анализ нуклеотидной последовательности гена nahg у

Биология
4. K ł o n o w s k a - O l e j n i k M . // Czerwona lista zwierząt ginących i zagrożonych w Polsce. Krakow, 2002. S. 131.
5. Красная книга Республики Беларусь. Минск, 2004. С. 205.
6. Там же. С. 226.
Поступила в редакцию 22.08.12.
Михаил Дмитриевич Мороз – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник НПЦ НАН Беларуси по биоресурсам.
УДК 576.851.132
А. А. СЕЧЕНИКОВ, М. А. ТИТОК
АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА NAHG
У ПРИРОДНЫХ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS FLUORESCENS NL61
The nucleotide sequence of gene nahG (size 813 bp) which is widespread among natural bacteria Pseudomonas circulating in
Belarus was determined in the present paper. Due to the presence of the nucleotide sequences of genes nahG type A88 (presumably
localized in the plasmid pA88 of IncP-9 group in bacteria P. fluorescens A88, its sequence is determined and have size 813 bp) and
NAH7 (localized in the plasmid NAH7 of IncP-9 group in bacteria Pseudomonas putida NCIB (complete open reading frame is
1305 bp)) made it possible to determine the investigated determinants relevant to type A88. It differs from the known sequence of
this type by following nucleotide substitution (it was substitution of thymine to cytosine in 651 position), which led to an additional
restriction site for the enzyme RsaI. Identified feature of the gene nahG organization in bacteria P. fluorescens NL61 can be a reliable
diagnostic marker in detection of this type of determinants in the analysis of natural and collection naphthalene-utilizing bacteria of
the Pseudomonas genus.
Ключевые слова: плазмиды, ген nahG, биодеградация, нуклеотидная последовательность, оперон, нафталин.
Key words: рlasmids, gene nahG, biodegradation, sequence, operon, naphthalene.
Транспозонная организация катаболитных оперонов, локализованных в составе конъюгативных
плазмид, обусловливает их горизонтальный перенос между бактериями в природных популяциях,
повышая адаптивные свойства содержащих их микроорганизмов [1]. Рекомбинационные события, а
также факторы внешней среды и различное генетическое окружение могут приводить к изменению
нуклеотидных последовательностей генов биодеградации, в результате чего образуются полиморфные
локусы, а также выявляются дуплицированные гены [2–4], дивергенция которых способствует возникновению новых ферментативных активностей.
Определяющие синтез ферментов биодеградации нафталина гены имеют оперонную организацию,
причем в «верхнем» опероне они обеспечивают окисление нафталина до салициловой кислоты, которая
под действием салицилат-1-гидроксилазы (кодируется первым геном «нижнего» оперона – nahG) превращается в катехол, в дальнейшем разлагающийся до интермедиатов цикла Кребса. Гены, входящие в состав «верхнего» и «нижнего» оперонов, имеют либо плазмидную, либо хромосомную локализацию [5–7].
Все изученные салицилатдегидроксилазы содержат НАД+-связывающий белковый домен высокой
степени консервативности [8]. Несмотря на это, нуклеотидные последовательности, определяющие
синтез данного функционально значимого участка белковой молекулы, характеризуются полиморфностью. В настоящее время описано 6 типов детерминант nahG (NAH7, A88, pDTG1, AN10, KF715 и
NKNS3) [2]. Понимание процессов и закономерностей, лежащих в основе преобразований генов биодеградации, способствует осознанию возможных путей их эволюции и создает предпосылки для их целенаправленного практического использования, в частности, для создания эффективных экологически
безопасных технологий очистки окружающей среды от опасных поллютантов.
Целью настоящей работы являлось определение нуклеотидной последовательности гена
nahG природных бактерий P. fluorescens NL61, детерминирующего синтез консервативного
НАД+-связывающего домена, входящего в состав салицилат-1-гидроксилазы.
Материал и методика
В работе использовали штаммы E. coli XL1-Blue (F′::Tn10(TcR) proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15/recA1
endA1, gуrA96(NalR) thi hsdR17 (rk–mk+) glnV44 relA1 lac), P. fluorescens NL61 (содержит Nah-плазмиду
ι-подгруппы группы IncP-9), а также векторную молекулу pUC19 (ApR, ColE1-репликон) из коллекции
кафедры микробиологии БГУ.
Бактерии выращивали в полноценной среде LB [6]. Агаризованные среды содержали 1,5 % агара,
источником углерода служила глюкоза в концентрации 0,2 %. Коммерческий препарат ампициллина
был взят в концентрации 100 мкг/мл. Изопропилтио-b-D-галактозид (IPTG) и b-галактозидазу (X-Gal)
производства Fermentas (Литва) готовили в соответствии с рекомендациями изготовителя и использовали в концентрации 0,5 мM и 50 мкг/мл соответственно.
57
Вестник БГУ. Сер. 2. 2013. № 1
Манипуляции с плазмидами. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора реактивов Plasmid
Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Рестрикцию плазмидной ДНК и легирование осуществляли в условиях, рекомендуемых фирмой-изготовителем (Fermentas, Литва). Продукты амплификации элюировали из агарозного геля с использованием набора DNA Extraction Kit (Fermentas, Литва). Электрофоретический анализ ДНК осуществляли общепринятыми методами, приведенными в руководстве
[9]. Размер фрагментов ДНК устанавливали на основании их электрофоретической подвижности в
агарозном геле, в качестве реперной ДНК применялся GeneRuler™ DNA Ladder Mix производства
Fermentas (Литва).
Трансформацию бактерий E. coli проводили согласно методическим рекомендациям, изложенным
в руководстве [9].
Тотальную ДНК выделяли с использованием GeneJET™ Genomic DNA Purification Kit производства Fermentas (Литва).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР была проведена с помощью набора реактивов производства Fermentas (Литва). Реакционная смесь (50 мкл) содержала 1 ед. полимеразы, 200 мкM каждого праймера, 200 мкМ дНТФ, 1,5 мМ MgCl2, 3 % глицерина и буфер согласно протоколу фирмыизготовителя.
Праймеры для ПЦР. Для амплификации гена nahG размером 893 п. н. использовали праймеры
shc1_up (5'-CGG CKT THG GTG ARG TCG GTG C-3') и shc1_lo (5'-GGC GAG GAA RTA GGC GTC CTC
AAG-3') [10] при режиме амплификации: 94 ºС – 5 мин (1 цикл); 94 ºС – 30 с, 64 ºС – 30 с, 72 ºС – 1,5 мин
(7 циклов); 94 ºС – 30 с, 68 ºС – 30 с, 72 ºС – 1,5 мин (23 цикла); 72 ºС – 10 мин (1 цикл).
Сиквенс-анализ. Для определения нуклеотидной последовательности гена nahG бактерий
P. fluorescens NL61, встроенной в состав вектора, использовали стандартные праймеры: M13/pUC
sequencing primer 5'-[Cy5]GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' и M13/pUC reverse sequencing primer
5'-[Cy5]CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'. Сиквенс осуществляли с помощью автоматического
секвенатора (ALFexpress II). Результаты анализировали с использованием компьютерных программ BLASTN2.2.1 (NCBI сайт: http://www.ncbi.nlm.nih.gov), ALFwin™ Sequence Analyser
(version 2.10).
Результаты и их обсуждение
На основании рестрикционного анализа продуктов амплификации генов nahG природных бактерий Pseudomonas, выделенных на территории Беларуси, было выявлено большое количество штаммов
(35 штаммов из 101 проверенного), для которых картина рестрикции ампликонов nahG соответствовала типу А88 в случае обработки рестриктазой MspI и типу NAH7 при воздействии рестриктазой RsaI. Это позволило отнести проанализированные последовательности к отдельному типу,
обозначенному как А88-NAH7 [11]. Тип А88 впервые был выявлен при рестрикционном и сиквенсанализе генов nahG природных бактерий P. fluorescens, изолированных из загрязненных полициклическими ароматическими углеводородами почвенных образцов на территории России. При этом
некоторые из генов предположительно имели внехромосомную локализацию (выявлены в штаммах,
содержащих плазмиды биодеградации нафталина группы IncP-7, IncP-9 или не идентифицированные репликоны) [2]. Особенность в организации генов nahG природных штаммов микроорганизмов
белорусской коллекции была выявлена для бактерий P. putida, P. fluorescens и P. species, многие из
которых содержали уникальные плазмиды ι-подгруппы группы IncP-9 (21 штамм из 35) [11]. Для
одной из плазмид штамма P. fluorescens NL61 был впервые клонирован и секвенирован мини-репликон. Поскольку у большинства исследованных бактерий ген nahG, обозначенный как А88-NAH7,
локализовался в геноме уникальных по организации систем репликации плазмид ι-подгруппы группы IncP-9, не исключалась возможность того, что выявленная детерминанта представляла собой
новый тип нуклеотидной последовательности данного гена. Для проверки этого предположения
продукт амплификации гена nahG бактерий P. fluorescens NL61, локализованного в составе плазмиды рNL61, был встроен в состав вектора pUC19 с дальнейшим определением его нуклеотидной
последовательности. Секвенированный фрагмент размером 893 п. н. проявлял наибольшую степень сходства (99 %) с геном nahG бактерий P. fluorescens A88 (AY433938.1), относящимся к типу
A88 (рис. 1, табл. 1), что дает основание отнести детерминанту nahG бактерий P. fluorescens NL61
к типу А88. Анализ нуклеотидной последовательности гена nahG плазмиды рNL61 природных нафталинутилизирующих бактерий P. fluorescens NL61 выявил 99 % идентичность с геном nahG бактерий P. fluorescens. Верхняя нуклеотидная последовательность соответствует гену nahG бактерий
P. fluorescens NL61, а нижняя – nahG бактерий Pseudomonas fluorescens A88 (AY433938.1). Выделен
сайт рестрикции для фермента RsaI.
58
Биология
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность гена nahG природных нафталинутилизирующих бактерий P. fluorescens NL61
Следует отметить, что тип А88 гена nahG имеет достаточно низкую степень гомологии с известными последовательностями. Максимальное сходство не превышает 87 % и проявляется c типом AN10,
минимальная гомология, составляющая 82 %, выявляется с типами pDTG1 и KB35B (см. табл. 1).
Таблица 1
Сходство нуклеотидной последовательности гена nahG природных нафталинутилизирующих
бактерий P. fluorescens NL61 с известными
Тип гена nahG
A88
AN10
NKNS3
KF715
NAH7
pDTG1
NL61*
KB35B**
Регистрационный номер
в генетическом банке данных
AY433938.1
AF039534.1
AY429511.1
S80995.1
AB237655.1
AF491307.2
JX171684
DQ265742.1
A88
100
AN10
87
100
Сходство нуклеотидных последовательностей, %
NKNS3
KF715
NAH7
pDTG1
86
98
100
86
98
98
100
83
84
85
83
100
82
82
83
82
93
100
KB35B
82
82
83
81
97
91
100
NL61
99
87
86
86
83
82
100
82
П р и м е ч а н и е . * Значения приведены для исследованного в данной работе гена nahG бактерий P. fluorescens NL61;
** тип KB35B условно выделен на основании сиквенс-анализа.
59
Вестник БГУ. Сер. 2. 2013. № 1
Наличие нуклеотидных последовательностей генов nahG типа А88 (предположительно локализован в составе плазмиды рА88 группы IncP-9 бактерий P. fluorescens A88, определена его последовательность размером 813 п. н.), NAH7 (локализован в составе плазмиды NAH7 группы IncP-9 бактерий
Pseudomonas putida NCIB, определена полная открытая рамка считывания размером 1305 п. н.) и, наконец, секвенированной в настоящей работе детерминанты размером 893 п. н. позволило объяснить
картину рестрикции последней ферментом RsaI (на форезе выявлялся тип NAH7 (табл. 2, рис. 2). Для
построения рестрикционных карт использовали нуклеотидные последовательности генов nahG типа
NAH7 (AB237655.1) и A88 (AY433938.1), представленные в генетическом банке данных, а также секвенированную в данной работе последовательность гена nahG из штамма P. fluorescens NL61. Оказалось,
что замена нуклеотида в гене nahG плазмиды рNL61 природных нафталинутилизирующих бактерий
P. fluorescens NL61 в позиции 651 (тимин на цитозин) привела к появлению дополнительного сайта
рестрикции RsaI (см. рис. 1) и обусловила картину рестрикции, сходную с типом NAH7 (см. рис. 2).
Рис. 2. Рестрикция ампликонов генов nahG под действием фермента RsaI: электрофореграмма (а) и рестрикционные карты (б):
а: номера дорожек соответствуют картине рестрикции известных типов генов nahG:
1 – pDTG1; 2 – AN10; 3 – NAH7; 4 – KF715; 5 – анализируемая последовательность гена nahG бактерий P. fluorescens NL61; M – репер 1 kB
DNA Ladder Mix (Fermentas, Литва)
Таблица 2
Фрагменты, образующиеся в результате рестрикции генов nahG ферментом RsaI
Сайт
317
518
649
750
–
NAH7
Фрагменты, образующиеся в результате рестрикции генов nahG ферментом RsaI
pNL61
Фрагмент
Сайт
Фрагмент
Сайт
317
201
131
101
–
317
328
518
649
750
317
11
190
131
101
317
328
518
750
–
А88
Фрагмент
317
11
190
232
–
На основании полученной в данной работе нуклеотидной последовательности гена nahG, природных бактерий P. fluorescens NL61, а также известных генов, депонированных в генетическом банке
данных, было построено древо детерминируемых ими белковых молекул, отражающее их филогенетическое родство (рис. 3). Филогенетически родственные группы белковых молекул NahG обозначены по
аналогии с типами нуклеотидных последовательностей, которые их детерминируют, а именно NAH7,
КВ35В, pDTG1, A88, AN10, KF715, NKNS. Белок, детерминируемый геном nahG бактерий P. fluorescens
NL61, исследованным в настоящей работе, выделен рамкой. Филогенетическое древо строилось с помощью программы MEGA 4.0 по методу ближайших соседей (количество bootstrap повторов 1000).
Таким образом, в ходе работы была установлена нуклеотидная последовательность гена nahG, широко распространенного среди природных бактерий Pseudomonas, циркулирующих на территории
Беларуси. Показано, что исследованная детерминанта относится к типу А88, однако отличается от
известной последовательности данного типа рядом нуклеотидных замен, одна из которых привела к
появлению дополнительного сайта рестрикции для фермента RsaI. Выявленная особенность в организации гена nahG бактерий P. fluorescens NL61 может служить надежным диагностическим маркером
для выявления подобного типа детерминант при анализе природных и коллекционных нафталинутилизирующих бактерий рода Pseudomonas.
60
Биология
Рис. 3. Филогенетическое древо белков NahG
Б И Б Л И О Г РА Ф И Ч Е С К И Й С П И С О К
1. To p E . , S p r i n g a e l D . , B o o n N . // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. Vol. 42. P. 199.
2. И з м а л к о в а Т. Ю . , С а з о н о в а О . И . , С о к о л о в С . Л . и др. // Микробиология. 2005. Vol. 74. P. 60.
3. L i W. , S h i J . , Wa n g X . et al. // Gene. 2004. Vol. 336. P. 231.
4. B o s c h R . , M o o r e E . R . , G a r c i a - Va l d e s E . et al. // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. P. 2315.
5. Ye n K . M . , G u n s a l u s I . C . // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. Vol. 79. P. 874.
6. D a v i e s J . I . , E v a n s W. C . // J. Biochem. 1964. Vol. 91. P. 251.
7. O r n s t o n L . N . , P a r k e D . // Biochem. Soc. Trans. 1976. Vol. 4. P. 468.
8. B e r g J . M . , Ty m o c z k o J . L . , S t r y e r L . Biochemistry. 5th ed. New York, 2002.
9. S a m b r o o k J . , F r i t s c h E . , M a n i a t i s T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York, 1989.
10. F e r r e r o M . , L l o b e t - B r o s s a E . , L a l u c a t L . et al. // Appl. Environm. Microbiol. 2002. Vol. 68. P. 957.
11. А л - Ш а м м а р и Ф . Д . Х . , Т и т о к М . А . // Докл. НАН Беларуси. 2010. Т. 54. № 6. С. 77.
Поступила в редакцию 04.09.12.
Артем Андреевич Сечеников – магистрант кафедры микробиологии.
Марина Алексеевна Титок – доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии.
УДК 604.4:577.15+579.852.11:579.222:577.15
А. В. Качан, А. Н. Евтушенков
Биохимическая характеристика термостабильной
α-амилазы природного изолята Bacillus sp. 1-15
Biochemical properties of the recombinant amylase of Bacillus sp. 1-15 isolate were characterized. Expression of the enzyme in
Escherichia coli cells was performed by expression plasmid consisting of the amylase gene. The intracellular extract of E. coli cells was
used as source of the enzyme. The enzyme had an optimal temperature at 80 to 90 ºC and an optimal pH of 7 to 9. In the absence of Са2+
ions, the amylase of Bacillus sp. 1-15 inactivated by 25 % after 30 min of incubation at 56 ºC. In the presence of 0,2 mM Са2+ ions, the
enzyme was active during a long-term incubation at 77 ºC, but rapidly inactivated at temperatures above 84 ºC. The stability of the amylase
increased in the presence of Са2+ ions and soluble starch. The amylase activity was significantly prevented by the presence of Co2+, Ni2+,
Zn2+, Fe2+, Cu2+ и Cd2+ cations, as well as by EDTA. The enzyme showed an ability to effectively adsorb on granules of raw starch of corn,
rice, potato and wheat in rates of 34÷86 %, respectively. In a period of 48 h, the amylase was able to degrade 27÷60 % of glycoside bonds in
61