ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНОВ НА РЕПАРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В

експериментальні роботи
УДК 572; 577
влияние лектинов на репаративные процессы
в клетках млекопитающих in vitro
В. В. ЛЫЛО, О. А. ПИВЕНЬ, К. В. СЕРЕБРЯКОВА, Л. Л. МАЦЕВИЧ, Л. Л. ЛУКАШ
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины; Киев
e-mail: [email protected]
Изучено влияние растительных лектинов на процесс восстановления первичных повреждений
ДНК, а также на экспрессию гена репаративного энзима О6 -алкилгуанин-ДНК алкилтрансферазы в
клетках млекопитающих in vitro. Показано, что исследуемые лектины оказывают модифицирующее
действие на процесс восстановления целостности клеточной ДНК и повышают уровень экспрессии
О6 -алкилгуанин-ДНК алкилтрансферазы в данной модельной системе.
К л ю ч е в ы е с л о в а: О6 -алкилгуанин-ДНК алкилтрансфераза, экспрессия, лектины, культура
клеток, Western blotting-анализ, повреждение и репарация ДНК, comet assay.
Г
еномы живых организмов постоянно
подвергаются воздействию экзогенных
и эндогенных повреждающих факторов,
таких как высокоэнергетические излучения и
активные химические агенты, в частности алкилирующие соединения и тяжелые металлы.
Для восстановления индуцированных
повреждений эволюционно возникли различные системы репарации. В их числе – репарация прямого восстановления первичных
повреждений, индуцированных алкилирующими соединениями, которая осуществляется
уникальным репаративным энзимом О6-алкил­
гуанин-ДНК алкилтрансферазой (АГТ). Этот
протеин устраняет наиболее опасные мутагенные и канцерогенные О6-алкилгуаниновые
аддукты в ДНК, вызванные алкилирующими
соединениями. Специфическая алкилтрансфераза переносит алкильную группу из О6-позиции гуанина на собственный цистеиновый
остаток, при этом необратимо инактивируясь
[1,2].
Уровень экспрессии АГТ различен в
отдель­ных тканях и органах одного и того же
организма, в нормальных и опухолевых клетках одного органа [3,4]. Позитивное значение
АГТ для организма – защита нормальных
клеток от алкилирования ДНК – меняется
на негативное при химиотерапии опухолей с
использованием алкилирующих соединений.
При этом наблюдается низкая эффективность
противоопухолевых препаратов при высоком
уровне экспрессии АГТ [5]. Поэтому актуальным является поиск новых индукторов и ингибиторов АГТ-активности. Показано [6], что
основными индукторами АГТ являются алки60
лирующие агенты, а также неспецифические
факторы, вызывающие разрывы ДНК.
Перспективными, с точки зрения возможного влияния на протекание репаративных
процессов, представляются лектины – углеводсвязывающие белки неиммуноглобулиновой природы, обладающие широким спектром
биологической активности. Ранее нами было
показано генетическое действие лектинов [7].
В экспериментах по изучению совместного
влияния лектинов и простого алкилирующего агента N-метил-N′-нитро-N-нитрозогуанидина (MNNG) на генетическую стабильность
клеточных популяций нами было показано [8],
что при комбинированной обработке клеток
химическим мутагеном и некоторыми лектинами, в частности лектинами семян чечевицы,
бузины черной, икры окуня, наблюдается антимутагенный эффект. Также показано, что лектины способны индуцировать разрывы ДНК в
культурах клеток млекопитающих [9,10]. Совокупность этих данных явилась основанием для
предположения, что лектины могут влиять на
протекание процессов репарации в клетке, в
частности быть индукторами экспрессии АГТ.
Целью нашей работы было изучить влия­
ние лектинов на динамику индукции разрывов ДНК и на уровень экспрессии репаративного энзима АГТ в клетках млекопитающих in
vitro.
Материалы и методы
При проведении экспериментальной работы использовали следующие культуры клеток:
BKF – первичные мезенхимальноподобные
клетки, полученные из крови человека; клон
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
В. В. ЛЫЛО, О. А. ПИВЕНЬ, К. В. СЕРЕБРЯКОВА и др.
КХ-III – производные от клеточной линии
китайского хомячка Blld-ii-FAF28. В качестве
позитивного контроля на наличие АГТ использовали линию клеток Hep-2 (рак гортани).
Клетки культивировали в стандартной
среде ДМЕМ с добавлением 10%-й эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и
антибиотиков пенициллина и стрептомицина.
При определении уровня экспрессии АГТ
клетки инкубировали на протяжении 4-х часов в бессывороточной среде ДМЕМ с добавлением лектина бузины черной (Sambucus nigra)
или лектина семян чечевицы (Lens culinaris) в
концентрации 20 мкг/мл. До и после обработки клеток лектинами клеточный монослой
трижды отмывали раствором PBS или средой
DMEM. Установлено, что оптимальное количество клеток для получения белкового экстракта должно составлять не менее 10 млн.
Белковый экстракт получали согласно
[11]. Концентрацию общего протеина в каждой пробе измеряли по методу Бредфорд [12].
Проводили SDS-электрофорез протеинов в
15%‑ном полиакриламидном геле по методу
[13]. Количество общего белка, который наносили в лунку геля при электрофорезе, было
одинаково для всех проб.
Идентификацию АГТ в клеточном экстракте проводили с помощью Western Blottingанализа. Использовали мышиные моноклональные антитела МТ 23.2 к АГТ человека
фирмы Novus biologicals, Littllton Co (США). В
качестве вторичных антител – видоспецифические конъюгированные с пероксидазой хрена антитела фирмы Jackson ImmunoResearch
(США). Процедуры по идентификации АГТ в
наших пробах проводили согласно методическим указаниям фирмы–изготовителя моноклональных антител.
Определение количества двунитевых разрывов ДНК проводили по методу электрофореза ДНК единичных клеток (comet assay,
нейтральный) согласно [14] с незначительными модификациями. Клетки обрабатывали генотоксическим агентом – хлоридом никеля в
концентрации 1000 мкг/мл – в течение 1 часа.
Выбор NiCl2 в качестве модельного мутагена был обусловлен тем, что эта соль является
ингибитором репаративного энзима АГТ (15).
Один из клеточных препаратов анализировался непосредственно после завершения обработки, еще два отмывали от генотоксического
агента и инкубировали в свежей ростовой среде в течение следующих 3-х часов. При этом в
ростовую среду одного из опытных вариантов
добавляли раствор лектина S. nigra до конечной
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
концентрации 0,2 мкг/мл; тогда как к ростовой среде в другом препарате (положительный
контроль) никаких дополнительных веществ
не добавляли. При анализе результатов клетки распределяли по следующим классам: с
фоновым количеством разрывов (отсутствие
электрофоретического трека); с незначительным количеством разрывов (длина электрофоретического трека – 1–2 диаметра (Ø) ядра);
со среднеповрежденной ядерной ДНК (3–5 Ø
ядра); с сильно поврежденной ядерной ДНК
(6–7 Ø ядра).
Результаты и обсуждения
На рис. 1 представлена динамика индукции двунитевых разрывов ДНК в клетках
млекопитающих под влиянием хлорида никеля, как модельного генотоксического агента,
и лектина коры S. nigra. Вариант обработки
клеток только лектином отсутствует, поскольку ранее [7] нами было показано, что обработка клеток этим протеином в концентрации
0,2 мкг/мл, используемой в данной серии опытов, не приводит к значимым изменениям в
распределении частот клеток с поврежденной
и неповрежденной ДНК по сравнению с контролем.
Как видно на рис. 1, величина пула клеток, чьи ядра образуют электрофоретические
треки, достоверно возрастает после обработки
хлоридом никеля. По истечении трех часов относительное количество таких клеток достоверно снижается, что свидетельствует о репарации привнесенных повреждений, однако их
количество не достигает контрольного уровня.
При условии обработки поврежденных клеток
лектином скорость репарации первичных повреждений оказалась выше: через 3 часа после
обработки генотоксическим агентом доля клеток с электрофоретическими треками была достоверно ниже, чем в положительном контроле, и не отличалась от значений, полученных в
отрицательном контроле.
Очевидно, что наблюдаемое нами снижение количества клеток, несущих избыточные
разрывы ДНК, не может быть связано лишь
с элиминацией таких клеток. Поскольку продолжительность инкубации после обработки
хлоридом никеля составляла всего 3 часа, то
маловероятно, что за этот промежуток времени все погибшие клетки могли бесследно разрушиться. В то же время клетки, находящие­
ся в состоянии некроза или апоптоза, легко
визуа­лизируются с помощью применяемого
нами метода электрофореза ДНК единичных
клеток. Не наблюдали мы и снижения концент­
61
. 1.
експериментальні роботи
0,7
0,6
Доля
клеток
ɞɨɥɹ ɤɥɟɬɨɤ
ɱɚɫɬɨɬɚ
0,5
11 1 1
0,4
0,3
0,2
0,1
0
22 2 2
33 3 3
ɨɩɵɬɚ
ɜɚɪɢɚɧɬ
ɨɩɵɬɚ
ɜɚɪɢɚɧɬ
ɨɩɵɬɚ
11ɜɚɪɢɚɧɬ
ɜɚɪɢɚɧɬ
ɨɩɵɬɚ
22
44 4 4
3
3
44
ɜɚɪɢɚɧɬ ɨɩɵɬɚ
Вариант
опыта
ɞɥɢɧɚ
ɷɥɟɤɬɪɨɮɨɪɟɬɢɱɟɫɤɨɝɨ
ɬɪɟɤɚ
/ ɞɢɚɦɟɬɪ
ɹɞɪɚ
ɞɥɢɧɚ
ɷɥɟɤɬɪɨɮɨɪɟɬɢɱɟɫɤɨɝɨ
ɬɪɟɤɚ
/ ɞɢɚɦɟɬɪ
ɹɞɪɚ
ɞɥɢɧɚ
ɷɥɟɤɬɪɨɮɨɪɟɬɢɱɟɫɤɨɝɨ
ɬɪɟɤɚ
/ ɞɢɚɦɟɬɪ
ɹɞɪɚ
ɞɥɢɧɚ
ɷɥɟɤɬɪɨɮɨɪɟɬɢɱɟɫɤɨɝɨ
ɬɪɟɤɚ
/ ɞɢɚɦɟɬɪ
ɹɞɪɚ 00 0 01-2
Длина
электрофоретического
трека/диаметр
ядра:
10–2
3–53-5
6–7
3-5
6-7
1-21-2
3-5
6-76-7
1-2
3-5
6-7
ɞɥɢɧɚ ɷɥɟɤɬɪɨɮɨɪɟɬɢɱɟɫɤɨɝɨ ɬɪɟɤɚ / ɞɢɚɦɟɬɪ ɹɞɪɚ
0
1-2
3-5
6-7
Рис. 1. Влияние лектина коры бузины черной (S. nigra) на динамику количества никель-индуцированных
разрывов ядерной ДНК (результаты comet assay): 1 – негативный контроль; 2 – NiCl2 , 1000 мкг/мл;
3 – NiCl2 , 1000 мкг/мл, с постинкубацией в ростовой среде; 4 – NiCl2 , 1000 мкг/мл, с постинкубацией
1. с добавлением лектина S. nigra (0,2 мкг/мл)
в ростовой Ɋɢɫ.
среде
рации ядер в препарате по истечении времени
постинкубации – хотя частота поврежденных
клеток при этом снижается весьма существенно: непосредственно после обработки клеток
хлоридом никеля она составляет 0,96, тогда
как в положительном контроле она снижается
до 0,69, а в опытном варианте до 0,46.
В пользу предположения о репарогенном
влиянии лектина коры S.nigra свидетельствует
также частотное распределение клеток с различным количеством разрывов в каждом препарате (рис. 1). Как видно, и положительный
контроль, и опытный вариант по частотному
распределению ядер с различным количеством
разрывов ДНК достоверно отличаются от препарата, анализировавшегося непосредственно после обработки клеток хлоридом никеля
(χ2 = 57,2 и χ2 = 83,6 соответственно, Р < 0,001).
В положительном контроле существенно возрастает доля ядер без электрофоретических
треков, однако одновременно с этим растет и
доля среднеповрежденных ядер, образующих
треки длиной 3–5 Ø ядра. Возрастание относительного количества неповрежденных ядер,
вероятно, является следствием репарации разрывов ДНК в слабоповрежденных ядрах (треки длиной 1–2 Ø ядра). Следует отметить, что
именно эти последние составляют 61,6% всех
ядер в препарате, проанализированном непосредственно после обработки клеток генотоксическим агентом. Возрастание же доли
среднеповрежденных ядер, возможно, являет62
ся следствием появления вторичных разрывов
ДНК. В опыте относительное количество ядер,
не образующих электрофоретические треки,
еще выше; а доля ядер, образующих треки
средней длины – ниже. При этом различие
между положительным контролем и опытом
также носит достоверный характер (χ2 = 15,8,
Р < 0,01). Это может свидетельствовать о более эффективной репарации, в частности об
уменьшении количества образующихся вторичных разрывов ДНК под влиянием лектина
коры S. nigra в малых концентрациях.
Отмеченный феномен снижения количест­
ва вторичных разрывов под влиянием исследуемого лектина позволяет предположить, что
этот лектин, возможно, повышает экспрессию
и/или активность репаративных энзимов, ответственных за устранение повреждений, отличных от первичных двунитевых разрывов
ДНК. К таким энзимам относится, в частности, АГТ.
В нашей работе мы исследовали влияние
различных лектинов и состава культуральной
среды на уровень экспрессии АГТ в клетках
различного происхождения. Результаты, полученные с использованием различных культур
клеток, принципиально не различаются, поэтому в данном сообщении представлены данные одного из наиболее типичных опытов.
Согласно данным литературы [16],
9 АГТ
млекопитающих имеет молекулярную массу
22–24 кДа. Однако при Western blotting-анаISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
В. В. ЛЫЛО, О. А. ПИВЕНЬ, К. В. СЕРЕБРЯКОВА и др.
лизе в клеточных линиях разного происхождения и при различных условиях культивирования мы систематически наблюдали наличие
специфического сигнала моноклональных антител к АГТ не только в области 24 кДа, но и
в области около 50 кДа, причем соотношение
количества протеина в этих полосах различалось в зависимости от объекта [17]. Мы предположили, что причиной появления сигнала в
области 50 кДа является модифицированная
форма АГТ, которая, возможно, является комплексом этого энзима с другим протеином. В
пользу этого предположения свидетельствуют,
например, данные о наличии в клетках 48–
50 кДа конъюгатов АГТ с убиквитином [18].
Данный феномен представляется интересным
с точки зрения возможного влияния модификации протеина АГТ на его энзиматическую
активность.
На основании полученных результатов мы
планируем в ходе
дальнейших1 исследований
ɞɨɪɨɠɤɚ
2
провести изучение природы присутствующей в
изученных нами клеточных линиях модифи1
ɞɨɪɨɠɤɚ
11
ɞɨɪɨɠɤɚ
ɞɨɪɨɠɤɚ
ɞɨɪɨɠɤɚ
Дорожка
2 1
22 1
цированной формы протеина с молекулярной
массой 50 кДа.
На рис. 2 показан результат воздействия
растительных лектинов на уровень экспрессии
АГТ в культуре первичных клеток человека. В
контрольном необработанном лектинами варианте (дорожка 2) присутствует только модифицированная форма протеина (50 кДа). После обработки клеток лектином бузины черной
(дорожка 3) наблюдается возрастание экспрессии протеина в модифицированной форме по
отношению к контролю.
Поскольку, как уже было сказано выше,
некоторые лектины, в том числе и лектин коры
бузины черной, индуцируют разрывы клеточной ДНК, мы предположили, что, вероятно,
одним из механизмов наблюдаемого нами повышения уровня экспрессии АГТ являются
именно привносимые действием экзогенных
лектинов разрывы ДНК.
Однако
этот
3
4
5 механизм, очевидно, не является единственным. Как уже было показано, более низкие концентрации лектина
3 2
33 2
4
44
3 5
3 55
4
4
5
5
50 кДа
5000
4000
3000
2000
1000
0
ɨɬɧɨɫɢɬɟɥɶɧɨɟ
ɤɨɥɢɱɟɫɬɜɨ
ɛɟɥɤɚ
ɨɬɧɨɫɢɬɟɥɶɧɨɟ
ɤɨɥɢɱɟɫɬɜɨ
ɛɟɥɤɚ
Относительное количество протеина
ɨɬɧɨɫɢɬɟɥɶɧɨɟ
ɨɬɧɨɫɢɬɟɥɶɧɨɟ
ɤɨɥɢɱɟɫɬɜɨ
ɤɨɥɢɱɟɫɬɜɨ
ɛɟɥɤɚ
ɛɟɥɤɚ
ɨɬɧɨɫɢɬɟɥɶɧɨɟ ɤɨɥɢɱɟɫɬɜɨ ɛɟɥɤɚ
24 кДа
комплекс
мономер
Дорожка
ɞɨɪɨɠɤɚ 1ɞɨɪɨɠɤɚ2
ɞɨɪɨɠɤɚ
ɞɨɪɨɠɤɚ
3
4
5
Рис. 2. Влияние растительных
лектинов
Ɋɢɫ. 2.
Ɋɢɫ. 2. на экспрессию АГТ в клетках человека in vitro (результаты
ɞɨɪɨɠɤɚ
Ɋɢɫ.12.– HepɊɢɫ.
Western blotting-анализа):
2,2.позитивный контроль; 2 – BKF, контроль, 11-й пассаж; 3 –
BKF + лектин S.nigra (20 мкг/мл), 11-й пассаж; 4 – BKF, среда M1, 7-ой пассаж; 5 – BKF + лектин
L. culinaris (20Ɋɢɫ.
мкг/мл),
среда M1, 7-ой пассаж
2.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
63
експериментальні роботи
(0,2 мкг/мл), не индуцирующие первичных
разрывов ДНК [19], тем не менее стимулируют снижение количества вторичных разрывов
ДНК. Следовательно, есть основания предполагать, что этот лектин в низких концентрациях стимулирует репарацию как самих первичных разрывов, так и других повреждений
ДНК, из которых в отсутствие лектина возникают вторичные двунитевые разрывы. К числу
таких повреждений, как известно, относится и
алкилирование оснований в составе ДНК.
Кроме среды DMEM, в нашей работе для
культивирования клеток мы использовали модифицированную среду М1, разработанную в
нашем отделе на основе среды DMEM. При
культивировании клеток в среде М1 наблюдается полное подавление экспрессии АГТ
(дорожка 4). В то же время, после обработки
клеток лектином семян чечевицы в условиях
пребывания в среде М1 мы наблюдали появление полосы в области 50 кДа (дорожка 5).
Эти данные подтверждают свойство лектинов
способствовать повышению экспрессии АГТ.
Таким образом, нами показано, что исследуемые лектины обладают индуцибельным
действием относительно репаративного энзима
АГТ в культуре клеток человека. Обработка
клеточной культуры лектинами семян чечевицы и коры бузины черной в концентрации
20 мкг/мл приводит к повышению уровня экспрессии АГТ за счет повышения содержания
модифицированной формы энзима с молекулярной массой ~ 50 кДа. Кроме того, для лектина бузины черной было показано наличие
репарогенного действия при более низкой концентрации (0,2 мкг/мл): обработка клеточной
культуры этим протеином совместно с модельным мутагеном (хлоридом никеля) приводит
к снижению количества клеток с разрывами
ДНК, индуцированными этим мутагеном.
вплив лектинів на репаративні
процеси в клітинах ссавців
in vitro
В. В. Лило, О. О. Півень,
К. В. Серебрякова, Л. Л. Мацевич,
Л. Л. Лукаш
Інститут молекулярної біології і
генетики НАН України, Київ;
e-mail: [email protected]
Досліджено вплив рослинних лектинів на
процес відновлення первинних пошкоджень
ДНК, а також на експресію гена репаративного ензиму О6-алкілгуанін-ДНК алкілтрансфе64
рази у клітинах ссавців in vitro. Показано, що
досліджувані лектини спричинюють модифікувальну дію на процес відновлення цілісності
клітинної ДНК і підвищують рівень екс­пресії
О6-алкілгуанін-ДНК алкілтрансферази в даній
модельній системі.
К л ю ч о в і с л о в а: О6-алкілгуанін-ДНК
алкілтрансфераза, експресія, лектини, культура клітин, Western blotting-аналіз, пошкодження та репарація ДНК, comet assay.
The influence of lectins
on some repair processes
in mammalian cells in vitro
V. V. Lylo, O. O. Piven’, K. V. Serebryakova,
L. L. Macewicz, L. L. Lukash
Institute of Molecular Biology and Genetics,
National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: [email protected]
Summary
The influence of plant lectins on primary DNA
damage repair and on expression of repair enzyme
alkylguanine-DNA alkyltransferase (MGMT) in
mammalian cells in vitro has been investigated.
Those lectins have been shown to modify DNA
damage repair process, and to induce the MGMT
expression increasing its level in the used model
system.
K e y w o r d s: O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase, expression, lectins, cell culture,
Western­ blotting-analysis, DNA damage and repair, comet assay.
1. Pegg A. E. // Mutat. Res. – 2000. – 462. –
P. 83–100.
2. Лукаш Л. Л., Манько В. Г., Лыло В. В. //
Биополимеры и клетка. – 2001. – 17, № 4. –
С. 265–277.
3. Kyrtopoulus S. A. // Toxic. Lett. – 1998. –
102–103. – P. 53–57.
4. Mitra G., Pauly G. T., Kurman R. и др. // Proc.
Nat. Acad. Sci. USA. – 1989. – 86, N 28. –
P. 8650–8654.
5. Gerson S. L. // G. Clinical. Oncol. – 2002. –
20, N 9. – Р. 2388–2399.
6. Fritz G., Kaina B. // BBA. – 1992. – 1171. –
P. 35–40.
7. Мацевич Л. Л., Коваленко О. А., Сухорада О. М.,
Лукаш Л. Л. Фактори експериментальної
еволюції організмів (Збірн. наук. праць за
ред. акад. М. В. Роїка). – К: Аграрна наука,
2003. – С. 91–97.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
В. В. ЛЫЛО, О. А. ПИВЕНЬ, К. В. СЕРЕБРЯКОВА и др.
8. Коваленко О. О., Лукаш Л. Л. // Цитологія
та генетика. – 2007. – 41, № 6. – С. 62–66.
9. Мацевич Л. Л., Лукаш Л. Л. Фактори
експериментальної еволюції організмів
(Збірник наукових праць за ред. акад.
М. В. Роїка). – К: Аграрна наука, 2004. –
С. 111–116.
10. Sestili P., Alfieri R., Carnicelli D. // DNA
Repair. – 2005. – N 4. – P. 271–277.
11. Morton E. N., Margison G. P. // Carcinogenesis. –
1988. – 9. – P. 45–49.
12. Bradford M. M. // Anal. Biochem. – 1976. –
72. – P. 248–254.
13. Laemmli U. K. // Nature. – 1970. – 227. –
P. 680–685.
14. Singh N., McCoy M., Tice R., Schneider E. //
Exp. Cell Res. – 1988. – 175, N 1. – Р. 189–191.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
15. Iwitzki F., Schlepegrell R., Eichhorn U. et al. //
Arch Toxicol. – 1998. – 72, N 11. – Р. 681–
689.
16. Mitra G., Pauly G. T., Kurman R. et al. // Proc.
Nat. Acad. Sci. USA. – 1989. – 86, N 28. –
P. 8650–8654.
17. Лыло В. В., Манько В. Г., Серебрякова К. В.,
Лукаш Л. Л. // Досягнення і проблеми
генетики, селекції та біотехнології. –
2007. – 1. – C. 117–121.
18. Srivenugopal K. Yuan X., Friedman H., AliOsman F. // Biochemistry. – 1996. – 35. –
P. 1328–1334.
19. Macewicz L., Suchorada O., Lukash L. // Cell
Biology International. 2005. – 29, Issue 1. –
P. 29–32.
Получено 03.07.2008
65