На правах рукописи МАКАРОВА АЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА
advertisement
На правах рукописи МАКАРОВА АЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА СВОЙСТВА НЕТОЧНОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ЙОТА В ЭКСТРАКТАХ КЛЕТОК ЭУКАРИОТ Специальность 03.00.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2009 1 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. ДНК живых организмов повреждается под действием разнообразных эндогенных и экзогенных факторов. Эти модификации ДНК вызывают мутации, остановку репликации, гибель клеток, играя важную роль в онкогенезе, старении и других патологических процессах. В конце ХХ в. были открыты специализированные ДНК-полимеразы, основной функцией которых является участие в репликации и репарации поврежденной ДНК. Однако из-за открытого каталитического центра, приспособленного к синтезу на матрице с поврежденными основаниями, специализированные ДНК-полимеразы часто ошибаются на неповрежденной матрице. Такие полимеразы, подавляющее большинство которых относится к Y-семейству ДНК-полимераз, были названы склонными к ошибкам. Их участие в репликации строго регулируется. Изучение биохимических свойств и особенностей регуляции активности специализированных ДНК-полимераз относится к числу наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии. Нормальное функционирование этих ферментов в клетках препятствует процессам мутагенеза и канцерогенеза. Большинство из склонных к ошибкам ДНК-полимераз эукариот остаются не достаточно изучены. К их числу относится ДНК-полимераза йота (Рol ι), открытая в 2000 г [Tissier A. et. al., 2000; Zhang Y. et. al., 2000]. Рol ι человека является самой неточной ДНК-полимеразой из всех известных и характеризуется необычными свойствами in vitro благодаря особому строению активного центра фермента [Johnson R.E. et. al., 2006]. В тоже время, фермент дрозофилы по свойствам почти ничем не отличается от своего паралога ДНК-полимеразы эта (Pol η) и не демонстрирует такой высокой склонности к ошибкам [Ishikawa I. et. al., 2001]. Имеются многочисленные литературные данные о связи нарушения регуляции активности Рol ι с развитием злокачественных новообразований у человека и мыши. Однако, функции Рol ι остаются не известны. Данные об экспрессии этого фермента в организме животных малочисленны. Не изучен филогенез Рol ι и свойства фермента у позвоночных животных разных таксономических групп. Ограничен круг модельных объектов для изучения Рol ι. Биохимической активности специализированных ДНК-полимераз посвящено большое количество работ, однако предметом изучения большинства из них являлись очищенные рекомбинантные ферменты in vitro. Решающая роль в регуляции активности склонных к ошибкам ДНК-полимераз в организме принадлежит посттрансляционному уровню регуляции. В связи с чем актуальной задачей является поиск методов, позволяющих 2 изучать специализированные ДНК-полимеразы в условиях, приближенных к реальному биохимическому окружению в клетках. Одним из таких подходов может являться тестирование биохимической активности ДНК-полимераз в экстрактах клеток, содержащих суммарный набор ферментов метаболизма нуклеиновых кислот. Уникальная способность Pol ι встраивать преимущественно дГТФ напротив тимина матрицы («дГТФ-Т» активность) может давать возможность специфичного определения продуктов реакции этой ДНКполимеразы [Генинг Л.В. с соавт., 2004]. Изучение активности и биохимических свойств Рol ι в экстрактах клеток эукариот является актуальным и фундаментально значимым для понимания молекулярнобиологических процессов, лежащих в основе поддержания стабильности генома, механизмов канцерогенеза и старения. Цель настоящей работы заключалась в изучении активности склонной к ошибкам Pol ι в экстрактах клеток эукариот. В ходе исследования были поставлены следующие задачи: • провести оценку биохимической активности рекомбинантной Pol ι человека в экстрактах клеток Saccharomyces cerevisiae; • охарактеризовать «дГТФ-Т» активность Pol ι в органах и тканях инбредных линий домовой мыши (Мus musculus) c аллелью Pol ι дикого типа и дефектами гена Pol ι; • провести сравнительный филогенетический анализ Pol ι и исследовать «дГТФ-Т» активность в организме позвоночных животных разных таксонов; • определить влияние ряда эволюционно полиморфных и консервативных замен аминокислот, а также делеций на биохимическую активность Pol ι человека. Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые проведено исследование склонной к ошибкам Рol ι с применением методики тестирования активности ДНК-полимеразы непосредственно в экстрактах клеток эукариот. Впервые охарактеризована активность Рol ι в организме M. musculus. В работе показано отсутствие активности Pol ι у мышей линии 129/J, несущих нонсенс мутацию во втором экзоне гена POLI. Установлено, что в организме мышей линии 129/J мРНК Рol ι претерпевает альтернативный сплайсинг по второму экзону с сохранением рамки считывания, однако образующийся в ходе трансляции укороченный фермент не обладает ДНК-полимеразной активностью. Работа представляет собой первое филогенетическое исследование Рol ι позвоночных животных. Обнаружено, что активность Рol ι по встраиванию dGTP напротив T матрицы обнаруживается в организме млекопитающих, но отсутствует у других классов 3 позвоночных животных. Установлена связь между появлением «дГТФ-Т» активности Pol ι у млекопитающих с заменой Leu62Ile активного центра фермента. В работе впервые получены и описаны свойства ряда мутантных форм Рol ι человека, несущих замены эволюционно полиморфных и консервативных аминокислот, а также делецию второго экзона ДНК-полимеразы. Данные об активности Рol ι в организме домовой мыши и изменении биохимических свойств фермента в филогенезе важны для поиска биологической функции Рol ι. Информация о биохимических свойствах мутантных форм Рol ι человека расширяет представление о структуре активного центра фермента и механизме катализа ДНКполимеразной реакции. Предложенная система экспресс-тестирования активности Рol ι в экстрактах клеток S. cerevisiae может быть использована для изучения свойств полиморфных форм Рol ι и других высокоошибочных ДНК-полимераз. Методика тестирования активности Рol ι в экстрактах клеток животных представляет практический интерес для изучения активности Рol ι в организме человека в норме и при различных патологиях, в частности при изучении и комплексной диагностике злокачественных новообразований. Тестирование «дГТФ-Т» активности Рol ι в опухолях глаза апробируется у пациентов Офтальмологической клинической больницы Департамента здравоохранения г. Москвы. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 – материалы симпозиумов и конференций. Основные положения работы были представлены автором на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), РоссийскоЕвропейском симпозиуме по репарации ДНК и эпигенетической регуляции стабильности генома (Санкт-Петербург, Россия, 2008), конференции Американского общества микробиологии «Мутагенез и репарация ДНК: от молекулярной структуры к болезни человека» (Вистлер, Канада, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009). Диссертационная работа была апробирована на совместных семинарах Сектора развития методов молекулярной генетики Института молекулярной генетики РАН и Лаборатории биохимии Института биологии развития РАН (Москва, 03.08.2008), семинарах Медицинского центра Университета Небраски (Омаха, США, 07.01.2009 и 24.03.2009) и семинарах Института молекулярной генетики РАН. 4 Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста, содержат 15 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 244 источника. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Конструирование дрожжевых продуцентов Pol ι человека дикого типа и мутантных форм фермента В работе использовался химически синтезированный ген ДНК-полимеразы, нуклеотидная последовательность которого была оптимизирована с учетом частоты встречаемости дрожжевых кодонов – POLISc. Плазмида, несущая структурную часть POLISc (pESC-POLISc-URA), была любезно предоставлена проф. Ю.И. Павловым. В качестве вектора для клонирования амплифицированного в ходе ПЦР фрагмента POLISc использовали плазмиду pRS424-GAL-GST-TRP [Fortune J.M. et. al., 2006]. Плазмида имела в своем составе селективные маркеры AmpR и TRP1, последовательность гена глутатион-S-трансферазы (GST) и индуцибельный химерный промотор GAL1-GAL10. ПЦРфрагмент встраивали в состав pRS424-GAL-GST-TRP в рамку считывания с последовательностью гена GST по участкам расщепления рестриктаз ClaI – Sal I. Сайты узнавания были предусмотрены в составе олигонуклеотидных праймеров для ПЦР. Согласно данным литературы N-концевое слияние Pol ι с GST не оказывает влияния на биохимические свойства фермента [Haracska L. et. al., 2003]. Для получения штаммовпродуцентов в настоящей работе была использована также плазмида pESC-GAL-MYCPOLISc-URA, сконструированная ранее в лаборатории проф. Ю.И. Павлова. В данной конструкции ген POLISc был слит в рамке считывания с последовательностью, кодирующей пептид-эпитоп c-myc на N-конце (myc-Рol ι) и находился под GAL1-GAL10 промотором. Мутантные формы Рol ι человека (Рol ι L62I , Рol ι E126A/D127A , Рol ι 2exon-d , Рol ι 421-715-d ), слитые с GST, были получены в конструкции pRS424-GAL-GST-POLISc-TPR при помощи сайт-направленного мутагенеза. В качестве реципиентного штамма был использован штамм S. cerevisiae BJ 2168 (MATa, ura3–52, trp1–289, leu2–3, 112 prb1–1122, prc1–407, pep4–3), особенностью которого является выключение 3 дрожжевых протеаз [Bylund G. et. al, 2006]. 5 2. Продукция, выделение и тестирование активности Pol ι человека дикого типа и мутантных форм фермента Экспрессию рекомбинантных ДНК-полимераз в дрожжевых клетках BJ 2168 проводили согласно Bylund G. c соавт. [2006], индукцию осуществляли внесением в среду культивирования 2 % галактозы. Выделение рекомбинантной Рol ι человека дикого типа и ферментативно активных мутантных форм Рol ι L62I, Рol ι E126A/D127A и Рol ι 421-715-d, слитых на N-конце с GST, было осуществлено при помощи аффинной хроматографии с сорбентом GSH-сефарозой. Для измерения ДНК-полимеразной активности очищенных ферментных препаратов, а также оценки эффективности включения дАТФ и дГТФ, реакции синтеза ДНК проводили в присутствие 20 nМ меченного олигонуклеотидного субстрата (матрица 1), 0,05-1000 µМ дНТФ и 1-2,6 nМ фермента в течение 2,5-5 мин. ДНК-полимеразную активность оценивали по степени утилизации праймера по формуле: PrEXT = Σ x 100% /Pr + Σ. Где Pr – количество не использованного в ходе реакции праймера, Σ – общее количество включенных во время реакции нуклеотидов Σ = AА+AG+2BA+2BG+3C+…13M; A, B, C, D, … М – количество 18, 19, 20, 21, … 30 -членных продуктов реакции соответственно, коэффициенты А и G – отражают количество включенного дАТФ или дГТФ в 18 и 19 положения субстрата. Расчеты производились с помощью программы ImageQuant 5.2. 3. Тестирование «дГТФ-Т» активности Pol ι в экстрактах клеток эукариот Для тестирования биохимической активности Pol ι в экстрактах эукариотических клеток использовали модифицированную методику Генинга Л.В. с соавт. [2004], основанную на уникальной способности этой ДНК-полимеразы преимущественно встраивать дГТФ напротив тимина матрицы. Принцип метода показан на рис.1. Экстракты клеток дрожжей или клеток органов и тканей животных использовались в качестве ферментных препаратов при проведении ДНК-полимеразной реакции с меченым олигонуклеотидным субстратом в присутствие различных сочетаний 1 мМ дНТФ. В качестве матрицы для субстрата использовали два олигонуклеотида длиной 30 оснований: матрица 1 и матрица 2. Использование матрицы сиквенс-контекста 1 для тестирования эффективности включения нуклеотидов Pol ι (очищенный ферментный препарат) напротив тимина описано в работе Zhang Y. с соавт. [2000]. Нуклеотидная последовательность матрицы 2 аналогична матрице 1, однако в 19 положении матрицы 2 вместо гуанина находится цитозин. 6 После электрофоретического разделения продуктов реакции наличие активности Pol ι определяли по присутствию двух радиоактивных полос, соответствующих двум 18-членным олигонуклеотидам со встроенным напротив тимина аденином или гуанином на 3`-конце и характеризующихся разной электрофоретической подвижностью. Более подвижная нижняя полоса отражает количество олигонуклеотида с 3`-концевым аденином, а верхняя – количество менее подвижного специфического продукта синтеза Pol ι, у которого в 18-м положении произошло включение дГТФ («дГТФ-Т» активность). После включения дГТФ напротив тимина матрицы фермент в ряде случаев не способен продолжать синтез ДНК. Свойство Pol ι получило название «Т-стоп» [Zhang Y. et. al., 2000]. Рис. Принцип 1. тестирования «дГТФ-Т» активности Pol ι в экстрактах эукариотических клеток. ДНК- полимеразную реакцию осуществляли с меченым олигонуклеотидным субстратом (содержащим матрицу 1) в присутствие 1 мМ дАТФ и дГТФ и последующим электрофоретическим разделением продуктов реакции. Наличие «дГТФ-Т» активности определяли по появлению дополнительной электофоретической полосы, соответствующей включенному гуанину напротив тимина матрицы в 18-м положении олигонуклеотидного субстрата. Внизу рисунка: слева – экстракт семенника мыши лини 129/J, несущей нонсенс-мутацию во втором экзоне гена Pol ι (мутация нарушает синтез полноразмерного фермента); справа – экстракт семенника мыши линии С3H/Sn c геном Pol ι дикого типа. Полуколичественный расчет активности Pol ι в экстракте проводился тремя способами: по 1) (GA) – абсолютному значению включения дГТФ в 18-м положении олигонуклеотидного субстрата: АG, 2) положении олигонуклеотидного (G18) – по проценту включения дГТФ в 18-м субстрата относительно суммарного количества включенных в 18 положение нуклеотидов: АG х 100% / (AA+AG), 3) (G30) – по проценту 7 включения дГТФ в 18-м и 19-м положениях олигонуклеотидного субстрата относительно суммарного количества всех включенных во время реакции нуклеотидов: АG+ВG х 100% / Σ. Общую ДНК-полимеразную активность экстракта оценивали по степени утилизации праймера: PrEXT = Σ x 100% /Pr + Σ. Нормирование активности при расчетах осуществляли по концентрации суммарного растворимого белка в экстракте для клеток органов и тканей животных, или по уровню продукции ферментов в случае экстрактов клеток дрожжейпродуцентов. Расчеты производились с помощью программы ImageQuant 5.2. 4. Оценка генетического и транскрипционного межлинейного полиморфизма по второму экзону гена Pol ι мыши Генотипирование 27 кодона осуществляли рестрикционным анализом ПЦРфраментов с участка второго экзона гена Pol ι как описано McDonald J.P. c соавт. [2003]. Наличие альтернативно сплайсированных форм по второму экзону Pol ι определяли c помощью обратной транскрипции тотальной РНК с последующей ПЦР участка кДНК, содержащего второй экзон, по методике, предложенной Wang M. c соавт. [2004]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. «дГТФ-Т» активность в экстрактах клеток S. сerevisiae, продуцирующих склонную к ошибкам Рol ι человека В качестве экстракта эукариотических клеток для тестирования активности рекомбинантной Рol ι человека использовали пекарские дрожжи S. cerevisiae, у которых отсутствует встречающаяся у высших эукариот Рol ι. Были получены штаммы S. cerevisiae – продуценты Рol ι человека. Уровень продукции рекомбинантных ферментов в экстрактах клеток дрожжей, трансформированных плазмидами с геном POLI человека pRS424-GALGST-POLISc-TPR и pESC-GAL-MYC-POLISc-URA, или соответствующими векторами без вставок, был оценен при помощи иммуноблота (рис. 2А). Высокий уровень продукции Рol ι был достигнут при N-концевом слиянии соответствующего белка как с небольшим эпитопом с-myc (рис. 2А: дор. 5 и 6), так и с GSTбелком массой 26,6 кДа (рис. 2А: дор. 3 и 4). Следует отметить негативное влияние GST на выход рекомбинантной Рol ι в растворимую надосадочную фракцию при приготовлении клеточных лизатов, что может объясняться склонностью GST образовывать агрегаты. Положительный эффект слияния рекомбинантной Рol ι с GST-белком заключался в увеличении стабильности фермента и ограничении его протеолиза. 8 Рис. 2. А. Продукция рекомбинантных GST-Рol ι и myc-Рol ι в штамме S. сerevisiae BJ 2168. Иммуноблот: иммуноокрашивание GST-Рol ι при помощи первичных антител к GST; иммуноокрашивание myc-Рol ι при помощи первичных антител к с-myc; Б. Анализ ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток S. сerevisiae, продуцирующих GST-Рol ι, myc-Рol ι и GST. Условия реакции: 0,15 mM Mn2+, 1 мМ каждого дНТФ. Сочетания дНТФ в реакционной смеси: 1 – все 4 дНТФ, 2 – дАТФ + дТТФ + дЦТФ, 3 – дАТФ + дГТФ, 4 – дАТФ, 5 – дГТФ. Дор. 1, 12 и 18 – отрицательный контроль без добавления клеточного экстакта. Экстракты дрожжевых клеток, продуцирующих GST-Рol ι, myc-Рol ι или трансформированные вектором без вставки, были использованы для анализа ДНКполимеразной активности в присутствие различных вариантов комбинаций дНТФ в эквимолярном соотношении (рис. 2Б). Общая ДНК-полимеразная активность экстрактов 9 дрожжей, продуцирующих Рol ι (рис. 2Б: дор. 2-11), оцениваемая по степени утилизации 17-членного праймера, превосходила таковую у клеток, трансформированных GSTвектором без вставки (рис. 2Б: дор. 13-17). Высокая активность по встраиванию дГТФ напротив тимина матрицы, тестируемая по появлению характерных двойных полос в геле, была отмечена в образцах продуцентов Рol ι при добавлении в реакционную смесь всех четырех дНТФ (рис. 2Б: дор. 2 и 7) или только дАТФ и дГТФ (рис. 2Б: дор. 4 и 9). Дополнительные полосы в 18-м положении субстрата не появлялись, если дГТФ не был добавлен в реакцию (рис. 2Б: дор. 3 и 8). Важно отметить, что «дГТФ-Т» активность, характерная для Рol ι, отсутствовала в контрольном экстракте S. сerevisiae, экспрессирующем GST-белок (рис. 2Б: дор. 13 и 15). После включения дГТФ напротив тимина матрицы в случае экстрактов клеток-продуцентов Рol ι синтез ДНК останавливается («Т-стоп»). По литературным данным «Т-стоп» является характерной особенностью биохимической активности очищенного препарата Рol ι человека, варьирующей, однако, в зависимости от условий проведения эксперимента. Специфичность тестирования «дГТФ-Т» активности Рol ι в экстрактах эукариотических клеток может ограничиваться рядом факторов. Один из факторов – «механизм проскальзывания матрицы», или «транзиентный мисэлаймент», который может происходить в активном центре некоторых ДНК-полимераз [Kokoska R.J. et. al., 2002]. При «транзиентном мисэлайменте» в случае выпетливания ДНК-матрицы 1 возможно корректное включение дГТФ в 18-е положение праймера напротив 19-го цитозина матрицы. Данный продукт ДНК-полимеразной реакции будет не отличим на электрофореграмме от «дГТФ-Т»-продукта Рol ι. Для оценки такой возможности тестирование «дГТФ-Т» активности было осуществлено в экстрактах продуцентов Рol ι с использованием олигонуклеотидной матрицы другого сиквенс-контекста (матрицы 2), отличающейся от матрицы 1 заменой цитозина на гуанин в 19-м положении. Результаты тестирования «дГТФ-Т» активности в экстрактах дрожжей, продуцирующих GST-Рol ι или GST-белок на матрице 2 были схожи с результатами, полученными на матрице 1 (рис. 2Б: дор. 2-11 и 19-23). Следовательно, возможность «транзиентного мисэлаймента» на используемых субстратах в экстрактах клеток эукариот является маловероятной. Следует отметить, что на матрице 2 правило «Т-стоп» было выражено слабее (рис. 2Б: дор. 19). Большая часть продукта реакции со встроенным дГТФ напротив тимина в 18-м положении была использована в дальнейшем синтезе ДНК и продолжена до 19-го положения субстрата. Это согласуется с данными литературы, 10 согласно которым поведение Рol ι в значительной степени определяется сиквенс-контекстом ДНК-матрицы. Таким образом, анализ ДНК-полимеразной активности показал возможность специфической детекции активности Рol ι в экстрактах эукариотических клеток, содержащих суммарных набор ферментов метаболизма нуклеиновых кислот. Важные характеристики биохимической активности рекомбинатной Рol ι человека в экстрактах клеток S. сerevisiae схожи со свойствами очищенных ферментных препаратов Рol ι человека и мыши [Frank E.G. et. al., 2007; Wang M. et. al., 2004; Zhang Y. et. al., 2000]. 2. Анализ «дГТФ-Т» активности Pol ι в организме позвоночных животных 2.1. Анализ «дГТФ-Т» активности Pol ι в органах домовой мыши Решающая роль в регуляции работы ДНК-полимераз принадлежит пострансляционным механизмам регуляции, поэтому активность Рol ι в клетках является более полной характеристикой экспрессии фермента, чем количественное определение соответствующей мРНК. В настоящей работе подход тестирования «дГТФ-Т» активности в экстрактах органов и тканей был использован для анализа экспрессии Pol ι в организме позвоночных животных. ДНК-полимеразную реакцию осуществляли в присутствие ионов Mg2+ или Mn2+. Mg2+ является основным кофактором ДНК-полимеразной реакции для большинства ДНК-синтезирующих ферментов. Однако было показано, что активность чистого ферментного препарата Pol ι существенно повышается в присутствие ионов Mn2+, тогда как большинство ДНК-полимераз демонстрируют снижение активности при замене ионов Mg2+ на катионы Mn2+ в реакционной смеси [Frank E.G. et. al., 2007]. При использовании ионов Mg2+ в качестве кофактора ДНК-полимеразной реакции «дГТФ-Т» активность четко детектировалась в организме взрослой мыши линии C57BL/6 только в семенниках и головном мозгу (рис. 3В: дор. 6-10 и 16-20; табл.1). Использование же ионов Mn2+ в качестве кофактора позволило детектировать варьирующую по интенсивности «дГТФ-Т» активность в практически во всех органах мыши. Наибольшая активность фермента характерна для экстрактов семенников, высокой активностью обладают экстракты яичников, головного мозга, почек, печени, селезенки и поджелудочной железы, следовая активность детектируется в экстрактах легких и сердца (рис. 3А, табл.1). Интересно отметить, что «дГТФ-Т» активность полностью отсутствовала в семенниках новорожденных животных, в то время как высокая активность в головном мозгу была характерна и для взрослых, и для новорожденных животных (табл. 1). Можно 11 предположить, что функция Pol ι в семенниках связана с гаметогенезом, так как самые ранние процессы сперматогенеза у мыши начинаются с 4-х суток жизни [McLean J.D. et. al., 2003]. Рис. 3. А. Анализ ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток семенников и головного мозга инбредных линий домовой мыши 129/J и С57BL/6 (1 мМ дАТФ и дГТФ, 5 мМ Mg2+); Б. Генотипирование стоп-кодона во втором экзоне гена Pol ι линий домовой мыши 129/J и С57BL/6 - рестрикционный анализ ПЦР-фраментов с участка второго экзона Pol ι. Мутация сопровождается исчезновением сайта рестриктазы TaqI; B. Анализ ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток органов и тканей линии домовой мыши С57BL/6. Дор. 1 – контроль без добавления экстракта (1 мМ дАТФ и дГТФ; 0,2 мМ Mn2+); 12 Г. Анализ ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток органов и тканей инбредной линии домовой мыши 129/J. Дор. 1 – контроль без добавления экстракта (1 мМ дАТФ и дГТФ; 0,2 мМ Mn2+). Количество удобных биологических объектов для изучения Pol ι ограничено. Животные с генотипом Pol ι –/– (нокаутом) не описаны в литературе. Но известно, что линия мышей 129/J несет гомозиготную нонсенс-мутацию во втором экзоне гена Pol ι, при которой 27 сериновый кодон TCG замещается стоп-кодоном TAG. Мутация блокирует синтез полноразмерного фермента в семенниках животных [McDonald J.P. et. al., 2003]. Эксперименты, свидетельствующие об отсутствие фермента в других органах мышей 129-й линии в литературе не описаны. Наличие стоп-кодона было подтверждено генотипированием для всех животных линии 129/J, использовавшихся в наших экспериментах (рис. 3Б). Активность Pol ι отсутствовала во всех проанализированных органах мышей 129-й линии в случае использования ионов Mn2+ в качестве кофактора (рис. 3Г), что согласуется с данными литературы об отсутствии фермента в семенниках этих животных. Однако в случае использования ионов Mg2+ в головном мозгу мышей линии 129/J была отмечена следовая активность, подобная Pol ι (рис. 3А: дор. 1-5, табл. 1). Табл. 1. «дГТФ-Т» активность в организме домовой мыши (среднее арифметрическое ± гол. мозг новорожд. семенник новорожд. мышеч. ткань поджел. железа селезенка сердце почки печень легкие гол. мозг яичник семенник «дГТФ-Т» активность кофактор Mn2+ Mg2+ C57BL/6 129/J не 370±31 детек. не 36±7 59±12 73±8 22±5 65±9 детек. GA 540±34 150±12 230±16 30±7 140±8 210±15 62±14 78±15 80±11 15±4 129/J C57BL/6 линия средняя ошибка среднего арифметрического). G18 86±9 75±6 49±3 23±4 40±5 57±9 GA не детектир. – – G18 не детектир. – – не 220±12 детек. не 53±4 детек. GA 230±11 170±9 100±6 10±2 9±1 11±2 не детектир. G18 54±4 46±3 35±4 11±1 12±1 не детектир. GA не детектир 34±18 не детектир. – – G18 не детектир 16±8 не детектир. – – 9±2 13 Известно, что в легких мышей некоторых линий мРНК Pol ι претерпевает альтернативный сплайсинг по второму экзону с сохранением рамки считывания [Wang M. et. al., 2004]. Поэтому нами была изучена возможность участия альтернативного сплайсинга по второму экзону в качестве механизма сохранения частичной ферментативной активности Pol ι. РТ-ПЦР с использованием мРНК из разных органов мыши линии 129/J показал наличие мажорного продукта с молекулярным весом, соответствующим мРНК Pol ι без второго экзона (рис. 4: дор. 1, 3, 5), и почти полное отсутствие данного транскрипта в семенниках мыши с геном дикого типа (рис. 4: дор. 7). Экзон является небольшим по размеру и содержит 42 аминокислотных остатка, 29 из которых входят в состав активного центра ДНК-полимеразы. В теории нельзя исключать полной потери активности Pol ι с делецией второго экзона. Рис. 4. Альтернативный сплайсинг по второму экзону мРНК Pol ι домовой мыши линии 129/J. Свойства Pol ι с делецией второго экзона будут рассмотрены в разделе 3.1. 2.2. Филогенетический анализ Pol ι Гены группы RAD30 кодируют ДНК-полимеразы, найденные только у эукариот. У человека обнаружены два представителя RAD30: RAD30A (Pol η) и RAD30B (Pol ι). Предполагается, что Рol ι произошла от Рol η за счет генетической дупликации [Vaisman A. et. al., 2002]. Анализ базы данных ГенБанк выявил высоко гомологичные Рol ι человека транскрипты у млекопитающих, амфибий, рыб, насекомых и некоторых грибов, за исключением S. сerevisiae. При помощи пакета программ MEGA 3.1 был проведен 14 филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей мРНК Pol ι у представителей разных таксономических групп эукариот. Филогенетическое древо представлено на рис. 5А. Рис. 5. А. Филогенетический анализ Pol ι: филогенетическая дистанция (p-distance) рассчитывалась как среднее число нуклеотидных замен на пару гомологичных сайтов сравниваемых нуклеотидных последовательностей; Б. Выравнивание 15 функционально значимых аминокислот активного центра Pol ι животных из разных таксономических групп; цвета аминокислотных остатков приведены в соответствие с общепринятыми обозначениями для пакета программ MEGA (http://www.megasoftware.net/WebHelp/helpfile.htm). Анализ показал, что филогенетические отношения последовательностей исследованных кластеров в основном соответствуют молекулярно-филогенетической классификации эукариот, Филогенетическая но дистанция, в тоже время отражающая есть и некоторые генетическое особенности. расстояние между нуклеотидными последовательностями мРНК Pol ι, характеризуется незначительными величинами в пределах класса млекопитающих. Дивергенция между человеком и шимпанзе составляет всего 0,01 ± 0,0001, между человеком и мышью – 0,19 ± 0,01, между человеком и утконосом – 0,25 ± 0,01 нуклеотидных замен на пару гомологичных сайтов. Следовательно, Pol ι является консервативным ферментом млекопитающих, что предполагает схожие биохимические свойства и функции фермента в пределах класса. В тоже время, фермент менее консервативен в пределах класса насекомых. Дивергенция между Pol ι плодовой мушки дрозофилы и египетского комара из отряда двукрылых, достигает 0,43 ± 0,01, а средняя частота нуклеотидных замен на пару гомологичных сайтов для двукрылых и перепончатокрылых насекомых (паразитический наездник насония витрипенис) составляет более 50 %. Из данных филогенетического анализа следует предположение о том, что свойства Pol ι млекопитающих и насекомых могут заметно отличаться, т.к. филогенетическая дистанция между млекопитающими и насекомыми составляет более 0,5. Предположение согласуются биохимическими данными из литературы. Экзон-интронная организация генов Рol ι (мышь) и POLI (человек) и свойства соответствующих ферментов имеют очень большое сходство [Wang M. et. al., 2004]. Однако, Pol ι дрозофилы более схожа по своим свойствам с Рol η человека или дрожжей, нежели с человеческой Рol ι. В отличие от Рol ι человека, Рol ι дрозофилы характеризуется меньшей частотой ошибок при синтезе ДНК и преимущественно встраивает напротив тимина матрицы канонический дАТФ [Ishikawa I. et. al., 2001]. Активность Pol ι была протестирована в некоторых органах у нескольких видов млекопитающих. «дГТФ-Т» активность была детектирована в экстрактах семенников, головного мозга и печени крысы, семенников собаки, а также семенников и различных отделов головного мозга кролика (данные не представлены). Следовательно, у 16 проанализированных млекопитающих общая картина активности Pol ι оказалась сходной. Однако, в экстрактах тканей представителей других классов позвоночных животных (рыб, амфибий, рептилий, птиц) «дГТФ-Т» активности Pol ι обнаружено не было (данные не представлены). Таким образом, экстракты клеток тканей рыб, амфибий, пресмыкающихся и птиц не осуществляют тестируемое данным подходом включение дГТФ напротив Т матрицы. Появление «дГТФ-Т» активности Pol ι в организме млекопитающих может быть связано с особенностями структуры активного центра фермента, высокой стабильностью или особенностями регуляции активности Pol ι. Сравнение аминокислотных последовательностей Pol ι организмов разных таксономических групп (по базе данных ГенБанк) с данными рентгеноструктурного анализа Pol ι человека из литературы, позволило предположить, что изменение свойств Pol ι в процессе эволюции может быть связано, в частности, с заменой изолейцина на лейцин в положении 62 активного центра фермента (рис. 5Б). Каталитический центр Pol ι насекомых отличается от млекопитающих тремя заменами функционально значимых аминокислот (положения 214, 307 и 343). Замена одной функциональной значимой аминокислоты (положение 62) отличает Pol ι млекопитающих от остальных позвоночных и беспозвоночных животных. Действительно, согласно недавно полученным данным рентгеноструктурного анализа Pol ι человека Leu 62 вместе с Gln 59 стабилизируют дГТФ при его включении напротив тимина матрицы [Kirouac K.N. et. al., 2009]. 3. Изучение свойств Рol ι человека с делециями и заменами аминокислот, представляющих эволюционно- и транскрипционно-полиморфные формы фермента С целью изучения функциональной значимости и влияния ряда делеций и замен аминокислот на биохимическую активность Pol ι млекопитающих были определены свойства 4-х мутантых форм Рol ι человека в ДНК-полимеразной реакции с использованием экстрактов клеток дрожжей-продуцентов и очищенных ферментных препаратов. 3.1. Оценка ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток S. сerevisiae, продуцирующих мутантные формы Рol ι человека Чтобы оценить влияние эволюционно полиморфной замены Leu62Ile на биохимические свойства Рol ι млекопитающих была получена мутантная форма Рol ι 17 человека с заменой Leu62Ile (Рol ι L62I ). В качестве контроля была осуществлена двойная замена эволюционно консервативных аминокислот активного центра Рol ι человека Asp126Ala и Glu127Ala (Рol ι E126A/D127A) (рис 6). Для проверки гипотезы участия альтернативного сплайсинга в сохранении активности Рol ι в организме мышей линии 129/J был получен вариант Рol ι человека с делецией второго экзона, частично затрагивающей активный центр фермента (Рol ι 2exon-d ). Также была сконструирована мутантная форма Рol ι человека с интактным активным центром фермента, но несущая протяженную делецию C-концевого участка полимеразы (Рol ι 421-715-d ) (рис. 6). Известно, что С-концевая область принимает участие в белок- белковых взаимодействиях и выполняет регуляторную функцию. Рис. 6. Схематическое изображение форм Рol ι человека с делециями и заменами аминокислот, полученных при помощи сайт-направленного мутагенеза и использовавшихся в работе. Представлена доменная структура Рol ι человека, где PIP 1 – домен, взаимодействующий с PCNA, UBM1/2 – убиквитин-связывающие мотивы 1 и 2. Продукция мутантных форм Рol ι, слитых с GST, была подтверждена иммуноблотом (рис. 7А). Результатом замены эволюционно консервативных аминокислот Asp 126 и Glu 127, участвующих в координации ионов металлов и переносе встраивающегося нуклеотида, на аланин стала почти полная потеря активности Рol ι (рис. 7Б: дор. 6-9; табл. 2). Таким образом, Asp 126 и Glu127 важны для обеспечения ДНК-полимеразной активности 18 фермента, что подтверждает предложенную модель организации активного центра Рol ι человека [Nair D.T. et. al., 2004; Kirouac K.N. et. al., 2009]. Рис. 7. А. Продукция рекомбинантных GST-Рol ι E126A/D127A, GST-Рol ι L62I, GST-Рol ι 2exon-d и GST-Рol ι 421-715-d в штамме S. сerevisiae BJ 2168 (надосадочная фракция). Иммуноблот: иммуноокрашивание при помощи первичных антител к GST; Б. Анализ ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток S. сerevisiae, продуцирующих GST-Рol ι дикого типа (WT), GST-Рol ι E126A/D127A, GST-Рol ι L62I, GST-Рol ι 2exon-d, GST-Рol ι 421-715-d и GST (1 мМ каждого дНТФ. Сочетания дНТФ в реакционной смеси: 1 – все 4 дНТФ, 3 – дАТФ + дГТФ; 0,15 mM Mn2+ и 0,25 mM Mg 2+). 19 Замена эволюционно-полиморфной аминокислоты Leu 62 на Ile, встречающаяся в активном центре фермента у амфибий и рыб, привела к снижению «дГТФ-Т» активности Рol ι в экстракте дрожжевых клеток в 2,8–5,9 раз по сравнению с ферментом дикого типа в случае использования ионов Mn2+ в качестве кофактора реакции и в 7,2 раза при использовании ионов Mg2+. При этом общая ДНК-полимеразная активность экстракта клеток-продуцентов Рol ι L62I упала в 2,1-2,3 раза (рис. 7Б: дор. 10-13; табл. 2). Следовательно, эволюционно-полиморфная замена L62I оказывает влияние на способность фермента к включению дГТФ напротив тимина матрицы и его общую ДНК-полимеразную активность. Табл. 2. Активность мутантных форм рекомбинантной GST-Рol ι в экстрактах клеток дрожжей-продуцентов (среднее арифметрическое ± средняя ошибка среднего арифметрического). фермент GA кофактор PrEXT Mn2+ Mg 2+ Mn2+ Mg 2+ Mn2+ Mg 2+ Mn2+ Mg 2+ Mn2+ Mg 2+ 76,4±9 37,4±3,1 18±1,9 13,6±2,2 35,6±4 16,2±2 20±2,3 14,9±1 91,3±11,5 21±3,6 GST-Рol ι GST-Рol ι E126A/D127A GST-Рol ι L62I GST-Рol ι 2exon-d GST-Рol ι 421715-d Свойства укороченного варианта Рol ι 1 6500±240 640±32 126±18 1095±46 6890±370 680±75 421-715-d 3 7290±305 830±41 217±12 2600±50 115±9 6460±86 1070±93 G30 38,2±3,4 5,7±1,2 1,5±0,4 9,3±2 49,4±5 18±3,1 с интактным активным центром и делецией 294 аминокислот С-концевой области практически не отличались от свойств полноразмерного фермента дикого типа по включению дГТФ напротив тимина матрицы. Незначительно активность возрастала полностью лишь дистрибутивность отсутствовала в фермента. экстрактах клеток, Однако, «дГТФ-Т» экспрессирующих альтернативно-сплайсированный вариант Рol ι 2exon-d с делецией 42 аминокислот N-концевой области (рис. 7Б: дор. 14-17). Таким образом, очевидно, что второй экзон Рol ι кодирует функционально важный для ДНК-полимеразной активности участок и потеря соответствующих аминокислот вследствие альтернативного сплайсинга приводит к полной утрате «дГТФ-Т» активности (и, вероятно, общей ДНК-полимеразной активности) фермента. 20 Схожие результаты по тестированию активности мутантных форм Рol ι в экстрактах клеток-продуцентов были получены с использованием матрицы 2 (данные не представлены). Таким образом, наличие следовой «дГТФ-Т» активности, подобной активности Рol ι, обнаруженной в экстрактах головного мозга мышей линии 129/J при использовании ионов Mg2+ в качестве кофактора ДНК-полимеразной реакции, вероятно, не может являться следствием альтернативного сплайсинга Рol ι по второму экзону, а обусловлено другими причинами. Можно предположить, «дГТФ-Т» активность в ряде случаев может являться продуктом синтеза других склонных к ошибкам ДНК-полимераз, более активных в присутствие Mg2+. Использование низких концентраций Mn2+ в качестве кофактора ДНКполимеразной реакции является важным дополнительным фактором, повышающим чувствительность и специфичность «дГТФ-Т» теста. 3.2. Оценка ДНК-полимеразной активности очищенных ферментных препаратов мутантных форм Рol ι человека Варианты GST-Рol ι E126A/D127A , GST-Рol ι L62I и GST-Рol ι 421-715-d , обладающие активностью по результатам тестирования в экстрактах клеток S. cerevisiae, были выделены при помощи аффинной хроматографии (рис. 8А). Очищенные препараты GST-Рol ι, GST-Рol ι L62I и GST-Рol ι 421-715-d обладали высокой ДНК-полимеразной активностью. Следует отметить, что правило «Т-стоп» не было выражено (рис. 8Б и В), что отличается от данных литературы для очищенного ферментного препарата на данном субстрате [Zhang Y. et. al., 2000]. Причиной различия могут быть разные условия очистки ферментов и проведения ДНК-полимеразной реакции (в частности, использованием разных кофакторов). Результаты, полученные при изучении свойств чистых ферментных препаратов GSTРol ι E126A/D127A и GST-Рol ι 421-715-d, полностью совпали с данными по активности мутантных форм фермента в дрожжевых экстрактах. GST-Рol ι E126A/D127A обладал следовой ДНК- полимеразной активностью (рис. 8Б: дор. 8), тогда как делеция С-концевой области Рol ι не привела к значительному изменению свойств полимеразы (рис. 8Б: дор. 10). Очищенный ферментный препарат мутантной формы GST-Рol ι L62I демонстрировал сниженную ДНК-полимеразную активность по сравнению с ферментом дикого типа (рис. 8Б: дор. 9). Эффективность включения нуклеотидов варьировала в зависимости от типа и концентрации дНТФ. Включение дАТФ осуществлялось вариантом GST-Рol ι L62I в 0,3-0,5 раз менее эффективно в сравнении с ферментом дикого типа. Тогда как эффект снижения эффективности включения дГТФ в случае использования высоких концентраций (100-1000 21 µМ) достигал 2-5 раз (рис. 8В). Таким образом, замена 62 аминокислоты активного центра Рol ι с Leu на Ile оказывает влияние на свойства чистого фермента in vitro. Рис. 8. А. Очистка GST-Рol ι E126A/D127A, GST-Рol ι аффинной хроматографии, окраска Кумасси; L62I и GST-Рol ι 421-715-d при помощи 22 Б. Анализ ДНК-полимеразной активности очищенных ферментных препаратов GST-Рol ι дикого типа (WT), GST-Рol ι E126A/D127A, GST-Рol ι L62I и GST-Рol ι 421-715-d в присутствии или отсутствии экстракта клеток дрожжей» (100 µМ каждого дНТФ, 2,6 nM фермента, 0,15 mM Mn2+, время реакции – 5 мин); В. Включение дАТФ и дГТФ GST-Рol ι человека дикого типа (WT) и GST-Рol ι L62I (0,05– 1000 µМ дНТФ, 1 nM фермента, 0,15 mM Mn2+, время реакции – 2,5 мин). Возможно комплексное влияние данной аминокислотной замены на свойства Рol ι, в частности стабильность фермента или его способность взаимодействовать с дополнительными факторами в клетке. Одновременное добавление в реакционную смесь экстракта клеток дрожжей, трансформированных вектором без вставки, в 2-2,5 раза усиливало отличие в общей ДНК-полимеразной активности между ферментом дикого типа и полиморфным вариантом GST-Рol ι L62I (рис. 17Б: дор. 11-13). Полученные результаты согласуются с предложенной моделью организации активного центра Рol ι человека [Nair D.T. et. al., 2004; Kirouac K.N. et. al., 2009]. ВЫВОДЫ: 1. «дГТФ-Т» активность в изученных нами экстрактах тканей млекопитающих является активностью Pol ι поскольку: - «дГТФ-Т» активность отсутствует у мышей линии 129/J, несущих нонсенс мутацию во втором экзоне гена Pol ι; - особенности проявления «дГТФ-Т» активности в экстрактах органов млекопитающих схожи с «дГТФ-Т» активностью в экстрактах клеток дрожжей, продуцирующих рекомбинантную Pol ι человека. 2. «дГТФ-Т» активность варьирует в различных органах мыши. Наибольшая «дГТФ-Т» активность фермента характерна для семенников, что может указывать на важную роль Pol ι в гаметогенезе. 3. Филогенетическое исследование Pol ι установило, что «дГТФ-Т» активность Рol ι стабильно присутствует в экстрактах ряда органов млекопитающих и отсутствует в этих же органах у других классов позвоночных животных. 4. Анализ ДНК-полимеразной активности мутантных форм Pol ι человека в экстрактах клеток S. cerevisiae, продуцирующих фермент, и очищенных ферментных препаратов показал, что: 23 замена - эволюционно-консервативных аминокислот D126 и E127 на аланин приводит к резкому снижению ДНК-полимеразной активности Рol ι; - удаление 421-715 аминокислот С-концевой области Рol ι не вызывает значительного влиянии на ДНК-полимеразную активность Pol ι; - эволюционно-полиморфная замена Leu62Ile вызывает умеренное снижение общей ДНКполимеразной и «дГТФ-Т» активностей Pol ι. 5. В организме мышей линии 129/J мРНК Рol ι претерпевает альтернативный сплайсинг по второму экзону с сохранением рамки считывания, однако укороченный фермент человека не обладает «дГТФ-Т» активностью. Это позволяет рассматривать линию мышей 129/J в качестве удобной модели для изучения функций Pol ι в организме млекопитающих. Результаты диссертации изложены в следующих публикациях: 1. Генинг Л.В., Макарова А.В., Малашенко А.М., Тарантул В.З. Фальшивая нота ДНК- полимеразы йота в ансамбле защитников генома млекопитающих // Биохимия. 2006. Т. 71. № 2. С. 155-159. 2. Макарова А.В., Генинг Л.В., Тарантул В.З. Эволюция структуры и функции ДНК- полимеразы йота у эукариот // Биохимия. 2008. Т. 73. № 3. С. 426-433. 3. Макарова А.В., Генинг Л.В., Макарова И.В., Тарантул В.З. Активность склонной к ошибкам ДНК-полимеразы йота в разные периоды отногенеза домовой мыши Mus musculus // Онтогенез. 2008. Т. 39. № 5. С. 367-373. 4. Генинг Л.В., Макарова А.В., Малашенко А.М., Тарантул В.З. Фальшивая нота ДНК- полимеразы йота в ансамбле защитников генома млекопитающих // Материалы VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород (Россия). 2005. С. 27-28. 5. Макарова А.В., Генинг Л.В., Макарова И.В., Тарантул В.З. Необычные свойства и интригующие функции ДНК-полимеразы йота млекопитающих // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск (Россия). 2008. С. 67. 6. Makarova A.V., Gening L.V., Makarova I.V., Tarantul V.Z. The error-prone activity of DNA-polymerase iota in phylo- and ontogenesis // The Russian-European Workshop on DNA repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability. St. Petersburg (Russia). 2008. P. 67. 24 7. Makarova A.V., Gening L.V., Tarantul V.Z., Bessho T., Pavlov Y.I. Inaccurate DNA synthesis by yeast whole cell extracts overproducing variants of human DNA-polymerase iota // The 3rd ASM Conference on DNA Repair and Mutagenesis: from molecular structure to human disease. Whistler (Canada). 2009. P. 50-51. 8. Макарова А.В., Генинг Л.В., Тарантул В.З., Бешо Т., Павлов Ю.И. Функциональная значимость полиморфных замен аминокислот и укороченных вариантов Рol ι человека // Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань (Россия). 2009. С. 66. МАКАРОВА АЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА СВОЙСТВА НЕТОЧНОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ЙОТА В ЭКСТРАКТАХ КЛЕТОК ЭУКАРИОТ Специальность 03.00.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 01.10.2009г. Усл.п.л. – 1.5 Заказ №00457 Тираж: 100экз. Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru
