Закономерности ввзаимодействия хитозана с глутаровым

На правах рукописи
Перминов Петр Анатольевич
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ХИТОЗАНА С ГЛУТАРОВЫМ
АЛЬДЕГИДОМ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ
ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ
02.00.06 – Высокомолекулярные соединения
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Москва - 2007
www.sp-department.ru
2
Работа выполнена на кафедре аналитической, физической и коллоидной
химии Московского государственного текстильного университета имени А.Н.
Косыгина
Научный руководитель:
доктор химических наук
Кильдеева Н.Р.
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор
Зеленецкий А.Н.
доктор химических наук, профессор
Варламов В.П.
Ведущая организация:
Институт элементоорганических
соединений им. А.Н. Несмеянова
РАН.
Защита диссертации состоится « » ноября 2007 года в ___ часов на
заседании диссертационного совета Д 212.139.01 при Московском
государственном текстильном университете имени А.Н. Косыгина по
адресу: 119071, Москва, Малая Калужская, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского
государственного текстильного университета имени А.Н. Косыгина.
Автореферат разослан «
» октября 2007 года
Ученый секретарь
диссертационного совета
www.sp-department.ru
доктор химических наук
Зубкова Н.С.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Разработка биологически активных полимерных
систем с заданными свойствами имеет большое значение для создания новых
материалов, предназначенных для применения в медицине, биотехнологии,
экологии и других областях. Полисахарид хитозан обладает комплексом
уникальных свойств, таких как биосовместимость, гидрофильность,
биологическая и сорбционная активность, биоразлагаемость. Растворимость
хитозана в разбавленных водных растворах кислот, наряду с волокно- и
пленкообразующей способностью и наличием реакционно-способных
аминогрупп облегчает модификацию этого полимера и переработку его в
полимерные изделия.
Модификация
бифункциональными
сшивающими
реагентами,
наиболее распространенным из которых является глутаровый альдегид (ГА),
позволяет получить на основе хитозана пленки, микрокапсулы, гранулы,
волокна,
нерастворимые
в
воде,
но
обладающие
высокой
влагоудерживающей способностью гидрогели и композиционные материалы
и зафиксировать в их структуре лекарственные соединения, ферменты и
другие белки. Несмотря на то, что ГА широко используется в различных
областях, и в особенности в биохимии, не сформировалось единого мнения о
механизме реакции ГА с белками, а тем более с хитозаном. Изучение
закономерностей взаимодействия хитозана с ГА позволит определить
перспективы использования этой системы для получения новых материалов
для биотехнологии и медицины, а также выбрать оптимальные условия их
получения.
Работа выполнена в соответствии с основными направлениями
научных исследований кафедры аналитической, физической и коллоидной
химии МГТУ в рамках госбюджетной темы № 06-635-42 единого заказ-наряда
Федерального агенства по образованию и гранта молодых ученых МГТУ, а
также в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным
направлениям развития науки и техники на 2002-2006гг.» (Комплексный
проект ЖС-КП.4/002),
Целью работы являлось установление закономерностей и
формирование представлений о механизме взаимодействия хитозана с
глутаровым альдегидом, и разработка на этой основе различных
ферментсодержащих полимерных систем.
Для достижения поставленной цели необходимо было изучить влияние
рН на свойства растворов хитозана и ГА, провести квантовохимическое
моделирование реакции взаимодействия аминогрупп хитозана с различными
формами ГА, изучить кинетику реакции сшивки хитозана ГА и кинетику
гелеобразования в растворах хитозана в присутствии ГА, исследовать
свойства образующихся гелей, а также разработать метод получения на
основе
гелеобразующих
систем
ферментсодержащих
полимерных
материалов.
Научная новизна полученных результатов. В диссертационной
работе впервые показано, что особенности реакции с ГА в растворах
хитозана связаны с наличием равновесных форм ГА, соотношение между
которыми может меняться в зависимости от рН, а также высокой степенью
протонирования аминогрупп хитозана, снижающей их реакционную
способность в реакции с карбонильными группами.
www.sp-department.ru
4
Показано, что увеличение реакционной способности ГА в реакции с
аминогруппами хитозана, наблюдаемое с ростом рН, связано с увеличением
подвижности протона при соседнем с карбонильной группой атоме углерода,
играющего ключевую роль в реакции альдольной конденсации,
предшествующей образованию его α,β-ненасыщенных производных.
На основании анализа значений тепловых эффектов реакции
взаимодействия глюкозамина и триглюкозамина с различными формами ГА,
полученных методом квантовохимического моделирования, установлено, что
наиболее вероятным является взаимодействие депротонированных
аминогрупп с сопряженными с С=С-связью карбонильными группами
олигомерной формы ГА.
Предложен механизм взаимодействия хитозана с ГА, заключающийся в
образовании альдиминной связи, инициирующей рост олигомерной цепи на
хитозане, и последующей межмолекулярной сшивке путем кротоновой
конденсации олигомерных цепей модифицированного хитозана или (в
зависимости от рН) взаимодействия с аминогруппами макромолекул
немодифицированного хитозана.
Установлена
взаимосвязь
состава
ферментсодержащих
гелеобразующих систем на основе хитозана или его сульфатированного
производного, степени связывания белка и каталитических характеристик
иммобилизованных в полимерных материалах различной физической формы
ферментов трипсина и органофосфатгидролазы.
Практическая значимость. Показана возможность использования
реакции
сшивки хитозана
и
его
производных
для
получения
ферментсодержащих полимерных систем разной физической формы
(гидрогелей,
пленок
микрокапсул,
волокнистых
биокатализаторов).
Разработан
метод
иммобилизации
органофосфатгидролазы
путем
гелеобразования белоксодержащей композиции на основе сульфата
хитозана и ГА, позволяющий сохранить до 70% активности фермента.
Разработка
«Волокнистый
биокатализатор
для
детоксикации
фосфорорганических нейротоксинов» получила Золотую медаль на
Всероссийской выставке научно – технического творчества молодежи
(Москва, ВВЦ, 2005г).
Исследование процесса сшивки хитозана ГА показало присутствие в
образцах сшитого хитозана продуктов кротоновой конденсации ГА,
содержащих карбонильные группы и С=С-связи, что заставляет
рекомендовать исключить использование реакции с ГА для разработки
материалов, контактирующих с живыми тканями.
Публикации Основные результаты диссертации изложены в 12
печатных работах, в том числе, 1 патенте, 4 статьях в научных журналах, 8 –
в сборниках статей и материалах конференций.
Апробация работы Результаты работы были представлены на: VII и
VIII Международных конференциях «Современные перспективы в
исследовании хитина и хитозана » (СПб-Репино, 2003; Казань, 2006), XII
Internetional Workshop on bioencapsulation (Spain, Vitoria, 2004), Всероссийских
научно-технических
конференциях
«Современные
технологии
и
оборудование текстильной промышленности (Москва, 2004 и 2005),
Международной
научно-практической
конференции
«Современные
энергосберегающие тепловые технологии» (Москва, 2005), XII Всероссийской
конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2006),
www.sp-department.ru
5
III Всероссийской научной конференции «Физико-химия процессов
переработки полимеров» (Иваново, 2006), V Международной конференции
«Современные подходы к разработке и клиническому применению
эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных
имплантатов» ( Москва, 2006).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152
страницах, состоит из введения, обзора литературы, методического раздела,
обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 117
наименований. Работа содержит 17 таблиц и 52 рисунка.
Содержание работы. Во введении дана общая характеристика
работы, обоснована ее актуальность и сформулированы цели исследования.
Обзор литературы состоит из двух разделов: первый посвящен
использованию хитозана и его производных в процессах иммобилизации
ферментов, второй раздел включает сведения о взаимодействии глутарового
альдегида с аминокислотами, белками и другими полимерами. В
методическом разделе приведены характеристики исходных соединений,
описаны способы получения полимерных материалов на основе хитозана и
ГА и методы исследования, включающие УФ- и ИК-спектроскопию, ЯМРспектроскопию, электронную сканирующую микроскопию, методы ядерной
магнитной
релаксации
и
квантово-химического
моделирования,
реологический и физико-механический методы, кинетические методы
определения ферментативной активности.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1 Закономерности процесса сшивки хитозана глутаровым альдегидом
Взаимодействие белков и других аминосодержащих полимеров с ГА
происходит при комнатной температуре и в физиологическом интервале рН,
т.е. в условиях, исключающих денатурацию белка, и является перспективным
методом получения иммобилизованных препаратов таких конформационночувствительных биологически активных соединений как ферменты.
Традиционные представления объясняют рН-зависимость реакции сшивки
белков ГА снижением реакционной способности протонированных
аминогрупп в реакции с карбонильными группами.
рН 2%-го раствора хитозана в 2%-ной уксусной кислоте составляет 4,1.
Степень протонирования аминогрупп при этом рН α=0,9, т.е. только 10%
аминогрупп наиболее реакционноспособны в реакциях нуклеофильного
присоединения. Увеличить число депротонированных аминогрупп в растворе
хитозана возможно добавлением NaOH в количестве, не приводящем к
осаждению полимера. Для определения рН-пределов растворимости
хитозана разной молекулярной массы эквиконцентрированные (2%-ные)
растворы хитозана в 2%-ной уксусной кислоте были турбодиметрически
оттитрованы раствором NaOH с определением рН точки помутнения.
Результаты титрования показали, что область рН-стабильности растворов
хитозана увеличивается с уменьшением его молекулярной массы (рис.1).
Добавление 0,5М раствора NaOH в раствор хитозана с ММ 180 кДа до рН=5,6
позволяет, сохранив гомогенность раствора, увеличить до 47% число
депротонированных аминогрупп.
www.sp-department.ru
6
Величина
рН
может
влиять на равновесие между
разными формами ГА в его
7
водных растворах: линейным
мономерным диальдегидом и
6,5
его гидратами, циклическим
полуацеталем,
а
также
6
олигомерными
продуктами
альдольной
и
кротоновой
конденсации (схема 1), а
5,5
следовательно,
и
на
реакционную способность ГА в
5
его реакции с аминогруппами
0
0,5
1
1,5
2
2,5
хитозана. Для формирования
lg(ММ),[кДа]
представлений о возможном
Рис.1 – Зависимость рН точки помутнения механизме
реакции
ГА
с
2%-ных растворов хитозана в 2%-ной аминогруппами
хитозана
уксусной кислоте при титровании раствором методом
ЯМР-спектроскопии
NaOH от молекулярной массы хитозана
были изучены растворы ГА
фирмы Merck при рН 3,1, соответствующем рН коммерческого 25%-го
водного раствора, рН 4,1, соответствующем рН 2%-го раствора хитозана в
2%-ном водном растворе уксусной кислоты, и рН 5,6,
13
В
С
O
O
O
OH
HO
OH
ЯМР-спектрах
HO
обнаруживает
OH
OH
A
B
ся
17
C
сигналов
атомов
углерода.
OH
HO
Сложный
OH
HO
характер
(1)
O
HO
O
O
HO
спектров
D cis
объяснется
E trans
присутствием
в
растворе
O
приведенных
OH
на
схеме 1
HO
O
O
O
OH
O
O
пяти основных
F
форм ГА (А G
Е). По данным
O
интегрирован
1
O
O
ия
H-ЯМРспектров
при
H
рН
3
соотношение форма E:форма D:свободный альдегид (формы A и B):
гидратированный альдегид (формы B и C): составляет 1:1.12:1.63:0.87,
практически такое же соотношение наблюдается рН 4.2 - 1:1.50:1.56:0.97, а
при рН 5.6 – 1:2.02: 2.09: 1.38, содержание форм A, B и C существенно выше,
чем циклических продуктов D и E.
рН точки помутнения
7,5
www.sp-department.ru
7
На основании результатов ЯМР-спектроскопии на 1Н и 13С нельзя
утверждать о присутствии α,β-ненасыщенных производных ГА (схема
1,продукты альдольной G и кротоновой H конденсаций) в растворах ГА в
количестве, большем 2-4% даже при рН 5,6. Однако, данные 1H и 13С ЯМРспектров показывают увеличение подвижности протона при соседнем с
карбонильной группой атоме углерода при рН 5.6. И этот факт указывает на
увеличение в этих условиях реакционной способности ГА в реакции
альдольной конденсации, предшествующей образованию его α,βненасыщенных производных. Действительно результаты УФ-спектроскопии
растворов ГА показывают медленный рост оптической плотности во времени
в области λ=230-240 нм, соответствующей поглощению С=С-связей,
сопряженных с карбонильными группами, при рН 5,6 и 7,0, который не
наблюдается при 4,1.
Для установления наиболее реакционноспособной формы ГА в
реакции с аминогруппами хитозана с использованием методов квантовохимического моделирования был проведен расчет энтальпий образования
глюкозамина, остатком которого является мономерное звено хитозана, пяти
различных форм ГА, а также продуктов их взаимодействия с
протонированной и депротонированной аминогруппами глюкозамина. В
качестве критерия оценки вероятности протекания реакции был использован
ее тепловой эффект, который рассчитывали по следствию из закона Гесса:
∆ r Н = Σ∆Н прод. − Σ∆Н исх. .
Тепловые
эффекты
реакций
взаимодействия
глюкозамина,
содержащего как депротонированную, так и протонированную аминогруппу, с
мономерным ГА в его линейной негидратированной форме и форме
полуацеталя, рассчитанные с помощью обеих программ, оказались
положительными, что указывает на низкую реакционную способность этих
форм. Гидратирование одной или двух карбонильных групп ГА приводит к
O
повышению его
H
C
реакционной
H
способности
в
C
C
H
реакции
с
C
H
H
аминогруппой
C
H
H
H
C
глюкозамина
H
H
O
H
C
H
C
H
H
(∆rH
=
-16,5
C
C
O
C
кДж/моль),
что
C
C
H
H
C
H
быть
(2) может
H
H
H
C
обусловлено
N
H
O C O
H
H
изменением
H
HO
C
величины
C
C
C
положительного
H
H
OH
H
заряда
на атоме
C
H
углерода
O H
карбонильной
группы. Наиболее устойчивые основания Шиффа образует олигомерный
продукт кротоновой конденсации ГА, взаимодействующий с NH2-группой
глюкозамина по карбонильной группе, находящейся в сопряжении с двойной
связью (схема 2), что является следствием эффекта резонанса. Однако
результаты расчетов свидетельствуют о более низкой вероятности
www.sp-department.ru
8
образования азометинов с протонированой аминогруппой глюкозамина.
Очевидно, при протонировании аминогруппы такая реакция трудно
осуществима, так как вакантная электронная пара азота, занятая протоном,
уже не может быть электронодонором и проявляет более слабые
нуклеофильные свойства в реакции присоединения, чем депротонированная.
Для изучения кинетики реакции взаимодействия аминогрупп хитозана с
ГА методом УФ-спектроскопии при рН 4,1был использован хитозан с ММ 3
kDa,, растворимый в воде во всем диапазоне рН (рис.2).
Образование
продуктов
1,2
конденсации
хитозана
с
ГА
А
сопровождается
увеличением
поглощения в широкой области
1
длин
волн
200-300
нм.
Возникновение
максимума
в
0,8
области 260-300 нм в основном
связано
с
образованием
азометинов (λC=N=272 нм), кроме
0,6
того
область
λ=285
нм
7
соответствует
поглощению
карбонильных групп, сопряженных
0,4
с
С=С-связями.
В
пользу
6
C C CHO ,
появления структур
0,2
2
наряду с альдиминовыми связями,
3
свидетельствует
спектр,
1
полученный через 15 часов после
0
начала реакции (спектр 7, рис.2),
200 220 240 260 280 300 320 340
на
котором
заметно,
что
λ, нм
увеличение
поглощения
в
Рис.2– УФ-спектры совместного раствора диапазоне длин волн λ=260-300 нм
хитозана (3 кДа) и ГА (3-7) (ГА/NH2=2,0 является результатом наложения
моль/моль, рН 4,1). 1 – спектр ГА; 2 – двух
максимумов,
спектр хитозана; 3 – 12 мин; 4 – 30 мин; 5 соответствующих
областям
– 45 мин; 6 – 90 мин; 7 – 900 мин
поглощения
соединений,
содержащих эти структуры и основания Шиффа. Эти факты, а также
появление на спектре 7 (рис.1) в области λ=230 нм выраженного плеча
максимума поглощения С=С-связей, сопряженных с карбонильной группой,
могут объясняться помимо очевидного увеличения во времени концентрации
альдиминных связей вследствие конденсации карбонильных групп ГА и
депротонированных аминогрупп хитозана увеличением концентрации
продуктов кротоновой конденсации ГА, протекающей параллельно с
образованием оснований Шиффа.
Растворы хитозана с ММ 180 кДа с концентрацией 1,3% и рН 4,1 и рН
5,6 были использованы для изучения влияния условий реакции на скорость
гелеобразования в присутствии ГА. Время гелеобразования закономерно
уменьшалось с ростом соотношения ГА/NH2, причем при рН 5,6 оно было
существенно меньше, чем при рН 4,1, что особенно заметно при низких
концентрациях ГА в реакционной смеси (рис. 3). Уменьшением соотношения
ГА/NH2 при рН 4,1 до 1 моль/моль можно увеличить время гелеобразования в
4
5
www.sp-department.ru
9
системе до суток. Увеличение молекулярной массы хитозана приводит к
уменьшению времени гелеобразования в эквиконцентрированных растворах.
Переход от псевдопластической жидкости к пространственно-сшитой
структуре геля, происходящий в растворе хитозана в присутствии ГА,
соответствует завершению гелеобразования, но не реакции сшивки хитозана
ГА. Об этом свидетельствует кинетика изменения модуля упругости гелей,
полученных в разных условиях (рис. 4). Рост модуля упругости во времени
указывает на образование дополнительных сшивок, фиксирующих структуру
геля.
60
Е, кПа
50
Время гелеобразования, мин
120
5
100
80
2
40
1
1
60
30
40
20
20
10
4
0
3
2
0
0
1
2
3
4
5
Соотношение ГА/NH2 , моль/моль
6
Рис.3
–
Зависимость
времени
гелеобразования в растворе хитозана и
ГА
от
соотношения
ГА/NH2.
Концентрация раствора хитозана 1,31
%, ММ хитозана 180 кДа, рН 4,1 (1) и 5,6
(2).
0
50
100
150
Время, мин
200
250
Рис.4 – Кинетика изменения модуля
упругости гелей хитозана, сшитых ГА.
Соотношение ГА/NH2 2,5 (1), 1,0 (2,3,5),
0,4 (4) и рН 4,1 (1-3) и 5,6 (4,5).
Концентрация хитозана в реакционной
смеси 1,31% (1,2,4,5) и 1,9% (3).
Если допустить, что в реакции сшивки глутаровым альдегидом
принимают участие две его карбонильные группы, то теоретически возможная
модификация аминогрупп бифункциональным сшивающим реагентом должна
быть достигнута при эквимольном соотношении альдегидных групп ГА и
аминогрупп хитозана, что с учетом степени протонирования соответствует
соотношению ГА/NH2 0,24 моль/моль рН 5,6, а при 4,1 – 0,05 моль/моль 0,5.
Однако изучение кинетики изменения вязкости в растворах хитозана в
присутствии ГА и изменения модуля упругости гелей обнаружило рост этих
показателей при увеличении содержания ГА в системе свыше 0,4 моль/моль.
Эти
результаты
свидетельствуют
о
более
сложном
механизме
взаимодействия аминогрупп хитозана с ГА.
Учитывая установленный нами состав растворов ГА при различном рН
и результаты теоретических расчетов теплот реакций взаимодействия
модельных соединений с различными формами ГА, можно предположить,
что первой стадией процесса сшивки является образование оснований
Шиффа в результате взаимодействия депротонированных аминогрупп
хитозана с моно- или дигидратированной формой ГА с образованием
продукта (схема 3):
(3)
OCH (CH2)3 CH N Chitosan
www.sp-department.ru
10
Образование оснований
Шиффа
однозначно
подтверждается
результатами ИК-спектроскопии (рис.5). Наиболее существенные изменения
в спектрах сшитых образцов наблюдаются в области 3000-2800 см-1 и 17001300 см-1, где поглощают СН2-группы, альдегидные, амидные и аминогруппы.
4
3
2
1
Рис.5 – Фурье ИК-спектры образцов хитозана (1) и хитозана, сшитого ГА (2-4):
1 – исходный хитозан, 2-4 – хитозан, сшитый ГА при рН 4,1 (2) и 5,6 (3, 4) и
соотношении ГА/NH2 0,4 (2, 3) и 2,5 (4) моль/моль.
О наличии азометиновой группы в продукте взаимодействия хитозана с
ГА следили по пику валентных колебаний связи C=N, который благодаря
высокому коэффициенту экстинкции легко обнаруживается в приведенных
спектрах на частоте 1634 см-1. С увеличением числа протонированных
аминогрупп в хитозане (увеличение рН с 4,1 до 5,6) интенсивность этого пика
возрастает.
Известно, что альдиминные связи в основаниях Шиффа неустойчивы и
легко гидролизуются в водной, а тем более в кислой среде, что не
происходит в продуктах взаимодействия хитозана и ГА. Учитывая уже
отмечавшееся отсутствие значимых концентраций продуктов кротоновой
конденсации ГА можно предположить, что резонансные структуры,
стабилизирующие продукт взаимодействия хитозана с ГА, возникают в
последующих стадиях реакции сшивки хитозана. По-видимому, образование
альдиминной связи активирует присоединенную молекулу ГА, и инициирует
рост олигомерной цепи за счет избыточного содержания ГА в растворе
(схема 4). В пользу этого свидетельствуют полосы поглощения альдегидных
групп в ИК-спектрах продуктов взаимодействия хитозана и ГА при 1706 см-1, а
также увеличение ее интенсивности с ростом концентрации ГА (рис.5). Эта
полоса появляется только в образцах хитозана, сшитого при более высоком
значении рН (5,6), при котором, как было показано, возрастает подвижность
протона, находящегося в α-положении к карбонильной группе и играющего
ключевую роль в реакции альдольной конденсации.
Дальнейшие превращения с образованием уже сшитого продукта могут
происходить путем конденсации аминогрупп хитозана с карбонильными
группами модифицированного хитозана (схема 5) или путем альдольной и
www.sp-department.ru
11
кротоновой конденсации олигомерных цепей модифицированного хитозана
(схема 6). Результаты ИК-спектроскопии не исключают возможность
O
HC N Chitosan
получения
как
(OH)2HC (CH2)3 C
+
продукта
,
как
согласно
схеме
CH2 (CH2)2 CHO
H
5, так и схеме 6. Однако как
увеличение
числа
альдегидных
групп
в
OH HC N Chitosan
образце
сшитого
при
(OH)2HC (CH2)3 CH CH (CH2)2 CHO
высокой концентрации ГА
H 2O
хитозана (спектр 4, рис.5),
( (4) так и рост модуля упругости
HC N Chitosan
геля,
полученного
в
(OH)2HC (CH2)3 CH C (CH2)2 CHO
аналогичных
условиях
(рис.4), свидетельствует о
H 2O
H2O
том, что при избытке ГА и рН
5,6 в реакционной смеси
HC N Chitosan
вероятнее
образование
OCH (CH2)3 CH C (CH2)2 CHO
соединения (4).
Следует
отметить, что длина
OCH (CH2)3 CH C (CH2)2 CHO
Chitosan NH2 +
олигомерных цепей в
модифицированном
(5) или сшитом хитозане
H 2O
может
быть
Chitosan N CH (CH2)3 CH C (CH2)2 CHO
различной, поэтому
химическое строение
HC N Chitosan
продуктов
взаимодействия
HC N Chitosan
хитозана с ГА, в
2 OCH (CH2)3 CH C (CH2)2 CHO
особенности
полученных в разных
H2O
может
(6) условиях,
сильно различаться.
HC N Chitosan
С уменьшением рН
OH)2HC (CH2)3 CH C CH2 C CH
длина олигомерных
(CH2)2
OHC
цепей
и,
OCH (CH2)3 CH C CH N Chitosan
соответственно,
число карбонильных
групп должны уменьшаться, что подтверждается результатами ИК-спектров
хитозана, сшитого ГА при 4,1.
Равновесная степень набухания сшитых систем, образующихся в
результате гелеобразования в растворах хитозана в присутствии ГА, в
зависимости от условий их получения изменяется в несколько раз и может
достигать 11000%. Увеличение степени сшивки при росте соотношения
ГА/NH2 и числа депротонированных аминогрупп (с увеличением рН) приводит
к синерезису геля и сопровождается выделением некоторого количества
воды. Набухший гель хитозана, сшитого ГА, имеет высокопористую
структуру, характеризующуюся замкнутыми порами размером 50-100 мкм
(рис.6а). Удаление воды при высушивании приводит к контракции пор и
HC N
Chitosan
www.sp-department.ru
12
уменьшению их размеров (рис. 6б). В процессе сушки при 400С в результате
релаксационных процессов происходит переход структуры сшитого полимера
в равновесное состояние, характеризующееся меньшей (выше чем на
порядок) влагоудерживающей способностью.
а)
б)
Рис. 6 – Микрофотографии сколов геля хитозана, сшитого ГА. а) – набухший гель;
б) – гель после высушивания при 400С
2 Получение ферментсодержащих полимерных материалов на основе
хитозана с использованием реакции сшивки ГА
Изучение
взаимодействия
аминогрупп
хитозана
с
ГА
и
гелеобразования в растворах хитозана, являющегося результатом сшивки
ГА, показало, что исследуемый процесс позволяет в широких пределах
регулировать время гелеобразования и свойства формирующихся систем, и
это явилось предпосылкой для разработки различных форм полимерных
материалов, в том числе содержащих иммобилизованные ферменты.
Установленные в работе закономерности были использованы для получения
микрокапсул, пленок, гидрогелей и волокнистых биокатализаторов.
Микрокапсулы получали методом высокочастотного разбиения струи
на установке, сконструированной в лаборатории криогенной техники
Московского энергетического института. Капсулы формовали из растворов
хитозана, содержащих ГА и трипсин, в теплое (40оС) растительное масло и
после
промывки исследовали изменение
активности
полученных
микрокапсул при многократном гидролизе специфического субстрата.
Показано, что скорость гидролиза N-бензоил-L-аргинина в течение семи
циклов практически не изменялась, что свидетельствует о необратимой
иммобилизации трипсина.
Система раствор хитозана - ГА может быть использована для
получения высоконабухающих пленок, при этом полимерная пленка может
быть сформирована не только на твердой подложке, но и на любой другой
поверхности, например, на волокне или ткани. Для иммобилизации
ферментов органофосфатгидролазы и трипсина был выбран метод,
заключающийся в формировании на поверхности хлопчатобумажной бязи
тонкой гелеобразной ферментсодержащей полимерной пленки. В качестве
пленкообразующих полимеров использовали хитозан и сульфат хитозана
(СХ). Выбор сульфата хитозана обусловлен его растворимостью в широком
диапазоне рН.
www.sp-department.ru
13
Время гелеобразования, мин.
Триэфиры ортофосфорной кислоты, используемые как пестициды и
инсектициды, а также в качестве боевых отравляющих веществ, по характеру
токсикологического действия относятся к нейротоксинам. Проблема их
детоксикации является крайне актуальной. Ключевым ферментом в процессе
биодеструкции, катализирующим гидролиз фосфорэфирной связи в
ортофосфатах, является органофосфатгидролаза (ОФГ). Волокнистые
материалы, содержащие иммобилизованную ОФГ, могут быть использованы
для удаления и детоксикации следов нейротоксинов с поверхности
оборудования, а также в качестве средства гигиены и индивидуальных
средств защиты (салфетки, респираторы). Разработка и изучение свойств
волокнистого биокатализатора, содержащего иммобилизованную ОФГ,
проведены в рамках совместных исследований с научной группой
Е.Н.Ефременко (кафедра химической энзимологии Химического факультета
МГУ имени М.В.Ломоносова).
Активный центр ОФГ содержит ионы Со3+ и координационную воду,
поэтому носитель должен обладать влагоудерживающей способностью, а
условия иммобилизации ограничены величиной рН>7,5. Это явилось
причиной низкой активности ОФГ (7-8% активности нативного фермента),
иммобилизованной на бязи с использования композиций на основе
растворов хитозана. Эквиконцентрированные растворы СХ (Мм 120 кДа) изза более низкой молекулярной массы, а также благодаря наличию в его
макромолекулах SO3H-групп значительно менее структурированы по
сравнению с растворами хитозана, что позволило использовать
концентрацию раствора, а не рН в качестве параметра для варьирования
времени гелеобразования в процессе сшивки ГА (рис.7).
При
выбранном
составе
160
композиции была изучена
эффективность
140
иммобилизации
различных
120
количеств ОФГ в гелях СХ с
100
использованием
бязи
в
качестве подложки (рис 8).
80
Было показано, что в то
60
время
как
активность
биокатализаторов
на основе
40
СХ
при
увеличении
20
количества вводимого белка
возрастает, эффективность
0
иммобилизации
снижается
2
3
4
5
6
7
8
9 10
вследствие
увеличения
Концентрация сульфата хитозана, %
влияния
диффузионных
Рисунок
7
–
Зависимость
времени факторов на гетерогенногелеобразования от концентрации СХ (рН 8,0,
каталитическую
реакцию.
соотношение ГА/NH2 0,24 моль/моль)
Постоянство
значений
эффективности иммобилизации при введении свыше 0,4 мг белка на 1 г
катализатора связано с десорбцией фермента из биокатализатора.
www.sp-department.ru
14
В
результате
проведенных
исследований
был выбран состав композиций
60
на основе 7%-го раствора СХ
(рН
8,0)
при
мольном
50
соотношении
ГА/NH2
0,24
моль/моль и 0,3 мг наносимого
40
белка на 1 г бязи. Определены
кинетические
параметры
30
реакций гидролиза различных
субстратов:
параоксона,
20
паратиона,
кумафоса
и
хлорпирифоса, катализируемых
иммобилизованным
10
препаратом ОФГ (таблица 1).
Значения
Км
0
иммобилизованного
фермента
,
0
2
4
6
8
полученные для различных
Масса введенной ОФГ, мг/г
субстратов,
были
выше
Рис 8 – Зависимость эффективности
аналогичных параметров для
иммобилизации от массы вводимой ОФГ для
растворимой формы ОФГ, что
препаратов
тканевого
биокатализатора,
является
следствием
полученных на основе СХ
диффузионных
ограничений,
обусловленных наличием пространственных затруднений для диффузии
субстратов и продуктов реакции в объеме геля, а также наличием
сильнозаряженных групп носителя.
Эффективность иммобилизации, %
70
Таблица 1 – Кинетические параметры реакции гидролиза различных субстратов,
катализируемой препаратами растворимой и иммобилизованной ОФГ.
Растворимая форма ОФГ
Субстрат
Параоксон
Паратион
Кумафос
Хлорпирифос
Иммобилизованная форма ОФГ
Км, мМ
Vmax ,
мкМ/мин
Vmax / Км
*10-3,
мин-1
Км, мМ
Vmax ,
мкМ/мин
Vmax / Км
*10-3,
мин-1
0,46±0,03
1,54±0,05
1,58±0,06
32,1 ± 1,2
9,7 ± 0,5
9,4 ± 0,4
70 ± 2,5
6,3 ± 1,0
5,9 ± 1,5
1,36±0,07
3,43 ± 0,1
5,71 ± 0,2
21,31±0,8
6,42 ± 0,3
6,21 ± 0,4
15,8 ± 0,1
1,9 ± 0,3
1,1 ± 0,2
1,59±0,04
9,1 ± 0,4
5,7 ± 1,0
4,71 ± 0,4
6,19 ± 0,6
1,3 ± 0,2
Таким образом, показана возможность использования разработанного
препарата иммобилизованной ОФГ для детоксикации фосфорорганических
нейротоксинов путем гидролиза эфирной связи в триэфирах ортофосфорной
кислоты.
ВЫВОДЫ
1. Установлены закономерности процесса сшивки хитозана ГА;
показано, что основным фактором, влияющим на механизм реакции
взаимодействия аминогрупп хитозана с ГА и характер гелеобразования в
растворах хитозана в присутствии ГА, является концентрация ионов
водорода.
www.sp-department.ru
15
2. Установлено соотношение между равновесными молекулярными
формами в растворах ГА при различных рН, соответствующих рН растворов
хитозана, при этом не обнаружено значимых концентраций продуктов
альдольной и кротоновой конденсации диальдегида.
3. С использованием квантово-химических расчетов показано, что
наиболее вероятным процессом при взаимодействии хитозана с ГА является
образование оснований Шиффа депротонированными аминогруппами
хитозана с сопряженными с С=С-связью карбонильными группами
олигомерной
формы
ГА.
Из
мономерных
форм
наиболее
реакционноспособная форма - линейный гидрат ГА.
4. Предложен механизм сшивки хитозана ГА. Установлено, что
увеличение реакционной способности ГА в реакции с аминогруппами
хитозана, скорости гелеобразования в растворах хитозана и модуля
упругости геля при увеличении рН и соотношения ГА – аминогруппа связаны
как с уменьшением степени протонирования аминогрупп, так и с изменением
механизма сшивки хитозана ГА.
5. Получены гидрогели хитозана, способные удерживать до 10000%
воды, удаление которой при высушивании приводит к релаксационным
процессам и резкому снижению способности к набуханию.
6. Показана возможность использования реакции сшивки хитозана или
сульфата хитозана ГА для получения ферментсодержащих микрокапсул,
гелей, пленок и волокнистых биокатализаторов. Получены образцы с
высокой стабильностью, сохраняющие до 70-100% активности нативного
фермента.
Показана
эффективность
применения
биокатализатора,
содержащего
органофосфатгидролазу
для
детоксикации
фосфорорганических нейротоксинов.
Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:
1. Перегудов А.А., Перминов П.А., Филиппова Н.В., Ефременко Е.Н., Кильдеева
Н.Р. Разработка новых форм биокатализаторов для деградации
фосфорорганических нейротоксинов/ В сб. научных трудов молодых ученых
«Современные проблемы биологии, экологии и химии». – Ярославль. – 2003. –
С. 169-172.
2. Кильдеева Н.Р., Вихорева Г.А., Ефременко Е.Н., Перминов П.А.
Использование хитозана и его производных для иммобилизации белков/ Матлы Седьмой Международной конференции «Современные перспективы в
исследовании хитина и хитозана». – М., ВНИРО. – 2003. – С. 395-398.
3. Peregudov A., Kildeeva N., Perminov P., Vikhoreva G., Efremenko E. Chitosan gels
with entrapped enzyme hydrolyzing pesticides and chemical warfare agents/ Mater.
XII Inter. Workshop on bioencapsulation. – Spain, Vitoria. – 2004. – P. 230-233.
4. Ефременко Е.Н., Перегудов А.А., Кильдеева Н.Р., Перминов П.А.,
Варфоломеев С.Д. Способ получения биокатализатора и биокатализатор для
гидролиза фосфорорганических соединений/ Патент РФ № 2261911. 2005.
Приоритет от 18.03. 2004.
5. Миронов А.В., Бухаров А.В., Кильдеева Н.Р., Перминов П.А. Получение
микрокапсул на основе хитозана методом вынужденного капиллярного
распада струи/ В сб. трудов II Международной научно-практической
конференции «Современные энергосберегающие технологии» (СЭТТ-2005). –
М., МЭИ. – 2005. – т. 1. – С. 391-392.
6. Efremenko Е., Peregudov А., Kildeeva N., Perminov P., Varfolomeyev S. New
enzymatic immobilized biocatalysts for detoxification of organophosphorus
compounds// Biocatalysis and Biotransformation. – 2005. – V. 23 (2). – P. 103-108.
www.sp-department.ru
16
7. Никоноров В.В., Перминов П.А., Кильдеева Н.Р. Закономерности
структурообразования в растворах хитозана в присутствии сшивающего
реагента для получения волокнистых биокатализаторов// Хим. волокна. – 2006.
– №2. – С. 9-11.
8. Кильдеева Н.Р., Вихорева Г.А., Гальбрайх Л.С., Миронов А.В., Бонарцева Г.А.,
Перминов П.А., Ромашова А.Н. Получение биодеградируемых пористых
пленок для использования в качестве раневых покрытий// Прикладная
биохимия и микробиология. – 2006. – т. 42. – № 6. – С. 716-720.
9. Перминов П.А., Кильдеева Н.Р., Вихорева Г.А., Владимиров Л.В., Акопова Т.А.,
Бабак В.Г. Изучение взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом/ Матлы Восьмой Международной конференции «Современные перспективы в
исследовании хитина и хитозана». – Казань. – 2006. – С. 119-122.
10. Перминов П.А., Миронов А.В., Ромашова А.Н., Никоноров В.В. Исследование
полимерных систем – носителей биологически активных компонентов и
разработка на их основе текстильных композиционных материалов/ В сб.
научных трудов, выполненных по итогам конкурса грантов молодых
исследователей «ГРАНТ-2005». – М., МГТУ. – 2006. – С. 3-8.
11. Кильдеева Н.Р., Вихорева Г.А., Владимиров Л.В., Тимофеева Л.М., Перминов
П.А. Биологически активные системы на основе сшитого хитозана/ В сб. статей
XII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных
систем», ч. 1 – 2006. – С. 384-390.
12. Перминов П.А., Кильдеева Н.Р., Тимофеева Л.М., Абронин И.А., Бабак В.Г.,
Никоноров В.В. Структурообразование в растворах хитозана в присутствии
сшивающего реагента при получении биологически активных полимерных
материалов// Известия ВУЗов (Химия и химическая технология). – 2007. – т.
50. – вып. 3. – С. 53-56.
www.sp-department.ru