ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ БИОХИМИЧЕСКИХ

Естественные науки
УДК 579.2:519.2
Турская А.Л.1,2, Букин Ю.С.3, Степанов А.В.1, Маркова Ю.А.1, Верхотуров В.В.2
1
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
2
Иркутский государственный технический университет
3
Лимнологический институт СО РАН
Email: turskayaanna@mail.ru
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
В РАСТЕНИЯХ С ПОМОЩЬЮ СРЕДЫ ПРОГРАММИРОВАНИЯ R
В статье показана возможность использования среды программирования R для изучения об6
разования защитных соединений в растениях при бактериальном заражении. С помощью статис6
тического критерия Шапиро6Уилка и методов однофакторного дисперсионного и регрессионного
анализа было достоверно подтверждено влияние длительности заражения микроорганизмом
Escherichia coli проростков редиса на интенсивность генерации активных форм кислорода.
Ключевые слова: среда программирования R, биометрия, фитоиммунитет, активные фор6
мы кислорода, Escherichia coli.
Введение
В основе ответных реакций растительной
клетки на внедрение микроорганизма лежит
сложная сеть биохимических процессов. В ре#
зультате таких процессов меняется активность
ряда ферментов, происходит накопление защит#
ных соединений. Изменения всех этих перемен#
ных величин во времени и пространстве состав#
ляют кинетику биологических процессов, кото#
рую сложно оценить стандартными статисти#
ческими методами. Подобного рода задачи успеш#
но решаются в среде программирования R. Сре#
да R позволяет проводить как первичный ана#
лиз данных (таблицы, графики), так и матема#
тическую статистику со всеми приложениями.
R является свободно распространяемым
программным обеспечением, которое достаточ#
но просто устанавливается под Windows, Mac
OS X, Linux, базовая комплектация R занимает
немного места на жестком диске и включает в
себя все функции, необходимые для статистичес#
кого анализа; для более серьезной работы всегда
можно дополнительно установить вспомогатель#
ные пакеты с необходимыми функциями [3].
Актуальность изучения ответных реак#
ций растений на бактериальное заражение
обусловлена растущим количеством заболе#
ваний, вызываемых условно#патогенными
микроорганизмами и, следовательно, необхо#
димостью установления закономерностей
циркуляции в окружающей среде, а также
выявления новых источников заражения че#
ловека. Многими исследованиями показано,
что в природных условиях энтеробактерии
способны колонизировать различные ткани
и органы растений, сохраняться в них дли#
114
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
тельное время, что представляет серьезную
угрозу возникновения кишечных заболеваний
человека при употреблении в пищу свежих
растений или их плодов [1, 11, 14].
Продукция активных форм кислорода
(АФК) является одним из первых событий в
защитном ответе растений на вторжение мик#
роорганизма, они играют роль сигнальных мо#
лекул, а также служат защитными соединения#
ми в стрессовых условиях [10, 12]. Время воз#
никновения реакции образования АФК может
колебаться от нескольких минут до часов, но,
как правило, наблюдаются ранний и более по#
здний окислительный «взрыв» [6].
Для проводимого исследования была по#
ставлена следующая цель: с помощью статис#
тического анализа выявить закономерности, по
которым менялась концентрация АФК с тече#
нием времени в корнях проростков редиса
(Raphanus sativus L.) при заражении их кишеч#
ной палочкой Escherichia coli. Для достижения
цели были сформулированы следующие зада#
чи: выбор статистических методов и анализ с их
помощью искомой зависимости; выбор методов
и их реализация для графической визуализа#
ции искомой зависимости.
Материалы и методы
1. Экспериментальные данные по динами#
ке измерения концентрации активных форм
кислорода
E. сoli – важнейший модельный микроор#
ганизм, условный патоген человека и животных,
относящийся к группе возбудителей кишечных
инфекций. Для статистического анализа были
взяты данные по измерению концентрации
Турская А.Л. и др.
Исследование закономерностей биохимических процессов...
АФК в корнях проростков редиса при зараже#
нии их E. сoli.
Измерения концентрации АФК проводи#
ли в динамике времени, в течение 5 часов. Через
определенные промежутки времени после ино#
куляции (5, 15, 30, 60, 180, 360 минут) определя#
ли интенсивность образования АФК с помо#
щью флуоресцентного красителя DCF#DA
(2’,7’#дихлорофлуоресцеин диацетат) в концен#
трации 1 мкМ. DCF#DA широко используется
как маркер внутриклеточных оксидантов в жи#
вотных и растительных тканях [13]. DCF#DA,
проникая в клетки, гидролизуется внутрикле#
точными эстеразами с выделением DCF. В ре#
акции с перекисью водорода или гидроперок#
сидами образуется DCF#производное соедине#
ние, которое может обнаруживаться флуорес#
ценцией при длине волны возбуждения и испус#
кания 480 и 530 нм соответственно.
На рисунке 1 представлены изображения
корня редиса, полученные с помощью эпифлу#
оресцентного микроскопа Axio Observer Z1 (Carl
Zeiss, Германия). Светящиеся участки показы#
вают интенсивность образования АФК в клет#
ках корня. Обработка и анализ изображений
проводились в программе Axio Vision, где со#
держание АФК выражали в условных едини#
цах флуоресценции.
2. Первичная обработка и подготовка дан#
ных для расчетов с помощью языка програм#
мирования R
Данные, полученные в ходе экспериментов,
сохранялись в электронных таблицах Microsoft
Excel. Массив данных формировался в виде трех
колонок. В первую колонку заносился номер из#
мерения, во вторую колонку заносилось время
(в минутах), прошедшее после заражения, при
котором проводилось измерение показателей
концентрации АФК, в третью колонку заноси#
лось значение измеренного показателя концент#
рации АФК. Результаты контрольных опытов
были занесены в таблицу с показателем времени
0 минут, прошедших с момента заражения.
После формирования массива данных в
программе Microsoft Excel, он был сохранен в
формате .csv с разделителями запятая между
столбцами. Формат данных csv может быть про#
читан стандартными функциями языка про#
граммирования R. Для чтения данных в фор#
мате csv служит функция:
>data<#read.csv(file="C://Rrab//my_data/
/data.csv")[7].
В качестве аргументов этой функции выс#
тупает переменная file, которая хранит в себе
строку с полным именем файла, содержащего
данные в формате csv. Данные считываются в
переменную (в примере это переменная data)
типа фрейм. Фреймы в языке программирова#
ния R представляют собой сложные структу#
ры, содержащие в себе несколько векторов (мас#
сивов данных) одинаковой размерности. Име#
на внутренних векторов фрейма соответству#
ют названиям столбцов в файле формата csv
[9]. Например, в нашем случае, столбец со вре#
менем, прошедшим после заражения, был обо#
значен как time. Обратиться к этому столбцу
как к вектору в фрейме data можно с помощью
конструкции data$time, а к конкретному элемен#
ту вектора (например к 10) по его индексу
data$time [10]. Столбец с показателями концен#
трации АФК был обозначен как afk. Обратить#
ся к этому столбцу как к вектору во фрейме мож#
но с помощью конструкции data$afk. В случае
рассматриваемого массива данных вектор
data$time выступал в качестве фактора, опре#
деляющего принадлежность конкретного изме#
ренного показателя концентрации АФК опре#
деленному времени, прошедшему с момента за#
Рисунок 1. Корни проростков редиса, окрашенные флуоресцентным красителем DCF#DA. Через 1 час после
заражения E. coli (слева); незараженные корни, контроль (справа). Масштабный отрезок – 200 мкм.
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
115
Естественные науки
ражения корней проростков редиса кишечной
палочкой.
3. Методы, используемые для статистичес#
кой обработки данных
Критерий Шапиро#Уилка
Данный критерий проверяет гипотезу H0 –
исследуемая выборка распределена по нормаль#
ному закону [2]. В языке программирования R
критерий реализован в виде функции: >
shapiro.test(x), где x – вектор, содержащий зна#
чения проверяемой выборки [8].
Однофакторный дисперсионный анализ с
помощью непараметрического критерия Крас#
кела#Уоллиса
Данный критерий проверяет гипотезу H0 –
выбранные градации фактора не влияют на сред#
ние значения в сравниваемых выборках [4]. В язы#
ке программирования R критерий реализован в
виде функции: >kruskal.test(x~fac), где x – вектор,
содержащий массив данных, fac – переменная типа
фактор, указывающая принадлежность измере#
ния определенной градации фактора [7].
Критерий Вилкоксона#Манна#Уитни
С помощью данного критерия можно срав#
нить две выборки на предмет равенства их сред#
них значений [4]. Гипотеза H0 – средние значе#
ния двух выборок достоверно не различаются.
В качестве альтернативных гипотез могут выс#
тупать следующие предположения H1 – сред#
ние значения в выборках достоверно отличают#
ся, H2 – среднее значение в первой выборке
больше, чем во второй выборке и H3 – среднее
значение в первой выборке меньше чем, во вто#
рой выборке. В языке программирования R кри#
терий реализован в виде функции: >
wilcox.test(x,y,alternative ="greater"), где x – век#
тор, содержащий массив данных первой выбор#
ки, y – вектор, содержащий массив данных вто#
рой выборки, alternative – параметр, задающий
альтернативную гипотезу [7].
Оценка параметров регрессии методом
наименьших квадратов
Для оценки параметров регрессионной за#
висимости с помощью метода наименьших квад#
ратов в языке программирования R существует
функция: > nls(y ~ a * x^2+b*x+c, Data, start =
list(a=1,b=1,c=1)), где y ~ a * x^2+b*x+c – пред#
полагаемая зависимость для регрессионного
анализа между зависимой и независимой пере#
менной, Data – переменная типа фрейм, содер#
жащая экспериментальные значения независи#
116
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
мой переменной x и соответствующие значения
зависимой переменной y, start – список, содер#
жащий начальные значения для параметров
регрессионной функции [9].
F критерий Фишера
Использовался в работе для тестирования
гипотезы H0 – кривая с выбранными парамет#
рами при регрессионном анализе способна
адекватно отразить наблюдаемую эксперимен#
тальную зависимость между рядами данных
[5]. В языке программирования R критерий ре#
ализован в виде функции: > var.test(yr,yp), где
yr – наблюдаемые значения зависимой пере#
менной, yp – ожидаемые (рассчитанные с по#
мощью регрессионной функции) значения за#
висимой переменной [3].
4. Методы графической визуализации ре#
зультатов
Для визуализации распределения величин
в выборках первичных данных использовался
метод боксплотов (ящик с усами). В языке про#
граммирования R графическая функция боксп#
лот имеет следующий вид: > boxplot(x~fac), где
x – вектор, содержащий массив данных, fac –
переменная типа фактор, указывающая при#
надлежность измерения определенной града#
ции фактора [7].
Построение графика распределения на
плоскости точек, отражающих зависимость
средних показателей концентрации АФК от
времени, прошедшего с момента заражения
кишечной палочкой, осуществлялось с помо#
щью следующей функции: > plot(x~t), где x –
вектор, содержащий средние значения пока#
зателей АФК, t – вектор, содержащий момен#
ты времени, соответствующие значению век#
тора x.
Визуализация кривой, отражающей рег#
рессионную зависимость на графике распреде#
ления на плоскости точек, показывающих за#
висимость средних показателей концентрации
АФК от времени, прошедшего с момента зара#
жения кишечной палочкой, осуществлялось с
помощью следующей функции: > lines(x,t), где
x – вектор, содержащий рассчитанные с помо#
щью регрессионной зависимости средние пока#
зателей концентрации АФК, t – вектор, содер#
жащий временные точки, прошедшие с момен#
та заражения бактериальной культурой, в ко#
торые производился расчет средних показате#
лей концентрации АФК.
Турская А.Л. и др.
Исследование закономерностей биохимических процессов...
Результаты и обсуждение
1.Проверка исходных данных на предмет со#
ответствия закону нормального распределения
При проверке выборок на предмет соответ#
ствия нормальному закону распределения с по#
мощью критерия Шапиро#Уилка были полу#
чены вероятности принятия нулевой гипотезы,
представленные в таблице 1.
Нулевая гипотеза соответствия выборки
закону нормального распределения отверга#
лась при вероятности ее меньше, чем 0,1. Из таб#
лицы 1 видно, что при времени, прошедшем с
момента заражения t=0 и t=360, нулевая гипо#
теза о соответствии выборок закону нормаль#
ного распределении, не может быть принята. Из
этого следует, что для дальнейшего статисти#
ческого анализа необходимо использовать не#
параметрические статистические критерии.
2.Однофакторный дисперсионный анализ
выборок
Перед проведением однофакторного дис#
персионного анализа массив данных был визу#
ализирован в виде боксплотов (рис. 2). На ри#
сунке видно, что медианы выборок показателей
концентраций АФК, полученных при разном
времени с момента заражения, различаются
между собой. Максимальное различие достига#
ет 100 процентов.
При использовании критерия Краскела#
Уоллиса вероятность принятия нулевой гипо#
тезы об отсутствии достоверных различий меж#
ду средними значениями выборок оказалась
равной 0,049, что существенно меньше вероят#
ностного порога 0,1. Это означает, что между
выборками существуют достоверные различия
по их средним значениям. Следовательно, на#
блюдаемые различия между выборками, полу#
ченными при различных периодах времени,
прошедших с момента заражения носят законо#
мерный (неслучайный) характер.
На рисунке 2 видно, что уже через 5 минут
воздействия бактерии E. coli уровень АФК в
корнях проростков редиса достоверно повыша#
ется по сравнению с контрольным вариантом.
Максимальное содержание АФК наблюдается
через 3 часа после инокуляции, а к 5 часам пока#
затель стрессового ответа значительно снижа#
ется. Это согласуется с литературными данны#
ми о характере «всплеска» уровня АФК у рас#
тений при биотическом стрессе; первый пик яв#
ляется неспецифическим и возникает в первые
минуты после взаимодействия растения с мик#
роорганизмом, что наблюдается в нашем слу#
чае, а второй связан со специфическим узнава#
нием партнеров [6].
3. Попарное сравнение средних значений в
выборках
Результаты попарного сравнения выборок
на предмет равенства средних значений с помо#
щью критерия Вилкоксона#Манна#Уитни
представлены в таблице 2. Из таблицы видно,
что нулевая гипотеза об отсутствии достовер#
ных различий между средними значениями мо#
жет быть принята при уровне ее достоверности
больше, чем 0,1 только при сравнении выборок,
соответствующих моментам времени 5, 15 и 360
и моментам времени 30, 60 и 180, прошедших с
момента заражения. При попарном сравнении
выборок, соответствующих моментам времени
5#30, 5#60, 5#180, 15#30, 15#60, 15#360, 30#360, 60#
360 были получены достоверные различия по
средним показателям концентрации АФК.
Рисунок 2. Зависимость концентрации АФК
в корнях проростков редиса от времени заражения
бактерией E. coli
Таблица 1. Значения вероятностей принятия нулевой гипотезы H0 соответствия выборок
показателей концентрации АФК закону нормального распределения
Âðåìÿ ïîñëå çàðàæåíèÿ, ìèí
p-value
t0
0,08014
t5
0,4487
t 15
0,1896
t 30
0,8036
t 60
0,9647
t 180
0,4005
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
t 360
0,05
117
Естественные науки
С помощью критерия Вилкоксона#Манна#
Уитни была оценена вероятность принятия ну#
левой гипотезы (отсутствие достоверных раз#
личий между выборками) против вероятности
принятия альтернативной гипотезы о том, что
среднее значение в первой сравниваемой выбор#
ке больше, чем во второй сравниваемой выбор#
ке. Результаты данного сравнения представле#
ны в таблице 3.
Таким образом, использование критерия
Вилкоксона#Манна#Уитни позволяет сделать
вывод о том, что средние значения показателей
концентрация АФК в моменты времени 30, 60 и
180 минут, прошедших с момента заражения
достоверно больше показателей концентрации
АФК в моменты времени 5, 15 и 360 минут, про#
шедших с момента заражения.
4. Регрессионный анализ
В качестве модели кривой для регрессион#
ного анализа была выбрана квадратичная за#
висимость, имеющая следующий общий вид:
y=ax^2+bx+c. Независимой переменной x вы#
ступает время, прошедшее с момента зараже#
ния бактериальной культурой, в качестве за#
висимой переменной y выступает средняя кон#
центрация АФК.
В процессе расчетов были получены следу#
ющие значения для коэффициентов регрессии:
a = #0,033±0,015; b = 5,6±2,17; c = 2130,94±252,27.
Исходные средние значения для выборок вмес#
те с линией тренда в виде квадратичной зави#
симости представлены на рисунке 3.
Дисперсии показателей концентрации
свободных радикалов для экспериментальных
значений составило σn = 543,52, дисперсия по#
казателей концентрации свободных радика#
лов, рассчитанных по квадратичной аппрок#
симации, составила σr = 399,95. Значение F
критерия Фишера для рассчитанных значений
дисперсии составило 0,5415, для этого значе#
ния критерия вероятность принятия нулевой
гипотезы об отсутствии достоверных значений
между дисперсиями составляет p#value =
0,4743. Полученное значение p#value > 0,1, что
означает принятие нулевой гипотезы. В на#
шем случае это говорит о том, что зависимость
между временем, прошедшим с момента зара#
жения, и средней концентрацией АФК может
быть достаточно точно приближена квадра#
тичной зависимостью с указанными значени#
ями параметров.
118
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
Таблица 2. Значения вероятностей принятия
гипотезы H0 об отсутствии достоверных различий
между средними значениями выборок показателей
концентрации АФК
t5
t 15
t 30
t 60
t 180
t5
0
t 15
0,7959
t 30
0,1051 0,2799
t 60
0,1051 0,2799 0,4813
t 180
0,0630 0,0892 0,5787 0,3527
t 360
0,2475 0,4813 0,0524 0,0355 0,0115
t 360
0,7959 0,1051 0,1051 0,0630 0,2475
0
0,2799 0,2799 0,0892 0,4813
0
0,4813 0,5787 0,0524
0
0,3527 0,0355
0
0,0115
0
Таблица 3. Матрица результатов оценки принятия
или отвержения нулевой гипотезы H0 об отсутствии
достоверных различий против альтернативной
гипотезы H1 – значения в первой выборке больше,
чем во второй выборке для показателей
концентрации АФК
t5
t 15
t 30
t 60
t 180
t 360
t5
0
>
>
>
<
>
t 15
>
0
>
>
<
>
t 30
>
>
0
>
>
<
t 60
>
>
>
0
>
<
t 180
<
<
>
>
0
<
t 360
>
>
<
<
<
0
Знак «>» в таблице означает принятие гипотезы H1, знак
«<» означает принятие гипотезы H0
Рисунок 3. Зависимость между временем,
прошедшим с момента заражения проростков редиса
бактериальной культурой, и концентрацией АФК,
выраженная в виде точек, соответствующих
реальным наблюдениям и регрессионной кривой
квадратичной функции. На графике приведено
полученное в ходе анализа данных уравнение
квадратичной зависимости
Турская А.Л. и др.
Исследование закономерностей биохимических процессов...
В результате проведенного статистическо
го анализа закономерностей изменения концен
трации АФК в корнях проростков редиса при
бактериальном заражении с помощью средств
языка программирования R выяснено, что уро
вень концентрации АФК в начальные момен
ты времени растет, затем достигает определен
ного максимума в точке 180 минут с момента
заражения, после чего начинает снижаться.
Максимальная концентрация АФК в опыте в
среднем в два раза превышала показания конт
роля (отсутствие заражения кишечной палоч
кой). Это согласуется с литературными данны
ми об активации неспецифического защитного
ответа растения сразу после взаимодействия с
чужеродным микроорганизмом посредством,
так называемых, образраспознающих рецепто
ров. В результате происходит окислительный
«взрыв» вследствие накопления активных
форм кислорода [8, 12].
6.10.2014
Список литературы:
1. Алексеенко А.Л. Особенности взаимодействия условнопатогенных энтеробактерий с растениями. Автореферат дис. на
соиск. уч. степ. канд. биол. наук. Иркутск. – 2010. 22 с.
2. Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика. – 1976. 598 с.
3. Зарядов И.С. Введение в статистический пакет R: типы переменных, структуры данных, чтение и запись информации,
графика. М.: Издво Российского университета дружбы народов. – 2010. 207 с.
4. Ивантер Э.В. Элементарная биометрия: учеб. пособие. Петрозаводск: Издво ПетрГУ. – 2010. 104 с.
5. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. – 1990. 352 с.
6. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода. Под ред. И.П. Ермакова. М.: КДУ. – 2007. 140 с.
7. Baayen R.H. Analyzing Linguistic Data. A Practical Introduction to Statistics Using R. UK: Cambridge University Press. – 2008.
369 pp.
8. Boller T.А., Felix G.A. Renaissance of Elicitors: Perception of MicrobeAssociated Molecular Patterns and Danger Signals by
PatternRecognition Receptors // Annual Review of Plant Biology. – 2009. – V.60. – Р. 379406.
9. Crawley M.J. The R Book. England: John Wiley and Sons Ltd. – 2007. 951 pp.
10. Daudi A., Cheng Z., O’Brien J. A. et al. The Apoplastic Oxidative Burst Peroxidase in Arabidopsis is a Major Component of
PatternTriggered Immunity // Plant Cell. – 2012. – V.24. – № 1. – Р. 275–287.
11. Kirzinger M.W., Nadarasah G., Stavrinides J. Insights into CrossKingdom Plant Pathogenic Bacteria // Genes. – 2011. – V.2. –
№ 4. – Р. 980–997.
12. O’Brien J. A., Daudi A., Finch P. et al. PeroxidaseDependent Apoplastic Oxidative Burst in Cultured Arabidopsis Cells
Functions in MAMPElicited Defense // Plant Physiology. – 2012. – V.158. – Р. 2013–2027.
13. RodriguezSerrano M., RomeroPuertas M.C., Zabalza A. et al. Cadmium effect on oxidative metabolism of pea (Pisum sativum L.)
roots. Imaging of reactive oxygen species and nitric oxide accumulation in vivo // Plant Cell Environ. – 2006. – V.29. – P. 1532–1544.
14. Tyler H.L., Triplett E.W. Plants as a Habitat for Beneficial and/or Human Pathogenic Bacterium // Annu. Rev. Phytopathol. –
2008. – V.46. – Р. 53–73.
Сведения об авторах:
Турская Анна Леонидовна, научный сотрудник лаборатории фитоиммунологии
Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН,
магистрант Института кибернетики им. Е.И. Попова Иркутского государственного технического
университета, кандидат биологических наук, email: turskayaanna@mail.ru
Степанов Алексей Владимирович, научный сотрудник лаборатории физиологической генетики
растений Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН,
email: stepanov@sifibr.irk.ru
Маркова Юлия Александровна, заведующая лабораторией фитоиммунологии
Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН, доктор биологических наук,
email: juliam06@mail.ru
664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, тел. (3952) 426753
Верхотуров Василий Владимирович, заведующий кафедрой технологии продуктов питания и химии
Института пищевой инженерии и биотехнологии Иркутского государственного технического
университета, доктор биологических наук, профессор, email: vervv@mail.ru
664074, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83, тел. (3952) 405178
Букин Юрий Сергеевич, старший научный сотрудник лаборатории геносистематики,
Лимнологический институт СО РАН, кандидат биологических наук, email: bukinyura@mail.ru
664033, г. Иркутск, ул. УланБаторская, 3, тел. (3952) 422623
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
119