoside colochiroside A from sea cucumber Colochirus anceps // Zhongguo Zhongyao Zazhi. 2011. V. 36, No. 4. P. 504–507. 183. Zhao Q., Liu Z.-D., Xue Y., Wang J.-F., Li H., Tang Q.-J., Wang Y.-M., Dong P., Xue C.-H. Ds-echinoside A, a new triterpene glycoside derived from sea cucumber, exhibits antimetastatic activity via the inhibition of NF-κB-dependent MMP-9 and VEGF expressions // J. Zhejiang Univ. Sci. B 12. 2011. P. 534–544 184. Zhao Q., Xue Y., Liu Z.-d., Li H., Wang J.-F., Li Z.-J., Wang Y.-M., Dong P., Xue C.-H. Differential effects of sulfated triterpene glycosides, Holothurin A1, and 24-Dehydroechinoside A, on antimetastasic activity via regulation of the MMP-9 signal pathway // J. Food Sci. 2010. V. 75. P. 280–288. 185. Zhao Q., Xue Y., Wang J.F., Li H., Long T.-T., Li Z., Wang Y.-M., Dong P., Xue C.-H. In vitro and in vivo anti-tumor activities of echinoside A and ds-echinoside A from Pearsonothuria graeffei // J. Sci. Food Agric. 2012. V. 92, No. 4. P. 965–974. 128 186. Zong W.X., Thomson C.B. Necrotic death as a cell fate // Genes and Development. 2006. V. 20. P. 1–15.
