ИССЛЕДОВАНИЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ЯЩУРА В КЛЕТКАХ

Л А Б О РАТ О Р Н А Я Д И А Г Н О С Т И К А
УДК 619:578.835.2:57.082.26
Исследование репродукции вируса
ящура в клетках ВНК-21/2-17,
культивируемых в среде
с пониженным содержанием цистина
М.Н. Гусева, кандидат биол. наук, В.В. Михалишин, доктор вет. наук, Б.Л. Манин, кандидат биол. наук,
В.Д. Юрчишин ([email protected])
Всероссийский научноисследовательский институт защиты животных (Владимир)
В статье приведены результаты исследования пролиферации клеток ВНК-21/2-17 в питательной ростовой среде
с пониженным содержанием аминокислоты цистин, а также данные по репродукции вируса ящура в этих клетках.
Ключевые слова: аминокилоты, вирус ящура, гидролизат белков крови, клетки ВНК-21, цистин
Сокращения: АМК — аминокислоты, ВНИЯИ — Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт, ГБК — гидролизат белков крови, ИП — индекс
пролиферации, КМ — культиваторы металлические,
КС — культиваторы стеклянные, РСК — реакция
связывания комплемента, ТЦД — тканевая цитопатическая доза
Введение
В последнее время клетки млекопитающих все больше используются в промышленных технологиях, а различным аспектам культивирования уделяется значительное внимание.
В своих исследованиях Игл и соавт. установили, что
для роста и деления клеток позвоночных вне организма необходимы 13 АМК (изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, аргинин, глютамин, гистидин, тирозин, цистин) [4, 9],
а для роста клеток в живых организмах — первые
8 АМК. Все АМК участвуют в биосинтезе разнообразных белков, в том числе ферментов, а также нуклеиновых кислот. Выполнение АМК той или иной функции
in vitro во многом зависит от условий культивирования.
Одна из причин, по которой в среду для культивирования необходимо дополнительно вводить пять АМК,
которые не требуются для целостного организма, — это
ограниченный их синтез в культуре [3].
Почти все белки включают в себя серосодержащие
АМК. Последние участвуют не только в биосинтезе полипептидов, но и в формировании вторичных и третичных белковых структур, поэтому полное их отсутствие
ведет к дегенеративным изменениям клеток. Содержат
серу три АМК: цистин, цистеин и метионин [4, 8].
В питательную среду серу обычно добавляют в форме одного из неорганических веществ, в частности сульфата, или в виде цистеина либо метионина. При
аэробных условиях цистеин почти целиком превращается в цистин, который способен заменять цистеин [1, 5].
Суспензионные клеточные культуры проходят характерные стадии роста, или фазы: лаг-фазу, фазу логариф-
22
мического роста, стационарную и логарифмического отмирания. В первой стадии, как правило, количество клеток уменьшается, во второй популяция клеток увеличивается (стадия логарифмического роста),
в третьей количество клеток не увеличивается (стационарная). Если культивирование продолжить, то
обнаружится уменьшение численности клеток —
фаза логарифмического отмирания (фаза разрушения) [4, 8].
Вирус ящура хорошо репродуцируется в клетках, находящихся в стационарной фазе, то есть в суспензии,
в которой отсутствуют митозы [1, 6]. Так как культивируемые клетки нуждаются в большом количестве
таких АМК, как цистин и глутамин, то, вероятно, изменение их концентрации в ростовой питательной среде может повлиять на сроки наступления стационарной фазы, следовательно, ослабить клетки и улучшить
репродукцию в них вируса. По «Промышленному регламенту» в питательную среду для роста клеток добавляют АМК, витамины, соли и до 0,25 % по сухому остатку ГБК, который содержит различные АМК, в том
числе цистин 1,0…4,8 мг/л в зависимости от серии изготовления ГБК. Сухой цистин вносят дополнительно
из расчета 0,032 г/л.
Цель исследования
Изучить пролиферацию клеток ВНК-21/2-17 в питательной ростовой среде с пониженным содержанием цистина, а также репродукцию вируса ящура в них.
Материалы и методы
В работе использовали: клетки ВНК-21/2-17; КС рабочим объемом до 30 л; КМ рабочим объемом до
1800 л; стандартную питательную среду для выращивания клеток (рН 7,2), изготовленную согласно
«Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов», с пониженным содержанием цистина, который поступал только из ГБК (опыт); стандартную питательную среду
для выращивания клеток (рН 7,2), изготовленную
согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов»
(контроль).
РВЖ • СХЖ • № 1/2014
Исследование репродукции вируса ящура в клетках ВНК-21/2-17, культивируемых в среде
с пониженным содержанием цистина
Суспензионную культуру клеток
выращивали и заражали вирусом
также согласно «Промышленному
регламенту». Для заражения клеток
использовали культуральный вирус
ящура штаммов: «A №2045/Киргизия/2007», «Азия-1 Шамир/Израиль
3/89», «О/Пан Азия-2», «О/№2102
Забайкальский/2010».
Количество общего вирусного Рис. 1. Клетки ВНК21/217, выращенные
Рис. 2. Клетки ВНК21/217, выращенные
белка и компонентный состав ус- в среде с пониженным содержанием цистина, в среде со стандартным количеством цистина,
танавливали согласно «Методике объектив х 40
объектив х 40
определения содержания вирусспецифического белка и компонентного состава вируса муногенных компонентов на 1 млн клеток (табл. 2).
ящура с помощью количественной РСК», утвержден- Количество вирусспецифического белка с 1 млн клеток
было выше в 1,2…1,6 раза в клетках, выросших в опытной директором ВНИЯИ в 1987 г.
ИП рассчитывали как отношение конечной концен- ной среде, чем в клетках на среде со стандартным количеством цистина (р < 0,01).
трации клеток к исходной в одном пассаже.
При выращивании клеток ВНК-21/2-17 в КМ на среЦитохимическую морфологию клеток ВНК-21/2-17
изучали с помощью люминесцентного микроскопа де с дефицитом цистина уже на протяжении двух пасМЛ-2Б. Нативные препараты окрашивали 0,001%-м сажей ИП составил 2,96±0,511, в контрольной срераствором акридинового оранжевого. Фотографи- де — 5,96±0,240, что выше в 2 раза, различия сущестровали камерой Leica на микроскопах Zeiss, Olimpus, венны (р < 0,01). Таким образом, чем больше число
пассажей в среде с ограниченным количеством цисLeica.
тина, тем ИП ниже: различие по ИП с контролем в
одном пассаже с низким количеством цистина состаРезультаты
На первых этапах работы выращивали клетки ВНК- вило 1,5 раза, в двух — уже 2 раза.
При репродукции вируса ящура в клетках на про21/2-17 (два пассажа) в КС. ИП в контрольной среде составил 3,78±0,325, в опытной — 2,75±0,233, что су- тяжении двух пассажей в среде с дефицитом цистищественно ниже (р< 0,05, при n=6). Выращенные в раз- на количество вирусспецифического белка с 1 млн клеличных средах клетки охлаждали и отстаивали соглас- ток было выше в 1,8 раза, чем в контроле (табл. 3). При
но Регламенту. Заражали штаммом вируса ящура репродукции вируса в клетках, выросших с понижен«О/№2102 Забайкальский/2010» в дозе 0,2 ТЦД 50/ ным содержанием цистина, количество иммуногенных
компонентов с 1 млн клеток составило 0,72±0,04 мкг/мл,
клетка.
Результаты репродукции вируса приведены в таб- в контрольных — 0,40±0,037 мкг/мл.
При цитохимическом исследовании клеток выявилице 1. Количество иммуногенных компонентов
с 1 м л н к ле т о к в о п ы т е в с р е д н е м с о с т а в и л о ли, что отношение объема клетки к объему ядра (в дан0,37±0,015 мкг/мл, в контроле — 0,23±0,015 мкг/мл, ном случае мы ориентировались на площадь) изменичто существенно ниже (р < 0,005), причем определя- лось. При уменьшении количества цистина при культивировании клеток объем цитоплазмы увеличился в
ли только 146S–компонент.
На следующем этапе эксперимента выращивали среднем на 1/3 (рис. 1, 2).
клетки ВНК-21/2-17 на двух средах (с добавлением
цистина и без него) в КМ (один и два пассажа). Ус- Обсуждение и выводы
тановили, что на протяжении одного пассажа при В результате проведенных исследований установлено,
дефиците цистина клетки росли менее интенсивно. что при дефиците цистина клетки ВНК-21/2-17 расТак, ИП клеток в контрольной среде (число опытов тут менее интенсивно, ИП отличается от контроля в
18) составил 5,50±0,234, в опытной (n=4) — 3,44±0,235, 1,37; 1,50 и 2,00 раза в зависимости от системы кульчто ниже в 1,6 раза, то есть различия существенны тивирования и числа пассажей в средах с пониженным
(р < 0,01).
содержанием цистина; однако количество иммуноВирус ящура разных штаммов, выращенный в по- генных компонентов с 1 млн клеток в них гораздо вылученных клетках, различался по количеству им- ше (в 1,2…1,8 раза).
1. Влияние состава ростовых питательных сред на репродукцию вируса ящура в КС
Среда
Опытная
Контрольная
№ опыта
Концентрация
клеток, млн/мл
1
2
Количество вирусного белка, мкг/мл
Количество
пораженных клеток, %
Время репродукции
вируса, ч
0,35
87
11
0,40
85
12
1,14
0,36
76
18
1,12±0,10
p < 0,05
0,96±0,092
p < 0,05
0,37±0,015
p < 0,005
83±3,388
p < 0,005
13,7±2,19
p < 0,05
2,19
0,82
0,57
0,26
91
11
2,3
0,67
0,51
0,22
87
12
3
3,4
1
0,73
0,21
77
18
Среднее значение,
M±m
2,63±0,386
p < 0,05
0,83±0,095
p < 0,05
0,60±0,066
p < 0,05
0,23±0,015
p < 0,005
85±4,163
p < 0,005
13,7±2,19
p < 0,05
После инакт.
и очистки
146 S
146 S с 1 млн
клеток
2,54
0,98
0,88
2,10
1,00
0,85
3
3,16
1,38
Среднее значение,
M±m
2,60±0,307
p < 0,05
1
2
РВЖ • СХЖ • № 1/2014
23
М.Н. Гусева, В.В. Михалишин, Б.Л. Манин, В.Д. Юрчишин
2. Влияние состава ростовых питательных сред на репродукцию вируса ящура в КМ
Среда
Концентрация клеток
млн/мл
Количество вирусного белка, мкг/мл
После инактивации
и очистки
146+75 S
146+75 S с 1
млн.клеток
Количество
пораженных клеток,
%
Время репродукции
вируса, ч
A №2045/Киргизия/2007
Опытная
n=4
3,2±0,27
р< 0,005
2,95±0,038
р< 0,001
2,54±0,043
р< 0, 001
0,81±0,052
р< 0,001
90,8±0,75
р< 0,001
10,6±0,63
р< 0,001
Контрольная
n=8
4,2±0,14
р< 0,001
3,16±0,125
р< 0,001
2,72±0,117
р< 0,001
0,66±0,035
р< 0,001
85,5±2,88
р< 0,001
12,3±0,48
р< 0,001
Опытная
n=5
3,1±0,26
р< 0,001
2,55±0,245
р< 0,001
2,30±0,236
р< 0,001
0,84±0,035
р< 0,001
90,4±0,40
р< 0,001
10,8±0,37
р< 0,001
Контрольная
n=4
4,6±0,05
р< 0,001
2,93±0,640
р< 0,05
2,42±0,436
р< 0,05
0,53±0,094
р< 0,05
91±1,0
р< 0,001
10,3±0,25
р< 0,001
Опытная
n=8
3,4±0,113
р< 0,001
2,69±0,087
р< 0,001
2,21±0,084
р< 0,001
0,66±0,049
р< 0,001
87,5±1,31
р< 0,001
12,8±0,57
р< 0,001
Контрольная
n=10
3,8±0,20
р< 0,001
2,17±0,157
р< 0,001
1,91±0,135
р< 0,001
0,51±0,022
р< 0,001
90,7±0,45
р< 0,001
11,2±0,29
р< 0,001
Азия1 Шамир/Израиль 3/89
О Пан-Азия2
3. Репродукция вируса ящура в клетках ВНК21/217, выращиваемых в КМ в среде с пониженным содержанием
цистина на протяжении двух пассажей
Среда
Опытная
Контрольная
Количество вирусного белка, мкг/мл
После инактивации
146+75S с 1 млн.
146+75S
и очистки
клеток
№
Концентрация
клеток, млн/мл
Количество
пораженных клеток, %
Время репродукции
вируса, ч
1
2,9
3,14
2,59
2
2,9
2,15
1,94
0,89
90
10
0,67
92
3
2,9
2,15
10
1,94
0,67
90
11,5
4
2,6
5
3,1
2,15
1,94
0,75
90
11
2,55
2,27
0,73
90
6
11
3,6
2,55
2,27
0,63
90
11
Среднее значение,
M±m
3,0±0,26
р < 0,001
2,45±0,159
р < 0,001
2,16±0,109
р < 0,001
0,72±0,04
р < 0,001
90,3±0,33
р < 0,001
10,75±0,25
р < 0,001
1
4,5
1,6
1,45
0,32
90
10
2
4,5
2,07
1,93
0,43
94
11
3
3,8
2,04
1,42
0,37
90
10
4
3,5
1,94
1,71
0,49
92
13
Среднее значение,
M±m
4,1±0,25
р < 0,001
1,91±0,108
р < 0,001
1,63±0,120
р < 0,001
0,40±0,037
р < 0,005
91,5±0,96
р < 0,001
11±0,71
р < 0,001
При цитохимическом исследовании клеток выявлено, что отношение объема клетки к объему ядра
изменилось. При уменьшении количества цистина при
культивировании клеток объем цитоплазмы был увеличен в среднем на 1/3. Из этих наблюдений можно сделать вывод: так как основная биосинтетическая активность данной клеточной культуры направлена на
синтез нуклеиновых кислот и ядерных мембран, то, вероятно, синтез цитоплазматических белков замедлен, и в интерфазе он не набирает необходимого объема для репродукции вирусов [4].
Таким образом, клеточная линия ВНК-21/2-17 при
оптимальных условиях культивирования, согласно
«Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов», обладает высокой пролиферативной активностью. Очевидно, динамика пролиферации настолько высока, что синтез
ДНК клеток опережает синтез структурных белков [4,
6]. Вероятно, этим объясняется тот факт, что накопление вирусспецифических компонентов с 1 млн клеток при репродукции ящура активнее происходит
в клетках, выросших в среде с пониженным содержанием цистина.
Библиография
1. Адамс, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адамс. —
М.: Мир, 1983. — 263 с.
2. Голубев, Д.Б. Руководство по применению клеточных культур
в вирусологии. / Д.Б. Голубев, А.А. Соминина, М.Н. Медведева. —
Л.: Медицина, 1976. — 224 с.
3. Дьяконов, Л.П. Культивирование клеток и тканей животных /
Л.П. Дьяконов, В.Ф. Глухов, А.А. Поздняков, Г.Ф. Денисенко,
Т.П. Калмыкова. — Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988. — Ч.2. —
91 с.
4. Животная клетка в культуре / Под. ред. Л.П. Дьяконова. — М.: Спутник +, 2009. — 652 с.
5. Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. — М.:
Мир, 1989. — 333 с.
6. Манин, Б.Л. Параметры биологической толерантности производственной клеточной культуры ВНК-21/01 / Б.Л. Манин, В.В. Михалишин, Т.И. Корпусова и др. // Ветеринарна медицина. — 2002. —
Віп. 80. — С. 404–408.
7. Сергеев, В.А. Культуры клеток в ветеринарии и биотехнологии /
В.А. Сергеев, Ю.А. Собко. — Киев: Урожай, 1990. — 150 с.
8. Ченцов, Ю.С. Введение в клеточную биологию / Ю.С. Ченцов. —
М.: Академкнига, 2004. — 495 с.
9. Eagle, H. Nutrition needs of mammalian cells in tissue culture /
H. Eagle // Sciens.. — 1955 — Т. 122. — N. 3168. — Р. 501–514.
SUMMARY
M.N. Guseva, V.V. Mikhalishin, B.L. Manin, V.D. Yurchishin
Federal Centre for Animal Health (Vladimir)
Study of FMD Virus Reproduction in ВНК21/217 Cells Cultured in Low Cystine Medium. The results of study
of ВНК21/217 cell proliferation in nutrient growth medium with low cystine content and data on FMDV reproduction
in such cells are presented.
24
РВЖ • СХЖ • № 1/2014