ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ
ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
На правах рукописи
ВИХРЕВА Полина Никитична
«ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ДЕРЕГУЛЯЦИИ
СУПРЕССОРА ОПУХОЛЕВОГО РОСТА PDCD4 В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ»
Специальность 03.01.03 – молекулярная биология
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
научный руководитель:
доктор биол. наук Коробко И.В.
МОСКВА
2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список использованных сокращений.......................................................................................... 5
1.
ВВЕДЕНИЕ ......................................................................................................................... 7
2.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................................................ 9
3.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ..................................................... 10
4.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................... 11
4.1.
Ген и белок Pdcd4 ......................................................................................................... 11
4.1.1.
Ген и транскрипт Pdcd4 ........................................................................................ 11
4.1.2.
Структура белка Pdcd4 .......................................................................................... 12
4.1.3.
Молекулярные механизмы действия Pdcd4 ........................................................ 15
4.2.
Регуляция активности Pdcd4........................................................................................ 20
4.2.1.
Регуляция транскрипции Pdcd4 ........................................................................... 20
4.2.2.
Регуляция трансляции Pdcd4 ................................................................................ 21
4.2.3.
Регуляция стабильности белка Pdcd4 .................................................................. 23
4.2.4.
Внутриклеточная локализация Pdcd4 .................................................................. 26
4.2.5.
Регуляция активности Pdcd4 ................................................................................ 27
4.3.
Характер экспрессии Pdcd4 ......................................................................................... 30
4.4.
Функции Pdcd4 .............................................................................................................. 32
4.4.1.
Pdcd4, апоптоз и контроль пролиферации клеток .............................................. 32
4.4.2.
Влияние Pdcd4 на клеточный цикл ...................................................................... 35
4.5.
Pdcd4 и неопластическая трансформация .................................................................. 36
4.5.1.
Pdcd4 и онкогенез: причинно следственная связь.............................................. 36
4.5.2.
Прогностическое значение Pdcd4 ........................................................................ 39
4.5.3.
Pdcd4 и супрессия роста опухолевых клеток...................................................... 40
4.5.4.
Ангиогенез ............................................................................................................. 41
4.5.5.
Pdcd4 и прогрессия опухоли ................................................................................. 42
4.5.6.
Pdcd4 и хеморезистенция...................................................................................... 45
4.5.7.
Pdcd4 как интегральный маркер про-онкогенных изменений .......................... 47
4.6.
Заключение .................................................................................................................... 48
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................................ 50
5.
5.1.
Реактивы ........................................................................................................................ 50
5.2.
Культуры клеток, реагенты и трансфекция................................................................ 50
5.3.
Вестерн-блот анализ и антитела .................................................................................. 51
5.4.
Выделение РНК и ПЦР в реальном времени ............................................................. 52
3
5.5.
Ферменты ....................................................................................................................... 55
5.5.1.
Гидролиз ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции ........................................ 55
5.5.2.
Обработка фрагментов ДНК фрагментом Кленова............................................ 55
5.5.3.
Лигирование фрагментов ДНК ............................................................................ 55
5.6.
Получение плазмидных конструкций ......................................................................... 55
5.6.1.
Бактериальные штаммы, среды, реактивы, антибиотики .................................. 55
5.6.2.
Приготовление компетентных клеток E. coli...................................................... 56
5.6.3.
Трансформация клеток E. сoli .............................................................................. 56
5.6.4.
Секвенирование ДНК ............................................................................................ 56
5.6.5.
Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli ................................................... 57
5.6.6.
Электрофорез ДНК в агарозном геле .................................................................. 57
5.6.7.
Очистка фрагментов ДНК .................................................................................... 57
5.6.8.
Полимеразная цепная реакция ............................................................................. 57
5.6.9.
Клонирование продуктов ПЦР ............................................................................. 57
5.6.10. Получение плазмидных конструкций ................................................................. 57
5.7.
Двойной люциферазный анализ .................................................................................. 61
5.8.
Статистическая обработка результатов ...................................................................... 61
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .................................................................................. 63
6.
6.1.
Анализ экспрессии Pdcd4 в клетках меланомы человека ......................................... 63
6.1.1.
Уровень белка Pdcd4 в клетках меланомы и нормальных меланоцитах ......... 63
6.1.2. Роль Akt и MEK/ERK сигнальных путей в супрессии Pdcd4 в клетках
меланомы .............................................................................................................................. 67
6.2.
Анализ уровней белка и транскрипта Pdcd4 в клетках линий рака легких ............ 71
6.3. Роль Akt/mTOR/S6K1-сигнального пути в супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках
рака легких ............................................................................................................................... 73
6.4. Роль протеинкиназы GSK3β в регуляции экспрессии супрессора опухолевого
роста Pdcd4 в клетках линии рака легких.............................................................................. 75
6.5. Вклад протеолитической деградации белка Pdcd4 в супрессию Pdcd4 в клетках
опухолей легких ....................................................................................................................... 77
6.6. Влияние ингибиторов Akt/mTOR/S6K1-сигнального пути рапамицина и LY29002
на уровень транскрипта Pdcd4................................................................................................ 78
6.7. Вклад микроРНК miR-21 и miR-183 в рапамицин-зависимую супрессию Pdcd4 в
опухолевых клетках линии рака легких ................................................................................ 79
6.8. mTOR-зависимая супрессия активности промотора гена Pdcd4 в клетках линии
рака легких ............................................................................................................................... 84
4
6.8.1. Способность ингибитора mTOR рапамицина оказывать действие на
активность промоторной области гена Pdcd4 ................................................................... 85
6.8.2. Картирование минимального фрагмента промотора гена Pdcd4,
ответственного за влияние Akt-сигнального пути на транскрипционную активность
промотора гена Pdcd4 .......................................................................................................... 86
6.8.3. Анализ участков связывания потенциальных транскрипционных факторов с
делеционным мутантом промотора гена Pdcd4 ................................................................ 87
6.8.4. Анализ активности репортерного гена под контролем делеционного мутанта
минимального фрагмента промотора гена Pdcd4, опосредующего эффект рапамицина
89
7.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................. 92
6.
ВЫВОДЫ .......................................................................................................................... 93
ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА ...................................................................................................... 94
БЛАГОДАРНОСТИ .................................................................................................................... 95
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................................... 96
5
Список использованных сокращений
а.о.
АТФ
ДНК
ДСН-ПААГ
кДа
кДНК
мРНК
НМКРЛ
нт
НТО
ОМЛ
п.н.
ПЦР
РНК
т.п.н.
ЭДТА
Akt
AP-1
ATRA
DMEM
аминокислотный остаток
аденозинтрифосфат
дезоксирибонуклеиновая кислота
додецилсульфат натрия-полиакриамидный гель-электрофорез
килодальтон
комплементарная ДНК
матричная РНК
немелкоклеточный рак легкого
нуклеотиды
нетранслируемая область
острая миелоидная лейкемия
пары нуклеотидов
полимеразная цепная реакция
рибонуклеиновая кислота
тысяч пар нуклеотидов
этилендиаминтетраацетат
протеинкиназа B
транскрипционный фактор АР-1 (активирующий белок-1)
полностью транс-ретиноевая кислота (all trans retinoic acid)
среда Игла, модифицированная Дюльбекко (Dulbecco’s Modified
Eagle Medium)
ERK
киназы, активируемые внеклеточным сигналом (extracellular signal
regulated kinases)
FOX
HEM
транскрипционные факторы семейства forkhead box
нормальные человеческие меланоциты (Human epidermal
melanocyte)
интерлейкин
киназа, фосфорилирующая N-концевой активаторный домен c-Jun
(c-Jun N-terminal kinase)
IL
JNK
LB
LPS
MAPK
среда Лурия Бертани (Luria Bertani medium)
липополисахариды (бактериальный эндотоксин)
митоген-активируемая протеинкиназа (Mitogen-Activated Protein
Kinase)
mTOR
протеинкиназа серин-треониновой специфичности/«мишень
рапамицина у млекопитающих» (mammalian target of rapamycin)
NES
NF-κB
NLS
PARP
PBS
PC1
Pdcd4
сигнал ядерного экспорта (Nuclear export sequence)
ядерный фактор κB (nuclear factor κB)
сигнал ядерной локализации (Nuclear localization sequence)
поли(АДФ-рибоза)-полимераза
фосфатно-солевой буфер (Phosphate buffered saline)
пробелок конвертазы 1 (proprotein convertase 1)
Programmed cell death 4
6
PI3K
PRMT5
S6K1
SRSF3
фосфатидилинозитол-3-киназа (Phosphoinositide-3-kinase)
белок аргинин метилтрансфераза 5 (protein arginine methyltransferase
5)
рибосомная S6 киназа 1
серин/аргинин-богатый фактор сплайсинга 3 (Serine/arginine-rich
splising factor 3)
TNF
TOR
фактор некроза опухолей (Tumor Necrosis Factor)
протеинкиназа серин-треониновой специфичности/«мишень
рапамицина» (target of rapamycin)
TPA
(12-O-тетра-деканоилфорбол-13-ацетат)/ PMA (4-форбол-12миристат-13-ацетат) – опухолевый индуктор
TRAIL
YB-1
ZBP-89
βTRCP
TNF-related apoptosis-inducing ligand
Y-box связывающий белок
zinc-finger-binding protein 89
белок, содержащий повторные участки бета-трансдуцина (betatrancducin repeat-containing protein)
7
1. ВВЕДЕНИЕ
Одной из главных причин смертности в мире остаются онкологические
заболевания. Природа каждой раковой опухоли с молекулярной точки зрения всегда
уникальна. Возникновение и прогрессия опухоли определяется многочисленными и
разнообразными факторами и процессами, среди которых, однако, общепринятым
является представление об онкогенах и генах-супрессоров опухолевого роста, играющих
противоположные роли в процессе опухолевой трансформации. Протоонкогены кодируют
белки, изменение активности которых приводит к опухолевой трансформации клетки.
Гены-супрессоры опухолевого роста, напротив, кодируют белки, которые ингибируют
процессы трансформации. Дерегуляция супрессоров опухолевого роста играет одну из
ключевых ролей в процессах возникновения и прогрессии опухолей. Более того,
восстановление функций супрессоров опухолевого роста в ряде случаев может приводить
к ингибированию опухолевых характеристик, таких как пролиферативная активность,
инвазивность и других, и, в конечном результате, к гибели опухолевых клеток. Изменения
уровня
экспрессии
или
мутации
супрессоров
опухолевого
роста
в
процессе
злокачественной трансформации клеток могут служить диагностическими (так как
являются характерными чертами именно опухолевых клеток) и прогностическими (так как
могут коррелировать с дальнейшим его течением) маркерами опухолей. Дерегуляция
супрессоров опухолевого роста также может коррелировать с чувствительностью
опухолевых
клеток
молекулярных
необходимо
к
различным
механизмов
для
выявления
анти-неопластическим
функционирования
способов
препаратам.
супрессоров
восстановления
их
Понимание
опухолевого
активности,
роста
создания
рациональных способов диагностики онкологических заболеваний, выбора оптимальной
стратегии лечения, а так же для создания препаратов, характеризующиеся высокой
эффективностью и специфичностью воздействия, тем самым, способствуя расширению
спектра методов борьбы с онкологическими заболеваниями.
В настоящее время известно большое количество генов и кодируемых ими белков,
обладающих свойствами супрессоров опухолевого роста. Несмотря на общность в
способности ингибировать возникновение и прогрессию опухолей, механизмы действия
супрессоров опухолевого роста чрезвычайно разнообразны. Объектом настоящего
исследования является один из супрессоров опухолевого роста, Programmed Cell Death 4
(Pdcd4).
Опухолевые
клетки
различного
происхождения
часто
характеризуются
сниженным, вплоть до полной потери, уровнем белка Pdcd4. На сегодняшний день
известно, что в основе снижения уровня белка Pdcd4 лежат: усиленная деградация белка,
8
его сниженная продукция и/или деградация кодирующей белок мРНК. Активация этих
процессов обусловлена повышенной активностью проонкогенных процессов. При этом,
как показали проведенные ранее исследования, потеря Pdcd4 способствует прогрессии
опухоли. Все это делает исследование свойств, функций и механизмов дерегуляции Pdcd4
в опухолевых клетках актуальной задачей, решение которой позволит глубже понять
молекулярные процессы, определяющие прогрессию опухолей, и выделить критические
мишени для воздействия на опухолевые клетки. Повышенный интерес к белку Pdcd4
также определяется потенциальной возможностью его использования в диагностических и
прогностических целях и, в перспективе, использовать Pdcd4 в качестве молекулярной
мишени для лечения онкологических заболеваний.
Данная
работа
посвящена
исследованию
молекулярных
механизмов,
ответственных за супрессию Pdcd4 в клетках рака легких и меланомы. Несмотря на то, что
есть литературные данные свидетельствующие о возможной роли белка Pdcd4 как
фактора, препятствующего развитию и прогрессии рака кожи, меланома, являющаяся
наиболее агрессивным видом рака кожи, остается неизученной в отношении изменения
уровня экспрессии Pdcd4. Что касается опухолей легкого, то для них снижение уровня
транскрипта Pdcd4 является значимым прогностическим фактором, и опухоли легкого
рассматриваются как одна из перспективных мишеней для генной терапии с
использованием Pdcd4. Однако молекулярные механизмы дерегуляции Pdcd4 в клетках
рака легкого остаются неизученными.
9
2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью работы являлось исследование молекулярных механизмов, ответственных за
супрессию Pdcd4 в клетках рака легких и меланомы.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Исследовать характер продукции белка Pdcd4 в клетках меланом человека по
сравнению с нормальными меланоцитами.
2. Исследовать характер экспрессии Pdcd4 в клетках рака легких по сравнению с
клетками нормального бронхиального эпителия.
3. Установить вклад протеолитической деградации белка в супрессию Pdcd4 в
клетках рака легких.
4. Исследовать роль протеинкиназы GSK3β в регуляции экспрессии супрессора
опухолевого роста Pdcd4 в клетках рака легких.
5. Исследовать роль микроРНК в рапамицин-зависимой регуляции транскрипта Pdcd4
в клетках рака легких.
6. Исследовать mTOR-зависимое ингибирование активности промотора гена Pdcd4 в
клетках линий рака легких.
10
3. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ ДЛЯ ЗАЩИТЫ
1.
Уровень супрессора опухолевого роста Pdcd4 снижен в ~25% исследованных
меланом. Снижение уровня супрессора опухолевого роста в клетках меланом
частично опосредовано активностью Akt-сигнального пути.
2.
Уровень супрессора опухолевого роста Pdcd4 значительно понижен во всех
восьми исследованных клеточных линий рака легких. Изменение уровня белка
Pdcd4 не коррелирует с аналогичными изменениями в уровне транскрипта
Pdcd4.
3.
Активность протеинкиназы GSK3β необходима для поддержания уровня Pdcd4
в клетках рака легких.
4.
Протеолитическая деградация не является единственным молекулярным
механизмом снижения уровня супрессора опухолевого роста Pdcd4 в клетках
рака легкого, опосредованного активацией Akt-сигнального пути.
5.
МикроРНК, в частности, микроРНК miR-21 и miR-183, сайты узнавания
которых находятся в 3`-нетранслируемой области транскрипта Pdcd4, не
опосредуют рапамицин-зависимую супрессию транскрипта Pdcd4 в клетках
линии Calu-I.
6.
Активация Akt-сигнального пути приводит к опосредованной сигнальным
комплексом mTORС1 супрессии транскрипции с промотора гена Pdcd4.
11
4. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
4.1. Ген и белок Pdcd4
4.1.1. Ген и транскрипт Pdcd4
Впервые Pdcd4 (Programmed cell death-4) был изолирован как транскрипт H731,
продуктом которого является ядерный антиген пролиферирующих клеток Pr-28 [1–3].
Позже он же был изолирован как транскрипт, присутствие которого в мышиных
кератиноцитах (клетки линии JB6) ингибировало их неопластическую трансформацию [4].
Другой группой исследователей он был описан как MA-3 - транскрипт, индукция
которого, как показали последующие исследования, наблюдалась при апоптозе в
исследованных клеточных линиях [5]. Вскоре после этого Ониши и Кизаки опубликовали
гомологичную
кодирующую
последовательность,
названную
TIS
–
транскрипт
(topoisomerase inhibitor suppressed gene), супрессия которого наблюдалась при обработке
клеток
лимфомы
RVC
ингибитором
топоизомеразы
камптотецином
[4,6,7].
В
последующие годы еще несколькими независимыми группами исследователей были
идентифицированы человеческий (197/15a), куриный (Pdcd4) и крысиный (DUG)
ортологи [8]. Транскрипт 197/15а дифференциально регулируется интерлейкинами 2, 12 и
15 в NK- и Т-клетках [9]. Уровень транскрипта DUG значительно увеличивался в клетках
крысиной инсулиномы INS-1, претерпевающих апоптотическую гибель [10]. Поскольку в
ряде модельных систем экспрессия гена была сопряжена с индукцией апоптотического
процесса, этот ген получил официальное название Pdcd4 (Programmed cell death-4).
Ген Pdcd4 мыши имеет длину приблизительно 21 т.п.н. включает 11 экзонов и
присутствует в единичной копии [11]. Анализ 5'-фланкирующего участка гена показал
наличие основных консенсусных последовательностей корового промотора – TATA и
CAAT-боксов в позициях -21 и -81, соответственно [11]. В клетках линии COS-1 при
помощи люциферазного анализа было показано, что функциональный участок промотора,
содержащий эти два элемента, является транскрипционно активным. Чувствительность к
камптотецину, ингибитору топоизомеразы I, была ассоциирована с участком промотора от
[-132/+160] и обуславливает супрессию транскрипции гена Pdcd4 при воздействии на
клетки
ингибиторами
топоизомераз.
Более
того,
в
промоторной
области
был
идентифицирован потенциальный участок связывания транскрипционных факторов NFκB
(в позиции от -488 до -470), NF1 [-326/-314], и два сайта связывания C/EBP [-424/-416] и [254/-246]. Но остается неясным, функционируют ли эти последовательности при
транскрипции.
12
Рис. 1. Схематическое изображение транскриптов Pdcd4 и изоформ 1 и 2 белка Pdcd4. (А)
Открытые рамки считывания (ORF) вариантов 1 и 2 транскрипта показаны штриховкой.
Альтернативный экзон, присутствующий в варианте 2 транскрипта, показан черным цветом.
Начала и концы открытых рамок считывания и положение альтернативного экзона в варианте 2
транскрипта приведены в нуклеотидах (нт). (Б) Показаны положения МА3-доменов в изоформах 1
и 2 белка Pdcd4. N-концевые области белков, различающиеся в изоформах 1 и 2, показаны черным
цветом. Положения МА3-доменов приведены в аминокислотных остатках (ао).
Ген Pdcd4 человека картирован в локусе 10q24 [12], состоит из 12 экзонов и
составляет около 28 т.п.н. Кроме транскрипта размером в 3591 п.н. (GeneBank Acc.
NM_014456), кодирующего изоформу 1 белка Pdcd4 из 469 аминокислот (а.о.), существует
альтернативно сплайсированный транскрипт Pdcd4 длиной 3675 п.н., кодирующий
изоформу 2 (GeneBank Acc. NM_145341). Инсерция дополнительного экзона между
экзонами 2 и 3 в транскрипте, кодирующем изоформу 2, сдвигает рамку считывания, что
приводит к инициации трансляции с AUG-кодона, находящегося в альтернативном экзоне,
и синтезу белка из 458 аминокислот, практически полностью идентичного изоформе 1 за
исключением N-концевой области полипептидной цепи (Рис. 1). В настоящее время
функциональные различия между двумя изоформами Pdcd4 неизвестны.
4.1.2. Структура белка Pdcd4
Белок Pdcd4 (изоформа 1) состоит из 469 а.о. Белковая молекула Pdcd4 имеет
характерное строение и состоит из доменов, определяющих способность к узнаванию и
связыванию с РНК и белками-партнерами. Полипептидная цепь включает два основных
домена на N- и С- концах и два консервативных α-спиральных MA-3 домена [10,13] (Рис.
2).
МА-3 домен является высококонсервативным. Он присутствует в факторах
инициации трансляции eIF4G человека и eIF(iso)4F растений, а также в изоформе eIF4G
13
DAP-5/NAT-1/p97, но отсутствует в белке eIF4G дрожжей [14,15]. МА-3 домен в факторе
eIF4G необходим для его взаимодействия с АТФ-зависимой РНК-хеликазой eIF4A,
которая необходима для инициации трансляции и релаксации вторичных структур в 5'нетранслируемых
областях
коиммунопреципитации,
(НТО)
дрожжевой
[16].
И
двугибридной
действительно,
системой,
методами
конфокальной
иммунофлуоресцентной микроскопии было показано взаимодействие между Pdcd4 и
eIF4A, и на основании такого взаимодействия был предложен механизм Pdcd4-зависимой
репрессии трансляции [10,17]. Механизм состоит в том, что Pdcd4 за счет MA-3 домена
связывается с eIF4A и тем самым препятствует связыванию eIF4A с eIF4G и eIF4E. Таким
образом, Pdcd4 не дает сформироваться комплексу eIF4F и тем самым блокирует
трансляцию. В подтверждение предложенного механизма было показано, что хеликазная
активность eIF4A ингибируется дозозависимым способом рекомбинантным белком Pdcd4,
тем самым, репрессируя кэп-зависимую трансляцию [17].
Мутации в MA-3 домене белка Pdcd4 приводили к полной потере способности
Pdcd4 связывать eIF4A и, как результат, ингибировать трансляцию, что указывает на
критичную роль MA-3 доменов Pdcd4 в процессе подавления трансляции [16].
Рис. 2. Структура белка Pdcd4. Возможные сайты ядерной локализации (NLS) отмечены
красным; сигналы ядерного экспорта (NES) зеленым; стрелками указаны сайты
фосфорилирования; два консервативных MA-3 домена обозначены сиреневым цветом; РНКсвязывающий сайт обозначен голубым цветом; участок богатый аргинином отмечен желтым
(адаптировано из [18]).
В последующие годы методом ЯМР-спектроскопии была определена структура Сконцевого MA-3 домена (MA-3c) молекулы белка Pdcd4 [19,20]. Было показано, что MА-3
домен Pdcd4 эффективно конкурирует с eIF4G за взаимодействие с eIF4A. Pdcd4 обладает
схожей или даже большей аффинностью связывыания с eIF4A, чем eIF4G, и такое
связывание является достаточным для ингибирования инициации трансляции. Методом
ЯМР-спектроскопии была также определена структура второго, MA-3 домена (MA-3m),
находящегося ближе к N-концу [21]. Домен MA-3m структурно и функционально схож с
MA-3c и оба они действуют синергично. Оба MА-3 домена Pdcd4 необходимы для
высокоаффинного связывания с eIF4A. Однако регуляция трансляции белком Pdcd4 может
быть еще более сложной, так как было показано, что Pdcd4 может напрямую
14
взаимодействовать с eIF4G, и к тому же обладает еще и РНК-связывающей активностью
[22].
Интересно отметить, что гомологи Pdcd4 присутствуют и у низших эукариот, и у
растений, но не у дрожжей. Pdcd4 в высших растения уникален тем, что состоит из
четырех MA-3 доменов [23].
N-концевая часть домена Pdcd4, как было показано in vitro, обладает способностью
связываться с РНК [22]. РНК-связывающий участок белка сильно гидрофилен и содержит
протяженные участки основных а.о. Анализ РНК-связывающей активности участка Nконцевого домена показал, что существуют две области, богатые остатками аргинина и
лизина, с центрами, расположенными вокруг аминокислот 63 и 103 [24]. Эти участки,
обозначенные как RBM1 и RBM2, демонстрируют значительную консервативность среди
позвоночных, и даже между гомологами Pdcd4 сильно отдаленных видов, таких как S.
domuncula, D. melanogaster, X. laevis, D. rerio, M. musculus и H. sapiens. Мутантный анализ
показал, что для связывания РНК и Pdcd4 in vivo необходимы оба кластера.
Аминокислотные остатки аргинина в позиции 73 и 110, фланкированные остатками
глицина и представляющие собой канонические сайты метилирования, играют роль в
изменении активности Pdcd4 [25].
Аминокислотная
последовательность
Pdcd4
содержит
множество
сайтов
фосфорилирования. Фосфорилирование Pdcd4 впервые было продемонстрировано в
клетках линии HeLa, но функциональная значимость этого выявленного факта некоторое
время
оставалась
неясной
[26].
Позднее
было
показано,
что
протеинкиназа
Akt/протеинкиназа B специфически фосфорилирует Pdcd4 по серину-67 и серину-457 [27].
Такое фосфорилирование индуцирует два эффекта, первый – ядерную транслокацию
Pdcd4, и второй – снижение его способности функционировать как ингибитор AP-1
(активаторный белок 1)-зависимой транскрипции. В дополнение к этому было показано,
что в ответ на воздействие митогенов на клетку Pdcd4 быстро фосфорилируется по
серину-67
протеинкиназой
S6K1
(S6
киназа
1)
и
затем
подвергается
убиквитинилированию убиквитин-лигазой SCF (βTRCP) с последующей деградацией.
Нельзя исключить, что такой механизм деградации Pdcd4 в ответ на действие митогенов
может привести к эффективному синтезу белка и к последующему росту клеток [28]. Эти
данные были подтверждены исследованиями уровня белка Pdcd4 после обработки клеток
опухолевым индуктором PMA (4-форбол-12-миристат-13-ацетат) [29]. Отмеченное
количественное уменьшение Pdcd4, как было продемонстрировано, является результатом
усиления его деградации в протеасомах. Такая деградация опосредована как активацией
Akt и S6K1, так и MEK-ERK-сигнального пути [29].
15
4.1.3. Молекулярные механизмы действия Pdcd4
Экспрессия Pdcd4 может оказывать существенное влияние на возникновение и
прогрессию опухолей. Каковы молекулярные основы этого феномена?
Выявление факта активности Pdcd4 как супрессора опухолевого роста в модели
клеток JB6 [4] послужило отправной точкой для исследования молекулярных путей,
которые приводят к супрессии онкогенной трансформации клеток. Так как активация AP1- и NFκB-зависимых транскрипционных активностей, а так же активация орнитин
декарбоксилазы являются критическими событиями при неопластической транформации
клеток
JB6,
была
исследована
возможность
того,
что
Pdcd4
супрессирует
неопластическую трансформацию за счет влияния на эти мишени.
Было показано, что экспрессия Pdcd4 вызывала существенное ингибирование АР-1зависимой транскрипционной активности, в то время как влияние на NFκB-зависимую
транскрипцию и активность орнитин декарбоксилазы было незначительным или
отсутствовало [30]. Таким образом, мишенью для Pdcd4 является AP-1-зависимая
транскрипционная
активность.
При
этом
повышенная
экспрессия
компонентов
транскрипционного фактора AP-1 не отменяла Pdcd4-зависимое ингибирование AP-1зависимой транскрипции, и авторами не было показано прямого взаимодействия Pdcd4 с
компонентами
комплекса
AP-1.
Это
позволило
им
сделать
предположение
о
непосредственном действии Pdcd4 на факторы, ответственные за трансактивацию AP-1
[30]. Экспрессия Pdcd4 в тканях легких у мышей, трансгенных по гену люциферазы под
контролем
АР-1-зависимого
промотора,
вызывала
существенное
ингибирование
экспрессии репортерного гена [31], а также сопровождалась усилением апоптотической
клеточной гибелью и снижением пролиферативной активности клеток [31,32]. Кроме того,
ингибирование экспрессии Pdcd4 при помощи коротких шпилечных РНК в клетках
карциномы кишечника линии НТ29 приводило к повышению инвазивных свойств клеток,
что предположительно было опосредовано активацией АР-1-зависимой транскрипции
[33].
Таким
образом,
результаты
многочисленных
экспериментов
убедительно
демонстрируют, что в клетках Pdcd4 действует как ингибитор AP-1-зависимой
транскрипции, и эта функция Pdcd4 непосредственно связана с его активностью как
супрессора опухолевого роста.
Каким образом Pdcd4 ингибирует АР-1-зависимую транскрипцию в клетках? Было
установлено, что Pdcd4-зависимое ингибирование активности AP-1 непосредственно
связано с его способностью ингибировать трансляцию, и мутация D418A, приводящая к
невозможности взаимодействия Pdcd4 с eIF4A, также отменяла и ингибирующее действие
16
Pdcd4 на АР-1-зависимую транскрипцию [17]. Однако детальная связь между влиянием
Pdcd4 на АР-1-зависимую транскрипцию и его способностью ингибировать трансляцию,
как и исчерпывающий молекулярный механизм влияния Pdcd4 на активность АР-1,
остаются неизвестными.
В других исследованиях было установлено, что эффект Pdcd4 на AP-1-зависимую
транскрипцию определяется прямым взаимодействием Pdcd4 с c-Jun компонентом AP-1, в
результате чего блокируется фосфорилирование c-Jun протеинкиназой JNK [34]. Кроме
того, Pdcd4 предотвращает взаимодействие c-Jun с его ко-активатором р300, что также
негативно влияет на трансактивационный потенциал транскрипционного фактора [34].
Наконец, Вонг и его коллеги показали, что супрессия транскрипта Pdcd4 приводит к
увеличению уровня белка c-Jun в клетке, тем самым способствуя активации АР-1зависимой
транскрипции
экспериментальных
[33].
данных
Очевидные
могут
различия
определяться
и
даже
существованием
противоречия
в
альтернативных
механизмов влияния Pdcd4 на АР-1-зависимую транскрипцию, реализация которых может
зависеть от типа клеток. Косвенно это подтверждается способностью мутированных
версий Pdcd4, характеризующихся преимущественно цитоплазматической или ядерной
локализацией, эффективно ингибировать АР-1-зависимую транскрипцию. В случае с
мутантом Pdcd4, локализованном в ядре клетки, его влияние на активность АР-1 через
непосредственное ингибирование процесса трансляции исключена, что предполагает
существование других альтернативных механизмов ингибирования [27].
Рис. 3. Схема регуляции Pdcd4 за счет существования обратной связи между AP-1 и Pdcd4
при участии miR-21. ┬ снижение экспрессии; ↑ увеличение экспрессии,; Pdcd4 – транскрипт;
Pdcd4 – белок.
Опубликованные новые данные указывают на то, что в клетках гепатоклеточной
карциномы активация AP-1 может напрямую активировать транскрипцию микроРНК miR21, для которой, в свою очередь, мРНК Pdcd4 является одной из мишеней [35]. Таким
образом, показано существование обратной связи между AP-1 и Pdcd4 при участии miR-21
(Рис. 3). Помимо этого, выявлен еще один молекулярный механизм, в котором
ингибирование miR-21 в клетках гепатоклеточной карциномы приводит к повышению
уровня опухолевого супрессора PTEN [36]. Ченг и соавторы показали, что потеря PTEN
17
приводит к активации Akt, таким образом PTEN является регулятором Akt-сигнального
пути [37]. В то же время PTEN является мишенью miR-21 и, действуя на него, miR-21
приводит к активации Akt-сигнального пути [38,39]. Таким образом, miR-21 приводит к
супрессии не только Pdcd4, но и к супрессии PTEN, что в свою очередь приводит к
активации Akt-сигнального пути и тем самым еще больше усиливает супрессию Pdcd4.
Было показано, что в клетках рака простаты белок Pdcd4 взаимодействует с
транскрипционным фактором Twist1 и тем самым отрицательно регулирует мишень
Twist1, белок YB-1 (Y-box связывающий белок) [40]. Pdcd4 взаимодействует с ДНК
связывающим доменом Twist1, и тем самым ингибирует его ДНК связывающую
способность и экспрессию белка YB-1. Показано, что транскрипционный фактор Twist1
является компонентом нескольких сигнальных путей, которые контролируют клеточный
рост, апоптоз, дифференциацию и превращение дифференцированных эпителиальных
клеток в мезенхимальные, обладающих повышенной миграционной активностью [41].
Белок YB-1, в свою очередь, играет одну из ключевых ролей в пролиферации и
химиотерапевтической устойчивости раковых клеток [42]. Повышенное содержание YB-1
в опухолях молочной железы коррелирует с потерей Е-кадгерина и является признаком
высокой вероятности метастазирования и плохого прогноза лечения [43,44]. Таким
образом, за счет взаимодействия с Twist1, Pdcd4 негативно регулирует экспрессию белка
YB-1, который вовлечен в процесс злокачественного роста клеток и приобретения
опухолевыми клетками устойчивости к химиотерапии.
Известен еще один пример, когда Pdcd4 действует за счет прямого взаимодействия
с транскрипционным фактором. Так, было показано, что в клетках мультиформной
глиобластомы линий U251 и LN229, которые стабильно сверхэкспрессируют Pdcd4,
происходит ингибирование NF-κB-зависимой активации транскрипции [45]. Авторы
показали, что сверхэкспрессия Pdcd4 препятствует локализации белка p65 в ядре за счет
непосредственного взаимодействия Pdcd4 с белком p65 в цитоплазме, а для активации NFκB-зависимой транскрипции необходима аккумуляция всех субъединиц фактора NF-κB в
ядре. Таким образом, Pdcd4-регулируемая доступность белка p65 в ядре является
лимитирующим фактором для генов-мишеней NF-κB, в частности тех, которые
определяют инвазивные свойства клеток.
Как упоминалось выше, Pdcd4 способен взаимодействовать с eIF4A, что приводит к
ингибированию хеликазной активности последнего [10,16]. Кроме того, Pdcd4 также
способен взаимодействовать с eIF4G и предотвращать его связывание с eIF4A [17]. Оба
эти взаимодействия препятствуют формированию комплекса eIF4A с eIF4G и, как
следствие, приводят к ингибированию хеликазной активности eIF4A и ингибированию
18
трансляции
eIF4A-зависимой
нетранслируемыми
с
областями
транскриптов
(Рис.
4)
с
высокоструктурированными
[16].
Следует
отметить,
5'что
высокоструктурированные 5'-НТО характерны для транскриптов, кодирующих факторы
роста, протоонкогены, и белки, необходимые для клеточного роста [46]. Pdcd4-зависимое
ингибирование
трансляции
с
этих
транскриптов
может
являться
одним
из
механистических объяснений свойств Pdcd4 как супрессора опухолевого роста.
Рис. 4. Механизм ингибирования трансляции за счет связывания Pdcd4 с eIF4A и
eIF4G.
Далее, Бом и его коллеги обнаружили, что Pdcd4 с помощью N-концевого домена
может взаимодействовать с молекулами РНК. Авторы предположили, что благодаря этой
активности Pdcd4 может участвовать в регуляции ядерного метаболизма РНК, а так же
транспорта или процессинга РНК [22]. В подтверждение этого механизма трансляционной
супресии при помощи белка Pdcd4 были выявлены некоторые мРНК мишени Pdcd4. Так,
мРНК p53 является первой обнаруженной физиологической мишенью для Pdcd4 [47].
Показано, что Pdcd4 связывается мРНК p53 in vivo и супрессирует трансляцию с неё.
Эффект ингибирования трансляции зависит от способности Pdcd4 связываться с eIF4A и
опосредован 5`-НТО мРНК p53, которая формирует стабильные шпилечные структуры.
Показано, что обработка клеток ДНК-повреждающимим агентами (УФ или ингибитор
топоизомераз – этопозид) понижает экспрессию Pdcd4. Это указывает на то, что
трансляционная супрессия при помощи Pdcd4 играет роль в поддержании низкого уровня
p53 в неповрежденных клетках, и эта супрессия отменяется низким уровнем Pdcd4 после
повреждения ДНК.
Так же в качестве трансляционной мишени для Pdcd4 была идентифицирована
протоонкогенная мРНК гена с-myb [48]. Показано, что Pdcd4 супрессирует трансляцию
19
мРНК с-myb независимо от 5`-НТО, а супрессия зависит от взаимодействия с
последовательностью, локализованной в кодирующем участке с-myb. N-концевой РНКсвязывающий домен Pdcd4 опосредует связывание Pdcd4 со вторичной структурой РНК,
которая формируется Pdcd4-зависимым элементом в мРНК с-myb, что, по-видимому,
указывает на то, что Pdcd4 узнает не конкретную последовательность мРНК, а скорее
непосредственно вторичную структуру, образованную этой РНК. Недавно было показано,
что мРНК протоонкогена A-myb так же является мишенью для трансляционной супрессии
Pdcd4 [49]. Трансляционная супрессия в данном случае так же зависит от РНКсвязывающего домена на N-конце Pdcd4 и от последовательности, локализованной внутри
кодирующей последовательности мРНК A-myb. Полученные данные указывают на то, что
Pdcd4 вызывает ингибирование трансляции только тогда, когда непосредственно
происходит процесс трансляции с мРНК-мишени c-myb и A-myb. Таким образом, выявлен
новый механизм при котором Pdcd4 супрессирует трансляцию, ингибируя фазу
элонгации.
Так же есть данные о том, что Pdcd4 связывается с элементом внутренней посадки
рибосомы (IRES) в 5`-НТО мРНК белков XIAP и Bcl-xL и репрессирует трансляцию с этих
транскриптов за счет ингибирования формирования инициаторного 48S трансляционного
комплекса [50]. Это указывает на то, что прямое связывание Pdcd4 с IRES мешает
связыванию с рибосомой и препятствует инициации трансляции. Белок XIAP,
кодируемый Х хромосомой, является ингибитором белков апоптоза (Х-chromosome linked
IAP – inhibitor of apoptosis protein – XIAP). Белок XIAP содержт 3 N-концевых BIRдомена, которые специфически связываются с каспазами 3 и 7, блокируя их активные
сайты [51,52]. Белок Bcl-xL содержит трансмембранный домен, который позволяет ему
встраиваться во внешнюю мембрану митохондрий и, за счет поддержания мембранного
понтенциала припятствововать выходу цитохрома-С из митохондрий и, таким образом,
контролировать апоптоз. Bcl-xL подавляет апоптоз также за счет образования
гетеродимерных комплексов с белками Вах и/или Bak [52,53]. Образование таких
комплексов препятствует формированию димеров Bax/Bax или Bak/Bak, которые
запускают высвобождение цитохрома-С из митохондрий в цитозоль и активируют каспазу
3. Таким образом, деградация Pdcd4 вызывает увеличение уровня антиапоптотических
белков XAIP и Bcl-xL, что по-видимому, вносит вклад в устойчивость клеток к
химиотерапевтическим воздействиям.
Являясь ингибитором трансляции и оказывая влияние на процессы транскрипции,
изменения в уровне Pdcd4 должны, по всей видимости, приводить к изменениям в
продукции белков в клетке. И действительно, изменения в экспрессии Pdcd4 приводили в
20
различных системах к изменениям в содержании белков, значимых для прогрессии
опухолей. В частности, описано влияние Pdcd4 на экспрессию тканевого ингибитора
металлопротеиназ-2 (TIMP-2), белка Daxx, урокиназного рецептора u-PAR, dUTPазы,
молекулы адгезии Е-кадгерина, белков-регуляторов клеточного цикла – PCNA, циклина
D1, CDK4, p27, CDK1, p21WAF/Cip1, цитокинов-регуляторов ангиогенеза – фактора роста
эндотелия сосудов и фактора роста фибробластов-2 [6,31–33,54–58]. Однако спектр
белков, экспрессия которых регулируется Pdcd4, может существенно варьировать в
различных типах клеток [57].
4.2. Регуляция активности Pdcd4
Регуляция активности Pdcd4 осуществляется на различных этапах – от собственно
регуляции физиологической активности до его клеточной локализации и уровня белка в
клетке.
4.2.1. Регуляция транскрипции Pdcd4
Как упоминалось выше, во многих случаях наблюдается супрессия Pdcd4 в
опухолях различного происхождения, причем часто происходит снижение уровня
транскрипта Pdcd4. Одной из причин снижения уровней транскриптов генов в опухолевых
клетках является аномальное метилирование областей, ответственных за регуляцию их
транскрипции, что приводит к ее ингибированию.
Аномальное метилирование CpG-островка в 5'-области гена Pdcd4, сопряженное с
ингибированием транскрипции, часто наблюдалось в глиомах и, по мнению авторов
исследования, является основной причиной снижения уровня мРНК Pdcd4 в опухолях
этого типа [59]. Значимость метилирования в супрессии Pdcd4 косвенно подтверждается и
участием ДНК-метилтрансферазы 1 в снижении уровня мРНК Pdcd4 в клетках
гепатокарциномы SMMC-7721 [60]. Инактивация ДНК метилтрансферазы 1 в клетках
линии гепатоклеточной карциномы приводила к деметилированию ДНК и индукции
Pdcd4. Но оказалось, что избыточное метилирование не является универсальным
механизмом, ответственным за снижение уровня Pdcd4. Так, в ряде опухолевых
клеточных линиях молочной железы не наблюдалось изменения уровня мРНК Pdcd4 при
их обработке деметилирующим агентом 5-деокси-азацитидином [61], а в клетках
гепатоклеточной карциномы индукция экспрессии ДНК-метилтрансферазы 1 не изменила
статуса метилирования промотора гена Pdcd4 [62]. Таким образом, вероятно, что, наряду с
изменением статуса метилирования, супрессия уровня мРНК Pdcd4 может определяться и
21
другими
механизмами,
как
на
уровне
регуляции
транскрипции,
так
и
пост-
транскрипционно. Действительно, по данным Франкеля и соавторов транскрипт Pdcd4
подвержен пост-транскрипционной регуляции посредством онкогенной микроРНК miR-21
в клетках линии MCF-7, обусловленной сайтом-мишенью для miR-21 в 3'-НТО
транскрипта Pdcd4 [63].
4.2.2. Регуляция трансляции Pdcd4
МикроРНК являются природными некодирующими РНК, которые контролируют
экспрессию генов посредством специфических сайтов-мишеней в 3`-НТО, что вызывает
репрессию трансляции и/или деградацию транскрипта [64,65]. МикроРНК обладают
важными регуляторными функциями в процессах дифференцировки, пролиферации и
ингибирования апоптоза [66]. Есть данные об аберрантной экспрессии многочисленных
микроРНК, например, miR-21, 17-92, -15, -16, -14, let-7, miR-182, miR-183, miR-499-5p и
ряда других, в процессе роста опухолей, канцерогенезе, в чувствительности к
химиотерапии при различных заболеваниях [64,65,67–71]. Была описана сверхэкспрессия
miR-21 в различных карциномах, в частности при глиобластомах или при раке легкого
[64,65]. Изначально мишени miR-21, связанные с раковыми заболеваниями, включали в
себя PTEN и тропомиозин 1 (TPM1), теперь дополняются новыми молекулярными
мишенями и, следовательно, добавляются и функции miR-21 в контексте процессов
прогрессии опухолей и метастазирования [67,72]. В частности, описано участие
микроРНК miR-21, опосредованное сайтом-мишенью в 3`-НТО, в регуляции Pdcd4 [63,73–
75]. Более того, была продемонстрирована функциональная значимость miR-21-зависимой
супрессии Pdcd4 и ее влияние на инвазивные и метастатические свойства опухолевых
клеток, их пролиферацию и трансформацию [63,73–75]. В работе Френкеля и соавторов
miR-21 непосредственно вызывала снижение уровня мРНК Pdcd4 в клетках MCF-7 [63].
Однако известно, что микроРНК могут оказывать влияние на трансляцию, не вызывая
снижения уровня транскрипта, и именно этот механизм реализуется в клетках линий
MDA-MB-231 и Colo206f, где miR-21-зависимое снижение уровня белка Pdcd4 не
сопровождалось соответствующим снижением уровня мРНК [73,75,76].
Биоинформатические исследования выявили консервативный сайт-мишень для
miR-21 в 3`-НТО гена Pdcd4 в районе 228-249 нуклеотидов [73]. В 10 различных линиях
рака кишечника наблюдалась обратная зависимость miR-21 и белка Pdcd4. Трансфекция
линии клеток Colo206f miR-21 значительно снижала экспрессию люциферазного
репортерного гена содержащего, 3`-НТО гена Pdcd4, тогда как трансфекция клеток линии
RCO анти-miR-21 повысило активность этой конструкции.
22
Таким образом, miR-21 контролирует экспрессию гена Pdcd4, оказывая влияние на
трансляцию и деградацию таргетной мРНК Pdcd4. До недавнего времени связь между
этими процессами оставалась неясной, но к настоящему моменту показано, что процесс
ингибирования трансляции и деградация мРНК являются связанными [77]. Авторы
показали, что микроРНК-зависимое ингибирование трансляции является первичным
процессом, за которым следует последующая дестабилизация мРНК. Такая линейная
модель микроРНК-зависимой регуляции генов, вероятно, справедлива и для Pdcd4.
Кроме того было показано, что, помимо miR-21, Pdcd4 является мишенью и для
других проонкогенных микроРНК, таких как miR-182, miR-183 и miR-499-5p [68–71]. В
одной из последних публикаций показано, что повышенное содержание микроРНК miR499 в неонатальных крысиных кардиомиоцитах защищает их от H2O2-индуцированного
апоптоза [78]. Авторы показали, что эффект ингибирования происходит за счет
супрессирующего действия микроРНК miR-499 на проапоптотические гены, в частности,
за счет ингибирования транскрипта Pdcd4. На примере раковых клеток яичника человека,
было показано, что Pdcd4 также является мишенью для микроРНК miR-106a [79].
Рис. 5. Модель SRSF3-зависимой пост транскрипционной регуляции Pdcd4.
Кроме
того,
недавно
был
выявлен
альтернативный
механизм
пост-
транскрипционной регуляции Pdcd4. Было показано, что фактор сплайсинга SRSF3
подавляет трансляцию Pdcd4 за счет связывания с 5`-НТО мРНК Pdcd4 [80].
Серин/аргинин-богатый фактор сплайсинга 3 (SRSF3) принадлежит к семейству РНКсвязывающих белков, которые играют роль в сплайсинге и альтернативном сплайсинге
пре-мРНК. Была показана и про-онкогенная роль SRSF3 [81,82]. Впервые эта роль SRSF3
23
нашла подтверждение, когда снижение уровня SRSF3, вызванное РНК-интерференцией,
привело к антипролиферативному эффекту, клеточному старению и, в конечном счете, к
апоптотической клеточной смерти [81,82]. Помимо этого есть данные, указывающие на то,
что при раке почки экспрессия SRSF3 влияет на экспрессию многих онкогенов и генов –
супрессоров опухолевого роста [83]. Ким с соавторами показали, что SRSF3 регулирует не
только сплайсинг, но и трансляцию с транскрипта Pdcd4 [80]. В клетках линии U2OS,
SW480 и HEK-293, нокаутных по SRSF3, был повышен уровень изоформы 2 мРНК Pdcd4,
а так же был повышен уровень белка обоих изоформ Pdcd4. То, что количество белка
Pdcd4 изоформы 1 повышается, а уровень мРНК изоформы 1 остается при этом
неизменным, может объясняться ролью SRSF3 в регуляции трансляции цитозольной
мРНК Pdcd4 или ее стабильности. Интересно отметить, что нокаут SRSF3 в клетках линии
HeLa не приводил к повышению уровня белка Pdcd4, что указывает на то, что механизм
пост-трансляционной регуляции Pdcd4 может различаться в зависимости от типа клеток.
Сверхэкспрессия SRSF3, наоборот, способствовала перемещению мРНК Pdcd4 в
нетранслируемые рибосомные фракции. Помимо этого, падение уровня SRSF3 привело к
сильному повышению уровня апоптоза, связанного с повышением уровня белка Pdcd4
(Рис. 5).
4.2.3. Регуляция стабильности белка Pdcd4
Помимо пост-транскрипционной регуляции уровня продукции белка Pdcd4, сам
белок Pdcd4 подвержен регулируемой протеасомной деградации. Впервые Pdcd4 был
описан как мишень для протеасомной деградации в работе Доррелло и соавторов [28].
Авторы показали, что при стимуляции клеток в состоянии покоя митогенами наблюдается
значительная дестабилизация и деградация белка Pdcd4. Деградация Pdcd4 регулируется
активацией Akt/mTOR/S6K1-сигнального пути. А именно, S6 киназа 1 фосфорилирует
Pdcd4 по остатку серина-67. Это создает пермессивные условия для дальнейшего
фосфорилирования Pdcd4 по остаткам серина 71 и 76 (S6 киназой 1 или другими
протеинкиназами), что приводит к формированию сайта связывания βTRCP (βTRCPtrancducin
repeat-containing
protein),
субъединицы
Е3
убиквитин-лигазы
SCF,
последующему убиквитинилированию и деградации Pdcd4 (Рис. 6).
Интересно, что серин-67 также может быть фосфорилирован и протеинкиназой Akt
[27]. Таким образом, активация Akt стимулирует деградацию Pdcd4 как через
непосредственное фосфорилирование серина-67, так и опосредованно через эффекторный
Akt/mTOR/S6K1-сигнальный путь. Akt-зависимая деградация Pdcd4 действительно может
быть существенной для возникновения и прогрессии опухолей. Об этом свидетельствует
24
наблюдаемая связь между высокой активностью Akt и низким уровнем Pdcd4 в опухолях
кишечника,
для
которых
низкий
уровень
белка
Pdcd4
является
независимым
прогностическим фактором и коррелирует с прогрессией новообразования [84]. Однако,
такая интерпретация факта корреляции высокой активности Akt и низкого уровня Pdcd4 в
опухолях кишечника является спорной, так как в действительности может быть вторичной
[36,37,39]. Так, было показано, что ингибирование miR-21 в клетках гепатоклеточной
карциномы приводит к повышению уровня опухолевого супрессора PTEN, который
является ингибитором Akt. Таким образом miR-21, действуя на PTEN, приводит к
активации Akt-сигнального пути, и тем самым вносит вклад в супрессию Pdcd4.
Рис. 6. Пост-трансляционная Akt/mTOR/S6K1-зависимая протеолитическая деградация
белка Pdcd4. Субстрат mTOR, S6 киназа 1, фосфорилирует Pdcd4 по остатку серина-67. Это
создает условия для дальнейшего фосфорилирования Pdcd4 по остаткам серина 71 и 76, что
приводит к появлению сайта связывания βTRCP, субъединицы убиквитин-лигазы, и
последующему убиквитинилированию и деградации Pdcd4.
Установлено, что уровень белка Pdcd4 снижен в папилломах у мыши, снижение
уровня Pdcd4 сопровождается активацией S6 киназы 1 или Akt, и снижение уровня Pdcd4
увеличивает чувствительность к экспериментальному канцерогенезу кожи [29]. Наконец,
в BCR-ABL-трансформированных клетках наблюдается Akt/mTOR/S6K1-зависимая
супрессия белка Pdcd4 [85].
В одной из последних работ было показано, что в клетках гепатоклеточной
карциномы линии Huh7 ингибитор mTOR рапамицин повышает уровень мРНК Pdcd4 [86].
Таким образом, потенциально Akt/mTOR/S6K1-сигнальный путь может контролировать
как деградацию белка Pdcd4, так и транскрипцию гена Pdcd4.
Помимо вышеописанных, есть данные о механизмах регуляции уровня белка Pdcd4
под воздействием воспалительных процессов микроокружения опухоли [87]. Форболофый
эфир
TPA
человеческих
(12-O-тетра-деканоилфорбол-13-ацетат)
моноцитов
линии
U937,
индуцирует
увеличивает
дифференцировку
экспрессию
и
секрецию
воспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухолей α, IL-6 и IL-8.
25
Воздействие кондиционированной среды активированных макрофагов заметно снижало
экспрессию белка Pdcd4 во многих опухолевых клетках, как и непрямое сокультивирование с макрофагами, полученными из активированных U937 моноцитов.
Падение уровня белка Pdcd4 было приписано усиленной протеасомной деградации,
снижающей время жизни белка Pdcd4. Для протеасомной деградации необходима
активация PI3K/mTOR сигнального пути. Так как для деградации Pdcd4 было достаточно
кондиционированной среды макрофагов, падение уровня Pdcd4 было интерпретировано
как косвенный односторонний эффект макрофагов на опухолевые клетки. Эксперименты
in vivo, выполненные на мышах, язвенный колит у которых был вызван при помощи
декстран сульфата натрия, показали, что уровень белка Pdcd4 был так же понижен в
клетках толстой кишки, полученном от мышей после воздействия на них декстран
сульфата, по сравнению с клетками толстой кишки контрольной группы мышей. Таким
образом, было продемонстрировано существование PI3K/mTOR-зависимой протеасомной
деградации белка Pdcd4 в опухолевых клетках в результате воздействия воспалительных
процессов микроокружения опухоли [87]. Следовательно, стабилизация белка Pdcd4 могла
бы стать новой многообещающей терапевтической стратегией борьбы с последствиями
воздействия про-воспалительного микроокружения на канцерогенез.
Известно,
что
компоненты
воспалительного
процесса,
включающие
про-
воспалительные цитокины и химически активные формы кислорода, помимо всего
прочего, стимулируют развитие опухоли [88,89]. Были получены данные об активации
miR-21 под воздействием воспалительных процессов, таких как легочное воспаление у
мышей, вызванное липополисахаридами [90]. Это привело к предположению о роли miR21 как о связующем звене между раковой опухолью и воспалительным процессом. Было
показано, что липополисахариды (LPS), являющиеся бактериальными эндотоксинами,
индуцируют экспрессию miR-21, что приводит к супрессии Pdcd4. Супрессия белка Pdcd4
происходит в результате и miR-21 зависимого ингибирования трансляции Pdcd4, и
протеасома-зависимой деградации Pdcd4 при участии Akt-mTOR сигнального пути
[28,29]. Кроме того, как уже было сказано, PTEN является мишенью miR-21, и, действуя
на него прямо или косвенно, miR-21 приводит к активации Akt-сигнального пути [39], а,
следовательно, приводит к Akt-зависимой деградации белка Pdcd4. Таким образом, Pdcd4
является одной из мишеней в клетках в процессе связанного с воспалением канцерогенеза.
Помимо этого, Pdcd4 может служить полезным прогностическим маркером, так как
наблюдается обратная корреляция между экспрессией Pdcd4 и уровнем про-онкогенной
микроРНК miR-21 [74,84,91,92].
26
4.2.4. Внутриклеточная локализация Pdcd4
Литературные
данные,
касающиеся
внутриклеточной
локализации
Pdcd4,
противоречивы и разнообразны [93,94]. Одни данные указывают на ядерную локализацию
в нормальной ткани и цитоплазматическую в раковой ткани, тогда как другие говорят об
обратном распределении [3,61,84,95,96]. Сегодня известно, что Pdcd4 перемещается из
ядра в цитоплазму и наоборот [22]. В клетках острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) было
обнаружено повышение уровня Pdcd4 во время дифференцировки гранулоцитов, и такое
повышение уровня сопровождалось ядерной транслокацией белка [97]. Вероятно,
противоречивые данные связаны со специфическим действием Pdcd4 в разных клетках
[57].
Однако накопленные данные все же позволяют предположить, что активность
Pdcd4 регулируется через контроль внутриклеточной локализации белка. Как было
отмечено выше, Pdcd4 был обнаружен как транскрипт, кодирующий ядерный антиген Pr28 в пролиферирующих клетках [3]. Синтез этого антигена наблюдался в период поздней
G1-фазы клеточного цикла. Возможно, уровень и внутриклеточная локализация Pdcd4
изменяются в течение клеточного цикла, и, более того, могут различаться в зависимости
от типа клеток. Для клеток эпителия кишечника была показана статистически значимая
корреляция между прогрессией опухоли и транслокацией Pdcd4 в цитоплазму [84].
Отмечена аккумуляция Pdcd4 в ядрах клеток Huh7 при индукции их апоптотической
гибели [96]. В ряде опухолей и опухолевых клеточных линиях наблюдается полная или
частичная локализация Pdcd4 в ядре [3,98]. В то же время, в устойчивых к
злокачественной
трансформации
клетках
линии
JB6(P-)
Pdcd4
локализован
исключительно в цитоплазме [17]. И, наконец, в фибробластах линии QT6 Pdcd4
обнаруживается в ядре при их пролиферации и транслоцируется в цитоплазму при
удалении ростовых факторов из среды [22].
Таким образом, хотя и прослеживается связь внутриклеточной локализации и
функциональной активности Pdcd4 как супрессора опухолевого роста, все же последняя
не может быть однозначно ассоциирована с его ядерной локализацией.
Внутриклеточная локализация Pdcd4 определяется двумя сигналами ядерного
экспорта NES1 (a.о. 241-251) и NES2 (a.о. 182-192) и двумя потенциальными сигналами
ядерной локализации вблизи N- и C-конца, которые и ответственны за транслокацию
Pdcd4 из ядра в цитоплазму и наоборот [22]. Ядерная локализация Pdcd4 регулируется
фосфорилированием. Так, замена серина-457 на аланин приводит к тому, что белок Pdcd4
при нормальных условиях роста клеток локализуется исключительно в цитоплазме [27].
27
Таким образом, фосфорилирование Pdcd4 по серину-457, осуществляемое протеинкиназой
Akt, отвечает за его ядерную локализацию. Интересно отметить, что мутант Pdcd4 с
цитоплазматической локализацией сохранял способность ингибировать АР-1-зависимую
транскрипцию, считающейся основной мишенью в действии Pdcd4 как супрессора
опухолевого роста. Это указывает на то, что Pdcd4 действует как в цитоплазме, ингибируя
трансляцию, так и в ядре, где он, видимо, как следует из полученных данных, может
ингибировать c-Jun-зависимую трансактивацию AP-1 [27].
4.2.5. Регуляция активности Pdcd4
Помимо
влияния
Akt-зависимого
фосфорилирования
на
внутриклеточную
локализацию Pdcd4 было сделано предположение, что фосфорилирование Pdcd4 может
регулировать и его активность. Как уже было отмечено выше, белок Pdcd4 содержит
множественные
сайты
возможного
фосфорилирования.
Фосфорилирование
Pdcd4
протеинкиназой Akt и S6K1 ведет его к протеасомной деградации. Супрессия
протеинкиназ Akt и S6K1 флувастатином, эффективным индуктором апоптоза и
супрессором пролиферации в клеток почечной карциномы, приводила к повышению
уровня экспрессии Pdcd4 [99]. Замена серинов-67 и -457, которые являются субстратами
для протеинкиназы Akt, на их нефосфорилируемые аналоги, аланины, усиливала
способность Pdcd4 ингибировать AP-1-зависимую транскрипцию. Этот факт позволил
предположить, что фосфорилирование Pdcd4 по серинам-67 и 457 ингибирует его
функции как репрессора AP-1-зависимой транскрипции [27]. Как было уже отмечено
фосфорилирование Pdcd4 по серину-67 приводит к его убиквитин-зависимой деградации,
а замена серина-67 на аланин стабилизирует белок [28]. Фосфорилирование Pdcd4 по
серину-457 индуцирует ядерную транслокацию белка, а при замене серина-457 на аланин
белок Pdcd4 локализуется исключительно в цитоплазме. Следует подчеркнуть, что замена
серина-457 на аланин не влияет на деградацию белка.
Как это было показано в работе Паламарчук и соавторов, эффект Pdcd4 на АР-1зависимую транскрипцию носит дозозависимый характер, и этот эффект более выражен у
мутантного по серинам-67 и -457 варианта Pdcd4 по сравнению с диким вариантом. Это
может быть объяснено увеличением уровня продукции мутантов за счет их более высокой
стабильности [27,30].
Было показано, что опухолевый индуктор TPA понижает уровень белка Pdcd4
[100]. Этот эффект был индуцирован PKC (протеинкиназа С/protein kinase C)-зависимой
активацией
PI3K-Akt-mTOR-p70S6K-сигнального
пути,
что
приводит
к
фосфорилированию Pdcd4 и его последующей протеасомной деградации. Активация PKC
28
является одним из самых ранних событий в каскаде, который контролирует множество
клеточных
ответов
[101,102].
Классические
PKC
являются кальций-зависимыми
ферментами благодаря наличию у них кальций-связывающего С2 домена, а так же за счет
регуляторного цистеин-богатого С1 домена, который активируется фосфатидилсерином,
диацилглицеролом, форболовыми эфирами (TPA, PMA). Активация Akt и S6K1 выступает
в роли медиатора деградации Pdcd4, наряду с MEK-ERK сигнальным путем. Активация
MEK-ERK сигнального
пути
при
помощи
TPA необходима для поддержания
убиквитинилирования Pdcd4, направляя убиквитинилированный Pdcd4 напрямую в
протеасомы
или
через
поддержание
конформационных
изменений
в
Pdcd4-
убиквитинилированной системе, усиливая доступность убиквитинилированного Pdcd4 для
протеасомной деградации. Уровень белка Pdcd4 является решающим для канцерогенеза.
Так, низкий уровень Pdcd4, по-видимому, ведет к большей вероятности развития опухоли,
тогда как его высокий уровень является защитным [103].
Рис. 7. Механизмы супрессии Pdcd4. Транскрипция гена Pdcd4 может супрессироваться в
результате аномального метилирования в области промотора. Таргетная мРНК Pdcd4 может
деградировать посредством микроРНК miR-21, miR-182, miR-183 и miR-499-5p. Эффективность
трансляции может ингибироваться посредством микроРНК, а так же при помощи фактора
сплайсинга SRSF3. Белок Pdcd4 в клетке подвержен фосфорилированию (Р) протеинкиназами Akt
и S6K1. Фосфорилированный белок Pdcd4 подвергается убиквитинилированию (Ubi) и
последующей деградации. Кроме того, активность белка Pdcd4 может быть изменена за счет
метилирования (CH3) аргинина в позиции 110 метилтрансферазой PRMT5.
Тем не менее, так как существуют противоречивые данные о специфическом
действии Pdcd4 в разных клетках, его роль при апотозе и в качестве опухолевого
супрессора может быть ограничена для определенных клеточных линий [57].
Значительное число опухолей характеризуются высоким уровнем Pdcd4 и, тем не менее,
такие больные имеют низкую выживаемость, что, возможно, говорит о том, что
29
сигнальные пути, активированные в раковой опухоли, могут изменять активность Pdcd4.
В частности, при раке молочной железы было показано, что PRMT5 (protein arginine
methyltransferase 5, белок аргинин метилтрансфераза 5) изменяет функции Pdcd4 [25].
Показано,
что
коэкспрессия
Pdcd4
и
PRMT5
в
клетках
линии
человеческой
аденокарциномы молочной железы MCF7e усиливала рост клеток. Кроме того, авторы
показали, что рост клеток зависит, как от каталитической активности PRMT5, так и от
присутствия интактных сайтов метилирования в N-концевой части белка Pdcd4.
Установлено, PRMT5 посттрансляционно присоединяет метильную группу к концевым
азотам остатка аргинина в позиции 110 белка Pdcd4, что изменяет функции Pdcd4 и
активирует опухолевый рост.
Последние данные указывают на то, что Pdcd4 метилируется при недостатке
питательных веществ [104]. Авторы на примере клеток аденокарциномы молочной
железы человека линии MCF7 показали, что в условии недостатка питательных веществ
метилированный Pdcd4 способствует росту раковых клеток. Метилирование Pdcd4 в
условиях недостатка питательных вещест приводит к локализации белка Pdcd4
преимущественно в цитоплазме, усиливает его способность связываться с eIF4A, и делает
это взаимодействие более сильным. После восстановления содержания питательных
веществ уровень метилированного Pdcd4 регулируется фосфорилированием, которое,
контролирует локализацию метилированного белка Pdcd4 и его стабильность. Ранее было
показано, что во взаимодействии с eIF4A принимают участие два MA-3 домена белка
Pdcd4, а N-концевой домен является несущественным в этом взаимодействии [16].
Последние же данные указывают на то, что метилирование N-концевого домена, а именно
аргинина-110, либо усиливают связь между MA-3 доменом Pdcd4 и eIF4A, либо делает
MA-3 домен Pdcd4 более доступным для взаимодействия с eIF4A. Для повышения
жизнеспособности клеток в период недостатка питательных веществ, для формирования
более сильного взаимодействия Pdcd4 c eIF4A требуется как два MA-3 домена, так и
метилирование аргинина 110 белка Pdcd4. Метаболический стресс возникает в ходе
поздней прогрессии опухоли, когда в опухоли формируютсят участки, труднодоступные
для доставки питательных веществ. Так как метилирование Pdcd4 происходит во время
недостатка
питательных
веществ,
авторы
исследования
предполагают,
что
метилированный Pdcd4 играет роль именно на поздней стадии прогрессии опухоли. На
ранних этапах прогрессии опухоли Pdcd4 играет роль супрессора опухоли, так как в это
время ингибирование трансляции предотвращает неопластическую трансформацию. А в
ходе поздней прогрессии опухоли, роль метилирования Pdcd4 может заключаться в резкой
модуляции трансляции, позволяя опухолевым клеткам выжить в условиях недостатка
30
питательных веществ, что в конечном счете будет способствовать росту опухолевых
клеток
и
приведет
к
распространениню
опухоли.
Авторы
предполагают,
что
применительно к канцерогенезу метилирование Pdcd4 в клетках, находящихся в условиях
недостатка питательных веществ, наделяет преимуществом растущую опухоль. Таким
образом, полученные результаты, кажущиеся парадоксальными, указывают на важность
клеточного контекста для выполнения Pdcd4 своих функций.
Таким образом, в опухолевых клетках могут быть реализованы различные
механизмы, оказывающие влияние на Pdcd4, затрагивающие транскрипцию гена,
стабильность мРНК, эффективность трансляции, стабильность белка и его активность
(Рис. 7).
4.3. Характер экспрессии Pdcd4
Транскрипт Pdcd4 экспрессируется повсеместно в нормальных тканях. Результаты
Нозерн-гибридизации РНК нормальных тканей мышей показали, что наиболее высокий
уровень экспрессии Pdcd4 в тканях печени, затем по убыванию следуют яичники, легкие,
мозг, почки и селезенка [11,93]. Совсем низкие уровни Pdcd4 наблюдались в скелетных
мышцах и мышцах сердца.
Экспрессия Pdcd4 изменяется под действием различных цитокинов. Понижение
экспрессии наблюдалось в человеческих NK-клетках и T-клетках под действием
интерлейкина (IL) 2 и IL-15, а под действием IL-12 наблюдалось повышение экспрессии
[9].
Уровень транскрипта Pdcd4 повышен в ооцитах и в эмбрионах мыши на стадии
двух клеток, что указывает на возможно важную роль белка Pdcd4 в эмбриогенезе [105].
Часто
наблюдаемая
супрессия
экпрессии
Pdcd4
в
опухолях
различного
происхождения вызвала значительный интерес к нему как к супрессору опухолевого
роста. Снижение уровня белка Pdcd4 отмечалось при гепатоклеточных карциномах и в
различных опухолях кожи [95,96]. Подавление транскрипции Pdcd4 наблюдалось в
клеточных линиях опухолей легких и первичных опухолях этой ткани, в гепатоклеточных
карциномах, глиомах [96,106–109]. Подавление транскрипции Pdcd4 не наблюдалось при
снижении уровня белка Pdcd4 при раке кишечника, а при плоскоклеточном раке легких,
наоборот, подавление транскрипции Pdcd4 не всегда сопровождалось супрессией уровня
белка [73,84,108]. Однако в ряде случаев было отмечено усиление транскрипции Pdcd4 в
опухолях. Например, трансформация T-антигеном нормальных фибробластов MRC5
сопровождалась увеличением уровня транскрипта Pdcd4 [3]. Повышенный уровень Pdcd4
наблюдался так же в клетках NK/T лимфом, возникших в результате инфицирования
31
вирусом Эпштейна-Барра, в сравнении с клетками, полученными из периферической
крови пациентов у которых инфицирование вирусом Эпштейна-Барра не привело к
развитию лимфомы [110].
Pdcd4 является прямой мишенью для транскрипционной активации онкогеном vmyb вируса миелобластоза птиц [8,111,112]. Ретровирусный онкоген v-myb, кодирует
транскрипционный фактор v-Myb, который ответственен за способность вируса
миелобластоза птиц трансформировать миеломоноцитные клетки. Так, направленное
разрушение прото-онкогена c-myb, являющегося клеточным аналогом ретровирусного
онкогена v-myb, понижало уровень транскрипта Pdcd4 в куриной клеточной линии DT40
[112]. Таким образом, получается, что онкоген v-myb и протоонкоген c-myb индуцируют
экспрессию гена Pdcd4, который, в свою очередь, является опухолевым супрессором. Как
было сказано выше, Pdcd4 супрессирует трансляцию мРНК c-myb за счет взаимодействия
с
последовательностью,
локализованной
в
кодирующем
участке
с-myb
[48].
Следовательно, существует обратная связь в которой Pdcd4 ограничивает активность cMyb за счет супрессии синтеза белка. Такой механизм обратной связи может иметь
значение для контроля пролиферативно-стимулирующей активности c-Myb. Кроме того
он согласуется с функцией Pdcd4 в качестве опухолевого супрессора. Это может быть
значимым, например, при раке кишечника, где пониженный уровень экспрессии Pdcd4 и
повышенный уровень экспрессии с-myb часто ассоциированы с более злокачественными
случаями [84,113].
Иммуногистологические исследования показали, что повышенный уровень белка
Pdcd4 наблюдается в опухолях мочевого пузыря и молочной железы [3]. Низкий уровень
экспрессии белка Pdcd4 тесно взаимосвязан с развитием и прогрессией плоскоклеточной
карциномы гортани, так как путем иммуногистохимического окрашивания было
установлено, что в тканях плоскоклеточной карциномы гортани уровень белка Pdcd4 был
значительно ниже, чем его уровень в нормальных тканях слизистой оболочки гортани.
Таким образом, белок Pdcd4, возможно, является новым молекулярным маркером для
прогнозирования развития плоскоклеточной карциномы гортани [114].
Суммируя, известные данные указывают на то, что изменение уровня экспрессии
Pdcd4 в процессе трансформации клеток и прогрессии опухолевого фенотипа, а также
влияние Pdcd4 на пролиферативную активность клеток и участие Pdcd4 в процессе
апоптоза, не носят универсального характера, а варьируют в зависимости от типа клеток.
Однако, несмотря на существующую вариабельность, экспериментальные данные все же
позволяют связать потерю экспрессии Pdcd4 с процессом приобретения клетками свойств
опухолевых и/или прогрессией опухолей, что более подробно описано ниже.
32
4.4. Функции Pdcd4
4.4.1. Pdcd4, апоптоз и контроль пролиферации клеток
Pdcd4 первоначально был изолирован как транскрипт, повышение уровня которого
наблюдалось при апоптотической гибели клеток. Ониши с соавторами клонировали Pdcd4
как транскрипт, уровень которого снижался при обработке клеток ингибиторами
топоизомеразы, вызывающими апоптотическую клеточную смерть [5–7]. Этот факт
является первым указанием на возможную вариабельность регуляции экспрессии и
функций Pdcd4 в зависимости от внешних физиологических сигналов, так и от
конкретных внутриклеточных процессов и типа клеток. Дальнейшие исследования
взаимосвязи Pdcd4 и процесса апоптоза подтвердили это предположение.
В экспериментах in vivo было показано, что повышенный уровень экспрессии
Pdcd4 приводит к индукции апоптоза в клетках линии гепатокарциномы Huh7 и карцином
молочной железы человека MCF7, T47D и MDA-MB-231 [96,98]. А в клетках линий Bon-1,
HEK293, RKO, JB6 (Р+), U2OS, лимфоидных клетках и кератиноцитах повышенный
уровень Pdcd4, напротив, не индуцировал апоптоз клеток [5,30,34,55,103,115,116].
Было
установлено,
что
Pdcd4
играет
существенную
роль
при
TGFβ1-
индуцированной гибели клеток гепатокарциномы Huh7 [96]. Авторы показали, что
трансформирующий фактор роста β1 (TGFβ1) вызывает увеличение экспрессии Pdcd4 и
индуцирует апоптоз в клетках гепатокарциномы Huh7. TGFβ является плейотропным
цитокином, контролирующим различные свойства клеток организма, такие как
пролиферация, подвижность, адгезия и дифференцировка. Генетические изменения
компонентов
TGFβ
сигнального
каскада
описаны
для
опухолей
различного
происхождения, но его роль в канцерогенезе противоречива, так как TGFβ в зависимости
от клеточного контекста может проявлять либо свойства опухолевого супрессора, либо
способствовать прогрессии опухоли. Считается, что в нормальных клетках и на ранних
этапах развития эпителиальных опухолей TGFβ подавляет пролиферацию и индуцирует
апоптоз, однако на более поздних стадиях прогрессии он индуцирует эпителиальномезенхимальный переход, усиливает инвазию и метастазирование [117].
Был показан новый механизм регуляции Pdcd4 TGFβ-сигнальным путем, хотя и с
противоположным эффектом, в гладкомышечных клетках сосудов (Рис. 8). Этот механизм
состоит в TGFβ-индуцированном быстром росте количества зрелых miR-21, которые, как
сейчас известно, супрессируют Pdcd4 [118]. В клетках рака кишечника сверхэкспрессия
miR-21 приводила к появлению свойств, присущих стволовым клеткам, за счет падения
уровня Pdcd4, а так же за счет активации Wnt/β-катенин- сигнального пути,
33
обусловленной падением уровня TGFβR2 (рецептор 2 трансформирующего фактора роста
бета) [119]. В другой работе авторы показали, что клетки гепатоклеточной карциномы
Huh7, трансфицированные микроРНК miR-183, мишенью которой так же является Pdcd4,
становились устойчивыми к апоптозу, индуцированному TGFβ [71].
Рис. 8. Различные механизмы регуляции апоптоза Pdcd4. ┬ снижение экспрессии, ↑
увеличение экспрессии, | медиатор действия.
Pdcd4 вовлечен в повышение чувствительности клеток рака желудка к апоптозу,
индуцированному цитокином TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) [120]. TRAIL
– цитокин семейства факторов некроза опухолей (TNF), является многообещающим
противоопухолевым агентом, вызывающим апоптоз раковых клеток и оказывающий
минимальный эффект на здоровые клетки [121]. TRAIL индуцирует апоптоз, связываясь
со своими родственными рецепторами TRAIL-R1 и TRAIL-R2. Однако некоторые раковые
клетки оказались только частично чувствительными или совсем нечувствительными к
действию TRAIL, несмотря на наличие на их поверхности TRAIL-рецепторов. Клетки,
нокаутные по Pdcd4, теряли чувствительность к TRAIL-индуцированному апоптозу. Так
же было показано, что Pdcd4 способен супрессировать экспрессию ингибитора каспаз
белка FLIP (FLICE-inhibitory protein), являющегося негативным регулятором апоптоза.
Есть данные, что Pdcd4 может выполнять функцию супрессора апоптоза за счет
ингибирования трансляции с мРНК прокаспазы-3 [122]. Авторами показано, что потеря
Pdcd4 из-за специфической РНК-интерференции приводила к повышению уровня
экспрессии прокаспазы-3, её дальнейшей активации, расщеплению прокаспазой-3
полимеразы PARP (поли(АДФ-рибоза)-полимераза), что в дальнейшем приводило к
повышению чувствительности клеток к апоптозу. Таким образом, был открыт
принципиально новый механизм действия Pdcd4 в качестве регулятора апоптоза.
Далее было продемонстрировано, что в дрожжевой двугибридной системе Pdcd4
взаимодействует с одним из доменов протеинкиназы US3 [123]. Протеинкиназа вируса
простого герпеса 1 – US3, играет ключевую роль в блокировании апоптоза,
34
индуцированного продуктами вирусных генов или экзогенными агентами. Было показано,
что в инфицированных клетках Pdcd4 пострансляционно модифицируется как US3зависимо, так и US3-независимо, что приводит к ослаблению апоптоза.
Помимо про-апоптотической, Pdcd4 может проявлять и анти-пролиферативную
активность. Так, увеличение количества Pdcd4 отмечалось в стареющий диплоидных
фибробластах человека [13]. Удаление ростовых факторов из среды вызывало увеличение
уровня Pdcd4 в клетках линий HEK293, NIH3T3 и глиобластомы T98G и приводило к
индукции апоптоза в них [10,28]. Показано, что транс-ретиноевая кислота (ATRA), DMSO
и оксид мышьяка способны индуцировать дифференцировку гранулоцитов при острой
миелоидной лейкемии (ОМЛ) и приводить к повышению уровня Pdcd4 [97]. Острая
миелоидная лейкемия – является наиболее часто встречаемым видом острого лейкоза и
характеризуется остановкой дифференциации предшественников гематопоэтических
клеток на ранних стадиях миелопоэза. Высокоэффективной и наименее токсичной
считается терапия ОМЛ препаратами, индуцирующими дифференциацию гранулоцитов.
Так, ATRA является сильным индуктором дифференциации незрелых промиелоцитов в
нормальные зрелые гранулоциты у пациентов с ОМЛ и приводит к повышению уровня
Pdcd4 за счет ингибирования PI3K/Akt/mTOR сигнального пути. Нокаут Pdcd4 приводил к
ингибированию ATRA-индуцированной дифференциации гранулоцитов [97]. Но, в то же
время,
при
TPA-индуцированной
дифференцировке
промиелоцитов
в
моноциты/макрофаги при ОМЛ изменение уровня Pdcd4 не наблюдалось [97]. Эти данные
указывают на взаимосвязанность индукции экспрессии Pdcd4 и дифференцировки именно
гранулоцитов при ОМЛ. Другое указание на роль Pdcd4 в процессах дифференцировки
заключалось в высоком уровне экспрессии Pdcd4 в дифференцирующихся клеточных
слоях, таких как супрабазальный слой эпидермиса и супрабульбарная область волосяных
фолликул, в сравнении с уровнем в базальном слое эпидермиса и внутри волосяных
фолликул, которые состоят из пролиферирующих и недифференцирующихся клеток [95].
Однако, как и в случае с индукцией апоптоза, влияние Pdcd4 на пролиферацию не
является универсальным. Так, высокий уровень экспрессии Pdcd4 в клетках линии
HEK293, RKO, Bon-1 и кератиноцитах in vivo не оказывал ингибирующее действие на их
пролиферативную активность [34,55,103,115].
Рост клеток рака молочной железы регулируется через сигнальный путь,
включающий в себя поверхностные рецепторы факторов роста и ядерные рецепторы
семейства стероидных/тироидных/ретиноидных генов. Рецепторы ретиноидной кислоты
(RAR) являются членами семейства рецепторов стероидных/тироидных гормонов, и
являются
лиганд-зависимыми
транскрипционными
факторами,
обладающими
35
способностью ингибировать рост опухолевых клеток рака молочной железы. Было
показано, что агонисты RAR и синтетические ретиноиды, такие как ферентинид,
индуцируют апоптоз в злокачественных клетках рака молочной железы, тогда как
здоровые клетки не затрагиваются. Для того, чтобы определить, какие гены вовлечены в
RAR-зависимое ингибирование роста клеток рака молочной железы, была создана база
данных генов, которые потенциально регулируются RAR-агонистами в них. Было
показано, что уровень белка Pdcd4 повышается примерно в три раза при обработке клеток
рака молочной железы линии T-47D альфа-селективными агонистом RAR Am580 [98].
Пан-агонист RAR и альфа-селективный агонист RAR Am580, но не агонист ретиноидных
Х рецепторов (RXR), стимулировали экспрессию Pdcd4 в различных исследованных
клеточных линиях опухоли молочной железы. RAR-агонисты не индуцировали
экспрессию гена Pdcd4 в тех клетках рака молочной железы, рост которых не
ингибировался ретиноидами. Так же показано, что антиэстроген (Фулвестрант) и
антагонист HER-2/neu (Герцептин) так же индуцировали экспрессию Pdcd4 в клетках
линии T-47D, что, вероятно, указывает на центральную роль Pdcd4 в ингибировании
пролиферации клеток опухоли молочной железы. Транзиторная сверхэкспрессия Pdcd4 в
клетках линий T-47D (ER+, RAR+) и MDA-MB-231 (ER-, RAR-) приводила к
апоптотической клеточной гибели, что указывает на роль Pdcd4 как медиатора индукции
апоптоза в клетках рака молочной железы. Это первые данные об индукции экспрессии
Pdcd4 RAR-агонистами, антиэстрогенами или антагонистами HER2/neu в клетках опухоли
молочной железы и его потенциальной роли в процессе апоптоза в этих клетках [98].
Из приведенных выше данных следует, что способность Pdcd4 ингибировать
пролиферацию клеток и индуцировать апоптоз не универсальна и почти всегда зависит от
типа клеток. Экспериментально показано отсутствие зависимости между уровнем
экспрессии Pdcd4 и степенью пролиферации во многих клеточных линиях, а также
экспрессией различных белков, ассоциированных с прогрессией клеточного цикла или
апоптозом.
4.4.2. Влияние Pdcd4 на клеточный цикл
Pdcd4 участвует в контроле клеточного цикла. Показано, что Pdcd4 через индукцию
p21
Waf1/Cip1
репрессирует транскрипцию CDK1/cdc2 [55]. p21Waf1/Cip1 блокирует активность
CDK2 и CDK4/6 (Рис. 9). Повышенный
уровень CDK1/cdc2 характерен при
злокачественной трансформации клеток, например легких, молочной железы, кишечника
и простаты. Более того, авторы показали прямую зависимость внутриклеточной
локализации Pdcd4 и его экспрессии с прогрессией опухоли. И, наконец, было показано,
36
что ингибитор CDK1/cdc2 росковитин может ингибировать пролиферацию некоторых
опухолевых клеток, указывая на то, что ингибирование cdc2 может оказаться действенной
стратегией против неопластической трансформации. Роль Pdcd4 в регуляции cdc2
позволяет рассматривать Pdcd4 как потенциальную новую мишень в антинеопластической
терапии.
Рис. 9. Влияние Pdcd4 на клеточный цикл.
Сверхэкспрессия
Pdcd4
приводила
к
индукции
белка
p21Waf1/Cip1
в
нейроэндокринной клеточной линии Bon-1, однако в клетках линии HCT116С не оказала
никакого эффекта [57]. При ОМЛ снижение уровня белка Pdcd4 не привело к изменениям
в экспрессии p21Waf1/Cip1 [97]. Эти данные еще раз подтверждают тот факт, что активность
Pdcd4 как опухолевого супрессора не только сложно регулируется, но и разнообразна по
своей природе и практически всегда зависит от типа клеток.
4.5. Pdcd4 и неопластическая трансформация
4.5.1. Pdcd4 и онкогенез: причинно следственная связь
Результаты
многочисленных
исследований
выявили
подавление
уровня
транскрипта Pdcd4 в опухолях различного типа. Подавление транскрипции наблюдалось в
клеточных линиях опухолей легких и первичных опухолях этой ткани, в гепатоклеточных
карциномах, глиомах, в опухолях кожи человека, при раке молочой железы и в раковых
клетках яичника [63,79,95,96,106–109]. Подавление транскрипции Pdcd4 не наблюдалось
при снижении уровня белка Pdcd4 при раке кишечника, а при плоскоклеточном раке
легких, наоборот, подавление транскрипции Pdcd4 не всегда сопровождалось супрессией
уровня белка [73,84,108].
Носит ли эта связь только коррелятивный характер или же подавление экспрессии
Pdcd4 является значимым событием, вносящим вклад в возникновение и прогрессию
опухолей? Выявленное участие Pdcd4 в процессе апоптотической гибели и контроле
пролиферативной активности клеток позволяет предполагать, что эта связь имеет
37
причинно-следственный, а не только коррелятивный характер. И это предположение
действительно подтверждается результатами ряда исследований.
Рис. 10. Pdcd4 ингибирует трансляцию и AP-1-зависимую транскрипцию.
За счет MA-3 домена, Pdcd4 выступает в роли ингибитора трансляции, и тем самым
влияет на белковый паттерн клетки (Рис. 10). Влияние Pdcd4 на опухолевую
трансформацию клеток было впервые выявлено в работе Кмарика и соавторов [4]. Они
изолировали транскрипт Pdcd4 в результате сравнительного анализа транскриптомов
близкородственных вариантов мышиных клеток эпидермального происхождения JB6.
Существует два варианта этой клеточной линии: одна (P+) чувствительная к
неопластической трансформации с низким уровнем Pdcd4, которая претерпевает
трансформацию при стимуляции опухолевых промоторов; вторая – устойчивые (P-) с
более высоким уровнем Pdcd4 по сравнению с P+ клетками. Авторы продемонстрировали,
что именно повышенный уровень Pdcd4 в клетках JB6(P-) определяет их устойчивость к
трансформации. Супрессия Pdcd4 в этих клетках приводила к приобретению ими
чувствительности к неопластической трансформации и наоборот, экспрессия Pdcd4 в
клетках JB6(P+) делала их устойчивыми к действию индукторов неопластической
трансформации [4,30]. В соответствии с этими результатами сверхэкспрессия Pdcd4 в
клетках линии P+ была достаточна для того, чтобы ингибировать PMA-индуцированную
трансформацию [30]. В ТРА-трансформированном варианте клеточной линии JB6 – линии
RT101, сверхэкспрессия Pdcd4 приводила к подавлению роста клеток независимых от
прикрепления к внеклеточному матриксу и приводила к ингибированию AP-1-зависимой
транскрипции, указывая на то, что повышенный уровень Pdcd4 является достаточным
условием для подавления опухолевого фенотипа в исследованной модельной системе
(Рис. 10) [124]. Вместе с данными, касающимися экспрессии Pdcd4 в различных видах
38
опухолей, было предпринято несколько попыток прояснения механизма действия Pdcd4
как опухолевого супрессора. Трансформация, вызванная опухолевым индуктором – PMA,
зависит от трансактивации транскрипционных факторов AP-1 и NF-κB (ядерный фактор
κB) [125]. Уже упоминалось, что в клетках мультиформной глиобластомы линий U251 и
LN229, которые стабильно сверхэкспрессируют Pdcd4, происходит ингибирование NF-κBзависимой активации транскрипции [45]. Так же, при помощи транзиторной котрансфекции плазмиды, экспрессирующей Pdcd4, и плазмиды, содержащей репотрерный
ген люциферазы под контролем AP-1 транскрипционного фактора, было показано, что
повышенный уровень Pdcd4 понижает трансактивацию AP-1 после клеточной стимуляции
опухолевым индуктором TPA в мышиных эпидермальных клетках линии JB6 [30].
Ингибирование AP-1-зависимой транскрипционной активности зависело от концентрации
Pdcd4, и эффект был тем сильнее, чем больше был уровень Pdcd4. Показано, что
ингибирование AP-1-зависимой транскрипции за счет повышения уровня Pdcd4
происходит из-за снижения уровня фосфорилирования с-Jun [34]. Белок c-Jun
фосфорилируется Jun N-концевой киназой (JNK) MAPK-сигнального пути (митоген
активируемая
протеинкиназа).
Авторы
показали,
что
Pdcd4
ингибирует
фосфорилирование c-Jun за счет того, что Pdcd4 связывается с c-Jun и препятствует его
фосфорилированию киназой JNK. Более детальный анализ активации c-Jun в клетках
линии RKO, стабильно сверхэкспрессирующих Pdcd4, показал, что Pdcd4 также может
ингибировать экспрессию киназы MAPKKKK1/MAP4K1 (MAP киназа киназа киназа
киназа 1), которая, в свою очередь, активирует киназу JNK [115]. И наоборот, нокаут
Pdcd4 в клеточной линии рака толстой кишки HT29 стимулировал AP-1-зависимую
транскрипцию. Однако нокаут Pdcd4 в этих клетках не приводил к повышению уровня
фосфорилированных
форм
киназы
JNK
и
не
вызывал
повышения
уровня
фосфорилирования с-Jun, но при этом наблюдалось повышение уровня белка с-Jun. Эти
данные указывают на то, что именно повышение уровня белка с-Jun приводит к активации
AP-1-зависимой транскрипции в клетках HT29, нокаутных по Pdcd4 [33].
Большинство данных по супрессии опухолей были получены в экспериментах на
клеточных культурах, но есть несколько исследований и на животных моделях, которые
подтвердили природу Pdcd4 как опухолевого супрессора. Исследования на модели мышей
с трансгенной экспрессией Pdcd4 в эпидермисе показали, что экспрессия Pdcd4 приводит
к значительному снижению формирования папиллом и карцином и ингибирует
перерождение папиллом в карциномы при химически индуцированном канцерогенезе
кожи [103]. Таким образом, в канцерогенезе кожи Pdcd4, несомненно, выполняет роль
супрессора опухолевого роста. Этот вывод подтверждается и результатами анализа
39
опухолей кожи человека, при которой была показана тенденция потери экспрессии Pdcd4
в новообразованиях [95].
Результаты исследования мышей с направленно разрушенным геном Pdcd4 также
подтвердили причинно-следственную связь потери Pdcd4 с процессом канцерогенеза и
указывают на его активность как супрессора опухолевого роста. Оказалось, что Pdcd4дефицитные мыши обладают повышенной частотой развития спонтанных лимфом,
преимущественно В-клеточного происхождения, которые часто метастазировали в печень
и почки [126]. Кроме того, инактивация гена Pdcd4 приводила к увеличению
чувствительности к химической индукции канцерогенеза кожи [29]. Эти данные еще раз
подтверждают, что Pdcd4 обладает активностью супрессора опухолевого роста и его
потеря ведет к развитию онкологического заболевания.
4.5.2. Прогностическое значение Pdcd4
Полученные к настоящему времени экспериментальные данные однозначно
указывают, что процесс возникновения и прогрессии опухоли может быть связан с
потерей экспрессии Pdcd4. Многие литературные данные указывают на то, что потеря
белка Pdcd4 является прогностическим фактором и часто коррелирует с возникновением и
прогрессией опухоли [33,109,127,128]. Это делает Pdcd4 привлекательной мишенью для
разработки новых подходов в диагностике, прогностике и лечении онкологических
заболеваний [93].
Как отмечалось выше, снижение уровня транскрипта Pdcd4 часто наблюдается в
опухолях различных типов, что делает транскрипт Pdcd4 перспективным кандидатом в
молекулярные маркеры опухолей, а так же для дифференциальной диагностики опухолей.
Действительно, в аденокарциномах легких снижение уровня транскрипта Pdcd4
коррелирует с более поздней стадией заболевания и с сокращением продолжительности
жизни больного [109]. Аналогичная зависимость была обнаружена и для опухолей
кишечника, для которых потеря белка Pdcd4 коррелировала с более короткой
продолжительностью жизни пациента и со степенью малигнизации новообразования [84].
Кроме того, многочисленные экспериментальные данные, описанные выше, указывают на
то, что потеря экспрессии Pdcd4 приводит, по тому или иному механизму, к увеличению
подвижности и инвазивности опухолевых клеток. Поэтому потеря экспрессии Pdcd4
может рассматриваться как фактор, увеличивающий вероятность агрессивного поведения
и распространения опухоли в организме. Эти факты позволяют использовать уровень
транскрипта и белка Pdcd4 как в прогностических целях, так и в качестве маркеров для
определения степени малигнизации опухоли.
40
4.5.3. Pdcd4 и супрессия роста опухолевых клеток
Частая
потеря
экспрессии
Pdcd4
в
опухолевых
клетках
и
полученные
экспериментальные данные, свидетельствующие о анти-неопластическом эффекте
восстановления экспрессии Pdcd4, делают Pdcd4 привлекательной мишенью и для генной
терапии опухолей, в основе которой лежит восстановление функций Pdcd4 в опухолевых
клетках. Перспективность этого подхода подтверждается результатами, полученными на
модели мышей, экспрессирующих трансген Pdcd4 в эпидермисе. Трансгенные по Pdcd4
мыши характеризовались значительным снижением частоты формирования папиллом и
карцином и частоты перерождения папиллом в карциномы по сравнению с мышами
дикого типа при экспериментальном канцерогенезе кожи [103]. Эти результаты
демонстрируют
потенциал
экзогенной
экспрессии
Pdcd4
в
предотвращении
возникновения новообразований и ингибировании их злокачественной прогрессии.
Потенциальная анти-неопластическая эффективность экспрессии экзогенного Pdcd4 была
также продемонстрирована в работах Хванга с соавторами и Джина с соавторами [31,32]
по аэрозольной доставке модуля для экспрессии Pdcd4 в легкие мышей, трансгенных по
репортерному гену люциферазы под контролем AP-1-зависимого промотора, и в легкие
мышей с K-Ras-зависимым канцерогенезом легких. Экспрессия экзогенного Pdcd4 в этих
экспериментальных моделях приводила к увеличенному уровню апоптоза в легких,
интерференции с пролиферативными сигнальными путями, а также к ингибированию
ангиогенных сигнальных путей и АP-1-зависимой транскрипционной активности. В то же
время остается неясным, будет ли экспрессия экзогенного Pdcd4 одинаково эффективна и
в качестве профилактического средства, как это было продемонстрировано в работе
Янсена и соавторов [103], и как способ терапии уже сформировавшихся опухолей. В
пользу потенциальной эффективности как средства для терапии опухолей говорит ряд
экспериментальных фактов, в частности, ингибирование подвижности и инвазивности
опухолевых клеток в культуре [6,33,54,73,75,115], индукция их апоптотической гибели
[96,98] и повышенная чувствительность к действию определенных химиотерапевтических
агентов [116] в ответ на восстановление экспрессии Pdcd4. Однако, как упоминалось
ранее, эффект экспрессии экзогенного Pdcd4 может сильно варьировать в зависимости от
типа клеток. Кроме того, в опухолевых клетках супрессия Pdcd4 происходит не только на
уровне
транскрипции,
но
и
посредством
микроРНК-зависимого
ингибирования
трансляции белка и его пост-трансляционной деградации. Активация механизмов,
ответственных за пост-транскрипционную супрессию уровня белка Pdcd4, которая часто
41
происходит в опухолевых клетках, будет приводить и к снижению экзогенно
продуцируемого белка Pdcd4, тем самым потенциально нивелируя ожидаемый эффект.
Кроме того, последние данные указывают на то, что трансляция многих мРНК,
кодирующих важные онкогены и транскрипционные факторы зависит от РНК хеликазы
eIF4A, которая требуется для того чтобы разрешить структуру G-квадродуплексов [129].
Было замечено, что 5`-НТО часто совпадают с предсказанными структурами Gквадродуплексов [130]. Таким образом, РНК хеликаза eIF4A является лимитирующим
звеном в трансляции тех мРНК, которые несут G-квадродуплексы в составе своих 5`-НТО.
Эти данные указывает на то, что ингибирование РНК хеликазы eIF4A может представлять
собой эффективную антираковую терапию. А Pdcd4, как уже упоминалось, способен
взаимодействовать с eIF4A, и тем самым приводить к ингибированию ее хеликазной
активности. Помимо этого было показано, что eIF4F является причиной устойчивости к
анти-BRAF и к анти-MEK раковой терапии [131]. Авторы исследования показали, что
комбинирование препаратов ингибирующих комплекс eIF4F либо за счет блокирования
взаимодествия eIF4E и eIF4G, либо за счет воздействия на eIF4A, а так же препаратов
ингибирующих BRAF и/или MEK может привести к преодолению механизмов
устойчивости к антираковой терапии при BRAF(V600) меланоме.
4.5.4. Ангиогенез
Процесс ангиогенеза является существенным для роста и прогрессии опухоли
[132]. Кругом и соавторами было выявлено ингибирующее действие Pdcd4 на процессы
ангиогенеза [133]. Авторы показали, что в нейроэндокринной клеточной линии Bon-1 и в
клеточной линии колоректальной карциномы HCT116 в результате нокаутирования Pdcd4
наблюдался повышенный уровень ангиопоэтина-2 (Ang-2) как на уровне белка, так и на
уровне мРНК. Повышение экспрессии Ang-2 в клетках линии Bon-1 дикого типа
приводило к повышению пролиферации, повышению скорости образования колоний, а
так же снижало клеточную адгезию. Наиболее вероятно, что стимуляция Ang-2 вызвана
повышенной активацией AP-1, однако это не исключает вовлечение и других сигнальных
каскадов.
Ang-2
является
модулятором
ремоделирования
сосудов.
Воздействие
супернатантов, полученных от клеток, нокаутных по Pdcd4, на клетки эндотелия,
приводило к снижению их адгезии и повышению уровня формирования колоний. Эти
данные впервые продемонстрировали прямое ингибирующее влияние Pdcd4 на Ang-2 и
соответственно, на процесс ангиогенеза. Новый механизм действия опухолевого
супрессора Pdcd4 делает его еще более привлекательной мишенью для новых
терапевтических стратегий в лечении раковых опухолей.
42
Помимо этого, как уже упоминалось, аэрозольная доставка модуля для экспрессии
Pdcd4 в легкие мышей с K-Ras-зависимым канцерогенезом легких приводила к
увеличению числа клеток, претерпевающих апоптоз в легких, интерференции с
пролиферативными сигнальными путями, а также к ингибированию ангиогенных
сигнальных путей [31,32]. Авторы показали, что экспрессия индукторов ангиогенеза
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor – фактор роста эндотелия сосудов) и FGF-2
(Fibroblast Growth Factor – фактор роста фибробластов) была значительно понижена в
легких мышей с K-Ras-зависимым канцерогенезом после аэрозольной доставки модуля
для экспрессии Pdcd4 по сравнению с контрольной группой. VEGF является наиболее
значимым ростовым фактором, вовлеченным в ангиогенез, так как в результате его
действия
улучшается
веществами,
обеспечение
усиливается
тканей,
проницаемость
окружающих
опухоль,
питательными
сосудов,
так
индуцируется
а
же
метастазирование [134,135]. Многими группами ученых показана связь между VEGF и
ростом сосудов опухоли, а так же резистентностью к химиотерапии и плохим прогнозом
при НМКРЛ [136]. FGF-2 так же является известным индуктором ангиогенеза и
опухолевого роста [137]. Авторы показали, что аэрозольная доставка модуля для
экспрессии Pdcd4 приводила к супрессии обоих вышеупомянутых ангиогенных факторов
роста, что укзывает на то, что аэрозольная доставка модуля для экспрессии Pdcd4 может
быть многообещающим агентом для лечения рака легких.
4.5.5. Pdcd4 и прогрессия опухоли
Pdcd4
регулирует
множество
белков
в
клетках
на
транкрипционном
и
трансляционном уровнях, которые вовлечены в прогрессию опухоли, клеточный цикл и
дифференцировку (Рис. 11). Так как Pdcd4 влияет на кэп-зависимую трансляцию [17],
были проанализированы различия в экспрессии цитозольных белков в контрольных
клетках человеческой эмбриональной почки линии HEK-293 и в этих же клетках
трансфицированных плазмидой, экспрессирующей белок Pdcd4 [138]. В результате
эксперимента белок CA II (карбоангидраза типа II) был идентифицирован как белок,
уровень которого снижен в клетках, сверхэкспрессирующих Pdcd4, причем уровень мРНК
CA II оставался неизменным. Это указывает на то, что регуляция возникает только на
уровне трансляции. Карбоангидраза катализирует гидратацию CO2 до бикарбоната,
который является субстратом для многих фундаментальных процессов, таких как
глюконеогенез, биосинтез некоторых аминокислот, синтез пиримидина, синтез жирных
кислот. Так как раковые клетки обладают повышенным уровнем пролиферации, для их
43
жизнедеятельности требуется высокий уровень бикарбоната [94,139], поэтому Pdcd4зависимое понижение уровня CA II, вероятно, способствует супрессии опухоли.
Рис. 11. Схема известных мишеней Pdcd4. Следует учитывать, что не все приведенные
пути активны во всех клетках. ┬ ингибирование, ↑ стимуляция (адаптировано из [18]).
В нейроэндокринной клеточной линии Bon-1 супрессия Pdcd4 приводила к
усиленному высвобождению диагностического маркера нейроэндокринных опухолей CgA
(хромогранин А) и Sg II (секретогранин II) и сопровождалась повышением уровня
внеклеточного PC1 (пробелка конвертазы 1) [140]. Видимо, повышенная секреция CgA и
Sg II опосредована активацией протеинкиназы Akt, которая, в свою очередь, активируется
PI3K. Было показано, что ингибирование PI3K снижает фосфорилирование Akt, тем
44
самым усиливая экспрессию Pdcd4. В то же время, в клетках линии Bon-1,
сверхэкспрессирующих Pdcd4, уровень фосфорилированного Akt был понижен, что
указывает на существование аутокринной регуляторной петли. Кроме того, показано, что
в ядре низкий уровень Pdcd4 ассоциирован с высоким уровнем фосфорилированной
протеинкиназы Akt, то
есть
уровень
фосфорилированной, а значит
активной,
протеинкиназы Akt обратно коррелирует с уровнем Pdcd4 как в ядре, так и в цитоплазме, а
так же с транслокацией Pdcd4 из ядра в цитоплазму в клетках опухолей толстой кишки
[84].
Результаты ряда исследований выявили, что Pdcd4 оказывает влияние на еще один
крайне важный для прогрессии опухоли процесс – метастазирование [75]. Впервые Pdcd4зависимое ингибирования инвазивных свойств клеток было отмечено Янгом и коллегами,
обнаружившими, что восстановление экспрессии Pdcd4 в клетках карциномы кишечника
линии RKO приводило к супрессии их инвазии [115]. Pdcd4-зависимое ингибирование
подвижности и инвазии, а также метастазирования опухолевых клеток, было описано и в
ряде других работ [6,33,54,73,75]. Однако молекулярные механизмы Pdcd4-зависимого
изменения инвазивных свойств клеток оказались гетерогенными. Помимо того, что в
клетках линии RKO Pdcd4 приводит к супрессии транскрипции MAP4K1 и, как следствие,
снижению АР-1-зависимой транскрипционной активности [115], в тех же клетках линии
RKO Pdcd4 вызывал снижение уровня урокиназного рецептора u-PAR [54]. u-PAR
(урокиназный рецептор) является медиатором деградации внеклеточных матриксных
компонентов и усиливает инвазию опухолевых клеток и метастазирование [141].
Показано, что u-PAR является важным прогностическим фактором во многих сóлидных
раковых опухолях молочной железы, легких, кишечника, пищевода и желудка [142–145],
и очевидно, что u-PAR является важной мишенью для Pdcd4. В клетках опухолей
кишечника была обнаружена обратная корреляция между экспрессией Pdcd4 и u-PAR.
При этом Pdcd4 влияет на экспрессию u-PAR на уровне транскрипции, через
транскрипционные факторы семейства Sp1/Sp3.
Однако, в отличие от клеток линии RKO, в клетках рака молочной железы MCF7 не
было обнаружено супрессии транскрипции u-PAR за счет сверхэкспрессии Pdcd4 [6], что
еще раз подчеркивает зависимость специфической активности Pdcd4 и его мишеней от
типа клеток. Но, как и в клетках RKO, повышенная экспрессия Pdcd4 в клетках MCF7
приводила к снижению их инвазивных свойств. Мишенью для Pdcd4 в этом процессе
является тканевой ингибитор металлопротеиназ-2 (TIMP-2), который супрессирует
активность протеаз внеклеточного матрикса [146].
45
Нокаут Pdcd4 в клетках линии HT29 сопровождался усилением клеточной инвазии
и вызывал снижение уровня экспрессии Е-кадгерина и аккумуляцию активного β-катенина
в ядре [33]. Активный β-катенин активирует Tcf-зависимую транскрипцию. Механизм, за
счет которого снижение уровня белка Pdcd4 усиливает инвазию, по-видимому включает
активацию Tcf- и AP-1-зависимые транскрипции.
В недавних исследованиях показано, что особо инвазивная клеточная линия
мультиформной глиобастомы U87R4 обладает свойствами стволовых клеток, в сравнении
с неинвазивными, но пролиферирующими клетками линии U87L4 [147]. Результаты
анализа показали, что в более инвазивной клеточной линии уровень генов Pdcd4 и
каспазы-3, индуцирующих апоптоз, был понижен, тогда как уровень некоторых генов
важных для стволовых клеток (Frizzled 4 и CD44) был повышен. Оказалось, что клетки
линии U87R4 были устойчивы к противоопухолевым препаратам, индуцирующим
клеточную гибель, частично благодаря пониженной экспрессии Pdcd4 и каспазы 3. Кроме
того,
они
сохраняли
активированным
путь
Wnt/β-катенин-сигнальный
за
счет
повышенной экспрессии рецептора лигандов Wnt Frizzled 4, который, как было показано
ранее, участвует в активации канонического Wnt-сигнального пути [148]. Аберрантная
активация канонического пути Wnt наблюдается при многих видах рака, в том числе и при
раке легкого [149,150].
Таким образом, одной из универсальных активностей Pdcd4 как супрессора
опухолевого роста является его способность ингибировать метастатический потенциал
клеток, однако мишени Pdcd4 и молекулярные механизмы этого процесса могут
варьировать в зависимости от типа клеток. Все эти данные еще раз подчеркивает важность
роли Pdcd4 как опухолевого супрессора и необходимость поиска молекулярных
механизмов и молекул, которые ведут к ингибированию Pdcd4 при опухолевой
трансформации клеток.
4.5.6. Pdcd4 и хеморезистенция
Уровень экспрессии Pdcd4 может быть использован и для селекции наиболее
эффективных лекарственных средств при терапии опухолей. В ряде работ было отмечено,
что присутствие Pdcd4 является необходимым для противоопухолевой активности ряда
анти-неопластических препаратов. В определенных случаях экспрессия Pdcd4 в
опухолевых
клетках
приводит
к
снижению
уровня
dUTPазы
в
клетках,
что
сенсибилизирует их к действию препаратов, мишенью которых является тимидилат
синтаза [57]. По данным Янсена и соавторов, экспрессия Pdcd4 коррелирует с
чувствительностью опухолевых клеток к определенным химиотерапевтическим агентам, в
46
частности, к гельданамицину и тамоксифену [116]. Продолжая тему влияния Pdcd4 на
устойчивость к лекарственным препаратам, можно отметить, что присутствие Pdcd4 в
клетке необходимо для антилейкемийного действия ингибиторов протеинкиназной
активности
онкогена
Bcr-Abl,
нилотиниба
и
мезилата
иматиниба,
на
клетки,
трансформированные Bcr-Abl [85]. Хронический миелобластный лейкоз (ХМЛ) – форма
лейкоза,
которая
ассоциирована
с
характерной
хромосомной
транслокацией
(Филадельфийской хромосомой) при которой происходит слияние гена тирозинкиназы
ABL 9-й хромосомы с геном Bcr 22-й хромосомы [151,152]. Тирозин киназная активность
химерного белка Bcr-Abl обуславливает фосфорилирование множественных субстратов,
что приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей, способствующих
клеточному росту и выживаемости. К настоящему времени разработана таргетная
терапия, позволяющая специфически ингибировать активность химерного белка Bcr-Abl
in vitro и in vivo. В частности, применение таких препаратов как иматиниба мезилат,
нилотиниба и дизатиниба в лечении больных ХМЛ положительно повлияло на ход
течения этого заболевания [153–158]. Было продемонстрировано, что mTOR-зависимый
сигнальный путь активирован в Bcr-Abl-трансформированных клетках [159–162]. В
результате воздействия мезилата иматаниба блокируется фосфорилирование mTOR и,
соответственно, предотвращается активация p70S6K [85]. Карайл с соавторами нашли
новый механизм регуляции, с помощью которого Bcr-Abl способствует клеточной
пролиферации, действуя при этом на p70S6K-зависимую супрессию Pdcd4. Более того,
показано, что в клетках линии K562, полученных от больного ХМЛ в стадии бластного
криза, экспрессия Pdcd4 повышается под действием ингибиторов киназы Bcr-Abl, а
супрессия Pdcd4, опосредованная siРНК, приводила к отмене супрессирующего эффекта
мезилата иматиниба и нилотиниба на колонии клеток–предшественников лейкемии. Все
эти данные указывают на важную роль белка Pdcd4 в генерировании антилейкемийного
ответа при воздействии иматиниба мезилата и нилотиниба и делает его перспективным
маркером в молекулярной диагностике лекарственной чувствительности к этим
препаратам при Bcr-Abl-индуцированном лейкозах.
Резистентность организма к химиотерапии значительно снижает выживаемость
больного при раке, и перспективными методами лечения являются альтернативные
подходы, которые помогают преодолеть хеморезистенцию. Как уже упоминалось, Pdcd4
является мишенью для микроРНК miR-106a. Помимо этого авторы работы показали, что в
клетках рака яичника повышенный уровень miR-106a повышает устойчивость клеток к
цисплатину [79]. При этом уровень Pdcd4 понижен в клетках, устойчивых к цисплатину.
Подавление экспрессии Pdcd4 при помощи РНК-интреференции показало, что Pdcd4
47
является ключевой сигнальной молекулой, обеспечивающей устойчивость клеток рака
яичника к цисплатину. Рак яичника стоит на пятом месте по смертности от рака среди
женщин. Низкая выживаемость больных, в частности, связана с появлением устойчивости
к химиотерапии. Таким образом, потеря или снижение экспрессии Pdcd4 может служить
причиной резистенции к химиотерапии при раке яичника, и восстановление уровня
экспрессии Pdcd4 может повысит чувствительность клеток рака яичника к химиотерапии.
Однако,
на
сегодняшний
день
механизм
за
счет
которого
Pdcd4
повышает
чувствительность к химиотерапии, остается неясной. В то же время, интересно отметить,
что при чешуйчатоклеточной карциноме языка ингибирование микроРНК miR-21
повышало чувствительность клеток к цисплатину и приводило к повышению уровня белка
Pdcd4 [163]. Напротив, клетки, трансфицированные малой интерферирующей РНК к
Pdcd4, приобретали устойчивость к химиотерапии цисплатином. Эти данные говорят о
том, что микроРНК miR-21 может изменять хеморезистентность клеток плоскоклеточной
карциномы языка к цисплатину за счет влияния на уровень Pdcd4, а супрессия Pdcd4
ослабляет цисплатин-индуцированный апоптоз.
Кроме того, Pdcd4 может служить прогностическим параметром чувствительности
к неоадьювантной химиорадиотерапии при местнораспространенном раке прямой кишки
[164]. Авторы исследования показали, что пациенты с высоким уровнем экспрессии Pdcd4
были более чувствительны к неоадьювантной химиорадиотерапии, чем пациенты с
низким уровнем экспрессии Pdcd4. Таким образом, высокий уровень белка Pdcd4 является
хорошом прогностическим фактором, указывающим на положительный ответ при
неоадьювантной химиорадиотерапии и, следовательно, хороший прогноз лечения
пациентов с местнораспространенным раком прямой кишки.
4.5.7. Pdcd4 как интегральный маркер про-онкогенных изменений
Выявленная зависимость уровня экспрессии Pdcd4 и чувствительности к
химиотерапевтическим препаратам позволяет ожидать, что уровень экспрессии Pdcd4 в
опухоли
может
быть
использован
как
индикатор
используемых агентов по отношению к клеткам опухоли.
специфической
активности
48
Рис. 12. Pdcd4 может быть использован как индикатор, который отражает воздействие на
комплексные, многочисленные про-онкогенные процессы(А); Белок Pdcd4 вовлечен во многие
сигнальные каскады, которые активированы в опухолевых клетках и понижают его уровень в
клетке, ? – неизвестные на данный момент про-онкогенные процессы (Б).
Интегральные маркеры помогают установить эффективность определенного
препарата или их комбинации, так как отражают эффект проводимых процедур на первом
этапе клиничеких испытаний [165]. Такие биомаркеры позволяют выбрать набор
химиотерапевтических препаратов, наиболее подходящих для конкретного пациента
[166]. Современные тенденции направлены на изменение парадигмы в лечении больных,
так, все большее распространение получает персонализированная медицина [167]. Такой
подход позволяет избежать многих побочных эффектов, а так же позволяет резко
сократить дозы лекарственных средств, что особенно актуально при химиотерапии. Таким
образом, белок Pdcd4 как можно использовать как маркер суммарного воздействия на
многочисленные про-онкогенные процессы при поиске новых противоопухолевых
препаратов направленного действия (Рис. 12). Поскольку в различных клетках механизмы
супрессии Pdcd4 различны, становится возможным высокоэффективный скрининг
препаратов, воздействующих на различные молекулярные мишени. И этот факт имеет
существенное значение в онкологии, так как возникновение и прогрессия рака имеет
гетерогенные молекулярные основы.
4.6. Заключение
Итак, белок Pdcd4 подвержен сложной регуляции на транскрипционном
трансляционном и белковом уровнях. Между тем его роль в качестве опухолевого
супрессора не подвергается сомнению. Потеря экспрессии Pdcd4, часто наблюдаемая в
опухолях человека различного типа, носит не только коррелятивный характер, но и может
49
указывать на причинно-следственную связь между потерей экспрессии Pdcd4 и
возникновением опухоли, а так же ее прогрессией. Помимо этого, Pdcd4 может принимать
участие и в процессах дифференциации, в воспалительных процессах, и при различных
заболеваниях таких, например, как диабет. Множественные сигнальные пути, на которые
оказывает влияние Pdcd4, а так же зависимость биологического ответа при изменении
уровня Pdcd4 от типа клеток отражает сложные и многообразные механизмы, приводящие
к развитию раковых клеток. Уровень экспрессии Pdcd4 в опухолевых клетках может
рассматриваться как молекулярный диагностический и прогностический маркер, а также
быть использован при прогнозировании чувствительности опухолевых клеток к
определенным противоопухолевым средствам. Однако необходимо принимать во
внимание вариабельность эффектов Pdcd4 в различных типах клеток и недостаточно
обширные статистические данные. Поэтому для практического использования уровня
экспрессии Pdcd4 в качестве диагностического и прогностического маркера необходимы
дополнительные исследования, призванные установить в каких типах и/или при наличии
каких молекулярных характеристик опухолей уровень экспрессии Pdcd4 будет значимым
фактором для прогноза заболевания и определении чувствительности опухолевых клеток
к анти-неопластическим препаратам. Требуется провести еще немало исследовательской
работы для того чтобы внести ясность в эти аспекты, но перспективы использования
в
Pdcd4
качестве
терапевтической
мишени
представляют
собой
не
только
фундаментальный интерес, но и интерес в прикладной области.
Принимая во внимание вариабельность функциональной активности Pdcd4 в
клетках
различного
типа,
актуальным
является
исследование
механизмов
функционирования и регуляции Pdcd4 не только в целом, но и с учетом специфического
клеточного контекста. В частности, данная задача существенна в отношении опухолей
различного происхождения. Успехи в ее решении позволят, в том числе благодаря
пониманию молекулярных механизмов дерегуляции Pdcd4 в отдельных типах опухолей,
более полно понимать специфические молекулярные механизмы возникновения и
прогрессии опухоли, что является сегодня необходимым для разработки новых таргетных
противоопухолевых препаратов.
50
5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
5.1. Реактивы
В работе использовались ферменты, производимые фирмой «Fermentas» (Литва.
Олигонуклеотиды для проведения ОТ-ПЦР, ПЦР были заказаны в фирме «Литех»
(Россия).
В работе использовали только реактивы высокой степени очистки: NaCl, KCl,
CaCl2, MgCl2, трис (Trizma-Base), трис-HCl (Trizma-HCl), глицин, глицерин, ацетат натрия,
фосфатно-солевой буфер (PBS, 10 мМ фосфат натрия, pH 7.4, 138 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl),
трис-солевой буфер (TBS, 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 138 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl), бычий
сывороточный альбумин (БСА), β-меркаптоэтанол, Triton X-100 («Sigma», США); ЭДТА
(«Serva», Германия); Nonidet P-40 (NP-40) («Fluka», Германия); дитиотриетол (DTT)
(«Boenhringer Mannheim», Германия); 30% раствор акриламида/бис-акриламида (37.5:1),
10% раствор Tween-20, 20% раствор додецил сульфата натрия (ДСН) приобретали у «BioRad», США.
5.2. Культуры клеток, реагенты и трансфекция
В работе были использованы 8 клеточных линий рака легких человека: NCI-H1299,
Calu-I, NCI-H23, NCI-H460, NCI-H358, A549, NCI-596 и NCI-H292 («American Type
Culture Collection», США) и 23 первичных клеточных линий меланомы человека: Mel_226,
Mel_82, Mel_G, Mel_Ibr, Mel_Il, Mel_Kor, Mel_Kis, Mel_Ksen, Mel_Me, Mel_P, Mel_R,
Mel_Si, Mel_253, Mel_Ch, Mel_259, Mel_Mtp, Mel_263, Mel_Kal, Mel_I, Mel_Cher, Mel_E,
Mel_335.1, Mel_335.2 [168–170], полученные из метастатических узлов пациентов с
меланомой IV степени. Также в работе была использована клеточная линия нормальных
человеческих эпителиальных клеток HBEpC («European Collection of Cell Cultures»,
Великобритания).
Использованные в работе клеточные линии культивировали в пластиковой посуде
«Corning Inc.» (США), в инкубаторе Heracell 150 («Thermo electron corp.», США) при
температуре 37°C, 95% влажности и содержании СО2 5%. Клетки линий рака легких
человека культивировали в среде DMEM/F12 («HyClone», США) с добавлением 10%-ной
эмбриональной бычьей сыворотки («HyClone», США), 100 мкг/мл стрептомицина и 100
МЕ/мл пенициллина («Gibco», США). Клетки линий меланомы человека культивировали
в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ Lглутамина («HyClone», США), 100 мкг/мл стрептомицина и 100 МЕ/мл пенициллина
51
(«Gibco», США). Линию нормальных человеческих эпителиальных клеток HBEpC
культивировали в среде BEGM, приготовленной из базальной среды (Basal Medium) и
набора SingleQuots™ Kit, содержащего ростовые факторы, цитокины и требуемые
добавки («Lonza», Швейцария).
При пересеве удаляли питательную среду, избавлялись от следов среды и её
компонентов путем добавления к клеткам фосфатно-солевого буфера (PBS) без
содержания Ca2+ и Mg2+ («ICN», Великобритания), затем удаляли буфер и снимали клетки
кратковременной инкубацией в 0,05% растворе трипсина («HyClone» или «Gibco», США).
Затем фермент инактивировали добавлением ростовой среды с сывороткой и пересевали
клетки в необходимой для дальнейшей экспериментальной работы плотности.
На следующий день после рассева, там где это указано, клетки обрабатывали
следующими ингибиторами в течение 18 ч:
1. 20 нг/мл рапамицин (Rapamycin, Rap) – ингибитор сигнального комплекса
mTOR 1 (mTORC1) («Calbiochem», США),
2. 10 мкМ LY294002 (LY2) («Promega», США) – ингибитор фосфоинозитид-3киназы (PI3K),
3. 20 мкМ Akt-inhibitor X (AktX) («Calbiochem», США) – ингибитор
протеинкиназы Akt,
4. 10 мкМ MG132 («Calbiochem», США) – ингибитор протеасом,
5. 20 мкМ PD098059 («Sigma», США) – ингибитор MEK1/2,
6. 0.05, 0.2, 0.5, 2, 5, 10 мкМ GSK3β-inhibitor VIII («Calbiochem», США) –
ингибитор протеинкиназы GSK3β
Трансфекцию клеток проводили с использованием реагента UnifectinTM-56
(«Русбиолинк», Россия), который применяли в соответствии с рекомендациями
производителя.
5.3. Вестерн-блот анализ и антитела
Для подготовки проб, клетки лизировали в буфере для нанесения проб,
содержащим 125 мM Tрис-HCl, pH 6.8, 4% ДСН, 20% глицерола, 10% β-меркаптоэтанола
и 0.01% (вес/объем) бромфенолового синего. Образцы 5 раз пропускали через иглу 26G.
После этого пробы кипятили в течение 5 минут, а затем центрифугировали в течение 30
секунд при 14000 об/мин (настольная мини-центрифуга, «Eppendorf», Германия).
Полученные образцы подвергали электрофорезу в 10% ДСН-ПААГ (толщина геля 0.75
мм) по Лэммли в камере для вертикального электрофореза MiniProtean 3 Cell Gel System
(«Bio-Rad», США) в трис-глициновом буфере (25 мМ Трис, 250 мМ глицина, 0.1 % ДСН)
52
по стандартному протоколу. В качестве стандартов молекулярных весов использовались
Prestained Dual Color Protein Standards («Bio-Rad», США). Лизат нормальных человеческих
эпидермальных меланоцитов был получен от «ScienCell» (США).
Белки переносили на мембрану из поливинилиден дифторида Hybond-P («GE
Healthcare», Великобритания) с использованием буфера (25 мМ Трис, 250 мМ глицина,
20% метанол) и прибора для переноса производства «Sigma», США. Для предотвращения
неспецифического связывания, мембрану инкубировали в блокирующем буфере TBS (50
мМ Трис-HCl pH=8.0, 138 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl), содержщим 0,1% Tween-20 (TBS-T) и
5% реагента для блокировки ECL Blocking Agent («GE Healthcare», Великобритания) в
течение 1 ч при комнатной температуре. После блокировки мембрану инкубировали с
первичными антителами при 4°С в течение ночи в блокирующем буфере. Затем мембрану
промывали 3 раза буфером TBS-T и инкубировали с конъюгированными с пероксидазой
хрена
вторичными
антителами
против
иммуноглобулинов
мыши
или
кролика,
соответственно, («GE Healthcare», Великобритания) в разведении 1:5000 в блокирующем
буфере при комнатной температуре в течение 1 часа. После чего мембрану снова
промывали 3 раза буфером TBS-T. Связавшиеся антитела детектировали с помощью
реагента Immobilon Western Chemiluminescence HRP Substrate («Millipore», США). Для
детекции тубулина использовали набор для мечения антител WesternDot™ 625 Western
Blot Kit («Invitrogen», США). Хемилюминесценцию детектировали с помощью системы
гель-документации ChemiDoc XRS Gel Documentation System («BioRad», США) и
интенсивность сигнала анализировали с помощью программного обеспечения QuantityOne
4.6.2 software («BioRad», США). В работе представлены измерения интенсивности сигнала
в виде среднего значения для трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение,
показанное с помощью планок погрешностей.
В работе использовали следующие антитела: мышиные моноклональные анти-αтубулин (клон DM1α) антитела производства «Sigma», США, кроличьи поликлональные
антитела против белка Pdcd4, полученные ранее в нашей лаборатории [108],
поликлональные кроличьи
антитела к
протеинкиназам Akt и
p70S6K1, и их
фосфорилированным формам: по серину-473 для протеинкиназы Akt (phospho-Akt), и по
треонину-389 – для S6 киназы 1 (Phospho-p70S6K1) («Cell Signaling», США).
5.4. Выделение РНК и ПЦР в реальном времени
Для определения относительного содержания транскрипта Pdcd4 методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ, Real-Time
53
PCR) тотальную РНК выделяли из образцов, приготовленных из клеточных линий рака
легких и нормальных человеческих эпителиальных клеток HBEpC, при помощи набора
реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия). Затем образцы обрабатывали на колонке
с ДНКазой I («Qiagen», Германия). Процедуру выделения РНК проводили в условиях,
рекомендованных производителем набора. Концентрацию и чистоту выделенной РНК
определяли при помощи спектрофотометра NanoDrop 8000 («Thermo Scientific», США).
Полученную тотальную РНК использовали для получения первой цепи кДНК с помощью
обратной транскриптазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы) Super Script III и с
использованием случайных гексануклеотидных праймеров [d(N)6] (random hexamers)
(«Invitrogen», США). Для каждой реакции обратной транскрипции брали по 2 мкг
тотальной РНК. Первая цепь кДНК далее была использована в качестве матрицы для
ПЦР-РВ. Для амплификации фрагмента кДНК гена Pdcd4 размером 136 нт для ПЦР-РВ
использовали
олигонуклеотидные
5`-cctccacatcatacacctgtcc-3`
праймеры:
(соответствующие
5`-actgtgccaaccagtccaaagg-3`
554-575
нт
и
668-689
нт
и
на
комплементарной цепи, мРНК гена Pdcd4, номер последовательности NM_014456 в базе
данных GeneBank). Для нормализации уровня транскрипта гена Pdcd4 использовали
уровень транскрипта гена GAPDH. Для амплификации фрагмента кДНК гена GAPDH
человека размером 131 нт на матрице кДНК из клеточных линий рака легкого
использовали
олигонуклеотидные
5`-accaccctgttgctgtagccaa-3`
праймеры:
(соответствующие
5`-gtctcctctgacttcaacagcg-3`
1032-1053
нт
и
1141-1162
нт
и
на
комплементарной цепи, мРНК гена GAPDH, номер последовательности NM_002046 в базе
данных GeneBank). ПЦР-РВ проводили в пластиковых пробирках для ПЦР объемом 0,2
мл («Corning Incorporated», США) с помощью реагентов для амплификации ДНК SYBR
GREEN JumpStart Tag Ready Mix («Sigma», США) в соответствии с протоколом
производителя. ПЦР в реальном времени проводили на ПЦР-приборе Opticon real-time
PCR cycler («BioRad», США). ПЦР-РВ проводили при условиях указанных в Таблице 1.
Таблица 1. Условия проведения реакции ПЦР-РВ для определения относительного
количества транскрипта Pdcd4.
Температура,
°C
94
94
60
Для
определения
Время,
сек
120
15
60
относительного
Количество
циклов
1
50
количества
транскрипта
использовали
сравнительный ∆∆Сt-метод (2-∆∆Сt), где количество мишени Pdcd4 нормировано на
54
количество эндогенного контроля GAPDH. В работе данные представлены в виде среднего
значения для трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение, показанное с
помощью планок погрешностей.
Для определения относительного содержания микроРНК miR-21 методом ПЦР-РВ
тотальную РНК, включающую малые РНК размером от 18 нт и выше, выделяли из
клеточных лизатов линий рака легких и нормальных человеческих эпителиальных клеток
HBEpC при помощи набора реагентов miRNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия). Затем
образцы обрабатывали на колонке ДНКазой I («Qiagen», Германия). Реакцию проводили в
условиях, рекомендованных производителем набора для выделения. Концентрацию и
чистоту выделенной РНК определяли при помощи спектрофотометра NanoDrop 8000
(«Thermo Scientific», США). Полученную РНК далее использовали для получения первой
цепи кДНК в реакции полиаденилирования и обратной транскрипции при помощи набора
реагентов miScript Reverse Transcription Kit («Qiagen», Германия). Реакцию проводили в
условиях, рекомендованных производителем набора. В каждой реакции обратной
транскрипции использовали по 0,5 мкг РНК. Первая цепь кДНК далее была использована
в качестве матрицы для ПЦР-РВ, которую проводили в пластиковых пробирках для ПЦР
объемом 0,2 мл («Corning Incorporated», США) с помощью реагентов для амплификации
miScript SYBR Green PCR Kit («Qiagen», Германия) и miScript Primer Assay («Qiagen»,
Германия) в соответствии с протоколом производителя. В реакции использовали
универсальный праймер для микроРНК (miScript Universal Primer, «Qiagen», Германия) и
специфические праймеры для микроРНК miR-21 и эндогенной контрольной РНК RNU6B
(miScript Primer Assay «Qiagen», Германия). ПЦР в реальном времени проводили на ПЦРприборе Opticon real-time PCR cycler («BioRad», США). ПЦР-РВ проводили при условиях,
указанных в Таблице 2.
Таблица 2. Условия проведения реакции ПЦР-РВ для определения относительного
количества микроРНК miR-21
Температура,
°C
95
94
55
70
Время,
сек
900
15
30
30
Количество
циклов
1
40
Для определения относительного количества микроРНК miR-21 использовали
сравнительный
∆∆Сt-метод
(2-∆∆Сt),
где
количество
мишени
микроРНК
miR-21
нормировано на количество эндогенного контроля RNU6B. Данные представлены в виде
55
среднего значения для трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение,
показанное с помощью планок погрешностей.
5.5. Ферменты
5.5.1. Гидролиз ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции
В работе использовали эндонуклеазы рестрикции EcoRI, EcoRV, BamHI, SalI, NotI,
HindIII, XhoI, KpnI, Cfr9I, NcoI, AflII, StuI и DpnI производства «Fermentas» (Литва) или
«Promega» (США). Реакции рестрикции проводили в объеме 15-50 мкл при 37°С в течение
1-2 часов в соответствующем буфере, рекомендованном производителем ферментов.
5.5.2. Обработка фрагментов ДНК фрагментом Кленова
Достраивание 5`-выступающих концов ДНК, образующихся при расщеплении
рестриктазами, проводили в присутствии ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова)
(«Fermentas», Литва), смеси dATP, dCTP, dTTP, dGTP и инкубировали при 30°С в течение
30 минут.
5.5.3. Лигирование фрагментов ДНК
Для лигирования фрагментов ДНК использовали T4 DNA Ligase («Invitrogen»,
США) в соответствии с рекомендациями производителя. Реакции лигирования проводили
в объеме 10-15 мкл и инкубировали в течение ночи при 16°С.
5.6. Получение плазмидных конструкций
5.6.1. Бактериальные штаммы, среды, реактивы, антибиотики
В работе использовали штамм Escherichia coli XL1-Blue MRF´ («Stratagene»,
США). Клетки E.coli культивировали в жидкой среде Miller’s LB broth (0.171 М NaCl, 1%
триптон, 0.5% дрожжевой экстракт) («BD Bioscience», США) при 37°С. Для заливки
чашек Петри к среде LB добавляли бактериальный агар («BD Bioscience», США) до
концентрации 1.5 %. В работе использовали следующие реагенты: натриевая соль
ампициллина (ОАО «Синтез» г. Курган, Россия), канамицинсульфат (ОАО «Биохимик», г.
Саранск, Россия), тетрациклингидрохлорид («Sigma», США), 5-бромо-4-хлоро-3-индолилβ-D-галактопиранозид (X-gal) и изопропил-β-D-тиогалактозид (ИПТГ) производства
«Fermentas», Литва.
56
5.6.2. Приготовление компетентных клеток E. coli
Бактерии штамма E. сoli XL1-Blue MRF´ высевали на чашку, содержащую с
тетрациклином (12.5 мкг/мл), и растили ночь. На следующий день инокулировали 10 мл
LB без антибиотика ночной культурой и снова растили в течение ночи. На следующий
день переносили 2 мл ночной культуры в 200 мл среды LB без антибиотика и растили с
интенсивной аэрацией до достижения оптической плотности 0.45-0.55 при 600 нм.
Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Genesys 10 Uv Spectrophotometer
(«Thermo Scientific», США). Культуру бактерий охлаждали на ледяной бане в течение 2
часов и затем центрифугировали при 2500g в течение 15 мин при 4°С. Клеточный осадок
ресуспендировали в ледяном буфере (40 мМ ацетат натрия pH 5.5, 100 мМ CaCl2, 70 мМ
MgCl2) и выдерживали на ледяной бане в течение 45 мин. Клетки осаждали
центрифугированием при 1800g в течение 10 мин при 4°С, осадок ресуспендировали в
холодном буфере (40 мМ ацетат натрия pH 5.5, 100 мМ CaCl2, 70 мМ MgCl2, 15%
глицерина). Клеточную суспензию разливали в аликвоты по 100 мкл и замораживали в
жидком азоте. Клетки хранили при -70°С.
5.6.3. Трансформация клеток E. сoli
Для трансформации к аликвоте (100 мкл) компетентных клеток E.coli добавляли
плазмидную ДНК, перемешивали и инкубировали на ледяной бане в течение 30 мин. Для
проведения теплового шока клетки помещали на 50 сек в водяную баню с температурой
42°С, потом быстро переносили в ледяную баню на 1 мин. Суспензию клеток переносили
в 1 мл среды LB без антибиотиков и инкубировали клетки при интенсивном
перемешивании при 37°С в течение 1 часа и высевали на чашки с селективным LB-агаром.
Чашки инкубировали в течение ночи 37°С.
5.6.4. Секвенирование ДНК
Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM®
BigDye™
Terminator v. 3.1
с последующим анализом продуктов реакции на
автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant в Межинститутском Центре
коллективного пользования «Геном» Федерального государственного бюджетного
учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской
академии наук (http://www.genome-centre.narod.ru).
57
5.6.5. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli
Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора GenElute Plasmid
MiniPrep Kit («Sigma», США) в соответствии с протоколом производителя.
5.6.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле (Certified Molecular Biology Agarose, «BioRad», США) проводили в буфере ТAЕ (40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА, рН 7.6) при
постоянном напряжении электрического поля 120В. В буфер добавляли бромистый
этидий («Fluka», Швейцария) до конечной концентрации 0.00005%. Для внесения
образцов в лунки геля использовали шестикратный буфер для нанесения 6X Orange
Loading Dye Solution («Fermentas», Литва). В качестве маркеров молекулярного веса
фрагментов ДНК использовали 1 kb DNA Ladder («Fermentas», Литва).
5.6.7. Очистка фрагментов ДНК
Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля, очистку продуктов ПЦР и реакций
рестрикции проводили с использованием набора QIAEX II Gel Extraction Kit («Qiagen»,
Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.
5.6.8. Полимеразная цепная реакция
ПЦР-смесь включала в себя воду и реагенты производства «Invitrogen», США:
набор dNTP, высокоспецифичную Pfx Platinum ДНК-полимеразу, 1 х буфер и раствор
MgCl2 в концентрациях, рекомендованными производителем фермента. ПЦР проводили
на приборе DNA Engine Dyad thermal cycler («Bio-Rad», США).
5.6.9. Клонирование продуктов ПЦР
Для клонирования продуктов ПЦР в плазмидные вектора использовали набор Zero
Blunt® PCR Cloning Kit («Invitrogen», США) в соответствии с протоколом производителя.
5.6.10. Получение плазмидных конструкций
В работе использовали плазмидные вектора pGL3-Basic, pGL3-Control, pRL-CMV
производства («Promega», США), pBluescriptSK(-) («Stratagene», США) и pCR-Blunt
(Invitrogen», США).
58
Рекомбинантную
плазмиду
pRL-Pd4-3UTR
получали
следующим
образом.
Фрагмент 3`-нетранслируемой области (3`-НТО) человеческого гена Pdcd4 размером 676
нт (номер последовательности NM_014456 в базе данных GeneBank, 1682-2357 нт),
начиная от четырех последних кодирующих кодонов до альтернативного сайта
полиаденилирования,
был
амплифицирован
при
помощи
специфических
олигонуклеотидных праймеров (5`-ccagagagctactgaatataaga-3` и 5`-aaagaatcaatactgcttcacatg3`) на матрице геномной ДНК, выделенной из культуры клеток человека линии Raji.
Полученный продукт ПЦР клонировали в промежуточный плазмидный вектор pCR-Blunt
(Invitrogen», США). После определения правильной ориентации вставки (праймеры M13
прямой и M13 обратный; Zero Blunt® PCR Cloning Kit «Invitrogen», США), фрагмент
субклонировали по сайтам NotI и BamHI в плазмидный вектор pRL-CMV («Promega»,
США) таким образом, что клонируемая последовательность располагается на месте SV40
сигнала позднего полиаденилирования, с тем чтобы связать его с 3`концом репортерного
гена люциферазы Renilla. Плазмида обозначена pRL-Pd4-3UTR.
Мутацию и делецию сайта связывания микроРНК miR-21 проводили в полученном
векторе pCR-Pd4-3UTR согласно Frankel с соавторами и Zhu с соавторами [63,75] Для
этого использовали набор для сайт-направленного мутагенеза QuickChange («Agilent
Technologies», США) и следующие олигонуклеотиды:
miR-21
mut:
5`-gtggaatattctaataacgtaccttttgtaagtgccatg-3`
и
5`-catggcacttacaaaaggtacgttattagaatattccac-3`;
miR-21∆:
5'-aaagtaacctcttcttaagtggaatatccttttgtaagtgccatgttta-3'
и
5'-taaacatggcacttacaaaaggatattccacttaagaagaggttacttt-3').
Далее, субфрагменты, несущие мутацию и делецию, из исходной плазмиды pCRPd4-3UTR клонировали в плазмидный вектор pRL-CMV («Promega», США) по сайтам
NotI и BamHI. Полученные рекомбинантные плазмиды были обозначены pRL-Pd4 3UTR
miR21mut и pRL-Pd4 3UTR miR21∆.
Мутацию в сайте связывания микроРНК miR-183 в векторе pCR-Pd4-3UTR
проводили согласно Li с соавторами [71]. 3`-НТО гена Pdcd4 был амплифицирован при
помощи двух пар праймеров: M13-прямой/5`-gattagataataaacacgtaatttacaaaaggtagc-3` и
5`-gctaccttttgtaaattacgtgtttattatctaatc-3`/M13-обратный. Далее амплифицированные участки
отжигались и полноразмерный участок 3`-НТО гена Pdcd4 был амплифицирован при
помощи фланкирующих праймеров (M13-прямой и M13-обратный; Zero Blunt® PCR
Cloning Kit «Invitrogen», США). А затем полученный ПЦР продукт клонировали в
промежуточный плазмидный вектор pCR-Blunt (Invitrogen», США) и полученную
плазмиду обозначили pCR-Pd4-3UTR-miR183mut. Далее из полученной плазмиды pCR-
59
Pd4-3UTR-miR183mut вырезали фрагмент, содержащий 3`-НТО гена Pdcd4 с мутацией в
сайте связывания микроРНК miR-183, по сайтам EcoR1-EcoR1 и субклонировали по
соответствующим сайтам в плазмиду pRL-Pd4-3UTR для того, чтобы заменить
немутированный участок 3`-НТО. Последовательность полученной рекомбинантной
плазмиды проверяли секвенированием.
Рекомбинантную плазмиду pGL3-Pd4 получали следующим образом. Участок
промотора человеческого гена Pdcd4 размером 3559 нт амплифицировали при помощи
специфических
олигонуклеотидных
праймеров
(5`-ctgagaagagttgtgggtaaag-3`
и
5`-ctcacaggatttcagtccagc-3`) на матрице геномной ДНК из культуры клеток человека линии
Raji. Полученный продукт ПЦР клонировали в промежуточный вектор pCR-Blunt
(«Invitrogen», США). После определения правильной ориентации вставки (праймеры M13
прямой и M13 обратный; Zero Blunt® PCR Cloning Kit «Invitrogen», США), фрагмент
субклонировали по сайтам EcoRV и EcoRI в плазмидный вектор pBluescriptSK(-)
(«Stratagene», США). Полученную плазмиду обозначили pBl-Pd4. Затем из полученной
плазмиды pBl-Pd4 вырезали фрагмент по сайтам KpnI и Cfr9I, который субклонировали по
соответствующим сайтам в плазмидный вектор pGL3-Basic («Promega», США). Плазмиду,
полученную на данном этапе обозначили pGL3-Pd4.
Делеции
5`-участков
промотора
Pdcd4
проводили
в
плазмиде
pBl-Pd4.
Рекомбинантную плазмиду pBl-Pd4-∆839 получали следующим образом. Из плазмиды
pBl-Pd4 по сайтам SalI и AflII вырезали фрагмент, затем концы последовательности
плазмиды достраивали фрагментом Кленова («Fermentas», Литва), лигировали и
полученную плазмиду обозначили pBl-Pd4-∆839. Для получения плазмиды pBl-Pd4-∆1022
из плазмиды pBl-Pd4 вырезали фрагмент по сайтам SalI и StuI, затем выступающий
5`-конец, образованный при расщеплении рестриктазой SalI в векторе достраивали
фрагментом Кленова («Fermentas», Литва) и лигировали. Для получения плазмиды
pBl-Pd4-∆1803 из плазмиды pBl-Pd4 вырезали фрагмент по сайтам рестрикции SalI и NdeI,
затем полученный вектор обрабатывали фрагментом Кленова («Fermentas», Литва) и
лигировали. Для получения плазмиды pBl-Pd4-∆2231 из плазмиды pBl-Pd4 по сайтам
рестрикции XhoI и NcoI вырезали фрагмент, затем концы обрабатывали фрагментом
Кленова («Fermentas», Литва) и лигировали. Для получения плазмиды pBl-Pd4-∆2636 из
плазмиды pBl-Pd4 вырезали фрагмент по сайтам рестрикции HindIII-HindIII, затем
провели лигирование. Для получения плазмид pGL3-Pd4-∆839, pGL3-Pd4-∆1022, pGL3Pd4-∆1803, pGL3-Pd4-∆2231, и pGL3-Pd4-∆2636 из соответствующих плазмид pBl-Pd4
(pBl-Pd4-∆839,
pBl-Pd4-∆1022,
pBl-Pd4-∆1803,
pBl-Pd4-∆2231
и
pBl-Pd4-∆2636,
соответственно) были вырезаны фрагменты по сайтам KpnI и Cfr9I. Вырезанные
60
фрагменты затем субклонировали по соответствующим сайтам в вектор pGL3-Basic. Для
получения двух других делеционных мутантов соответствующие области промотора гена
Pdcd4 амплифицировали при помощи ПЦР и клонировали в промежуточный плазмидный
вектор pCR-Blunt. Затем фрагмент субклонировали по сайтам KpnI и Cfr9I в
соответствующие
сайты
плазмидного
вектора
соответствующих
плазмид
при
олигонуклеотиды:
плазмида
pGL3-Pd4-∆3027
pGL3-Basic.
амплификации
Для
использовали
получения
следующие
(5`-ggtaccaggggtcagtaccagtag-3`
и
5`-cccgggaacctccgccagagggg-3`), плазмида pGL3-FTss-R3027 (5`-ggtacccactcctctcccttttcc-3` и
5`-cccgggctactggtactgacccc-3`).
Плазмиду pGL3-Pd4-∆2636-∆FoxD3, содержащую делецию в сайте связывания
транскрипционного фактора семейства forkhead box, получали следующим образом.
Делеция последовательности длиной 18 нт на участке промотора человеческого гена
Pdcd4, которая содержит вероятный сайт связывания транскрипционного фактора
семейства forkhead box, была сделана на плазмиде pBl-Pd4-∆2636 при помощи набора для
сайт-направленного мутагенеза QuickChange («Agilent Technologies», США) с помощью
следующих
олигонуклеотидов:
5'-tgttactgggtagaaggcgagaagggccagag-3'
и
5'-ctctggcccttctcgccttctacccagtaaca-3'. После проведения мутагенеза фрагмент вырезали по
сайтам KpnI и Cfr9I из плазмиды pBl-Pd4-∆2636 и субклонировали в плазмиду pGL3-Basic
по соответствующим сайтам. Все позиции делеционных фрагментов промотора гена
Pdcd4 указаны в Таблице 3. Все клонированные фрагменты проверяли секвенированием.
Таблица 3. В таблице суммированы созданные в данной работе плазмидные
конструкции участка промотора человеческого гена Pdcd4, длины фрагментов и их
позиции (детали клонирования указаны в тексте).
плазмида
длина
положение
pBl-Pd4
3559
-2916/642
pGL3-Pd4
3401
-2851/+550
pGL3-Pd4-∆839
2585
-2035/+550
pGL3-Pd4-∆1022
2402
-1852/+550
pGL3-Pd4-∆1803
1621
-1071/+550
pGL3-Pd4-∆2231
1149
-599/+550
pGL3-Pd4-∆2636
775
-225/+550
pGL3-Pd4-∆3027
366
-179/+544
pGL3-Pd4 FTss-R3027
249
-53/+196
pGL3-Pd4-∆2636-∆FoxD3
757
-225/+550 ∆+61-78
61
5.7. Двойной люциферазный анализ
Для исследования эффекта участка 3`-НТО на экспрессию репортерного гена,
клетки
линии
NCI-H1299
и
Calu-I
трансфицировали
плазмидой
pRL-CMV
с
клонированным участком 3`-НТО Pdcd4 или его мутированной версией, а так же
плазмидой pGL3-Control, которая кодирует люциферазу светлячка под контролем
промотора и энхансера SV40. Активности люциферазы Renilla и люциферазы светлячка
определяли через 48 часов после трансфекции при помощи набора реагентов «DualLuciferase® Reporter Assay System» производства («Promega», США). Для каждого анализа
каждая экспериментальная точка измерялась трижды. Активность люциферазы Renilla
нормализировали на активность люциферазы светлячка для каждой лунки. Затем
подсчитывали среднее значение активности и ± стандартное отклонение. Каждый
эксперимент
повторяли
трижды
для
подтверждения
достоверности
полученных
результатов.
Для анализа активности промотора Pdcd4 клетки линии NCI-H1299 и Calu-I
трансфицировали плазмидой, содержащей люциферазу светлячка под контролем
промотора гена Pdcd4, и плазмидой pRL-CMV, кодирующей люциферазу Renilla под
контролем конститутивного промотора CMV. Относительные значения активности
промотора подсчитывали, как описано выше, но люцифераза светлячка была нормирована
на люциферазу Renilla.
Активацию промотора Pdcd4 детектировали с использованием набора реагентов
«Dual-Luciferase® Reporter Assay System» производства («Promega», США). Для
проведения двойного люциферазного анализа клетки линий рака легких человека
высевали в 24-луночный планшет, в количестве 1,5х105 клеток на лунку. Через 18-20
часов клетки трансфицировали 100 нг плазмидной ДНК pGL3 («Promega», США), 2 нг
плазмидной ДНК pRL-CMV («Promega», США). Через 48 часов после трансфекции клетки
лизировали и детектировали интенсивность биолюминесценции в образцах, используя
люменометр
Glomax
20\20
Luminometer
(«Promega»,
США)
в
соответствии
с
рекомендациями производителя. Каждый эксперимент проводили 3 раза, после чего
вычисляли арифметическое среднее значение и стандартное отклонение.
5.8. Статистическая обработка результатов
При обработке результатов двойного люциферазного анализа, ПЦР в реальном
времени, а так же при измерении интенсивности сигнала антител при Вестерн-блот
анализе, использовали стандартные статистические методы. Измерения проводились как
62
минимум в трех независимых экспериментах, после чего вычисляли арифметическое
среднее значение для трех независимых измерений ± стандартное отклонение, показанное
с помощью планок погрешностей. Оценку достоверности различий между исследуемыми
группами проводили с использованием U-теста Манна-Уитни. Вычисление проводили с
помощью
онлайн
программы
статистической
обработки
http://www.psychol-
ok.ru/statistics/mann-whitney/. Различия средних показателей считали достоверными при
уровне значимости менее 0.05.
63
6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
6.1. Анализ экспрессии Pdcd4 в клетках меланомы человека
6.1.1. Уровень белка Pdcd4 в клетках меланомы и нормальных меланоцитах
Функциональная роль Pdcd4 как супрессора опухолевого роста впервые была
показана на примере рака кожи, на модели мышиных эпидермальных клеток линии JB6,
претерпевающих неопластическую трансформацию [4]. Меланома – одна из наиболее
агрессивных форм опухолей, отличающаяся способностью быстро распространяться через
лимфатические
и
кровяные
русла
организма
[171,172].
Способность
быстро
метастазировать на ранних стадиях заболевания обуславливает высокую смертность
больных, а также часто наблюдаемую неэффективность проводимого лечения, что делает
актуальным поиск новых способов терапии меланомы, в том числе с учетом
индивидуальных молекулярных особенностей опухоли.
Экспрессия супрессора опухолевого роста Pdcd4, как это было показано на примере
рака толстой кишки [84], немелкоклеточного рака легких [108,109], глиомы [106],
гепатоклеточной карциномы [96], плоскоклеточной карциномы полости рта [127], часто
снижена в опухолевых клетках. Известно, что потеря экспрессии белка Pdcd4 в
большинстве случаев связана с прогрессией раковых опухолей. Такая корреляция была
показана для опухолей кишечника [84], яичников [128] и рака легких [109]. Однако
изменение уровня экспрессии Pdcd4 в клетках меланом остается малоизученым. Так, в
недавно опубликованной работе авторы показали, что уровень транскрипта Pdcd4 и его
продукта белка Pdcd4 снижены в клетках мышиной меланомы линии B16 по сравнению с
клетками нормальной ткани [173]. При экспериментальном повышении экспрессии Pdcd4
в этих клетках скорость их пролиферации и миграции снижалась. Все эти данные
свидетельствуют о возможной роли сохранения уровня экспрессии белка Pdcd4 как
фактора, препятствующему развитию и прогрессии меланом.
Поскольку роль Pdcd4 в прогрессии меланомы остается неизвестной, нами был
проведен анализ экспрессии Pdcd4 на панели клеточных линий меланом человека.
Сначала был проанализирован уровень экспрессии Pdcd4 в нормальных человеческих
эпидермальных меланоцитах (HEM) с помощью Вестерн-блот анализа клеточного лизата
и антител к белку Pdcd4. Антитела против белка Pdcd4 были получены ранее в нашей
лаборатории, для них была показана высокая специфичность и способность детектировать
белок Pdcd4 на эндогенном уровне [108]. В результате проведенного эксперимента в
лизате нормальных меланоцитов человека с помощью антител к Pdcd4 выявилась
64
единственная полоса, положение которой совпадало с экспериментальной подвижностью
белка Pdcd4 на уровне 60 кДа (Рис. 13). Таким образом, получено экспериментальное
подтверждение того, что в клетках нормальных меланоцитов человеческой кожи в норме
экспрессируется супрессор опухолевого роста Pdcd4.
Рис. 13. Экспрессия Pdcd4 в нормальных человеческих эпидермальных меланоцитах.
Показан результат Вестерн-блот анализа лизата нормальных человеческих эпидермальных
меланоцитов (HEM) с антителами против Pdcd4. Антитела против Pdcd4 детектируют
единственную белковую полосу с молекулярным весом около 60 кДа, что соответствует
экспериментальной подвижности белка Pdcd4. Положения маркеров молекулярных весов (MW)
отмечены слева, молекулярные веса приведены в кДа.
Статус экспрессии Pdcd4 в клетках человеческой меланомы был определен для 23
первичных клеточных линий, полученных из резецированных меланом человека. Затем
был проведен сравнительный анализ полученных данных с уровнем экспрессии Pdcd4 в
нормальных эпидермальных меланоцитах. В 6-ти клеточных линиях (Mel_253, Mel_Ch,
Mel_82, Mel_R, Mel_Ksen и Mel_E) уровень белка Pdcd4 был значительно ниже, чем в
нормальных меланоцитах (снижение уровня белка в 2.5 раза и более по сравнению с
уровнем белка в нормальных меланоцитах), в 3-ех других клеточных линиях (Mel_Kor,
Mel_Cher и Mel_259) уровень Pdcd4 был умерено понижен (снижение уровня белка в
диапазоне от 2.5 до 1.5 раз по сравнению с уровнем белка в нормальных меланоцитах)
(Рис. 14). В остальных 14-ти клеточных линиях уровень экспрессии белка Pdcd4 был схож
или, в некоторых случаях, даже повышен по сравнению с его уровнем в нормальных
меланоцитах (Рис. 14). Таким образом, снижение уровня белка Pdcd4 наблюдалось только
в четверти исследованных клеточных линий меланомы. Тот факт, что все клеточные
линии были получены на стадии прогрессирующей меланомы, указывает на то, что
снижение уровня белка Pdcd4, по всей видимости, не является решающим фактором в её
прогрессии.
65
Рис. 14. Экспрессия Pdcd4 в клеточных линиях человеческой меланомы. Результаты
анализа уровня белка Pdcd4 с помощью Вестерн-блоттинга в лизатах клеток меланом и
нормальных меланоцитах. Детекцию белка Pdcd4 проводили в лизатах клеток указанных линий
меланом и нормальных человеческих эпидермальных меланоцитах (HEM) при помощи антител
против Pdcd4 (Pdcd4). Для нормирования общего уровня белка в клеточных лизатах мембрану
также окрашивали антителами против α-тубулина. В клетках линии Mel_253, Mel_Ch, Mel_82,
Mel_R, Mel_Ksen и Mel_E уровень белка Pdcd4 был значительно ниже, чем в нормальных
меланоцитах; в клетках линии Mel_Kor, Mel_Cher и Mel_259 уровень белка Pdcd4 был умеренно
понижен; в клетках линии Mel_G, Mel_Si, Mel_226, Mel_Mtp, Mel_263, Mel_Kal, Mel_I, Mel_Kis и
Mel_Ibr уровень белка Pdcd4 был схож или, в некоторых случаях, даже повышен (Mel_335.1,
Mel_335.2, Mel_Il, Mel_Me и Mel_P) по сравнению с его уровнем в нормальных меланоцитах.
Особенности уровня экспрессии белка Pdcd4 при меланоме выявлены нами
впервые. В дополнение к нашим данным мы провели анализ экспрессии гена Pdcd4 в
меланомах с использованием данных базы экспрессии раковых генов Oncomine
[OncomineTM, Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI]. Результаты анализа показали, что
уровень мРНК Pdcd4 в меланомах был понижен в 2.496 раз (данные, депонированные
Haqq и коллегами) (Рис. 15А) и в 4.018 раза по результатам анализа данных,
депонированных Riker и коллегами (Рис. 15Б), по сравнению с нормальной тканью кожи
[175,176]. Таким образом, анализ по базе данных ДНК-микрочипов Oncomine показал
снижение экспрессии гена Pdcd4 в образцах меланом по сравнению с нормальной кожей,
что подтверждает полученные нами данные для подгруппы клеточных линий меланом.
66
Рис. 15. Уровень мРНК Pdcd4 понижен при меланоме. Для анализа и визуализации его
результатов была использована база данных OncomineTM (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI).
Данные по анализу экспрессии генов в меланомах, депонированных Hagg и коллегами (A) [176], а
так же Riker с коллегами (Б) [175], были получены, с использованием следующих фильтров –
Analysis type: Melanoma vs. Normal и Cancer type: Cutaneous Melanoma; и параметров – pvalue=0.05; fold change=2; gene rank=top 10%. Пониженный уровень гена Pdcd4 был выявлен в
обоих случаях: кратность изменения -2.496 для данных Haqq и др., и -4.018 для данных Riker и др.
по сравнению с нормальной тканью кожи.
Выявленная вариабельность экспрессии Pdcd4 в клетках линий меланом человека,
может отражать известное разнообразие клинических форм меланомы кожи. Как показали
последние исследования, отличительная черта меланомы – это её высокая вариабельность
на молекулярном уровне [177]. Необходимым условием для проведения эффективного
лечения меланомы является диагностика ее подтипа. Сегодня авторы исследований в
области меланомы предлагают классифицировать злокачественную меланому на
молекулярные подтипы, в отличие от традиционных гистологических [177,178]. Такой
подход
позволит
персонализировать
лечение
за
счет
возможности
выбора
терапевтических подходов, отражающие все последние научные, клинические и
технические достижения в этой области, что в итоге повысит эффективность лечения.
Поэтому, найденная вариабельность уровня экспрессии белка Pdcd4 в меланомных
клетках человека можно рассматривать как один из параметров молекулярного
типирования меланомы, позволяющий выделить группу опухолей со сниженным уровнем
67
супрессора опухолевого роста Pdcd4. Такие опухоли, в свою очередь, могут
характеризоваться специфическими молекулярными особенностями, существенными для
выбора оптимального способа лечения. Таким образом, нами установлено, что экспрессия
супрессора опухолевого роста Pdcd4 снижена в ~ четверти меланом по сравнению с
нормальными меланоцитами, и статус экспрессии Pdcd4 позволяет выделить по этому
молекулярному параметру группу опухолей.
6.1.2. Роль Akt и MEK/ERK сигнальных путей в супрессии Pdcd4 в клетках
меланомы
К настоящему времени описаны два основных механизма, ответственных за
супрессию Pdcd4 в опухолевых клетках – это микроРНК-зависимая деградация
транскрипта Pdcd4 и ингибирование трансляции с него, а также Akt/mTOR/S6K1зависимая протеолитическая деградация белка Pdcd4 [179]. МикроРНК-зависимая
супрессия является одним из основных механизмов, который приводит к снижению
уровня белка Pdcd4 в опухолевых клетках [91,180]. При детальном исследовании
оказалось, что повышения уровня микроРНК miR-21 и miR-183 не происходит в ходе
прогрессии меланомы [181]. Эти данные указывают на то, что микроРНК не всегда
является причиной супрессии Pdcd4 в клетках меланомы, и за его супрессию в этом
случае ответственны другие механизмы. Важно отметить, что при этом Akt-сигнальный
путь, являющийся ключевым регулятором, ответственным за супрессию белка Pdcd4,
часто активирован в клетках человеческой меланомы [182]. Авторы работы измеряли
активность Akt-сигнального пути иммуногистохимически при помощи антител к
фосфорилированному Akt в клетках меланомы человека линий Hs294T, SKMel5,
SKMel28, WM115 и WM164, а также в нормальных клетках пигментного эпителия
сетчатки RPE и нормальных клетках человеческих меланоцитов NHEM. Оказалось, что
Akt-сигнальный путь активирован в 66,3% процентах исследованных клеточных линий
меланомы, тогда как в нормальных клетках фосфорилированного Akt не наблюдалось.
Полученные данные указывают на то, что активация Akt-сигнального пути может
являться ранним предвестником прогрессии меланомы [182] и в значительной степени
способствует прогрессии опухоли [183,184].
Именно поэтому нами была исследована роль Akt-сигнального пути в супрессии
уровня Pdcd4 в клетках меланомы. Для этого были использованы ингибитор киназы PI3K,
которая в сигнальном пути стоит “выше” киназы Akt, и также ингибитор комплекса
mTORC1, который в сигнальном пути стоит “ниже” киназы Akt. PI3K киназу
ингибировали при помощи ингибитора LY294002, а mTORC1 – при помощи рапамицина.
68
В целом следует отметить, что обработка клеток обоими ингибиторами приводила к
повышению уровня белка Pdcd4. В меланомных клеточных линиях Mel_253, Mel_Ch и
Mel_R, для которых был показан наиболее низкий уровень белка Pdcd4 (Рис. 14), при
обработке ингибиторами было отмечено повышение уровня белка Pdcd4 (Рис. 16А). Для
опухолевых клеточных линий Mel_Kor и Mel_Cher, где падение уровня Pdcd4 в сравнении
с нормальными меланоцитами было невысоким, так же наблюдался эффект повышения
уровня Pdcd4 в присутствии ингибиторов (Рис. 16Б). В клетках линий Mel_Me и Mel_Si, в
которых уровень белка Pdcd4 оставался неизмененным по сравнению с нормальными
меланоцитами (Рис. 16В), отмечалось повышение уровня белка Pdcd4 при добавлении
ингибиторов. В то же время, в клетках линии Mel_335.2 и Mel_P, в которых был отмечен,
наоборот, повышенный уровень Pdcd4 в сравнении с нормальными меланоцитами (см Рис.
14), в присутствии ингибиторов уровень белка Pdcd4 едва заметно повышался или
оставался неизменным в сравнении с клетками в условиях роста в отсутствии ингибиторов
(увеличение уровня белка в 1.5 раза и менее по сравнению с уровнем белка в
необработанных клетках) (Рис. 16Г). Таким образом, в присутствии ингибиторов
Akt/mTOR-сигнального пути повышается уровень белка Pdcd4 в клетках злокачественной
меланомы. Следовательно, PI3/Akt/mTOR-сигнальный путь вовлечен в супрессию Pdcd4 в
клетках меланомы, и ингибирование разных этапов этого сигнального пути приводит к
явному повышению уровня Pdcd4 не только в тех клетках, которые характеризовались
сниженным уровнем белка Pdcd4, но так же и в тех клеточных линиях, где уровень белка
Pdcd4 оставался неизменным (см. Рис. 14).
Известно, что индукция экспрессии Pdcd4 супрессирует клеточную пролиферацию
и приводит к апоптозу [96,98,120,185–187], поэтому повышение уровня Pdcd4 может быть
одним из механизмов противоопухолевого действия ингибиторов Akt-сигнального пути.
Таким образом, ингибиторы Akt-сигнального пути могут представлять интерес как
перспективные средства в лечении меланомы, позволяющие восстановить уровень
супрессора опухолевого роста Pdcd4, тем более что Akt-сигнальный путь рассматривается
как перспективная мишень для воздействия при разработке новых препаратов для лечения
меланомы [183].
69
Рис. 16. Эффект ингибиторов Akt и MEK/ERK сигнальных путей на уровень экспрессии
белка Pdcd4. Лизаты были приготовлены из указанных клеточных линий, обработанных 10 мкМ
ингибитора LY294002 (LY), рапамицином в концентрации 20 нг/мл (Rap), 20 мкМ ингибитора
PD098059 (PD) или из необработанных клеток (-). Уровень экспрессии белка Pdcd4 определяли
Вестерн-блот анализом с помощью анти-Pdcd4 антител (Pdcd4). Для нормирования общего уровня
белка в клеточных лизатах образцы окрашивали антителами против α-тубулина. (A) – клеточные
линии со значительно сниженным уровнем Pdcd4; (Б) – клеточные линии с умеренно пониженным
уровнем Pdcd4; (В) – клеточные линии в которых уровень Pdcd4 сравним с уровнем Pdcd4 в
нормальных эпидермальных меланоцитах; (Г) – клеточные линии с повышенным уровнем Pdcd4
по сравнению с нормальными эпидермальными меланоцитами.
Активация Akt и mTORC1 приводит к пост-трансляционной супрессиии Pdcd4 за
счет фосфорилирования Pdcd4 протеинкиназой S6K1, которое ведет к дальнейшему его
убиквитинилированию и последующей деградации в клетке [28]. Помимо Aktсигнального пути, активация каскада MEK/ERK усиливает протеасомную деградацию
убиквитинилированного Pdcd4, что также вносит вклад в понижение уровня опухолевого
супрессора Pdcd4 в раковых клетках [29]. Поэтому, нам было интересно исследовать
эффект блокирования MEK/ERK-сигнального пути на уровень белка Pdcd4 в опухолевых
клетках меланомы. В наших исследованиях ингибирование MEK1/2 при помощи
70
ингибитора PD098059 привело к увеличению уровня Pdcd4 в тех клетках меланомы, в
которых Pdcd4 был практически потерян (Mel_253, Mel_Ch и Mel_R). В этих же клетках
эффект от рапамицина был так же положительный (Рис. 16A). При действии ингибитора
PD098059 на клетки линии Mel_Kor, Mel_Cher, Mel_Me и Mel_Si не было отмечено
какого-либо заметного эффекта, но в этих же клетках ингибирование Akt/mTORсигнального пути LY294002 и рапамицином приводило к повышению уровня белка Pdcd4
(Рис. 16Б и В). Клетки линии Mel_335.2 и Mel_P, в которых был отмечен высокий уровень
Pdcd4 в сравнении с другими опухолевыми меланомными клеточными линиями,
оказались
практически
нечувствительны
к
действию
PD098059,
так
же
как
нечувствительны к действию двух других ингибиторов (LY294002 и рапамицина) (Рис.
16Г).
Из литературных данных известно, что MEK/ERK-сигнальный путь играет роль в
супрессии Pdcd4 в клетках кожной папилломы и кератиноцитах мыши, а так же в
человеческой линии клеток HEK293 [29]. Полученные нами результаты также указывают
на то, что потеря белка Pdcd4 в клетках человеческой меланомы может быть частично
обусловлена MEK/ERK-зависимым усилением его протеасомной деградации.
Таким образом, выявленный нами факт повышения уровня белка Pdcd4,
обусловленный ингибированием компонентов Akt-сигнального пути, указывает, что
потеря белка Pdcd4 в клетках злокачественной меланомы отчасти обусловлена активацией
Akt-сигнального пути. Этот факт указывает на то, что терапевтический эффект
ингибиторов Akt-сигнального пути может быть частично обусловлен восстановлением
уровня супрессора опухолевого роста Pdcd4. На данный момент, согласно литературным
данным, в клинических испытаниях исследуются 6 основных классов агентов,
направленных на подавление PI3K/Akt/mTOR-сигнального пути [188,189]. Более того, уже
получены данные, указывающие на то, что комбинация ингибиторов Akt-сигнального
пути и MEK/ERK-сигнального пути является перспективной стратегией в лечении
меланомы, так как, как показывают исследования, комбинация ингибиторов обладает
более выраженным антипролиферативным и проапоптотическим действием [190].
Итак, подводя итоги первого раздела можно сказать, что нами был впервые
проведен анализ уровня экспрессии Pdcd4 в меланомах, который показал, что супрессия
Pdcd4 наблюдается в четверти первичных клеточных линий, полученных из человеческих
тканей резецированных меланом. Потеря белка Pdcd4 в клетках меланом часто
обусловлена активацией Akt-сигнального пути.
71
6.2. Анализ уровней белка и транскрипта Pdcd4 в клетках линий рака
легких
Ранее в нашей лаборатории впервые было показано отсутствие корреляции между
уровнем транскрипта и уровнем его продукта белка Pdcd4 [108]. Мы продолжили
детальное исследование уровней транскрипта и белка Pdcd4 в опухолевых клетках рака
легкого.
Немелкоклеточный рак легких (НМКРЛ) представляет собой опухоль, в которой
часто наблюдается супрессия транскрипта Pdcd4 [108,109]. При этом, как было
продемонстрировано ранее, потеря Pdcd4 коррелирует с прогрессией опухолей легких
[109], что указывает на возможное непосредственное участие Pdcd4 в сдерживании
прогрессии опухоли. Однако механизмы, за счет которых происходит супрессия Pdcd4 в
клетках рака легких, остаются малоисследованными.
Анализ уровня белка в 8 клеточных линиях НМКРЛ и в нормальных человеческих
бронхиальных эпителиальных клетках (HBEpC) показал, что опухолевый супрессор Pdcd4
практически утрачен (понижен более чем в 10 раз) во всех исследованных нами
опухолевых клеточных линиях по сравнению с клетками HBEpC (Рис. 17А, Б). В клетках
линии Calu-I, NCI-H23, NCI-H358 и NCI-H596 уровень белка Pdcd4 находится в пределах
погрешности измерений (Таблица 4). В то же время, при анализе уровня мРНК Pdcd4
наблюдалась другая картина. В клетках линий NCI-H460 и A549 уровень транскрипта
Pdcd4 достоверно не отличим от контрольного уровня в клетках линии HBEpC, а уровень
белка Pdcd4 в них понижен, как и во всех исследованных клеточных линиях. На рисунке
17 видно несоответствие уровня транскрипта Pdcd4 и уровня белка Pdcd4. В клетках
линии NCI-H1299, Calu-I, NCI-H23, NCI-H358, NCI-H292 и NCI-H596 уровень
транскрипта существенно и достоверно понижен более чем вполовину по сравнению с
контрольными клетками (в клетках линии Calu-I и NCI-H23 в 10 раз). Таким образом,
уровень мРНК Pdcd4 был понижен (более чем в два раза) в 6 из 8 раковых клеточных
линиях по сравнению с нормальными человеческими бронхиальными эпителиальными
клетками HBEpC (Рис. 17В).
72
Рис. 17. Уровень экспрессии белка Pdcd4 в клеточных линиях рака легких. (A) Результаты
Вестерн-блот анализа белка Pdcd4 в указанных клеточных линиях рака легкого и нормальных
человеческих бронхиальных эпителиальных клетках HBEpC. Детекцию Pdcd4 проводили при
помощи антител против Pdcd4. Для нормирования общего уровня белка в клеточных лизатах
образцы окрашивали антителами против α-тубулина. (Б) Содержание белка Pdcd4, определенное
Вестерн-блот анализом после денситометрического анализа изображений. Данные представлены
как среднее значение трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение, нормированные
относительно содержания белка Pdcd4 в клетках линии HBEpC, которое было принято за 1,0. (В)
Относительное содержание транскрипта Pdcd4 в указанных клеточных линиях рака легких.
Содержание транскрипта Pdcd4 определяли методом ПЦР в реальном времени. Данные
представлены как среднее значение трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение.
Содержание транскрипта Pdcd4 в раковых клеточных линиях нормировано относительно
содержания транскрипта Pdcd4 в клетках линии HBEpC, которое было принято за 1,0. н.д. –
различия не являются статистически достоверными. * - P<0.05.
73
Таблица 4. Относительные значения уровня белка Pdcd4 и уровня транскрипта Pdcd4 ±
стандартное отклонение. Соотношение белка и транскрипта Pdcd4 в клетках линии HBEpC было
принято за 1,0.
белок Pdcd4
± стандотклон
транскрипт
Pdcd4
± стандотклон
NCI-H1299
Calu-I
NCI-H23
NCI-H460
NCI-H358
A549
NCI-H292
NCI-H596
0.136±0.093
0.032±0.047
0.013±0.021
0.118±0.081
0.013±0.017
0.112±0.060
0.106±0.069
0.065±0.090
0.357±0.077
0.076±0.005
0.120±0.001
1.008±0.026
0.313±0.076
0.929±0.285
0.196±0.038
0.616±0.152
Наши данные указывают на то, что уровень экспрессии белка Pdcd4 сильно
понижен по сравнению с его уровнем в нормальных клетках бронхиального эпителия
HBEpC, даже в тех клеточных линиях, в которых не наблюдалось существенной
супрессии транскрипта Pdcd4 (Рис. 17 и Таблица 4). Полученные результаты
несоответствия между уровнем белка и уровнем мРНК Pdcd4, указывают на то, что, по
всей видимости, существуют пост-транскрипционные механизмы, которые обуславливают
супрессию Pdcd4 в клетках рака легкого.
6.3. Роль Akt/mTOR/S6K1-сигнального пути в супрессии Pdcd4 в
опухолевых клетках рака легких
Как уже упоминалось, активация Akt-сигнального пути, являющаяся характерной
особенностью опухолевых клеток, приводит, в свою очередь, к активации S6-киназы-1
(S6K1).
Протеолитическая
деградация
Pdcd4
зависит
от
S6K1-зависимого
фосфорилирования по серину-67 [28,87]. Аналогичной субстратной специфичностью
обладает и сама протеинкиназа Akt [27], что предполагает ее непосредственное участие в
индукции деградации Pdcd4 [29]. Кроме того, протеинкиназа Akt может регулировать
экспрессию Pdcd4 опосредованно, через микроРНК miR-21, поскольку активация Aktсигнального пути может приводить к усиленной экспрессии микроРНК miR-21 [29]. Таким
образом, протеинкиназа Akt, видимо, играет ключевую роль в пост-трансляционной
регуляции белка Pdcd4.
Сначала необходимо было исследовать, действительно ли Pdcd4 является мишенью
для супрессии через Akt-сигнальный путь в клетках линий рака легких NCI-H1299
(немелкоклеточный рак легкого) и Calu-I (эпидермоидная карцинома легкого). Для этого
был проведен анализ влияния ингибирования некоторых компонентов Akt/mTOR/S6K1сигнального пути на уровень Pdcd4 в клетках линий NCI-H1299 и Calu-I. Клетки
обрабатывали следующими ингибиторами: рапамицином, ингибитором сигнального
комплекса mTOR 1 (mTORC1); LY294002, ингибитором фосфоинизитид-3-киназ (PI3K),
74
которые являются активаторами протеинкиназы Akt; Akt-inhibitor X, высокоспецифичным
ингибитором собственно протеинкиназы Akt.
На рис. 18 хорошо видно, что в клетках обеих линий обработка ингибитором Aktinhibitor X, так же как и обработка LY294002 и рапамицином, приводит к повышению
уровня белка Pdcd4. Эти данные еще раз подчеркивают то, что активированный Aktсигнальный путь действительно играет существенную роль в супрессии Pdcd4 в
исследованных линиях клеток рака лёгкого.
Рис. 18. Изменения статуса активации компонентов Akt/mTOR/S6K1-сигнального пути при
обработке ингибиторами Akt-сигнального пути. Представлены результаты Вестерн-блот анализа
лизатов необработанных клеток (-) и клеток, обработанных рапамицином (Rap; 20 нг/мл),
ингибитором LY294002 (LY; 10 мкМ) или ингибитором протеинкиназы Akt, Akt inhibitor X (AktX;
20 мкМ) с антителами против белка Pdcd4 (А и Б), а для клеток линии NCI-H1299 (А) приведены
результаты детекции суммарных уровней протеинкиназы Akt (Akt) и S6K1 (S6K1), и их
фосфорилированных форм по серину-473 для протеинкиназы Akt (P-Akt) и по треонину-389 – для
S6 киназы 1 (P-S6K1) соответственно. Для контроля суммарного количества белка в дорожках
проводили детекцию α-тубулина.
Далее
был
проведен
анализ
изменения
статуса
активации
компонентов
Akt/mTOR/S6K1-сигнального пути в клетках линии NCI-H1299 при их обработке
ингибиторами Akt-сигнального пути, для чего использовался метод иммуноблоттинга
лизатов клеток с антителами, позволяющими детектировать активированные формы
протеинкиназ Akt и S6K1. Для этого использовали антитела против протеинкиназы Akt,
фосфорилированной
по
серину-473,
и
антитела
против
протеинкиназы
S6K1,
фосфорилированной по треонину-389. Параллельно проводили детекцию суммарного
75
количества протеинкиназ Akt и S6K1 с использованием соответствующих антител,
узнающих белки независимо от статуса их фосфорилирования. Оказалось, что, как и
ожидалось, ингибиторы LY294002 и Akt-inhibitor X действительно приводят к
инактивации протеинкиназ Akt и S6K1, о чем свидетельствует отсутствие их
фосфорилированных форм (Рис. 18). Рапамицин, мишенью которого является сигнальный
комплекс mTORC1, находящийся ниже протеинкиназы Akt в сигнальном пути, вызывал
только инактивацию S6K1, но не Akt (Рис. 18).
На рис. 18 видно, что ингибиторы LY294002 и Akt-inhibitor X блокируют
активность протеинкиназы Akt и S6K1, а рапамицин блокирует активность только
протеинкиназы S6K1, но не Akt. Следует отметить, что все три ингибитора обладали
одинаковой способностью восстанавливать уровень экспрессии Pdcd4 в клетках (Рис. 18).
Эти данные указывают, что в непосредственной индукции деградации Pdcd4 в
исследуемых клеточных линиях, ключевую роль играет именно mTORC1 и, вероятно его
мишень, протеинкиназа S6K1, но не непосредственно протеинкиназа Akt.
6.4. Роль протеинкиназы GSK3β в регуляции экспрессии супрессора
опухолевого роста Pdcd4 в клетках линии рака легких
Помимо
Akt/mTOR/S6K1-сигнальной
ветви,
протеинкиназа
Akt
является
компонентом и других сигнальных каскадов в клетке. В частности, одной из
непосредственных мишеней Akt является протеинкиназа GSK3β, фосфорилирование
которой по серину-9 приводит к ее инактивации. В свою очередь, канонический Wntсигнальный путь, в котором инактивация протеинкиназы GSK3β играет ключевую роль,
часто является одним из аномально активированных про-онкогенных сигнальных путей, в
том числе и при раке легкого [150]. Принимая во внимание роль GSK3β в процессах
онкогенеза [191] и ключевую роль протеинкиназы Akt в регуляции экспрессии супрессора
опухолевого роста Pdcd4, нами была исследована возможная роль GSK3β в Akt-зависимой
супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках.
В ходе работы выяснилось, что в клетках линии NCI-H1299 и Calu-I
активированный Akt-сигнальный путь приводит к снижению уровня белка Pdcd4.
Поскольку протеинкиназа GSK3β является одной из прямых мишеней протеинкиназы Akt
и ее Akt-зависимое фосфорилирование приводит к инактивации GSK3β, мы исследовали
эффект прямого ингибирования активности протеинкиназы GSK3β на уровень белка
Pdcd4. Обработка клеток линии NCI-H1299 ингибитором протеинкиназы GSK3β (GSK3βinhibitor VIII) в течение 18 часов привела к доза-зависимому снижению уровня белка
76
Pdcd4 (Рис. 19). Аналогичный эффект ингибирования GSK3β наблюдался и в клетках
линии Calu-I, обработка которых ингибитором GSK3β-inhibitor VIII также вызывала
существенное падение уровня белка Pdcd4 (Рис. 19).
Рис. 19. Влияние обработки клеток линий NCI-H1299 (А) и Calu-I (Б) ингибитором
протеинкиназы GSK3β на уровень супрессора опухолевого роста Pdcd4. Приведены результаты
иммуноблоттинга лизатов клеток, обработанных ингибитором GSK3β-inhibitor VIII в указанных
(мкМ) концентрациях, с антителами против белка Pdcd4. Для контроля суммарного количества
белка в дорожках проводили детекцию α-тубулина.
Таким образом, нами впервые выявлена роль протеинкиназы GSK3β в регуляции
супрессора
опухолевого
роста
Pdcd4.
Полученные
экспериментальные
данные
предполагают, что активация GSK3β является необходимой для поддержания уровня
Pdcd4 в клетках. Поскольку протеинкиназа Akt супрессирует активность GSK3β, казалось
бы, следовало ожидать, что из-за кумулятивного эффекта Akt на активность протеинкиназ
S6K1 и GSK3β, ингибирование протеинкиназы Akt должно было бы привести к более
существенному увеличению уровня Pdcd4 по сравнению с уровнем Pdcd4 в клетках,
обработанных рапамицином. Но это оказалось не так. Отсутствие такого эффекта в
клетках линий NCI-H1299 и Calu-I может быть обусловлено тем, что существующий
эндогенный уровень активности GSK3β в них достаточен для того, чтобы поддержать
GSK3β-зависимый уровень Pdcd4. Однако дополнительные про-онкогенные сигналы,
получаемые клеткой извне, которые могут приводить к супрессии активности
протеинкиназы GSK3β, могут приводить к дальнейшему снижению уровня Pdcd4 в
опухолевых клетках. Принимая во внимание дозо-зависимый противоопухолевый эффект
Pdcd4 [30], открытый нами новый механизм супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках может
являться существенным фактором, вносящим вклад в дальнейшую малигнизацию опухоли
и ее резистентность к терапии. В частности, одним из часто аномально активированных
про-онкогенных сигнальных путей, в том числе и при раке легкого, является
канонический Wnt-сигнальный путь [150], в котором инактивация протеинкиназы GSK3β
77
играет ключевую роль [150]. Действительная же роль GSK3β-зависимой регуляции Pdcd4
в канцерогенезе и ее значимость в процессе прогрессии опухоли остаются предметом
дальнейших исследований.
6.5. Вклад протеолитической деградации белка Pdcd4 в супрессию Pdcd4 в
клетках опухолей легких
Белок Pdcd4 подвержен S6K1-зависимому фосфорилированию, которое ведет к
последующему убиквитинилированию белка и далее к его деградации [28]. Мы провели
анализ влияния ингибиторов компонентов Akt/S6K1/mTOR-сигнального пути, а так же
ингибитора протеасом, на уровень Pdcd4 в клетках линий рака легких NCI-H1299, Calu-I,
NCI-H23, NCI-H460, NCI-H358, A549, NCI-596 и NCI-H292. Лизаты, приготовленные из
обработанных ингибиторами клеток, а также лизаты из необработанных клеток,
анализировали методом иммуноблоттинга с помощью антител против Pdcd4. Полученные
результаты показали, что супрессия активности PI3K при помощи ингибитора LY294002,
а так же ингибирование mTOR сигнального комплекса – 1 (mTORC1) при помощи
рапамицина, приводит к повышению уровня белка Pdcd4. Этот эффект наблюдался во
всех исследованных клеточных линиях рака легких за исключением только одной, NCIH460 (Рис. 20). Следует отметить, что выявленное нами повышение уровня белка Pdcd4 в
ответ на ингибирование Akt-сигнального пути имело более выраженный характер в
клетках линий NCI-H1299, Calu-I и NCI-H23 по сравнению с действием ингибитора
протеасом MG132 (Рис. 20).
Рис. 20. Влияние обработки указанных клеточных линий рака легкого ингибитором PI3Kкиназ LY294002 (LY), ингибитором сигнального комплекса mTORC1 рапамицином (Rap) или
ингибитором протеасом MG132 (MG) на уровень белка Pdcd4. (-) – необработанные клетки.
Клетки обрабатывали рапамицином в концентрации 20 нг/мл, 10 мкМ ингибитора LY294002 или
10 мкМ MG132 в течение 18 часов. Показан результат Вестерн-блот анализа с антителами против
белка Pdcd4. Для нормирования общего уровня белка в клеточных лизатах образцы окрашивали
антителами против α-тубулина.
78
Таким образом, нами показано, что в большинстве исследованных клеточных
линиях НМКРЛ, PI3K/Akt/mTOR-сигнальный путь вносит существенный вклад в
супрессию Pdcd4. Но, кроме того, значимость протеасомной деградации в супрессии
Pdcd4 при НМКРЛ вариабельна. Это позволяет сделать вывод о существовании иных
молекулярных механизмов, приводящих к снижению уровня белка Pdcd4 в опухолевых
клетках в результате активации Akt-сигнального пути, отличных от протеасома-зависимой
деградации белка Pdcd4. Если PI3K/Akt/mTOR-зависимая супрессия Pdcd4 не всегда
обусловлена только протеасомной деградацией, то вторым (помимо S6K1-зависимой
деградации) по значимости механизмом супрессии Pdcd4 может являться описанная ранее
микроРНК-зависимая супрессия трансляции или
деградация транскрипта Pdcd4,
опосредованная его 3`-НТО. Таким образом, мы предположили, что Akt-сигнальный путь
может регулировать экспрессию микроРНК miR-21 с последующей супрессией Pdcd4
через деградацию транскрипта Pdcd4 или супрессию трансляции с него.
6.6. Влияние ингибиторов Akt/mTOR/S6K1-сигнального пути рапамицина и
LY29002 на уровень транскрипта Pdcd4
На первом этапе было исследовано влияние рапамицина и LY294002 на уровень
транскрипта Pdcd4. Обработка клеток ингибиторами действительно приводила к
повышению уровня мРНК Pdcd4 во всех трех исследованных клеточных линиях: NCIH1299, Calu-I и NCI-H23 (Рис. 21), для которых нами ранее было показано различие
эффекта обработки рапамицином, LY294002 и MG132 на уровень белка Pdcd4 (см. Рис.
20). Повышение уровня транскрипта Pdcd4 при действии LY294002 и рапамицина на
компоненты PI3K/Akt/mTOR-сигнального пути наблюдалось в чувствительных к этим
ингибиторам клеточных линиях, таких как NCI-H1299, Calu-I и NCI-H23. Клетки линии
NCI-H460 оказались нечувствительны к действию ингибиторов, и уровень транскрипта
(Рис. 21) и уровень белка (Рис. 20) были сравнимы с их уровнями в необработанных
клетках. В клетках линии NCI-H358 повышение уровня транскрипта Pdcd4 наблюдалось
только под действием рапамицина, но заметно меньшее по сравнению с чувствительными
к нему клеточными линиями NCI-H1299, Calu-I и NCI-H23 (Рис. 21). Полученные данные
указывают на то, что ингибирование комплекса mTORC1 рапамицином вызывает более
существенное повышение уровня транскрипта Pdcd4 в большинстве исследованных
клеточных линий по сравнению с эффектом ингибитора регулирующей активность
протенкиназы Akt, PI3K-киназы, LY294002.
79
Рис. 21. Ингибиторы компонентов PI3K/Akt/mTOR-сигнального пути LY294002 (LY) и
рапамицин (Rap) повышают уровень транскрипта Pdcd4 в чувствительных клеточных линиях
(NCI-H1299, Calu-I и NCI-H23) и не повышают его в нечувствительной клеточной линии NCIH460. Клетки обрабатывали рапамицином в концентрации 20 нг/мл или 10 мкМ ингибитора
LY294002 в течение 18 часов. Уровень транскрипта Pdcd4 был определен при помощи ПЦР в
реальном времени. Образцы нормализовали по уровню транскрипта GAPDH. Представлены
данные трех независимых экспериментов как среднее значение трех независимых измерений ±
стандартное отклонение. Содержание транскрипта Pdcd4 в клетках обработанных ингибиторами
было нормировано относительно содержания транскрипта Pdcd4 в необработанных клетках,
которое было принято за 1,0. * - P<0.05.
Таким образом, нами был установлен факт влияния Akt-сигнального пути на
уровень транскрипта Pdcd4 в опухолевых клетках рака легкого, которое опосредовано
активностью сигнального комплекса mTORC1.
6.7. Вклад микроРНК miR-21 и miR-183 в рапамицин-зависимую супрессию
Pdcd4 в опухолевых клетках линии рака легких
Ранее было экспериментально продемонстрировано, что микроРНК miR-21 играет
значительную роль в супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках и ее уровень часто повышен
при НМКРЛ [91,192,193]. Было показано, что супрессия miR-21 часто приводит к
повышению уровня экспрессии Pdcd4 и, кроме того, приводит к снижению интенсивности
пролиферации и повышению проапоптотической активности клеток НМКРЛ [193]. Нас
интересовал вопрос: вовлечена ли miR-21 в рапамицин-зависимое повышение уровня
Pdcd4 в клетках НМКРЛ? Известно, что эффект miR-21 на уровень Pdcd4 обусловлен
сайтом связывания, локализованным в 3`-НТО мРНК Pdcd4 [63,73,75]. Для проверки
гипотезы о том, что Akt-сигнальный путь регулирует miR-21 и за счет этого супрессирует
80
Pdcd4, вначале нами был исследован относительный уровень этой микроРНК в клетках
линий рака легких и в клетках нормального легочного эпителия HBEpC. Анализ
проводили методом ПЦР в реальном времени. Результаты показали, что в 6 из 8
исследованных клеточных линии рака легких не наблюдается повышенного уровня
микроРНК miR-21 по сравнению с клетками нормального нетрансформированного
эпителия. В клетках линии NCI-H1299, Calu-I, NCI-H460, NCI-H358 и NCI-H23 уровень
микроРНК miR-21 даже ниже, чем в контрольных клетках линии HBEpC, а в клетках
линии NCI-H358 и в клетках линии A549 уровень микроРНК miR-21 повышен
приблизительно в два раза по сравнению с контрольными клетками линии HBEpC (Рис.
22).
Рис. 22. Относительное содержание микроРНК miR-21 в указанных клеточных линиях рака
легких и клетках нормального нетрансформированного эпителия HBEpC определяли методом
ПЦР в реальном времени. Уровень микроРНК miR-21 нормализовали по уровню транскрипта
RNU6B. Содержание микроРНК miR-21 в опухолевых клеточных линиях нормировано
относительно содержания микроРНК miR-21 в клетках линии HBEpC, которое было принято за
1,0.
Далее нами было исследовано влияние ингибиторов Akt-сигнального пути
LY294002 и рапамицина, приводящих к увеличению уровня транскрипта Pdcd4, на
уровень микроРНК miR-21 в опухолевых клетках. Для этого так же проводили анализ при
помощи ПЦР в реальном времени на матрице РНК, изолированных из клеток,
предварительно обработанных ингибиторами LY294002 и рапамицином (Рис. 23).
Полученные результаты показали отсутствие влияния обработки опухолевых клеток
81
указанными ингибиторами на уровень микроРНК miR-21. Это позволяет сделать вывод,
что, микроРНК miR-21 не является посредником в наблюдаемом эффекте повышения
уровня транскрипта Pdcd4 в ответ на ингибирование mTORC1 рапамицином.
Рис. 23. Относительное содержание микроРНК miR-21 в указанных клеточных линиях рака
легких определяли методом ПЦР в реальном времени. Уровень микроРНК miR-21 нормализовали
по уровню транскрипта RNU6B. Содержание микроРНК miR-21 в клетках, обработанных
ингибиторами, было нормировано относительно необработанных клеток, в которых содержание
микроРНК miR-21 было принято за 1,0.
Для дальнейшего выявления роли микроРНК в Akt-зависимом снижении уровня
транскрипта Pdcd4 в клетках рака легкого было решено исследовать влияние Aktсигнального пути на уровень экспрессии репортерного гена, сшитого с 3`-НТО мРНК
Pdcd4. Как уже было сказано, в 3`-НТО транскрипта Pdcd4 находится сайт связывания
микроРНК miR-21, а так же других микроРНК, регулирующих Pdcd4. Анализ влияния
обработки клеток рапамицином на активность репортерного гена люциферазы, сшитого с
3`-НТО транскрипта Pdcd4, показал, что, в отличие от увеличения уровня эндогенного
транскрипта Pdcd4, как нами было показано ранее (см. Рис. 21), рапамицин не влияет на
уровень активности репортерного гена, сшитого с 3`-НТО мРНК Pdcd4 (Рис. 24). В
качестве контроля нами была использована аналогичная конструкция с сигналом
терминации транскрипции и полиаденилирования вируса SV40 вместо 3`-НТО
транскрипта Pdcd4, для которой так же не наблюдалось эффекта обработки рапамицином
на активность репортерного гена. Полученные данные о том, что рапамицин не влияет на
уровень активности репортерного гена, сшитого с 3`-НТО мРНК Pdcd4, были
справедливы для клеток линии Calu-I. Таким образом, полученные результаты указывают
82
на то, что наблюдаемый эффект рапамицина и LY294002 на уровень транскрипта Pdcd4 не
опосредуется цис-действующими детерминантами в 3`-НТО мРНК Pdcd4.
Рис. 24. Влияние 3`-НТО гена Pdcd4 на уровень продукции репортерного гена люциферазы
Renilla под контролем CMV промотора в клетках линии Calu-I при их обработке рапамицином. В
качестве контроля была использована последовательность терминации транскрипции и сигнал
полиаденилирования вируса SV40. Рапамицин в концентрации 20 нг/мл добавляли к клеткам через
24 часа после трансфекции. Через 48 ч после трансфекции проводили люциферазный анализ.
Активность люциферазы Renilla нормализовали на активность люциферазы светлячка.
Представлены данные трех независимых экспериментов в виде относительных единиц
люминесценции (ОЕЛ), как среднее значение трех независимых измерений ± стандартное
отклонение. Значение ОЕЛ в клетках, обработанных рапамицином, нормировали относительно
необработанных клеток, в которых значение ОЕЛ было принято за 1,0. н.д. – различия не являются
статистически достоверными.
Для исчерпывающего подтверждения отсутствия роли микроРНК miR-21 и miR183, для которых ранее было продемонстрировано участие в регуляции Pdcd4, в
рапамицин-зависимом увеличении уровня транскрипта Pdcd4 в клетках рака легкого нами
был проведен сравнительный анализ активности репортерного гена люциферазы, сшитого
с 3`-НТО транскрипта Pdcd4 «дикого типа» или с введенными точечными мутациями,
нарушающими связывание микроРНК miR-21 и miR-183, или с удаленным сайтом
связывания микроРНК miR-21. Клетки линии Calu-I, трансфицированные репортерными
конструкциями. инкубировали в присутствии рапамицина и без него, после чего
определяли активность репортерного гена. В результате проведенных экспериментов
оказалось, что активность репортерного гена практически не отличалась в присутствии
или в отсутствии ингибитора рапамицина (Рис. 25). Как видно из результатов анализа,
внесение мутаций или делеция сайтов связывания микроРНК также не приводила к
изменению уровня репортерного гена в ответ на обработку рапамицином, что
подтверждает отсутствие роли этих микроРНК в рапамицин-индуцированном увеличении
83
уровня транскрипта Pdcd4 в клетках рака легкого. Таким образом, повышение уровня
Pdcd4 в присутствии рапамицина происходит не за счет понижения его микроРНКзависимой пост-транскрипционной супрессии. Сделанный вывод справедлив для всех
потенциальных цис-регуляторных сайтов узнавания микроРНК, находящихся в 3`-НТО
гена Pdcd4, включая miR-21, miR-182, miR-183 и miR-499-5p. Правда, следует отметить,
что при делеции или мутации сайта связывания miR-21 в 3`-НТО гена Pdcd4, а так же при
мутации сайта связывания miR-183, наблюдалось увеличение активности репортерного
гена, которое, все же, свидетельствует об участии, микроРНК miR-21 и miR-183 в
супрессии Pdcd4 в клетках линии Calu-I (Рис. 25).
Рис. 25. МикроРНК miR-21 и miR-183 не участвуют в рапамицин-зависимом повышении
экспрессии Pdcd4, опосредованным 3`-НТО транскрипта Pdcd4. кДНК люциферазы Renilla под
контролем CMV-промотора была сшита с 3`-НТО Pdcd4 дикого типа (wt), или к 3`-НТО Pdcd4 с
мутированным (miR-21 (mut)) или делетированным (miR-21 (del)) сайтом связывания miR-21, или
к 3`-НТО Pdcd4 с мутированным сайтом связывания miR-183 (miR-183 (mut)). Клетки
обрабатывали рапамицином в концентрации 20 нг/мл через 24 часа после трансфекции в течение
24 часов (светлые столбцы), или инкубировали в отсутствии рапамицина (темные столбцы). Через
48 часов после трансфекции проводили люциферазный анализ. Активность люциферазы Renilla
нормализовали на активность люциферазы светлячка. Представлены данные трех независимых
экспериментов в виде относительных единиц люминесценции (ОЕЛ), как среднее значение трех
независимых измерений ± стандартное отклонение. * - P<0.05.
Таким образом, наши данные показали, что микроРНК miR-21 и miR-183
участвуют, в определенной степени, в супрессии Pdcd4 в клетках рака легких линии CaluI. В то же время, 3`-НТО транскрипта Pdcd4 в целом, а так же miR-21 и miR-183 в
частности, не опосредуют рапамицин-зависимое увеличение уровня транскрипта Pdcd4 в
84
клетках рака легкого. Однако следует отметить, что микроРНК могут выступать в роли
трансляционных супрессоров, не оказывая, при этом, влияния на уровень транскрипта, и
подобный феномен был ранее продемонстрирован для Pdcd4 в случае рака молочной
железы и колоректального рака [73,75,76]. Таким образом, микроРНК, по всей видимости,
потенциально могут быть причастны к наблюдаемому несоответствию отношения уровня
белка Pdcd4 и уровня транскрипта Pdcd4, которое было выявлено в случае клеток рака
легких.
6.8. mTOR-зависимая супрессия активности промотора гена Pdcd4 в
клетках линии рака легких
Известно, что пониженный уровень Pdcd4 в клетках рака легких может быть
восстановлен
ингибированием
активности
комплекса
mTORC1
ингибитором
рапамицином, а так же ингибированием активатора mTOR PI3K киназы при помощи
ингибитора LY294002 [97]. Однако, как показали результаты наших исследований,
известные механизмы пост-транскрипционной регуляция Pdcd4 не могут полностью
объяснить пониженный уровень Pdcd4, который наблюдается в клетках рака легких.
Полученные ранее другими исследователями данные указывают на то, что изменение
уровня транскрипции гена Pdcd4 может вносить вклад в общую супрессию Pdcd4 в
опухолевых клетках. Модификации ДНК, такие как гиперметилирование CpG островков,
может приводить к инактивации генов опухолевых супрессоров и, тем самым, к развитию
раковых опухолей [194]. Так, аномальное гиперметилирование участка промотора гена
Pdcd4 было продемонстрировано на примере глиом и приводило к понижению уровня его
транскрипции, и такое понижение, в свою очередь, могло быть восстановлено
ингибитором ДНК метилтрансферазы [59]. Не так давно было показано, что изменения
содержания транскрипционного фактора ZBP-89 так же может приводить к изменению
уровня экспрессии Pdcd4 [195]. Авторы показали, что транскрипционный фактор ZBP-89
играет важную роль в транскрипции Pdcd4, и уровни Pdcd4 и мРНК ZBP-89 в опухолевых
клеточных линиях демонстрируют существенную корреляцию. Факт такой корреляции
дает основание полагать, что понижение уровня экспрессии ZBP-89 в раковых клетках
может играть заметную роль в процессе понижения экспрессии Pdcd4 в клетках рака
легких на стадии транскрипции. Поэтому, для дальнейшего исследования механизма
супрессии Pdcd4 в клетках линии рака легких, был проведен анализ влияния блокирования
PI3K/Akt/mTOR-сигнального пути на транскрипцию гена Pdcd4, которое может приводить
к снижению уровня транскрипта Pdcd4 в клетках рака легкого.
85
6.8.1. Способность ингибитора mTOR рапамицина оказывать действие на
активность промоторной области гена Pdcd4
Нами была исследована возможность реализации эффекта рапамицина на уровень
транскрипта Pdcd4 через регуляцию транскрипции гена Pdcd4. Для этого мы
проанализировали влияние действия рапамицина на активность репортерного гена
люциферазы светлячка под контролем 5`-фланкирующего участка гена Pdcd4 размером
около 3 т.п.н. (от позиции -2851 до +550 нт). В обеих исследованных клеточных линиях,
Calu-I и в NCI-H1299, рапамицин приводил к увеличению промоторной активности
исследуемого фрагмента 5`-области гена Pdcd4 в 2 и в 1.5 раза, соответственно (Рис. 26).
Таким образом, ингибирование компонента Akt-сигнального пути, сигнального комплекса
mTORC1, рапамицином вызывает индукцию транскрипции с промотора гена Pdcd4 в
клетках рака легкого. Таким образом, нами выявлен новый ранее неизвестный механизм,
при котором активация Akt-сигнального пути приводит к ингибированию транскрипции
гена супрессора опухолевого роста Pdcd4 в опухолевых клетках, и ингибитор mTORС1
рапамицин способен усиливать транскрипцию гена Pdcd4 через цис-регуляторный
элемент(ы), локализованный(ые) на участке гена Pdcd4 между нуклеотидами -2851 и
+550.
Способность рапамицина блокировать активность mTORC1, в результате чего
происходит
повышение
транскрипции
Pdcd4,
говорит
о
том,
что
активация
проонкогенного mTOR-сигнального пути способна воздействовать на уровень продукции
Pdcd4 на транскрипционном уровне. Наши данные указывают на то, что активация Aktсигнального пути ингибирует транскрипцию гена супрессора опухолевого роста Pdcd4 в
опухолевых клетках. Схожие данные, свидетельствующие о том, что рапамицин повышает
уровень мРНК Pdcd4, были недавно получены и на клетках гепатоклеточной карциномы
линии Huh7 [86], что подтверждает открытый нами феномен. Таким образом,
Akt/mTOR/S6K1-сигнальный путь может контролировать как деградацию белка Pdcd4, так
и транскрипцию гена Pdcd4.
86
Рис. 26. Анализ активности репортерного гена люциферазы светлячка под контролем
фрагмента 5`-области гена Pdcd4 (нт от -2851 до +550) в клетках линии Calu-I и NCI-H1299,
обработанных (светлые столбцы) или необработанных (темные столбцы) рапамицином. Клетки
обрабатывали рапамицином в концентрации 20 нг/мл в течение 18 часов. Активность люциферазы
светлячка нормализовали на активность люциферазы Renilla. Представлены данные трех
независимых экспериментов в виде относительных единиц люминесценции (ОЕЛ), как среднее
значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. Значение ОЕЛ в клетках,
обработанных рапамицином, нормировали относительно необработанных клеток, в которых
значение ОЕЛ было принято за 1,0. * - P<0.05.
6.8.2. Картирование минимального фрагмента промотора гена Pdcd4,
ответственного за влияние Akt-сигнального пути на транскрипционную
активность промотора гена Pdcd4
После установления того, что область от позиции -2851 до +550 нт гена Pdcd4
человека обеспечивает способность рапамицина вызывать увеличение транскрипционной
активности, нами было проведено исследование, направленное на установление
минимальной области использованного нами фрагмента 5`-области гена Pdcd4,
обуславливающего этот эффект. Для этого из 5`-области гена Pdcd4 от позиции -2851 до
+550 нт была получена серия из семи делеционных мутантов, сшитых с репортерным
геном люциферазы светлячка (Рис. 27, левая панель). Анализ действия рапамицина на
активность репортерного гена в клетках линии Calu-I под контролем различных
делеционных мутантов 5`-области гена Pdcd4 между нуклеотидами -2851 и +550 показал,
что участок, обуславливающий чувствительность к рапамицину, расположен внутри
фрагмента от нуклеотидов в позиции -53 до позиции +196 (Рис. 27). Данный участок гена,
содержащий нетранслируемый экзон 1 (от нт +1 до нт +182) и часть интрона A, сохраняет
способность к увеличению транскрипции репортерного гена при обработке клеток
рапамицином, в то время как дальнейшая 5`-концевая делеция и удаление экзона 1
87
приводила и к потере транкрипционной активности репортерного гена в целом, и к потере
ее зависимости от обработки рапамицином.
Рис. 27. Картирование рапамицин-чувствительного элемента промотора гена Pdcd4
человека от позиции -2851 до +550 нт. Клетки линии Calu-I были трансфицированы плазмидами,
содержащими кДНК люциферазы светлячка под контролем указанных фрагментов промотора гена
Pdcd4. Рапамицин в концентрации 20 нг/мл добавляли через 30 часов после трансфекции. Через 48
ч после трансфекции проводили люциферазный анализ. Активность люциферазы светлячка
нормализовали на активность люциферазы Renilla, плазмида для экспрессии которой (pRL-CMV)
была котранфицирована с плазмидой с репортерным геном люциферазы светлячка. Данные
являются репрезентативными, по меньшей мере, для трех независимых экспериментов и
представлены в виде относительных единиц люминесценции (ОЕЛ) как среднее значение трех
независимых измерений ± стандартное отклонение. pGL3-Basic – активность люциферазы при
экспрессии с безпромоторной конструкции; Luc – репортерный ген люциферазы светлячка; Ex1 –
экзон 1 гена Pdcd4. * - P<0.05.
Таким образом нами было показано, что экзон 1 гена Pdcd4 человека содержит цисдействующий
элемент(ы),
определяющие
рапамицин-зависимое
увеличение
транскрипционной активности гена Pdcd4 в клетках рака легкого.
6.8.3. Анализ участков связывания потенциальных транскрипционных
факторов с делеционным мутантом промотора гена Pdcd4
Для анализа участка промотора гена Pdcd4 на наличие потенциальных участков
связывания
транскрипционных
факторов
была
использована
база
данных
эукариотических факторов транскрипции TRANSFAC (TRANScription FACtor database). In
silico анализ показал, что на участке гена, начиная от позиции -53 нт от сайта старта
88
транскрипции и заканчивая положением +196 нт, находятся потенциальные сайты
связывания для нескольких транскрипционных факторов, включая регуляторную
последовательность чувствительную к барбитуратам, CCAAT бокс и сайты связывания
для COMP1, рецепторов эстрогена, v-MAF и транскрипционных факторов семейства FOX
(forkhead box).
Рис. 28. Фрагмент участка гена Pdcd4 (от нуклеотида в положении +48 до нуклеотида в
положении +89 от сайта инициации транскрипции. Коровые последовательности двух
предсказанных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства forkhead box
подчеркнуты. 18 нуклеотидов, которые были удалены на участке гена начиная с положения -225 и
заканчивая положением +550 нуклеотидов от сайта начала транскрипции представлены
заглавными буквами.
Среди транскрипционных факторов, которые могут быть потенциально вовлечены
в рапамицин-индуцированное повышение уровня транскрипции Pdcd4, известно, что
члены семейства FOX – транскрипционные факторы FoxA2 [196] и FoxO [197], негативно
регулируются протеинкиназой Akt. Авторы показали, что указанные транскрипционные
факторы содержат сайты фосфорилирования протеинкиназой Akt. Фосфорилирование по
этим сайтам приводит к инактивации транскрипционных факторов FoxA2 и FoxO за счет
их секвестра в цитоплазме. Интересно отметить, что ортолог FoxA у дрозофилы [198] и
нематоды [199] негативно регулируются TOR (мишень рапамицина/target of rapamycin)
также за счет их секвестирования в цитоплазме. Более того, у нематоды TORопосредованная регуляция ортолога фактора FoxA зависит от ортолога нематоды S6
киназы, активность которой регулируется киназой TOR [199]. Так как протеинкиназа Akt
и S6 киназа 1 имеют одинаковые консенсусные сайты фосфорилирования [200], можно
предположить, что транскрипционный фактор млекопитающих FoxA2 так же возможно
негативно регулируется за счет фосфорилирования S6 киназой в клетках млекопитающих.
Не так давно было установлено, что еще один член семейства транскрипционных
факторов forkhead box – FOXO связывается с нетранслируемым экзоном 1 ортолога гена
Pdcd4 у дрозофилы, и тем самым регулирует его транскрипцию [201]. Существенно
отметить, что из двух предсказанных сайтов связывания транскрипционных факторов
семейства forkhead box на участке гена -53 нт – +196 нт (Рис. 28), один (расположенный
“выше”)
является
высококонсервативным
в
эволюционном
контексте
среди
млекопитающих и птиц [202] (анализ проводился в геномном браузере UCSC при
Калифорнийском университете, Санта Круз, США). Это позволяет предположить, что
89
транскрипционные факторы семейства forkhead box могут принимать участие в
рапамицин-индуцированном повышении уровня транскрипта Pdcd4.
6.8.4. Анализ активности репортерного гена под контролем делеционного
мутанта минимального фрагмента промотора гена Pdcd4, опосредующего
эффект рапамицина
Далее нами было исследовано потенциальное участие консервативного сайта
связывания
транскрипционных
факторов семейства
forkhead
box
в рапамицин-
индуцируемом повышении уровня транскрипции Pdcd4. Для этого 18 нуклеотидов,
содержащие консервативные сайты связывания транскрипционных факторов семейства
forkhead box в 5`-области гена Pdcd4, были удалены в контексте фрагмента гена -225 нт –
+550 нт от начала транскрипции (Рис. 28). Далее был проанализирован ответ
мутированного участка промотора на воздействие рапамицина методом измерения
активности репортерного гена.
Рис. 29. кДНК люциферазы светлячка под контролем участка промотора гена Pdcd4 от нт 225 до нт +550 дикого типа или содержащая 18-ти нуклеотидную делецию на участке, который
содержит предполагаемые сайты связывания транскрипционных факторов семейства forkhead box,
были трансфицированы в клетки рака легких линии Сalu-I. Перед определением активности
репортерного гена клетки обрабатывали рапамицином в концентрации 20 нг/мл в течение 18 часов
(светлые столбцы) или ничем не обрабатывали (темные столбцы). Активность люциферазы
светлячка нормализовали на активность люциферазы Renilla, плазмида для экспрессии которой
(pRL-CMV) была котранфецирована с плазмидой с репортерным геном люциферазы светлячка.
Данные являются репрезентативными, по меньшей мере, для трех независимых экспериментов и
представлены в виде относительных единиц люминесценции (ОЕЛ) как среднее значение трех
независимых измерений ± стандартное отклонение. Luc – репортерный ген люциферазы светлячка;
Exon1 – экзон 1 гена Pdcd4. н.д. – различия не являются статистически достоверными. * - P<0.05.
Такая делеция привела к отмене стимулирующего эффекта рапамицина на
активность репортерного гена (Рис. 29). Таким образом, то, что консервативный сайт
связывания транскирипционных факторов семейства forkhead box несет ответственность
за
рапамицин-зависимую
регуляцию
активности
промотора
Pdcd4,
получило
90
экспериментальное подтверждение. На рисунке 30 представлена обобщенная схема
участия Akt-сигнального пути в регуляции уровня Pdcd4 с учетом описанных нами новых
молекулярных механизмов, предполагающих участие транскрипционных факторов
семейства forkhead box и протеинкиназы GSK3β.
Рис. 30. Обобщенная схема возможного участия Akt-сигнального пути в регуляции уровня
Pdcd4 с учетом описанных нами новых молекулярных механизмов, предполагающего участие
транскрипционных факторов семейства forkhead box и протеинкиназы GSK3β. Pdcd4 – белок
Pdcd4; Pdcd4 – транскрипт Pdcd4.
За счет выявленного непосредственного влияния на активность нескольких
транскрипционных факторов, сигнальный комплекс mTORC1 сегодня рассматривается не
только как регулятор трансляции, но и как регулятор транскрипции [203]. Тем не менее,
ни один из транскрипционных факторов, которые, по данным на сегодняшний день,
регулируются mTORC1, не имели предсказанных сайтов связывания на минимальном
участке промотора Pdcd4, способного обеспечивать mTOR-зависимую регуляцию
транскрипции. Более того, единственными консервативными межвидовыми сайтами
связывания на этом участке были сайты связывания транскрипционных факторов
семейства forkhead box. Как оказалось, делеция этого мотива способна отменять mTORзависимое ингибирование транскрипции с промотора гена Pdcd4. Важно отметить, что
член семейства транскрипционных факторов forkhead box белок FOXO недавно был
91
идентифицирован как транскрипционный регулятор ортолога Pdcd4 у дрозофилы [201].
Кроме того, было показано, что FOXO связывается с нетранслируемым экзоном 1 гена
Pdcd4 у дрозофилы [201], фактически в том месте, где и расположен потенциальный
участок связывания транкрипционных факторов семейства forkhead box в гене Pdcd4
человека, и делеция которого отменяла эффект рапамицина на транскрипцию Pdcd4. Эти
данные в совокупности подтверждают предположение о том, что транскрипционные
факторы семейства forkhead box вовлечены в рапамицин-зависимое повышение уровня
Pdcd4. Несмотря на то, что некоторые транскрипционные факторы семейства forkhead box
и были определены как мишени для регуляции протеинкиназой Akt, активность
протеинкиназы Akt не ингибируется рапамицином. При этом, ортолог FoxA у дрозофилы
[198] и нематоды [199] определены как мишени для протеинкиназы TOR, в последнем
случае через ортолог киназы S6. В связи с этим, вполне вероятно, что mTOR (или
непосредственно его мишени) может регулировать активность транскрипционных
факторов семейства forkhead box в клетках млекопитающих, тем самым оказывая прямое
влияние на транскрипцию Pdcd4.
С другой стороны, картированные рапамицин-чувствительные участки цисдействующего
элемента
промотора
Pdcd4
могут
опосредовать
действие
тех
транскрипционных факторов, которые еще не определены в качестве мишеней для
регуляции протеинкиназой mTORC1. Потенциальный интерес в этой связи представляет,
в частности, транскрипционный фактор PPARγ, активность которого стимулируется за
счет mTORC1 [203]. Так, агонист PPARγ – пиоглитазон, приводил к снижению уровня
белка Pdcd4 [140]. Следовательно, возможно, что mTORC1-сигнальный путь способен
косвенно влиять на транскрипцию Pdcd4 через транскрипционный фактор PPARγ.
Указанные возможные варианты снижения уровня белка Pdcd4 являются перспективными
для дальнейших исследований.
92
7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В работе впервые был проанализирован характер экспрессии Pdcd4 в клетках
меланом. Полученные данные указывают на то, что потеря Pdcd4 при меланоме не такое
частое событие, но, тем не менее, статус экспрессии Pdcd4 может быть использован для
молекулярного типирования меланом. Кроме того, было показано, что активированные
Akt-сигнальный путь и, в меньшей степени, MEK/ERK-сигнальный путь, вносят вклад в
супресию Pdcd4 в клетках меланом.
В работе была впервые выявлена роль протеинкиназы GSK3β в регуляции Pdcd4 в
опухолевых клетках. Впервые было показано, что активность протеинкиназы GSK3β,
которая ингибируется в результате активации Akt-сигнального пути, необходима для
поддержания уровня Pdcd4 в клетках рака легких.
Было продемонстрировано, что Akt-сигнальный путь действительно играет
существенную роль в супрессии Pdcd4 в клетках рака легкого, однако, в отличие от ранее
описанных механизмов, не только за счет индукции деградации белка Pdcd4. Полученные
данные показали, что ингибирование Akt-сигнального пути также приводит к увеличению
уровня транскрипта Pdcd4. Было продемонстрировано, что Akt-сигнальный путь mTORзависимо супрессирует транскрипционную активность промотора гена Pdcd4, в то время
как ингибирование Akt/mTOR-сигнальной оси отменяет эту супрессию. Делеция
предсказанного сайта связывания транскрипционных факторов семейства forkhead box в
промоторе гена Pdcd4 приводила к отмене эффекта ингибирования Akt-сигнального пути
на индукцию транскрипции, что позволяет рассматривать делетированный участок как
цис-действующий элемент, ответственный за наблюдаемый феномен. Таким образом, в
работе выявлен новый механизм супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках, состоящий в
mTOR-зависимом ингибировании транскрипции гена Pdcd4. Это может являться одним из
механизмов
реализации
про-онкогенной
активности
Akt-сигнального
пути.
Представленные результаты работы вносят вклад и существенно расширяют понимание
сложных молекулярных механизмов, ответственных за супрессию Pdcd4 в опухолях, в
частности, и в развитии и прогрессии опухолей в целом.
93
6. ВЫВОДЫ
1. Установлено, что снижение уровня супрессора опухолевого роста Pdcd4 происходит в
~25% исследованных меланом и опосредовано активностью Akt-сигнального пути.
Статус продукции Pdcd4 может быть использован для молекулярного типирования
меланом.
2. Показано, что уровень супрессора опухолевого роста Pdcd4 значительно понижен во
всех восьми исследованных клеточных линий рака легких. При этом изменение уровня
белка Pdcd4 не коррелирует с аналогичными изменениями в уровне транскрипта
Pdcd4.
3. Установлено,
что
протеолитическая
деградация
не
является
единственным
молекулярным механизмом снижения уровня супрессора опухолевого роста Pdcd4 в
клетках рака легкого, опосредованного активацией Akt-сигнального пути.
4. Впервые выявлена роль протеинкиназы GSK3β в контроле уровня супрессора
опухолевого роста Pdcd4 в опухолевых клетках. Показано, что активность
протеинкиназы GSK3β необходима для поддержания уровня Pdcd4 в клетках рака
легких.
5. Установлено, что в клетках линии Calu-I рапамицин-зависимая супрессия транскрипта
Pdcd4 не опосредуется микроРНК, в частности, микроРНК miR-21 и miR-183, сайты
узнавания которых находятся в 3`-нетранслируемой области транскрипта Pdcd4.
6. Описан новый молекулярный механизм Akt-зависимой супрессии Pdcd4, состоящий в
mTORС1-опосредованном ингибировании транскрипции гена Pdcd4 в клетках рака
легких.
В
промоторе
гена
опосредующий этот эффект.
Pdcd4
локализован
цис-действующий
элемент,
94
ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА
Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований, проведены
обработка
и
иллюстративный
анализ
полученных
материал,
экспериментальных
сформулированы
основные
данных,
подготовлен
положения
диссертации,
составляющие ее новизну и практическую значимость, а также подготовлены материалы
публикаций в научных журналах. Эксперименты по картированию минимального
фрагмента промотора гена Pdcd4, ответственного за влияние Akt-сигнального пути на
транскрипционную активность промотора гена Pdcd4 выполнены совместно с М.В.
Шепелевым (ИБГ РАН, Москва). Антитела против белка Pdcd4 были получены ранее С.В.
Калиниченко (ИБГ РАН, Москва). Имена соавторов указаны в соответствующих
публикациях.
95
БЛАГОДАРНОСТИ
Я выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю доктору
биологических
наук
Игорю
Викторовичу
Коробко
за
чуткое
руководство
и
интеллектуальную поддержку, за доверие и терпение, критическое чтение диссертации.
Я благодарю Михаила Валентиновича Шепелева за неоценимую помощь и участие
в проведении экспериментальной работы и плодотворное обсуждение полученных
результатов.
Я благодарю всех сотрудников лабораторий молекулярной онкогенетики и генной
терапии рака ИБГ РАН, помогавших проведению работы.
96
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Matsuhashi S. et al. Preparation of monoclonal antibodies against nuclear antigens in a
DNA affinity purified protein fraction from chick embryo extract // Jpn J Exp Med.
1989/08/01 ed. 1989. Vol. 59, № 4. P. 139–147.
2.
Matsuhashi S., Watanabe T., Hori K. An antigen expressed in proliferating cells at late
G1-S phase // Exp Cell Res. 1987/06/01 ed. 1987. Vol. 170, № 2. P. 351–362.
3.
Yoshinaga H. et al. Novel human PDCD4 (H731) gene expressed in proliferative cells is
expressed in the small duct epithelial cells of the breast as revealed by an anti-H731
antibody // Pathol Int. 2000/01/13 ed. 1999. Vol. 49, № 12. P. 1067–1077.
4.
Cmarik J.L. et al. Differentially expressed protein Pdcd4 inhibits tumor promoter-induced
neoplastic transformation // Proc Natl Acad Sci U S A. 1999/11/26 ed. 1999. Vol. 96, №
24. P. 14037–14042.
5.
Shibahara K. et al. Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon
programmed cell death // Gene. 1995/12/12 ed. 1995. Vol. 166, № 2. P. 297–301.
6.
Nieves-Alicea R. et al. Programmed cell death 4 inhibits breast cancer cell invasion by
increasing tissue inhibitor of metalloproteinases-2 expression // Breast Cancer Res Treat.
2008/04/04 ed. 2009. Vol. 114, № 2. P. 203–209.
7.
Onishi Y., Kizaki H. Molecular cloning of the genes suppressed in RVC lymphoma cells
by topoisomerase inhibitors. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 228, № 1. P.
7–13.
8.
Schlichter U. et al. Identification of the myb-inducible promoter of the chicken Pdcd4
gene // Biochim Biophys Acta. 2001/07/27 ed. 2001. Vol. 1520, № 1. P. 99–104.
9.
Azzoni L. et al. Differential transcriptional regulation of CD161 and a novel gene,
197/15a, by IL-2, IL-15, and IL-12 in NK and T cells // J Immunol. 1998/10/06 ed. 1998.
Vol. 161, № 7. P. 3493–3500.
10.
Goke A. et al. DUG is a novel homologue of translation initiation factor 4G that binds
eIF4A // Biochem Biophys Res Commun. 2002/09/11 ed. 2002. Vol. 297, № 1. P. 78–82.
11.
Onishi Y., Hashimoto S., Kizaki H. Cloning of the TIS gene suppressed by topoisomerase
inhibitors. // Gene. 1998. Vol. 215, № 2. P. 453–459.
12.
Soejima H. et al. Assignment of the programmed cell death 4 gene (PDCD4) to human
chromosome band 10q24 by in situ hybridization // Cytogenet Cell Genet. 2000/01/21 ed.
1999. Vol. 87, № 1-2. P. 113–114.
13.
Kang M.J. et al. Up-regulation of PDCD4 in senescent human diploid fibroblasts //
Biochem Biophys Res Commun. 2002/06/11 ed. 2002. Vol. 293, № 1. P. 617–621.
14.
Aravind L., Koonin E. V. Eukaryote-specific domains in translation initiation factors:
implications for translation regulation and evolution of the translation system // Genome
Res. 2000/08/25 ed. 2000. Vol. 10, № 8. P. 1172–1184.
97
15.
Ponting C.P. Novel eIF4G domain homologues linking mRNA translation with nonsensemediated mRNA decay // Trends Biochem Sci. 2000/09/06 ed. 2000. Vol. 25, № 9. P.
423–426.
16.
Yang H.S. et al. A novel function of the MA-3 domains in transformation and translation
suppressor Pdcd4 is essential for its binding to eukaryotic translation initiation factor 4A //
Mol Cell Biol. 2004/04/15 ed. 2004. Vol. 24, № 9. P. 3894–3906.
17.
Yang H.S. et al. The transformation suppressor Pdcd4 is a novel eukaryotic translation
initiation factor 4A binding protein that inhibits translation // Mol Cell Biol. 2002/12/17
ed. 2003. Vol. 23, № 1. P. 26–37.
18.
Lankat-Buttgereit B., Goke R., Göke R. The tumour suppressor Pdcd4: recent advances in
the elucidation of function and regulation // Biol Cell. 2009/04/10 ed. 2009. Vol. 101, №
6. P. 309–317.
19.
Waters L.C. et al. Structure of the C-terminal MA-3 domain of the tumour suppressor
protein Pdcd4 and characterization of its interaction with eIF4A // Oncogene. 2007/02/22
ed. 2007. Vol. 26, № 34. P. 4941–4950.
20.
LaRonde-LeBlanc N. et al. Structural basis for inhibition of translation by the tumor
suppressor Pdcd4. // Mol. Cell. Biol. 2006/10/25 ed. 2007. Vol. 27, № 1. P. 147–156.
21.
Suzuki C. et al. PDCD4 inhibits translation initiation by binding to eIF4A using both its
MA3 domains // Proc Natl Acad Sci U S A. 2008/02/26 ed. 2008. Vol. 105, № 9. P. 3274–
3279.
22.
Bohm M. et al. The transformation suppressor protein Pdcd4 shuttles between nucleus and
cytoplasm and binds RNA // Oncogene. 2003/08/02 ed. 2003. Vol. 22, № 31. P. 4905–
4910.
23.
Cheng S., Liu R., Gallie D.R. The unique evolution of the programmed cell death 4
protein in plants. // BMC Evol. Biol. 2013. Vol. 13. P. 199.
24.
Wedeken L. et al. Association of Tumor Suppressor Protein Pdcd4 With Ribosomes Is
Mediated by Protein-Protein and Protein-RNA Interactions. // Genes Cancer. 2010. Vol. 1,
№ 3. P. 293–301.
25.
Powers M. a et al. Protein arginine methyltransferase 5 accelerates tumor growth by
arginine methylation of the tumor suppressor programmed cell death 4. // Cancer Res.
2011. Vol. 71, № 16. P. 5579–5587.
26.
Yoshinaga, H., S. Matsuhashi, J. Ahaneku, Z. Masaki K.H. Expression and identification
of H731 gene product in HeLa cells. // Res. Commun. Biochem. Cell Mol. Biol. 1997.
Vol. 1. P. 121–131.
27.
Palamarchuk A. et al. Akt phosphorylates and regulates Pdcd4 tumor suppressor protein //
Cancer Res. 2005/12/17 ed. 2005. Vol. 65, № 24. P. 11282–11286.
28.
Dorrello N.V. et al. S6K1- and betaTRCP-mediated degradation of PDCD4 promotes
protein translation and cell growth // Science (80-. ). 2006/10/21 ed. 2006. Vol. 314, №
5798. P. 467–471.
98
29.
Schmid T. et al. Translation inhibitor Pdcd4 is targeted for degradation during tumor
promotion // Cancer Res. 2008/02/26 ed. 2008. Vol. 68, № 5. P. 1254–1260.
30.
Yang H.S. et al. A novel transformation suppressor, Pdcd4, inhibits AP-1 transactivation
but not NF-kappaB or ODC transactivation // Oncogene. 2001/04/21 ed. 2001. Vol. 20, №
6. P. 669–676.
31.
Hwang S.K. et al. Aerosol-delivered programmed cell death 4 enhanced apoptosis,
controlled cell cycle and suppressed AP-1 activity in the lungs of AP-1 luciferase reporter
mice // Gene Ther. 2007/07/06 ed. 2007. Vol. 14, № 18. P. 1353–1361.
32.
Jin H. et al. Aerosol delivery of urocanic acid-modified chitosan/programmed cell death 4
complex regulated apoptosis, cell cycle, and angiogenesis in lungs of K-ras null mice //
Mol Cancer Ther. 2006/05/02 ed. 2006. Vol. 5, № 4. P. 1041–1049.
33.
Wang Q., Sun Z., Yang H.-S.S. Downregulation of tumor suppressor Pdcd4 promotes
invasion and activates both beta-catenin/Tcf and AP-1-dependent transcription in colon
carcinoma cells // Oncogene. 2007/09/11 ed. 2008. Vol. 27, № 11. P. 1527–1535.
34.
Bitomsky N., Bohm M., Klempnauer K.H. Transformation suppressor protein Pdcd4
interferes with JNK-mediated phosphorylation of c-Jun and recruitment of the coactivator
p300 by c-Jun // Oncogene. 2004/08/31 ed. 2004. Vol. 23, № 45. P. 7484–7493.
35.
Zhu Q. et al. miR-21 promotes migration and invasion by the miR-21-PDCD4-AP-1
feedback loop in human hepatocellular carcinoma. // Oncol. Rep. 2012. Vol. 27, № 5. P.
1660–1668.
36.
Meng F. et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in
human hepatocellular cancer. // Gastroenterology. Elsevier, 2007. Vol. 133, № 2. P. 647–
658.
37.
Chen Z. et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Ptendeficient tumorigenesis. // Nature. 2005. Vol. 436, № 7051. P. 725–730.
38.
Yuan T.L., Cantley L.C. PI3K pathway alterations in cancer: variations on a theme. //
Oncogene. 2008. Vol. 27, № 41. P. 5497–5510.
39.
Yan-Nan B. et al. MicroRNA-21 accelerates hepatocyte proliferation in vitro via
PI3K/Akt signaling by targeting PTEN. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2013.
40.
Shiota M. et al. Programmed cell death protein 4 down-regulates Y-box binding protein-1
expression via a direct interaction with Twist1 to suppress cancer cell growth // Cancer
Res. 2009/03/26 ed. 2009. Vol. 69, № 7. P. 3148–3156.
41.
Cheng G.Z., Zhang W., Wang L.-H. Regulation of cancer cell survival, migration, and
invasion by Twist: AKT2 comes to interplay. // Cancer Res. 2008. Vol. 68, № 4. P. 957–
960.
42.
Kuwano M. et al. The role of nuclear Y-box binding protein 1 as a global marker in drug
resistance // Mol. Cancer Ther. 2004. Vol. 3, № 11. P. 1485–1492.
99
43.
Evdokimova V. et al. Translational activation of snail1 and other developmentally
regulated transcription factors by YB-1 promotes an epithelial-mesenchymal transition. //
Cancer Cell. 2009. Vol. 15, № 5. P. 402–415.
44.
Matsumoto K., Bay B.-H. Significance of the Y-box proteins in human cancers. // J. Mol.
Genet. Med. 2005. Vol. 1, № 1. P. 11–17.
45.
Hwang S.-K. et al. Tumor suppressor PDCD4 inhibits NF-κB-dependent transcription in
human glioblastoma cells by direct interaction with p65. // Carcinogenesis. 2014.
46.
Van der Velden A.W., Thomas A.A. The role of the 5’ untranslated region of an mRNA in
translation regulation during development. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. Vol. 31, №
1. P. 87–106.
47.
Wedeken L. et al. Tumor suppressor protein Pdcd4 inhibits translation of p53 mRNA. // J.
Biol. Chem. 2011. Vol. 286, № 50. P. 42855–42862.
48.
Singh P. et al. Pdcd4 directly binds the coding region of c-myb mRNA and suppresses its
translation. // Oncogene. 2011. Vol. 30, № 49. P. 4864–4873.
49.
Biyanee A. et al. A novel mechanism for the control of translation of specific mRNAs by
tumor suppressor protein Pdcd4: inhibition of translation elongation. // Oncogene. 2014.
50.
Liwak U. et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated
translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. // Mol. Cell. Biol.
2012. Vol. 32, № 10. P. 1818–1829.
51.
Scott F.L. et al. XIAP inhibits caspase-3 and -7 using two binding sites: evolutionarily
conserved mechanism of IAPs. // EMBO J. 2005. Vol. 24, № 3. P. 645–655.
52.
Harada H., Grant S. Apoptosis regulators. // Rev. Clin. Exp. Hematol. 2003. Vol. 7, № 2.
P. 117–138.
53.
Frenzel A. et al. Bcl2 family proteins in carcinogenesis and the treatment of cancer. //
Apoptosis. 2009. Vol. 14, № 4. P. 584–596.
54.
Leupold J.H. et al. Tumor suppressor Pdcd4 inhibits invasion/intravasation and regulates
urokinase receptor (u-PAR) gene expression via Sp-transcription factors // Oncogene.
2007/02/14 ed. 2007. Vol. 26, № 31. P. 4550–4562.
55.
Goke R. et al. Programmed cell death protein 4 suppresses CDK1/cdc2 via induction of
p21(Waf1/Cip1) // Am J Physiol Cell Physiol. 2004/08/20 ed. 2004. Vol. 287, № 6. P.
C1541–6.
56.
Bitomsky N. et al. siRNA-mediated knockdown of Pdcd4 expression causes upregulation
of p21(Waf1/Cip1) expression // Oncogene. 2008/04/23 ed. 2008. Vol. 27, № 35. P.
4820–4829.
57.
Lankat-Buttgereit B. et al. The action of Pdcd4 may be cell type specific: evidence that
reduction of dUTPase levels might contribute to its tumor suppressor activity in Bon-1
cells // Apoptosis. 2007/10/24 ed. 2008. Vol. 13, № 1. P. 157–164.
100
58.
Kumar N. et al. Tumor suppressor protein Pdcd4 interacts with Daxx and modulates the
stability of Daxx and the Hipk2-dependent phosphorylation of p53 at serine 46. //
Oncogenesis. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 2, № 1. P. e37.
59.
Gao F. et al. PDCD4 gene silencing in gliomas is associated with 5’CpG island
methylation and unfavourable prognosis // J Cell Mol Med. 2008/09/17 ed. 2009. Vol. 13,
№ 10. P. 4257–4267.
60.
Fan H. et al. DNA methyltransferase 1 knockdown induces silenced CDH1 gene
reexpression by demethylation of methylated CpG in hepatocellular carcinoma cell line
SMMC-7721 // Eur J Gastroenterol Hepatol. 2007/12/01 ed. 2007. Vol. 19, № 11. P. 952–
961.
61.
Wen Y.H. et al. Alterations in the expression of PDCD4 in ductal carcinoma of the breast
// Oncol Rep. 2007/11/06 ed. 2007. Vol. 18, № 6. P. 1387–1393.
62.
Qiu X. et al. HBx-mediated miR-21 upregulation represses tumor-suppressor function of
PDCD4 in hepatocellular carcinoma. // Oncogene. 2013. Vol. 32, № 27. P. 3296–3305.
63.
Frankel L.B. et al. Programmed cell death 4 (PDCD4) is an important functional target of
the microRNA miR-21 in breast cancer cells // J Biol Chem. 2007/11/10 ed. 2008. Vol.
283, № 2. P. 1026–1033.
64.
Hammond S.M. MicroRNAs as oncogenes // Curr Opin Genet Dev. 2005/12/20 ed. 2006.
Vol. 16, № 1. P. 4–9.
65.
Esquela-Kerscher A., Slack F.J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer // Nat Rev
Cancer. 2006/03/25 ed. 2006. Vol. 6, № 4. P. 259–269.
66.
Croce C.M., Calin G.A. miRNAs, cancer, and stem cell division // Cell. 2005/07/13 ed.
2005. Vol. 122, № 1. P. 6–7.
67.
Meng F. et al. Involvement of human micro-RNA in growth and response to
chemotherapy in human cholangiocarcinoma cell lines // Gastroenterology. 2006/06/10
ed. 2006. Vol. 130, № 7. P. 2113–2129.
68.
Wang M. et al. Downregulation of microRNA-182 inhibits cell growth and invasion by
targeting programmed cell death 4 in human lung adenocarcinoma cells. // Tumour Biol.
2013.
69.
Wang Y.-Q. et al. MicroRNA-182 promotes cell growth, invasion, and chemoresistance
by targeting programmed cell death 4 (PDCD4) in human ovarian carcinomas. // J. Cell.
Biochem. 2013. Vol. 114, № 7. P. 1464–1473.
70.
Liu X. et al. MicroRNA-499-5p promotes cellular invasion and tumor metastasis in
colorectal cancer by targeting FOXO4 and PDCD4. // Carcinogenesis. 2011. Vol. 32, №
12. P. 1798–1805.
71.
Li J. et al. miR-183 inhibits TGF-beta1-induced apoptosis by downregulation of PDCD4
expression in human hepatocellular carcinoma cells. // BMC Cancer. 2010. Vol. 10. P.
354.
101
72.
Zhu S. et al. MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1) // J
Biol Chem. 2007/03/17 ed. 2007. Vol. 282, № 19. P. 14328–14336.
73.
Asangani I.A. et al. MicroRNA-21 (miR-21) post-transcriptionally downregulates tumor
suppressor Pdcd4 and stimulates invasion, intravasation and metastasis in colorectal
cancer // Oncogene. 2007/10/31 ed. 2008. Vol. 27, № 15. P. 2128–2136.
74.
Lu Z. et al. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell
death 4 gene // Oncogene. 2008/04/01 ed. 2008. Vol. 27, № 31. P. 4373–4379.
75.
Zhu S. et al. MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis //
Cell Res. 2008/02/14 ed. 2008. Vol. 18, № 3. P. 350–359.
76.
Filipowicz W., Bhattacharyya S.N., Sonenberg N. Mechanisms of post-transcriptional
regulation by microRNAs: are the answers in sight? // Nat Rev Genet. 2008/01/17 ed.
2008. Vol. 9, № 2. P. 102–114.
77.
Meijer H.A. et al. Translational Repression and eIF4A2 Activity Are Critical for
MicroRNA-Mediated Gene Regulation // Science (80-. ). 2013. Vol. 340, № 6128. P. 82–
85.
78.
Wang J. et al. miR-499 protects cardiomyocytes from H 2O 2-induced apoptosis via its
effects on Pdcd4 and Pacs2. // RNA Biol. 2014. Vol. 11, № 4.
79.
Li H., Xu H., Shen H. microRNA-106a modulates cisplatin sensitivity by targeting
PDCD4 in human ovarian cancer cells. // Oncol. Lett. 2014. Vol. 7, № 1. P. 183–188.
80.
Kim J. et al. Splicing factor SRSF3 represses the translation of programmed cell death 4
mRNA by associating with the 5’-UTR region. // Cell Death Differ. Nature Publishing
Group, 2014. Vol. 21, № 3. P. 481–490.
81.
Tang Y. et al. Downregulation of splicing factor SRSF3 induces p53β, an alternatively
spliced isoform of p53 that promotes cellular senescence. // Oncogene. 2013. Vol. 32, №
22. P. 2792–2798.
82.
He X. et al. Knockdown of splicing factor SRp20 causes apoptosis in ovarian cancer cells
and its expression is associated with malignancy of epithelial ovarian cancer. // Oncogene.
2011. Vol. 30, № 3. P. 356–365.
83.
Piekielko-Witkowska A. et al. Disturbed expression of splicing factors in renal cancer
affects alternative splicing of apoptosis regulators, oncogenes, and tumor suppressors. //
PLoS One. 2010. Vol. 5, № 10. P. e13690.
84.
Mudduluru G. et al. Loss of programmed cell death 4 expression marks adenomacarcinoma transition, correlates inversely with phosphorylated protein kinase B, and is an
independent prognostic factor in resected colorectal cancer // Cancer. 2007/09/13 ed.
2007. Vol. 110, № 8. P. 1697–1707.
85.
Carayol N. et al. Suppression of programmed cell death 4 (PDCD4) protein expression by
BCR-ABL-regulated engagement of the mTOR/p70 S6 kinase pathway. // J. Biol. Chem.
2008. Vol. 283, № 13. P. 8601–8610.
102
86.
Matsuhashi S. et al. Control of a tumor suppressor PDCD4: Degradation mechanisms of
the protein in hepatocellular carcinoma cells. // Cell. Signal. 2014. Vol. 26, № 3. P. 603–
610.
87.
Schmid T. et al. Inflammation-induced loss of Pdcd4 is mediated by phosphorylationdependent degradation // Carcinogenesis. 2011/07/21 ed. 2011. Vol. 32, № 10. P. 1427–
1433.
88.
Karin M. The IkappaB kinase - a bridge between inflammation and cancer // Cell Res.
2008/02/28 ed. 2008. Vol. 18, № 3. P. 334–342.
89.
Cheng Y. et al. MicroRNA-21 protects against the H(2)O(2)-induced injury on cardiac
myocytes via its target gene PDCD4. // J. Mol. Cell. Cardiol. 2009. Vol. 47, № 1. P. 5–14.
90.
Sheedy F.J. et al. Negative regulation of TLR4 via targeting of the proinflammatory tumor
suppressor PDCD4 by the microRNA miR-21 // Nat Immunol. 2009/12/01 ed. Nature
Publishing Group, 2010. Vol. 11, № 2. P. 141–147.
91.
Allgayer H. Pdcd4, a colon cancer prognostic that is regulated by a microRNA // Crit Rev
Oncol Hematol. 2009/10/20 ed. 2010. Vol. 73, № 3. P. 185–191.
92.
Talotta F. et al. An autoregulatory loop mediated by miR-21 and PDCD4 controls the AP1 activity in RAS transformation // Oncogene. 2008/10/14 ed. 2009. Vol. 28, № 1. P. 73–
84.
93.
Lankat-Buttgereit B., Goke R., Göke R. Programmed cell death protein 4 (pdcd4): a novel
target for antineoplastic therapy? // Biol Cell. 2003/11/25 ed. 2003. Vol. 95, № 8. P. 515–
519.
94.
Goke R. et al. Programmed cell death protein 4 (PDCD4) acts as a tumor suppressor in
neuroendocrine tumor cells // Ann N Y Acad Sci. 2004/05/22 ed. 2004. Vol. 1014, № 1. P.
220–221.
95.
Matsuhashi S. et al. Expression patterns of programmed cell death 4 protein in normal
human skin and some representative skin lesions // Exp Dermatol. 2007/02/09 ed. 2007.
Vol. 16, № 3. P. 179–184.
96.
Zhang H. et al. Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factorbeta1-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma // Oncogene. 2006/05/10 ed.
2006. Vol. 25, № 45. P. 6101–6112.
97.
Ozpolat B. et al. Programmed cell death-4 tumor suppressor protein contributes to retinoic
acid-induced terminal granulocytic differentiation of human myeloid leukemia cells // Mol
Cancer Res. 2007/01/30 ed. 2007. Vol. 5, № 1. P. 95–108.
98.
Afonja O. et al. Induction of PDCD4 tumor suppressor gene expression by RAR agonists,
antiestrogen and HER-2/neu antagonist in breast cancer cells. Evidence for a role in
apoptosis // Oncogene. 2004/09/14 ed. 2004. Vol. 23, № 49. P. 8135–8145.
99.
Woodard J. et al. Statin-dependent suppression of the Akt/mammalian target of rapamycin
signaling cascade and programmed cell death 4 up-regulation in renal cell carcinoma //
Clin Cancer Res. 2008/07/17 ed. 2008. Vol. 14, № 14. P. 4640–4649.
103
100. Nakashima M. et al. Regulation of tumor suppressor PDCD4 by novel protein kinase C
isoforms. // Biochim. Biophys. Acta. 2010. Vol. 1803, № 9. P. 1020–1027.
101. Nishizuka Y. The role of protein kinase C in cell surface signal transduction and tumour
promotion // Nature. 1984/04/19 ed. 1984. Vol. 308, № 5961. P. 693–698.
102. Keranen L.M., Dutil E.M., Newton A.C. Protein kinase C is regulated in vivo by three
functionally distinct phosphorylations // Curr Biol. 1995/12/01 ed. 1995. Vol. 5, № 12. P.
1394–1403.
103. Jansen A.P., Camalier C.E., Colburn N.H. Epidermal expression of the translation
inhibitor programmed cell death 4 suppresses tumorigenesis // Cancer Res. 2005/07/19 ed.
2005. Vol. 65, № 14. P. 6034–6041.
104. Fay M.M. et al. Enhanced Arginine Methylation of Programmed Cell Death 4 during
Nutrient Deprivation Promotes Tumor Cell Viability. // J. Biol. Chem. 2014.
105. Jurisicova A. et al. Expression and regulation of genes associated with cell death during
murine preimplantation embryo development. // Mol. Reprod. Dev. 1998. Vol. 51, № 3. P.
243–253.
106. Gao F. et al. Frequent loss of PDCD4 expression in human glioma: possible role in the
tumorigenesis of glioma // Oncol Rep. 2006/12/05 ed. 2007. Vol. 17, № 1. P. 123–128.
107. Difilippantonio S. et al. Gene expression profiles in human non-small and small-cell lung
cancers // Eur J Cancer. 2003/08/23 ed. 2003. Vol. 39, № 13. P. 1936–1947.
108. Kalinichenko S. V et al. Pdcd4 protein and mRNA level alterations do not correlate in
human lung tumors // Lung Cancer. 2008/05/07 ed. 2008. Vol. 62, № 2. P. 173–180.
109. Chen Y. et al. Loss of PDCD4 expression in human lung cancer correlates with tumour
progression and prognosis. // J. Pathol. 2003. Vol. 200, № 5. P. 640–646.
110. Zhang Y. et al. Transcriptional profiling of Epstein-Barr virus (EBV) genes and host
cellular genes in nasal NK/T-cell lymphoma and chronic active EBV infection // Br J
Cancer. 2006/02/02 ed. 2006. Vol. 94, № 4. P. 599–608.
111. Schlichter U. et al. The chicken Pdcd4 gene is regulated by v-Myb // Oncogene.
2001/04/21 ed. 2001. Vol. 20, № 2. P. 231–239.
112. Appl H., Klempnauer K.H. Targeted disruption of c-myb in the chicken pre B-cell line
DT40 // Oncogene. 2002/06/26 ed. 2002. Vol. 21, № 19. P. 3076–3081.
113. Ramsay R.G., Gonda T.J. MYB function in normal and cancer cells. // Nat. Rev. Cancer.
Nature Publishing Group, 2008. Vol. 8, № 7. P. 523–534.
114. Wang J., Zhang Y. [Expression of programmed cell death 4 protein is closely correlated
with laryngeal squamous cell carcinomas] // Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke
Za Zhi. 2011/09/29 ed. 2011. Vol. 25, № 12. P. 539–541.
104
115. Yang H.S. et al. Tumorigenesis suppressor Pdcd4 down-regulates mitogen-activated
protein kinase kinase kinase kinase 1 expression to suppress colon carcinoma cell invasion
// Mol Cell Biol. 2006/02/02 ed. 2006. Vol. 26, № 4. P. 1297–1306.
116. Jansen A.P. et al. Characterization of programmed cell death 4 in multiple human cancers
reveals a novel enhancer of drug sensitivity // Mol Cancer Ther. 2004/02/27 ed. 2004.
Vol. 3, № 2. P. 103–110.
117. Pardali K., Moustakas A. Actions of TGF-beta as tumor suppressor and pro-metastatic
factor in human cancer. // Biochim. Biophys. Acta. 2007. Vol. 1775, № 1. P. 21–62.
118. Davis B.N. et al. SMAD proteins control DROSHA-mediated microRNA maturation //
Nature. 2008/06/13 ed. 2008. Vol. 454, № 7200. P. 56–61.
119. Yu Y. et al. MicroRNA-21 induces stemness by downregulating transforming growth
factor beta receptor 2 (TGFβR2) in colon cancer cells. // Carcinogenesis. 2012. Vol. 33,
№ 1. P. 68–76.
120. Wang W. et al. Programmed cell death 4 (PDCD4) mediates the sensitivity of gastric
cancer cells to TRAIL-induced apoptosis by down-regulation of FLIP expression. // Exp.
Cell Res. 2010. Vol. 316, № 15. P. 2456–2464.
121. Ashkenazi A. et al. Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand. // J.
Clin. Invest. 1999. Vol. 104, № 2. P. 155–162.
122. Eto K. et al. Loss of programmed cell death 4 induces apoptosis by promoting the
translation of procaspase-3 mRNA // Cell Death Differ. 2011/10/01 ed. 2012. Vol. 19, №
4. P. 573–581.
123. Wang X., Patenode C., Roizman B. US3 protein kinase of HSV-1 cycles between the
cytoplasm and nucleus and interacts with programmed cell death protein 4 (PDCD4) to
block apoptosis // Proc Natl Acad Sci U S A. 2011/08/17 ed. 2011. Vol. 108, № 35. P.
14632–14636.
124. Yang H.-S. et al. Pdcd4 suppresses tumor phenotype in JB6 cells by inhibiting AP-1
transactivation. // Oncogene. 2003. Vol. 22, № 24. P. 3712–3720.
125. Hsu T.C. et al. Activator protein 1 (AP-1)- and nuclear factor kappaB (NF-kappaB)dependent transcriptional events in carcinogenesis. // Free Radic. Biol. Med. 2000. Vol.
28, № 9. P. 1338–1348.
126. Hilliard A. et al. Translational regulation of autoimmune inflammation and lymphoma
genesis by programmed cell death 4 // J Immunol. 2006/11/23 ed. 2006. Vol. 177, № 11.
P. 8095–8102.
127. Reis P.P. et al. Programmed cell death 4 loss increases tumor cell invasion and is
regulated by miR-21 in oral squamous cell carcinoma. // Mol. Cancer. 2010. Vol. 9. P.
238.
128. Wei N.A. et al. Loss of Programmed cell death 4 (Pdcd4) associates with the progression
of ovarian cancer. // Mol. Cancer. 2009. Vol. 8. P. 70.
105
129. Wolfe A.L. et al. RNA G-quadruplexes cause eIF4A-dependent oncogene translation in
cancer // Nature. Nature Publishing Group, 2014.
130. Bugaut A., Balasubramanian S. 5’-UTR RNA G-quadruplexes: translation regulation and
targeting. // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, № 11. P. 4727–4741.
131. Boussemart L. et al. eIF4F is a nexus of resistance to anti-BRAF and anti-MEK cancer
therapies // Nature. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited.
All Rights Reserved., 2014. Vol. advance on.
132. Dimova I., Popivanov G., Djonov V. Angiogenesis in cancer - general pathways and their
therapeutic implications. // J. BUON. Vol. 19, № 1. P. 15–21.
133. Krug S. et al. Knock-down of Pdcd4 stimulates angiogenesis via up-regulation of
angiopoietin-2. // Biochim. Biophys. Acta. 2012/02/01 ed. 2012. Vol. 1823, № 4. P. 789–
799.
134. Bergsland E.K. Vascular endothelial growth factor as a therapeutic target in cancer. // Am.
J. Health. Syst. Pharm. 2004. Vol. 61, № 21 Suppl 5. P. S4–11.
135. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. // Nat. Med.
1995. Vol. 1, № 1. P. 27–31.
136. Sandler A.B., Johnson D.H., Herbst R.S. Anti-vascular endothelial growth factor
monoclonals in non-small cell lung cancer. // Clin. Cancer Res. 2004. Vol. 10, № 12 Pt 2.
P. 4258s–4262s.
137. Cox G. et al. Angiogenesis and non-small cell lung cancer. // Lung Cancer. 2000. Vol. 27,
№ 2. P. 81–100.
138. Lankat-Buttgereit B. et al. Pdcd4 inhibits growth of tumor cells by suppression of
carbonic anhydrase type II // Mol Cell Endocrinol. 2004/04/06 ed. 2004. Vol. 214, № 1-2.
P. 149–153.
139. Supuran C.T. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and
activators. // Nat. Rev. Drug Discov. Nature Publishing Group, 2008. Vol. 7, № 2. P. 168–
181.
140. Lankat-Buttgereit B. et al. Knockdown of Pdcd4 results in induction of proprotein
convertase 1/3 and potent secretion of chromogranin A and secretogranin II in a
neuroendocrine cell line // Biol Cell. 2008/06/14 ed. 2008. Vol. 100, № 12. P. 703–715.
141. Allgayer H. Molecular regulation of an invasion-related molecule--options for tumour
staging and clinical strategies // Eur J Cancer. 2006/04/18 ed. 2006. Vol. 42, № 7. P. 811–
819.
142. Heiss M.M. et al. Individual development and uPA-receptor expression of disseminated
tumour cells in bone marrow: a reference to early systemic disease in solid cancer // Nat
Med. 1995/10/01 ed. 1995. Vol. 1, № 10. P. 1035–1039.
106
143. Janicke F. et al. Urokinase (uPA) and its inhibitor PAI-1 are strong and independent
prognostic factors in node-negative breast cancer // Breast Cancer Res Treat. 1993/01/01
ed. 1993. Vol. 24, № 3. P. 195–208.
144. Pedersen H. et al. Urokinase and plasminogen activator inhibitor type 1 in pulmonary
adenocarcinoma // Cancer Res. 1994/01/01 ed. 1994. Vol. 54, № 1. P. 120–123.
145. Ganesh S. et al. Urokinase receptor and colorectal cancer survival // Lancet. 1994/08/06
ed. 1994. Vol. 344, № 8919. P. 401–402.
146. González-Villasana V. et al. Programmed cell death 4 inhibits leptin-induced breast
cancer cell invasion. // Oncol. Rep. 2012. Vol. 27, № 3. P. 861–866.
147. Jin X. et al. Frizzled 4 regulates stemness and invasiveness of migrating glioma cells
established by serial intracranial transplantation // Cancer Res. 2011/03/03 ed. 2011. Vol.
71, № 8. P. 3066–3075.
148. Reya T., Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer. // Nature. 2005. Vol. 434, №
7035. P. 843–850.
149. Ramachandran I. et al. Wnt inhibitory factor 1 induces apoptosis and inhibits cervical
cancer growth, invasion and angiogenesis in vivo. // Oncogene. 2012. Vol. 31, № 22. P.
2725–2737.
150. Königshoff M., Eickelberg O. WNT signaling in lung disease: a failure or a regeneration
signal? // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2010. Vol. 42, № 1. P. 21–31.
151. Ben-Neriah Y. et al. The chronic myelogenous leukemia-specific P210 protein is the
product of the bcr/abl hybrid gene // Science (80-. ). 1986/07/11 ed. 1986. Vol. 233, №
4760. P. 212–214.
152. Daley G.Q., Van Etten R.A., Baltimore D. Induction of chronic myelogenous leukemia in
mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome // Science (80-. ).
1990/02/16 ed. 1990. Vol. 247, № 4944. P. 824–830.
153. Mauro M.J. et al. STI571: a paradigm of new agents for cancer therapeutics // J Clin
Oncol. 2002/01/05 ed. 2002. Vol. 20, № 1. P. 325–334.
154. Deininger M., Buchdunger E., Druker B.J. The development of imatinib as a therapeutic
agent for chronic myeloid leukemia // Blood. 2004/12/25 ed. 2005. Vol. 105, № 7. P.
2640–2653.
155. Lydon N.B., Druker B.J. Lessons learned from the development of imatinib // Leuk Res.
2004/03/24 ed. 2004. Vol. 28 Suppl 1. P. S29–38.
156. Druker B.J. Imatinib as a paradigm of targeted therapies // Adv Cancer Res. 2004/08/26
ed. 2004. Vol. 91. P. 1–30.
157. Burgess M.R., Sawyers C.L. Treating imatinib-resistant leukemia: the next generation
targeted therapies // ScientificWorldJournal. 2006/08/15 ed. 2006. Vol. 6. P. 918–930.
107
158. O’Hare T. et al. In vitro activity of Bcr-Abl inhibitors AMN107 and BMS-354825 against
clinically relevant imatinib-resistant Abl kinase domain mutants // Cancer Res.
2005/06/03 ed. 2005. Vol. 65, № 11. P. 4500–4505.
159. Ly C. et al. Bcr-Abl kinase modulates the translation regulators ribosomal protein S6 and
4E-BP1 in chronic myelogenous leukemia cells via the mammalian target of rapamycin //
Cancer Res. 2003/10/03 ed. 2003. Vol. 63, № 18. P. 5716–5722.
160. Mohi M.G. et al. Combination of rapamycin and protein tyrosine kinase (PTK) inhibitors
for the treatment of leukemias caused by oncogenic PTKs // Proc Natl Acad Sci U S A.
2004/02/21 ed. 2004. Vol. 101, № 9. P. 3130–3135.
161. Parmar S. et al. Differential regulation of the p70 S6 kinase pathway by interferon alpha
(IFNalpha) and imatinib mesylate (STI571) in chronic myelogenous leukemia cells //
Blood. 2005/03/26 ed. 2005. Vol. 106, № 7. P. 2436–2443.
162. Prabhu S. et al. A novel mechanism for Bcr-Abl action: Bcr-Abl-mediated induction of
the eIF4F translation initiation complex and mRNA translation // Oncogene. 2006/08/29
ed. 2007. Vol. 26, № 8. P. 1188–1200.
163. Ren W. et al. miR-21 modulates chemosensitivity of tongue squamous cell carcinoma
cells to cisplatin by targeting PDCD4. // Mol Cell Biochem. 2014. Vol. 390, № 1-2. P.
253–262.
164. Dou X. et al. PDCD4 as a predictor of sensitivity to neoadjuvant chemoradiotherapy in
locally advanced rectal cancer patients. // Asian Pac J Cancer Prev. 2014. Vol. 15, № 2. P.
825–830.
165. Schilsky R.L. et al. Development and use of integral assays in clinical trials. // Clin.
Cancer Res. 2012. Vol. 18, № 6. P. 1540–1546.
166. Mankoff D.A., Pryma D.A., Clark A.S. Molecular imaging biomarkers for oncology
clinical trials. // J. Nucl. Med. 2014. Vol. 55, № 4. P. 525–528.
167. Dittrich C. The changing world of drug development // Chinese Clin. Oncol. 2014. Vol. 3,
№ 2. P. 1–5.
168. Mikhaĭlova I.N. et al. [Melanoma cell lines as the basis for antitumor vaccine
preparation]. // Vestn. Ross. Akad. Med. Nauk. 2005. № 7. P. 37–40.
169. Mikhaylova I.N. et al. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines. //
Melanoma Res. 2008. Vol. 18, № 5. P. 303–313.
170. Berezhnoĭ A.E. et al. [HLA-E molecule induction on the surface of tumor cells protects
them from cytotoxic lymphocytes]. // Vopr. Onkol. 2009. Vol. 55, № 2. P. 224–229.
171. MacKie R.M., Hauschild A., Eggermont A.M.M. Epidemiology of invasive cutaneous
melanoma. // Ann. Oncol. 2009. Vol. 20 Suppl 6. P. vi1–7.
172. Siegel R. et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2012 // CA Cancer J Clin.
2012/06/16 ed. 2012. Vol. 62, № 4. P. 220–241.
108
173. Wang D. et al. Distinct roles of different fragments of PDCD4 in regulating the metastatic
behavior of B16 melanoma cells // Int. J. Oncol. Spandidos Publications, 2013. Vol. 42, №
5. P. 1725–1733.
174. OncomineTM, Compendia
www.oncomine.org.
Bioscience,
Ann
Arbor,
MI
[Online].
URL:
175. Riker A.I. et al. The gene expression profiles of primary and metastatic melanoma yields a
transition point of tumor progression and metastasis. // BMC Med. Genomics. 2008. Vol.
1. P. 13.
176. Haqq C. et al. The gene expression signatures of melanoma progression. // Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 2005. Vol. 102, № 17. P. 6092–6097.
177. Vidwans S.J. et al. A melanoma molecular disease model. // PLoS One. 2011. Vol. 6, №
3. P. e18257.
178. Bis S., Tsao H. Melanoma genetics: the other side. // Clin. Dermatol. 2013. Vol. 31, № 2.
P. 148–155.
179. Vikhreva P.N. et al. [Pdcd4 tumor suppressor: properties, functions, and their application
to oncology] // Mol Gen Mikrobiol Virusol. 2010/06/15 ed. 2010. № 2. P. 3–11.
180. Allen K.E., Weiss G.J. Resistance may not be futile: microRNA biomarkers for
chemoresistance and potential therapeutics. // Mol. Cancer Ther. 2010. Vol. 9, № 12. P.
3126–3136.
181. Howell P.M. et al. MicroRNA in Melanoma. // Ochsner J. 2010. Vol. 10, № 2. P. 83–92.
182. Dhawan P. et al. Constitutive Activation of Akt/Protein Kinase B in Melanoma Leads to
Up-Regulation of Nuclear Factor-{kappa}B and Tumor Progression // Cancer Res. 2002.
Vol. 62, № 24. P. 7335–7342.
183. Madhunapantula S. V, Robertson G.P. Therapeutic Implications of Targeting AKT
Signaling in Melanoma. // Enzyme Res. 2011. Vol. 2011. P. 327923.
184. Robertson G.P. Functional and therapeutic significance of Akt deregulation in malignant
melanoma. // Cancer Metastasis Rev. 2005. Vol. 24, № 2. P. 273–285.
185. Wei Z.-T. et al. PDCD4 inhibits the malignant phenotype of ovarian cancer cells. //
Cancer Sci. 2009. Vol. 100, № 8. P. 1408–1413.
186. Hwang S.-K. et al. Decreased level of PDCD4 (programmed cell death 4) protein
activated cell proliferation in the lung of A/J mouse. // J. Aerosol Med. Pulm. Drug Deliv.
2010. Vol. 23, № 5. P. 285–293.
187. Gaur A.B. et al. Downregulation of Pdcd4 by mir-21 facilitates glioblastoma proliferation
in vivo. // Neuro. Oncol. 2011. Vol. 13, № 6. P. 580–590.
188. Fruman D.A., Rommel C. PI3K and cancer: lessons, challenges and opportunities. // Nat.
Rev. Drug Discov. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 13, № 2. P. 140–156.
109
189. Wong K.-K., Engelman J.A., Cantley L.C. Targeting the PI3K signaling pathway in
cancer. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2010. Vol. 20, № 1. P. 87–90.
190. Meier F. et al. Combined targeting of MAPK and AKT signalling pathways is a promising
strategy for melanoma treatment. // Br. J. Dermatol. 2007. Vol. 156, № 6. P. 1204–1213.
191. Miyashita K. et al. An emerging strategy for cancer treatment targeting aberrant glycogen
synthase kinase 3 beta. // Anticancer. Agents Med. Chem. 2009. Vol. 9, № 10. P. 1114–
1122.
192. Guan P. et al. Meta-analysis of human lung cancer microRNA expression profiling studies
comparing cancer tissues with normal tissues. // J. Exp. Clin. Cancer Res. 2012. Vol. 31.
P. 54.
193. Lan H. et al. [Overexpression of miR-21 promotes proliferation and reduces apoptosis in
non-small cell lung cancer]. // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2011. Vol. 33, № 10. P. 742–
746.
194. Esteller M. CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present,
a brighter future. // Oncogene. 2002. Vol. 21, № 35. P. 5427–5440.
195. Leupold J.H. et al. Promoter cloning and characterization of the human programmed cell
death protein 4 (pdcd4) gene: evidence for ZBP-89 and Sp-binding motifs as essential
Pdcd4 regulators. // Biosci. Rep. Portland Press Ltd., 2012. Vol. 32, № 3. P. 281–297.
196. Wolfrum C. et al. Insulin regulates the activity of forkhead transcription factor Hnf3beta/Foxa-2 by Akt-mediated phosphorylation and nuclear/cytosolic localization. // Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100, № 20. P. 11624–11629.
197. Xie Q., Chen J., Yuan Z. Post-translational regulation of FOXO. // Acta Biochim.
Biophys. Sin. (Shanghai). 2012. Vol. 44, № 11. P. 897–901.
198. Bülow M.H. et al. The Drosophila FoxA ortholog Fork head regulates growth and gene
expression downstream of Target of rapamycin. // PLoS One. 2010. Vol. 5, № 12. P.
e15171.
199. Sheaffer K.L., Updike D.L., Mango S.E. The Target of Rapamycin pathway antagonizes
pha-4/FoxA to control development and aging. // Curr. Biol. 2008. Vol. 18, № 18. P.
1355–1364.
200. Belham C., Wu S., Avruch J. Intracellular signalling: PDK1--a kinase at the hub of things.
// Curr. Biol. 1999. Vol. 9, № 3. P. R93–6.
201. Olson C.M. et al. The insulin receptor cellular IRES confers resistance to eIF4A
inhibition. // Elife. 2013. Vol. 2. P. e00542.
202. Lalmansingh A.S. et al. Multiple modes of chromatin remodeling by Forkhead box
proteins. // Biochim. Biophys. Acta. 2012. Vol. 1819, № 7. P. 707–715.
203. Laplante M., Sabatini D.M. Regulation of mTORC1 and its impact on gene expression at
a glance. // J. Cell Sci. 2013. Vol. 126, № Pt 8. P. 1713–1719.