ПРИЛОЖЕНИЕ II Проверка способа определения параметров процессов, происходящих на уровне одиночных клеток асинхронных суспензионных культур. Проверка предложенного способа определения параметров процессов, происходящих в суспензионных культурах на уровне одиночной клетки была осуществлена в лаборатории д. б. н., проф. Ю. В. Евтодиенко (Институт теоретической и экспериментальной биофизики АН СССР, Пущино, Московская область). Глутатион играет важную роль в различных внутриклеточных процессах: в синтезе дезоксирибонуклеотидов – предшественников ДНК, в транспорте аминокислот, в защите клетки от перекисей, радикалов, токсичных веществ и других процессах. Тотальные SH-группы являются компонентами белковых SH-групп и низкомолекулярных SH-соединений, из которых преобладающим является глутатион. Для глубокого понимания роли глутатиона и тотальных SH-групп во внутриклеточных процессах необходимо знать как изменяется количество глутатиона и тотальных SH-групп в течение жизненного цикла клетки (бактерии). Поэтому, соответствующие исследования проводились на синхронизированных суспензионных культурах. Так как согласно логике синхронизированная клеточная суспензионная культура представляет собой одну ―укрупненную‖ клетку. Это предположение может соответствовать истине лишь в том случае, когда все клетки популяции делятся одновременно, в течение нескольких минут (рис. 1, 2). Но в реальных условиях это не происходит (рис. 3, 4). Обычно клетки популяции синхронизированных культур делятся в интервале времени равном трети продолжительности жизненного цикла клетки. Эксперименты проводились на бактериях E.coli CSH. Несмотря на то, что в одинаковых условиях были проведены десятки экспериментов по синхронизации роста суспензионных культур бактерии E.coli, но так и не удалось провести хотя бы два идентичных эксперимента в которых имелись бы схожие динамики: роста численности клеток суспензионной культуры; количества глутатиона; количества тотальных SHгрупп. При этом эксперименты различаются не только динамиками указанных параметров, но они значительно различаются и периодами удвоения численности клеток популяции, т.е. усредненными длительностями жизненных циклов клеток этих суспензионных культур. Рассмотрим два наиболее ―синхронных‖ эксперимента (рис. 5) и (рис. 12). Несмотря на то, что кривая роста численности клеток суспензионной культуры первого эксперимента (рис. 5) в какой-то степени имеет ступенчатый вид, тем не менее данная культура не является синхронной, и даже не является ―полусинхронной‖. Во втором эксперименте (рис. 12) суспензионную культуру можно считать полусинхронной. В первом эксперименте продолжительность роста суспензионной культуры – полтора часа. Так как в данном случае исходная концентрация клеток популяции E.coli весьма высока (108 кл/мл), поэтому рост этой суспензионной культуры начинается не с лаг-фазы, а с конца фазы ускорения роста или начала ЭФР (рис. 13). Кривая численности культуры в интервале [1200,1240], когда происходит удвоение численности популяции и концентрация клеток достигает 2,2·108 кл/мл, своей формой напоминает экспоненту. В интервале [1240,1300] численность популяции не увеличивается, а затем в течение [1300,1320] она достигает приблизительно 4,4·108 - 4,5·108 кл/мл. Затем снова происходит задержка роста численности популяции [1320, 1335]. Рост численности популяции несколько скачкообразен. По динамике роста численности популяции видно, что усредненная длительность жизненного цикла клеток равна 40 мин (g = 40 мин). Так как шаг дискретизации клеток по возрасту, шаг дискретизации по времени или шаг дискретизации модели равны 5 мин (Δτ = Δt = 5 мин), то, соответственно число возрастных групп равно k = 8 или g = 8·5 мин = 40 мин. 1 Поскольку, в ЭФР в клетках одинакового возраста происходят одни и те же процессы, то, согласно логике, параметры клеток, вычисленные по разным участкам динамики численности клеточной популяции и по другим соответствующим интегральным параметрам культуры должны иметь между собой определенное сходство. Для обозначения разных участков динамики роста численности клеточной популяции и других соответствующих интегральных параметров культуры в данном эксперименте были выделены семь интервалов времени (или периодов): 1-[1225,1305], 2 - [1230,1310], 3 [1235,1315], 4 - [1240,1320], 5 - [1245,1325], 6 -[1250,1330], 7 - [1255,1335] (рис. 6). По значениям оптической плотности (D), концентрации глутатиона (G) и тотальных SH-групп (S) суспензионной культуры каждого из этих семи временных интервалов вычислялись соответствующие параметры одиночной клетки E.coli, в зависимости от ее возраста: Концентрация клеток популяции (X) и ее оптическая плотность определялась через каждые 5 мин в течение интервала времени [1200,1335]. Концентрация глутатиона и тотальных SH-групп, приходящихся на 1 мл. клеточной суспензии также определялась через каждые 5 мин, но в течение меньшего периода времени [1225,1335]. Вычисленные для семи периодов кривые ОП (D) клетки характерны специфическим увеличением значений D4 и D5 в середине жизненного цикла бактерии (рис. 7). Нетрудно заметить, что без учета значений D4 и D5 динамика увеличения ОП клетки для 4, 5 и 6-го периодов напоминает экспоненту. Появление ―горба‖ на кривой ОП клетки обусловлено ускорением синтеза белка, которое, по-видимому, является следствием ускорения синтеза ДНК, которое проявляется именно в середине жизненного цикла бактерии E.coli. Если проследить за динамикой изменения формы кривой ОП клетки для 7 периодов (рис. 7), то можно заметить, что кривые 1, 2 и 3 периодов постепенно переходят в форму кривой ОП клетки, которая остается стабильной для - 4, 5 и 6-го периодов и несколько изменяется в 7-м периоде. Среди них кривая ОП 5-го периода имеет, как бы центральную или ―эталонную‖ форму. В отличие от кривых ОП клетки кривые тотальных SH-групп клетки имеют большую устойчивость. Так, если кривые ОП клетки одинаковы для 4-го и 5-го периодов, то сходство кривых тотальных SH-групп (S) проявляется в 3÷7 периодах (рис. 8). При этом необходимо отметить, что в данном случае ―нулевая‖ линия, относительно которой на уровне клетки изменяются значения концентрации S, условна и связана со спецификой производимых расчетов. То есть, кривые S клетки иллюстрируют колебания значений тотальных SH-групп на уровне одиночной клетки, а для определения истинных значений количества S в зависимости от возраста клетки τi используются соответствующие соотношения. Если динамика изменения количества тотальных SH-групп в течение жизненного цикла практически одинакова для 3÷7 периодов (рис. 8, рис. 9b), то динамика изменения количества глутатиона менее устойчива и ее явная идентичность наблюдается лишь между 3 и 4 периодами, хотя определенная схожесть с ними наблюдается и у кривой глутатиона 5-го периода (рис. 9a). Количество глутатина клетки значительно меньше количества ее тотальных SH-групп. На рис. 9 иллюстрируется обратная зависимость динамики изменения концентрации глутатиона - G от динамики изменения концентрации белковых SH-групп – S. Это видно на 3, 4 и 5-м кадрах, но в наибольшей степени она проявляется на 5-м кадре. Если следовать формальной логике, то существование данной обратной зависимости может объясняться, по-видимому, двумя взаимосвязанными процессами: - образование молекулы глутатиона в результате распада белковых молекулярных соединений SH-групп; - участие молекулы глутатиона в формировании белковых SH-групп. На рис. 10 одновременно приведены семь расчетных кривых изменения количества тотальных SH-групп бактерии E.coli в зависимости от ее возраста (b) и 7 участков 2 экспериментальной кривой количества тотальных SH-групп суспензионной культуры бактерии E.coli (см. рис. 5) по которым производились, соответствующие вычисления (a). Кривые, приведенные на рис. 5 однозначно и полностью подтверждают правильность предлагаемого способа определения параметров процессов, происходящих в суспензионных культурах на уровне одиночной клетки в течение ее жизненного цикла. Об этом свидетельствует большое сходство между пятью расчетными кривыми изменения количества тотальных SH-групп бактерии E.coli в зависимости от ее возраста (3-7 периоды, рис. 10b) и значительные различия между соответствующими (3-7) участками кривой количества тотальных SH-групп суспензионной культуры бактерии E.coli (рис. 10a) по которым производились, соответствующие вычисления. Иначе говоря, почти в течение целого часа [1235,1335] у бактерий суспензионной культуры E.coli была одинаковая динамика изменения количества тотальных SH-групп (3-7 периоды), хотя это никак не проявляется на динамике количества тотальных SH-групп суспензионной культуры. Ибо, процесс формирования количества тотальных SH-групп суспензионной культуры весьма сложен и зависит как от динамики тотальных SH-групп отдельных бактерий E.coli, так и от непрерывно изменяющегося возрастного состава клеток суспензионной культуры. Проиллюстрировать правильность способа определения параметров процессов, происходящих на уровне одиночных клеток суспензионной культуры можно также сравнением расчетных кривых количества глутатиона (Gi) и тотальных SH-групп (Si) одиночной клетки E.coli, вычисленных по значениям G и S суспензионной культуры 3 и 6го периодов (рис. 11). Несмотря на то, что G и S ―входные‖ параметры суспензионной культуры 3 и 6-го периодов резко различаются, тем не менее, согласно расчетам Gi и Si физиологическое состояние клеток и их метаболические процессы остаются стабильными в течение интервала времени [1235,1330]. Об этом свидетельствует большое сходство вычисленных для 3 и 6-го периодов динамик изменения количества глутатиона и тотальных SH-групп одиночной клетки E.coli в зависимости от ее возраста - Gi и Si (рис. 5). Вышеприведенные параметры клетки E.coli, вычисленные по показаниям суспензионной культурой (рис. 5) подтверждают эффективность предлагаемого способа определения параметров процессов, происходящих в клетке. Одним из основных требований к проводимым экспериментам – их воспроизводимость. Поэтому они ставились приблизительно в одно и то же время дня (≈12 00). Концентрация клеток посевного материала была одинаковой (1,1·108кл/мл) и конечно же условия в которых проводились эксперименты были одними и теми же. Но несмотря на это, так и не удалось провести два идентичных эксперимента. Второй эксперимент (рис. 12) также иллюстрирует большое различие между суспензионными культурами E.coli, выращенными в идентичных условиях (рис. 5). Второй эксперимент также продолжался приблизительно полтора часа [1130, 1310]. Концентрация культуры в интервале [1155,1235] увеличилась незначительно, от 1,9·108 кл/мл до 2,1·108 кл/мл, а в интервале [1235,1250] концентрация резко увеличивается от 2,1·108 кл/мл до 3,8·108 кл/мл, но полное удвоение численности популяции происходит в течение интервала [1155,1250], т. е. за 55 мин. Таким образом, динамика роста численности популяции показывает, что длительность жизненного цикла равна 55 мин (g = 55 мин). Так как шаг дискретизации клеток по возрасту, шаг дискретизации по времени или шаг дискретизации модели равны 5 мин (Δτ = Δt = 5 мин), то, соответственно число возрастных групп равно k = 11 или g = 11·5 мин = 55 мин. Подавляющее большинство клеток популяции делится в течение 15 мин. - [1155,1250], поэтому, согласно нашему определению, данная культура является полусинхронной, ибо 3Δt/11Δt ≈ 0,272 < 0,333. Так как анализируемая суспензионная культура E.coli является полусинхронной, то динамика изменения ОП, концентрации глутатиона –G и концентрации тотальных SHгрупп этой культуры в какой-то мере должна быть похожей на соответствующие 3 показатели ―укрупненной‖ клетки E.coli. Ибо, вычисленные параметры одиночной клетки E.coli - Di, Gi и Si должны иметь определенное сходство с соответствующими параметрами полусинхронной популяции - Dj, Gj и Sj, так как, вычисление параметров клетки равнозначно процессу ―идеальной‖ синхронизации суспензионной культуры. То есть, когда все клетки суспензионной культуры делятся за время Δt. Иначе говоря, разработанный способ осуществляет ―виртуальную‖ синхронизацию суспензионной культуры и она ―функционирует‖ как одна ―укрупненная‖ клетка. При ―виртуальной‖ синхронизации различие клеток по возрасту в одной возрастной субпопуляции ограничено значением ≤ Δt. Параметры Di, Gi и Si, вычисленные для первого эксперимента равнозначны параметрам, снятым с синхронной культуры Dj, Gj и Sj, у которой Δt/8 = 0,125, а параметры Di, Gi и Si, вычисленные для второго эксперимента равнозначны параметрам, снятым с синхронной популяции - Dj, Gj и Sj, с Δt/11Δt ≈ 0,091. Теоретически, предлагаемый способ позволяет довести значение Δt/kΔt (или 1/k) до любой заранее заданной малой величины. Все зависит от времени Δt, в течение которого можно определить значение измеряемого параметра. Например, если бы в рассматриваемых экспериментах значения Dj, Gj и Sj снимались с популяции ежеминутно, то в этом случае значение Δt/kΔt, соответственно равнялось бы 1/40 = 0,029 и 1/55 ≈ 0,0182. Во втором эксперименте (рис. 12), в отличие от первого эксперимента (рис. 5), имеется всего 4 участка кривых значений параметров суспензионной культуры E.coli: 1 [1155,1250], 2 - [1200,1255], 3 - [1205,1300], 4 - [1210,1305], по которым вычислялись соответствующие параметры одиночной клетки E.coli (рис. 14). Относительная стабильность или схожесть между вычисленными параметрами клетки наблюдается только в 1 и 2-й периоды. Динамика ОП 1-го периода (рис. 15) похожа на динамики 4÷7 первого эксперимента (рис. 7), а динамика 2-го периода - на динамику 1 и 2-го периодов первого эксперимента. Очевидно, что такой ―рваной‖ динамики ОП - Di или динамики роста биомассы клетки, вычисленной по показаниям 4-го периода (Dj), в природе не существует. Прежде всего это обусловлено большой гетерогенностью длительностей жизненного цикла клеток популяции. Соответственно и другие параметры клетки (Gi и Si), вычисленные по показаниям 4-го периода (Gj и Sj), не соответствуют истине. Динамики глутатиона (Gi ) 1 и 2-го периодов почти идентичны (рис. 16). Меньшая схожесть проявляется между динамиками тотальных SH-групп (Si ) 1 и 2-го периодов (рис. 16). То есть, происходит то же самое, что и с ОП (Di) 1 и 2-го периодов (рис. 15). Вместе с этим, показания Di ,Gi, и Si 1 и 2-го периодов сильно различаются от соответствующих динамик 3 и 4-го периодов (рис. 15, 16). То, что Di, Gi, и Si 1-го периода соответствуют реальным показаниям клетки свидетельствует не только ―эталонная‖ динамика Di 1-го периода, схожая с показаниями Di 3÷7 периодов первого эксперимента (рис. 7), но и схожесть динамик Di , Gi и Si клетки с динамиками, соответствующих параметров - Dj , Gj и Sj полусинхронной культуры (рис. 17). Последнее объясняется тем, что именно динамики Di , Gi и Si 1-го периода являются параметрами ―виртуально‖ или ―идеально‖ синхронизированной суспензионной культуры E.coli. Поэтому схожесть динамик Di , Gi и Si клетки с динамиками, соответствующих параметров - Dj , Gj и Sj полусинхронной культуры, равнозначна схожести параметров ―синхронной‖ культуры с параметрами ―полусинхронной‖. Схожесть же между показателями ―синхронной‖ и ―полусинхронной‖ культурами очевидна и логична (рис. 2 и рис. 3). Оба, вышерассмотренных эксперимента с суспензионной культурой E.coli (рис. 5, рис. 12), хотя и по-разному, но однозначно подтверждают правильность предложенного способа определения параметров процессов, происходящих в асинхронных суспензионных культурах E.coli CSH на уровне одиночной клетки. На основе анализа и сравнения данных двух экспериментов можно сделать следующие выводы: 4 ● Несмотря на идентичные условия проведения экспериментов, тем не менее, длительность жизненных циклов клеток значительно отличается (в первом эксперименте g = 40 мин., во втором – g = 55 мин.); ● Формы кривых количества глутатиона (Gi) и тотальных SH-групп (Si) бактерии E.coli в зависимости от ее возраста 1-го эксперимента сильно различаются от соответствующих кривых 2-го эксперимента; ● В отличие от 1-го эксперимента (рис. 9), во 2-м эсперименте (рис. 16) отсутствует явно выраженная обратная зависимость между динамикой изменения на клеточном уровне концентрации тотальных SH-групп – (Si) и динамикой изменения концентрации глутатиона – (Gi); ● В двух экспериментах (рис. 7→3÷7) и (рис. 15→1) формы кривых ОП (или биомассы) бактерии E.coli, в зависимости от ее возраста, - (Di) имеют между собой высокое сходство, т.е. динамика роста биомассы клеток E.coli является наиболее устойчивым показателем клеток суспензионных культур; ● Идентичность динамики количества тотальных SH-групп (Si) бактерии E.coli в течение 3÷7 периодов (рис. 8) означает, что: a) по возрастному составу суспензионной культуры момента t = 1235, используя соответствующие соотношения, возможно спрогнозировать возрастной состав популяции по крайней мере до t = 1335 ; b) в интервале [1235, 1335] кривая количества тотальных SH-групп (Si) одиночной клетки суспензионной культуры практически неизменна; ● По возрастному составу суспензионной культуры момента t = 1235 и по динамике изменения количества тотальных SH-групп на уровне одиночной клетки (Si) 3-го периода (или интервала [1235,1315]) имеется возможность с высокой точностью спрогнозировать динамику концентрации тотальных SH-групп суспензионной культуры Xj - (Sj), вплоть до t = 1315. Проверка способа определения параметров процессов, происходящих на уровне одиночных клеток асинхронных суспензионных культур, произведена на двух экспериментах малой продолжительности. Малая продолжительность проводимых экспериментов суспензионных культур значительно затрудняла проверку предлагаемого способа, так как суспензионные культуры не проходили стабильную фазу роста*(СФР), когда клетки популяции имеют одинаковую продолжительность жизненных циклов (рис. 18, 19). Более того, при засеве культуры значительная часть клеток и изначально была крупных размеров, т.е., имели аномально большую биомассу. Тем не менее, предложенный способ даже в этих условиях показал свою полную дееспособность, что свидетельствует о его высокой надежности и универсальности. Очевидно, что в условиях периодического и, тем более, непрерывного выращивания суспензионных культур данный способ будет иметь чрезвычайно широкие возможности. [*Стабильная фаза роста – одна из четырех новых, выявленных нами в экспоненцивальной фазе роста (ЭФР) и однозначно идентифицируемых, фаз роста. Это (рис. 18): первая переходная фаза роста (I-ПФР); стабильная фаза роста (СФР); C – вторая переходная фаза роста (II - ПФР). В определенных ситуациях при периодическом культивировании вместо ЭФР имеет место промежуточная фаза роста (ПрФР).] 5 Рис. 1. Изменение количества вещества p в клетке в зависимости от ее возраста τi - pi. у. е. – условная единица количества вещества p в клетке, i = i·Δτ – возраст клетки, g = 9·Δτ = 9·Δt – продолжительность жизненного цикла клетки. Рис. 2. Динамика роста численности клеток ―идеальной‖ синхронной популяции Xj и количество вещества p в популяции - Pj. ●▬●▬● численность клеток популяции Xj ■­ -■­ -■ количество вещества p популяции Xj в условных единицах (у.е.) - Pj tj(i) = j·Δt – время с обозначением возраста клеток популяции (i) в tj-й момент времени, g = 9·Δτ = 9·Δt. Все клетки популяции делятся в течение 1Δt. 6 Рис. 3. Динамика роста численности клеток полусинхронной популяции Xj и количество вещества p в популяции - Pj. ●▬●▬● численность клеток популяции Xj ■­ -■­ -■ количество вещества p популяции Xj в условных единицах (у.е.) - Pj tj(a,b) = j·Δt – время с обозначением возраста клеток популяции (a,b) в tj-й момент времени, g = 9·Δτ = 9·Δt. Все клетки популяции делятся в течение 2Δt. Рис. 4. Динамика роста численности клеток полусинхронной популяции Xj и количество вещества p в популяции - Pj ●▬●▬● численность клеток популяции Xj ■- -■- -■ количество вещества p популяции Xj в условных единицах (у.е.) - Pj tj(a,b,c) = j·Δt – время с обозначением возраста клеток популяции (a,b,c) в tj-й момент времени, g = 9·Δτ = 9·Δt. Все клетки популяции делятся в течение 3Δt. 7 Рис. 5. Рост суспензионной культуры бактерий E. coli. — концентрация клеток (X) ∙— 95% -й доверительный интервал концентрации клеток популяции, ○—○ оптическая плотность суспензии - D □—□ количество глутатиона - G, 8 количество белковых SH-групп - S ? - значения концентрации клеток не определялись 1÷7 – нумерация периодов, t – время суток в часах. Параметры культуры определяли через 5 мин., заштрихована «сглаженная» кривая концентрации клеток. Время удвоения численности клеток – 40 мин. Рис. 6. Участки кривых значений параметров суспензионной культуры E.coli по которым вычислялись значения, соответствующих параметров одиночной клетки E.coli, в зависимости от ее возраста. ○—○ оптическая плотность суспензии - D □—□ количество глутатиона - G количество белковых SH-групп - S 1÷7 – нумерация периодов, t – время суток в часах. Рис. 7. Расчетная оптическая плотность клетки E.coli в зависимости от ее возраста. 1÷7 – периоды. 9 Рис. 8. Расчетное количество содержания белковых SH-групп клетки E. coli в зависимости от ее возраста. 1÷7 – периоды. Рис. 9. a) Производная по времени концентрации глутатиона клетки E.coli где ΔGi-1 = Gi - Gi-1, i = 1,8 , Δτi-1 = Δτ = 5 мин, G0 = Gi 1 , i 1 G8 . 2 b) Производная по времени концентрации белковых SH-групп клетки E. coli - S i 1 , i 1 S8 . (Для сравнения с кривыми глутатиона 2 данная производная повернута вокруг оси возраста клетки на 1800). 1÷7 периоды. где ΔSi-1 = Si - Si-1, Δτi-1 = Δτ =5 мин, S0 = 10 Рис. 10. Участки экспериметальной кривой количества тотальных SH-групп суспензионной культуры бактерии E.coli по которым производились вычисления (a) и соответствующие расчетные кривые изменения количества тотальных SH-групп бактерии E.coli в зависимости от ее возраста (b). Периоды или интервалы времени, согласно которым выделены семь участков кривой: 1[1225,1305], 2 - [1230,1310], 3 - [1235,1315], 4 - [1240,1320], 5 - [1245,1325], 6 - [1250,1330], 7 [1255,1335]. i = iΔτ - возраст клетки, i =1,8 , Δτ = 5 мин. Длительность жизненного цикла клетки - 40 мин. 11 Рис. 11. Динамики оптической плотности (D), количества (концентрации) глутатиона (G) и белковых SH-групп (S) 3-го и 6-го периодов роста суспензионной культуры по которым вычислялись, соответствующие параметры одиночной клетки в зависимости от ее возраста. ○—○ оптическая плотность суспензии и клетки - D □—□ количество глутатиона суспензии и клетки - G количество белковых SH-групп суспензии и клетки - S 3, 6 – периоды 12 i = iΔτ - возраст клетки, i = 1,8 , Δτ = 5 мин. Длительность жизненного цикла клетки - 40 мин. Рис. 12. Рост суспензионной культуры бактерий E. coli. — концентрация клеток (X) ∙— 95% -й доверительный интервал концентрации клеток популяции ○—○ оптическая плотность суспензии - D □—□ количество глутатиона - G количество белковых SH-групп - S ? - значения концентрации клеток не определялись 1÷4 – нумерация периодов, t – время суток в часах. Параметры культуры 13 определяли через 5 мин, заштрихована «сглаженная» кривая концентрации клеток. Время удвоения численности клеток – 55 мин. Рис.13. S-образная кривая роста численности клеток суспензионной культуры. Xj – концентрация клеток популяции или число клеток в 1мл; tj – время. I-лаг-фаза; II-фаза ускорения роста (μ < μmax); III-экспоненциальная или логарифмическая фаза роста (μ = μmax,); IV-фаза замедления роста (μ < μmax,); V-стационарная фаза роста. Рис. 14. Участки кривых значений параметров суспензионной культуры E.coli по которым вычислялись значения, соответствующих параметров одиночной клетки E.coli, в зависимости от ее возраста. ○—○ оптическая плотность суспензии - D □—□ количество глутатиона - G количество белковых SH-групп - S 14 1÷4 – нумерация периодов, t – время суток в часах. Периоды и интервалы времени, согласно которым выделены четыре участка кривых: 1[1155,1250], 2 - [1200,1255], 3 - [1205,1300], 4 - [1210,1305]. i = i - возраст клетки, i = 1,11 , = 5 мин. Длительность жизненного цикла клетки - 55 мин. Рис. 15. Расчетная оптическая плотность клетки E. coli в зависимости от ее возраста. 1÷4 – периоды. 15 Рис. 16. Расчетное количество содержания глутатиона (a) и белковых SH-групп (b) в клетке E. coli в зависимости от ее возраста. 1÷4 – периоды. 16 Рис. 17. Динамики оптической плотности (D), количества (концентрации) глутатиона (G) и белковых SH-групп (S) 1-го периода роста суспензионной культуры по которым вычислялись, соответствующие параметры одиночной клетки в зависимости от ее возраста. ○—○ оптическая плотность суспензии и клетки - D □—□ количество глутатиона суспензии и клетки - G количество белковых SH-групп суспензии и клетки - S 1-й – период. i = i - возраст клетки, i = 1,11 , = 5 мин. Длительность жизненного цикла клетки - 55 мин. 17 Рис. 18. Три составляющие экспоненциальной фазы роста численности клеток суспензионной культуры. A – первая переходная фаза роста (I-ПФР), (μ = μmax,); B – стабильная фаза роста (СФР), (μ = μmax,); C – вторая переходная фаза роста (II - ПФР), (μ = μmax,). При фазе ускорения роста (II) и фазе замедления роста (IV) - (μ < μmax). 18 Рис.19. Динамика роста численности клеточной популяции с соответствующей схемой размножения клеток популяции. Не только по схеме размножения, но и по динамике численности видно, что в 1-ПФР в интервале времени [tp,tp+β] присутствуют клетки с g > gmin, а то, что во 2-ПФР присутствуют клетки с g > gmin свидетельствует отсутствие ожидаемого увеличения 19 численности популяции в tq+α до 48, а в tq+β до 64 клеток. Тем не менее, нормализованные возрастные распределения клеток популяции в tq-k-a и tq-a моменты времени идентичны, где q = p+3k, a = 0, k . gmin = kΔt = kΔτ, (Δ τ = Δt). Динамика популяции: 20; 4p; 6p+α, 8p+β; 8p+k; 12p+k+ α; 16p+k+ β; 16p+2k или 16q-k; 16q-k+α; 24q-k+α; 32q-k+β; 32q; 34q+α; 38q+β. Л. Казарян 20