Детекция экспрессии генов в живых моноцитах и макрофагах с
advertisement
Указание по применению Детекция экспрессии генов в живых моноцитах и макрофагах с использованием проточной цитофлуориметрии Введение Детекция экспрессии генов в иммунокомпетентных клетках традиционно ограничивается технологиямина основе репортных конструкций для целевых генов или технологиями анализа лизированных или фиксированных клеточных популяций (как в случае ОТ-ПЦР). В данной работе мы продемонстрируем возможность детекции экспрессии генов в живых моноцитах и макрофагах. Выявление повышения или снижения экспрессии генов в живых клетках иммунной системы, обеспечивает получение беспрецедентного, физиологически значимого представления о сложных генных регуляторных путях и функционировании клеток иммунной системы. Для достижения этого мы использовали SmartFlare™ зонды, инновационную технологию детекции экспрессии РНК, способную идентифицировать специфичные мРНК и микроРНК в живых, интактных клетках (рис. 1). Данная технология позволяет детектировать целевые РНК, с возможностью выполнения последующих этапов анализа, таких как флуоресцентно-активированная сортировка, а также для обогащения и последующего анализа, специфичных субпопуляций живых клеток, основанного исключительно на профиле экспрессии РНК. Существует ряд преимуществ в сортировке живых клеток на основе экспрессии РНК. Популяциям клеток свойственна гетерогенность, и данные по функционированию генов при их анализе на популяционном уровне могут маскироваться. Напротив экспрессия генов может быть более точно связана с фенотипом клетки путем оценки экспрессии генов с разрешением до одной клетки или путем исследования гомогенных клеточных субпопуляций. Другим преимуществом анализа экспрессии генов в живых клетках является тот факт, что измерение уровня РНК в данных клетках в течение долгого времени (динамический эксперимент) может быть гораздо более информативным, чем оценка повторных, дискретных образцов в различные, фиксированные временные точки. A. Рис. 1. Механизм детекции РНК SmartFlare™ в живых клетках. Зонды SmartFlare™, на основе наночастиц (A.)вводятся в клетку с помощью собственного клеточного процесса эндоцитоза. Зонды циркулируют внутри клетки и связываются с комплементарными РНК последовательностями. Данное связывание высвобождает флуорофор, придавая клетке флуоресцентное свечение для возможности проведения детекции. Со временем зонд выходит из клетки, не внося изменений, что сохраняет возможность проведения последующего анализа (В). Gold-quenched fluorophore on reporter strand Gold nanoparticle Capture strand/ reporter strand duplex B. 1 2 3 t 4 1 – зонды вводятся в клетку посредством естественного процесса эндоцитоза 2 – зонды сближаются с целевой РНК 3 – зонды связываются с целевой молекулой, флуорофор высвобождается для возможности проведения детекции 4 – зонды покидают клетку путем экзоцитоза. Данные клетки можно повторно использовать для проведения других экспериментов Благодаря использованию зондов SmartFlare™ клетки иммунной системы могут быть разделены на основе внутриклеточных целевых РНК (таких как транскрипционные факторы и микроРНК), которые традиционно сложно использовать для сортировки. Кроме того зонды SmartFlare™ могут быть легко включены в существующие комбинации поверхностных антител для окрашивания, позволяя одновременно определять CD-маркеры (кластеры дифференцировки) и внутриклеточные мРНК в тех же клеточных образцах, эксперименты, осуществление которых было невозможным до настоящего времени. В данном исследовании мы сортировали смешанную популяцию клеток иммунной системы на основе экспрессии транскрипционного фактора с-Мус (MYC), в норме ассоциированного с пролиферацией клеток и ДНК репликацией1. Был показан высокий уровень экспрессии данного фактора в моноцитах, а также его снижение во время дифференцировки в макрофагов2. Материалы и методы Подготовка клеток Количественный ОТ-ПЦР анализ Мононуклеарные клетки периферической крови человека изолировали из цельной крови в градиенте плотности Фиколла. Общая РНК была экстрагирована с использованием RNeasy™ kit (Qiagen) и добавлена к TaqMan® RNA-to-Ct™ 1-step kit (Life Technologies). Для анализа использовали TaqMan® qRT-PCR праймеры для всех генов. Амплификация и детекция была проведена с использованием системы LightCycler® 480 (Roche). Наполнениеклеток зондами SmartFlare™ Клетки инкубировали в течение ночи при 370С в среде, содержащей зонды для детекции РНК SmartFlare™ для MYC или неспецифический контроль Scramble. Зонды для детекции РНК SmartFlare™, используемые в данном исследовании Наименование Номер в каталоге Флуорофор MYC Human SF-702/ SF-736 SF-102/ SF-103 Cy5/Cy3 Scramble control Cy5/Cy3 Дифференцировка в макрофагов клеток линии ТНР-1 Клетки инкубировали в течение ночи при 370С в среде, содержащей зонды для детекции РНК SmartFlare™для MYC или неспецифический контроль Scramble. Визуализация мРНК MYC SmartFlare™ Су5 сигналы для мРНК MYC измеряли с использованием настольного проточного цитофлуориметра guava easyCyte™ 8HT и визуализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Nikon C2. Сортировка клеток Смешанная популяция недифференцированных ТНР-1 (моноциты) и РМА-дифференцированных ТНР-1 (макрофаги) клеток, меченных зондами, была отсортирована на основе уровня экспрессии мРНК MYC с использованием прибора FACSAria™ (BD Biosciences). Продукты сортировки были раздельно возвращены в культуру в течение 2 дней в среду без РМА и в дальнейшем были использованы для проведения экспериментов после сортировки. Анализ бактериального фагоцитоза Бактериальная культура (GFP-экспрессирующие E.coli), инкубировавшаяся в течение ночи, была добавлена к MYC-экспрессирующим продуктам сортировки. Фагоцитоз был количественно оценен с помощью конфокальной микроскопии путём подсчета числа клеток с поглощенными бактериями. Мультиплексный анализ секреции цитокинов Продукты сортировки стимулировали липополисахаридом (ЛПС) в концентрации 100 нг/мл в течение 8 часов. Затем анализировали секрецию цитокинов с использованием набора MILLIPLEX® map Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Multiplex Panel (Cat. No. HCYTOMAG-60K). Результаты Высокий уровень экспрессии мРНК MYC детектируется в живых моноцитах в популяции мононуклеарных клеток периферической крови человека Сначала мы исследовали экспрессию MYC в моноцитах, представленных в популяции мононуклеарных клеток периферической крови человека (Рис. 2). С использованием проточной цитофлуориметрии для детекции сигналов РНК MYC, так же как иммуноцитохимию для детекции 2 CD33 и CD14, мы обнаружили, как и ожидалось, что CD33+ CD14+ моноциты могут быть отделены от CD33+CD14клеток, которые представляют собой гетерогенную смесь таких типов клеток как дендритные клетки, гранулоциты и т.д. Дальнейший анализ CD33+CD14+и CD33+CD14- клеток на основе Myc SmartFlare флуоресценции показал, что моноциты в популяции мононуклеарных клеток периферической крови человека экспрессируют транскрипционный фактор на особенно высоком уровне (рис. 2С и 2D), также в соответствии с ожидаемыми значениями. A. C. Моноциты B. D. Не моноциты Рис. 2. Специфичная детекция мРНК MYC в моноцитах в популяции мононуклеарных клеток периферической крови человека. Изолированные мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) инкубировали в течение ночи с зондами SmartFlare™, затем отмывали и докрашивали антителами, специфичными к CD14 и CD33, двум поверхностным маркерам, обычно используемым для идентификации моноцитов в крови3. На точечной диаграмме МКПК (А.) гейтировали живые клетки и затем анализировали их на точечной диаграмме CD14 vs. CD33 экспрессии (В.), гейтировали CD33+CD14+(моноциты) и CD33+CD14- (не моноциты). Гистограммы отражают относительные сигналы для моноцитов (С.) и не моноцитарных клеток (D.), демонстрирующие, что только моноциты имеют высокий уровень флуоресценции по Су5, в соответствии с экспрессией MYC, детектируемой с помощью зондов SmartFlareMYC. «Unflared» - клетки, не инкубированные с зондами SmartFlare™. Снижение уровня экспрессии мРНК MYC во время дифференцировки ТНР-1 моноцитов в макрофаги Чтобы направить линию дифференцировки в направлении макрофагов, ТНР-1 клетки стимулировали РМА в концентрации 5 нг/мл в течение 1 дня. В дальнейшем клетки дифференцировались в нормальной клеточной среде без РМА в течение 4 дней. Под влиянием РМА, останавливалась пролиферация ТНР-1 клеток, и начинались изменения в морфологии клеток. Снижение мРНК MYC в течение 5-дневной дифференцировки, детектируемой с помощью Су5 зондовSmartFlare™, визуализировали с помощью конфокальной микроскопии (рис. 3А, красное флуоресцентное свечение) и проточной цитофлуориметрии (рис. 3В). Оба набора полученных данных соответствовали количественной оценке мРНК MYC, полученной с помощью ОТ-ПЦР. 3 A. Дни обработки с ПМА B. C. Рис. 3. Снижение уровня экспрессии мРНК MYC в ответ на РМА-индуцированную дифференцировку детектировали в живых ТНР-1 клетках с использованием зондов для детекции РНК SmartFlare™ (А., В.) и количественной ОТ-ПЦР (С.). Сортировка живых клеток на основе экспрессии мРНК MYC в недифференцированных и дифференцированных ТНР-1 клетках Анализ с помощью проточной цитофлуориметрии- перед сортировкой клеток изолированных популяций недифференцированных ТНР-1 (высокий уровень экспрессии MYC) vs. РМА-дифференцированных ТНР-1 (низкий уровень экспрессии MYC) с использованием A. SmartFlare™ зондов для детекции РНК MYC продемонстрировал различие в профиле экспрессии MYC. Чтобы продемонстрировать, что технология SmartFlare™ может быть использована для изоляции клеток с высоким уровнем экспрессии MYC от клеток с низким уровнем экспрессии MYC, обе клеточные популяции были смешаны после инкубации с зондами SmartFlare™ и отсортированы на основе уровня экспрессии мРНКMYC (рис. 4С). C. Смешанная популяция B. Рис. 4. Сортировка клеток на основе уровня экспрессии мРНК MYC для проведения последующих функциональных анализов. Изолированные популяции недифференцированных (А.) и РМА-стимулированных (В.) ТНР-1 клеток были обработаны зондами SmartFlare™ для определения уровня экспрессии MYC. Сходный анализ смешанной популяции демонстрирует широкий спектр экспрессии MYC в пределах популяции, в которой могут быть отсортированы клетки с низкой и высокой экспрессией MYC (С.). 4 Фагоцитоз E.coli макрофагами, отсортированными на основе мРНК MYC Продукты сортировки, представленные на рис.4, были раздельно возвращены в культуру в течение 2 дней и подвергнуты анализу бактериального фагоцитоза, в ходе которого клетки инкубировали с GFP- экспрессирующими бактериями. В общей сложности A. Высокий уровень экспрессии MYC (моноциты) было визуализировано 1000 клеток после 3-часовой инкубации с GFP-E.coli (рис. 5А и 5В), процент клеток, поглотивших 5 или более бактерий, определяли с помощью микроскопа. В то время как только 0.3% моноцитов с высокой экспрессией MYC фагоцитировали бактерий, 9.1% макрофагов с низкой экспрессией MYC продемонстрировали фагоцитоз (Рис. 5С). B. Низкий уровень экспрессии MYC (макрофаги) C. Анализ фагоцитоза после сортировки клеток Фаготицирующие клетки (%) Рис. 5. Анализ бактериального фагоцитоза. Популяции клеток с высоким (моноциты) и низким (макрофаги) уровнем экспрессии MYC, отсортированные на основе SmartFlare™ флуоресценции (красный цвет) были протестированы на способность к фагоцитозу GFP-экспрессирующих E.coli(зеленый цвет). MYC отсортированные моноциты и макрофаги демонстрируют различный профиль экспрессии цитокинов и различный ответ на стимуляцию ЛПС ЛПС (липополисахарид), компонент клеточной стенки бактерий, индуцирует секрецию цитокинов и, соответственно, иммунный ответ. Чтобы охарактеризовать биологическую функцию продуктов сортировки, представленных на рисунке 4, клетки, после их возвращение в культуру в течение 2 дней, были подвергнуты ЛПСиндуцированной секреции цитокинов и цитокиновому анализу с использованием мультиплексного анализа на основе частиц MILLIPLEX® MAP. Клетки с высоким и низким уровнем экспрессии MYC стимулировали ЛПС в концентрации 100 нг/мл в течение 8 часов. Культуральную среду собирали и одновременно анализировали на 9 секретируемых цитокинов и хемокинов. Не только не стимулированные продукты (рис. 6А) сортировки продемонстрировали различия в профиле секреции цитокинов, но также и ЛПС-стимули рованные продукты сортировки (рис. 6В и 6С) продемонстрировали различия в амплитуде и кинетике цитокинового ответа в соответствии со статусом экспрессии MYC. Например, клетки с низким уровнем экспрессии MYC демонстрируют более быстрое увеличение MIP-1a по сравнению с клетками с высоким уровнем экспрессии MYC. И в то время как клетки с низким уровнем экспрессии MYC имеют более высокий базовый уровень МСР-1, клетки с высоким уровнем экспрессии MYC отвечают на ЛПС стимуляцию секрецией повышенного уровня МСР-1, что, в конечном счете, приводит в соответствие уровень экспрессииМСР-1, характерный для клеток с низкой экспрессией MYC. Цитокином, демонстрирующим наибольшее различие между клетками с низкой и высокой экспрессией MYC, является TNFα, чья секреция значительно возрастает при стимуляции ЛПС клеток с низким уровнем экспрессии MYC, но не клеток с высокой его экспрессией, в культурах, для которых показаны данные, согласующиеся с данными, представленными в литературе5. 5 Рис. 6. Различная секреция цитокинов в MYC-сортированных популяциях клеток. Благодаря использованию мультиплексного иммуноанализа на основе использования частиц, мы смогли провести одновременную количественную оценку уровня секреции цитокинов и кинетику секреции 9 цитокинов в нестимулированных (А) и ЛПС-стимулированных продуктах сортировки (В и С). Заключение Мы продемонстрировали, чтотехнологияSmartFlare™ позволяет детектировать РНК в живых клетках без нарушения их жизнеспособности и целостности, а также полезность данной технологии в анализе экспрессии генов в популяции живых мононуклеарных клеток периферической крови человека. Кроме того, мы подтвердили возможность использования технологии SmartFlare™ для сортировки живых клеток на основе внутриклеточной экспрессии мРНК. До настоящего времени сортировка живых клеток на основе внутриклеточных целевых молекул была невозможна, вследствие необходимости пермеабилизации клеток для введения в них антител, что приводило к потере их жизнеспособности и целостности. В данном исследовании мы успешно продемонстрировали использование технологии SmartFlare™ для сортировки моноцитов и макрофагов в гетерогенном клеточном образце на основе дифференциальной экспрессии мРНК 6 MYC, целевой молекулы, которая, как правило, пригодна для использования в качестве параметра для сортировки клеток. Клетки, отсортированные в соответствии с флуоресцентными сигналами SmartFlare™, были не только жизнеспособны в культуре после мечения и сепарации, но также полностью сохраняли свою ожидаемую биологическую активность, как было показано в ходе анализа фагоцитирующей способности, и кроме тогосохраняли способность к секрециизначимых цитокиновых маркеров в ответ на ЛПС стимуляцию. Уникальные свойства зондов SmartFlare™ позволяют исследователям оптимизировать существующие схемы окрашивания клеток для сортировки, включая анализ мРНК, делая возможным разработку новых методов анализа клеток иммунной системы и открытие новой фенотипической классификации, которая, в конечном итоге, может помочь в улучшении определения индивидуальных типов клеток иммунной системы. Цитированная литература 1. Marcu KB, Bossone SA, Patel AJ. Myc function and regulation. Annu Rev Biochem. 1992;61:809-60. 2. Matikainen S1, Hurme M. Comparison of retinoic acid and phorbol myristate acetate as inducers of monocytic differentiation. Int J Cancer. 1994 Apr 1;57(1):98-103. 3. Szeberényi JB1, Rothe G, Pállinger E, Orsó E, Falus A, Schmitz G. Multi-color analysis of monocyte and dendritic cell precursor heterogeneity in whole blood. Immunobiology. 2000 May;202(1):51-8. 4. H Phillip et al. Phorbol ester effect on differentiation of human myeloid leukemia cell lines blocked at different stages of maturation. Cancer Research. 1981 Mar ;41 919-926. 5. Takashiba S et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kappaB. Infect Immun. 1999 Nov;67(11):5573-8. Для размещения заказа или получения технической информации MERCK MILLIPORE 115054, г. Москва, ул. Валовая, д. 35 Тел.: +7 (495) 937-33-04 e-mail: mm.russia@merckgroup.com Присоединяйтесь! Вступайте в сообщество Merck Millipore Biosciense в своей любимой социальной сети и получайте самые свежие новости! facebook.com/MerckMilliporeBioscience twitter.com/Merck4Bio Merck Millipore и марка М являются зарегистрированными торговыми марками. SmartFlare и guava easyCyte –торговые марки Merck KGaA, Дармштадт, Германия. Все торговые марки, принадлежащие третьим сторонам, являются собственностью их правообладателей. Lit №. AN5333EN000 BS GEN-14-10174
