Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата у

Известия Тульского государственного университета
Естественные науки. 2011. Вып. 2. С. 334–345
Биология
УДК 579.844:62854
Генетическая модификация синтеза
полигидроксибутирата у Methylobacterium
extorquens ∗
Б. Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко
Аннотация. Гетерологичная экспрессия гена aceA из Escherichia
coli К12 под промотором метанолдегидрогеназы Methylobacterium
extorquens G10 и AM1 сопровождалась появлением активности
изоцитратлиазы (15 нмоль/мин/мг белка) и повышенным
синтезом ПГБ в клетках трансформантов по сравнению с
исходными штаммами. Мутанты M. extorquens G10, несущие
ген aceA E. coli в хромосоме, также имели более высокий
уровень ПГБ в клетках. Введение гена phaC, кодирующего
полигидроксибутират (ПГБ)-синтазу M. extorquens AM1 в M.
extorquens G10 сопровождалось появлением у трансформанта
более высокой активности ПГБ-синтазы и изменением динамики
накопления биополимера.
Ключевые слова: полигидроксибутират, биосинтез, клонирование,
полигидроксибутиратсинтаза, изоцитратлиаза, Methylobacterium
extorquens.
Введение
Многие прокариоты синтезируют и запасают в цитоплазматических
гранулах поли-3-гидроксибутират (ПГБ) при несбалансированных условиях
роста (дефицит азота, фосфатов, магния или кислорода) [1, 2]. ПГБ
и его сополимер с валератом (ПГБВ) обладают биоразлагаемостью,
биосовместимостью, термопластичностью и рассматриваются в качестве
заменителей пластмасс, получаемых из нефтепродуктов. Среди
метилобактерий способность накапливать в клетках ПГБ/ПГБВ особенно
четко выражена у организмов с сериновым путем фиксации формальдегида
[2, 3]. Метилобактерии, использующие для роста и синтеза ПГБ/ПГБВ
дешевое непищевое сырье — метанол, являются наиболее перспективными
*
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России на 2009-2011 годы» (гос. контракт №
14.740.11.0111).
Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата
335
продуцентами биодеградируемых биопластиков [4, 5]. Секвенирование
геномов нескольких штаммов «сериновых» метилобактерий [6, 7], в том
числе наиболее изученного в плане синтеза ПГБ и ПГБВ M. extorquens
AM1, даёт возможность конструирования рекомбинантных штаммов
метилотрофов с увеличенной продуктивностью ПГБ из метанола.
M. extorquens АМ1 ассимилирует С1 -соединения сериновым путем,
в котором первичным акцептором формальдегида служит глицин,
образующийся из глиоксилата, но при этом отсутствует изоцитратлиаза
(ИЦЛ) [8]. Недавно показано, что у метилотрофов в ИЦЛ− варианте
серинового цикла ацетил-КоА окисляется в глиоксилат в этилмалонатном
пути, начальные этапы которого катализирует β-кетотиолаза, осуществляющая конденсацию двух молекул ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА,
и НАДФН-зависимая ацетоацетил-КоА-редуктаза, образующая (R)-3гидроксибутирил-КоА, причем последний превращается в кротонил-КоА
— ключевой интермедиат в этилмалонатном пути, или направляется
на биосинтез ПГБ с участием ПГБ-синтазы [9, 10, 11]. Таким образом,
реакции, катализируемые β-кетотиолазой и ацетоацетил-КоА-редуктазой,
являются общими для биосинтеза ПГБ и цикла регенерации глиоксилата.
Учитывая эти факты и принимая во внимание дискретное расположение
гена phaC, кодирующего ПГБ-синтазу вне кластера генов phbAB, мы
предположили, что биосинтез ПГБ у M. extorquens регулируется на уровне
транскрипции/трансляции ПГБ-синтазы и, возможно, связан с уровнем
глиоксилата в клетках. Соответственно, для генетической модификации
метаболизма метилобактерий с целью повышения продукции ПГБ в данной
работе впервые использовали два подхода: 1) увеличение уровня глиоксилата
в клетках путем введения гена изоцитратлиазы (aceA) и 2) увеличение
копийности гена ПГБ-синтазы (phaC).
Материалы и методы
Штаммы и условия культивирования. Для генетической
модификации метаболизма использовали два штамма метилобактерий —
M. extorquens AM1 (ATCC 14718) и M. extorquens G10 [12]. Культуры
выращивали в жидкой или агаризованной минеральной среде «К» [13] при
28◦ С в аэробных условиях с метанолом (0.5 об%). Для изучения динамики
накопления ПГБ использовали ту же среду, но без источника азота. Клетки
штаммов E. coli XL1-blue, JM-109 и S17-1 культивировали при 37◦ C в жидкой
или агаризованной (1.5% агара «Difco») стандартной среде LB.
Выделение геномной и плазмидной ДНК. Геномную ДНК
выделяли по методу Мармура [14] и очищали экстракцией фенолом [15].
Плазмидную ДНК из клеток штаммов E.coli XL1-blue и JM-109 выделяли с
использованием набора Wizard MiniPrep «Promega» (США).
ПЦР-амплификация. Реакционная смесь (30 мкл) содержала: 75 мМ
Трис-HCl pH 8.8, 20 мМ (NH4 )2 SO4 , 0.01% Твин 20, 2.5 мМ MgCl2 , по 0.5 мкМ
336
Б. Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко
прямого и обратного праймеров, 0.2 мкМ дНТФ, 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы
и 50-100 нг ДНК.
ПЦР проводили в следующем режиме: 95◦ C — 1 мин, 1 цикл; затем 25
циклов: денатурация — 94◦ C 30 с, отжиг — 40 с (при соответствующих Tm,
указанных в табл. 1), элонгация — 72 ◦ C 1.5 мин, и достройка — 72◦ C 1 мин,
1 цикл.
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности праймеров
Праймер Последовательность (50 – 30 )
Ген
Acea1f
Acear
P-AM1f
P-AM1r
aceA
aceA
phaC
phaC
GGT ACC ATA ACT ATG GAG CAT CTG CAC
GAA TTC GTT GTT GCT TAG AAC TGC GA
GGT ACC AAC GAT CAC TCC ACC GGG TT
GTC GAC TGT TGC AAC GCG CTT CTA TC
Температура
отжига
53
53
58
58
Праймеры были синтезированы в ЗАО «Синтол» (г. Москва). Продукты
реакции разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии
бромистого этидия. Элюцию фрагментов из агарозного геля проводили,
используя набор Wizard SV Gel (Promega, США) согласно рекомендациям
фирмы-производителя.
Конструирование плазмид для экспрессии изоцитратлиазы
и ПГБ-синтазы. Для экспрессии изоцитратлиазы в метилобактериях
получали плазмиду pACE, содержащую ген aceA из E. coli K-12 под
контролем регулируемого промотора метанолдегидрогеназы (Pmxa F).
Фрагмент ДНК из E. coli K-12 (NCBI GenBank NP_418439.1), содержащий
ген aceA размером 1304 п.н., амплифицировали при помощи ПЦР с
Taq-полимеразой и праймерами Aceaf1/Acear1. Фрагмент клонировали
в вектор pTZ57R/T (Fermentas, Литва) по «А-Т» сайтам. Затем из
полученного вектора pTZ57R/T-aceA вырезали фрагмент ДНК, содержащий
ген aceA, по сайтам EcoRI и KpnI и субклонировали в плазмидном векторе
pCM 160 [16], линеаризованном этими же рестриктазами.
Для экспрессии ПГБ-синтазы в M. extorquens G10 использовали
плазмиду pPHA, несущую ген phaC c собственной промоторной областью.
Соответствующий фрагмент ДНК (1817 п.н.), содержащий ген phaC и
промоторную область (NCBI GenBank YP_002964321.1), амплифицировали
из геномной ДНК M. extorquens AM1 при помощи ПЦР с Taq-полимеразой
и парой праймеров P-AM1f/P-AM1r, и клонировали в вектор pTZ57R/T
по «А-Т» сайтам. Затем данный фрагмент ДНК вырезали из вектора
pTZ57R/T-phaC по сайтам EcoRI и субклонировали в плазмидном векторе
pCM 160, линеаризованном этой же рестриктазой.
Для введения гена aceA E. coli в хромосому M. extorquens G10
использовали плазмиду pTnACE, которую получали на основе вектора
pTn-modOKm. Данный вектор является пласпозоном, способным к
Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата
337
единичному переносу генетического материала между репликонами [17].
Для конструирования pTnACE плазмиду pACE, содержащую ген aceA
под контролем Pmxa F, гидролизовали эндонуклеазой рестрикции VneI,
обрабатывали Т4 ДНК-полимеразой в присутствии дНТФ для получения
тупых концов, затем гидролизовали эндонуклеазой рестрикции NheI и
полученный фрагмент помещали в вектор pTn-modOKm, линеаризованный
по сайтам SmiI и SpeI.
Гидролиз ДНК проводили, используя для каждой эндонуклеазы
рестрикции соответствующий буфер и температурный режим. Полученные
генетические конструкции для генов phaC и aceA трансформировали
в штамм E.coli XLI-blue. Наличие генов в трансформантах проверяли
ПЦР. Далее рекомбинантные плазмиды pACE, pPHA и pTnACE
трансформировали в коньюгативный штамм E. coli S17-1. Анализ уровня
экспрессии клонированных белков у полученных колоний проводили
стандартным электрофорезом по методу Лэммли [18].
Приготовление компетентных клеток и трансформация E. coli.
Компетентные клетки штаммов E. coli и их трансформацию проводили
модифицированным кальциевым методом [19]. Отбор трансформантов
осуществляли на агаризованных средах с добавлением канамицина (50
мкг/мл).
Коньюгативный перенос плазмидной ДНК из E. coli в
метилобактерии. Клетки E.coli S17-1, несущие плазмидный вектор со
вставкой, выращивали при 37◦ C в течение 24 ч с добавлением канамицина
(50 мкг/мл). Для коньюгации отбирали 1 мл культуры и центрифугировали
(4000 об/мин, 30 мин) для осаждения клеток. Осадок промывали 1 мл среды
«К» и суспендировали в 1 мл этой среды.
Параллельно выращивали метилобактерий до ОП600 = 0.2 − 0.3 на среде
«К» (30 мкг/мл). Клетки из 30 мл культуры собирали центрифугированием
(4000 об/мин х 30 мин). Осадок ресуспендировали в 2 мл среды «К» и
переносили в пробирку с 1 мл отмытых клеток E. coli. После перемешивания
суспензию фильтровали через нитроцеллюлозный фильтр (Hybond,
Amersham, Англия) с размером пор 0.45 мкм. Фильтр помещали на
агаризованную среду «К», добавляя 0.1% метанола и 0.02% протеозного
пептона, и инкубировали в течение 1 сут. при 28◦ C. Далее клетки смывали с
фильтра 2 мл среды «К» с 0.5% метанола, 20 мкг/мл налидиксовой кислоты
и 50 мкг/мл канамицина, суспендировали и высевали по 100 мкл на ту
же агаризованную среду. Чашки инкубировали при 28◦ С до появления
индивидуальных колоний. Выросшие колонии метилобактерий очищали от
E. coli, повторно пересевая на ту же среду.
Определение активности ферментов. Клетки в экспоненциальной
фазе роста центрифугировали при 6000g 30 мин и отмывали 0.05 M
Трис-HCl буфером pH 7.5 ресуспендировали в том же буфере и разрушали
ультразвуком на дезинтеграторе MSE (Англия) при 20 кГц (6х30 с) на
холоду. После центрифугирования (15000g, 30 мин) полученный супернатант
338
Б. Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко
диализовали в течение 1 сут в Трис-HCl буфере 50 мМ, pH 7.5. Активности
ферментов определяли при 30◦ C. Концентрацию белка в бесклеточном
экстракте определяли по методу Лоури. Изоцитратлиазу (КФ
4.1.3.1) определяли спектрофотометрически по образованию комплекса
фенилгидразона с глиоксилатом при 324 нм [20]. Реакционная смесь
содержала (мкмоль/мл): Трис-HCl (pH 7.5) — 50, цистеин-HCl — 2, MgCl2
· 6H2 O — 10, фенилгидразин-HCl (pH 8.0) — 10.5, L-изоцитрат натрия — 5,
экстракт. ПГБ-синтазу (КФ 2.3.1.-) определяли спектрофотометрически
при 412 нм [21]. Реакционная смесь содержала (мкмоль/мл): Трис-HCl
(pH 7.5) - 25, 5,5’-дитиобис-2-нитробензойную кислоту (ДТНБ) — 0.1,
гидроксибутирил-КоА — 3, экстракт.
Количественный анализ ПГБ. Содержание ПГБ в биомассе
определяли методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «LKB» (Швеция) [22].
Все количественные данные представляют среднюю арифметическую из не
менее трех измерений.
Результаты и их обсуждение
Клонирование гена изоцитратлиазы aceA из E. coli в M.
extorquens. Поскольку увеличение в клетках метилотрофных бактерий
уровня глиоксилата, являющегося предшественником глицина — первичного
акцептора С1 -соединений в сериновом пути, могло позитивно влиять
на скорость роста и выход биомассы метилобактерий, ожидалось, что
экспрессия гена aceA E. coli в штамме-продуценте ПГБ M. extorquens AM1
усилит образование ацетил-КоА в сериновом цикле. При этом ацетил-КоА
будет накапливаться в виде ПГБ.
Трансформация вектора pACE, несущего ген aceA E. coli, в M. extorquens AM1 привела к появлению в клетках активности изоцитратлиазы
на уровне 15 нмоль/мг белка мин. ПААГ-электрофорез цитоплазматических
белков трансформанта выявил дополнительную белковую полосу, которая
по молекулярной массе соответствовала изоцитратлиазе (рис. 1).
У трансформанта M. extorquens AM1 выявлено изменение динамики
роста и увеличение накопления ПГБ, по сравнению с контрольным штаммом
(рис. 2А). Обнаружены два пика накопления ПГБ: в начале фазы активного
роста и в стационарной фазе.
По-видимому, снижение уровня ПГБ в фазе активного роста связано
с необходимостью дополнительного расхода углерода для роста и деления
трансформированных клеток. Аналогичные трансформанты по гену
ace изоцитратлиазы были получены для M. extorquens G10 с близкими
ростовыми параметрами, но более высоким накоплением ПГБ (рис. 2Б).
Поскольку в промышленном масштабе продуцент, несущий необходимый
ген на векторе, может оказаться малоэффективным из-за необходимости
добавления антибиотика в среду и проблем с элиминацией плазмид в
процессе культивирования, целевой ген необходимо встроить в хромосому.
Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата
339
Рис. 1. 12% ДСН-ПААГ-электрофорез клеточных белков M. extorquens
AM1: 1 — исходного штамма; 2 — клеток, трансформированных плазмидой
pCM160 (контроль); 3 — клеток, несущих плазмиду pACE с геном
изоцитратлиазы; М — маркеры
После коньюгативного переноса pTnACE из E. coli в M. extorquens G10 на
тестовой среде с канамицином выросло 65 колоний.
Полученные штаммы ICL, представляющие собой M. extorquens G10 с
встроенным в хромосому геном aceA, экспрессировали данный фермент, что
выявил электрофорез тотальных клеточных белков (рис. 3).
Наличие вставки в геноме проверяли геномной гибридизацией по
Саузерну, где в качестве маркерной последовательности использовали
фрагмент гена aceA (рис. 4).
На основании критерия скорости роста были отобраны 4 штамма ICL, у
которых определяли накопление ПГБ в стационарной фазе роста на полной
среде «К» или на среде без источника аммонийного азота. В результате
физиологических экспериментов был отобран наиболее активный штамм M.
extorquens ICL35, который накапливал 61% ПГБ, что существенно выше, чем
у исходного штамма G10 (табл. 2).
Таблица 2
Уровни накопления ПГБ (в % от веса сухой биомассы) трансформантами
M. extorquens G10 со встроенным геном aceA
Условия роста
Стационарная фаза
Лимит по азоту
M. extorquens G10
30
46
IСL8
44
45
IСL21 IСL35 IСL36
45
50
40
35
61
45
Клонирование гена ПГБ-синтазы M. extorquens AM1 в M.
extorquens G10. Для увеличения в M. extorquens G10 копийности
340
Б. Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко
Рис. 2. Накопление ПГБ (% от сух. веса) у M. extorquens AM1 (А) и G10
(Б). 1 и 3 — ОД600 и содержание ПГБ у контрольных культур (клетки
трансформированы вектором pCM160); 2 и 4 — ОД600 и содержание ПГБ у
штаммов, несущих ген изоцитратлиазы (клетки трансформированы
плазмидой pACE)
гена phaC, кодирующего ПГБ-синтазу, использовали ген phaC из M.
extorquens AM1, так как его полная последовательность известна
(www.ncbi.nlm.nih.gov NC_012808). Электрофорез цитоплазматических
белков штамма, трансформированного плазмидой pPHA, несущей ген phaC
и его промоторную область (1817 п.н.), показал, что уровень экспрессии phaC
не отличался от контрольного штамма G10, трансформированного вектором
pCM160 без гена phaC. Однако активность ПГБ-синтазы в бесклеточном
экстракте трансформанта была выше и составляла 1.4 нмоль/мг белка мин,
по сравнению с экстрактом контрольного штамма (0.48 нмоль/мг белка
мин).
В клетках M. extorquens G10, трансформированных вектором pPHA из
M. extorquens AM1 или pCM160 (без гена phaC), выявлены различия в уровне
и динамике накопления ПГБ, при этом скорость роста этих трансформантов
была практически одинакова (рис. 5).
Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата
341
Рис. 3. 10% ДСН-ПААГ — электрофорез цитоплазматических белков M.
extorquens G10 (контроль) и штаммов M. extorquens ICL8, M. extorquens
ICL35, несущих в хромосоме ген aceA; М — маркеры
Рис. 4. Гибридизация 33 Р-меченного зонда на ген aceA: 1 — с геномной
ДНК M. extorquens G10 (дикий тип), обработанной рестриктазой BamH I; 2
— с ДНК штамма M. extorquens ICL35, обработанной рестриктазами BamH
I; 3 — Sac I; 4 — EcoR I; 5 — Xma I; 6 — Xba I
Максимальное накопление ПГБ у штамма с дополнительным геном phaC
происходило в конце логарифмической фазы роста и достигало 75%, в
отличие от контрольного штамма, максимально накапливающего ПГБ в
стационарной фазе.
Заключение
Таким образом, клонирование генов aceA и phaC в M. extorquens G10
и AM1 привело к повышению уровня синтеза ПГБ метилобактериями,
при этом скорость роста трансформантов практически не изменилась.
Описанные приемы генной модификации метаболизма потенциального
342
Б. Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко
Рис. 5. Кривые роста (1, 2) и накопления ПГБ (3, 4) M. extorquens G10,
трансформированной векторами pCM160 (1, 3 — контроль) и pPHA (2, 4 —
несущие ген ПГБ-синтазы)
продуцента ПГБ M. extorquens G10 и дальнейшие исследования
свойств ПГБ-синтаз метилобактерий могут представить интерес при
конструировании продуцента ПГБ из метанола.
Авторы признательны д.б.н. Хмелениной В.Н. за помощь в подготовке
статьи и к.х.н. Шляпникову М.Г. (ИБФМ РАН) за секвенирование ДНК.
Список литературы
1. Anderson A.J., Dawes E.A. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial
uses of bacterial polyhydroxyalkanoates // Microbiol Rev. 1990 V.54, №4. P.450–472.
2. Говорухина Н.И., Троценко Ю.А. Содержание поли-β-оксибутирата у
метилотрофных бактерий с различными путями первичной ассимиляции
метанола // Прикл. биохимия и микробиол. 1991. Т.27, №1. С.98–101.
3. Короткова Н.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера
3-оксибутирата/3-оксивалерата метилобактериями с сериновым путем
метаболизма // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т.33, №4.
С.398–403.
4. Suzuki Т., Yamane Т., Shimizu S. Mass production of poly-β-hydroxybutyric acid
by fully automatic fed-batch culture of methylotroph // Appl. Microbiol. Biotechnol.
1996. V.23. P.322–329.
5. Короткова Н.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера
3-гидроксибутирата/3-гидроксивалерата
Methylobacterium
extorquens:
метаболизм пропанола, пропионата и валерата // Микробиология. 1999. Т.68,
№3. С.351–359.
6. Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AM1 from a genomic point of view
/ L. Chistoserdova [et al.] // J. Bacteriol. 2003. V.185. P.2980–2987.
7. Genome of Methylobacillus flagellatus, molecular basis for obligate methylotrophy,
and polyphyletic origin of methylotrophy / L. Chistoserdova [et al.] // J. Bacteriol.
2007. V.189. P.4020–4027.
Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата
343
8. Anthony C. The Biochemistry of Methylotrophs. London: Academic, 1982.
P.113–114.
9. Korotkova N., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Identification of genes involved in
the glyoxylate regeneration cycle in Methylobacterium extorquens AM1, including
two new genes, meaC and meaD // J. Bacteriol. 2005. V.187. P.1523–1526.
10. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway / T.J. Erb [et al.] // PNAS. 2007.
V.104, №25. P.10631–10636.
11. Korotkova N., Lidstrom M.E. Connection between poly-beta-hydroxybutyrate
biosynthesis and growth on C(1) and C(2) compounds in the methylotroph
Methylobacterium extorquens AM1 // J. Bacteriol. 2001. V.183. P.1038–1046.
12. Nunn D.N., Lidstrom M.E. Isolation and complementation analysis of 10 methanol
oxidation mutant classes and identification of the methanol dehydrogenase structural
gene of Methylobacterium sp. strain AM1 // J Bacteriol. 1986. V.166. P.581–590.
13. Attwood M.M., Harder W. A rapid and specific enrichment procedure for Hyphomicrobium sp // Ant. Leeuwenhoek. 1972. V.38. P.369–377.
14. Marmur J.A. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // J. Mol. Biol. 1961. V.63. P.1208–1218.
15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир,
1984. 480 c.
16. Marx C.J., Lidstrom M.E. Development of improved versatile broad-host-range
vectors for use in methylotrophs and other Gram-negative bacteria // Microbiology
(UK). 2001. V.147. P.2065–2075.
17. Dennis J.J., Zystra G.J. Plasposons: modular self-cloning minitransposon derivatives for rapid genetic analysis of Gram-negative bacterial genomes // Appl. Environ.
Microbiol. 1998. V.64, №7. P.2710–2715
18. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 // Nature. 1970. V.227. P.680–685.
19. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia
coli with plasmids // Gene. 1990. V.96. P.23–28.
20. Kornberg H.L., Krebs H.A. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modified
tricarboxylic acid cycle // Nature. 1957. V.179. P.988–991.
21. Valentin H.E., Steinbüchel A. Application of enzymatically synthesized
short-chain-length hydroxy fatty acid coenzyme A thioesters for assay of
polyhydroxyalkanoic acid synthases // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V.40.
P.699–709.
22. Определение поли-3-оксибутирата и сополимера 3-оксибутирата-3-оксивалерата
в микробной биомассе методом обращенно-фазовой высокоэффективной
жидкостной хроматографии / Н.А. Короткова [и др.] // Прикл. биохим.
микробиол. 1997. Т.33. С.339–343.
Ешинимаев Булат Цыденжапович ([email protected]), к.б.н.,
научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
344
Б. Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко
Лапин Александр Александрович ([email protected]), аспирант,
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Пущино.
Бесчастный Александр Павлович ([email protected]), к.б.н.,
научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Троценко Юрий Александрович ([email protected]), д.б.н.,
профессор, зав. лабораторией, Институт биохимии и физиологии
микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Genetic modification of polyhydroxybutyrate synthesis in
Methylobacterium extorquens
B. C. Eshinimaev, A. A. Lapin, A. P. Beschastny, Yu. A. Trotsenko
Abstract. Heterologous expression of the aceA gene from Escherichia coli
К12 under methanol dehydrogenase promoter into the Methylobacterium extorquens G10 and AM1 accomplish of the isocitrate lyase activity appearance (15
nmol/min/mg protein) and of the PHB synthesis increment in the transformant
cells in comparison with an original strains. Mutants with inserted the aceA E.
coli gene into M. extorquens G10 chromosome also had higher level of the PHB
in cell. The phaC gene encoding the polyhydroxybutyrate (PHB) synthase of the
M. extorquens AM1 introduction into M. extorquens G10 resulted in increasing
activity of PHB-synthase and in alteration of the biopolymer accumulation.
Keywords: polyhydroxybutyrate, biosynthesis, cloning, polyhydroxybutyrate
synthase, isocitrate lyase, Methylobacterium extorquens.
Eshinimaev Bulat ([email protected]), candidate of biological sciences,
research scientist, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Lapin Alexander ([email protected]), postgraduate student,
Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS,
Pushchino.
Beschastny Alexander ([email protected]), candidate of biological sciences, research scientist, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology
of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Trotsenko Yuri ([email protected]), doctor of biological sciences,
professor, head of laboratory, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology
of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Поступила 21.10.2010