29 биологические свойства лактобацилл. перспективы
реклама
УДК 576.852:578.2:613.2/.3 БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАКТОБАЦИЛЛ. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ЛАБОРАТОРИЯХ РОСПОТРЕБНАДЗОРА ЭКСПРЕССМЕТОДОВ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ КОНТРОЛЕ КАЧЕСТВА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, БАД К ПИЩЕ, ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ, СОДЕРЖАЩИХ ЛАКТОБАЦИЛЛЫ (АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР) И.В. Соловьева, А.Г. Точилина, И.В. Белова, Н.А. Новикова, Т.П. Иванова, ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Точилина Анна Георгиевна – e-mail: [email protected] В обзоре представлены актуальные данные о биологии бактерий рода Lactobacillus и их использовании в промышленности и биотехнологии. Большое внимание уделено вопросам таксономии этих бактерий, их молекулярно-генетическим свойствам, особенностям метаболизма, условиям культивирования и современным методам идентификации на основе методов амплификации нуклеиновых кислот (MAHK). Ключевые слова: Lactobacillus, методы амплификации нуклеиновых кислот, бактериальный геном, пищевая промышленность. The actual data about Lactobacillus biology and their industry and biotechnology usage can be found in the article. The Lactobacillus taxonomy, molecular properties, individual metabolism, growing conditions and modern identification methods considered in detail in the article. Key words: Lactobacillus, methods nucleic acid amplification, bacterial genome, food industry. ВВЕДЕНИЕ С конца XIX века и до настоящего времени лактобациллы (Lactobacillus spp.) являются объектом научных исследований, так как с древних времен они использовались в качестве стартерных культур для производства кисломолочных продуктов. Лактобациллы широко применяются в различных отраслях биотехнологии и пищевой промышленности. Основная область их использования – производство кисломолочных продуктов, обогащение различных продуктов питания, а также создание пробиотиков в форме лекарственных препаратов и БАД к пище. На данный момент на отечественном рынке представлен широкий ассортимент продуктов и препаратов, содержащих бактерии рода Lactobacillus [1]. Следует отметить также, что бактерии рода Lactobacillus зачастую становятся причиной порчи продуктов питания, как на этапе производства, так и на этапе хранения. Помимо предусмотренного в действующей нормативной документации Федеральной службы Роспотребнадзора контроля безопасности продукта, то есть отсутствия в его составе санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов, и «полезности» – только констатации факта наличия лактобацилл в определенном количестве, в настоящее время назрела необходимость введения качественно нового этапа бактериологического контроля – контроля видовой структуры пробиотических штаммов [2, 3]. 29 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 В течение многих лет для контроля продуктов, содержащих лактобациллы, было регламентировано использование микробиологических методов исследования, не направленных на биохимическую идентификацию лактобацилл, включающих работу с чистыми культурами микроорганизмов и изучение их биохимических свойств, так как это длительные и дорогостоящие методики [3, 4]. Кроме того, микробиологический метод не всегда позволяет точно идентифицировать отдельные виды бактерий рода Lactobacillus ввиду вариабельности их фенотипических свойств и также дифференцировать филогенетически родственные бактерии ввиду идентичности свойств [5]. В связи с этим необходимо дополнение методической базы Федеральной службы Роспотребнадзора достоверными, удобными в использовании, экономически выгодными методами контроля продуктов и препаратов, содержащих лактобациллы, в том числе и методами на основе амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). Это позволит проводить контроль видового состава лактобацилл, заявленного в нормативно-технической документации и рекламируемого производителем, тем самым дополнить контроль «полезности» и пищевой ценности продукта. Материалы, представленные в обзоре, содержат актуальную информацию о биологии лактобацилл, их таксономии на современном этапе и раскрывают возможности молекулярно-биологических методов для решения основной задачи Федеральной службы Роспотребнадзора по сохранению здоровья и благополучия населения страны. Экология лактобацилл. Лактобациллы встречаются в различных экологических нишах, которые отвечают их потребностям – дефицит кислорода, высокая концентрация питательных веществ, ростовых факторов (растворимых углеводов, белковых продуктов распада, витаминов) – почва, эпифитная микрофлора, различные биотопы организма человека и животных. Кислотоустойчивость этих бактерий, как и способность продуцировать большое количество молочной кислоты, можно рассматривать как эволюционно сложившийся механизм приспособления к выживанию в сложных условиях и конкуренции. Это объясняет широкое распространение лактобацилл и успешное освоение ими различных сред обитания [6]. Согласно последним исследованиям, бактерии рода Lactobacillus составляют 0,01–1% от общего числа микроорганизмов эпифитной микрофлоры растений. Столь низкие цифры могут быть связаны с присутствием их на растениях в небольшом количестве (104–105 КОЕ/мл), что затрудняет их индикацию [7]. Кроме того, условия обитания на растениях связаны с выраженным действием экзогенных факторов, таких как ультафиолетовое излучение, механические повреждения растений, что достаточно неблагоприятно для микроорганизмов. Основными видами – представителями эпифитной микрофлоры, т. е. микрофлоры поверхности листьев растений, являются L. plantarum, L. paracasei, L. fermentum, L. brevis и L. buchneri. Некоторые виды лактобацилл, такие как L. plantarum, L. brevis и L. fermentum, входят в состав ризоидной (прикорневой) микрофлоры [8]. Роль лактобацилл заключается в антагонистическом воздействии на фитопатогенные бактерии, закисление среды лактобациллами способствует также предотвращению развития инфекций при механической травме растения. Лактобациллы часто встречаются в почве и сточных водах. Присутствие этих микроорганизмов в почве связано с наличием растительного покрова или растительных остатков, видовой состав отражает эпифитную и ризоидную микрофлору. В сточных водах присутствует большое количество лактобацилл различных видов в количестве 104–105 КОЕ/мл – L. plantarum, L. ruminis, L. sharpeae, L. agilis, L. casei, L. acidophilus, L. farciminis, L. curvatus, L. sakei, L. salivarius и L. coryniformis [9]. Многие из этих видов встречаются в фекалиях человека и животных, их присутствие в сточных водах, по-видимому, является следствием фекального загрязнения вод. Лактобациллы входят в состав резидентной микрофлоры желудочно-кишечного и урогенитального тракта человека, в желудочно-кишечном тракте эти микроорганизмы представлены наиболее широко. Их количественное содержание в полости рта здоровых людей составляет 103–104 КОЕ/мл. Так, L. casei, L. rhamnosus, L. acidophilus, 30 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 L. fermentum и L. salivarius чаще всего выделяются из зубного налета и являются членами многочисленного бактериального сообщества поддесневой микрофлоры [9, 10]. В желудке лактобациллы обнаруживаются в количестве 103 КОЕ/мл, в тощей и подвздошной кишке их количество находится в пределах 102–105 КОЕ/мл. Количественное содержание лактобацилл в фекалях человека мало зависит от возраста и составляет в норме 107–108 КОЕ/мл [11]. В просвете толстой кишки здоровых взрослых людей чаще всего встречаются 14 видов лактобацилл – L. brevis (28%), L. plantarum (19%), L. acidophilus (12%), L. cellobiosis (9,5%) L. casei (9,5%), L. delbrueckii, L. gasseri, L. curvatus, L. salivarius, L. ruminis, L. johnsonii, L. sakei [11, 12]. Бактерии рода Lactobacillus являются неотъемлемым и доминирующим компонентом микробиоценоза влагалища и составляют 95–98% от общего числа микроорганизмов [12]. Во влагалище обнаруживают более 10 видов лактобацилл, в основном L. crispatus (32%), L. jensenii (23%), L. gasseri (5%), L. fermentum (0,3%), L. oris (0,3 %), L. reuteri (0,3%), L. ruminis (0,3%) и L. vaginalis (0,3%) [13, 14]. Показано, что чаще всего встречается ассоциация L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii и L. iners, в то время как разновидности, такие как L. rhamnosus, L. paracasei, L. fermentum и L. plantarum, встречаются реже. Лактофлора колонизирует пристеночную зону слизистых оболочек ЖКТ и влагалища, где формируются микроколонии, образующие биопленку, находящуюся в тесной взаимосвязи с эпителиоцитами, что позволяет их объединить в микробно-тканевые комплексы. Комплексы образуют сами микроколонии и их метаболиты, слизь (муцин), эпителиальные клетки слизистой оболочки и их гликокаликс, а также клетки стромы слизистой оболочки (фибробласты, лейкоциты, лимфоциты, нейроэндокринные клетки, клетки микроциркуляторного русла и др.) [6]. В пределах кишечного микробно-тканевого комплекса существуют сложные трофические и регуляторные связи. Установлено, что в кишечнике существует обмен пищевыми субстратами, как между различными микроорганизмами, так и между индигенными микроорганизмами и кишечным эпителием. Так, известно, что сахаролитические анаэробные микроорганизмы в результате расщепления углеводов, а именно мукополисахаридовов, продуцируемых бокаловидными клетками, и полисахаридов, поступающих с пищей, образуют короткоцепочечные жирные кислоты, которые, в свою очередь, используются эпителиоцитами в качестве важного источника энергии [14]. В микробиоценозе влагалища у здоровых женщин репродуктивного возраста преобладают пероксидпродуцирующие штаммы лактобацилл. Единственным полисахаридом, доступным для потребления влагалищными лактобациллами, является гликоген. Расщепляя гликоген, лактобациллы производят большое количество молочной кислоты, что приводит к закислению среды до 3,8 – 4,4. Проведенные исследования показывают, что лишь редкие штаммы лактобацилл имеют способность к ферментации гликогена, но в присутствии человеческой сыворотки, содержащей гликогеназу, эта способность повышается. Возможно, большинство влагалищных лактобацилл получает доступ к углеводам за счет физиологичного ферментативного распада полисахарида тканями или другими организмами [8]. Лактобациллы играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности влагалища за счет продукции биологически активных веществ, органических кислот и бактериоцинов. Лактобациллы, как один из основных компонентов пристеночной микрофлоры, способны инициировать множество физиологических процессов в организме человека: • участие в метаболизме углеводов, белков, липидов, нуклеиновых кислот и других соединений; • участие в водно-солевом обмене (Na, К, Са, Mg, Zn, Fe, Cu,Mn, Р, С1 и др.), поддержании рН и регуляции анаэробиоза; • участие в обеспечении энергией эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта (за счет короткоцепочечных жирных кислот); • участие в рециркуляции желчных кислот, стероидов и других макромолекул; • продукция биологически активных соединений (летучих жирных кислот, витаминов, дефензинов, гормонов, нейропептидов и др.); • иммуногенная роль (формируют и стимулируют работу всех звеньев иммунной системы); • участие в формировании иммунологической толерантности к пищевым и микробным антигенам; • обеспечение колонизационной резистентности и предотвращение транслокации (защита от патогенных микроорганизмов); • детоксикация экзогенных и эндогенных токсичных субстратов и метаболитов [6]. Бактерии рода Lactobacillus относятся к Империи Caryotes, Надцарству Procaryotes, Царству Bacteria, Отделу Fermicutes, Классу Bacilli, Порядку Lactobacillales, Семейству Lactobacillaceae, Роду Lactobacillus. Типовой вид Lactobacillus delbrueckii, имеющий четыре подвида Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus. Лактобациллы представляют собой грамположительные неспорообразующие палочки правильной формы, 31 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 размером 0,5–1,21,0–10,0 мкм. Как правило, палочки длинные, но иногда имеют вид кокков, обычно в коротких цепочках, в редких случаях подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Морфология микроорганизмов зависит от условий роста, состава питательной среды, температурного режима и возраста культуры. Факультативные анаэробы, микроаэрофилы, слабо растут на воздухе, лучше при пониженном содержании кислорода, некоторые виды растут только в анаэробных условиях. Рост обычно стимулируется добавлением 5% СО2. Колонии на агаризованных средах, как правило, диаметром 2–5 мм, выпуклые, с цельным краем, непрозрачные, непигментированные, в толще среды имеют вид кусочков ваты, белые или желтовато-бурые. Хемоорганотрофы нуждаются в богатых сложных средах. Метаболизм бродильного типа, сахарокластический; по меньшей мере половина углерода конечных продуктов брожения приходится на лактат. Нитраты не восстанавливают, желатину не разжижают, каталазоотрицательные, цитохромов не содержат. Оптимальная температура для роста 30–40°С [6]. Таксономия. Одной из наиболее ранних классификаций лактобацилл является классификация по фенотипическим признакам Orla-Jensen, созданная в 1919 году. Но эта классификация не отражает филогенетические связи внутри группы молочнокислых бактерий [15, 16]. Тем не менее, классификация по Orla-Jensen до сих пор находит свое применение в промышленной микробиологии, где общепринятыми и широкораспространенными являются понятия «мезофильные молочнокислые палочки», то есть лактобациллы с оптимальной температурой роста 30°С, относящиеся к стрептобактериям, и «термофильные палочки» – лактобациллы с оптимумом роста 40°С, относящиеся к термобактериям. На данный момент также существует классификация, созданная в 1986 году на основании изучения биохимических свойств. Так, выделено три группы лактобацилл – группа А (облигатно гомоферментативные лактобациллы), В (факультативно гетероферментативные) и С (облигатно гетероферментативные) [17, 18]. Другая классификация, согласно которой учитывались как филогенетические связи, так и биохимические признаки (1992 год), разделила род Lactobacillus на три группы: группа L. sakei, группа L. casei – Pediococcus, группа Leuconostoc [15, 16, 17]. В 2007 году в результате сравнительного анализа генетических детерминант 16 и 23S рРНК, биохимических свойств и данных о строении пептидогликана клеточных стенок, микроорганизмы, входящие в группу Leuconostoc были реклассифицированы как представители рода Leuconostoc и рода Weissella, а группа L. casei – Pediococcus разделена на род Pediococcus и 6 групп: группа L. casei, группа L. salivarius, группа L. reuteri, группа L. buchneri, группа L. plantarum и группа L. acidophilus, и составляли, вместе с выделенной ранее группой L. sakei, семь нуклеотидных групп. Группы разнородны и включают представителей, отличающихся по соотношению гуаниновых и цитозиновых оснований, с разным типом брожения, различным строением пептидогликана клеточной стенки [18, 19]. По последним данным, вся группа L. sakei, а также L. brevis, L. coryniformis и L. bifermentans, ранее рассматриваемые как уникальные, вошли в состав группы L. casei. Кроме того, выделены две новые группы – группа L. perolens и L. vitulinus-catenaformis. Так, на данный момент выделено восемь филогенетических групп бактерий рода Lactobacillus: группа Lactobacillus acidophilus, ряд видов (L. delbrueckii, L. acidophilus, L. helveticus), входящих в группу, являются промышленно значимыми и используются в пищевой и фармацевтической промышленности. Выделяются из кишечника, полости рта и репродуктивного тракта человека, кисломолочных продуктов и др.; группа L. reuteri включает в себя виды, выделенные из заквасок, из различных биотопов человека и животных, виды, характерные для органических остатков и как возбудители порчи продуктов, включает широко известный промышленно значимый вид – L. fermentum; группа L. casei включает в себя виды, выделяющиеся из растительных останков, сточных вод, испорченных продуктов, в основном мяса и сыров. Виды L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus широко используются в пищевой промышленности в составе стартерных культур для производства кисломолочных продуктов; группа L. plantarum включает в себя виды молочнокислых бактерий пищевого происхождения, к этой группе принадлежит широко известный промышленный штамм L. plantarum 8 RА-3; группа L. buchneri – виды, связанные с ферментацией и порчей пищевых продуктов, виды, выделяющиеся из заквасок и кисломолочных продуктов; группа L. perolens и Paralactobacillus включают в себя виды, связанные с порчей безалкогольных напитков и пива, а также виды, выделяющиеся из растительного сырья; группа L. salivarius – виды, выделенные в основном от животных (L. aviaries – от цыплят, L. hayakitensis и L. equi – от лошади и др.), испорченных продуктов и вин, сточных вод. Группа является высоко гетерогенной, в настоящее время она рассматривается как единая, хотя в будущем, без всякого сомнения, будет разделена на разные роды; группа Lactobacillus vitulinus – catenaformis включает 2 вида рода Lactobacillus: L. vitulinus и L. catenaformis. Вид L. vitulinus был выделен из рубца крупного рогатого скота, его ближайшим родственником является L. catenaformis. Вместе они формируют 32 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 отдельную ветвь, которая филогенетически отстоит довольно далеко от других видов рода Lactobacillus. Недавно установлено, что L. catenaformis и L. vitulinus вместе с бывшими лактобациллами L. minutus и L. rogosae не относятся к молочнокислым бактериям, и их ближайшими родственниками, возможно, являются Catenibacterium, затем Clostridium innocuum, Clostridium ramocum, Erysipelothrix rhusiopathiiae и др. В дальнейшем эти бактерии будут реклассифицированы [6, 20, 21]. Адгезия, антагонизм. Основными биологическими свойствами бактерий рода Lactobacillus, позволяющими им колонизировать различные биотопы организма человека и животных и успешно конкурировать с другими представителями микробного биоценоза, являются адгезивная и антагонистическая активность, устойчивость к высокой кислотности среды. Адгезия – ключевое свойство, определяющее эффективность колонизации. Явление адгезии обеспечивается специфическими органеллами – ресничками, находящимися на поверхности бактериальных клеток, ультраструктура этих органелл – конгломерат белков и полисахаридов. Достаточно хорошо изучены механизмы адгезии гастроинтестинальных лактобацилл. По данным M.H. Coconnier с сотрудниками адгезия L. acidophilus осуществляется с помощью экзополисахаридов клеточной стенки и инициируется promotingфактором – веществом белковой природы, которое является экзометаболитом [22]. У 9 видов молочнокислых бактерий были выделены и изучены mucus-binding domain (MUD) – белковые субстанции, которые обуславливали адгезию к муцину. Наиболее полные домены были обнаружены только у интестинальных молочнокислых бактерий. Последовательности, кодирующие эти пептиды, находились в кластере генов, кодирующих различные внеклеточные компоненты [23]. Антагонистические свойства молочнокислых бактерий обусловлены продукцией органических кислот (молочной, уксусной), перекиси водорода и образованием субстанций, схожих с антибиотиками. По мнению ряда исследователей, именно образование указанных органических кислот из углеводов приводит к снижению рН среды и предотвращает развитие других микроорганизмов [24]. Перекись водорода, которая в процессе роста каталазоотрицательных микроорганизмов аккумулируется в среде, оказывает ингибирующее действие на рост каталазоположительных бактерий за счет сильного окислительного действия на молекулярные структуры их белков [25]. Все микроорганизмы молочнокислого брожения продуцируют антимикробные субстанции белковой природы – бактериоцины. Бактериоцины подразделяются на 2 класса: лантибиотики (I класс) и нелантибиотики (II класс). Лантибиотики – это бактериальные термостабильные полипептиды массой от 3 до 7 кДа, в состав которых входят такие редкие тиоэфирные аминокислоты, как лантионин и метиллантионин. Эти вещества имеют широкий антимикробный спектр действия. Бактериоцины II класса подразделяются на несколько групп: микроцины – термостабильные пептиды низкой массы 1,0–2,0 кДа, высокомолекулярные термолабильные протеины массой от 10 до 5000 кДа и комплексы протеинов, для проявления антимикробной функции которых необходимы углеводная или липидная составляющие [26, 27]. Бактериоцины, выделяемые лактобактериями, чаще имеют узкий спектр действия, который компенсируется способностью этих микроорганизмов синтезировать несколько антимикробных субстанций, принадлежащих к разным классам и обладающих разным спектром активности. По признаку бактерии-мишени бактериоцины лактобацилл разделяют на две группы. Представители первой группы характеризуются узким спектром антибактериального действия – вызывают гибель организмов, близких к организму-продуценту. В эту группу входят лактоцин В и F27, амиловорин, педиоцин N5P, теpмофилин А, курвацин А, амиловорин L471, энтерококцин [26]. Бактериоцины, относящиеся ко второй группе, ингибируют рост многих видов грамположительных микроорганизмов, в том числе Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Clostridium sporogenes, Staphylococcus aureus, Pediococcus acidilactici, Bacillus spp., Enterococcus faecalis. К бактериоцинам второй группы относятся: педиоцин А, ацидоцин В, диацетин В1, курвацин FS47, лактицин 3147, плантарицин С, энтерококцин, саливарицин, низин, саркацин 674, мутацин. [29]. Способность к выработке бактериоцинов – штаммовая характеристика, но все виды рода Lactobacillus включают штаммы, способные продуцировать какие-либо бактериоцины [25]. Процесс синтеза бактериоцинов контролируется и синхронизируется межклеточными коммуникативными взаимодействиями («чувство кворума») и является механизмом, позволяющим изменять плотность клеточной популяции. Метаболизм сахаров. Все молочнокислые бактерии используют в качестве источника энергии углеводы и расщепляют их с образованием молочной кислоты. Молочнокислые бактерии способны только к брожению, не содержат гемопротеинов, таких как цитохромы и каталаза [28]. Гомоферментативные молочнокислые бактерии (группа А) при сбраживании глюкозы образуют практически одну молочную кислоту (90% всех продуктов брожения). Катаболизм глюкозы проходит по фруктозо-1,6- 33 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 бисфосфатному пути (гликолиз, или путь ЭмбденаМейерхофа-Парнаса). Эти бактерии обладают всеми необходимыми ферментами, включая альдолазу. От стереоспецифичности лактатдегидрогеназы и наличия лактатрацемазы зависит, какой продукт образуется – D(-), L(+) или DL-молочная кислота. Гомоферментативные молочнокислые бактерии не способны сбраживать пентозы. Факультативные гетероферментативные молочнокислые бактерии (группа В) способны сбраживать глюкозу по фруктозобисфосфатному пути, а при дефиците глюкозы – пентозы по пентозофосфатному пути с образованием уксусной, молочной кислоты, муравьиной кислоты и этанола. Облигатно гетероферментативные лактобациллы (группа С), у которых нет главных ферментов фруктозобисфосфатного пути – альдолазы и триозофосфат–изомеразы сбраживают глюкозу по пентозофосфатному пути с образованием молочной, уксусной кислот и СО2 и пентозу с образованием молочной и уксусной кислот [6]. За рубежом разработана диагностическая тест-система API 50 CH, «bioMеrieux», которая в основном и используется у нас в стране для идентификации лактобацилл [29]. Эта система предназначена для исследования углеводного метаболизма и состоит из 50 тестов. В сочетании со средой API 50 CHL позволяет проводить идентификацию бактерий рода Lactobacillus в течение 48 часов. В настоящее время для идентификации лактобацилл и бифидобактерий широко применяется тест-система API 20 А, но по набору тестов она позволяет идентифировать только два вида лактобацилл – L. acidophilus, L. fermentum. Также для идентификации лактобацилл используют набор HiCarbohydrateTM Kit «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», который содержит 36 тестов. Стандартные тест-системы дороги, поэтому их использование не всегда экономически оправдано. Специалистами Федеральной службы Роспотребнадзора эти тест-системы не используются, так как это не регламентировано в соответствующих нормативных документах. Трудности вызывает и дифференциация филогенетически близких видов лактобацилл, таких как L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus. Задача осложняется схожестью их сахаролитических свойств, значительной вариабельностью фенотипических признаков [30]. Характеристика генома Lactobacillus spp. На данный момент определена полная нуклеотидная последовательность генома и получены геномные карты для основных представителей рода Lactobacillus. Основные характеристики генома данных микроорганизмов представлены в таблице. Нуклеоид бактерий рода Lactobacillus представлен кольцевой замкнутой хромосомой, размером 1.993.564– 3.308.274 н.о., включает 2.864–3.052 генов. Содержание GC–оснований колеблется от 34.5% у L. jonsonii до 44.5% у L. plantarum. ТАБЛИЦА. Содержание GC-пар, % Длина хромосомы, н.о. Количество генов Источник Краткая характеристика геномов различных видов микроорганизмов молочнокислого брожения Lactobacillus plantarum WCFS1 Lactobacillus sakei 23K Lactobacillus johnsonii NCC533 Lactobacillus acidophilus NCFM Кольцевая замкнутая Кольцевая замкнутая Кольцевая замкнутая Кольцевая замкнутая 44,5 3.308.274 3009 [27] 41,3 1.884.661 1883 [96] 34,6 1.992.676 1818 [97] 34,7 1.993.564 1862 [33] Lactobacillus salivarius sp. salivarius USS118 Кольцевая замкнутая 32,9 1.827.111 1536 [98] Микроорганизм Тип хромосомы Общее количество генов в геноме Lactobacillus plantarum WCFS1 – 3.052. Установлены биологические функции 2.120 генов (70%), 39 генов идентифицированы как псевдогены. Геном содержит 4 рРНК оперона, которые распространены равномерно по всей хромосоме и практически не различаются по нуклеотидному составу. В геноме присутствуют 62 гена, кодирующих тРНК [27]. По данным научной литературы геном лактобацилл содержит определенное количество внехромосомной ДНК: инсерционные последовательности и плазмиды различной молекулярной массы. Так, в геноме одного из представителей рода Lactobacillus – L. acidophilus NCFM – выявлены 3 уникальные последовательности, которые могут быть расценены как потенциально автономные модули, несущие характеристики профагов и плазмид, а также гены интеграз, специфичных для фагов [31, 32]. Штаммы рода Lactobacillus содержат разное количество криптических плазмид, различных по молекулярной массе [33, 34, 35, 36]. Некоторые штаммы не несут плазмид – L. acidophilus NCFM, у других их количество достигает шести – L. plantarum WCFS2 [27]. В настоящее время молекулярно-генетические свойства бактерий молочнокислого брожения детально изучены, основные результаты научных исследований собраны в международной базе данных GenBank/EMBL. Это позволяет осуществлять индикацию и идентификацию лактобацилл с использованием молекулярно-генетических методов. Бактерии рода Lactobacillus в пищевой промышленности. Продукты питания, ферментированные лактобациллами – основные источники этих бактерий для человека. Бактерии рода Lactobacillus широко применяются в различных отраслях пищевой промышленности – молоко- и 34 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 мясоперерабатывающей, хлебопекарной, винодельческой и др. В состав заквасок, использующихся в хлебопекарной промышленности, входят L. fermentum, L. plantarum, L. delbrueckii, L. acidophilus, L. casei, L. farciminis, L. homohiochii, L. brevis, L. buchneri, L. hilgardii и L. sanfrancisco [37, 38, 39, 40]. В хлебопекарном производстве закваски используют для коррекции хлебопекарных свойств основного и дополнительного сырья, улучшения качества и предотвращения микробиологического инфицирования готовых изделий. Они представляют собой комбинации и ассоциации штаммов различных видов микроорганизмов, могут применяться в жидком, сухом и пастообразном состоянии. Добавление лактобацилл к традиционным закваскам на основе дрожжей улучшает брожение теста, аромат и срок годности изделий и придает им дополнительную пищевую ценность [39]. Для переработки растительного сырья, в частности, квашения капусты, заготовления соленых огурцов, помидоров и т. п., также используются лактобациллы [38]. В результате интенсивного молочнокислого брожения содержание молочной кислоты в продукте повышается до 1,5–2%. Молочная кислота является важнейшим консервирующим веществом и обуславливает стойкость готового продукта. Добавки на основе лактобацилл широко используются при производстве широкого ассортимента копченых и варено-копченых мясных продуктов. Использование этих микроорганизмов в составе стартовых культур позволяет сократить производственный цикл за счет сокращения созревания мышечной ткани, времени ферментации, повышает выход готового продукта [40]. Эффективно применяются стартерные культуры, содержащие L. plantarum, L. cellobiosus, L. reuteri и L. fermentum [41, 42]. Разрабатываются новые комплексные закваски на основе других видов лактобацилл, таких как L. pentosus и L. curvatus [43]. Другое направление в мясной промышленности – применение бактериоциногенных лактобацилл для биоконсервации готовых продуктов, хранящихся в условиях модифицированной атмосферы или под вакуумом. Для этих целей используют штаммы видов L. plantarum, L. sakei и L. sakei subsp. carnosus [44, 45]. Роль молочнокислых бактерий в винодельческой промышленности заключается в возбуждении яблочномолочного брожения – перехода яблочной кислоты в молочную на заключительном этапе брожения вина. Ведущая роль в этом процессе принадлежит Oenococcus oeni, а также гомо- и гетероферментативным лактобациллам: L. kunkeei, L. brevis, L. curvatus, L. plantarum, L. frumenti, L. pentosus [46, 47]. Яблочно-молочное брожение является необходимым для приготовления вин, имеющих высокую кислотность (рейнские вина, бордоские красные, херес и др.). Развитие этого вида брожения в винах с низкой кислотностью, напротив, приводит к порче вин и обуславливает их пороки [46]. Наиболее активно бактерии рода Lactobacillus используются для производства кисломолочных продуктов. Все кисломолочные продукты обладают высокой питательной ценностью и легко усваиваются, в основном за счет того, что казеин и жиры молока подвергаются действию эстераз и протеолитических ферментов молочнокислой флоры и гидролизуются до пептидов, аминокислот и свободных жирных кислот. Развитие бактерий закваски в молоке приводит к его обогащению ценными метаболитами: лактатом, биотином, ниацином, тиамином, фолиевой кислотой, бактериоцинами. Выраженная способность к кислотообразованию, интенсивная выработка экзаполисахаридов молочнокислыми кокками и некоторыми термофильными лактобациллами (Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Str. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus) влияет на скорость сквашивания молока, образование плотного сгустка и обуславливает технологичность этих культур. Поэтому эти микроорганизмы являются основой или важным компонентом заквасок для получения различных кисломолочных продуктов [48]. В промышленной микробиологии общепринятым является разделение микроорганизмов стартерных культур по оптимальной температуре роста и, соответственно, сквашивания молока: мезофильные кокки (оптимальная Tроста = 30–35°С), термофильные кокки и лактобациллы (оптимальная Tроста = 40–45°С). Мезофильные лактобациллы, такие как L. casei, L. rhamnosus, чаще всего используют как дополнительный заквасочный компонент для обогащения кисломолочных напитков и йогуртов. Мезофильные кокки (Lactococcus spp.) используются для производства сметаны, творога, простокваши и некоторых сыров. На основе термофильных латобацилл готовят «мечниковскую» простоквашу, йогурт, ацидофилин, сыры с высокой температурой второго нагревания и др. [48, 49]. Большую долю среди кисломолочных продуктов составляют продукты смешанного брожения, представленные в основном национальными продуктами – кефир, кумыс, тан и др. В состав закваски продуктов смешанного брожения (кисломолочного и спиртового) наряду с лактобациллами входят и другие бактерии молочнокислого брожении (Str. thermophilus, Lactococcus sp., Enterococcus durans, Leuconostoc sp.), дрожжи (Saccharomyces sp., Dekkera sp.a, Kluyveromyces sp. и др.) и уксуснокислые бактерии (Acetobacter sp.) [50, 51]. 35 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 В последние десятилетия популярностью пользуются пищевые продукты, дополнительно обогащенные пробиотическими культурами – «биопродукты». Первыми «биопродуктами» являются кисломолочные продукты «Молочный лактобактерин», «Кисломолочный бифидумбактерин» и «Бифилакт». «Молочный лактобактерин» был создан в Нижегородском НИИЭМ (тогда Горьковском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии) под руководством академика РАМН И.Н. Блохиной. Основой препарата было стерилизованное коровье молоко, закваска состояла из двух штаммов лактобацилл – L. fermentum 90 TC-4 и L. plantarum 8-RA-3. Была разработана инструкция по изготовлению (1977 год) и методические рекомендации по применению продукта в педиатрической практике. [52]. Продукт был разрешен к применению в августе 1977 года и с высокой эффективностью использовался на территории города и области в инфекционных и соматических детских стационарах в комплексе лечебно-реабилитационных мероприятий, в организованных детских коллективах для профилактики формирования хронической патологии у детей. «Кисломолочный бифидумбактерин» разработан в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского в 1987 году [53]. Продукт приготавливался из стерилизованного коровьего молока и бактериальной закваски, содержащей штаммы B. longum 379, B. bifidum 1 или B. bifidum 791. В настоящее время «Кисломолочный бифидумбактерин» выпускается промышленными предприятиями. Кисломолочный «Бифилакт» был разработан Горьковским НИИЭМ совместно с МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Продукт вырабатывается путем сквашивания стерильного коровьего молока комплексной закваской, включающей штаммы лакто- и бифидобактерий (B. longum 379 и B. bifidum 1 или 791, L. fermentum 90 TC-4 и L. plantarum 8-RA-3). Была разработана технология приготовления, инструкция по приготовлению на молочных кухнях и применению [54]. На данный момент выпускается рядом промышленных компаний. Бактерии рода Bifidobacterium также активно используются для обогащения молочных продуктов, причем на российском рынке имеется тенденция к увеличению объема совокупного спроса (80%) именно бифидосодержащих биопродуктов [1]. Первым биопродуктом, поступившим в массовое производство в России, является кефир «Бифидок». Рецептура кефира была разработана ЗАО «Партнер», в продажу продукт впервые поступил в 1992 году. За разработку технологии производства бифидосодержащих кисломолочных продуктов функционального питания серии «Бифидок®» ЗАО «Партнер» награждено почетной медалью Российской академии естественных наук «За практический вклад в укрепление здоровья нации». Российской академией медико-технических наук за работы в области науки о питании ЗАО «Партнер» присуждена премия А.А. Покровского. Сейчас кефир «Бифидок®» выпускается многими предприятиями по всей стране. На данный момент появилась тенденция «возвращения к жизни» традиционных национальных биопродуктов. Примером может служить био-овсяный продукт «VELLE», приготовленный с использованием овса, овсяных отрубей и комплексной пробиотической закваски. Другим источником пробиотических лактобацилл являются пробиотики – лекарственные препараты и БАД к пище. Различают пробиотики на основе лиофильно-высушенных штаммов и жидкие формы пробиотиков. По характеру использованной основы выделяют жидкие продукты на основе молока («Наринэ», «Трилакт») и на основе гидролизатов («Нормофлорины», «LB-комплекс»). Каждая из форм имеет свои преимущества и недостатки. К преимуществам сухих форм можно отнести длительный срок хранения, что удобно для реализации пробиотика, в том числе и через аптечную сеть. Основными преимуществами жидких форм являются физиологическая активность бактерий, не подвергавшихся стрессу (лиофильное высушивание), сохранность белков-адгезинов и ценных бактериальных метаболитов и др. На российском рынке можно выделить несколько крупных производителей пробиотиков – ЗАО «Партнер» (Московская обл.), ЗАО «Вектор-биальгам» (Новосибирская обл.), ЗАО «Био-веста» (Новосибирская обл.), ВНИИ молочной промышленности (г. Москва), НПО «Бифилайф» (г. Ковров) и др. Методы индикации и идентификации бактерий рода Lactobacillus. Среди методов, применяющихся для индикации и идентификации лактобацилл, необходимо выделить культуральные методы, то есть методы, требующие обязательного этапа выделения чистой культуры микроорганизма, и культурально независимые методы, позволяющие проводить исследования, минуя этот этап. Культуральные методы исследования (методы, предполагающие выделение чистой культуры микроорганизма). Для культивирования бактерий рода Lactobacillus с помощью классической микробиологии используются среды, богатые питательными веществами (дрожжевой экстракт, гидролизат обрата молока, пептон, Твин-80), различными солями, в том числе ацетатом натрия и др. и имеющие низкий уровень рН (4,5–6,2). Из специальных питательных сред наиболее широкое распространение получила среда МРС (MRS) – среда de Man, Rogosa, Sharp [55]. Среда богата питательными веществами и ростовыми факторами, содержит дрожже- 36 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 вой и мясной экстракты, глюкозу, пептон, ацетат натрия, цитрат аммония и Твин-80 – источник жирных кислот, необходимых для метаболизма лактобактерий. Кислотность среды – 6,2–6,4. Среда МРС может применяться как для работы с пробиотическими лактобациллами, так и для выделения этих микроорганизмов из продуктов питания и природных биотопов [56, 57, 58]. При выделении лактобацилл из внешней среды применяют селективные среды: Среда LBS, в которой ацетат натрия и цитрат аммония подавляют рост бактерий рода Streptococcus, плесневых грибов и также ограничивают рост подвижных микроорганизмов. Уксусная кислота снижает значение рН, что препятствует росту многих бактерий, способствуя росту лактобацилл. Эту среду рекомендуют для выделения и подсчета лактобактерий в пищевых продуктах [57]. Среда SL, в которой триптоза или гидролизат казеина и дрожжевой экстракт обеспечивают присутствие азотистых веществ, витаминов группы В и микроэлементов, необходимых для роста лактобактерий. Глюкоза, арабиноза и сахароза являются ферментируемыми углеводами. Твин80 – источник жирных кислот. За счет высокой концентрации ионов ацетата подавляется рост бактерий рода Streptococcus и Carnobacterium, но некоторые виды родов Leuconostoc, Pediococcus и Bifidobacterium способны расти на данной среде. Агар SL используют в качестве селективной среды для выращивания лактобактерий орального и фекального происхождения [58]. Среда LS используется для выращивания и дифференциации лактобактерий и стрептококков по культуральным свойствам, восстановлению ТТХ (трифенилтетразолия хлорида) и казеиновой реакции. Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus образует красные шероховатые (ризоидные) колонии с зоной помутнения, а Streptococcus thermophilus – красные гладкие колонии с зоной просветления [8]. Также для разделения культур лактобацилл и стрептококков при контроле производства йогурта используют Агар Ли с бромкрезоловым пурпурным [8]. Стрептококки растут первыми, образуя характерный сливочный аромат, обусловленный синтезом диацетила и подобных метаболитов. Кроме того, они снижают окислительно-восстановительный потенциал среды, позволяя размножаться лактобактериям, которые, в свою очередь, продуцируют вещества, стимулирующие рост стрептококков. Типичным является появление резкого запаха ацетальдегида. Карбонат кальция, входящий в состав, наряду с фосфатом калия, придают среде буферные свойства, препятствуя резкому сдвигу рН в связи образованием молочной кислоты. Бромкрезоловый пурпурный является индикатором рН, который желтеет в кислой среде и окрашивает в желтый цвет колонии стрептококков. Для культивирования гетероферментных лактобактерий и молочнокислых стрептококков, вызывающих порчу (позеленение) мяса и мясных продуктов, применяют бульон и агар APT (All Purpose Tween-80) с тиамином, предложенную Evans и Niven. Эта среда пригодна также для санитарно-микробиологического исследования мясных консервов, квашеной капусты, фруктовых соков и мясных изделий [10]. Созданы также дифференциально-диагностические среды для идентификации отдельных видов лактобацилл, например, среда для идентификации L. plantarum [60]. Присутствие антибиотика из группы фторхинолонов ингибирует рост посторонней микрофлоры и индигенных лактобацилл кишечника человека. При выращивании на этой среде колонии L. plantarum окрашиваются в яркожелтый цвет. После выделения и подращивания следует этап идентификации лактобацилл до вида. Идентификация проводится с использованием стандартных тест-систем API50CH производства «bioMerieux», набора HiCarbohydrateTM Kit «HiMedia Laboratories Pvt. Limited». Один из вариантов газо-жидкостной хроматографии также предполагает выделение чистой культуры для определения вида лактобацилл. Метод основан на изучении профиля жирных кислот бактерий. Он предполагает использование обширных баз данных, содержащих сведения о составе жирных кислот нескольких тысяч штаммов бактерий [61]. Культурально-независимые методы исследования (не предполагающие выделения чистой культуры микроорганизма). Метод газовой хроматографии-масс спектрометрии (ГХ-МС). В настоящее время альтернативу бактериологическим исследованиям составляют химические методы дифференциации микроорганизмов и, в частности, газовая хроматография (ГХ) в сочетании с масс-спектрометрией (ГХМС). Метод ГХ-МС основан на определении компонентов бактериальных клеток, появляющихся в результате их естественного отмирания или атаки компонентов иммунной системы. В качестве маркеров используют минорные липидные компоненты мембран микробов. Подобные вещества содержатся только в липидах микроорганизмов и не содержатся в среде их обитания. Поэтому, имея достаточно чувствительный метод анализа их можно обнаружить и измерить количественно непосредственно в среде обитания, избежав необходимости предварительно культивировать их на искусственных средах [61]. Существо анализа состоит в прямом извлечении с помощью химической процедуры высших жирных кислот из образца, подлежащего исследованию, их разделения на 37 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализа состава в динамическом режиме на массспектрометре. Метод ГХ-МС на данный момент применяется для изучения микробиоценоза кишечника при различных патологиях, а также микробиоты полости рта и влагалища [62, 63]. Применение этого метода в биотехнологии ограничено тем, что он позволяет идентифицировать микроорганизмы в основном до рода, а также сложностью интерпретации результатов. Например, маркером для определения лактобацилл по разным данным является цис-вакценовая кислота (цис-11-октадекановая) или метиленоктадекановая кислота (лактобацилловая) [64]. Но цис-вакценовая кислота является частым компонентом различных природных объектов, а лактобацилловая встречается также у бактерий рода Pseudomonas и у многих представителей Enterobacteriaceae, что говорит о неспецифичности метода и субъективности оценки полученных результатов [65]. Индикация лактобацилл с использованием бактериологических экспресс-анализаторов. В последние годы все больше лабораторий Роспотребнадзора используют в работе бактериологические экспресс-анализаторы – приборы для полностью автоматизированного обнаружения микробной контаминации и роста различных микроорганизмов. Наиболее распространенные модели – «Бак Трак 4100», «БиоТрак 4250», (SY-LAB Gerate GmbH, Австрия), «РЭБИТ» (SYRUS SYSTEMS Ltd, США), «ТEMPO» (bioMerieux). Принцип действия автоматических анализаторов основан на регистрации относительного изменения полного электрического импеданса питательной среды в пробе или на принципе флуоресценции. В первом случае лежит измерение изменения электрической проводимости питательной среды под воздействием роста микроорганизмов, во втором случае, как правило, используется флуоресцентный индикатор и проводится анализ изменения уровня флуоресценции в пробе. Использование подобных анализаторов оправдано при наличии большого потока анализируемых проб. К сожалению, в настоящее время программное обеспечение анализаторов позволяет идентифицировать до вида только некоторых представителей рода Lactobacillus, вызывающих порчу пищевых продуктов. Определение других видов лактобацилл не предусмотрено, поскольку они не являются санитарно-показательными микроорганизмами [3]. Методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) и другие молекулярно-генетические методы для контроля качества пищевых продуктов Методы, основанные на особенностях нуклеотидного состава ДНК микроорганизмов, успешно используются в микробиологии для решения целого ряда задач: уточнения таксономического положения микроорганизма, детекции, видовой идентификации и внутриштаммового типирования. Определение нуклеотидного состава ДНК и структуры отдельных генетических детерминант, а также сравнение нуклеотидных последовательностей геномов позволяет наиболее точно определить таксономическое положение микроорганизма и его филогенетические связи. Именно молекулярно-биологические методы составляют базу геномного фингерпринтинга – комплекса молекулярно-генетических методов, позволяющих идентифицировать и дифференцировать микроорганизмы. МЕТОДЫ ИНДИКАЦИИ Метод молекулярного зондирования (саузерн-блот) ранее активно использовался для детекции вирусов и бактерий [19]. Зонд - фрагмент ДНК или РНК строго специфичный для генома выявляемого объекта. О наличии в исследуемой пробе искомого микроорганизма судят по тому гибридизуется или не гибридизуется зонд с нуклеиновыми кислотами пробы. Для детекции зонда, вступившего в гибридизацию, применяют радиоактивные (Р32, Р33) или нерадиоактивные метки (дигоксигенин, биотин, флуоресцентные метки) с последующей автографией (для радиоактивных меток) или обработкой конъюгатом (антитело / фермент) и хромогенным раствором. Молекулярное зондирование на современном этапе применяют в составе комплексных методик, таких как гибридизация in situ, риботипирование и др. [19]. Гибридизация in situ позволяет проводить обнаружение искомого микроорганизма непосредственно в изучаемом субстрате. Для этого используют зонды с флуоресцентной меткой, которая после завершения процесса гибридизации регистрируется в флуоресцентном микроскопе. Достоинством метода является высокий порог аналитической чувствительности – возможность детекции единственной клетки микроорганизма в пробе субстрата. На настоящий момент существует два метода для обнаруженияч микроорганизмов с использованием молекулярной гибридизации in situ: PCR in situ (PI-PCR) и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) [66]. Метод PI-PCR. В этом случае происходит амплификация специфической нуклеотидной последовательности интактных клеток с видоспецифичными олигонуклеотидными праймерами, содержащими флуоресцентную метку. Этот метод чаще применяют при анализе эукариотических клеток, но может быть адаптирован и для прокариот. В случае работы с прокариотами метод применялся для визуализации отдельных клеток интересующего микроорганизма в окружающей среде. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием стеклянных пла- 38 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 стинок, на которых были иммобилизованы клетки бактерий. Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет визуализировать единственную клетку микрооганизмамишени в изучаемом субстрате [67]. Метод флуоресцентной гибридизация in situ (FISH) является альтернативой вышеописанному методу. В отличие от метода PI FISH не имеет этапа амлификации, а происходит гибридизация нуклеиновых кислот клеток, фиксированных на стеклянных пластинах, со специфическим олигонуклетидным зондом с флуоресцентной меткой. В процессе фиксации на пластинах происходит дестабилизация клеточной стенки, что позволяет коротким последовательностям зонда проникнуть внутрь клетки и взаимодействовать с клеточной ДНК. Использование неспецифичных последовательностей на основе гена 16S рРНК позволяет производить подсчет общего числа клеток в субстрате, причем точность этого метода в десятки раз превышает точность стандартных микробиологических методик [68]. Метод FISH эффективен для изучения лактофлоры различных биотопов организма человека и внешней среды. Кроме того, комбинация методов FISH и PI-PCR может позволить проводить изучение уровня экспрессии генов различными микроорганизмами микрофлоры человека в условиях in situ [66]. Полимеразная цепная реакция имитирует природный процесс воспроизведения (удвоения) ДНК – репликацию, происходящую на матричной основе (по принципу комплементарности) с участием фермента ДНКполимеразы. Но если во время репликации удваивается вся ДНК, то при ПЦР происходит многократное копирование (воспроизведение, амплификация) лишь интересующего исследователя специфического, небольшого фрагмента, расположенного между двумя праймерами [69]. Метод ПЦР широко применяется исследователями для индикации бактерий рода Lactobacillus. Для дизайна родо- и видоспецифичных праймеров чаще всего используют генетические детерминанты 16S и 23S рРНК и гипервариабельный интерспейсерный регион (ITS), разделяющий вышеназванные локусы [70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77]. Для работы с микроорганизмами молочнокислого брожения используются такие варианты ПЦР, как мультиплексная ПЦР, гнездовая ПЦР (TAP–ПЦР) и реал-тайм ПЦР [78]. При мультиплексной ПЦР в реакции используется несколько пар праймеров для одновременной амплификации нескольких детерминант в одной пробирке. Недостатком метода является сложность подбора условий для оптимальной работы всех праймеров, входящих в реакцию и, соответственно, для максимально эффективной амплификации. При одновременном выявлении нескольких достаточно филогенетически близких видов микроорганизмов может быть применен следующий вариант: один праймер является общим для всех и по одному дифференцирующему праймеру для каждого вида. При работе с лактобациллами и бифидобактериями чаще всего используют вариант мультиплексной ПЦР, при котором общим (родоспецифичным) является обратный праймер (реверс), а прямые праймеры (форварды) – видоспецифичны [79, 80, 81]. Принцип гнездовой ПЦР заключается в последовательном использовании двух пар праймеров – внешней и внутренней. После использования первой пары праймеров продукт амплификации переносят в другую пробирку с внутренней парой праймеров. Использование такой модификации обеспечивает высокую чувствительность реакции (до 1 копии генома) и широко используется для создания тест-систем для выявления M. tuberculosis, M. bovis, Y. pestis и др. [82]. Недостатком этого метода является риск контаминации при работе с продуктом первого раунда реакции. Но при условии использования современных ламинарных боксов с вытяжной вентиляцией риск контаминации сводится к минимуму. ПЦР позволяет проводить индикацию и идентификацию лактобацилл в различных пробах, включая биотопы организма человека и животных, объекты внешней среды, продукты питания и др. [83]. Метод ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) разработан уже более 10 лет назад [84]. Принципиальной особенностью этого метода является возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения реакции. Метод позволяет проводить количественные измерения ДНК и РНК искомой мишени, так как кинетика накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий исследуемой матрицы. В отличие от других методов количественного определения ДНК матрицы в пробе не требует дополнительных манипуляций, связанных с раститровкой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе ПЦР ампликонов, которые усложняют постановку анализа и могут приводить к появлению ложноположительных результатов. Подобный подход позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Метод ПЦР в реальном времени является оптимальным для характеристики и контроля за ростом микробной популяции. Так, в работе Z. Yu, с соавторами описан опыт по контролю динамики роста штаммов продуцентов пробиотика для ветеринарии. Было установлено, что на всех стадиях брожения бактерии Lactobacillus acidophilus, 39 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 Bifidobacterium bifidum и Bacillus licheniformis присутствовали в высоких титрах. [85]. Определение содержания ГЦ-оснований в тотальной геномной ДНК микроорганизма – классический метод, позволяющий установить его таксономическое положение и степень филогенетического родства в пределах отдельной группы. Классический вариант прямого определения соотношения азотистых оснований в ДНК методом хроматографии на бумаге длителен и трудоемок и в настоящее время в практических исследованиях используется редко. Наибольшее распространение в нашей стране получил метод тепловой денатурации, разработанный в Нижегородском НИИЭМ [18]. Определение процента GC-пар имеет место в исследованиях, посвященных бактериям молочнокислого брожения, в основном для уточнения их таксономии и построения филогенетического древа [15, 18]. Секвенирование гена 16S рРНК. С целью установления таксономического положения микроорганизма и филогенетических связей внутри таксона используют полное секвенирование отдельных генов. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК позволяет выявить филогенетические связи между крупными таксонами, например между родами Lactobacillus и Bifidobacterium. Для изучения филогении внутри рода рационально использовать сиквенс участка генома, разделяющего генетические детерминанты 16S и 23S рРНК, так называемого интерспейсерного (ITS) региона, высоко вариабельного в рамках отдельных таксонов [32]. Анализ последовательности 16S рРНК позволил реклассифицировать некоторые штаммы пробиотических лактобацилл [86, 87]. В другом случае этот метод использовался для оптимизации созданных ранее видоспецифичных праймеров для индикации L. plantarum 8 RA-3, L. fermentum 39 и L. casei 583. Получение информации о нуклеотидных последовательностях участка гена 16S рРНК позволило внести изменения в последовательность праймеров и повысить их специфичность [5]. Для межвидовой дифференциации и изучения штаммовых характеристик лактобацилл применяют молекулярно-генетические методы, основанные на изучении особенностей строения тотальной ДНК посредством применения рестрикционных и гибридизационных технологий, ПЦР и изучения электрофоретической подвижности. Пульс-гель электрофорез. Данный метод позволяет разделить большие фрагменты ДНК в агарозном геле с использованием электрического поля [95]. Суть метода заключается в обработке геномной ДНК редкощепящими рестриктазами, разделяющими геном на несколько (5–50) крупных фрагментов, которые затем разгоняют в агарозном геле. Особенность метода заключается в том, что ввиду крупного размера фрагментов все манипуляции (выделение ДНК из клеток), обработка рестриктазами осуществляются непосредственно в агарозных пластинах. Фрагменты, полученные после рестрикции на агарозных пластинах, вновь помещаются в гель и затем разделяются с помощью переменного электрического поля. Метод используют для фингерпринтинга изолятов бактерий [32]. Метод пульс-гель электрофореза является «золотым стандартом» типирования микроорганизмов и обладает очень высокой разрешающей силой, позволяет распознать перестройки генома по типу инсерции, делеции, что ценно для внутриштаммовой характеристики. С помощью компьютеризированной системы сканирования гелей стали возможными создание банка данных профилей PFGE для разных микроорганизмов и работа с ними [66, 88]. Этот метод применялся для внутривидового типирования L. rhamnosus и L. casei. В работе был использован комплекс молекулярно-генетических методов, но наибольшую чувствительность продемонстрировал именно метод пульс-электрофореза. С помощью этого метода получены штаммоспецифичные фореграммы для бактерий вида L. casei и L. rhamnosus [88]. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Анализ сайтов рестрикции является эффективным способом определения вариаций последовательности ДНК. Метод основан на сравнении количества и размеров фрагментов, образующихся в результате гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции, разрезающими ДНК в специфичных участках из 4–6 нуклеотидов. Благодаря высокой специфичности гидролиза, его результаты воспроизводимы – каждый раз образуется определенное количество фрагментов с определенными размерами. Эти фрагменты разделяются электрофорезом в агарозном геле и визуализируются после окраски бромидом этидия. Метод ПДРФ применяют для исследования штаммового состава микроорганизмов рода Lactobacillus и Bifidobacterium в различных биотопах организма человека [89, 90, 91, 92]. Чаще используется модификация этого метода – метод ПЦР-ПДРФ гена 16S рРНК (16S ARDRA, 16S рРНК RFLP Gene). При этом участок генома, кодирующий 16S рРНК, амплифицированный с использованием специфичных праймеров, обрабатывают мелкощепящими рестриктазами. Так, в работе Z. Yu с соавторами этот метод был применен для изучения разнообразия лактофлоры домашних кисломолочных напитков, характерных для стран Азии [85] . Риботипирование – метод геномного фингерпринтинга, представляющий собой наиболее распространенный на данный момент вариант саузерн-блот анализа. Для 40 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 выполнения риботипирования (создания риботипа) микроорганизма геномная ДНК обрабатывается мелкощепящими рестриктазами. Полученные фрагменты ДНК размером от 1000 до 20 000 п.н. разделяются в агарозном геле и обрабатываются зондом, в качестве которого выступают последовательности генова 16S, 23S или 5S рРНК, а также гипервариабельные нуклеотидные последовательности, рассеянные по геному. Гибридизация может быть проведена непосредственно в геле, либо на нейлоновой или нитроцеллюлозной мембране. Рестрикты, содержащие копии этих генов визуализируются, формируя индивидуальную конфигурацию – риботип [66]. Этот метод был использован для изучения разнообразия лактобацилл репродуктивного тракта женщин [88]. Данный метод оказался максимально информативным, с помощью полученных результатов удалось установить штаммовую принадлежность большинства свежевыделенных культур основных представителей лактофлоры влагалища здоровых женщин в «холодном периоде» – L. jensenii, L. casei, L. rhamnosus, L. acidophilus, L. plantarum, L. fermentum . Часто для изучения видового разнообразия и внутривидового типирования бактерий рода Lactobacillus применяют метод анализа полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК (RAPD), основанный на использовании коротких произвольных олигонуклеотидных праймеров длиной 9–10 пар нуклеотидов, которые гибридизуются с ДНК-мишенью при низкой температуре отжига. Суть метода заключается в амплификации случайных последовательностей ДНК-мишени с одного праймера, для которого неизвестно, где на ДНК мишени он имеет участки гомологии и сколько их. В данном методе стадия рестрикции амплификатов отсутствует, поскольку в процессе амплификации синтезируются фрагменты разной длины, которые разделяют электорофорезом в агарозном геле и анализируют полученные электрофореграммы [87]. Метод RAPD обладает высокой чувствительностью и позволяет дифференцировать близкородственные виды, он прост в исполнении и экономически выгоден. Для его использования не обязательно иметь информацию о строении генома искомого микроорганизма, один протокол можно применять для работы с широким спектром культур. К недостаткам метода отнесится плохая воспроизводимость, так как малейшие изменения условий реакции могут привести к изменению конечного результата. Triplicate Arbitrarily Primed-PCR (TAP-PCR). Этот метод является модификацией RAPD с более высокой чувствительностью. Суть TAP-PCR заключается в параллельной постановке с одним коротким праймером трех реакций амплификации при разной температуре отжига (38°, 40° и 42°С) и дальнейшем анализе наработанных фрагментов в агарозном геле и их сравнении. Чувствительность метода высока, как и у метода RAPD, а сравнение трех фореграмм одного штамма увеличивает точность и достоверность анализа [93]. ПЦР с электрофорезом в денатурирующем градиенте геля. Электрофоретический метод разделения макромолекул с высоким разрешением, используемый для идентификации точковых мутаций в молекуле ДНК, заключается в том, что двухцепочечные фрагменты ДНК, наработанные в ходе ПЦР, помещают в полиакриламидный гель, содержащий линейный градиент концентрации денатурирующего агента, что позволяет идентифицировать молекулы, различающиеся даже по единственному нуклеотиду. Метод основан на изучении конформационных профилей ДНК. Последовательность нуклеотидов в двухцепочечных фрагментах гена 16S рРНК определяет особенности изменения конформации этих фрагментов в денатурирующих условиях. Мутации (в том числе и одиночные замены нуклеотидов) изменяют температуру плавления (денатурации) доменов ДНК и приводят к изменению конформации и, соответственно, скорости миграции ампликона в геле. Фрагмент ДНК, содержащий мутацию, плавится при другой концентрации денатурирующего агента в геле и двигается с другой скоростью при электрофорезе по сравнению с аналогичным фрагментом ДНК дикого (неизмененного) типа. Денатурация происходит под действием формамида, входящего в состав геля. Разновидностью метода DGGE является метод электрофореза в температурном градиенте геля (TGGE), где в роли фактора плавления выступает повышение температуры. Для исключения возможности расхождения комплементарных цепей ДНК при денатурации, к 5'-концу одного из праймеров, использующихся для наработки фрагмента, присоединяют последовательность, богатую G и C основаниями, которая, будучи тугоплавкой, удерживает вместе цепи ДНК [66]. Метод электрофореза в денатурирующем градиенте геля эффективно используется для изучения видового разнообразия лактобацилл различных биотопов организма человека, микробных ассоциаций различных экологических ниш и субстратов [94, 95]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Экспресс-методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) уже не один десяток лет успешно применяются для решения различных прикладных задач биотехнологии и здравоохранения. Эти методы доступны для большинства лабораторий, стандартны и обладают высокой воспроизводимостью, так как оборудование, расходные материалы и реагенты строго регламентированы. 41 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 Неоспоримые преимущества, связанные с доступностью видовой идентификации микроорганизмов, высокой степенью достоверности, точности и скорости получения результатов при контроле готовых продуктов питания, БАД к пище и лекарственных форм, содержащих лактобациллы, возможностью оперативного мониторинга популяций на этапе производственного контроля, обосновывают актуальность введения МАНК в методическую базу лабораторного обеспечения работы Федеральной службы Роспотребнадзора. ЛИТЕРАТУРА 1.Аналитический обзор. Анализ российского рынка пробиотиков и продуктов на их основе. ЦИПАП, 2010. URL: http //centripap.ru/report/food/ functional/Probiotic Дата обращения 03.12.2011). Analyticheskii obsor. Analyz rossiiskogo rynka probiotikov I produktov na ih osnove. ZIPAP, 2010. URL: http //centripap.ru/report/food/functional/Probiotic. 2.МУ 2.3.2.2789-10 «Методические указания по санитарно-эпидемиологической безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». Методические указания. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2010. 93 с. MU 2.3.2.2789-10 «Metodicheskie ukasania po sanitarnoepidemiologicheskoy besopasnosti I funkcional` nogo potenciala probioticheskih microorganismov, ispol` suemyh dlya proisvodstva pishevyh productov». Metodicheskie ukasania. M: Federal `nyi sentr gigieny I epidemiologii Rospotrebnadsora.2010. 93 p. 3.СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов». 2002. SanPin 2.3.2.1078-01 «Gigienicheskie trebovania besopasnosti I pishevoy sennosti pishevyh productov». 2002. 4. ГОСТ 10444.11-89. Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов. 1989. GOST 10444.11-89. Producty pishevye. Metody opredelenia molochnokislyh microorganismov. 1989. 5.Точилина А.Г. Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus. дис…канд. биол. наук. Н. Новгород, 2009. 148 с. Tochilina A.G. Biohimicheskaya I molecularno-genetocheskaya identificasia bacterii roda Lactobacillus. Dis…kand. boil. Nauk. N. Novgorod, 2009. 148 p. 6. Lactobacillus. Molecular biology From Genomics to Probiotics. Edited by A. Ljungh, T. Wadstrom. Causter Academic Press, UK. 2009. 205 с. 7. Zwielehner J., Handschur M., Michaelsen A., Irez S., Demel M., Denner E.B., Haslberger A.G. DGGE and real-time PCR analysis of lactic acid bacteria in bacterial communities of the phyllosphere of lettuce. // Mol Nutr Food Res. –2008. – № 52 (5). – Р. 614-623. 8. Квасников Е.И., Нестеренко О.Л. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М.: Наука, 1975. 389 с. Kvasnikov E.I., Nesterenko O.L. Molochnokislye bacterii I puti ih ispol `sovania. M. Nauka, 1975. 389 p. 9. Hammes W.P., Hertel C. The genus of Lactobacillus and Carnobacterium / The Procaryotes A. Balows, H.G. Truper, M. Dworkin, W. Harder, K.-H. Schleifer. Edition 2. 1992. Vol. 4. Springer-Verlag. New-York. 10. Ботина С.Г., Червинец Ю.В., Климина К.М., Коробан Н.В., Червинец В.М., Гаврилова О.А., Лебедев Д.В., Миронов А.Ю. Генетическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей. Клиническая лабораторная диагностика. 2010. № 11. С. 43-46. Botina S.G., Chervinetz U.V., Klimina K.M. etc. Geneticheskaya identificasia antagonisticheski aktivnyh shtammov lactobacill, vydelennyh is rotovoy polosti zdorovyh ludei. Klinicheskaya diagnostica. 2010. № 11. P. 43-46. 11. Глушанова Н.А. Биологические свойства лактобацилл. Бюллетень сибирской медицины. № 4. 2003. С. 50-58. Glushanova N.A. Biologicheskie svoystva lactobacill. Bulleten` sibirskoy mediciny. № 4. 2003. S. 50-58. 12. Ботина С.Г., Коробан Н.В., Климина К.М., Глазова А.А., Захаревич Н.В., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. Генетическое разнообразие бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы людей. Генетика. 2010. Т. 46. № 12. С. 1589–159. Botina S.G., Koroban N.V., Klimina K.M. etc. Geneticheskoe raasnoobrasie bacterii roda lactobacillus is gastrointesninalnoy micribiomy ludei. Genetika. 2010. Т.46, №12. P. 1589–159. 13. Grigoroff S. Еtude sur une lait fermentе comestible. Le «Kissеlo mlеko» de Bulgarie // Revue Mеdicale de la Suisse Romande. Genéve. Georg&G., Libraires-Еditeurs. Librairie de L’Universitу. 1905. 14. Torriani S., Zapparoli G., Dellaglio F. Use of PCR-based methods for rapid differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis. Appl. Environ Microbiol. 1999. Vol. 65. № 10. P. 43514356. 15. Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению. / Под ред. проф. Е.И. Ткаченко, проф. А.Н. Суворова. СПб.: СпецЛит, 2007. 238 с. Disbioz kishechnika. Rukovodstvo po diagnostike I lecheniu / Pod. red. Prof. Tkachenko E.I., Suvuruva A.N. Spb: SpezLit. 2007. 236 s. 16. Леванова Г.Ф., Ефимов Е.И. Фенотаксономия и геносистематика лактобацилл / Под ред. проф. Г.И. Григорьевой. Н. Новгород.: изд. Ю.А. Николаев. 2009. 248 с. Levanova G.F., Efimov E.I. Fenotaksonomia I genosistematica lactobacill/ Pod red. Prof.Grogor`evoy. N. Novgorod: izd. U.A. Nikolaev. 2009. 248 s. 17. Stackerbrandt E., Tauber M. Molecular taxonomy and phylogenetic position of lactic acid bacteria. Biochimie. 1988. Vol. 70. P. 317-324. 18. Holzapfel W.H., Haberer P., Geisen R.et al. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. Am.J. Clin. Nutr. 2001. Vol. 73. P. 365S-373S. 19. Леванова Г.Ф., Мурыгина И.Н., Квасников Е.И. Размер генома, нуклеотидный состав и гомология ДНК некоторых лактобактерий. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1986. № 7. С. 26-29. Levanova G.F., Murygina I.N., Kvasnikov E.I. Rasmer genoma, nukleotidnyi sostav I gomologia DNK nekotoryh lactobacterii. Molecularnaya genetica, microbiologia I virusulogia. 1986. № 7. S. 26-29. 20. Klein G. Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteriaю. G. Klein, A. Rack, Ch. Bonaparte et al. Int. J. Food Microbiol. 1998. Vol. 41. P. 103125. 21. Kageyama A., Benno Y. Coprobacillus catena formis gen. nov., sp. nov., a new genus and species isolated from human feces. Microbiol. Immunol. Vol. 44 P. 23-28. 22. Kanatani K., Tahara T., Oshimura M.et al. Identification of the replication region of Lactobacillus acidophilus plasmid pLA102T. FEMS Microbiol. Lett. 1995. Vol. 133, Is. 2. P. 127-130. 23. Coconnier M.H., T.R. Klaenhammer, S. Kernéis et al. Protein-mediated adhesion of Lactobacillus acidophilus BG2FO4 on human enterocyte and mucus-secreting cell lines in culture. Appl Environ Microbiol. 1992. Vol. 58. № 6. P. 2034-2039. 24. Boekhorst J., Helmer Q., Kleerebezem M. et al. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiol. 2006. Vol.152. P. 273-280. 25. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Рахимова Н.Г. и др. К механизму антагонистической активности лактобацилл. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1989. № 2. С. 3- 8. Turin M.V., Shenderov B.A., Rahimova N.G. etc. K mechanism antagonisticheskoy aktivnisti lactobacill. Zurn. microbiol., epidemiol. I immunobiol. 1989. №2. S. 3-8. 26. Price R.J. Lee J.S. Inhibition of Pseudomonas species by hydrogen peroxide producing lactobacilli. J. Milk Food Technol. 1970. Vol. 3 № 1. P. 13-18. 27. Kleerebezem M. Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilin autoregulate their own biosynthesis. Peptides. 2004. Vol. 25 (9). P. 1405-1414. 28. Kleerebezem M., Boerchorst J., Kranenburg R. et al. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1. PNAS. 2003. Vol. 100. № 4. P. 19901995. 29. Современная микробиология: прокариоты: в 2-х томах: Т. 1. Пер с англ. / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир, 2005. 496 с. 42 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 Sovremenneya microbiologya v 2h tomah: T.1 / Pod red. Y. Lengelera, G. Drevsa, G. Shlegelya. M: Mir, 2005. 496 p. 30. Fleet G. H. et al. (1984), Appl. Environ. Microbiol. № 48. Р. 1034-1038. 31. Ward L.J., Timmins M.J. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction. Lett Appl Microbiol. 1999. Vol. 29. P. 90-92. 32. Alpert C.A., Crutz-Le Coq A.M., Malleret C. et al. Characterization of a theta-type plasmid from Lactobacillus sakei: a potential basis for low-copynumber vectors in lactobacilli. Appl Environ Microbiol. 2003. Vol.69. № 9. P. 5574-5584. 33. Polzin K.M., Romero D., Shimizu-Kadota M., Klaenhammer T.R., McKay L.L. Copy number and location of insertion sequences ISS1 and IS981 in lactococci and several other lactic acid bacteria. J. Dairy Sci. 1993. Vol. 76. P. 1243-1252. 34. Altermann E., Russel W.M., Azcarate-Peril M.A. et al. Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM. PNAS. 2005. Vol. 102. № 11. P. 1306-1312. 35. De las Rivas B., Marcobal A., Munoz R. Complete nucleotide sequence and structural organization of pPB1, a small Lactobacillus plantarum cryptic plasmid that originated by modular exchange. Plasmid. 2004. Vol. 52. № 3. P. 203-211. 36. Heng N.C., Bateup J.M., Loach D.M. et al. Influence of different futctional elements of plasmid pGT232 on maintenance of recombinant plasmids in Lactobacillus reuteri populations in vitro and in vivo. Appl. Environ Microbiol. 1999. Vol. 65. № 12. P. 5378-5385. 37. Karapetsas A, Vavoulidis E, Galanis A, Sandaltzopoulos R, Kourkoutas Y. Rapid detection and identification of probiotic Lactobacillus casei ATCC 393 by multiplex PCR.J Mol Microbiol Biotechnol. 2010. Vol. 18. № 3. P. 156161. 38. Матвеева И. В., Белявская И. Г. Биотехнологические основы приготовления хлеба. М.:ДеЛи принт. 2001. 150 с. Matveeva I.V., Belyavskaya I.G. Biotehnologicheskie osnovy prigitovlenia hleba. M: DeLi print.2001. 150 s. 39. Мюллер Г., Литц П., Мюнх Г.Д. Микробиология пищевых продуктов растительного происхождения. М.: Пищевая промышленность, 1977. 300 с. Muller G., Litz P., Muhh G.D. Microbiologia pishevyh productov rastitel`nogo proichozdenia. M: Pishevaya promyshlennost. 1977. 300 s. 40. Суюнчева Б. О., Вавренюк П. В., Ткачева М. С. Использование пробиотиков и пребиотиков в хлебопекарной промышленности Сборник научных трудов СевКавГТУ. Серия «Продовольствие». 2006. № 2. С. 42-47. Suuncheva B.O., Vavrenuk P.V., Tkacheva M.S. Ispol`sovanie probiotikov I prebiotikov v hlebipecarnoy rpomyshlennosti. Sbornic nauchnyh trudov SevKav GTU. Seria Prodovol`stvie. 2006. № 2. S. 42-47. 41. Шипулин В.И., Лупандина Н.Д., Дадян Н.К., Зиновченко А.А. Основные направления использования пищевых препаратов, интенсифицирующих технологических процесс производства сырокопченых колбас. Вестник СевКав ГТУ. 2010. № 3. С. 20-24. Shipulin V.I., Lupandina N.D., Dadyan N.K., Sinovchenko A.A. Osnovnye napravlenia ispolsovania pishevyh preparatov, intensificiruushih teshnologicheskii process proisvodstva syrokopchenyh kolbas. Sbornic nauchnyh trudov SevKav GTU. Seria Prodovol`stvie. 2010. № 3. S. 20-24. 42. Ратникова И.А. Биологические основы создания пробиотиков направленного действия для медицины, сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности: автореф…дисс. ... докт. биол. наук. Республика Казахстан, Алматы. 2010. 43 с. Ratnikova I.A. Biologicheskie osnivy sozdania probiotikov napravlennogo deystviya dlya mediciny, seiskogo hozyaystva I pererabatyvaushei promyshlennosti: аvtoref. Diss. dokt. biol. nauk. Respublika Kazahstan, Almatu. 2010. 43 p. 43. Ruiz-Moyano S., Martin A., Benito M.J., Casquete R., Serradilla M.J., Cordoba M.D. Safety and functional aspects of pre-selected lactobacilli for probiotic use in Iberian dry-fermented sausages. Meat Sci. 2009. № 83. P. 460467. 44. Liu G., Griffiths M.W., Shang N., Chen S., Li P. Applicability of bacteriocinogenic Lactobacillus pentosus 31-1 as a novel functional starter culture or coculture for fermented sausage manufacture. J Food Prot. 2010. № 73 (2). Р. 292-8. 45. Jones R.J., Wiklund E., Zagorec M., Tagg J.R. Evaluation of stored lamb bio-preserved using a three-strain cocktail of Lactobacillus sakei. Meat Sci. 2010. № 86 (4). Р. 955-9. 46. Vermeiren L., Devlieghere F., Debevere J. Evaluation of meat born lactic acid bacteria as protective cultures for the biopreservation of cooked meat products. Int J Food Microbiol. 2004. № 96 (2). Р. 149-64. 47. Бурьян Н.И., Тюрина Л.В. Микробиология виноделия. Москва: Пищевая промышленность, 1979. 271 c. Burian N.I., Turina L.V. Microbiologia vinodelia. Maskva: Pishevaya promushlennoct. 1979. 271 s. 48. Mesas J.M., Rodriguez M.C., Alegre M.T. Characterization of lactic acid bacteria from musts and wines of three consecutive vintages of Ribeira Sacra. Lett Appl Microbiol. 2011. № 52 (3). Р. 258-68. 49. Банникова Л.А., Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические основы молочного производства. М.: Агропромиздат. 1987. 400 с. Bannikova L.A., Koroleva N.S., SemenihinaV.F. Microbiologicheskie osnivy molochnogo proizvodstva. M: Agropromizdat. 1987. 400 s. 50. Тамим А.И., Робинсон Р.К. Йогурты и другие кисломолочные продукты. Спб: Профессия. 2003. 664 с. Tamim A.I., Robinson R.K. Yogurty I drugie kislomolochnye product. Spb: Professia. 2003. 664 s. 51. Lopitz-Otsoa F., Rementeria A., Elguezabal N., Garaizar J. Kefir: a symbiotic yeasts-bacteria community with alleged healthy capabilities. Rev Iberoam Micol. 2006. № 23 (2). Р. 67-74. 52. Morales F., Morales J.I., Hernаndez C.H., Hernаndez-Sеnchez H. Isolation and Partial Characterization of Halotolerant Lactic Acid Bacteria from Two Mexican Cheeses. Appl Biochem Biotechnol. 2011. № 164( 6). Р. 889-905. 53. Методические рекомендации «Применение молочного лактобактерина в лечении заболеваний, протекающих на фоне дисбактериоза кишечника». Горький. 1980 Минздрав РСФСР. 11 с. Metodicheskie recomendacii «Primenenie molochnogo lactobacterina v lechenii zabolevanii, protekaushih na fone disbacteriosa kishechnika». Gorkyi. 1980. Minzdrav RSFSR. 11 s. 54. Инструкция по приготовлению кисломолочного бифидумбактерина на молочных кухнях. Москва. 1987. 10 с. Instrukcia po prigotovleniu kislomolochnogo bifidumbacterina na molochnyh kuhnyah. Moskva. 1987. 10 s. 55. Инструкция по приготовлению кисломолочного бифилакта на молочных кухнях Москва . 1978. 11 с. Instrukcia po prigotovleniu kislomolochnogo bifilacta na molochnyh kuhnyah. Moskva. 1978. 11 s. 56. De Man J.C., Rogosa M., Sharpe M. E. A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 1960, Vol. 23. P. 130-135. 57. Van de Casteele S., Vanheuverzwijn T., Ruyssen T. et al. Evaluation of culture media for selective enumeration of probiotic strains of lactobacilli and bifidobacteria in combination with yoghurt or cheese starter. Int Dairy J. 2006. Vol. 16, Is.12. P. 1470-1476. 58. Rogosa M., Mitchell J.A., Wiseman R.F. A selective medium for the isolation and enumeration of oral lactobacilli. J Dent Res. 1951. Vol.30. № 5. Р. 682-689. 59. Rogosa M., Wiseman R.F., Mitchell J.A. et al. Species differentiation of oral lactobacilli from man including descriptions of Lactobacillus salivarius nov. spec. and Lactobacillus cellobiosus nov. spec. J. Bacteriol. 1953. Vol. 65. P. 681– 699. 60. Eloy C. and Lacrosse R., Bull. Rech. Agron Gembloux. 1976. № 11 (1-2). 83 р. 61. Liu C., Zhang Z.Y., Dong K., Yuan J.P., Guo X.K. Antibiotic resistance of probiotic strains of lactic acid bacteria isolated from marketed foods and drugs. Biomed Environ Sci. 2009. Vol. 22. № 5. P. 401-12. 62. Парфенов А.И., Осипов Г.А., Богомолов П.О. Дисбактериоз кишечника: новые подходы к диагностике и лечению. Consilium medicum. 2001. Т .3. № 6. С. 270-272. Parfenov A.I., Osipov G.A., Bogomolov P.O. Dysbacterios kishechnika: novye podhody k diagnostike I lecheniu. Consilium medicum. 2001. Т. 3. № 6. S. 270272. 63. Байрамова Г.Р. Бактериальный вагиноз. Гинекология. 2001. Т. 3. № 2. С. 52-54. 43 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 Bairamova G.R. Bacterialnui vaginoz. Ginecologia. 2001. Т. 3. № 2. P. 52-54. 64. Бегиашвили Л.В. Клиническая оценка нарушений метаболической активности микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях у детей и методы коррекции: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Москва, 2010. 24 с. Begiashvili L.V. Klinicheskaya ozenka narushenii metabolicheskoy aktivnosti microflory kishechnika pri ostryh kishechnyh infekciah u detei I metody korrekcii: аvtoref. diss. ... kand. med. nauk. Moskva, 2010. 24 s. 65. Струкова Е.Г. Количественное определение микробных сообществ полости рта с помощью хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров: автореф. дисс. … канд. хим. наук. Томск, 2011. 21 с. Strukova E.G. Kolichestvennoe opredelenie microbnyh soobshestv polosti rta s pomosh`u hromato-mass-spectrometrii microbhyh markerov: аvtoref. diss. kand. med. nauk. Tomsk, 2011. 21 s. 66. Осипов Г.А., Бойко Н.Б., Соколов Я.А., Демина А.М., Крымцева Т.А, Радюшина Т.В., Осипов Д.Г. Обнаружение маркеров микроорганизмов в составе жирных кислот биологических жидкостей урогенитального тракта и исследование их диагностической значимости. http://www.rusmedserv.com/ microbdiag/vfar7.htm. (дата обращения 5.03.2011) Osipov G.A., Boyko N.B., Sokolov Y.A. etc. Obnaruzenie markerov microorganismov v sosnave zirnyh kislot biologicheskih zidkostei urogenitalnogo trakta I issledovinie ih diagnosticheskoy znachimosti. http:// www.rusmedserv.com/microbdiag/vfar7.htm. 67. O’Sullivan D. J. Methods for Analysis of the Intestinal Microflora. Curr. Issues Intest. Microbiol. 2000. Vol. 1. № 2. P. 39-50. 68. Tani K., Kurokawa K., Nasu M. Development of a direct in situ PCR method for detection of specific bacteria in natural environments. Appl. Environ. Microbiol. 1998. Vol. 64. P. 1536-1540. 69. Harmsen H.J.M., Gibson G.R., Elfferich P., Raangs G.C., Wildeboer-Veloo A.C.M., Argaiz A., Roberfroid M.B., Welling G.W. Comparison of viable cell counts and fluorescence in situ hybridization using specific rRNA-based probes for the quantification of human fecal bacteria. FEMS. Microbiol. Letts. 2000. Vol.183. P. 125-129. 70. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций. КМАХ. 2000. Т. 2. № 3. С. 82-95. Shaginyan I.A. Rol I mesto molecularno-geneticheskih metodov v epidemiologicheskom analyse vnutribilnichnyh infekcii. KMAH. 2000. Т. 2. № 3. P. 82-95. 71. Комбарова С.Ю., Погосьян Т.С., Борисова О.Ю. и др. Молекулярногенетические методы дифференциации промышленных штаммов бифидобактерий и лактобацилл. Материалы конференции «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования». М. 2002. С. 21. Kombarova S.U., Pogosyan T.S., Borisova O.U. etc. Molecularno-geneticheskie metody differenciacii promyshlennyh shtammov bifidobacterii I lactobacill. Materialy konferencii «Probioticheskie microorganism – sovremennoe sostoyanie voprosa I persrectivy ispol`zovania». М. 2002. S. 21. 72. Кушугулова А.Р., Филипенко М.Л., Бекболатова Ж.Т. и др. Методы генотипического анализа лактобацилл /Материалы Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы». М. 2004. С. 27. Kushugulova A.R., Filipenko M.L., Bekbolatova Z.T. Metody genotipicheskogo analiza lactobacill. Materialy mezdunarodnoy konferencii «Probiotici, prebiotici, sinbiotici I funkcionalnye rpodukty pitania. Sovremennoe sostoyanie I persrectivy». М. 2004. P. 27. 73. Лопухов Л.В., Эйдельштейн М.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике. КМАХ. 2000. Т. 2. № 3. С. 96 -106. Lopuchov L.V. Eidelshtein M.V. Polymeraznaya zepnaya reakcia v klinicheskoi microbiologicheskoy praktike. KMAH.2000. Т. 2. № 3. S. 96 -106. 74. Roy D., Sirois S. Molecular differentation of Bifidobacterium species with amplified ribosomal DNA restriction analysis and alignment of short regions of the ldh gene. FEMS Microbiol Lett. 2000. Vol. 191 P. 17-24. 75. Sakamoto K., Konings W.N. Beer spoilage bacteria and hop resistance. Int J Food Microbiol. 2003. № 89 (2-3). Р. 105-24. 76. Song Y., Kato N., Liu C. et al. Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species- specific praimers deraived from the 16S-23S rRNA intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA. FEMS Microbiol Lett. 2000. Vol. 187. P. 167173. 77. Ventura M., Canchaya C., Meylan V. et al. Analysis, characterization, and loci of the tuf genes in Lactobacillus and Bifidobacteriun species and their direct application for species identification. Appl. Environ Microbiol. 2003. Vol. 69. № 11. P. 6908-6922. 78. Kwon H.S., Yang E. H., Yeon S. W. et al. Rapid identification of probiotic Lactobacillus species by multiplex PCR using species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA through 23S rRNA. FEMS Microbiology Letters. 2004. Vol.239, Is.2. P. 267-275. 79. Muller M.R.A., Ehrmann M.A., Vogel R.F. Multiplex PCR for the detection of Lactobacillus ponis and two related species in a sourdough fermentation. Appl. Environ Microbiol. 2000. Vol. 66. № 5. P. 2113-2116. 80. Shan N.P. Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods. J. Dairy Sci. 2000. № 83. P. 894-907. 81. Walter J., Tannock G.W., Tilsava-Timisjarvi A. et al. Detection and identification of gastrointestinal Lactobacillus species by using denaturating gradient gel electrophoresis and species-specific pcr primers. Appl. Environ Microbiol. 2000. Vol. 67. № 8. P. 297-303. 82. Глухов А.И. Применение гнездовой ПЦР в детекции возбудителя чумы. Клин. лаб. диагностика. 2003. № 7. С. 48-50. Glukhov A.I. Primenenie gnezdovoy PCR v detekcii vozbuditelya chumy. Klin. lab. diagnostika. 2003. № 7. S. 48-50. 83. Castellanos M.I., Chauvet A., Deschamps A. et al. PCR methods for identification and specific detection of probiotic lactic acid bacteria. Current microbiology. 1996. Vol. 33. P. 100-103. 84. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA-sequences. Bio-Technology. 1992. Vol. 10. № 4. Р. 413–417. 85. Yu Z., Dong B., Lu W. Dynamics of bacterial community in solid-state fermented feed revealed by 16S rRNA. Lett Appl Microbiol. 2009. Vol. 49. № 2. Р. 166-72. 115 86. Ботина С.Г. Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии: автореф. дисс. … докт. биол. наук. Москва, 2011. 46 с. Botina S.G. Molecularno-biologicheskie podhody k otboru bacterialnyh culture pri cozdanii zakvasok dlya biotahnologii: аvtoref. diss. ... dokt. biol. nauk. Moskva, 2011. 46 s. 87. Ботина С.Г., Климина К.М., Коробан Н.В., Амерханова А.М., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus. Генетика. 2010. Т. 46. № 11. С. 1306-1313. Botina S.G., Klimina K.M., Koroban N.V. Reclassificasia otechestvennyh probioticheskih kultur bacterii roda Lactobacillus. Genetika. 2010. Т. 46. № 11. S. 1306-1313. 44 № 2 ( 1 2 ) м а й 2 01 4 88. Tynkkynen S., Satokari R., Saarela M., Mattila-Sandholm, Saxelin M. Comparison of Ribotyping, Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis, and Pulsed-Field Gel Electrophoresis in Typing of Lactobacillus rhamnosus and L. casei srains. Appl. Environ Microbiol. 1999. Vol. 65. № 9. P. 3908-3914. 89. Коваленко Н.К., Бурьяновский Л.Н., Подгорский В.С. Использование ПЦР для идентификации представителей родов Lactobacillus и Streptococcus. Микробиологический журнал. 2000. № 62 (6). С. 7-14. Kovalenko N.K., Bur`yanovskii L.N., Podgorskii V.S. Ispolzovanie PCR dlya identifikacii predstaviteley rodov Lactobacillus i Streptococcus. Microbiologycheskii zurnal. 2000. № 62 (6). S. 7-14. 90. Лашевский В.В., Коваленко Н.К. Дизайн праймеров для ДНК лактобактерий. Микробиологический журнал. 2003. № 65 (3). С. 46-53. Lashevskii V.V., Kovalenko N.K. Dizain praimerov dlya DNK lactobacteriy. Microbiologycheskii zurnal. 2003. № 65 (3). S. 46-53. 91. Самсонова С.А. Самсонов В.В., Бавыкина Н.Б. и др. Методы ПЦР–идентификации и классификации пробиотических микроорганизмов. Сборник материалов конференции «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования». М. 2002. С. 20. Samsonova S.A., Samsonov V.V., Bavykina N.B. etc. Metody PCR-identifikacii I klassifikacii probioticheskih microorganismov. Sbornic materialov konferencii «Probioticheskie microorganism – sovremennoe sostoyanie voprosa I persrectivy ispol`zovania». М. 2002. S. 20. 92. Zhong W., Millsap R., Bialkowska-Hobrzanska H. et al. Differentiation of lactobacillus species by molecular typing. Appl. Environ Microbiol. 1998. Vol. 64. № 7. P. 2418-2423. 93. Cusick S.M., O'Sullivan D.J. Use of a Single, Triplicate Arbitrarily PrimedPCR Procedure for Molecular Fingerprinting of Lactic Acid Bacteria. Appl Environ Microbiol. 2000. Vol. 66. № 5. P. 2227–2231. 94. Lopez I., Ruiz-Larrea F., Cocolin L., Orr E., Phister T., Marshall M., VanderGheynst J., Mills D.A. Design and Evaluation of PCR Primers for Analysis of Bacterial Populations in Wine by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Appl Environ Microbiol. 2003. Vol. 69. № 11. P. 6801–6807. 95. Zoetendal E.G., Ben-Amor K., Akkermans A.D. et al. DNA isolation protocols affect the detection limit of PCR approaches of bacteria in samples from the human gastrointestinal tract. Syst Appl Microbiol. 2001. Vol. 24. № 3. P. 405-410. 96. Chaillou S., Champomier-Verges M., Cornet M. et al. The genome sequence of the meat-borne lactic acid bacterium Lactobacillus sakei 23K. Nat. Biotechnol. 2005. Vol. 23. № 12. P. 1494-1495. 97. Pridmore R.D., Berger B., Desiere F. et al. The genome sequence of the probiotic intestinal bacterium Lactobacillus johnsonii NCC 533. PNAS. 2004. Vol. 101. № 8. P. 2512-2517. 98. Claesson M.J., Li Y., Leahy S. Multireplicon genome architecture of Lactobacillus salivarius. PNAS. 2006. Vol. 103. № 17. P. 6718-6723.
