Электронные спектры сложных молекул
реклама
Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова Физический факультет Кафедра общей физики «Электронные спектры сложных молекул» Спецпрактикум кафедры общей физики Составители: Пацаева С.В., Южаков В.И. Москва, 2010 Теоретическая часть 1.1. Введение Атомные спектры, обусловленные квантовыми переходами между различными уровнями энергии свободных (слабосвязанных) атомов и получающиеся при испускании или поглощении ими электромагнитного излучения, являются линейчатыми, т.е. состоят из отдельных спектральных линий (как, например, спектр ртути). Сложное по сравнению с атомами строение молекул приводит к большему разнообразию их энергетических состояний. Полную энергию Е молекулярной системы можно представить в виде суммы электронной Еэ, колебательной Ек и вращательной Ев составляющих: Е = Еэ + Ек + Ев. При этом Еэ>>Ек>>Ев, и в первом приближении они квантуются независимо. В адиабатическом приближении рассматривается движение электронов в поле закрепленных ядер. При более строгом рассмотрении энергетических состояний молекул учитываются энергии электронно-колебательного, электронно-вращательного и колебательно-вращательного взаимодействий. Переходы между энергетическими состояниями сопровождаются поглощением или испусканием излучения, частота которого определяется изменением энергии и равна = (Еn - Еm)/h = Еэ /h + Ек /h + Ев /h . При поглощении и излучении видимого или ультрафиолетового (УФ) света обычно изменяется электронная энергия молекул, т.е. при Еэ≠0 получаются электронные молекулярные спектры. Электронные переходы обычно сопровождаются изменением колебательных и вращательных состояний. Широкая возможность переходов между всей совокупностью электронноколебательно-вращательных уровней и обуславливает возникновение сложных 2 полосатых (полосато-линейчатых) или сплошных молекулярных спектров поглощения и фотолюминесценции. Более подробно вопросы формирования электронных спектров поглощения и люминесценции освещены в книге [1], главы 1,3 (§3.1) 1.2. Электронные спектры поглощения. Закон Бугера—Ламберта— Бера. Пропускание и оптическая плотность. Представление спектров поглощения. Электронные спектры поглощения - это спектры, получающиеся при прохождении излучения с непрерывным спектром в веществе и его избирательном ослаблении на некоторых длинах волн за счет поглощения. Они возникают при квантовых переходах с нижних (невозбужденных) электронных уровней энергии на верхние (возбужденные). Спектр поглощения – это зависимость величины, характеризующей поглощательную способность вещества, от длины волны или волнового числа ν падающего света. Волновое число является обратной величиной длины волны в вакууме ν = 1/λ и выражается в обратных сантиметрах (см-1), показывая, сколько длин волн укладывается в 1 см. Длину волны в спектроскопии обычно выражают в нанометрах (1 нм = 10-9 м). Длины волн и волновые числа — взаимообратные величины: например, длина волны λ = 400 нм соответствует волновому числу ν = (107 /400) см-1 = 25000 см-1. Основной закон поглощения света – закон Бугера—Ламберта—Бера - это закон ослабления монохроматического света при поглощении его слоем вещества. Пусть монохроматический свет с длиной волны проходит через слой поглощающего вещества толщиной dl. Изменение интенсивности света dI в процессе поглощения определяется соотношением: dI = - I·· С·dl (1) 3 где I - интенсивность света, падающего нормально на границу слоя dl, C концентрация поглощающих частиц, - коэффициент, характеризующий поглощение и, зависящий от длины волны (частоты) падающего света. Данное утверждение справедливо в широких пределах интенсивности падающего света, однако при очень больших интенсивностях коэффициент поглощения зависит от интенсивности (сфокусированные лазерные пучки). Он также может изменяться при высоких концентрациях поглощающего вещества вследствие межмолекулярных взаимодействий. Интегрирование выражения (1) приводит к закону Бугера—Ламберта— Бера (Б–Л–Б): Il = I0 e - С l, где I0 - интенсивность падающего на образец света, Il - значение интенсивности после прохождения слоя толщины l. Коэффициент относят к слою толщиной 1 см с концентрацией раствора С=1 моль/литр и называют молярным коэффициентом экстинкции. Если толщину поглощающего слоя l выразить в сантиметрах, а концентрацию С поглощающих частиц в моль/литр, то размерность коэффициента экстинкции будет литр/(моль·см). В зависимости от соединения может меняться в широком диапазоне, начиная от 0 и до 103— 105 литр/(моль·см). Закон Б–Л–Б можно записать в логарифмическом виде: ln (I0 / Il) = · С· l. Если использовать десятичный логарифм, то: lg (I0 / Il) = 10· С· l. Коэффициент 10 называют десятичным молярным коэффициентом поглощения, или коэффициентом экстинкции (погашения). Два коэффициента имеют одинаковую размерность и отличаются лишь численным безразмерным множителем lg e ≈ 0,4343. Поэтому 10 ≈ 0,4343 . 4 Величина k = · l называется коэффициентом поглощения. Это величина, обратная толщине слоя, ослабляющего в 10 раз интенсивность падающего излучения. Отношение интенсивности света, прошедшего через слой толщины l, к величине интенсивности падающего света называется пропусканием Т=Il/I0 слоя и обычно выражается в процентах. Из закона Б–Л–Б следует, что пропускание вещества Т не зависит от интенсивности падающего света, но является функцией длины волны. Т может принимать значения от 0% (свет полностью поглощается веществом) до 100% (полностью прозрачная среда для длины волны измерения). Величина Т, отнесенная к толщине слоя 1 см, называется коэффициентом пропускания. Для практических целей обычно используют десятичный логарифм обратной величины Т, который называют оптической плотностью D слоя толщины l: D = lg (1/T) = lg (I0 / Il) = 10·С·l. Это безразмерная величина. Величина молярного коэффициента экстинкции численно равна оптической плотности раствора с концентрацией 1 моль/литр при толщине слоя (длине кюветы) 1 см. Коэффициент экстинкции не зависит от концентрации раствора и толщины проходимого светом слоя. Степень поглощения света неодинакова при различных длинах волн. Зависимость величины, характеризующей поглощение (D, ) от длины волны, или частоты или волнового числа и является спектром поглощения Следует иметь в виду, что поглощение вещества не зависит от наличия других поглощающих веществ, т.е. на данной длине волны оптическая плотность смеси компонентов A, B, C, не взаимодействующих между собой, равна сумме оптических плотностей отдельных компонентов при той же длине волны D = DА + DВ + DС. Для пропускания выполняется другая зависимость: полное пропускание нескольких слоев или компонентов является 5 произведением значений пропускания Т = ТА ·ТВ ·ТС. Величину оптической плотности выражают в долях единицы. Значение D = 2 соответствует ситуации, когда исходная интенсивность света ослабляется слоем вещества в 100 раз, D = 1 соответствует ослаблению в 10 раз, а при D = 0 поглощение света слоем вещества не происходит. Оптическая плотность не может принимать отрицательные значения! Иначе это будет соответствовать увеличению интенсивности света, вышедшего из образца по отношению к падающему свету. Если в эксперименте наблюдаются отрицательные значения оптической плотности – это повод задуматься о том, правильно ли проводятся измерения. Возможно, измеряя спектры поглощения на двухлучевом спектрофотометре, вы поменяли местами исследуемый образец и кювету сравнения, или была загрязнена кювета сравнения. Т.е. по ходу луча сравнения стоял образец, поглощающий свет сильнее, чем по ходу луча для исследуемого образца. В эксперименте, когда в поглощающей среде создана инверсия населенности, т.е. число возбужденных состояний на верхнем уровне превосходит число основных состояний на нижнем уровне, интенсивность выходящего света Il превосходит интенсивность падающего I0 . В этом случае имеет место усиление света, и формально это явление в законе Б.-Л.-Б. соответствует отрицательному коэффициенту поглощения, а само явление называется отрицательным поглощением света. Справедливость большом количестве закона Бугера—Ламберта—Бера веществ, находящихся в подтверждена различных на агрегатных состояниях. Однако при больших интенсивностях падающего на раствор света, когда значительная часть молекул вещества оказывается в возбужденном состоянии, пропорциональность между оптической плотностью и концентрацией вещества нарушается. Закон Бугера, строго говоря, справедлив лишь для параллельного пучка монохроматического света. Этот закон утверждает, что если толщина слоя 6 постоянна, то зависимость оптической плотности D от концентрации C представляет собой прямую линию, проходящую через начало координат с тангенсом угла наклона, равным . Причины кажущихся отклонений от закона Бугера—Ламберта—Бера могут быть следующие. Немонохроматичность падающего на кювету излучения. Агрегация молекул растворенного вещества, а также другие физикохимические процессы (взаимодействие вещества с растворителем, диссоциация, флуоресценция анализируемого вещества). Анизотропия изучаемого объекта. Изучение электронных спектров поглощения (абсорбционная спектроскопия) широко используется при решении многих задач аналитической химии (качественный и количественный анализы), при исследовании различных физических и химических процессов, в том числе межмолекулярных взаимодействий, в медицинских и биологических исследованиях. Для анализа спектрофотометры. электронных В спектров двухлучевых поглощения приборах для используются оценки степени поглощения исследуемого вещества интенсивность излучения, прошедшего через вещество (раствор), сравнивается с интенсивностью света, прошедшего через вещество сравнения, в качестве которого зачастую используется чистый растворитель. В зависимости от режима работы измеряют пропускание Т или оптическую плотность D как функцию длины волы или волнового числа. В практикуме будут в основном изучаться спектры поглощения и люминесценции растворов сложных органических веществ. Основные факторы, влияющие на точность спектрофотометрических измерений: 1. Случайные ошибки в приготовлении растворов, влияние содержащихся 7 в растворе примесей. 2. Кюветная ошибка, включающая в себя не скомпенсированное из-за разной толщины кювет поглощение растворителя, разное светопоглощение кювет. 3. Погрешность установки аналитической длины волны (включая несоответствие положения диспергирующего элемента – призма или решетка – и указателя на шкале длин волн) из-за неправильной или устаревшей калибровки шкалы прибора по длинам волн. На крутых участках спектра поглощения эта погрешность может быт существенной. 4. Непосредственная погрешность спектрофотометрического измерения (ошибки настройки прибора на 0 и 100% пропускания, нестабильность работы электронной схемы и т.п.). 5. Неправильный выбор спектральной щели регистрирующего монохроматора (сравнимой по величине или шире полосы поглощения). 6. Рассеяние света в приборе, к которому приводят изъяны в призмах и зеркалах, их помутнение и попадающая на них пыль. 7. Рассеяние света на частицах раствора, которое приводит к ослаблению прошедшего излучения, не вызванного поглощением в кювете. Большинство перечисленных факторов можно устранить, соблюдая правила приготовления растворов, обращения с кюветами и работы на приборе. Фактическая погрешность измерений на используемом приборе, присущие этому прибору оптимальные измеряемые оптические плотности и рабочий интервал могут быть определены лишь на основе экспериментального исследования. Точность количественных измерений падает, если измеряемое пропускание образца превышает 85% (оптическая плотность D>1). Поэтому при большом поглощении необходимо уменьшить либо концентрацию вещества, либо толщину поглощающего слоя. Обычно для измерения спектров поглощения 8 растворов используют стандартные кварцевые или стеклянные кюветы с длиной оптического хода лучей (толщиной поглощающего слоя) 1 см. Но для измерения спектров поглощения растворов большой оптической плотности необходимо использовать кюветы с меньшей длиной оптического хода лучей, например, 1 мм или меньше. Существуют специальные кюветы с толщиной поглощающего слоя между плоскопараллельными пластинами в 100, 10 или 1 микрометр. Минимальные значения оптической плотности, которые можно измерить спектрофотометром, определяются характеристиками прибора, и обычно составляют 0.005. Поэтому для измерения спектров поглощения разбавленных растворов необходимо использовать кюветы с длиной оптического хода лучей больше стандартной (например, 2 или 5 см). Все характеристики поглощения, в том числе коэффициент молярной экстинкции и оптическая плотность D, используются для представления спектров поглощения в виде графиков. Численные значения их с указанием размерности откладываются по оси ординат. По оси абсцисс откладываются либо длина световой волны λ, выраженная в нанометрах, либо волновое число в обратных сантиметрах ν. Большинство выпускаемых промышленностью спектрометров с решеточными монохроматорами градуировано в шкале длин волн, поэтому такие спектры привычнее и их легче визуально интерпретировать. С другой стороны, для некоторых задач спектроскопии предпочтительнее использовать спектры в шкале волновых чисел, поскольку они прямо пропорциональны энергии квантов света. 9 1.3. Определение люминесценции. Виды люминесценции. Представление спектров люминесценции. Спектры испускания и возбуждения флуоресценции Люминесценция — это явление излучения света, широко распространенное наряду с тепловым излучением и различными видами рассеяния света. Для возбуждения люминесценции необходимо передать частицам вещества энергию тем или иным способом, чтобы перевести их из основного электронного состояния в возбужденное. При обратном переходе частиц вещества (атомов, молекул, ионов) из возбужденного электронного состояния в основное наблюдается свечение, которое и называется люминесценцией. Чтобы отличить люминесценцию от теплового излучения, испускаемого веществом за счет его внутренней (тепловой) энергии, ее называют «холодным свечением». Или, по определению Акимова А.И., «люминесценция – это когда светит, но не греет». Рассмотрим подробнее определение люминесценции, различные механизмы испускания света и виды люминесценции по способу возбуждения. Люминесценция (от лат. lumen, род. падеж luminis -свет и -escent суффикс, означающий слабое действие) - свечение, возникающее в результате электронного перехода в атомах, молекулах, ионах и других более сложных комплексах при их возвращении из возбужденного состояния в основное. Следующие два свойства позволяют отличать люминесценцию от других видов излучения. Во-первых, люминесценция представляет собой избыток над тепловым излучением. А во-вторых, в отличие от различных видов рассеяния света люминесценция характеризуется временем свечения, значительно превышающим период колебаний световой волны и составляющим от пикосекунд (10-12 с) до нескольких суток. 10 Механизм молекулярной люминесценции заключается в образовании под действием энергии от внешнего или внутреннего источника возбужденных состояний люминесцирующих центров (атомов, молекул, ионов) и последующего испускании ими квантов света. При этом частицы преобразуют запасенную ими энергию в собственное излучение. Испускание света может происходить не обязательно теми же частицами, которые возбуждаются при поглощении энергии, но и другими, если происходит безызлучательная передача энергии возбуждения. Такое свечение называется сенсибилизированной люминесценцией. При рекомбинационной люминесценции под действием энергии возбуждения образуются носители заряда (электроны и дырки в кристаллофосфорах или ионы и радикалы в газах, жидкостях, стеклах), последующая рекомбинация которых сопровождается испусканием фотонов. Люминесценция может возникать у веществ, находящихся в любых агрегатных состояниях: газообразном, жидком или твердом. Так, люминесцируют разреженные пары и газы. Люминесцентной способностью обладают жидкости, растворы ряда неорганических солей и многих органических соединений, а также некоторые молекулярные кристаллы. В результате поглощения веществом энергии возбуждения (под энергией возбуждения мы будем понимать любой способ передачи энергии частицам вещества) составляющие его частицы (атомы, молекулы, ионы) переходят из основного электронного в возбужденное состояние. Обычно возбужденные частицы очень быстро, за время порядка 10-8—10-9 с, теряют свою избыточную энергию и возвращаются в основное невозбужденное состояние. Такой переход может осуществляться либо с испусканием свечения, которое называется 11 люминесценцией, либо без испускания квантов света (фотонов) - путем передачи энергии возбуждения окружающей среде в виде тепла. Таблица 1. Виды люминесценции по способу возбуждения Фотолюминесценция свечение, возбуждаемое электромагнитным излучением оптической частоты Катодолюминесценция свечение, вызываемое катодными лучами Рентгенолюминесценция свечение, возбуждаемое рентгеновскими лучами Радиолюминесценция свечение, возбуждаемое радиоактивными препаратами Хемилюминесценцией свечение, возбуждаемое за счет энергии химических реакций Биолюминесценция свечение живых организмов, частный случай хемилюминесценции. Электролюминесценция свечение, возникающее под действием электрического поля, Триболюминесценция свечение, возникающее при механическом воздействии В таблице 1 приведены различные виды люминесценции, отличающиеся способом возбуждения. Каждое из этих свечений имеет свои характерные особенности. В дальнейшем мы будем рассматривать только фотолюминесценцию. Излучательный переход из возбужденного состояния в основное может 12 происходить самопроизвольно (спонтанная люминесценция) или под действием внешнего электромагнитного излучения (вынужденная люминесценция). Рис. 1. Диаграмма Яблонского для энергетических уровней молекулы. Стрелками обозначены основные процессы преобразования энергии фотовозбуждения в молекуле. В зависимости от природы возбужденного электронного состояния фотолюминесценция делится на два типа - флуоресценцию и фосфоресценцию (см. рис.1). Флуоресценция возникает при переходах между уровнями одинаковой мультиплетности (при переходах с первого S1, или реже – второго возбужденного синглетного уровня S2 на основной синглетный уровень S0), а фосфоресценция – между уровнями различной мультиплетности (при переходах с первого триплетного T1 на основной синглетный уровень S0). Под мультиплетностью понимают число квантовых состояний М молекулы, различающихся только ориентацией суммарного электронного спина. Так как почти все электроны в молекуле спарены, то для большинства веществ в основном состоянии характерен нулевой суммарный спин и синглетное (М=1) состояние (исключением является, например, кислород, у которого основное состояние триплетное, М=3). 13 При поглощении фотона возбуждающего света энергии hA молекула переходит из основного состояния S0 в возбужденное состояние на более высокий энергетический уровень той же мультиплетности Sn. C высших уровней Sn (n > 1) в результате внутренней конверсии (переходов между состояниями с одинаковой мультиплетностью) молекула переходит на первый возбужденный синглетный уровень S1, откуда может перейти в основное состояние S0 либо без испускания фотона (безызлучательно) или с испусканием фотона люминесценции hF. В результате интеркомбинационной конверсии (переходов между состояниями с разной мультиплетностью) молекула может перейти в возбужденное безызлучательный переход триплетное в основное состояние, откуда возможен синглетное состояние или с испусканием фотона фосфоресценции hP. Флуоресценция и фосфоресценция на практике различаются временными характеристиками. Типичные времена для флуоресценции – порядка наносекунд (10-9 с), поэтому наблюдатель воспринимает флуоресценцию как практически мгновенный отклик на возбуждение светом. Фосфоресценция же «разгорается» через некоторое время как послесвечение. Типичные времена фосфоресценции – от миллисекунд до секунд. В последние десятилетия люминесцентные методы анализа состояния вещества получили особое развитие в связи с использованием лазерных источников возбуждения. Обладая большой чувствительностью, эти методы позволяют работать при очень малых концентрациях исследуемого вещества и незаменимы в биологии и медицине. В основе этих методов лежит измерение спектральных, поляризационных, пространственных и временных характеристик люминесценции. В люминесцентной спектроскопии, как и в спектроскопии поглощения, спектры изображают графически таким образом, что по оси абсцисс откладывается либо длина волны λ, либо волновое число ν. 14 Спектр флуоресценции — это зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны λ или волнового числа ν. Прибор для измерения спектров флуоресценции называют спектрофлуориметром или просто флуориметром. В англоязычной литературе флуориметр (fluorimeter) называют также люминесцентным спектрометром (luminescent spectrometer), а иногда – флуорометром (fluorometer). В русскоязычной литературе термин флуорометр закрепился за прибором для измерения кинетики флуоресценции. Стандартный коммерческий флуориметр может измерять три типа спектров - спектры испускания флуоресценции, спектры возбуждения флуоресценции и синхронные спектры. Чаще всего в люминесцентной спектроскопии используются спектры испускания. Для их регистрации используется фиксированная длина волны возбуждения, а спектр испускания измеряется фотодетектором при сканировании монохроматора приемной системы в определенном интервале длин волн (волновых чисел). При регистрации спектров возбуждения фиксируется длина волны регистрации флуоресценции, а длина волны возбуждения сканируется монохроматором возбуждения в определенном интервале длин волн (или волновых чисел). В случае синхронных спектров сканирование производится синхронно двумя монохроматорами таким образом, что разница между длиной волны возбуждения и длиной волны регистрации остается постоянной. Синхронные спектры могут также измеряться в другом режиме, когда неизменной остается разница в единицах волновых чисел для возбуждения и регистрации, т.е. остается неизменной разность энергии фотонов возбуждения и испускания. Рассмотрим подробнее особенности спектров испускания и возбуждения флуоресценции. Спектр испускания представляет собой зависимость интенсивности испускания от длины волны (или волнового числа) при фиксированной длине волны возбуждающего света. При строгих количественных измерениях спектры 15 испускания флуоресценции изображают одним из следующих способов: 1) по ocи ординат откладывают число квантов, испускаемых за секунду в расчете на единичный интервал длин волн с центром при данной длине волны λ — (dQ/dλ), а по оси абсцисс — длину волны λ; 2) по оси ординат откладывают число квантов, испускаемых за секунду в расчете на единичный интервал волновых чисел при данном волновом числе — (dQ/dv), а по оси абсцисс — волновое число v; 3) по оси ординат откладывают энергию, испускаемую за секунду в единичном интервале длин волн — (dE/dλ), а по оси абсцисс — длину волны λ. 4) по оси ординат откладывают энергию, испускаемую за секунду в единичном интервале волновых чисел — (dE/dv), а по оси абсцисс — волновое число v. При первых двух способах площадь под кривой пропорциональна полной скорости испускания флуоресценции во всем спектральном диапазоне, измеряемой в единицах квантов за единицу времени. При третьем и четвертом способе площадь под кривой дает полную энергию, испускаемую за единицу времени. Как видим, в разных случаях под интенсивностью флуоресценции понимают различные физические величины dQ/dλ, dQ/dv, dE/dλ, dE/dv, которые отличаются не только размерностью и значением величины, но и видом зависимости от длины волны (волнового числа) на графике. Поэтому спектры испускания не могут быть правильно изображены одновременно в шкале длин волн и в шкале волновых чисел. На рис. 2 использовано правильное изображение в шкале волновых чисел (приведена внизу каждого графика). Соответствующие волновым числам значения длин волн приведены на верхней оси абсцисс для удобства, но для представления спектра испускания в шкале длин волн надо выполнить преобразование значений интенсивности флуоресценции, которое изменит вид спектральной кривой. Как выполнить это преобразование, мы расскажем ниже. 16 Рис. 2. Спектры поглощения и испускания флуоресценции перилена и хинина. (Лакович Дж. Основы флуоресцентной диагностики" - М.: Мир, 1986) Форма спектра испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждающего света, поскольку испускание практически всегда происходит с нижнего колебательного подуровня возбужденного электронного состояния. Если вид спектра флуоресценции меняется с изменением длины волны возбуждающего света, это может быть следствием того, что в смеси содержится несколько флуоресцирующих компонентов. Интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества. Поэтому измерения флуоресценции можно использовать для определения концентраций. Минимальные измеряемые концентрации составляют около 10-12 г/литр, т.е. этот метод в 100-1000 раз чувствительнее, чем абсорбционная спектроскопия. 17 Спектром возбуждения называют зависимость интенсивности испускания (!) флуоресценции от длины волны (или волнового числа) возбуждающего света при постоянном потоке фотонов, падающих на образец. Напомним, что длина волны испускания при регистрации спектра возбуждения остается неизменной, а значения длины волны возбуждения (волновых чисел линии диапазона. Измеряемой возбуждения) величиной пробегают является значения интенсивность заданного испускания флуоресценции, но в спектре ось ординат называют интенсивностью возбуждения флуоресценции. При измерениях спектра возбуждения должно быть соблюдено условие постоянства потока фотонов возбуждения, попадающих на образец, независимо от длины волны возбуждения. Так как не существует источников света с постоянной по длине волны интенсивностью излучения, идеальный флуориметр должен компенсировать изменение интенсивности возбуждающего света с длиной волны. В современных приборах такая процедура осуществляется следующим способом. Небольшая часть возбуждающего света после прохождения монохроматора возбуждения отклоняется в сторону с помощью делительной пластинки, и ее интенсивность регистрируется дополнительным детектором (фотодиодом или ФЭУ). Зарегистрированный сигнал (интенсивность испускания на фиксированной длине волны) с основного детектора (как правило, это ФЭУ) нормируется на интенсивность возбуждающего света по результатам измерения дополнительного детектора. Внимание: необходимо убедиться, что в используемом вами приборе функция автоматической нормировки на интенсивность возбуждающего света включена, в противном случае такую нормировку необходимо провести вручную после регистрации интенсивностей. Для приборов старшего поколения, в которых нет одновременного 18 измерения интенсивности возбуждающего света и интенсивности испускания флуоресценции, существуют специальные процедуры коррекции спектров возбуждения, которые учитывают спектральное распределение излучения источника по длинам волн и характеристики пропускания света в зависимости от длины волны для монохроматора возбуждения. В результате измерения спектра возбуждения и его коррекции идеальный флуориметр должен показывать зависимость отношения числа испускаемых фотонов к числу падающих на образец фотонов от длины волны (или волнового числа) возбуждающего света. После такой коррекции спектр возбуждения с точностью до множителя – величины квантового выхода - должен совпадать со спектром поглощения люминесцирующего вещества. 1.4. Переход от шкалы длин волн к шкале волновых чисел Иногда желательно представить спектры в шкале волновых чисел ν, а не в шкале длин волн λ. Длины волн легко перевести в волновые числа, взяв обратные величины. Для спектров поглощения и возбуждения флуоресценции значения по оси абсцисс изменятся по закону ν = 1/λ, а соответствующие им значения оптической плотности или интенсивности в спектре возбуждения по оси ординат остаются неизменными (постарайтесь объяснить сами, почему). Однако для спектров испускания флуоресценции, которые представляют зависимостью от длины волны λ интенсивности флуоресценции в единицах dQ/dλ или dE/dλ, помимо преобразования оси абсцисс необходимо выполнить преобразование значений по оси ординат. Это обусловлено тем, что при изменении длины волны λ меняется значение интервала λ, соответствующее постоянному интервалу ν. Рассмотрим, например, постоянный интервал Δλ = λ 2 - λ 1, где λ 1 и λ 2 - длины волн по обе стороны максимума испускания (рис. 3). При λ = 300 нм интервал Δλ в 2 нм эквивалентен интервалу волновых чисел 19 Δν = 222 см-1. При λ = 600 нм тот же интервал Δλ будет эквивалентен уже Δν = 55 см-1. Интервалы волновых чисел переводятся в длины волн по формуле ν = λ/λ2, получающейся при дифференцировании соотношения ν = 1/λ. Обратный перевод: λ = - ν/ν2. Поэтому для спектров испускания, помимо пересчета значений по оси абсцисс, необходимо выполнить преобразование значений по оси ординат, а именно: при переходе к шкале волновых чисел надо каждое значение интенсивности умножить на λ2. Переход от длин волн к волновым числам показан на рис.3. Умножение на λ2 приводит к избирательному увеличению интенсивности в длинноволновой части спектра испускания и к сдвигу видимого максимума испускания. При этом изменится ширина и форма спектральной кривой, например, исходная спектральная линия гауссовой формы в шкале длин волн при переходе к шкале волновых чисел перестанет быть симметричной. Рис. 3. Спектры испускания в шкалах длин волн и волновых чисел. 20 Внимание: в научном отчете необходимо указывать единицы измерения и размерность интенсивность флуоресценции, так как положение максимума λmax и ширина спектра испускания флуоресценции в шкале длин волн и в шкале волновых чисел могут отличаться (νmax ≠ 1/λmax ) ! 1.5. Основные закономерности флуоресценции. Стоксов сдвиг Спектр испускания, как правило, сдвинут относительно спектра поглощения в сторону больших длин волн. Это явление впервые наблюдал Стокс в 1852 г. в Кембридже на примере раствора хинина, используя простейшую аппаратуру: источником возбуждения служил солнечный свет, пропущенный через пластинку из голубого стекла, приемником излучения служил глаз, а отделение сигнала люминесценции от возбуждающего света происходило фильтром, которым служил бокал с белым вином. Флуоресценция хинина лежит в области 450 нм и поэтому хорошо заметна невооруженным глазом. Согласно правилу Стокса, частота излученного света всегда меньше частоты поглощенного света. Одной из основных причин возникновения стоксова (длинноволнового) сдвига является потеря энергии фотовозбуждения. Разность энергий возбуждения и излучения в разреженных парах расходуется на перераспределение первичной колебательной энергии между другими колебательными степенями свободы (колебательными модами), играющими роль внутримолекулярного теплового резервуара. В конденсированных средах избыток колебательной энергии с большей вероятностью сбрасывается в окружение возбужденной молекулы. Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения 21 Форма спектра испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. Т.е. при возбуждении монохроматическим светом (спектральной линией) в любом месте полосы поглощения испускается вся полоса флуоресценции целиком с неизменным распределением в ней интенсивности. При возбуждении молекулы на высшие электронные уровни (S2 и др.) или верхние колебательные подуровни состояния S1 избыток энергии быстро расходуется, переводя молекулу на самый нижний колебательный подуровень электронного состояния S1 (см. рис.1). Релаксации происходит за время порядка 10-12 с, т.е. гораздо быстрее, чем происходит испускание. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания. Существуют исключения (например, азулен), когда испускание может происходить как из S1-, так и из S2-состояния. Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ведет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обусловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра происходит избирательно для тех флуорофоров, которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем. Правило зеркальной симметрии Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу из S0 в S1.. Эта закономерность - правило зеркальной симметрии спектров поглощения и люминесценции - была установлена В. Л. Левшиным (1931 г.). Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение, и испускание обусловлены симметричными переходами, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний S0 и S1. Согласно принципу Франка - Кондона, все электронные переходы 22 происходят без изменения межъядерного расстояния. В результате, если данная вероятность перехода (фактор Франка - Кондона) между нулевым и вторым колебательными уровнями максимальна при поглощении, соответствующий переход будет наиболее вероятен также и в испускании (рис. 4). Рис. 4. Правило зеркальной симметрии и факторы Франка - Кондона. Объяснение зеркальности полос дано Д.И. Блохинцевым (1939 г.) с позиций квантовой механики при учете следующих предположений: 1) системы колебательных уровней основного и возбужденного электронных состояний соответствуют друг другу по величине энергии, имеют одинаковые волновые функции, одинаковое распределение молекул по колебательным уровням и одинаковые плотности колебательных уровней; 2) при переходе в возбужденное состояние не происходит существенного изменения молекулярной структуры и частот колебаний, а меняются лишь равновесные длины связей. 23 Рис.5. Схема образования зеркально-симметричных полос Необходимым условием для зеркальной симметрии является представление спектров поглощения и испускания в соответствующих единицах. Поэтому наилучшая симметрия должна существовать между модифицированными спектрами ()/v и F()/3, где () - коэффициент поглощения, соответствующий волновому числу , a F() - относительный поток фотонов в интервале волновых чисел Δ. Соответствие между такими спектрами обычно хорошо выполняется для полиядерных ароматических углеводородов. 1.6. Квантовый выход флуоресценции. Коррекция спектров возбуждения с помощью счетчика квантов. Измерение квантового выхода флуоресценции. Очень важной характеристикой люминесцирующих веществ является выход флуоресценции, значение которого показывает, насколько эффективно в исследуемом веществе происходит преобразование возбуждающего света в свет флуоресценции. Различают квантовый выход и энергетический выход флуоресценции. Под квантовым выходом понимают величину, показывающую отношение среднего числа излучённых квантов на один поглощённый: Φкв = Nизл/Nп, где 24 Nизл — число излучённых квантов, Nп — число поглощённых квантов возбуждающего света. Энергетический выход Φэн — отношение энергии излучённых квантов Eизл к энергии поглощённых Eп: Φэн = Eизл/Eп . Энергетический выход связан с квантовых соотношением Φэн = Φкв × νизл/νп, где νизл и νп — волновые числа, соответствующие поглощению возбуждающего света и испусканию флуоресценции. С.И. Вавилов показал, что энергетический выход растворов органических веществ может достигать значения 0.8, в этом случае величина квантового выхода люминесценции близка к 1. Также им было показано, что квантовый выход флуоресценции в растворах не зависит от длины волны возбуждающего света (в пределах полосы поглощения красителя). Это связано с огромной скоростью колебательной релаксации, в ходе которой возбуждённая молекула передаёт избыток энергии молекулам растворителя. Постоянство квантового выхода флуоресценции при изменении длины волны возбуждающего света в определенном спектральном диапазоне используется для коррекции спектров возбуждения флуоресценции с помощью так называемых счетчиков квантов. Счетчик квантов представляет собой кварцевую кювету (треугольной или квадратной формы в сечении) с раствором красителя большой концентрации (чаще всего это раствор родамина С в этиленгликоле) и фотодетектора (фотоэлемента, ФЭУ). Фотодетектор располагают непосредственно за кюветой с раствором красителя, без какоголибо селектирующего фильтра или монохроматора. Концентрация красителя в счетчике квантов должна удовлетворять двум противоположным критериям. С одной стороны, она должна быть достаточно большой для того, чтобы весь падающий свет во всем используемом для возбуждения диапазоне длин волн поглощался в тонком слое. С другой стороны, раствор должен иметь такую концентрацию красителя, чтобы поглощение во всем диапазоне длин волн спектра флуоресценции было незначительным. При оптимально подобранной концентрации красителя 25 счетчик квантов поглощает все кванты возбуждающего света, и фотодетектор регистрирует кванты флуоресценции, число которых пропорционально числу квантов возбуждения, поскольку используется условие постоянства квантового выхода. Таким образом, фотодетектор регистрирует сигнал, пропорциональный числу квантов падающего на счетчик квантов света независимо от длины волны возбуждения. Поскольку спектр возбуждения должен измеряться при постоянном потоке фотонов, падающих на образец, показания фотодетектора счетчика квантов, на который отводится часть возбуждающего света, используют для коррекции спектров возбуждения. В современных флуориметрах такая коррекция может проводиться автоматически, но, приступая к измерениям, необходимо убедиться, что данная функция активирована в программе измерений. Измерение величины квантового выхода флуоресценции исследуемого соединения является довольно сложной процедурой, поскольку возбуждение люминесценции проводится ограниченным в пространстве пучком параллельного света, а при измерениях интенсивности люминесценции необходимо учесть испускание света во всех направлениях. для этого существуют следующие методы. Суть метода интегрирующей сферы заключается в сравнении суммируемых по поверхности сферы потоков люминесценции исследуемого образца и возбуждающего света, рассеянного эталонным экраном. Так называемая интегрирующая сфера, собирающая свет люминесценции, испущенный образцом во всех направлениях, покрыта изнутри слоем вещества (MgO, светотехнической эмали или специального полимера) с высоким коэффициентом диффузного отражения, одинаковым для всех длин волн, используемых в эксперименте. Она имеет два окна: входное – для ввода возбуждающего света и выходное, связанное с фотоприемником. Другой метод основан на измерении отношения величины энергии, 26 идущей на нагревание люминесцирующего вещества, и величины энергии, поглощенной нелюминесцирующими веществом, обладающим таким же пропусканием. Данный метод претерпел ряд методических усовершенствований. В частности, был предложен калориметрический метод определения квантового выхода люминесценции, в котором в качестве измеряемой величины используется расширение используемого раствора при его нагревании. По отношению изменений объема исследуемого и эталонного растворов при их одновременном облучении определяется доля поглощенного излучения, превращающаяся в тепло. Следует отметить, что при выполнении измерений данным методом необходима высокая степень термостатирования образцов, что, естественно, затрудняет его широкое использование. Проведение абсолютных измерений квантового выхода, не опирающееся на ранее измеренные величины, – непростая задача. Поэтому на практике наиболее удобным флуоресценции является измерение величины квантового выхода методом эталонного красителя, когда используется соединение, для которого квантовый выход ранее уже был измерен с хорошей точностью. Измерения проводят по следующей схеме: 1) Подбирается эталонный краситель, удовлетворяющий следующим условиям: схожесть полос поглощения и испускания с исследуемым соединением; квантовый выход для эталонного красителя должен быть известен для длины волны возбуждения, применяемой в эксперименте; желательно использовать один и тот же растворитель для раствора эталонного красителя и исследуемого соединения. 2) Приготавливаются несколько концентраций раствора эталонного красителя и несколько концентраций исследуемого соединения (если позволяет эксперимент). 3) Для каждого раствора измеряется значение оптической плотности Dλ на длине волны возбуждения флуоресценции. Оптическая плотность всех 27 растворов не должна превышать 0.1. В противном случае проводится разбавление растворов и повторное измерение оптической плотности. 4) Для каждого раствора измеряется значение интегральной по спектру интенсивности испускания флуоресценции Ifluo. Если интенсивность флуоресценции мала (сравнима с погрешностью измерения, то используются только растворы большей концентрации). Для эталонного красителя и для исследуемого соединения желательно иметь не менее 7 значений различных концентраций растворов с оптической плотностью менее 0.1 и приемлемым уровнем флуоресценции. 5) Измеренные значения наносятся на график зависимости интегральной по спектру интенсивности испускания флуоресценции от значения оптической плотности на длине волны возбуждения флуоресценции Ifluo (Dλ). По значениям Ifluo (Dλ) для растворов различной концентрации одного соединения проводится линейная аппроксимация полученных зависимостей Ifluo (Dλ). Определяются тангенсы угла наклона Kstand и Ksample соответственно для эталонного красителя и исследуемого соединения. 6) Значение квантового выхода исследуемого раствора Φ рассчитывается по формуле Φ = Φstand (Ksample / Kstand.), где Φstand. – значение квантового выхода флуоресценции эталонного красителя. 1.7. Факторы, искажающие форму спектра испускания. Коррекция спектров испускания Спектр испускания флуоресценции, зарегистрированный как зависимость от длины волны сигнала с фотоумножителя, должен быть скорректирован для получения истинного спектра. Если монохроматор испускания сканируется при постоянной ширине щели и чувствительности фотоумножителя, зависящей от 28 длины волны, то для определения истинного спектра на основе полученной кривой следует внести поправку на квантовую эффективность фотоумножителя и коэффициент пропускания монохроматора. Для коррекции спектров испускания люминесценции применяется один из следующих трех методов: 1. Метод стандартного флуоресцирующего раствора. Это самый удобный на практике метод коррекции спектров испускания, однако, он работает в ограниченном спектральном диапазоне. Он основан на определении коэффициента измеренного коррекции прибором спектрофлуориметра Iнабл () и путем истинного Iист() сравнения спектров флуоресценции эталонного соединения, выбранного в качестве стандарта. Для эталонного соединения должен быть известен истинный (исправленный) спектр флуоресценции. При использовании данного метода коррекции существенно, чтобы образец не содержал других флуоресцирующих примесей и чтобы флуоресценцию измеряли при тех же самых условиях (длина волны возбуждения, температура, концентрация, тип растворителя, рН и т.д.), для которых известен истинный спектр флуоресценции Iист(). В качестве эталонного соединения для коррекции спектров в области длин волн 400…600 нм часто используется раствор сульфата хинина в водном растворе серной кислоты. Коэффициент коррекции определяется соотношением K() =Iнабл () / Iист() 2. Метод эталонной лампы. Этот метод используется для коррекции спектров испускания в видимой и ближней ИК области. В качестве эталонной лампы используется лампа накаливания с известной цветовой температурой, при которой распределение энергии в спектре излучения абсолютно черного тела совпадает с распределением энергии в спектре лампы. Зная цветовую температуру, по формуле Планка можно вычислить спектральное распределение свечения лампы Iэт(). Для установления 29 чувствительности приемной части флуориметра с помощью диффузно рассеивающего экрана освещают излучением лампы накаливания щель регистрирующего монохроматора. При проведении процедуры коррекции очень важно строго поддерживать постоянство силы тока, проходящего через эталонную лампу, так как при ее изменении меняется и цветовая температура. Используя систему регистрации спектрофлуориметра, записывают зависимость интенсивности эталонной лампы от длины волны Iнабл(). Чувствительность регистрирующей системы (коэффициент коррекции) определяется из соотношения K() =Iнабл () / Iэт() Калибровочные данные для эталонных ламп представляются обычно в единицах энергии на единичный интервал длин волн, иногда – в шкале волновых чисел. Поэтому для калибровки флуориметра в числах квантов на единичный интервал длин волн необходимо провести соответствующие преобразования. 3. Метод диффузного отражения света источника возбуждения. Этот метод хорошо работает для коррекции в УФ диапазоне, где два предыдущих метода имеют ограниченную применимость. Однако он может использоваться, если, во-первых, коррекция спектров возбуждения уже проведена (например, с помощью счетчика квантов), и, во-вторых, флуориметр обладает возможностью регистрации так называемых синхронных спектров флуоресценции, когда оба монохроматора – возбуждения и испускания – сканируются синхронно. С помощью диффузного отражателя свет от источника возбуждения направляется на щель регистрирующего монохроматора. Идеальный диффузный отражатель для этого метода должен отражать небольшой процент падающего на него света с коэффициентом отражения, не зависящем от длины волны во всем спектральном диапазоне проведения 30 коррекции. На практике для этой цели используются матовая кварцевая пластинка, специальный полимер или стеклянная пластинка, покрытая слоем оксида магния или бария. Коэффициент коррекции K() в этом методе определяется синхронным сканированием монохроматоров возбуждения и регистрации как сигнал, записываемый с фотоумножителя Iсинхр() и нормированный на интенсивность возбуждающего света Iвозб() K() =Iсинхр () / Iвозб() Исправленный спектр люминесценции получают делением измеренного спектра люминесценции на коэффициент коррекции, полученный одним из перечисленных выше способов. Контрольные вопросы по теме «ЭЛЕКТРОННЫЕ СПЕКТРЫ СЛОЖНЫХ МОЛЕКУЛ» Поглощение света. Закон Бугера-Ламберта-Бера. Измерение спектров пропускания и оптической плотности. Люминесценция. Виды люминесценции в зависимости от способа возбуждения излучающих частиц. Спектры люминесценции. Спектральные закономерности люминесценции молекул. Основные элементы приборов для люминесцентного анализа. Источники излучения, фильтрация света возбуждения и люминесценции с помощью светофильтров и монохроматоров, типы и материал кювет, схемы регистрации люминесценции, приёмники излучения. Спектры возбуждения и испускания люминесценции, их регистрация и коррекция. Взаимосвязь между спектром возбуждения люминесценции и спектром поглощения. В каких единицах может измеряться интенсивность флуоресценции? Для ответа на этот вопрос сначала надо подумать: 31 что мы называем интенсивностью флуоресценции - интегральную по спектру величину, или спектральную плотность излучения (потока фотонов)? какая применяется нормировка спектров флуоресценции? проведена или нет корректировка на спектральную чувствительность флуориметра? В каких единицах представляют - спектр поглощения - спектр возбуждения флуоресценции - спектр испускания флуоресценции? (возможны несколько правильных ответов на каждый вопрос) Что такое квантовый выход флуоресценции? Какие величины надо измерить для расчета квантового выхода флуоресценции? Закон зеркальной симметрии Левшина В.Л. для спектров поглощения и люминесценции. В какой шкале он будет выполняться? Что отложено по оси абсцисс? Что отложено по оси ординат для спектра поглощения и для спектра испускания люминесценции? Переведите следующие графические зависимости из шкалы длин волн в а) зависимость оптической плотности от длины волны D() оптическая плотность D шкалу волновых чисел: 1 0 200 300 400 500 длина волны , нм 32 в) зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны в спектре возбуждения Iвозб( Список литературы интенсивность флуоресценции Iисп длины волны в спектре испускания Iисп() интенсивность флуоресценции Iвозб б) зависимость интенсивности флуоресценции от 1 0 200 300 400 500 300 400 500 длина волны , нм 1 0 200 Акимов А.И. Фотофизические свойства растворов сложных длина волны , нм органических соединений. Методическое пособие. –М.: Изд-во физического факультета МГУ. 2001. 44с. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. –М.: Эдиториал УРСС. 2001. 896с. Лакович Дж. Основы флуоресцентной диагностики. –М.: Мир, 1986. Левшин Л.В., Салецкий А.М. Люминесценция и ее измерения. –М: Изд-во Моск. Ун-та, 1989. Левшин Л.В., Салецкий А.М. Оптические методы исследования молекулярных система. –М: Изд-во Моск. Ун-та, 1994. Практикум по спектроскопии/ Под. ред. проф. Л.В. Левшина. –М.: Изд-во МГУ, 1976. Шмидт В. Оптическая спектроскопия для химиков и биологов. –М.: Техносфера. 2007. 33 Приложение 1. Правила выживания в химической лаборатории Если вы откупорили что-либо — закупорьте. Если в руках у вас жидкое — не разлейте, порошкообразное — не рассыпьте, газообразное — не выпустите наружу. Если включили — выключите. Если открыли — закройте. Если разобрали — соберите. Если вы не можете собрать — позовите на помощь умельца. Если вы не разбирали — не вздумайте собирать. Если вы одолжили что-либо — верните. Если вы пользуетесь чем-либо — держите в чистоте и порядке. Если вы привели что-либо в беспорядок — восстановите статус-кво. Если вы сдвинули что-либо — верните на место. Если вы хотите воспользоваться чем-либо, принадлежащим другому, попросите разрешения. Если вы не знаете, как это действует, — ради Бога, не трогайте. Если это вас не касается — не вмешивайтесь. Если не знаете, как это делается, — сразу спросите. Если не можете что-либо понять — почешите в затылке. Если все же не поймете, то и не пытайтесь. Если вы горите на работе, постарайтесь, чтобы у вас ничего не загоралось. Если у вас что-либо взорвалось, проверьте, остались ли вы живы. Если вы не усвоили этих правил — не входите в лабораторию! Из книги Воронков М.Г., Рулев А.Ю. О химии с улыбкой, или основы пегниохимии. – Спб.: Наука, 1999. – 220 с. 34
