учебное пособие - Южный федеральный университет
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Е. М. ВЕЧКАНОВ, В. В. ВНУКОВ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ Основы фотобиологии Ростов-на-Дону 2011 УДК 577 Рецензент: д.б.н., профессор кафедры биохимии и микробиологии факультета биологических наук ЮФУ Лукаш А. И. Печатается по постановлению редакционной комиссии по биологическим наукам факультета биологических наук ЮФУ. Протокол № 4 от 27 июня 2011 г. доц. каф. биохимии и микробиологии ЮФУ, к.б.н. Вечканов Е.М зав. каф. биохимии и микробиологии ЮФУ, д.б.н., профессор Внуков. В. В. Термодинамика и кинетика биологических процессов: Учеб-метод, пособие для вузов / Е.М. Вечканов, В. В. Внуков. Ростов-на-Дону: Изд-во Копи-Центр, 2011. 53 с. Издание подготовлено при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (20092010 годы)» № 2.1.1/5628). Учебное пособие предназначено для подготовки студентов по общему курсу биофизики, теме «Фотобиология». Для студентов дневной, очно-заочной и заочной форм обучения направления 020400 - биология и 022000 - биоэкология. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ 1. Квантовая биофизика. Свойства фотона. Свойства электрона. ------------------------ 5 2. Квантовые характеристики светового излучения-------------------------------------------- 7 3. Электромагнитное излучение. Шкала электромагнитных колебаний. ------------- 8 4. Основные виды фотобиологических процессов: фотоэнергетические, фотоинформационные, фотодеструктивные---------------------------------------------------- 5. Типы фотохимических реакций: фотоионизация, фотоокисление, фотовосстановление, фотодимеризация, фотодиссоциация------------------------------ 6. Взаимодействие квантов с молекулами. Электронные 10 19 возбуждѐнные состояния. Преобразования энергии электронных возбуждѐнных состояний.---- 15 7. Количественные законы поглощения монохроматического света растворами---- 17 8. Спектры пропускания и поглощения. ----------------------------------------------------------- 19 9. Измерение спектров поглощения. Спектрофотометры. ----------------------------------- 22 10. Флуоресценция. Правило Стокса, Левшина, Вавилова.----------------------------------- 23 11. Принцип Франка-Кондона--------------------------------------------------------------------------- 24 12. Фосфоресценция------------------------------------------------------------------------------------------ 25 13. Хемилюминесценция и еѐ эмпирические законы. ------------------------------------------ 26 14. Биолюминесценция, еѐ виды и механизмы. Люциферины люциферазы. Фотопротеины.------------------------------------------------------------------------------------ 15. Безизлучательные механизмы межмолекулярной миграции 28 энергии: индуктивно-резонансный, экситонный, обменно-резонансный------------------------ 35 16. Фотоинформационные процессы. Биофизика зрительного восприятия.----------- 38 17. Зрительный сигнальный каскад.----------------------------------------------------------------- 40 18. Изменения поляризации мембран зрительных рецепторов при поглощении квантов. Механизмы усиления.-------------------------------------------------------------------- 42 19. Бактериородопсин. Фотохимические реакции бактериородопсина. Перенос протона через пурпурную мембрану галофильных бактерий.-------------------------- 20. 43 Фотодеструктивные процессы. Фотохимические превращения биополимеров и биомембран.----------------------------------------------------------------------------------------------- 45 Вопросы по курсу-------------------------------------------------------------------------------------------------- 50 Список литературы----------------------------------------------------------------------------------------------- 52 3 ВВЕДЕНИЕ Фотобиология - наука о биологических процессах, инициированных в живых системах действием света, поглощѐнным одним или несколькими хромофорами (фоторецепторами) этих систем. В основе фотобиологии лежат теоретические представления о физикохимических свойствах биологических молекул и сложных биологических структур, полученные из экспериментальных результатов при изучении фотофизических и фотохимических свойств простых и сложных органических молекул, красителей, природных фотопроцессы и синтетических в растворах, пигментов. суспензиях, Свет инициирует адсорбатах, слоях, различные упорядоченных системах, мембранах клеток, в клетках, тканях, в целых организмах. Нередко эти процессы имеют свободно-радикальную природу и продолжаются в дальнейших темновых реакциях. Изучение таких процессов требует привлечения современных представлений физики, химии, биофизики и биологии. Знание механизмов первичных стадий фотобиологических процессов необходимо для понимания трансформации энергии поглощѐнных квантов света (фотонов) в таких явлениях как фотосинтез, зрение, повреждающее и лечебное действие ультрафиолетового и лазерного излучения. 4 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СВЕТА С ВЕЩЕСТВОМ § 1. Квантовая биофизика. Свойства фотона. Свойства электрона. Свойства фотона. Световое излучение - это поток фотонов. Фотон — это частица, обладающая нулевой массой покоя и скоростью света с. Первое из этих свойств означает только то, что фотон в покое не существует. Но «в полете» он обладает массой, которая проявляется в притяжении фотонов другими телами и в искривлении светового луча около центров гравитации. Эту массу можно найти из уравнения Эйнштейна, если мы знаем энергию фотона Е (1): E = mc2 (1) Одновременно фотон — это электромагнитная волна, обладающая частотой колебаний v и длиной X. Соотношение между этими величинами описывается уравнением (2) νλ = с (2) Энергия фотона связана с частотой электромагнитной волны уравнением Планка (3): Е = hν (3) из которого следует, что энергия фотона обратно пропорциональна длине его волны (4): Е = hс/λ (4) Коэффициент h называется постоянной Планка и равен 6,62 х 10-34 Дж•с Из уравнений (1) и (4) следует, что mc2 = hc/λ, откуда находим импульс фотона (5): р = mc = h/λ (5) Энергия фотона используется при его поглощении молекулами для осуществления фотохимических реакций, таких, как, например, превращение родопсина в сетчатке глаза, которое лежит в основе зрения. Импульс фотона проявляется в способности светового потока оказывать давление на отражающую поверхность. Свойства электрона. 5 Все вещества состоят из молекул, молекулы из атомов, атомы же состоят из электронов и ядер. Взаимодействие видимого или ультрафиолетового света и молекул - это, в конце концов, взаимодействие фотонов с электронами. Электроны располагаются на определенных орбиталях в атомах и молекулах по следующим причинам: 1. Они не разлетаются из-за электростатического притяжения электронов (несущих отрицательный заряд) и ядер (заряженных положительно); 2. Электроны не падают на ядра из-за центробежной силы, обусловленной их вращением вокруг ядер; 3. Они находятся на вполне определенных орбиталях из-за своих волновых свойств. В 1924 г. Луи де Бройль предположил, что электрон, как и любая другая частица, в частности фотон, обладает свойствами волны, а лучше сказать, является одновременно волной и частицей. Главное в гипотезе де Бройля заключается в том, что импульс электрона (а импульс характерен для движущихся тел) — это импульс волны, (инерция которой связана с явлением электромагнитной индукции). Из этих соображений выводится уравнение де Бройля, связывающее длину волны электрона со скоростью его движения. Чтобы вывести это уравнение, нужно приравнять импульс электрона как частицы к его импульсу как волны. Импульс электрона как частицы есть произведение массы электрона на скорость его движения (6): р = mv (6) Импульс электрона как электромагнитной волны находим по тому же уравнению (5), что и импульс фотона. В силу идентичности этих двух импульсов при сравнении (5) и (6) получаем уравнение де Бройля (7). λ = h/mv (7) Уравнение показывает, что тяжелые и быстрые частицы имеют короткую длину волны, а легкие и медленные - большую длину волны. Длина волны неподвижной частицы бесконечно большая. 6 § 2. Электронные переходы в молекулах В молекулах органических веществ в электронных переходах могут участвовать электроны трех типов: 1. s - электроны (для возбуждения таких переходов требуется относительно большая энергия, эти переходы формируют оптические спектры в далекой УФ-области). 2. n - электроны, не участвующие в образовании связей; 3. р - электроны, участвующие в образовании двойных и тройных связей. При расчѐте свойств электронных орбиталей в молекулах вводят некоторые допущения. При этом рассматриваются только электроны, образующие химическую связь, которые находятся в молекуле на молекулярных орбиталях. По аналогии с s-, p-, d- атомными орбиталями, их называют σ-, π-, δ- … орбиталями. В молекулах могут происходить разные электронные переходы (рис. 1). Хотя переходы n → σ * и σ → σ * в принципе реализуются, они требуют большой энергии и наблюдаются в далекой УФ-области. Наибольшее значение имеют переходы n → п* и п → п*, поскольку их энергия соответствует видимой или ближней ультрафиолетовой области, а вероятность переходов п → п* достаточно велика, поэтому соответствующие полосы поглощения обладают достаточной интенсивностью. Рис. 1 Уровни энергии молекулы (горизонтальные линии) и электронные переходы при поглощении энергии (вертикальные стрелки) 7 § 3. Электромагнитное излучение. Шкала электромагнитных колебаний. Электромагнитное распространяющееся электромагнитного излучение в пространстве поля (то есть, (электромагнитные возмущение волны) это (изменение взаимодействующих состояния) друг с другом электрического и магнитного полей). Электромагнитные волны можно изобразить в виде самораспространяющихся поперечных колебаний электрического и магнитного полей. На рисунке 2 плоскополяризованная волна, распространяющаяся справа налево. Колебания электрического поля изображены в вертикальной плоскости, а колебания магнитного поля в горизонтальной. Рис. 2 Схема изображающая электромагнитные колебания Среди электромагнитных полей вообще, порожденных электрическими зарядами и их движением, принято относить собственно к излучению ту часть переменных электромагнитных полей, которая способна распространяться наиболее далеко от своих источников - движущихся зарядов, затухая наиболее медленно с расстоянием. Электромагнитное излучение способно распространяться в вакууме (пространстве, свободном от вещества), но в ряде случаев достаточно хорошо распространяется и в пространстве, заполненном веществом (несколько изменяя при этом свое поведение). Электромагнитное излучение принято делить по частотным диапазонам (табл. 1, рис. 3). Между диапазонами нет резких переходов, они иногда перекрываются, а границы между ними условны. Поскольку скорость распространения излучения (в вакууме) постоянна, то частота его колебаний жѐстко связана с длиной волны в вакууме. 8 Рис. 3 Шкала электромагнитных колебаний Таблица 1 Диапазоны электромагнитного излучения Название диапазона Длины волн, λ Сверхдлинные более 10 км Длинные Радиоволны 10 км - 1 км Средние 1 км - 100 м Короткие 100 м - 10 м Ультракороткие 10 м - 1 мм Инфракрасное излучение 1 мм - 780 нм Видимое (оптическое) излучение Ультрафиолетовое Рентгеновские Гамма 780 - 380 нм Частоты, ν менее 30 кГц 30 кГц 300 кГц 300 кГц - 3 МГц 3 МГц - 30 МГц 30 МГц - 300 ГГц 300 ГГц 429 ТГц 429 ТГц 750 ТГц 380 - 10 нм 7,5×1014 Гц - 3×1016 Гц 10 - 5×10−3 нм 3×1016 — 6×1019 Гц менее 5×10−3 нм более 6×1019 Гц 9 Источники Атмосферные явления. Переменные токи в проводниках и электронных потоках (колебательные контуры). Излучение молекул и атомов при тепловых и электрических воздействиях. Излучение атомов под воздействием ускоренных электронов. Атомные процессы при воздействии ускоренных заряженных частиц. Ядерные и космические процессы, радиоактивный распад. § 4. Основные виды фотобиологических реакций: фотоэнергетические, фотоинформационные, фотобиосинтетические, фотодеструктивные Фотобиологические процессы происходят в результате воздействия света на организм. С биологической и функциональной стороны фотобиологические реакции можно подразделить на собственно физиологические и деструктивномодифицирующие (Конев С. В., Волотовский И. Д., 1979) (рис. 4) Рис. 4 Основные виды фотобиологических реакций (Конев С. В., Волотовский И. Д., 1979) Рис. 5 Спектр фотобиологических процессов (Конев С. В., Волотовский И. Д., 1979) 1 — темновая химия (энергия активации); 2 — фотохимия; 3 — фотореактивация; 4 — фототропизм; 5 — фотосинтез; 6 — пигментное потемнение; 7 — меланогенез; 8— эритема; 9— кожная фотосенсибилизация; 10 — зрение 10 Функционально-физиологические реакции Энергетические реакции В ходе энергетических реакций световая энергия в результате синтеза новых органических молекул трансформируется в химическую. При этом суммарная свободная энергия конечных продуктов реакции выше, чем у исходных. Основная энергетическая реакция - фотосинтез, в результате которого из воды и углекислого газа за счет энергии света синтезируется глюкоза. Фотосинтез включает в себя образование богатых энергией промежуточных продуктов, например, АТФ промежуточных и восстановленный продуктов НАДФ. фотосинтеза Возникновение может рассматриваться каждого как из само- стоятельная эндергоническая фотобиологическая реакция. Особой разновидностью фотосинтеза является светозависимое образование АТФ с участием бактериородопсина у галофильиых бактерий. Информационные реакции При информационных реакциях свет через образование фотопродуктов триггирует специализированные усилительные механизмы, в результате чего организм получает необходимую информацию о ситуации в окружающей среде. Отличительный признак этой группы реакций - сложная конструкция усилительного аппарата, достигающая самой высокой степени совершенства в органе зрения. Один квант света, попавший в рецепторную клетку сетчатки, вызывает передвижение огромного количества ионов, формирующих зрительный сигнал (усиление по мощности 10 5—106). Как и при энергетических реакциях, пигмент, поглощающий свет, практически не расходуется, поскольку его фотопревращения обратимы. К этой группе реакций можно отнести также таксисы, тропизмы, периодизмы, морфогенетические реакции. Биосинтетические реакции При биосинтетических реакциях в сложной цепи последовательных этапов синтеза органических молекул представлены отдельные фотохимические стадии, т. е. химические реакции, в норме протекающие только под действием света. Например биосинтеза хлорофилла на заключительной стадии - превращение протохлорофиллида в хлорофиллид, провитамины D, накапливаемые без участия света, превращаются в витамин фотохимическим путем. 11 Как при существенного информационных, запасания так энергии и не при биосинтетических происходит. Общим реакциях для всех функционально-физиологических реакций является отсутствие повреждений жизненно важных макромолекулярных и надмолекулярных структур клетки. Фотодеструктивные реации В противоположность функционально-физиологическим при деструктивномодифицирующих реакциях свет н электронно-возбужденные состояния молекул не являются естественными участниками нормальных метаболических процессов. Свет просто повреждает готовые молекулы биосубстрата, побуждая их к различным химическим превращениям, часто не свойственным норме. Деструктивно-модифицирующие реакции разделяются на отдельные классы реакций: летальные, мутационные и патофизиологические. Летальные реакции. Летальные реакции, приводящие к гибели организма, вызываются в основном ультрафиолетовым светом. Гибель организма наступает вследствие фотохимических повреждений биологически важных макромолекул и прежде всего ДНК. Эти же соединения являются акцепторами повреждающего света. Летальные эффекты наблюдаются у низкоорганизованных форм живой материи: животных, растительных и бактериальных вирусов (фагов), микроорганизмов, простейших. В случае микроорганизмов различают бактериостатический (клетки живут, но не размножаются) и бактерицидный (клетки гибнут) эффекты. Особой разновидностью летальных реакций представляется так называемый фотодинамический эффект, когда искусственно внесенная в клетку краситель сенсибилизирует организм к видимому свету в присутствии кислорода. Мутационные реакции Мутационные реакции по своей природе близки к летальным. Результат действия УФ-света - замена или выпадение основания в ДНК, т. е. возникновение мутантной формы организма. Подобно летальным, мутационные реакции возникают и при фотодинамическом действии видимого света. Патофизиологические реакции Патофизиологические метаболизма реакции приводят к временным нарушениям и физиологического состояния клеток организмов. В ходе этих 12 реакций не происходит необратимого повреждения уникальных, критических, жизненно важных структур. Патофизиологические реакции развиваются после поглощения света различными хромофорами: белками, нуклеиновыми кислотами, липидами, витаминами и др. К патофизиологическим реакциям примыкают и некоторые фотобиологические процессы, протекающие в коже, например, эритема и канцерогенез. § 5. Типы фотохимических реакций: фотоионизация, фотоокисление, фотовосстановление, фотодимеризация, фотодиссоциация Фотохимические реакции - химические реакции, которые инициируются воздействием электромагнитных волн, путѐм поглощения фотона с длиной волны ~ 100-1500 нм. При фотохимической реакции происходит квантовый переход молекулы вещества из основного электронного состояния в одно из возбужденных состояний. При этом происходит фотоионизация - отщепление электрона и образование катион-радикала (1). M + hν = M+ + e- (1) Возбужденные состояния молекул имеют отличную от основного состояния электронную структуру и, как правило, более высокую реакционную способность. Молекулы вступают в химические реакции, первичные продукты которых (ионы, радикалы, изомеры) чаще всего оказываются нестабильными. Для фотобиологии в основном типичны одноквантовые фотохимические реакции молекул, находящихся в нижнем электронно-колебательном синглетном (флуоресцентном) или триплетном (фосфоресцентном) возбужденном состоянии. Известны следующие основные типы одноквантовых фотохимических реакций органических молекул: 1. Фотораспад. При фотораспаде происходит разрыв химических связей с расщеплением молекулы на радикалы, ионы или нейтральные более простые молекулы (1). Фотораспад наблюдается, например, при облучении большими дозами ультрафиолета аминокислот, пептидов и белков (фотолиз пептидной связи, дезаминирование, нуклеотидов и нуклеиновых кислот. 13 декарбоксилирование), а также 2. Фотоперегруппировка. В ходе фотоперегруппировки один изомер или таутомер превращается в другой. А. Фотоизомеризация. Если перегруппировываются атомы или группы в молекуле, имеет место случай которой — отдельные фотоизомеризация, частный фотостереоизомеризация, заключающаяся в изменении пространственного расположения отдельных группировок в молекуле относительно еѐ «оси». Б. Фототаутомеризация. Перенос атомов водорода из одной части молекулы в другую. 3. Фотоприсоединение. Присоединение к возбуждѐнной молекуле других молекул. В зависимости от того, какая молекула присоединяется, различают: А. Фотодимеризацию. А* + А = (А*….А) = А2 Б. Фотооксидирование. А* + О2 = (А*….А) = ОАО В. Фотогидратацию. А* + Н2О = НАОН 4. Фотоперенос электронов. А. Фотоокисление. Возбуждѐнная молекула отдаѐт свой электрон второй невозбуждѐнной молекуле. А* + В = А+ + ХБ. Фотовосстановление. Возбуждѐнная молекула получает лишний электрон. А* + С = А- + С+ Продуктами реакций фотопереноса электрона являются сольватированные электроны, катион- и анион-радикалы. Важнейшие биологические реакции фотопереноса электронов - обратимое фотовосстановление хлорофилла при фотосинтезе и перенос электрона, образующегося при фотоионизации 14 ароматических аминокислотных остатков в белке, к дисульфидным связям с последующим их восстановлением. Разновидность фотопереноса электронов — так называемые комплексы с переносом заряда. Здесь происходит переброс электрона от одной части комплекса к другой с образованием новой полосы поглощения, не характерной для электронной архитектуры каждой из этих частей, обладающих свойствами относительно автономных хромофоров. 5. Фотоперенос протона. Суть реакции — в присоединении к возбужденной молекуле протона от невозбужденной кислоты или, наоборот,— в отдаче возбужденной кислотой своего протона основанию: А + ВН =АН+ + В- - фотоприсоединение Н+ АН+ + В = А- + Н+В – фотоотдача Н+ В обоих случаях реакция обусловлена изменением протонодонорных или протоноакцепторных свойств возбужденных молекул. § 6. Взаимодействие квантов с молекулами. Электронные возбуждѐнные состояния. Преобразования энергии электронных возбуждѐнных состояний На рисунке 6 дана схема электронных уровней (с колебательными подуровнями) некой молекулы, способной поглощать видимое излучение (и называемой хромофором - несущая окраску). В основном состоянии все электроны занимают самые низшие электронные уровни и расположены на орбиталях попарно, причем их спины имеют противоположное направление (антипараллельны). Такое состояние молекулы называют синглетным невозбужденным (основным) состоянием и обозначают как S0. Так же обозначают энергетический уровень невозбужденной молекулы. При поглощении света происходит переход одного из электронов на вышележащую орбиталь, но его спин не меняется. Такое состояние молекулы и ее энергетический уровень обозначают как S1 или S2, в зависимости от того, на какой уровень перешел электрон. Это синглетное возбужденное состояние иногда обозначают как S*. Через 10-8 - 10-9 сек сможет произойти испускание основной части поглощенной 15 энергии в виде кванта света с большей длиной волны (с меньшей энергией); такое излучение, обусловленное переходом S* - So, называют флуоресценцией. При определенных условиях может произойти обращение спина электрона, находящегося на верхней орбитали возбужденной молекулы, при этом часть его энергии теряется. параллельными энергетический Состояние спинами, уровень молекулы, называется электрона содержащей триплетным с обращенным два электрона с состоянием, а спином называют триплетным уровнем. Как этот уровень, так и молекула в триплетном состоянии обозначается обычно символом Т. Прямой переход электрона с триплетного уровня Т на основной уровень S0 невозможен, так как в этом случае на одной и той же орбитали оказались бы два электрона с параллельными спинами, что противоречит квантово-механическому принципу Паули. При таком переходе тоже может высвечивается фотон с меньшей энергией и, следовательно, большей длиной волны, чем в случае флуоресценции. Это замедленное и более длинноволновое излучение называется фосфоресценцией. Время жизни молекулы в триплетном возбужденном состоянии (от 10-4 с до нескольких секунд) много выше, чем в синглетном. Вместе флуоресценцию и фосфоресценцию называют фотолюминесценцией (или просто люминесценцией, если очевидно, что электронно-возбужденные молекулы образовались под действием света, а не ионизирующей радиации или в результате химических реакций). Рис. 6 Преобразования энергии электронных возбуждѐнных состояний 16 Наряду с электронными переходами в молекуле, сопровождающимися испусканием фотона (флуоресценцией и фосфоресценцией), после поглощения кванта возможен ряд безызлучательных переходов с более высоких электронных уровней и колебательных подуровней на нижележащие уровни и подуровни. Если между двумя или несколькими молекулами в системе имеется взаимодействие, то возможен безызлучательный перенос, или миграция, энергии электронного возбуждения от одной молекулы к другой. При этом, если безызлучательный переход не сопровождается изменением спина, его называют внутренней конверсией, тогда как переходы электрона с обращением спина называются интеркомбинационной конверсией. Все эти процессы перераспределения энергии электронного возбуждения, разыгрывающиеся после поглощения кванта, называют фотофизическими химическим изменениям процессами. возбужденных Обычно молекул, они предшествуют которые называют фотохимическими реакциями (рис. 7). Зная структуру энергетических уровней, нетрудно определить спектральные свойства молекулы, область ее поглощения, флуоресценции и фосфоресценции. И наоборот, на основании измерения спектров поглощения и люминесценции можно построить схему энергетических уровней данной молекулы. Рис. 7 Внутренняя конверсия § 7. Количественные законы поглощения монохроматического света растворами В случае прохождения через раствор пучка монохроматического света интенсивностью I0 происходит его поглощение и уменьшение его интенсивности до величины I (рис. 8). 17 Рис. 8 Иллюстрация к закону Бугера – Ламберта - Бера Отношение величин I0 и I называют пропусканием Т (8). T = I / I0 (8) акон Бугера - амберта - Бера - физический закон, определяющий ослабление параллельного монохроматического пучка света при распространении его в поглощающей среде. Закон выражается следующей формулой (9): I (l) = I0 e-Kλl (9) или lg I0\I = ε c l (10) D = ε c l (11) где I0 — интенсивность входящего пучка; l — толщина слоя вещества, через которое проходит свет; kλ — показатель поглощения; D – оптическая плотность раствора Зависимость пропускания света раствором, его поглощения показано на рисунке 9. Рис. 9 Зависимость пропускания Т, коэффициента поглощения (1-Т), и оптической плотности D от концентрации С хромофора в растворе. 18 С увеличением концентрации раствора С и длины оптического пути света оптическая плотность D растѐт линейно. Зависимость поглощения (1-Т) приближается к линейной только в начале графика, т. е. при малых концентрациях и оптических плотностях. Это обусловлено тем, что передние слои ослабляют свет, доходящий до задних слоѐв раствора. В тонких слоях раствора данным явлением можно пренебречь, и зависимость поглощения от концентрации вещества имеет линейный характер. Количественно связь (1-Т) и D можно представить в виде (12, 13): 1-Т = 1-10-D (12) 1-Т ~ ln 10D ~ 0,4343 D (13) При величинах коэффициента поглощения 0,1 и 0,2 (оптических плотностях 0,045 и 0,097) ошибка в расчѐтах по уравнению составит 4,5 и 10 % соответственно. Свет различных длин волн поглощается неодинаково. Показатель поглощения — коэффициент, характеризующий свойства вещества и зависящий от длины волны λ поглощаемого света. Эта зависимость называется спектром поглощения вещества. § 8. Спектры пропускания и поглощения Спектром пропускания называют зависимость коэффициента пропускания T от длины волны λ. Спектр пропускания используется для характеристики светофильтров. Спектром поглощения называют зависимость оптической плотности D какого-либо объекта, например раствора, от длины световой волны λ. Оптическая плотность D 1М индивидуального раствора называется молярной экстинкцией раствора. Спектры поглощения биологически-важных веществ представляют собой сравнительно плавные кривые с одним или несколькими максимумами. Максимум на этой кривой соответствует наиболее вероятной, усреднѐнной величине энергии электронного перехода. 19 Рис. 10 Спектры поглощения ароматических аминокислот триптофана, тирозина и фенилаланина. Поглощение света белками в области 240-300 нм обусловлено, главным образом, ароматическими аминокислотами - триптофаном, тирозином и фенилаланином (рис. 10). Спектральные свойства триптофана определяются его индольным кольцом. Триптофан имеет две полосы поглощения - в области 218 и 280 нм. Молярный коэффициент поглощении этой аминокислоты в четыре раза больше, чем тирозина, и почти в тридцать раз больше, чем фенилаланина. Спектр поглощения тирозина обусловлен его фенольным кольцом. Максимумы находятся при 222 и 275 нм. Спектральные свойства фенилаланина определяются бензольным ядром. Спектр характеризуется максимумом при 257 нм. Меньший вклад в поглощение белков вносит гистидин (рис. 11). Свет в области 210 нм, поглощают гистидин и серосодержащие аминокислоты - цистин, цистеин и метионин. Рис. 11 Спектр поглощения гистидина 20 Для окисленных форм никотинамидных коферментов НАД и НАДФ характерна интенсивная полоса поглощения с максимумом при 260 нм (рис. 12). Переход в восстановленную форму (НАД-Н) сопровождается появлением широкой полосы с максимумом при 340 нм, а интенсивность первой полосы немного уменьшается. Рис. 12 Спектр поглощения НАДН Максимум спектра при 260 нм связан с наличием пуринового и пиридинового колец (рис. 13), второй максимум при 340 нм обусловлен восстановлением кольца амида никотиновой кислоты. Рис. 13 Спектры поглощения пуриновых и пиримидиновых оснований. 21 Длинноволновый максимум поглощения зависит также от числа сопряжѐнных двойных связей в молекуле. Ниже на рисунке 14 представлены спектры поглощения для соединений, имеющих двойные связи. Рис. 14 Спектры поглощения соединений, обладающих двойными связями. 1 – фосфолипиды; 2 – окисленные фосфолипиды: диеновые конъюгаты (λmax = 233 нм (n = 2)), триеновые конъюгаты (λmax = 270-280 нм (n = 2)); 3 - трансретиналь (λmax = 360 нм (n = 6)); 4 - каротиноиды (n = 11). § 9. Измерение спектров поглощения. Спектрофотометры. Прибор для определения спектральных зависимостей коэффициента пропускания или оптической плотности называется спектрофотометром. Наиболее часто используемые спектрофотометры имеют диапазон измерений по длинам волн 180-1100 нм. Этот диапазон включает в себя три области спектра: ближнюю ультрафиолетовую область (УФ) -180-380 нм; видимую - 380-760 нм и ближнюю инфракрасную (ИК) - 760-1100 нм. Область измерений спектра конкретного вещества Функциональная определяется блок-схема исходя однолучевого рисунке 15. 22 из его химического спектрофотометра состава. приведена на Рис. 15 Функциональная блок-схема однолучевого спектрофотометра Свет от источника(чаще используются ксеноновые лампы, дающие сплошной спектр излучения в видимой и ультрафиолетовой областях) проходит через монохоматор (устройство для выделения определѐнного диапазона длин волн). Монохроматический пучок света проходит через кювету, и его интенсивность измеряют детектором света – фотоэлектронным умножителем (ФЭУ). Фототок подаѐтся на вход усилителя, затем сигнал преобразуется в электронном блоке и подаѐтся на компьютер. § 10. Флуоресценция. Правило Стокса, Левшина, Вавилова Флуоресценция - физический процесс, разновидность люминесценции. Является одним из способов дезактивации электронно-возбужденных состояний. Флуоресценция является описывается уравнением: S* = S0 + hνфлуор Возбужденная молекула переходит в основное состояние за время 10 -8 -10-9 с испусканием кванта света. При этом фотоэлектрон опускается на различные колебательные подуровни основного состояния. Как и при поглощении, здесь выполняется принцип Франка—Кондона (рис. 16). 23 Рис. 16 Схема флуоресценции Спектр флуоресценции обладает рядом особенностей: 1. Спектр флуоресценции сдвинут в длинноволновую область (правило Стокса) (14, 15, 16). hνфлуор < hν (14) hс/λфлуор < hс/λ (15) λ флуор > λ (16) где h – постоянная Планка, ν – частота колебаний, λ – длина волны 2. По форме спектр флуоресценции зеркально симметричен спектру поглощения (Правило Левшина). 3. Квантовый выход флуоресценции всегда меньше единицы (правило Вавилова) (17) β = n высвеч. квантов / n поглощ. квантов (17) β<1 § 11. Принцип Франка-Кондона Время, в течение перебрасывается на которого квант возбужденный света уровень, поглощается составляет 10 -15 и электрон с. Период колебательных процессов молекулы (смещение ядер относительно положения равновесия) значительно больше 10-13 с, поэтому за время электронного перехода положение ядер в пространстве практически не изменяется. В системе кривых потенциальной энергии основного 24 и возбужденного поглощение изображается вертикальной стрелкой. «Невертикальные» переходы наименее вероятны. Это так называемый принцип Франка — Кондона (рис. 17). Рис. 17 Иллюстрация принципа Франка-Кондона § 12. Фосфоресценция Наряду электронными с синглетными уровнями, (S) молекула расположенными в обладает шкале триплетными энергий ниже, (Т) чем синглетные. Переход синглетного возбужденного состояния за время около 10 -12 с. в триплетное называется интеркомбинационной конверсией. Ориентация спина eменяется на противоположное (18). Т = S0 + hνфосфор (18) Триплетное состояние дезактивируется теми же путями, что и синглетное. При излучательной дезактивации триплетной молекулы высвечивается квант фосфоресценции (рис. 18). 25 Рис. 18 Схема фосфоресценции § 13. Хемилюминесценция и еѐ эмпирические законы Хемилюминесценция химическим воздействием - люминесценция (например, (свечение) тел, вызванная фосфора при медленном свечение окислении), или при протекании химической реакции (например, каталитические реакции некоторых эфиров щавелевой кислоты с пероксидом водорода в присутствии люминофора). Квант света хемилюминесцентной состоянии. испускается реакции, Последующий одним или образующимися переход несколькими в электронов продуктами электронно-возбуждѐнном в основное состояние сопровождается эмиссией фотонов. Основные стадии хемилюминесцентной реакции: 1. Разделение зарядов с образованием двух заряженных частиц АН = •А+ + е2. Потребление дополнительной энергии (нагревание, освещение, окисление кислородом) 3. Рекомбинация радикалов с противоположными зарядами с образованием молекулы продукта в возбуждѐнном состоянии. В более сложных химических реакциях, сопровождающихся фотонной эмиссией, можно различить те же самые три стадии. Одним из важных примеров 26 является кислорода хемилюминесценция (АФК) - смеси люминола супероксидных, под действием пероксидных активных и форм гидроксильных радикалов. На рисунке 19 показана схема реакций люминола в присутствии АФК. В реакциях 1 и 2 образуются частицы с разделенными зарядами и возникает избыток энергии за счет присоединения акцептора (НО*) и донора (•00-) электрона. Последующая реорганизация молекул (реакции 3-5) заканчивается образованием 3-аминофталата и эмиссией фотона. Рис. 19 Реакции, вызывающие хемилюминесценцию люминола в присутствии активных форм кислорода Хемилюминесценция подразделяется на собственную хемилюминесценцию, активированную хемилюминесценцию и биолюминесценцию (рис. 20). Рис. 20 Виды хемилюминесценции в биологических системах 27 Эмпирические законы хемилюминесценции: 1. Как правило, спектр хемилюминесценции является аналогом спектра фосфоресценции, а не спектра флуоресценции. 2. Абсолютная величина квантового выхода в хемилюминесцентных реакциях обычно очень мала. 3. Энергия испущенного фотона близка сумме энтальпии реакции и энергии активации, последняя в основном высокая (правило Одюбера) (19) (рис. 21). hν = EA + δH (19) Рис. 21 Объяснение третьего правила хемилюминесценции Энергия испущенного фотона есть сумма энергии активации люминесценции EA и энтальпии реакции δH, отметим, что энергия активации существенно меньше при электронном переходе через триплетный уровень. § 14. Биолюминесценция, еѐ виды и механизмы. Люциферины люциферазы. Фотопротеины Биохемилюминесценция является частным случаем хемилюминесценции, связанным со специфическими ферментативными реакциями, происходящими в живых организмах. Выделяют следующие виды биолюминесценции (рис. 22): 1. Митогенетические лучи Гурвича – слабое ультрафиолетовое излучение клеток, которое индуцирует деление окружающих клеток. 2. Сверхслабое свечение Вавилова (собственная хемилюминесценция клеток и тканей) практически всегда сопровождает процессы жизнедеятельности. 3. Активированная биохемилюминесценция (химические и биохимические активаторы биохемилюминесценции, физические факторы: ионизирующая 28 радиация (радиохемилюминесценция), УФ и видимый диапазон света (фотохемилюминесценция), пропускание электрического тока (электролюминесценция), действие ультразвука (сонолюминесценция), воздействие сил трения (триболюминесценция). Рис. 22 Виды биохемилюминесценции Митогенетические лучи Гурвича и сверхслабое свечение Вавилова Отечественный ученый А. Г. Гурвич был первым, кто указал на существование собственного слабого свечения клеток животных и растений, названного им митогенетическими лучами. Согласно А. Г. Гурвичу, митогенетические лучи - это очень слабое ультрафиолетовое излучение клеток, которое индуцирует деление окружающих клеток. Хотя сам А.Г. Гурвич использовал для обнаружения лучей только биологический детектор, то есть разные делящиеся клетки, его последователи в России (С. Родионов и Г.М. Франк в 1934 году) и за рубежом (Р. Одюбер в 1938 г.) разработали физический детектор излучения: газоразрядный счетчик фотонов с кварцевым окном, прозрачным для УФ-лучей. Таким способом было показано, что собственное свечение тканей может быть обусловлено реакциями трех типов: 1. Реакции активных форм кислорода; 2. Реакции цепного (перекисного) окисления липидов; 3. Реакции с участием окиси азота. Реакции активных форм кислорода Собственная хемилюминесценция активированных фагоцитов была открыта Р. Элланом (R. Allen) и сотрудниками в 1971 году. Непосредственной причиной такого свечения является образование синглетного кислорода в реакциях между 29 кислородными радикалами, перекисью водорода и гипохлоритом. Действительно, известно, что весьма интенсивная хемилюминесценция сопровождает реакцию гипохлорита и перекиси водорода, в которой образуются молекулы кислорода в возбужденном (синглетном) состоянии (1О2): СlO- + Н2O2 → Сl- + Н2O + 1O2 Синглетный кислород переходит в основное (триплетное) состояние кислорода с испусканием кванта света (хемилюминесценции) в инфракрасной области спектра (длина волны 1270 нм) 1O 2 Кроме того, возбужденные → 3O 2 + фотон (1270 нм) молекулы димеры (так синглетного кислорода называемые эксимеры) могут образовывать кислорода, которые переходят в основное состояние с испусканием видимого света (длины волн 635, 580, 535 нм). Синглетный кислород может, по-видимому, образовываться также при взаимодействии кислородных радикалов: Реакции цепного (перекисного) окисления липидов Одна из главных составляющих собственной (неактивированной) хемилюминесценции животных клеток и тканей - свечение, сопровождающее цепное окисление липидов в мембранных структурах клеток и липопротеинах крови. Эта реакция идет с участием свободных радикалов липидов L* и липопероксидов LOO*, которые как бы ведут цепи окисления (рис. 23). Рис. 23 Реакция цепного окисления липидов Время от времени радикалы, ведущие цепь окисления, взаимодействуют друг с другом. В реакции взаимодействия двух радикалов липопероксида (LOO*) образуются молекулы кетона и кислорода в электронно-возбужденном состоянии, которые затем переходят в основное состояние, испуская квант света (фотон): 30 Чем больше радикалов LOO* в системе, то есть, чем энергичнее идут цепные реакции окисления липидов, тем выше интенсивность хемилюминесценции, сопровождающей реакцию радикалов. Вещества, реагирующие со свободными радикалами и тем самым тормозящие цепное окисление липидов (так называемые антиоксиданты), одновременно подавляют хемилюминесценцию. Реакции с участием окиси азота Окись азота NO - это газ, хорошо растворимый в воде и обладающий высокой реакционной способностью. Последнее связано с тем, что •NО - свободный радикал (•NО). Функции •NО: 1. Расслабление стенок кровеносных сосудов (вазодилатация), которое приводит к улучшению кровоснабжения органов и снижению общего кровяного давления. 2. Окись азота выделяется клетками-фагоцитами и участвует в борьбе организма- хозяина с микроорганизмами. Участие реакций •NО в собственной хемилюминесценции тканей животных было показано в опытах Джулио Терренса и сотрудников, которые изучали свечение перфузируемого легкого. Свечение снижается очень существенно (на 85%) при введении в перфузат нитро-L-аргинина, ингибитора NO-синтазы (фермента, катализирующего образование окиси азота в живых клетках). Также при реакции окиси азота и супероксида образуется пероксинитрит, соединение чрезвычайно токсичное. ON• + •ОО- → ONOO (пероксинитрит) Реакция пероксинитрита с белками приводит к свечению, которое вносит существенный вклад в свечение всего органа. Активированная биохемилюминесценция 31 Свет создаѐтся у более высоко развитых организмов в специальных светящихся органах (напр., в фотофорах рыб), у одноклеточных эукариот - в особых органоидах, а у бактерий - в цитоплазме (рис. 24). Биолюминесценция основывается на химических процессах, при которых освобождающаяся энергия выделяется в форме света. А Б В Рис. 24 Фотографии организмов, способных к биохемилюминесценции А - грибы, Б – светляки, В – арктический криль Пионером в исследовании механизмов биолюминесценции стал Рафаэль Дюбуа, который в своих опытах в 1887 г. показал, что за свечение были ответственны две фракции: устойчивая к нагреву низкомолекулярная, и белковая, теряющая фракцию активность при люциферином, нагревании.Дюбуа а белковую - назвал низкомолекулярную люциферазой и постулировал ферментативную природу реакций, вызывающих биолюминесценцию. Люциферины представляют собой небольшие молекулы, служащие субстратом для соответствующих ферментов люцифераз. Люцифериныокисляются в присутствии люциферазы с образованием оксилюциферина и излучают энергию в виде света. Типы люциферин-люциферазных систем: Существует 5 основных типов люциферинов. 1. Люциферин светлячка. 2. Бактериальный люциферин содержит длинноцепочечный альдегид и восстановленный рибофлавин-фосфат. Найден у бактерий, а также у некоторых кальмаров и рыб. 32 3. Люциферин динофлагеллят (простейших) — производное хлорофилла. Именно он приводит к явлению свечения (фосфоресценции) океана. Похожий люциферин найден у мелких морских ракообразных. 4. Варгулин-имидазолопиразин, обнаружен у ракушковых и некоторых глубоководных рыб. 5. Целентеразин обнаружен у радиолярий, ктенофор, книдарий, кальмаров, копепод, щетинкочелюстных, рыб и креветок. Является светоиспускающим компонентом белков экворина и обелина. Биолюминесценция происходит в светляка. Всем результате биохимической известное реакции свечение окисления светляков светлякового люциферина кислородом воздуха в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ): Е + LH2+ АТФ = Е-LH2 - АМФ + ПФ Е- LH2 - АМФ + О2 = Р*- Е-АМФ + СО2 Р*- Е–АМФ = Р +Е+АМФ + hν Здесь АМФ - аденозинмонофосфат, ПФ - пирофосфат, Е - люцифераза, LH2 - люциферин, Р* и Р - продукт реакции (оксилюциферин) в возбужденном и основном состояниях соответственно. При отсутствии АТФ биолюминесценции не наблюдается, на этом основан один из самых чувствительных методов анализа АТФ в различных объектах. Для определения содержания АТФ измеряют хемилюминесценцию в изучаемом растворе, к которому добавляют смесь люциферина и люциферазы. Удается определять содержание АТФ в образце от 10-17 моля и выше. Поскольку биосинтез АТФ - показатель нормальной жизнедеятельности клеток, препарат люциферин - люцифераза светляка используют для обнаружения бактериального заражения в какой-либо среде, для оценки жизнеспособности эритроцитов при консервировании крови, изучения действия на микроорганизмы антибиотиков. Биолюминесценция относится немного непосредственно бактериальной светящихся видов бактерий. сопровождаемая люциферазой бактерий. и числу светящихся Хемилюминесцентная свечением, включает К катализируется в себя реакция, ферментом процессы - окисления восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-Н2 до ФМН и одновременно 33 алифатического (С14) альдегида до миристиновой (С14) кислоты. Эта реакция протекает, по-видимому, через стадию образования пероксида флавинмононуклеотида: ФМН-Н2 + Е + О2 = Е-ФМН-Н2-ООН Е-ФМН-Н2-ООН + RCHO = RСОН-Е-ФМН-Н2-ООН RСОН-Е-ФМН-Н2-ООН = RCOOH + Е-ФМН-НОН* RCOOH + Е-ФМН-НОН* = RCOOH + Е + ФМН + Н20 + hν (490 нм). Здесь Е - люцифераза, ООН - гидроперекисная группа, RCOH - алифатический альдегид, RCOOH - жирная кислота, образующаяся при окислении альдегида. В последние годы получают все большее распространение биохимические анализы, в которых в качестве тест - объекта используют целые бактериальные клетки (в суспензии), экстракты светящихся бактерий, изолированный фермент люциферазу. Экворин (анг. Aequorin) — люминесцентный белок из медузы эквореи (Aequoreavictoria) и некоторых других морских организмов. Впервые выделен в 1961—1962 годах американскими учеными Джонсоном и Шимомурой. Состоит из белковой части (апопротеин) и простетической группы целентеразина (рис. 25). Люминесцирует в присутствии ионов кальция. Белковая молекула экворина состоит из 189 аминокислот, молекулярная масса - 22 кДа. Простетическая группа целентеразин (молекулярная масса 472 Да) относится к группе люциферинов. При связывании ионов кальция белком целентеразин окисляется до целентерамида и CO2 и переходит в возбуждѐнное состояние. При возвращении в релаксированное состояние испускается свет в синем диапазоне (длина волны 469 нм). Целентеразин + Ca2+ = Целентерамид* + CO2 = Целентеразин + hν (469 нм) Это свойство экворина используется в клеточной биологии для измерения концентрации ионов кальция в клетке, так как количество испускаемого света может быть измерено с помощью люминометра. 34 А Б В Рис. 25. А – Медуза экворея (Aequoreavictoria), Б – Структура белка экворина, В – Структура целекнтеразина § 15. Безизлучательные механизмы межмолекулярной миграции энергии: индуктивно-резонансный, экситонный, обменно-резонансный. Участие белков в метаболических процессах и механизмы их функциональной активности всегда связаны с изменением электронного состояния. Именно этот фактор индуцирует в белке определенные конформациюнные переходы, направленные к достижению нового равновесия с минимумом конформационной энергии, которое соответствует измененному электронному состоянию макромолекулы. Электронные переходы в биополимерах имеют самостоятельное значение в целом ряде важнейших биологических 35 процессов. Особую роль играют миграция энергии электронного возбуждения и транспорт электронов в биологических «структурах. Под миграцией энергии понимается безызлучательный обмен энергией между электронно-возбужденной молекулой (донором) и молекулой в основном состоянии (акцептором) (20): М* + М2 → М1 + М2* (20) Миграция энергии — чисто физический процесс, не сопровождающийся химическим изменением вещества. Она может происходить как между одинаковыми (М → М), так и между разными (Mi → М2) молекулами в направлении от более высокого к более низкому или одинаковому энергетическому уровню. Известно несколько механизмов миграции энергии: 1. Индуктивно-резонансный. 2. Экситонный. 3. Обменно-резонансный. Индуктивно-резонансный. Индуктивно-резонансный механизм передачи энергии осуществляется при слабых энергиях взаимодействия между молекулами (Евз = 10-3 эВ). Время миграции энергии τм>> 10-12 с, т. е. превышает время тепловой деградации энергии по колебательным подуровням. Расстояния переноса энергии 20 - 50 А0. Рис. 26 Схема миграции энергии при индуктивно-резонансном механизме. Перенос энергии происходит за счѐт кулоновских взаимодействий в молекулах донора и акцептора (рис. 26). Во время существования возбужденного состояния молекулы донора* генерируется переменное электромагнитное поле за счет осцилляции заряда электрона. Это поле взаимодействует с электроном в 36 невозбужденной молекуле акцептора. Если частота переменного поля донора* совпадает с частотой перехода электрона в акцепторе на возбужденный уровень, то происходит перенос энергии. При этом молекула донора* возвращается в основное, а молекула акцептора переходит в возбужденное состояние. Никакого высвечивания кванта света молекулой донора*и перепоглощения его молекулой акцептора не происходит. Классический аналог индуктивно-резонансного механизма миграции – два связанных верѐвкой маятника. Энергия колебаний одного из них передаѐтся механическим путѐм другому, который начинает колебаться, а колебания первого затухают (рис. 27). Рис. 27 Механический аналог индуктивно-резонансного механизма Обменно-резонансный. На более коротких расстояниях порядка 1-3 А0длины химической связи электронные орбитали донора и акцептора могут перекрываться. Такой перенос возбуждения осуществляется по обменно-резонансному пути, при котором происходит обмен электронами и «электронными» состояниями. В фотосинтетических мембранах обменно-резонансная передача происходит от хлорофилла в состоянии S1 на более низкий триплетный уровень каротиноидов. Экситонный Возбуждение, попавшее в молекулу донора, может перейти в соседнюю молекулу акцептора раньше, чем успеет произойти релаксация на нижние колебательные уровни состояния S1 молекулы донора. При экситонном переносе энергии возбуждение «бежит» по верхним 37 колебательным уровням взаимодействующих молекул, не успевая локализоваться на каждой из них в отдельности (рис. 19). Время миграции τм<< 10-12 с. Рис. 28 Схема экситонного механизма миграции энергии. Возбуждением одновременно охвачено несколько сот молекул, и оно носит коллективный характер. Такой тип миграции называется экситонным, а сама область возбуждения,включающая большое число молекул, -экситоном. В фотосинтетических мембранах экситонный механизм имеет место при энергии миграции впределах группы однородных молекул пигмента, фиксированных на одном и том же белковом носителе. § 16 Фотоинформационные процессы. Биофизика зрительного восприятия В сетчатке глаза позвоночных содержатся два типа фоторецепторных клеток: палочки и колбочки. Палочки чувствительны к свету, а колбочки чувствительны за восприятие цвета. На рисунке 29 схематически изображена одна из фоторецепторных клеток, палочка. Клетка состоит из двух основных частей, наружного и внутреннего сегментов. 38 Рис. 29 Строение палочки (Кольман Я., Рѐм К., 2000) В дисках наружного сегмента (специализированных замкнутых мембранах) локализован родопсин, интегральный мембранный белок, включающий 7 трансмембранных тяжей. Такое строение характерно для большой группы сигналпереносящих рецепторных белков (рис. 30). Рис. 30 Строение родопсина (Lehninger - David L. Nelson., Michael M. Cox., 2004) Родопсин белковой является части, опсина, светочувствительным молекула родопсина 39 хромопротеином. включает остаток Помимо 11-цис- ретиналя, ковалентно-связанного с ε-аминогруппой остатка лизина (рис. 31). Родопсин обладает характерным спектром поглощения света с максимумом при 500 нм. Рис. 31 Изомеризация 11-цис-ретиналя (Кольман Я., Рѐм К., 2000) Поглощение молекулой кванта света индуцирует изомеризацию 11-цисретиналя в полностью транс-форму. В результате изменяется геометрия ретиналя, а спустя 10 мс происходит аллостерический переход родопсина в его активную форму. Стимуляция родопсином* G-белка запускает каскад передачи сигнала, который побуждает зрительную клетку уменьшить выброс нейромедиатора (глутамата), вследствие чего биполярные нейроны, связанные со зрительными клетками, посылают измененный импульс, что воспринимается как зрительное возбуждение. § 17 Сигнальный каскад G-белок палочек носит название трансдуцин. Связывание активированного светом родопсина (метародопсина II) с ГДФ-трансдуцином катализирует обмен ГДФ (GDP) на ГТФ (GTP). Активная форма трансдуцина (ГТФ-трансдуцин) 40 диссоциирует на комплекс β, γ-субъединиц и ГТФ-α*-субъединицу, которая активирует цГМФ-фосфодиэстеразу (сGΜΡ - фосфодиэстеразу), связывая ингибиторную субъединицу фермента (рис. 32). Рис. 32 Схема зрительного сигнального каскада (Кольман Я., Рѐм К., 2000) В отсутствие света концентрация цГМФ (cGMP) в колбочках поддерживается на сравнительно высоком уровне (70 мкМ). Этот вторичный мессенджер постоянно синтезируется гуанилатциклазой (2) и гидролизуется цГМФ- фосфодиэстеразой (1). Активация фосфодиэстеразы (при освещении родопсина) вызывает быстрое (в течение нескольких мс) падение уровня цГМФ. Спустя короткое время α-субьединица трансдуцина инактивируется за счет медленного гидролиза связанного ГТФ и ассоциирует с комплексом β, γсубъединиц. Родопсин* распадается на опсин и полностью транс-ретиналь, 41 который изомеризуется в цис-ретиналь под действием ретинальизомеразы (3). После сборки родопсина молекула возвращается в исходное состояние. Источником ретиналя является ретинол витамина А, который образуется под действием фермента ретинолдегидрогеназы (4). § 18 Изменения поляризации мембран зрительных рецепторов при поглощении квантов. Механизмы усиления. Рис. 33 Механизм зрительного восприятия (Кольман Я., Рѐм К., 2000) В темноте высокий уровень цГМФ в При освещении уровень цГМФ резко палочках падает поддерживается благодаря за счѐт активности гуанилатциклазы. Поэтому фосфолиэстеразы, цГМФ-зависимые катионные каналы перекрыванию ионных каналов. Так плазматической как ионы Na+ мембраны остаются что активации приводит к и Ca++ постоянно открытыми и катионы Na+ и Ca++ выкачиваются из клетки, концентрация беспрепятственно поступают в клетку. их быстро падает. Это приводит к При этом зрительная клетка постоянно гиперполяризации выбрасывает глутамат (рис. 33) клетки нейромедиатор останавливает в синаптическую щель и выброс нейромедиатора. Снижение концентрации ионов Ca++ инициирует активацию гуанилатциклазы, что влечѐт за собой быстрый подъѐм уровня цГМФ настолько, что ионные каналы открываются вновь (рис. 33). 42 § 19 Бактериородопсин. Фотохимические реакции бактериородопсина. Перенос протона через пурпурную мембрану галофильных бактерий Бактериородопсины — семейство мембранных светочувствительных белков археот (галобактерий). Впервые данные хромопротеиды были выделены В. Стоккениусоми Д. Остерхельтом halobiumв 1971 году. из галофильных бактерий Halobacterium Бактериородопсин выполняет роль светозависимого протонного насоса, создающего градиент ионов водорода, энергия которых используется для синтеза АТФ (рис 34, 35). Рис. 34 Схематическое изображение бактериородопсина. Путь протона показан прямыми стрелками. Изогнутая стрелка показывает направление изгиба спирали F в ходе фотохимического цикла. (Lehninger - David L. Nelson., Michael M. Cox., 2004) Трансмембранная часть бактериородопсина сложена из 7 регулярных αспиралей, идущих от одного до другого края мембраны, а одинокая β-шпилька и все нерегулярные участки цепи (соединяющие спирали-петли) выходят из мембраны. Сидящие на α-спиралях гидрофобные группы обращенны «наружу» к липидам мембраны. Полярные группы обращены внутрь очень узкого канала, по которому проходит протон. Протонная 43 проводимость осуществляется при содействии прикрепленной внутри пучка спиралей молекулы кофактора ретиналя. Он перекрывает центральный канал бактериородопсина. Поглотив фотон, ретиналь переходит из полностью-транс в 13-цис форму. При этом он изгибается и переносит протон с одного конца семиспирального пучка на другой, после чего ретиналь разгибается и возвращается назад, но уже без протона. Таким образом на наружной поверхности мембраны бактерии скапливается положительный заряд, а на внутренней поверхности отрицательный. В мембрану встроена АТФ-синтетаза, направленная своей F1 субъединицей в цитоплазму бактерии. Протоны, проходя сквозь канал субединицы F0 вызывают вращение субъединицы F1 и синтез АТФ (рис. 35) Рис. 35 Светозависимый синтез АТФ в клетках H. Halobium (Овчинников Ю. А., 1987) 44 § 20. Фотодеструктивные процессы. Фотохимические превращения биополимеров и биомембран. Действие УФ-излучения на белковые системы. Фотохимические реакции белков – совокупность фотохимических реакций, приводящих к различным повреждениям белковых молекул и их возможной инактивации. Основными хромофорами белков являются остатки ароматических аминокислот, главным образом триптофана, тирозина и фенилаланина. Эти аминокислоты совместно с цистином ответственны за функционально-активное поглощение квантов света макромолекулами белков. Таким образом при воздействии УФ - излучения на уровне белков происходят следующие процессы: 1. Фотоионизация ароматических аминокислот с образованием катионрадикала (рис. 36) и сольватированного электрона (21). При распаде катион-радикала возникает нейтральный радикал (2). АН + hν = АН* = AH+. + esolv (21) AH+. = A. + H+ Рис. 36 Свободные радикалы ароматических аминокислот 2. Фотолиз цистина с разрывом S-S связей и возникновение радикала цистеина (рис. 37). Рис. 37 Фотолиз цистина 45 Действие УФ-излучения на нуклеиновые кислоты. Фотохимические реакции нуклеиновых кислот – совокупность фотохимических реакций, приводящих к их различным повреждениям, прежде всего ДНК. При воздействии УФ - излучения на уровне белков происходят следующие процессы: 1. Образование фотодимеров тимина, урацила, цитозина и смешанных димеров. Сущность реакции фотодимеризации состоит в разрыве 5,6двойной связи у обеих вступающих во взаимодействие молекул тимина и образовании циклобутанового кольца (рис. 38). Как прямая, так и обратная реакции имеют фотохимическую природу и не требуют термической активации. Рис. 38 Фотодимеризация тимина Фотодимеризация урацила происходит при УФ-облучении урацила или его производных в замороженных и водных растворах урацилсодержащих динуклеотидов, РНК вируса табачной мозаики, транспортной и рибосомной РНК (рис. 39). Рис. 39 Фотодимеризация урацила Фотодимеры цитозина обнаружены после УФ-облучения цитозина, цитидилцитидина, ДНК. Фотодимеры цитозина 46 неустойчивы в темноте и могут мономеризоваться в димеры урацила через стадию образования смешанного димера Ц-У (рис. 40). Рис. 40 Фотодимеризация цитозина 2. Реакция гидратации урацила и цитозина. Протекает под действием УФ-света в области 260-270 нм.Фотогидраты образуются в растворах урацила и цитозина, их ди- и полинуклеотидах, нуклеозидах, РНК и ДНК. Сущность реакции фотогидратации заключается в присоединении молекулы воды к пиримидиновому кольцу у 5,6 двойной связи с еѐ разрывом (рис. 41). Эта реакция фотонеобратима: гидраты разрушаются в темноте при повышении температуры образцов, при сдвигах рН образцов, при возрастании ионной силы раствора. Рис. 41 Реакция гидратации урацила и цитозина. 47 3. Разрывы полинуклеотидной цепи ДНК. Выявляются при воздействии больших доз УФ-излучения с квантовым выходом порядка 10 -5 – 10-6. Разрывы сахарофосфатного остова ДНК в результате УФ-облучения можно наблюдать под электронным микроскопом. 4. Образование внутримолекулярных ковалентных сшивок между двумя комплементарными цепями ДНК в растворе. 5. Фотоденатурация ДНК. Процесс является следствием разрушения кооперативной системы слабых нековалентных связей (водородных и гидрофобных) и частичным (локальным) или полным нарушением еѐ двуспиральной структуры (рис. 42). Рис. 42 Фотоденатурация ДНК. 6. Индукция сшивок нуклеиновая кислота-белок в составе РНП и ДНП. Аминокислоты белков (гистонов) через SH- и OH-группы присоединяются к пятому (или шестому) углеродному атому азотистого основания ДНК (тимина). Действие УФ-излучения на липиды и биологические мембраны. 1. Пероксидное фотоокисление липидов – основная реакция превращения молекул липидов под влиянием УФ-излучения. УФокисление липидов происходит по механизму (рис. 43). 48 цепному, свободнорадикальному Рис. 43 Пероксидное фотоокисление липидов R* - первичный свободный радикал, RO2* - пероксидный радикал, ROOH – пероксид жирных кислот 2. Гидропероксиды претерпевают дальнейшие превращения с образованием ряда стабильных продуктов окисления (альдегидов и кетонов, и в частности малонового диальдегида (МДА)). 3. Повышение проницаемости биомембран для различных веществ, и прежде всего для ионов. Д. И. Рощупкиным в 1980 году была предложена схема процессов, приводящих к повреждению мембранных структурживотной клетки под действием УФ-излучения (рис. 44). Рис. 44 Схема молекулярного механизма повреждения мембранных структур животной клетки под действием УФ-света (НЖК* - ненасыщенные жирные кислоты) (по Д. И. Рощупкину) 49 Вопросы и задания по курсу 1. Что изучают квантовая биофизика и биофизика фотобиологических процессов? 2. Назовите области практического использования идей и методов квантовой биофизики. 3. Проанализируйте отдельные стадии фотобиологического процесса. 4. Назовите условия, необходимые для того, чтобы произошло светопоглощение в биосистеме. 5. Охарактеризуйте спектры светопропускания и светопоглощения: их применение для количественного и качественного анализов биосистем. 6. Назовите типы электронных переходов, обусловливающих спектр поглощения вещества в видимой и УФ-областях. 7. Сравните спектры поглощения гемоглобина и сывороточного альбумина. 8. Назовите хромофорные группы молекул белков, нуклеиновых кислот, липидов, хлорофилла, родопсина, ароматических аминокислот. 9. Вследствие какого типа электронного перехода возникает полоса поглощения полипептидов и белков при 190 нм? 10. Объясните происхождение спектров поглощения НАД и НАДН. 11. Проанализируйте пути дезактивации электронно-возбужденного состояния биомолекул. 12. Как измеряют спектры люминесценции и спектры возбуждения люминесценции биообъектов? Какую информацию можно получить при их анализе? 13. Каковы квантовые выходы флуоресценции и фосфоресценции? 14. Что понимают под эффективностью хемилюминесценции? 15. Биолюминесценция как частный случай хемилюминесценции: система люциферин - люцифераза, механизм взаимодействия между ними. 16. Миграция энергии — это чисто физический процесс или она сопровождается химическими изменениями вещества? 17. Назовите особенности индуктивно-резонансного, экситонного, резонансного путей миграции энергии. Приведите примеры. 18. Что понимают под спектром действия фотобиологического процесса? 50 обменно- 19. Какова роль фотохимических процессов для поддержания жизни на Земле? 20. Дайте классификацию фотобиологических реакций. 21. Применение фотохимии в медицине. 22. В чем особенности УФ-излучения как физического агента и биологического фактора? 23. Дайте спектральную характеристику основных биологических эффектов УФизлучения. 24. Докажите, что наибольшую роль в фотоинактивации белков играют остатки серосодержащих и ароматических аминокислот. 25. Напишите структурную формулу свободного радикала, образующегося при фотолизе молекул цистина. 26. Влияет ли конформация белковых молекул на их УФ-чувствительность? 27. Проанализируйте закономерности и особенности фотохимических превращений гемопротеидов. 28. Перечислите основные типы фотохимических реакций, приводящих к различным повреждениям нуклеиновых кислот. 29. Напишите уравнения реакции фотодимеризации молекул тимина. 30. Является ли реакция фотодимеризации урацила фотохимически обратимой? 31. Напишите уравнения реакции фотогидратации урацила и цитозина. 32. Опишите отдельные стадии процесса образования стабильных продуктов фотоокисления липидов. 33. Какова роль липидов в процессах УФ-модификации биомембран? 34. Опишите схему процессов, приводящих к повреждению мембранных структур животной клетки под действием УФ-излучения (по Д.И. Рощупкину). 51 Список литературы Основная 1. Конев С. В., Волотовский. Фотобиология. И. Д. Минск.- Изд-во БГУ.-1979.- с. 384. 2. Артюхов В. Г. Биофизика: Учебник для вузов М.: Академический проспект; Екатеринбург: Деловая книга, 2009.- 294 с. – (Фундаментальный учебник) 3. Самойлов В. О. Медицинская биофизика: учебник для вузов - 2-е изд., испр. и доп.- СПб.: Спец Лит, 2007.-2007.-560 с.: ил. 4. Рубин А.Б. Биофизика, книга 2. Учебное пособие для вузов. Москва: "Высшая школа", 1987., 365 с. Дополнительная 1. Lehninger - David L. Nelson., Michael M. Cox. Principles of biochemistry. 2004 2. Артюхов В.Г. Гемопротеиды: закономерности фотохимических превращений в условиях различного микроокружения. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1995. 280 с. 3. Артюхов В.Г., Бутурлакин М.С., Шмелев В.П. Оптические методы исследования биологических систем и объектов. Воронеж, 1980. 116 с. 4. Артюхов В.Г., Путинцева О.В. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем агентами: Учеб. пособие. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1996. 240 с. 5. Бурштейн Э. А. Люминесценция белковых хромофоров (модельные исследования) // Итоги науки и техники. Биофизика. М., 1976. Т. 6. 213 с. 6. Владимиров Ю. А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Высшая школа, 1989. 199 с. 7. Владимиров Ю. А., Рощупкин Д.И., Потапенко А.Я., Деев А.И. Биофизика. М.: Медицина, 1983. 272 с. 8. Кольман Я., Рѐм. Наглядная биохимия: пер. с нем. К.-Г..-М.: Мир, 2000.-469 с. 9. Кудряшова Н. С., Кратасюк В. А., Есимбекова Е. Н. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа: Учеб. пособие. Красноярск: Изд-во КГУ, 2000. 154 с. 52 10. Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия.- М.: Просвещение, 1987.-815 с.: илл. 11. Пермяков Е. А. Метод собственной люминесценции белка. М.: Наука, 2003. 189 с. 12. Рощупкин Д. И., Фесенко Е.Е., Новоселов В.И. Биофизика органов: Учеб. пособие. М.: Наука, 2000. 255 с. 13. Рощупкин Д. И., Фесенко Е.Е., Новоселов В.И. Биофизика органов: Учеб. пособие. М.: Наука, 2000. 255 с. 14. Рощупкин Д. И. Молекулярные механизмы повреждения мембран, липидов и белков под действием ультрафиолетового излучения: Дис.... докт. биол. наук. М., 1980. 524 с. 15. Рощупкин Д. И., Артюхов В. Г. Основы фотобиофизики: Учеб. пособие. Воронеж: Изд- во ВГУ, 1997. 116 с. 16. Рощупкин Д. И., Артюхов В. Г. Основы фотобиофизики: Учеб. пособие. Воронеж: Изд- во ВГУ, 1997. 116 с. 17. Рубин А. Б. Биофизика. Т. 2. Биофизика клеточных процессов. М.: Изд-во МГУ, 2005. 480 с. 18. Самойлова К. А. Сравнительный анализ действия на клетки нефотосинтезирующих организмов ультрафиолетового излучения различных областей спектра: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. Л., 1979. 52 с. 19. Сахаров В. Н. Действие коротковолнового ультрафиолетового излучения на клеточные структуры и их функции: экспериментальный анализ методом микрооблучения: Автореф. дис. докт. биол. наук. М., 1988. 39 с. 20. Уэйн Р. Основы и применения фотохимии. М.: Мир, 1991. 304 с. 21. Фотобиология и мембранная биофизика / Под ред. И.Д. Волотовского. Минск: Технопроект, 1999. 255 с 53
