Структура и функциональные свойства биомолекул на

Е.В. Кудряшова
«Структура и функциональные свойства биомолекул на поверхностях
раздела фаз. Новые методы исследования»
Учебное пособие для студентов и аспирантов
специализирующихся в области биохимии и биофизики
Химический факультет МГУ
Москва 2013
1
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
3
Глава 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ
АДСОРБИРОВАННЫХ НА ПОВЕРХНОСТЯХ
РАЗДЕЛА ФАЗ ВОДА-ВОЗДУХ И ВОДА-МАСЛО
5
Глава 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНЫХ
СВОЙСТВ БЕЛКОВ В КОЛЛОИДНЫХ СИСТЕМАХ
23
Глава 3. РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПОДХОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ И БЕЛОК-СОДЕРЖАЩИХ
КОМПЛЕКСОВ НА ПОВЕРХНОСТИ ВОДА-ВОЗДУХ
71
ЛИТЕРАТУРА
136
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
146
2
ВВЕДЕНИЕ
Структурно-функциональное состояние белков на границах раздела фаз в
значительной степени определяет протекание многих жизненно важных
процессов в клетках. Именно на границах раздела фаз локализованы и
функционируют многие биомолекулы, отвечающие за процессы транспорта,
метаболизма и сигнальной трансдукции. Таким образом, разработка новых
подходов к исследованию структурно-функциональных особенностей белков и
ферментов в модельных коллоидных системах представляет очевидный
интерес с фундаментальной точки зрения. Кроме того, исследование на
молекулярном уровне механизмов образования и стабилизации искусственных
коллоидных систем имеет огромное значение для разработки новых
лекарственных форм, а также новых технологий для пищевой и косметической
промышленности.
Исследование функционирования белков и ферментов в коллоидных
системах, на границе раздела фаз и в микроэмульсиях, тесно связано с
изучением механизмов регуляции и обмена в живых системах. Наряду с
неоспоримой фундаментальной значимостью, исследование особенностей
функционирования белков в коллоидных системах представляет особый
интерес с точки зрения практического приложения. В первую очередь речь
идет о разработке новых лекарственных форм, пищевых коллоидных систем и
биологически активных добавок, а также, фермент-содержащих синтетических
моющих средств. В связи с открывающимися перспективами практического
применения, исследование адсорбции белков на поверхностях раздела фаз
привлекает все большее внимание исследователей.
Однако в настоящее время, в арсенале исследователей практически
отсутствуют прямые методы, позволяющие на молекулярном уровне изучать
структурные
и
динамические
свойства
белков
адсорбированных
на
поверхности раздела фаз. Информация, встречающаяся в литературе, носит
скорее качественный характер. Количественных данных по структуре белков и
3
белок-содержащих надмолекулярных ансамблей на поверхностях раздела фаз в
литературе практически не встречается. В представленной работе впервые
разработаны принципиально новые подходы, позволяющие исследовать
структурные свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз на
основе
высокочувствительных
микроспектроскопических
методов,
применяемых для изучения структурных свойств белков в гомогенных
системах. Суть разработанных подходов состоит в применении методов
разрешенно-временной флуоресцентной спектроскопии и ИК спектроскопии в
режиме внешнего отражения (соответственно, ER-TRFA и IRRAS) и
разработка соответствующих методов спектральной симуляции для получения
количественной
информации
конформации,
степени
о
свойствах
агрегации,
белков
(концентрации,
молекулярной
подвижности)
адсорбированных на поверхности вода-воздух. Кроме того, для получения
информации о диффузионных свойствах белков на поверхности раздела фаз
впервые адаптирован и применен метод флуоресцентной корреляционной
спектроскопии (FCS). С применением данных методов впервые получена
детальная информация о структурно-динамических свойствах белков и
ферментов, как в случае моно-, так и мультикомпонентных коллоидных
систем: в составе комплексов с соединениями различной природы –
полисахаридами, липидами, в составе олигомерных белков и белковых
агрегатов.
Разработанные подходы для исследования структурно-функциональных
свойств ферментов и белков в коллоидных системах, на поверхности раздела
фаз и в микроэмульсиях, представленные в данной книге, открывают широкие
перспективы, как для фундаментальных исследований, так и для создания
новых технологий для пищевой промышленности, биотехнологии и медицины.
4
Глава 1.
ИССЛЕДОВАНИЕ
МОЛЕКУЛЯРНЫХ
СВОЙСТВ
БЕЛКОВ
АДСОРБИРОВАННЫХ НА ПОВЕРХНОСТЯХ РАЗДЕЛА ФАЗ ВОДАВОЗДУХ И ВОДА-МАСЛО
Белки
как
амфифильные
соединения,
состоящие
из
аминокислот,
различающихся в широких пределах по своей полярности, спонтанно
адсорбируются на гидрофобных поверхностях, вода-воздух и вода-масло.
Движущей силой процесса является перенос гидрофобных участков белка в
среду с более низкой полярностью. Гидрофильные полярные и заряженные
группы предпочтительно ориентированы в водную фазу. На рис. 1.1.
изображены основные стадии адсорбции белков (не обязательно в указанном
порядке).
5
2
3
Air
4
Water
1
Рис. 1.1. Схематическое представление основных стадии адсорбции белков и образования
поверхностного слоя белка: 1) транспорт молекул белка к поверхности (диффузия), 2)
адсорбция молекул белка, 3) конформационные изменения, 4) взаимодействия между
соседствующими молекулами белка и 5) отклик на приложенное внешнее воздействие на
пленку (растяжение-сжатие).
Стадия 1 представляет собой перенос белка к поверхности путем
диффузии или конвекции. Скорость диффузии обратно пропорциональна
радиусу белковой глобулы. Поскольку большинство белков не слишком сильно
различаются по размеру, огромные различия, наблюдаемые в адсорбционной
5
кинетике белков, в основном вызваны другими молекулярными причинами.
Стадия 2 отражает взаимодействие с поверхностью белков, находящихся в
непосредственной близости от поверхности. Считается, что этот процесс
определяется, главным образом, равновесием между общим зарядом белка и
гидрофобностью поверхности белка (ГЛБ). Первый фактор увеличивает
кинетический барьер адсорбции, а последний фактор – уменьшает [1-2]. Данная
стадия адсорбции является определяющей и существенно различается для
разных белков. Стадия 3 отражает денатурацию белка на поверхности. Степень
денатурации зависит от конформационной стабильности белка [3-4] и
гидрофобности поверхности белка. Неупорядоченно свернутые полимерные
молекулы обычно легко разворачиваются на гидрофобных поверхностях,
располагаясь вдоль поверхности и образуя «петли и хвосты». Глобулярные
белки в меньшей степени подвержены денатурации на поверхности [5].
Денатурация глобулярных белков обычно носит ограниченный характер в
степени, зависящей от структуры белка [3-7]. Так, лизоцим при адсорбции на
поверхности
сохраняет
каталитическую
активность.
Файнермен
с
сотрудниками предложил модель, описывающую адсорбцию белков в которой
площадь поверхности занятая молекулами белка может изменяться между
максимальной и минимальной величиной в зависимости от поверхностного
давления [8]. В соответствии с этим, белки рассматриваются как «сжимаемые»
или мягкие частицы [9], причем термин «сжимаемые» относится к площади
поверхности, занимаемой молекулой белка, а не к объему молекулы. Этап
адсорбции 4 относится к межмолекулярному взаимодействию белков на
поверхности, где основную роль играет баланс между гидрофобными
взаимодействиями молекул белка и электростатическим отталкиванием
заряженных частиц (в условиях высокого общего заряда на белке). И наконец,
отклик на приложенное внешнее воздействие на пленку (растяжение-сжатие)
определяется такими факторами как способность или (неспособность) к
десорбции с поверхности. Совокупность молекулярных свойств белков,
конформационная стабильность, гидрофобность поверхности, распределение
6
заряда на белке, характер межмолекулярных взаимодействий определяет
адсорбционные свойства белков и реологические свойства адсорбированного
слоя, что в свою очередь влияет на стабильность коллоидных систем, пен и
эмульсий [10-12].
1.1. Методы слежения за адсорбцией белков на поверхностях вода-воздух и
вода-масло; исследование реологических свойств белковых пленок
Метод мономолекулярных слоев
При адсорбции белков, так же как и других поверхностно-активных веществ, на
поверхностях раздела фаз вода-воздух или вода-масло наблюдается изменение
поверхностного натяжения. Одним из классических методов слежения за
адсорбцией
ПАВ
на
поверхности
вода-воздух
является
метод
мономолекулярных слоев Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ). Для создания монослоя
используется ленгмюровская ванна (рис. 1.2). Рабочая площадь ванны
ограничена подвижными барьерами - с их помощью площадь можно менять
(рис. 1.2).
Рис. 1.2. Ленгмюровская ванна, оснащенная подвижными барьерами.
Для характеризации структуры монослоя белка строят изотерму сжатия (рис.
1.3) - зависимость размера площади, приходящейся на одну молекулу, от
поверхностного давления. Для этого регистрируется изменяющаяся площадь
рабочей поверхности ванны и с помощью ленгмюровских весов измеряется
поверхностное
давление.
Можно
контролировать
также
вязкость,
электростатический потенциал монослоя, изменение микроструктуры монослоя
7
(исследования с помощью микроскопа при отражении света от монослоя под
углом Брюстера).
Метод монослоев с использованием техники Ленгмюра – Блоджетта (рис.
1.2) применяется для изучения ферментативной активности мембранотропных
белков, например, липаз. Смешанные монослои липида и фермента получают
при нанесении на поверхность воды дисперсий везикул, либо при адсорбции
белка на заранее приготовленный мономолекулярный слой липида [13]. Для
сформировавшихся таким образом монослоев и полислоев характерно
сохранение активности мембранных ферментов, которая проявляется при
введении субстратов в водную подложку.
Для
изучения
свойств
мономолекулярных
слоев
и
измерения
каталитической активности ферментов с помощью техники Ленгмюр-Блоджетт
(ЛБ) измеряют двумерное поверхностное давление: -,
где  и поверхностные натяжения соответственно подложки и монослоя
ПАВ при строго заданном и известном содержании ПАВ на поверхности.
Поверхностное давление, которое можно изменять передвижением барьеров,
является
фактором,
регулирующим
течение
ферментативной
реакции,
поскольку определяет структуру монослоя, концентрацию и ориентацию
липидов, характер и силу взаимодействия фермента с липидным монослоем.
На поверхности раздела фаз вода-воздух в ЛБ-ванне можно формировать
монослой не только из молекул одного типа поверхностно-активного вещества,
но также получать смешанные монослои из молекул различных веществ.
Структура многокомпонентного монослоя зависит от ряда факторов: взаимного
соотношения количества веществ в монослое, соотношения длин главных осей
молекул и их строения. На основе получения смешанных монослоев были
созданы модели биологических липидных мембран с включениями белковых
молекул.
Используя субфазу, можно химически модифицировать монослой.
Например, можно модифицировать монослои, присоединяя к ним из субфазы
ионы металлов, белковые молекулы, нуклеиновые кислоты и т.д. Причем для
8
формируемой структуры очень важны не только само вещество, из которого
строится монослой на границе раздела вода-воздух, и “реагент” из субфазы, но
и характер их взаимодействия. Например, поместив в субфазу ДНК, а на
поверхности, сформировав монослой октадециламина или диметилалиламина, в
результате получают ЛБ-пленку с включением между липидными слоями
расплетенной (в первом случае) или спиральной (во втором) ДНК.
Тензиометрия
Другим способом измерения поверхностного натяжения является анализ
формы капли или воздушного пузырька, созданного в водном растворе белка,
для этого используется капельный тензиометер, в современном формате,
компьютерно управляемый автоматический капельный тензиометер (ADT).
Изменение в поверхностном натяжении вызванном адсорбцией белка на
поверхности
вода-воздух
или
вода-масло
выражается
величиной
поверхностного натяжения γ или поверхностного давления, П=γ 0-γ, где γ0 поверхностное натяжение поверхности в отсутствие белка и γ – измеряемое
поверхностное
натяжение.
натяжения
времени
во
Анализ
γ
(t)
кривых
часто
изменения
используют
для
поверхностного
характеризации
адсорбционных свойств белков.
На кривых снижения поверхностного натяжения при адсорбции ПАВ, как
правило, можно выделить 3 интервала «режима» адсорбции, которые
соответствуют различным агрегатным состояниям адсорбированного ПАВ в
поверхностном слое по аналогии с объемной фазой: 1- газообразные (Gпленки), которые приближенно подчиняются уравнению состояния идеального
двухмерного газа: П= RTГ. 2 – жидкие (L2 и L1-пленки), соответственно жидкорастянутые и жидкие пленки. Для последних характерны малые сжимаемости,
резкий подъем на кривых развития поверхностного давления при сжатии
пленки
(П
от
А).
Жидко-растянутые
пленки
рассматривается
как
промежуточное состояние между газообразными G-пленками и жидкими L1-
9
пленками; и 3 – конденсированные жидкие или твердые пленки (S-пленки),
сжимаемость которых еще ниже, чем у жидких L1-пленок [2, 8, 10, 14].
Следует
подчеркнуть
отличия
в структуре
поверхностного
слоя
образованного низкомолекулярными ПАВ и макромолекулами, в частности,
белками. В первом случае молекулярная подвижность ПАВ высокая и
молекулярные перестройки в поверхностном слое происходят очень быстро. В
связи с этим поверхностное давление полностью определяется поверхностной
концентрацией.
Однако, в случае белков внутри- и межмолекулярные перестройки на
поверхности вода-воздух или вода-масло происходят далеко не мгновенно, для
высокомолекулярных
ПАВ
характерна
малая
скорость
установления
равновесия между адсорбционным слоем и объемом раствора. Помимо этого
конформационные
перестройки
могут
вносить
вклад
в
изменение
поверхностного натяжения. В случае адсорбции белков нельзя также не
учитывать
процесс
межмолекулярного
взаимодействия,
приводящий
к
агрегации и образованию вязкоэластичных геле-подобных фаз, определяющих
необратимость на поздних стадиях адсорбции, а также возможный процесс
образования мультислоев. Перечисленные факторы определяют характерный
вид кривых снижения поверхностного натяжения от времени при адсорбции
белков в отличие от низкомолекулярных молекул ПАВ. В силу тех же факторов
кривые снижения поверхностного натяжения при адсорбции белков во многих
случаях не совпадают с кривыми увеличения поверхностной концентрации
белка. Измерение зависимости поверхностного натяжения от времени
формирования
адсорбционного
слоя
позволяет
получать
кинетических закономерностях адсорбционных явлений.
10
сведения
о
Поверхностное натяжение
Рис. 1.3. Типичная кривая снижения поверхностного натяжения белков при адсорбции из
разбавленных растворов на поверхности вода-воздух или вода-масло.
Интервал I: индукционный период
В случае адсорбции белков интервал I на кривых снижения поверхностного
натяжения соответствует индукционному периоду (лаг-фазе или мертвому
времени) адсорбции, где поверхностное натяжение практически не изменяется
по сравнению со свободной от белка поверхностью.
Рис. 1.4. Схематическое представление адсорбции глобулярных белков на поверхности водавоздух или вода-масло в интервале I на кривых изменения поверхностного натяжения.
Индукционный период (лаг-фаза) уменьшения поверхностного натяжения соответствует
процессу диффузии молекул белка к поверхности и началу конформационных изменений в
адсорбированных молекулах белков. Нативная конформация белков представлена кружками,
эллипсы соответствуют молекулам белка с конформационными изменениями [14].
Подобное явление – наличие лаг-фазы адсорбции довольно часто
наблюдается при адсорбции белков из разбавленных растворов (менее 0.1
11
мг/мл) на поверхности вода-воздух [14]. Механизм адсорбции в интервале I
диффузионно-контролируемый.
Интервал II: насыщение монослоя
Интервал II характеризуется (или определяется) несколькими процессами:
помимо диффузии вклад в развитие поверхностного давления вносят
конформационные изменения при адсорбции белков, а также и начальный этап
процесса гелеобразования. Только после того как поверхность насыщается
белком, дальнейшая адсорбция приводит к изменениям в поверхностном
натяжении
и
поверхностной
концентрации.
Другими
словами,
после
достижения определенной концентрации адсорбированного белка (во многих
случаях порядка 1 мг/м2), наблюдается резкое снижение поверхностного
натяжения.
Рис. 1.5. Схематическое представление адсорбции глобулярных белков на поверхности водавоздух или вода-масло в интервале II на кривых изменения поверхностного натяжения [14].
Интервал III: поверхностное гелеобразование
И последний интервал III соответствует медленному снижению поверхностного
натяжения, этот участок соответствует конформационным изменениям в белке
в адсорбированном слое, и постепенному образованию прочной «сети» вязкоэластичного геле-подобного поверхностного слоя. Схематически интервал III
12
снижения поверхностного натяжения представлен на рис. 1.6.
Рис. 1.6. Схематическое представление адсорбции глобулярных белков на поверхности водавоздух или вода-масло в интервале III на кривых изменения поверхностного натяжения.
Конформационные изменения и агрегация вызывает постепенное снижение поверхностного
натяжения без дальнейшего изменения концентрации белка в поверхностном слое.
Распространение агрегатов по всей поверхности раздела фаз индуцирует образование
аморфной геле-подобной структуры поверхностного слоя [14].
Наиболее важные отличия поверхностных пленок белков от пленок
образованных низкомолекулярными ПАВ обнаруживаются при сопоставлении
их реологических свойств.
Измерение реологических характеристик адсорбированного слоя белка
Реологические методы исследования белковых пленок образованных при
адсорбции белков на поверхностях определяют устойчивость или эластичность
адсорбированного слоя белка к физическим деформациям.
Изотермы сжатия. Для изучения состояния белков в адсорбционном слое
применяют метод измерения изотерм сжатия. Этот метод позволяет получить
сведения о конформации молекул белка в поверхностном слое, поскольку
конформация белка определяет величину площади поверхности, занимаемую
ими в двумерной пленке. Было обнаружено, что в случае пленок, образованных
глобулярными белками, альбумином, γ-глобулином, гемоглобином, трипсином
13
и др., изотермы двумерного давления монотонны и обратимы при сжатии
вплоть до давления 15-20 мН/м. При большем сжатии пленок, когда площадь
поверхности в пересчете на одну аминокислотную группу составляет порядка
0.17 нм2, двухмерное давление резко возрастает и в пленках наблюдаются
необратимые
изменения:
они
могут
приобретать
нерастворимость
и
своеобразные структурно-механические свойства (геле-образные), что связано с
изменением конформации белков и усилением белок-белковых взаимодействий
– двухмерной агрегации белковых молекул. Более сильное сжатие пленок (до
0.0.5-0.1 нм2) приводит к коллапсу – образованию складок, полимолекулярных
слоев, отрыву участков пленки от поверхности.
Существует также два типа измерений вязко-эластичных характеристик
белковых
пленок.
В
«дилатационном»
методе
измеряют
изменение
поверхностного давления П при деформации (сжатии или расширении пленки в
синусоидальном режиме) как функцию от площади поверхности А (см2). Форма
поверхности в таком формате остается постоянной. Данным методом
измеряется параметр поверхностный дилатационный модуль, Е = -dП/dlnА
(=dγ/ dlnА).
В другом методе измеряется устойчивость беловой пленки к деформации
сдвига. В таком формате изменяется форма поверхности, а площадь
поверхности
и,
следовательно,
поверхностное
давление
сохраняется
постоянным. Данным способом характеризуют силу взаимодействия между
адсорбированными молекулами белка в поверхностном слое.
Следует отметить, что описываемые коллоидно-физические методы
исследования белковых пленок ценны для получения информации о
функционировании белков в живых системах, они открывают путь к изучению
механизмов процессов обмена на границах раздела фаз в клетках в различных
биологических объектах.
14
Эллипсометрия
—
высокочувствительный
и
точный
поляризационно-
оптический метод исследования поверхностей и границ раздела различных сред
(твердых, жидких, газообразных), основанный на изучении изменения
состояния поляризации света после взаимодействия его с поверхностью границ
раздела этих сред (рис. 1.7). Основное уравнение эллипсометрии Друде для
отражённого света на первой границе имеет вид:
где углы подчиняются закону Снеллиуса в форме для комплексного
представления показателя преломления:
(nins − ikins)sin(θins) = (ntr − iktr)sin(θtr), где:

nins — показатель преломления среды, из которой свет падает на границу
раздела;

θins — угол падения света — угол между падающим на поверхность
лучом и нормалью к поверхности;

ntr — показатель преломления среды, в которую свет попадает, пройдя
границу раздела;

θtr — угол преломления света — угол между прошедшим через
поверхность лучом и нормалью к поверхности.
Непосредственные измерения на эллипсометрических приборах состояния
поляризации света во внешней среде отражения несут информацию об
оптических константах сред на этой исследованной границе раздела.
15
Рис. 1.7. Принципиальная схема работы эллипсометрического прибора.
Метод основан на том, что при отражении монохроматического
плоскополяризованного света, падающего под углом
электромагнитная
волна,
в
взаимодействуя
с
веществом,
преобразуется
эллиптически
поляризованную (рис. 1.7). Это объясняется тем, что электромагнитные
колебания, совершающиеся в плоскости падения (р-колебания) светового луча
и в перпендикулярной к ней плоскости (s-колебания), при отражении света поразному изменяют амплитуду напряженности электрического поля Е и
начальную фазу колебаний. Отношения амплитуд
или
комплексные коэффициенты отражения, вычисляют в рамках конкретной
модели отражающей поверхности, используя уравнения электромагнитной
теории света.
При изучении адсорбционных свойств белков адсорбированных на
поверхности вода-воздух методом эллипсометрии измеряется различие в
поляризации отраженного луча от поверхности раздела фаз в отсутствии и в
присутствии адсорбированного белка [15-18]. Параметры, получаемые методом
эллипсометрии, – толщина поверхностного слоя (d) и коэффициент отражения
(n) поверхностного слоя белка. Изменение адсорбированного количества белка
связано с измеряемыми параметрами d и n. Время измерения каждой точки в
современных эллипсометрах составляет порядка 10 секунд, таким образом,
метод эллипсометрии позволяет следить за скоростью адсорбции белков во
16
времени. Так, в работе [4] методом эллипсометрии было изучено влияние
поверхностной гидрофобности на адсорбционные свойства белков на примере
овальбумина. Овальбумин является слабым пенообразующим агентом, что
связывают с низкой скоростью развития поверхностного давления и
поверхностной концентрации при адсорбции белка. Однако было обнаружено,
что введение 3-4 остатков каприловой кислоты на поверхность овальбумина
путем ковалентной модификации существенными образом увеличивает
адсорбции
белка.
Было
продемонстрировано
[4],
что
поверхностная
гидрофобность белка один из параметров, определяющих адсорбционные и
пенообразующие свойства белков.
Достоинства эллипсометрии – методическая простота и высокая скорость
измерений, возможность производить их в ходе процесса в режиме реального
времени, в вакууме, при высоких температурах; кроме того, при экспериментах
поверхности не загрязняются и не разрушаются. Недостаток метода:
невозможность определять структурные свойства белков адсорбированных на
поверхностях; трудность правильного выбора модели отражающей системы и
соответственно, интерпретации результатов измерений. Поэтому наиболее
перспективно сочетание эллипсометрии с другими методами исследования
поверхности, например, УФ и рентгеновской спектроскопией, методами
дифракции электронов и рассеяния ионов.
Применение
метода
отражения
нейтронов
для
получения
профилей
распределения белковых молекул адсорбированных на границе раздела фаз
вода-воздух и вода-масло. Метод основан на том, что из-за отсутствия у
нейтронов электрического заряда они глубоко проникают внутрь большинства
материалов, что позволяет рассматривать их как достаточно прозрачные среды
для распространения нейтронных волн.
Метод нейтронного отражения также как эллипсометрия используются
для получения профиля плотности поверхностных слоев, т.е. распределения
белка на поверхности в слое порядка 10 нм [19-21]. Так, метод нейтронного
17
отражения
был
применен
для
исследования
адсорбции
белков
β-
лактоглобулина и β-казеина на поверхностях вода-воздух и вода-масло [21-22].
Было обнаружено, что эти два белка образуют четко выраженную и
пространственно отделенную мономолекулярную белковую пленку при
адсорбции на поверхностях. Было найдено, что в случае β-лактоглобулина,
адсорбированного на поверхности вода-воздух из низких концентраций,
толщина составляла 4 нм, что соответствует толщине монослоя. При этом,
общее количество белка составляло 3.2 мг/м2.
При
исследовании
смешанных
белок-полисахаридных
слоев
(β-
лактоглобулина с пектином) [23] показало, что при адсорбции комплексов
происходит образование существенно более «толстого» (по сравнению со
свободным белком (4.5 нм)) поверхностного слоя – толщиной 55 нм, что
соответствует геометрическому размеру комплекса в водном растворе (по
данным динамического светорассеяния). Причем, в избытке полиэлектролита
(когда частица комплекса несет высокий отрицательный заряд) образуется
существенно менее насыщенный по белку поверхностный слой (порядка 2
мг/м2) по сравнению с нейтральным комплексом, когда заряды на полианионе
скомпенсированы за счет взаимодействия с белком. В последнем случае
содержание белка в слое составляет 10-12 мг/м2 (рис. 1.8)
Рисунок 1.8. Схематическое представление адсорбированных слоев на поверхности водавоздух на основе анализа данных полученных методом нейтронного отражения. A: монослой
белка, Б – смешанный поверхностный слой, полученный при адсорбции комплекса белокпектин в условиях избытка пектина (отрицательно заряженный комплекс); B – смешанный
поверхностный слой, полученный при адсорбции нейтрального комплекса белок-пектин [23].
18
Таким образом, метод нейтронного отражения является информативным
для изучения адсорбционных слоев белков и смешанных комплексов, позволяет
получать количественную информацию о толщине поверхностного слоя и
распределении концентрации биомолекул вблизи поверхности вода-воздух [2426]. Однако следует подчеркнуть, что эксперименты такого рода трудоемки и
дорогостоящие и не могут проводиться рутинно. Для исследования белков
методом нейтронного отражения для проведения эксперименты требуется
деитеризация белков, что может повлиять на адсорбционные свойства белков.
Получение детальной молекулярной информации методам нейтронного
отражения и рентгеновских лучей в принципе возможно, однако для этого
требуется дальнейшее развитие теоретической базы и совершенствования
оборудования. На данном этапе результаты, получаемые данными методами,
являются полуколичественными.
Методы сканирующей зондовой микроскопии для исследования поверхностей
Анализируя методы исследования ленгмюровских монослоев и ленгмюровских
пленок нельзя не рассмотреть методы сканирующей зондовой микроскопии. В
настоящее время сканирующая зондовая микроскопия стала одним из наиболее
информативных методов в исследовании поверхности материалов. Сегодня
СЗМ позволяет производить самые разные операции, начиная с анализа
шероховатости поверхности, заканчивая получением трехмерных изображений
отдельных атомов, наноструктур или живых клеток.
Общий принцип работы СЗМ заключается в следующем. С помощью
системы позиционирования измерительный зонд подводится к поверхности
исследуемого образца. При приближении образца и зонда на расстояние менее
сотен
нм
структурами
последний
начинает
анализируемой
взаимодействовать
поверхности.
с
Перемещение
поверхностными
зонда
вдоль
поверхности образца осуществляется с помощью сканирующего устройства,
которое обеспечивает сканирование поверхности иглой зонда. Основной
интерес вызывает взаимодействие зонда с исследуемой поверхностью. Именно
19
тип взаимодействия, используемый конкретным сканирующим зондовым
микроскопом, определяет его возможности и сферу применения. Так в основе
работы атомно-силовых микроскопов лежит использование различных видов
силового взаимодействия зонда с поверхностью.
Атомно-силовая микроскопия (АСМ)
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) представляет собой мощный инструмент,
используемый для снятия профиля поверхностей и для изменения её рельефа, а
также для манипулирования микроскопическими объектами на поверхности с
нанометровым разрешением. АСМ применяется для изучения различных
органических и биологических объектов, наноструктур в приложениях
неразрушающего контроля, диагностики и модификации поверхностей [27].
Метод АСМ (и различные его модификации) используется для изучения
структуры полимерных пленок, а также индивидуальных макромолекул на
поверхностях раздела фаз твердое/воздух или твердое/жидкость [28-30]. В
частности, в последние годы методы AСМ активно применяются для
исследования
механизмов
функционирования
клеточных
мембран,
исследования биологических поверхностей в их нативном состоянии. Имея
пространственное разрешение порядка 1 нм, АСМ позволяет идентифицировать
различные
надмолекулярные
структуры
и
функциональные
состояния
мембранных белков. AСM позволяет детектировать взаимодействия между
двумя отдельными клетками с молекулярным разрешением.
Метод АСМ позволяет охарактеризовать систему в целом, причем
информация о молекулярных свойствах биомолекул (белков) на поверхностях
может быть получена в режиме on-line. В настоящее время нет литературных
данных
по
применению
метода АСМ
для
исследования
биомолекул
адсорбированных на поверхности вода-воздух и вода-масло напрямую,
непосредственно в процессе образования белковых пленок. Однако в ряде
работ продемонстрирована возможность получать методом АСМ двухмерные
изображения поверхностных пленок белков на флюидных поверхностях вода20
воздух и вода-масло путем перенесения образовавшихся белковых пленок и на
твердые поверхности. Так, в работе [28] методом AСM были получены
изображений белковых пленок образованных БСА и β-казеином на поверхности
вода-воздух и вода масло с последующим перенесением на слюдяную
поверхность для последующего анализа пленок (рис.1.9).
Рис. 1.9. АСМ изображения пленки бычьего сывороточного альбумина (БСА) образованной
на поверхности гексадекан-вода с последующим перенесением на слюдяную поверхность. (a)
Параметры сканирования: 500 Х 500 нм, шкала яркости 0–7.6 нм. (b) Параметры
сканирования: 200 х 200 нм, шкала яркости 0–7.0 нм [28].
Следует отметить, что хотя применение метода АСМ при изучении белковых
пленок образованных при адсорбции белков на флюидных поверхностях
требует дальнейшей оптимизации, данный метод является перспективным для
получения изображений таких пленок, что крайне важно при изучении
адсорбционных
свойств белков и анализа и
оптимизации
структуры
получаемых белковых пленок. В частности, в применении к пищевым
коллоидным системам, структура белковых пленок определяет текстуру и
вкусовые качества пищевых продуктов.
21
ГЛАВА 2.
МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
СТРУКТУРНЫХ
СВОЙСТВ
БЕЛКОВ
В
КОЛЛОИДНЫХ СИСТЕМАХ
В настоящее время практически отсутствуют прямые методы, позволяющие
изучать структурные свойства белков, адсорбированных на поверхностях
раздела фаз вода-воздух и вода-масло. Информация, о структурных свойствах
белков встречается в литературе крайне редко и носит, скорее качественный
характер. Практически отсутствует подходы, позволяющие следить за
изменениями в структуре и агрегационном состоянии белков в процессе
адсорбции в режиме реального времени. В настоящее время для исследования
свойств
белков,
адсорбированных
на
поверхностях,
разрабатываются
подходы, основанные на применении разнообразных спектроскопических
методов в режиме внешнего отражения.
На данный момент разработан ряд современных высокочувствительных
спектроскопических методов, позволяющих получать детальную информацию
о структурных и динамических свойствах белков: флуоресцентные методы
(флуктуационные и релаксационные – разрешенно-временные), а также
методы спектроскопии кругового дихроизма и ИК-спектроскопии Фурье. В
настоящее время эти методы широко применяются для исследования
структуры белков в растворах. Данные методы представляются также
перспективными
для
изучения
структурно-динамических
свойств
в
гетерогенных системах, на поверхностях раздела фаз. Кратко рассмотрим
основы вышеуказанных методов и перспективы их применения для изучеия
структуры белков на повернхости раздела фаз.
2.1. Применение методов инфракрасной (ИК) спектроскопии Фурье для
исследования структуры белков и других биополимеров
Одним из доступных и относительно простых с методической точки зрения, и в
то же время чрезвычайно информативных методов анализа структуры
биомолекул, в том числе в нанобиосистемах является метод инфракрасной
22
спектроскопии Фурье. Метод основан на регистрации колебательных спектров
молекул, что дает детальную информацию о состоянии молекул или
функциональных групп в исследуемом образце. ИК спектроскопия является
высокочувствительным физическим методом, который позволяет быстро и
точно
проводить
анализ
структуры
биомолекул
(белков,
липидов,
полисахаридов и других биополимерных молекул) при работе с несколькими
микрограммами исследуемого вещества. ИК-спектроскопия в настоящее время
является распространенным методом исследования вторичной структуры
белков на количественном уровне. Метод ИК спектроскопии широко и успешно
применяется при исследовании структуры белков, входящих в состав как
гомогенных, так и различных гетерогенных и микрогетерогенных систем. ИК
спектроскопия не требует оптической прозрачности раствора, что создает
возможность измерять спектры белка в составе крупных фрагментов мембран, в
суспензиях, в иммобилизованном агрегированном состоянии, в тельцах
включения, и др. Уникальным преимуществом метода ИК-спектроскопии
является возможность исследовать структуру и пространственную ориентацию
биомолекул в интактных биологических мембранах или в искусственных
липопротеидных комплексах – белок-содержащих липосомах. Это позволяет
изучать структуру многих мембранных белков, которые не могут быть изучены
методом
рентгеноструктурного
анализа.
Данный
метод
представляется
перспективным для исследования структуры белков, входящих в состав
различных нанобиосистем. Так метод ИК-спектроскопии был успешно
применен
при
исследовании
структуры
супрамолекулярных
белковых
комплексов при образовании пептидных нанотрубок; а также структуры белков
включенных в липосомы и обращенные мицеллы ПАВ; для анализа структуры
ферментов
в
составе
фермент-полиэлектролитных
комплексов,
как
в
растворимом, так и в состоянии геля. Важным преимуществом метода ИКспектроскопии
является
возможность
следить
за
межмолекулярными
взаимодействиями в белках или агрегацией. Агрегация является одним из
основных механизмов инактивации ферментов; агрегация играет ключевую
23
роль в гелеобразовании, а также в процессах самосборки белков в
супрамолекулярные комплексы (в том числе при образовании наноструктур,
наносфер и нанотрубок). Поэтому возможность напрямую следить за
агрегацией белка крайне важна при изучении свойств ферментов и белоксодержащих систем.
Метод ИК-спектроскопии в настоящее время успешно применяется на
практике,
в
медицинском
промышленности.
Метод
анализе,
позволяет
в
пищевой
осуществлять
и
фармацевтической
определение
многих
контролируемых показателей в таких сложных системах как кровь, в
медицинских препаратах, а также в пищевых продуктах сложного химического
состава, таких как шоколад, сыр, молоко. Так, в молочной промышленности
метод инфракрасной спектроскопии применяют для определения массовой
доли жира, белка, лактозы и др. веществ.
Исследования структуры белков методом ИК спектроскопии Фурье.
ИК спектроскопия в настоящее время является весьма распространенным
методом исследования структуры белков. Существует несколько режимов
измерения ИК спектров. Классическим является метод «пропускания»
(трансмиссии), где ИК луч пропускается через раствор белка в тонкой кювете
толщиной порядка 10 мкм (рис. 2.1). Ранее определенную проблему с анализом
трансмиссионных ИК-спектров представлял значительный вклад воды и
водяного пара. Так, вода (в жидкм состоянии) имеет характеристические
«мажорные» пики вблизи частот 3300 и 1600 см-1, в области ИК спектра,
чувствительной к вторичной структуре белков, что несколько усложняет
анализ. Однако современные ИК спектрометры Фурье оснащены програмным
обеспечением, которое помогает учитывать вклад воды в спектр белков, что в
большинстве случаев решает данную проблему.
В настоящее время все более популярным становится другой формат ИКспектроскопии Фурье - нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО
или FTIR-ATR). Его преимущество – высокая чувствительность, небольшие
24
количества анализируемого вещества (микро-количества), а также удобство
нанесения и измерения в методическом плане. Поскольку метод FTIR-ATR не
требует оптической прозрачности образца, что создает возможность измерять
спектр белка в суспензии, в иммобилизованном, агрегированном состоянии, в
составе
крупных
фрагментов
мембран.
Применимость
метода
ИК
спектроскопии при исследовании гетерогенных систем обусловлена тем
фактом, что в ИК диапазоне длин волн светорассеяние (обычно значительное в
случае гетерогенных систем) практически не вносит вклад в спектр: не
увеличивает шумовой сигнал и не искажает получаемый спектр.
Метод пропускания
Раствор белка или пленка
ИК спектр (Abs=-log(I/I0))
Метод нарушенного полного внутреннего отражения
Пленка белка
n2
n1
ИК спектр (Abs=-log(R/R0))
Ge кристалл
Рис. 2.1. Инфракрасная спектроскопия: режим пропускания и нарушенного полного
отражения (FTIR-ATR).
25
Применение метода FTIR-ATR для исследования свойств белков (как в
гомогенных системах, так и в составе наносистем) основано на следующем:
инфракрасный луч, направленный на отражающую поверхность кристалла
(например, германиевого) в условиях, когда свет полностью отражен - под
определенным углом α=1/sin (n2/n1), многократно отражается внутри кристалла
до тех пор, пока свет не пройдет до конца кристалла, затем попадает на
детектор, получают ИК спектр полного отражения (фона), R0=f(). Затем
наносят исследуемый образец белка на поверхность кристалла, тем самым
изменяется коэффициент преломления внешней среды n2. Получают ИК спектр
нарушенного полного отражения образца, R = f() [31-33]. Результирующий
абсорбционный ИК спектр белка выражается следующим образом: Abs=log
R/R0 (рис. 2.1).
В
ИК
спектре
белков
обычно
рассматривают
следующие
характеристические области: область амид А (валентные колебания атомов NH связей), амид В, амид 1 (вклад валентных колебаний C=O связи - 80%; и C-N
– связи – порядка 15 %); амид 2 (основной вклад деформационных колебаний
N-H связей (80%) и минорный вклад – валентных колебаний C-N – связи –
порядка 15 %) и амид 3 (рис. 2.2). Из анализа спектров получают следующую
информацию: концентрацию (из интенсивности всех пиков), конформацию (из
формы амид 1, амид 2 и амид 3 пиков) и пространственную ориентацию белка,
которая реализуется, например в липидном бислое. Пространственная
ориентация белков определяется из соотношения интенсивностей полос амид 1
области
(которая
соответствует
валентным
колебаниям
связей
С=О
полипептидной цепи, направленным вдоль α-спиралей в белках) и амид 2
области (которая соответствует деформационным колебаниям N-H связей
направленных перпендикулярно α-спиралям).
ИК
спектроскопию
широко
используют
для
анализа
вторичной
структуры белков. Области спектра амид 1, 1600-1700 см-1, представляет для
этой цели наибольший интерес, т.к. именно она наиболее чувствительна к
вторичной структуре белка. Амид 2 и 3 области также чувствительны к
26
изменениям во вторичной структуре. Однако в случае амид 3 области ИК
спектра существует множество побочных факторов, которые влияют на
структуру спектра и усложняют анализ вторичной структуры.
Каждый из элементов вторичной структуры α-спирали, β-структуры, βповороты, и неупорядоченные структуры характеризуется своими одной или
несколькими (мажорной и минорными) полосами и соответствующими
коэффициентами экстинкции в области амид 1 (рис. 2.3).
Рис. 2.2. ИК спектры β-казеина, измеренные методом нарушенного полного внутреннего
отражения FTIR-ATR, для высушенной пленки полученной из 100 л раствора -казеина (20
мг/мл в 20 мM натрий-фосфатном буфере). Амид 1 и Амид 2 области спектра
приведены отдельно на нижнем графике. Из работы [35].
Интересно, что ИК спектры в большей степени чувствительны к
изменениям в β- структуре. Дело в том, что α-спирали и неупорядоченные
структуры имеют близкие длины волн в амид 1 области ИК спектра – 1650 1655 см-1, и 1645 – 1652 см-1 соответственно, поэтому их бывает трудно
дискриминировать. В то время как с β-структурой такой проблемы нет - она
имеет два основных характеристических пика (интервалы волновых чисел
1628-1635 см-1 и 1680-1690 см-1.
27
Рис. 2.3. Соотнесение полос в ИК-спектрах белков с элементами вторичной структуры из
работы [36].
Важным преимуществом метода ИК-спектроскопии является возможность
следить за межмолекулярными взаимодействиями в белках или агрегацией.
Агрегация играет ключевую роль в гелеобразовании, а также в процессах
самосборки белков в супрамолекулярные комплексы (в том числе при
образовании наноструктур, наносфер и нанотрубок). Поэтому возможность
напрямую следить за агрегацией белка крайне важна при изучении свойств
белок-содержащих систем.
В ИК спектрах белков можно наблюдать два характеристических пика в
амид 1 области 1620-1624 и 1690-1696 см-1, которые соответствуют
антипаралельным
β-слоям
и
которые
достаточно
удалены
от
пиков
параллельных β-слоев и от других элементов вторичной структуры. При
агрегации
белков чаще
всего
наблюдается
экстенсивное
образование
дополнительных анти-параллельных β-слоев.
Так, при изучении гелеобразования мажорного белка куриного яйца,
овальбумина, (широко применяемого для стабилизации коллоидных систем в
пищевой промышленности) следили за изменениями структуры белка. В
структуре
нативного
овальбумина
практически
не
содержится
антипаралельных β-слоев и в спектре отсутствуют соответствующие пики (рис.
28
2.4). В то время как в спектре гелеобразующего термоденатурированного и
агрегированного
овальбумина,
сразу
же
видно
появление
пиков
соответствующих антипараллельным β-слоям (рис. 2.4), указывающих на
образование межмолекулярных белок-белковых взаимодействий.
антипараллел
β-слои
Absorbtion
параллел β-слои
2
1
1700
1660
1620
1580
cm-1
Рис. 2.4. Амид 1 область ИК спектров нативного (1) и агрегированного овальбумина (2).
Более детальную информацию об агрегации белка можно получить,
анализируя ИК спектры методом второй производной. Рассмотрим этот прием
на примере овальбумина и гомологичного ему белка, ингибитора протеаз α1-Pi
[37]. При обработке ИК спектров методом второй производной разрешение
пиков существенно выше по сравнению с исходными спектрами (рис. 2.5).
29
Исходный спектр белков
Рис. 2.5. Исходные (а) и дифференциальные (б) ИК-спектры овальбумина и белка α1-Pi в
Амид I области [37].
При нагревании белков выше температуры денатурации (соответственно,
до 65 и 85°C) в спектрах термоденатурированных и агрегированных
овальбумина и α1-Pi (агрегация показана в независимом эксперименте методом
гель-фильтрации),
наблюдается
появление
четко
разрешенных
пиков,
соответствующих антипараллельным β-слоям на длинах волн 1624 и 1694 см-1
(рис. 2.6), свидетельствующих об образовании агрегатов [37].
30
Волновое число, см-1
Волновое число, см-1
Рис. 2.6. Спектры второй производной в Амид I области белков, овальбумина (левый график)
и α-Pi (правый график) при различных температурах от 25 до 85°C или до 65°C,
соответственно. Стрелками указано направление спектральных изменений при изменении
температуры. Из работы [37].
Рассмотрим другой пример, где наглядно представлено сравнение
различных механизмов термоденатурации для двух препаратов пероксидазы:
цитохром с пероксидазы и пероксидазы хрена (HRP). В пероксидазе хрена аспиральные участки имеют 2 пика: при 1659 и 1649 см-1, что свидетельствует о
наличии двух различных типов α-спиралей, различающихся по геометрии или
по состоянию гидратации (водородных связей). При повышении температуры
наблюдается постепенное повышение интенсивности пика на 1645см -1
относительно пиков на 1659 и 1649см-1, что свидетельствует об увеличении
содержания статистического клубка за счет разрушения α-спиралей –
денатурации молекулы фермента. Интересно, что даже при температуре 95С в
препарате пероксидазы не поисходит агрегации, о чем свидетельствует
31
отсутствие пиков на длинах волн 1616 и 1684 см-1, характеристических для
агрегированной формы пероксидазы.
б
а
Рис. 2.7. Изучение термоденатурации ферментов пероксидазы хрена (а) и цитохром с
пероксидазы (б) [38].
Иная ситуация наблюдается в случае цитохром с пероксидазы (рис.
2.7(б)). При нагревании фермента до 50С вторичная структура остается
неизменной, что следует из неизменности ИК спектра белка. Однако в
интервале температур 50-55С наблюдаются резкие изменения в спектре белка:
что проявляется в появлении четких пиков при 1616 и 1684см-1, которые
свидетельствуют об экстенсивной агрегации белка (рис.2.7(б)).
В качестве другого примера можно привести применение метода ИКспектроскопии для исследования структуры нано-объектов. Метод может
эффективно использоваться для слежения за образованием регулярной
структуры пептидных нанотрубок. Так было показано, что образование
нанотрубок на основе биотинилированных пептидов, способных образовывать
32
амилоидные фибриллы (с внешним диаметром нанотрубок 60 нм; внутренним
диаметром
30
межмолекулярных
нм),
сопровождается
β-слоев,
интенсивным
стабилизирующих
образованием
регулярную
супрамолекулярную структуру в водных растворах.
ИК-спектроскопия Фурье является эффективным методом для изучения
вторичной структуры белков, как в растворах, так и в гетерогенных системах.
Так, нами было проведено
исследование структуры и агрегационного
состояния нового рекомбинантного белка, галактозооксидазы из Stigmatela,
Sagalox, образующегося при экспрессии в E. сoli в форме нерастворимых
агрегатов (телец включения) [39]. Поэтому доступной для анализа формой
является только суспензия белка. Для анализа вторичной структуры белка в
нерастворимом состоянии применяли метод ИК-НПВО спектроскопии. На
рисунке 2.8. приведен пример анализа «амид 1» области ИК-НПВО спектра
исследуемого белка, Sagalox.
Рис. 2.8. Анализ «амид 1» области ИК-НПВО спектра рекомбинантного белка, Sagalox, в
суспензии телец включения методом деконволюции. Сплошные кривые показывают
соответствие экспериментальной и теоретически полученной кривой; пунктирные линии
соответствуют теоретически полученным индивидуальным «Гауссианам», которые
соответствуют индивидуальным элементам вторичной структуры белка.
33
Методом деконволюции (разделения спектра на отдельные пики,
соответствующие различным элементам вторичной структуры) определяют
процентное содержание вторичных структур в изучаемом белке (в данном
случае, Sagalox). Для сравнения проводили анализ вторичной структуры
Sagalox в системе обращенных мицелл (в которой белок находится в
растворимой форме) методом КД спектроскопии. Спектр КД Sagalox в системе
обращенных мицелл АОТ представлен на рис. 2.9.
1
0
190
-1
200
210
220
230
240
250
260
-2
-3
2
[Q] 10 deg*cm *dmoles
-1
2
-3
-4
-5
Длина волны, нм
Рис. 2.9. Спектр кругового дихроизма (КД) в дальней УФ области Sagalox,
солюбилизованного в системе обращенных мицелл АОТ.
Количественный анализ КД-спектра Sagalox в системе обращенных
мицелл (рис. 2.9) с применением программного обеспечения «CDNN software»
показал, что фермент имеет вторичную структуру с высоким содержанием βслоев (41,5 %) и низким содержанием α–спиралей (8,5%). Подобная вторичная
структура характерна для белков, гомологичных Sagalox, содержащих
специфический «Келш»-домен [40]. В качестве контроля приводятся данные
вторичной структуры ближайшего гомолога Sagalox содержащего «Келш»домен, галактозоксидазы из Fusarium (Fusgalox), структура которого известна
(Таблица 2.1).
Сравнение вторичной структуры Sagalox в суспензии и в мицеллярной
системе (Таблица 2.1) показывает, что при солюбилизации суспензии тел
включения
в
системе
обращенных
мицелл
происходит
уменьшение
содержания β-структур при неизменном содержании α-спиралей. Наиболее
34
вероятно, что данные изменения отражают диссоциацию агрегатов белка при
их солюбилизации в мицеллах, что было продемонстрировано независимо
методом седиментационного анализа.
Таблица 2.1. Параметры вторичной структуры галактозооксидазы Sagalox
нерастворимой формы в суспензии (в тельцах включения), полученные из
анализа «амид 1» области ИК-спектра и Sagalox в системе обращенных мицелл
АОТ (на основе анализа КД спектра) в сравнении со структурными
параметрами ближайшего гомолога Sagalox, галактозооксидазы Fusgalox на
основе данных рентгеноструктурного анализа.
Элементы
FTIR-ATR
вторичной
(Sagalox
структуры
суспензии)
FTIR-ATR
в (Sagalox
Данные
в рентгеноструктурн
мицеллах)
ого анализа
Fusgalox
-спирали
9,0%
8,5%
0,5%
Неупоряд.
21,5%
31%
29,0%
-слои
47,5%
41,5 %
58,0%
-
22,0%
19,0%
12,5%
структуры
повороты
Отметим, что отнесение полос в ИК спектрах к индивидуальным
элементам вторичным структурам не являются полностью универсальным, а
может зависеть от специфики белка, что в определенной степени усложняет
анализ спектров в случае новых неизученных белков. Анализ спектров
упрощается, когда положение пиков и коэффициенты экстинкции каждого
элемента вторичной структуры уже известны, тогда мы следим за их
изменениями
при
изменении
условий
эксперимента.
Например,
при
исследовании денатурации белка или при исследовании изменения структуры
35
белка в результате его модификации. Т.е. удобно следить за относительными
изменениями в структуре уже хорошо известного белка. В противном случае
необходимо сопоставлять данные полученные методом ИК спектроскопии с
результатами полученными другими методами, в первую очередь методом КД
спектроскопии.
Следует отметить, что в настоящее время разработан ряд программ для
обработки ИК спектров с использованием базы данных ИК спектров белков
содержащих более 200 белков различных классов и различной структурных
типов, позволяющие довольно точно определять процентное содержание
элементов вторичной структуры в исследуемом белке.
Развитие метода ИК спектроскопии. Метод разрешенновременной двумерной
инфракрасной спектроскопии
Метод
ИК-спектроскопии
в настоящее
время
продолжает
интенсивно
развиваться. Так, недавно стало возможно наблюдать за изменением структуры
пептидных
молекул
и
белков
в
режиме
реального
времени,
как
продемонстрировали П. Хэмм с соавторами. Наблюдать этот сверхбыстрый
процесс, протекающий в течение пикосекунд, (10–12c) стало возможно с
помощью нового метода – разрешенновременной двумерной инфракрасной
спектроскопии. Разработанный метод имеет значительно более высокую
разрешающую способность, чем существующие до настоящего времени методы
изучения изменения структуры молекул. Так, метод 2D-ИК спектроскопии
использовали для наблюдения за изменением конформации небольшого
пептида. 2D-ИК спектроскопия в сочетании с результатами квантовохимических симуляций позволяет получать динамическую информацию об
изменении конформации пептидов. Наблюдаемые структурные изменения
включали, в частности, процесс разрыва водородной связи.
На примере модельных белков и пептидов поли-l-лизина, конканавалина
A, рибонуклеазы A, и лизоцима было показано, что метод 2D ИК
спектроскопии с применением симуляционных методов анализа позволяет
36
получать количественную информацию по динамике денатурации белков,
доступности растворителя и структурной стабильности белков.
Новый метод исследования строения молекул вносит существенный вклад в
понимание динамических процессов с участием белков в живых системах и
протекающих в пикосекундном временном интервале.
Инфракрасная спектроскопия в режиме отражения (IRRAS)
Метод IRRAS является относительно новым методом и разработан специально
для исследования свойств белков адсорбированных на флюидных поверхностях
вода-вохдух
и
вода-масло.
Метод
IRRAS
спектроскопии
является
в
определенном плане близким по техническому исполнению к методу
эллипсометрии. Также как и в эллипсометрии, в метод IRRAS измерения
проводятся в режиме отражения. Соответственно, в обоих случаях информация
о свойствах адсорбированного белка определяются, главным образом, через
влияние адсорбированного белка на оптические свойства поверхности. Как и в
случае эллипсометрии для количественного анализа данных полученных
методом IRRAS необходимо использовать уравнения электромагнитной теории
света. Однако в отличие от эллипсометрии, метод ИК спектроскопии в режиме
внешнего отражения, IRRAS, помимо концентрации белка на поверхности,
позволяет следить за структурными свойствами адсорбированных белков [35,
41-44].
IRRAS является спектром отражения, измеряемой величиной является
интенсивность отражения (-logR/R0), где R и R0, соответственно интенсивность
отражения буфера и раствора исследуемого образца (белка) от поверхности.
IRRAS спектр определяется не только молекулярными свойствами белка, но
главным образом, оптическими свойствами поверхности, что в отличие от
обычных абсорбционных методов позволяет изучать концентрацию, и
структуру
белка
на
поверхности.
В
IRRAS
экспериментах
глубина
проникновения ИК света составляет порядка 1 мкм, что позволяет исследовать
распределение концентрации белка (размером порядка 2-5 нм) вблизи
37
поверхности вода-воздух в слое от 1 до 100-200 нм. Показано, что IRRAS [3, 35,
45] достаточно чувствительный метод для исследования свойств белков в
монослоях и в тонких пленках.
Рис. 2.10. Установка для измерения IRRAS спектров белков, адсорбированных на
поверхности вода-воздух или вода-масло, в ленгмюровской ванне.
Использование улучшенной и дополненной модификации метода IRRAS,
поляризованно-модулированный IRRAS (PM-IRRAS), где измерения спектров
можно проводить для различных направлений поляризации и под разными
углами падения ИК света (Рис.
2.10), с одной стороны повышает
чувствительность метода для пространственно ориентированных молекул
адсорбированных на поверхности, а с другой стороны, позволяет получать
информацию о пространственной ориентации молекул на поверхности [44, 4647]. Схема установки PM-IRRAS, используемой при изучении свойств белков
на поверхности вода-воздух представлена на рис. 2.11.
38
Рис. 2.11. Схематическое представление установки IRRAS, используемой при изучении
свойств белков на поверхности вода-воздух.
Установка PM-IRRAS включает в себя источник ИК света (s- или
p-поляризованного); отражающую поверхность вода-воздух, создаваемую с
помощью
Ленгмюровской
ванны,
заполненной
раствором
белка.
Ленгмюровская ванна оснащена подвижным барьером. Что позволяет изменять
площадь доступной поверхности и, тем самым, поверхностное давление.
Метод IRRAS в настоящее время в основном используется для получения
качественной информации об изменениях свойств белков при адсорбции. Это
связано
как
со
сложностью
количественной
интерпретации
спектров
отражения, каковыми являются спектры IRRAS, так и высоким вкладом воды
(атмосферной, а также из жидкой фазы) в ИК спектры образцов. Примеры
IRRAS спектров β–казеина в амид 1 и амид 2 областях, чувствительных к
изменению во вторичной структуре белков, представлены на рис. 1.51. Из
рисунка видно, что при увеличении концентрации белка в системе наблюдается
увеличение интенсивности пиков, а также изменения в позициях полос ИКспектра отражения. Данные изменения могут быть связаны не только с
изменениями
свойств
адсорбированного
белка
при
варьировании
концентрации, но и с влиянием на оптические свойства системы. Очевидно, что
для
получения
достоверной
количественной
информации
о
свойствах
адсорбированных белков необходимо разработать адекватный метод анализа
данных. В 2001 году была опубликована работа [35], в которой была на
примере молочного белка β–казеина было продемонстрировано, что IRRAS –
перспективный метод для получения количественной информации о свойствах
39
(концентрации и конформации) биомолекул на поверхности вода-воздух.
Однако оптимизация самого метода и технического оснащения, а также
разработка методов количественного анализа IRRAS спектров, безусловно,
требует дальнейших исследований.
Рис. 2.12. IRRAS спектры β–казеина в амид 1 и амид 2 областях в зависимости от объемной
концентрации белка (из работы [35]).
Спектроскопия кругового дихроизма.
Ценным методом исследования вторичной, а также третичной структуры
белков является спектроскопия КД.
КД спектроскопия в настоящее время
является основным методом слежения за вторичной структурой белков в
растворах. Метод не требует знания общей пространственной структуры белка.
Напротив, структурное исследование белка обычно начинается с получения
спектров КД.
Метод
КД
основан
на
различии
в
поглощении
право-
и
левополяризованного света в зависимости от состояния полипептидной цепи
(например, в спиралях различной закрученности). Из-за различия в поглощении
плоскополяризованный свет превращается в эллиптически поляризованный.
Пептидные группы поглощают в "дальнем УФ", т.е. при длине волны
порядка 180-220 нм. Это примерно вдвое большая длина волны, чем та, на
которой возбуждаются отдельные атомы. Причина того, что пептидная группа
возбуждается более длинноволновым (т.е. менее "жестким") светом, — в
40
делокализации электронов пептидной группы по нескольким атомам. Еще
больше делокализованы электроны в ароматических группах — там они
"размазаны" не по трем, как в пептидной группе, а по шести атомам. Спектры
КД ароматических групп приходятся на длину волны ~260-295 нм. В этом
диапазоне длин волн,
окружения
(в "ближнем" ультрафиолете) изучают асимметрию
ароматических
образованием
уже
не
боковых
вторичной,
групп, т.е.
а
эффекты,
третичной
связанные
структуры
с
белка.
В КД спектроскопии за вторичной структурой белков следят в дальней УФ
области 180-240 нм. Характерные спектры эллиптичности в области "дальнего"
ультрафиолета (180-260 нм) приведены на Рис. 2.13.
Рис. 2.13. Характерные формы спектров КД для полилизина в форме a-спирали (a), bструктуры (b) и неупорядоченного клубка (r).
Спектры КД зависят от асимметрии окружения пептидных групп и
потому отражают состояние вторичной структуре в белке. Как и в ИК
спектроскопии каждый из элементов вторичной структуры характеризуется
одной или несколькими длинами волн в спектре и коэффициентом экстинкции.
Анализ зависимости «эллипличности» от длины волны (спектр кругового
дихроизма) позволяет получать количественную информацию о содержании
вторичных структур в белках. На рисунке 2.14. представлены КД спектры
41
белков с характерными типами вторичных стуктур (с основным содержанием αспиралей, с основным содержанием β-структуры, и белок с преимущественно
неупорядоченной структурой (пролин-богатый белок).
1
3
4
2
Рис. 2.14. Спектры КД миоглобина, белка, с основным содержанием α- спиралей (кривая 1),
два белка с основным содержанием β-структуры, конканавалин A (кривая 2), и βлактоглобулин (кривая 3), и пролин-богатый белок, коллаген (кривая 4).
Современное
программное
обеспечение
позволяет
осуществлять
количественный анализ вторичной структуры с разрешением β-поворотов,
параллельных и антипараллельных β-структур с точностью до 5%.
Следует отметить, что в то время, как ИК спектры чувствительны к
изменению в содержании β-структуры, в спектре КД β-структурные элементы
характеризуются более низким коэффициентом экстинкции, по сравнению с αспиралями.
Как и в случае ИК спектроскопии, методом КД спектроскопии удается
следить за образованием межмолекулярных контактов в белках (агрегацией).
Многие белки при агрегации образует анти-параллельные β-слои, которые
можно наглядно наблюдать по драматическому увеличению интенсивности
пика на 217-218 нм в спектре КД. Например, α-химотрипсин при агрегации
наблюдается драматическое увеличение интенсивности пика на 218 нм в
спектре КД (рис. 2.15).
42
Рис.
2.15.
Слежение
за
агрегацией
белков
методом
КД
спектроскопии
по образованию антипараллельных β-структур на длине волны 218 нм. Модифицированный
ХТ в смеси вода-этанол. 1 – водный раствор. Кривые 1-2 отражают – денатурацию при
переходе от водного раствора в систему, содержащую 30 об. % этанола. Кривые 3-6 –
агрегация фермента при концентрации этанола 40-60 об. % (Кудряшова Е.В. 1994 [48]).
Что касается КД в ближнем УФ, в этой области следят за изменениями в
третичной структуре. Основной вклад в спектр здесь вносят ароматические
остатки:
триптофан,
тирозин
и
фенилаланин.
При
изменинии
их
экспонированности и микроокружения. Данный процесс всегда сопровождает
изменения в третичной структуре белка, что отражается в изменении КДспектров в ближней УФ области (рис. 2.15). Например, в случае αхимотрипсина модифицированного глицеральдегидом в системе вода-этанол
при концентрации этанола 30% и выше наблюдаются существенные измерения
в КД спектре фермента, сопроводжающиеся уменьшением каталитической
активности и свидетельствующие об изменениии в третичной структуре белка.
43
Рис. 2.16. Спектры КД белка (химотрипсина модифицированного глицеральдегидом) в
смеси вода-этанол в ближней УФ области. Третичная структура: кривые 1-2 (0 и 20 об. %
этанола) – сохранение третичной структуры; кривые 2-5 (30-60 об. % этанола) –
наблюдаются конформационные изменения в белке (Кудряшова Е.В. 1994 [48]).
Таким образом, метод КД-спектроскопии применим для качественного
анализа в изменении третичной структуры белков. В отличие от ИК
спектроскопии, метод КД-спектроскопии применим в основном для анализа
оптически прозрачных растворов. Однако, следует отметить, что метод КД
успешно применяется для исследования структуры белков адсорбированных на
ультрамалых наночастицах, например, на полистиреновых частицах радиусом
до 20-30 нм. В этом случае интенсивность светорассеяния достаточно низкая
для измерения спектров. Данные о применении КД спектроскопии для изучения
белков адсорбированных на более крупных частицах или поверхностях в
литературе крайне малочисленны, они относятся в основном к белкам,
иммобилизованным на твердых поверхностях, например на поверхности
диспергированных в водном растворе твердых частиц; на границе раздела
твердый носитель-воздух; или на поверхности липид-вода. В данных работах
измерение спектров КД осуществлялось путем перенесения белковой пленки
(например, монослоя белка) образованной в исследуемых условиях на
кварцевую подложку. Однако, данные о свойствах системы и структуры белка в
44
таких системах полученные таким методом были косвенными и имели
ограниченную
информативность.
Для
исследования
структуры
белков
адсорбированных на поверхностях раздела фаз предложено использовать метод
спектроскопии КД в режиме внешнего отражения.
Спектроскопия кругового дихроизма в режиме отражения (ERCD)
Данные
о
применении
КД
спектроскопия
для
изучения
белков
адсорбированных на поверхностях в литературе крайне малочисленны и
относятся в основном к белкам, иммобилизованным на твердых поверхностях,
например на поверхности диспергированных в водном растворе твердых частиц
[49-50]; на границе раздела фаз твердый носитель-воздух [51-52]; или на
поверхности липид-вода [53]. В таких работах измерение спектров КД
осуществлялось путем перенесения белковой пленки (например, монослоя
белка) образованной в исследуемых условиях (например, в Ленгмюровской
ванне) на кварцевую подложку. Однако данные о свойствах системы и
структуры белка в таких системах и полученные таким методом были
косвенными и имели ограниченную информативность, так как не позволяли
следить за свойствами системы непосредственно в процессе адсорбции.
В 2002 году авторы работы [54] впервые предприняли попытку провести
измерения спектров КД белка адсорбированного на поверхности вода-воздух в
Ленгмюровской ванне. Схема установки для проведения экспериментов в
режиме отражения представлена на рис. 2.17.
45
Рис. 2.17. КД спектроскопия в режиме внешнего отражения (ER-CD). Схема установки для
проведения измерения КД спектров белков адсорбированных на поверхности вода-воздух (из
работы de Jongh [54]).
Примеры
КД
спектров
модельного
белка,
-лактоглобулина
адсорбированного на поверхности вода-воздух измеренных в Ленгмюровской
ванне в сравнении со спектром КД в объеме раствора приведены на рис. 2.18.
Для β-лактолгобулина, методом КД спектроскопии в режиме отражения
(ERCD) было найдено, что по сравнению с белком в объеме раствора при
адсорбции белка на поверхности вода-воздух наблюдаются изменения во
вторичной структуре, а именно, содержание β-структуры уменьшается на 10-15
%.
Рис. 2.18. Сравнение спектров КД белка в режиме отражения измеренный в ленгм.ровской
ванне, представленный как (КД спектр образца – КД спектр воды), (концентрация белка 20
мг/мл) и спектра КД в режиме пропускания -лактоглобулина в 10мМ фосфатном буфере
(pH 6.8). КД спектры -лактоглобулина в режиме пропускания измерялись с применением
той же самой установки, но в кварцевой кювете [54].
В целом, в работе впервые было продемонстрировано, что метод КД
является чувствительным для измерения изменений в концентрации и
46
конформации белков на поверхности вода воздух. Однако дополнительные
теоретические исследования и оптимизация экспериментальных условий
требуется для того, чтобы данный метод был широко применим для
исследования
молекулярных
свойств
белков
и
других
биополимеров
адсорбированных на поверхностях.
Флуоресцентные методы
исследования структуры белков. Особенности
применения при исследовании коллоидных систем
При
исследовании
структуры
белков,
как
в
растворах,
так
и
в
микрогетерогенных системах широко применяются флуоресцентные методы
(рис. 2.19).
Флуоресцентные методы анализа
структуры белков
Флуоресцентная
спектроскопия
Интегральная
Поляризация
флуоресценции
(анизотропия)
Стационарная
Дифференциальная
Тушение
флуоресценции
Динамическое
Разрешенновременная
Статическое
Разрешенновременная
Флуктуационная
ФФС
Рис. 2.19. Флуоресцентные методы исследования структуры белков
47
Преимуществами этих методов являются высокая чувствительность и
информативность. Широкое разнообразие флуоресцентных методов анализа
позволяет подобрать метод или комбинацию методов, наиболее подходящих
для исследуемой системы.
Метод
флуоресцентной
спектроскопии
является
одним
из
наиболее
распространенных для изучения физико-химических свойств биологических
систем и, в частности, структуры белков. Этот метод позволяет следить за
изменениями в микроокружении собственных флуорофоров белка или
введенной флуоресцентной метки. Белки содержат три аминокислотных
остатка, которые вносят основной вклад в собственную флуоресценцию белка
(тирозин,
фенилаланин
и
триптофан).
Собственная
флуоресценция
большинства белков обусловлена, в первую очередь, триптофановыми
остатками. Для селективного возбуждения остатков триптофана используется
диапазон длин волн 295-300 нм, при этих длинах волн поглощение тирозина и
фенилаланина минимально. Флуоресцентные свойства триптофана крайне
чувствительны к изменению его микроокружения, и главным образом,
полярности.
В
соответствие
с
этим,
комплексообразование
с
низкомолекулярными лигандами и макромолекулами, денатурация, агрегация и
другие процессы существенным образом влияют на спектры флуоресценции
белков.
Флуоресцентная анизотропия
При возбуждении флуоресцирующего образца поляризованным светом его
испускание
тоже
поляризовано.
Флуоресцентная
анизотропия
является
характеристикой степени поляризации образца и выражается как разница
параллельной и перпендикулярной составляющих флуоресценции в пересчете
на общую интенсивность флуоресценции:
r = (I║-I┴)/(I║+2I┴); или
IVV - G Ivh
r=
Ivv + 2G Ivh
48
где r – анизотропия, IVV и IVH - экспериментально определяемые интенсивности
параллельной и перпендикулярной составляющих флуоресценции, G= I HV /IHH,
(I║+2I┴) – общая интенсивность флуоресценции.
Существует
несколько
причин
деполяризации
(уменьшения
анизотропии), среди которых основной является вращательная диффузия
флуорофоров. Величину флуоресцентной анизотропии определяет скорость
вращательной диффузии флуорофора во время жизни его возбужденного
состояния, что, в свою очередь, определяется вязкостью, температурой
раствора и объемом вращающейся области. Взаимосвязь экспериментально
определяемой флуоресцентной анизотропии, флуоресцентным временем жизни
и скоростью вращательной диффузии флуорофора устанавливается уравнением
Перрeна:
r/ro ,
где - корреляционное время вращение, отражающее скорость вращательной
диффузии флуорофора,  - флуоресцентное время жизни, r - экспериментально
определяемая флуоресцентная анизотропия, ro - фундаментальная (или
предельная)
анизотропия
[55].
Данная
взаимосвязь
выполняется
при
допущении, что деполяризационные вращения флуорофора симметричны или
изотропны. Однако часто молекулы не симметричны, и следует ожидать
различных скоростей вращения вокруг каждой молекулярной оси. Так
например, дискообразная молекула перилена может вращаться либо вокруг оси,
перпендикулярной к ее плоскости (без сильного влияния на молекулы
растворителя), либо так, что плоскость молекулы сместится. Очевидно, что в
первом случае скорость вращения будет выше.
Любые внешние условия, влияющие на размер, форму и гибкость
молекулы флуорофора (рН, Т, , денатурация под действием различных агентов
и др.) могут оказывать влияние на деполяризацию флуоресценции. По этой
49
причине
метод
поляризации
флуоресценции
(или
флуоресцентной
анизотропии) лежит в основе многочисленных применений в биохимических
исследованиях. Измерение анизотропии флуоресценции используется для
количественной оценки денатурации и реакций ассоциации белков с лигандами
[56], для изучения комплексообразования с макромолекулами: связывание
антигена с антителом, ассоциация белков [55]. При комплексообразовании
существенно меняется размер, пространственная структура, подвижность
сегментов
макромолекулы,
что
приводит
к
изменению
наблюдаемой
анизотропии.
Применение
флуоресцентных методов
для
исследования молекулярной
подвижности белков.
Методы разрешенно-временной анизотропии (TRFA) и флуоресцентной
корреляционной
спектроскопии
микроспектроскопических
(FCS)
метода
-
два
относительно
позволяющие
новых
исследовать
пространственную организацию и молекулярную подвижность в белках. В
последние годы данные методы широко используются для исследования
структуры белков в растворах.
Метод разрешенно-временнной флуоресцентной анизотропии (TRFA)
Ценная информация о структуре белков и белок-содержащих комплексов
может
быть
получена
при
использовании
метода
TRFA.
Благодаря
достигнутому в последнее время уровню развития теоретической базы и
технического оснащения этот метод стал исключительно информативным для
исследования структурной организации белков и их комплексов. Он позволяет
следить за вращательной динамикой, как всего комплекса, так и каждого из
фрагментов, обладающих независимым вращением, и в итоге, получать
детальную информацию о пространственной структуре надмолекулярных
ансамблей [55].
50
В
TRFA
эксперименте
определяется
величина
флуоресцентной
анизотропии как функция от времени:
r(t) = (I‖ (t)-I(t))/(I(t)+2I(t)),
где I‖ (t) и I(t) - наблюдаемые параллельная и перпендикулярная компоненты
флуоресценции относительно направления поляризации возбуждающего луча.
Анизотропия сферических молекул, вращение которых симметрично
(изотропно), затухает согласно моноэкспоненциальному закону. В общем
случае
«затухание»
анизотропии
описывается
мультиэкспоненциальной
зависимостью:
r(t) = jexp(-t/j),
где j - индивидуальные корреляционные времена вращения, отражающие
скорость вращательного движения флуорофора, а j - вклады соответствующих
компонентов в затухание анизотропии.
Так как анизотропия r(t) вычисляется по разности между наблюдаемыми
компонентами эмиссии флуоресценции I║(t) и I(t), надежные значения
анизотропии r(t) могут быть вычислены только для времен, при которых
наблюдается значительное испускание флуоресценции. По этой причине
обычно в качестве метки выбирают флуорофоры со временем затухания,
сравнимым с предполагаемым корреляционным временем вращения. Если
флуоресцентное время жизни
 много меньше  то интенсивность
флуоресценции затухает раньше, чем произойдет заметная потеря анизотропии.
В белках существует несколько причин потери анизотропии (или
деполяризации): быстрое движение флуоресцентной метки относительно места
ее прикрепления, более медленное внутреннее движение сегментов белка,
медленное вращение всей молекулы белка, очень медленное вращение
51
белковых агрегатов (рис. 2.20), а также, перенос энергии между хромофорами
[57].
Рис. 2.20. Схематическое расположение флуоресцентных времен жизни остатков
триптофанов в белке (а) и корреляционных времен вращения, соответствующих движению
независимо вращающихся фрагментов белковой молекулы (б), на кривых общей
интенсивности флуоресценции (а) и флуоресцентной анизотропии (б), разрешенных в
наносекундной шкале (из работы E. Кудряшовой [58]).
Для многих белков преобладает один вид деполяризации связанный с
вращением всей молекулы белка [57, 59-61]. В этом случае потеря анизотропии
описывается как моноэкспонинциальная зависимость:
r(t) = *exp(-t
При этом для глобулярных белков корреляционное время вращения
(белка) связано с общим объемом белковой молекулы (V) (или с молекулярной
массой белка М) соотношением Стокса-Эйнштейна:
белкаRvR
52
где v - удельный объем белка; - вязкость растворителя; h - величина
гидратации, R – универсальная газовая постоянная, T – абсолютная
температура.
Например, сывороточный альбумин человека (MM 69кДа), содержащий
один
триптофановый
остаток,
характеризуется
одним
корреляционным
временем вращения φ1 (26,0 нс). Теоретически рассчитанная величина из
уравнения Стокса-Эйнштейна для белка с такой молекулярной массой
составляет 26,5 нс и хорошо согласуется с экспериментально наблюдаемым
временем. Это указывает на то, что триптофановый остаток альбумина
вращается вместе с белком и не имеет внутренней подвижности [61].
Экспериментально
определенные
величины
корреляционного
времени
вращения могут немного превышать теоретически рассчитанные значения за
счет гидратации белка. Обычно гидратный слой составляет 0,2 г воды на 1 г
белка. Например, ХТ, меченный по активному центру антранильной группой,
характеризуется одним корреляционным временем вращения (12 нс), что
соответствует вращению гидратированной белковой молекулы с массой 25 кДа
[59-60]. Отсутствие более коротких корреляционных времен вращения,
отражающих
сегментарную
подвижность
белка,
связано
с
тем,
что
антранильная метка не имеет вращательной подвижности, независимой от
движения всей молекулы белка [62].
В ряде случаев наблюдаемые значения  в 1,3-2 раза превышают
теоретически рассчитанные. Данный факт чаще всего обусловлен тем, что
многие белки имеют несферическую (эллипсоидную) форму и вращение
относительно более длинной оси определяет общую скорость вращения
молекулы белка. Например, овальбумин куриного яйца имеет эллипсоидную
форму и характеризуется одним корреляционным временем вращения - 24 нс
(Таблица 2.1). Теоретически рассчитанное значение  для белка с ММ 45 кДа
составляет 20 нс. Экспериментальные и теоретически полученные кривые
снижения интенсивности и кривые деполяризации флуоресценции для
53
овальбумина разрешенные в наносекундной временной шкале представлены на
рисунке 2.20. Результаты анализа кривых представлены в таблице 2.2.
Б
Рис. 2.21. Кривые снижения общей интенсивности флуоресценции (A) и флуоресцентной
анизотропии (Б), разрешенные в наносекундной шкале полученные для овальбумина из
куриного яйца в водном растворе (из работы E. Кудряшовой [58]). Экспериментальные кривые
снижения общей интенсивности флуоресценции (А) и деполяризации флуоресценции
представлены в сером, соответствующие теоретически полученные кривые представлены в
черном. Условия эксперимента: концентрация белка 0.05 мг/мл; 10 мM натрий-фосфатный
буфер, рН 7.0, 22оС.
Таблица 2.2. Параметры, определенные из анализа кривых снижения общей
интенсивности флуоресценции (A) и флуоресцентной анизотропии (Б)
овальбумина в водном растворе: флуоресцентные времена жизни (τ) и их
относительные вклады (α), а также корреляционное время вращения белка (1)
и его вклад в деполяризацию (). Длина волны возбуждения флуоресценции
300 нм, длина волны детекции интенсивности флуоресценции - 343 нм.
Следует отметить, что для белков несферической формы наблюдаются
различия в корреляционных временах вращения белка, полученных при разных
длинах волн возбуждения. Это свойство используют для выявления причин
отклонения значения  от теоретического. Например, АДГ из печени лошади –
димер, состоящий из двух идентичных субъединиц (ММ 40 кДа каждая) и
характеризующийся эллипсоидной формой с длинами полуосей 6 и 11 нм,
54
имеет корреляционные времена вращения при длинах волн возбуждения 300 и
295 нм, соответственно, 36 и 33 нс [61]. Многие белки проявляют два типа
реориентации флуорофоров: быстрое вращение сегмента белка, содержащего
флуорофор, и более медленное вращение всей молекулы белка. В этом случае
потеря анизотропи описывается следующим образом:
r(t) = (exp(-t/внутр)*exp(-t/белка

и характеризуется двумя корреляционными временами вращения: внутр и белка.
Например, глутатионредуктаза из эритроцитов крови – флавопротеин с
молекулярной массой 100 кДа - характеризуется двумя корреляционными
временами вращения: 3.6 нс и 38 нс. Долгое корреляционное время
соответствует вращению флуорофора (ФАД) вместе со всей гидратированной
молекулой белка. Это согласуется с теоретически рассчитанным значением для
белка с такой молекулярной массой. Короткое время вращения отражает
подвижность сегмента белка, связанного с ФАД [55].
При включении в комплекс или агрегации белка, спад анизотропии
принимает более сложный вид: появляются дополнительные источники
деполяризации, связанные с вращением всего комплекса и/или его отдельных
сегментов, что отражается в появлении соответствующих корреляционных
времен вращения. При этом, как правило, изменяется динамика самого белка:
подвижность его сегментов и/или всей молекулы.
Метод TRFA применим для исследования как гомогенных, так и
микрогетерогенных и гетерогенных систем. Рассмотрим несколько примеров
исследования белок-содержащих надмолекулярных структур методом TRFA,
иллюстрирующих исключительно широкие возможности метода, а также,
многообразие информации, которую он позволяет получать.
55
Взаимодействие мембранных белков с мицеллами [61]
Преимущества метода TRFA при изучении таких систем заключается в том, что
он позволяет осуществлять прямые измерения динамики вращательной
реориентации белков при их взаимодействии с модельными мембранными
системами
в
реальном
времени.
Методом
TRFA
было
исследовано
взаимодействие поверхностного белка из бактериофага М13 с мицеллами SDS.
За флуоресценцией следили по триптофановому остатку белка.
В случае взаимодействия белка с мицеллами спад анизотропии характеризуется
двумя корреляционными временами вращения. Короткое корреляционное
время 1 (0,5 нс) отражает быстрый деполяризационный процесс внутри белка,
долгое - 2 (9,8 нс) - соответствует вращению всей мицеллы, содержащей белок
(белок+мицелла). Это корреляционное время связано с динамическим объемом
белок-содержащей мицеллы уравнением Стокса-Эйнштейна:
Vобщий = RTбелок+мицелла,
где V - динамический объем вращающейся частицы, - вязкость растворителя.
Исходя из величины динамического объема (V), можно оценить число
молекул ПАВ (n) в каждой белок-содержащей мицелле в соответствии с
уравнением:
Vобщий = 2Mprot(vprot+h)+nMSDS(vSDS+h),
где v – парциальные сферические объемы (vprot=0.74 см3/г, vSDS0.87 см3/г), hвеличина гидратации.
Было установлено, что мицеллу, содержащую две молекулы белка,
образуют 57 молекул SDS.
Для получения информации о форме вращающейся частицы изучают
зависимость общего корреляционного времени вращения от температуры.
Например, для данной системы было найдено, что белок+мицелла зависит от
температуры, причем таким образом, что динамический объем комплекса
56
(Vобщий = RTбелок+мицелла/) остается постоянным. Это свидетельствует о том, что
белок-содержащие мицеллы вращаются в виде компактных сферических частиц
[63
Белки, включенные в системы обращенных мицелл ПАВ
Метод
оказался
TRFA
эффективен
при
изучении
структуры
белков,
включенных в систему обращенных мицелл ПАВ [57, 59, 61]. Благодаря
высокой
чувствительности
TRFA
позволяет
определять
динамические
параметры даже при крайне низкой степени заполнения мицелл белком (много
меньше 1%). Это позволяет изучать структуру частиц в условиях определения
каталитической активности ферментов в таких системах. Например, методом
TRFA было изучено влияние включения в систему обращенных мицелл ПАВ на
структуру активного центра и конформационную подвижность ХТ [59]. В
качестве флуоресцентной метки использовали антранильную группу, которая
была введена в активный центр фермента в результате реакции ацилирования
ХТ антранил-пара-нитроанилидом. Антранильная группа характеризуется
достаточно
долгим
флуоресцентным
временем
жизни,
что
позволяет
определить вращательную подвижность как свободного белка, так и белоксодержащих обращенных мицелл ПАВ. Было найдено, что свободный
химотрипсин
характеризуется
единственным
корреляционным
временем
вращения (12 нс), которое соответствует вращению всей молекулы белка.
Включение фермента в систему обращенных мицелл ПАВ приводит к
появлению
короткого
корреляционного
времени
вращения,
которое
соответствует движению метки в активном центре. Это предполагает, что
активный
центр
характеризуется
ХТ,
включенного
существенно
в
меньшей
систему
обращенных
жесткостью
по
мицелл,
сравнению
со
свободным белком. Долгое время вращения (2) соответствует вращению
белок-содержащей мицеллы. При варьировании степени гидратации мицелл, w 0
= [H2O]/[AOT] в диапазоне от 10 до 25 долгое корреляционное время вращения
не изменялось и было равно 45 нс. Данное значение соответствует
57
динамическому объему белок-содержащей мицеллы, равному 3,6*102 нм3 (в
соответствии с уравнением Vобщ = Vбелка+Vоболочки = долгоеRT/). Это означает,
что в таких мицеллах молекула белка окружена 350 молекулами ПАВ. Размер
белок-содержащих мицелл остается постоянным при увеличении степени
гидратации в отличие от «пустых» мицелл, для которых наблюдается
монотонное возрастание размера при увеличении степени гидратации [61].
Учитывая, что в данной системе ХТ имеет оптимум каталитической активности
при степени гидратации 10, был сделан вывод, что фермент создает «свою
мицеллу», которая наибольшим образом соответствует его размеру [59].
Ферменты в средах, содержащих органические растворители
Использование метода TRFA позволило изучить взаимосвязь каталитической
активности и структуры ферментов в системах, содержащих органические
растворители
двух
типов
(гетерогенных
и
гомогенных):
ферменты,
суспензированные в неполярных органических растворителях и растворенные в
водно-органических смесях. На примере ХТ и субтилизина было показано, что
в случае суспензий ферментов происходит образование агрегатов, в которых
отсутствует
подвижность
отдельных
молекул
белка,
но
сохраняется
подвижность белковых сегментов. Причем было обнаружено, что именно
подвижность сегментов белка определяет уровень каталитической активности и
энантиоселективности ферментов в суспензиях [64]. В случае ферментов,
растворенных в водно-органических смесях, было показано существование
мономеров, а также растворимых белковых ассоциатов - тримеров и тетрамеров
[60].
Белок-содержащие капли бездетергентных микроэмульсий
Метод TRFA был применен для изучения структуры белок-содержащих капель
бездетергентных микроэмульсий, существующих в тройной системе гексанизопропанол-вода. Такие микрогетерогенные системы используются для
проведения
практически
важных
биокаталитических
58
реакций
[65].
Преимущество данных систем состоит в легкости выделения продукта реакции
и возможности регенерации фермента. Методом TRFA удалось определить
размер трипсин-содержащих капель бездетергентных микроэмульсий, который
составляет 27-37 Å в зависимости от состава системы. Было показано, что
молекула фермента окружена в микроэмульсиях водным слоем толщиной 7-10
Å, который экранирует фермент от контакта с органическим растворителем,
что, очевидно, способствует сохранению каталитически активной конформации
белка в системах с низким содержанием воды [66].
Ферменты в комплексе с субстратами и эффекторами
АДГ из печени лошади - НАД-зависимый фермент, состоящий из двух
идентичных субъединиц (с общей молекулярной массой 80 кДА). АДГ
характеризуется одним корреляционным временем вращения (36,2 нс),
отражающим вращение всей молекулы белка. При образовании тройного
комплекса, белок-НАДН-субстратоподобный ингибитор (изобутирамид), были
обнаружены существенные изменения во вращательной динамике белка.
Появляется короткое время вращения φ1 (2,6 нс), соответствующее движению
сегментов белка, а время вращения всего тройного комплекса φ2 составляет 33
нс, т.е. уменьшается на 10% по сравнению со свободным ферментом. Эти
данные указывают на то, что при комплексообразовании АДГ происходит
«сжатие» белка. Полученные данные позволили выявить структурные различия
между свободным ферментом и ферментом в процессе его каталитического
действия [67].
Диссоциация флавиновых кофакторов
Вращение собственных флуорофоров белка, а также искусственно введенных
меток
характеризуется
субнаносекундным
корреляционным
временем
вращения (0,1-1 нс), что обычно отражает быстрое вращение небольшого
сегмента белка, несущего метку, или вращение флуорофора вокруг места
59
прикрепления. Отметим, что короткое корреляционное время вращения (50-100
пс) может отражать также движение диссоциированных флуоресцентных
молекул, например ФАД и ФМН. Методом TRFA можно следить за
диссоциацией этих молекул. Примером может служить исследование влияния
концентрационной зависимости желтого флуоресцентного белка (YFP),
содержащего
ФМН,
на
его
вращательную
динамику.
При
высоких
концентрациях YFP мажорным компонентом анизотропийного ответа является
долгое корреляционное время вращения φобщее (14,8 нс), соответствующее
вращению комплекса YFP-ФМН. Минорный компонент (0,15 нс) соответствует
вращению свободного ФМН (φФМН). При снижении концентрации белка в
растворе наблюдается заметная диссоциация ФМН и вклад быстрого
корреляционного времени (φФМН) в анизотропию существенно увеличивается
[55].
Интересные результаты получены при исследовании методом ТРФА
динамики
ФАД-содержащего белка Tyr-159
мутантной
формы
НАДН
пероксидазы. При повышении температуры с 293 до 313 К анизотропийный
ответ этого фермента (регистрируемый на длине волны 576 нм) имеет
необычный характер: резкий спад во временном интервале до 1 нс, за которым
следует
увеличение
анизотропии.
Такой
вид
анизотропии
обусловлен
диссоциацией ФАД при повышенной температуре. Резкий спад анизотропии
соответствует деполяризации свободного ФАД, интенсивность флуоресценции
которого намного выше по сравнению с ФАД, связанного с белком. При более
долгих временах наблюдается возрастание вклада связанного с белком ФАД и,
как следствие, рост анизотропии (рис. 2.22) [56, 68].
60
Рис. 2.22. Разрешенная во времени флуоресцентная анизотропия ФАД-содержащего Tyr159А мутантной формы НАДН-пероксидазы, регистрируемая на длине волны 567 нм.
Быстрый спад анизотропии соответствует быстрой деполяризации диссоциированных
молекул ФАД. Рост анизотропии соответствует вращательному движению молекулы белка,
содержащей ФАД. Условия эксперимента: Т 313К [56].
Исследование доменов в молекуле иммуноглобулина Е (IgE)
Методом ТRFA было исследовано взаимодействие IgE с мембранным
рецептором [63]. Как известно, IgE имеют Y – образную структуру. Две
верхних ветви представляют собой антиген-связывающий фрагмент (Fab). В
основании
вилки
расположен
Fс
фрагмент,
который
связывается
с
плазматической мембраной. Флуоресцентную метку вводили путем связывания
дансил-лизина с антиген связывающим фрагментом иммуноглобулина, F ab.
Было
найдено,
что
не
связанный
с
мембраной
дансил-лизин-IgE
характеризуется двумя корреляционными временами вращения: 48 и 125 нс.
Долгое время вращения соответствует вращению комплекса дансил-лизин-IgE.
Короткое время вращения характеризует независимое вращение Fab фрагмента.
При связывании с мембранным рецептором анизотропийный ответ меняется
существенным
образом.
Долгое
корреляционное
время
вращения
увеличивается до 438 нс и отражает движение связанного с мембраной дансиллизин-IgE. Короткое время вращения, соответствующее движению Fab
фрагмента белка, практически не изменяется при связывании с мембранным
61
рецептором. Таким образом, было показано, что IgE взаимодействует с
рецептором через Fс фрагмент и это взаимодействие не влияет на независимое
вращение Fab фрагмента белка (рис. 2.23).
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ IgE С МЕМБРАНОЙ
СВОБОДНЫЙ IgE:
Y
 Вращение Ag-связывающего
фрагмента (48 нс)
 Вращение всей молекулы IgE (125 нс)
IgE СВЯЗАННЫЙ С МЕМБРАНОЙ :
Y
 Вращение Ag-связывающего
фрагмента (48 нс)
 Вращение всей молекулы IgE (438нс)
мембрана
Рис. 2.23. Исследование методом ТRFA взаимодействия IgE с мембранным рецептором.
Сравнение корреляционных времен вращения независимо вращающихся фрагментов в
молекуле IgE в случае свободного иммуноглобулина и связанного с мембраной
иммуноглобулина.
Исследование внутримолекулярных конформационных переходов в полимерах
В
работе
[70]
метод
внутримолекулярных
TRFA
был
впервые
конформационных
применен
переходов
в
для
изучения
полимерах.
Для
полиметакриловой кислоты (ПМА) и поли-изопропилакриламида (ПИАМ)
было обнаружено, что вызванные изменением условий (температуры и рН
раствора) конформационные переходы сопровождаются драматическими
изменениями
динамики
полимеров,
от
высокоподвижного
до
«гиперколированного» состояния полимерных цепей в кислых средах.
Так, при температурах 28-31oС ниже ПИАМ находится в относительно
подвижном состоянии с корреляционным временем вращения 3.6-3.7 нс. При
температуре
выше
450С
сегментальная
подвижность
характеризуется
корреляционным временем вращения 160 нс, что соответствует снижение
подвижности в полимере более чем в 40 раз. Полученные данные
демонстрируют, что метод TRFA высокочувствителен при исследовании
62
пространственных структур в полимерах. Этот факт может быть использован
при исследовании пространственной структуры белок-полиэлектролитных
комплексов.
Ожидается,
что
при
образовании
белок-ПЭ
комплексов
пространственная структура полиэлектролита будет изменяться существенным
образом. Конформация белка также может измениться. Метод TRFA может
быть применен для исследования вращательной динамикой каждого из
компонентов комплекса и за общей структурой всего комплекса.
Установление пространственной структуры фермент-полиэлектролитных
комплексов с применением метода ТРФА позволило получить детальную
информацию о молекулярных механизмах, лежащих в основе влияния
комплексообразования с ПЭ на каталитические свойства ферментов [60]. Так,
при изучении молекулярной подвижности комплексов химотрипсина (ХТ) с
полиметакриловой кислотой (ПМА) методом TRFA было обнаружено, что при
взаимодействии ХТ с ПМА (ММ 300кДа) происходит образование компактной
упорядоченной структуры комплекса. Причем структура комплекса и его
динамические свойства определяются соотношением компонентов в системе.
Так,
в
избытке
ПЭ
взаимодействие
с
химотрипсином
приводит
к
структурированию молекулы ПМА вокруг молекулы белка (рис. 2.24).
Молекулярная масса вращающегося фрагмента комплекса составляет 150
кДа, что означает, что в образование компактной структуры комплекса
вовлечена только часть молекулы ПМА (примерно 50%). Оставшаяся часть
молекулы ПМА не связана с ферментов и проявляет свободное вращение.
Фермент сохраняет также независимую вращательную подвижность в составе
комплекса, которая ограничена по сравнению с ферментом, не включенным в
комплекс (величины корреляционного времени вращения, φ белка, равны
соответственно 16 и 12 нс).
63
Рис. 2.24. Предполагаемая пространственная структура комплекса ХТ-ПМА при
соотношении ХТ/ПМА=1/1. Указаны корреляционные времена вращения независимо
вращающихся фрагментов комплекса, полученные методом TRFA (из работы Kudryashova et
al. 2001 [60]).
При увеличении соотношения фермент-ПЭ в системе (ХТ/ПМА=4/1)
наблюдается образование доменной пространственной структуры комплекса,
состоящей из нескольких идентичных сегментов с независимым вращением, в
каждом из которых белок окружен участком ПЭ. Корреляционное время
вращения сегментов φsegm =59 нс, что соответствует ММ =100 кДа.
Предполагаемая пространственная структура комплекса при соотношении
ХТ/ПМА=4/1 представлена на рис. 2.25.
Рис. 2.25. Предполагаемая пространственная структура комплекса
соотношении ХТ/ПМА=4/1 (из работы Kudryashova et al., 2001 [60]).
64
ХТ-ПМА
при
При «насыщении» ПЭ белком (ХТ/ПМА= 10/1) наблюдается образование
общей компактной глобуло-подобной структуры комплекса (рис. 2.26), что
проявляется в появлении вращательного движения комплекса как целой
частицы (φ=278 нс, что соответствует ММ=550-600 кДа).
Рис. 2.26. Предполагаемая пространственная структура комплекса ХТ-ПМА при
соотношении ХТ/ПМА=10/1. Указаны корреляционные времена вращения независимо
вращающихся фрагментов комплекса, полученные методом TRFA (из работы Kudryashova et
al., 2001 [60]).
Переход в систему вода-этанол приводит к образованию более
конденсированной и «жесткой» структуры комплекса. Следует заметить, что
уменьшение подвижности фермента, как общей, так и внутренней, в системе
вода-этанол коррелирует с каталитической активностью фермента. Так,
обнаружено,
что
в
системе,
содержащей
20%
этанола,
наблюдается
максимально ограниченная подвижность комплекса как внутренняя, так и
общая (корреляционное время вращение всего комплекса и его отдельных
сегментов увеличивается вдвое по сравнению с водным раствором). Именно
при этой концентрации этанола наблюдается 5-6 кратный активационный
эффект при комплексообразовании ХТ с ПЭ (рис. 2.27).
65
Рис. 2.27. Зависимость каталитической активности ХТ, включенного в комплекс с
поликатионом - полибреном (1), с полианионом – полиакриловой кислотой (2) и свободного
ХТ (3) в реакции гидролиза амидного субстрата (БТНА) от концентрации этанола. [ХТ] = 1
мкМ (из работы Kudryashova et al., 1997 [48]) .
Наиболее вероятно, что в случае ХТ активационный эффект связан с тем,
что в результате образования комплекса «заморожена» каталитически активная
конформация фермента, что вызывает увеличение эффективности обобщенного
нуклеофила в активном центре ХТ (Asp102...His57...Ser195) за счет сближения
и пространственной фиксации функциональных групп. Подтверждением
предложенной гипотезы является тот факт, что активационный эффект при
взаимодействии ХТ с ПЭ наблюдается только в случае субстратов, для которых
скорость-лимитирующей
стадией
является
нуклеофильная
атака
с
образованием ацилфермента. Образование компактной и упорядоченной
структуры фермент-ПЭ комплекса, является также основной причиной
стабилизации ферментов в водно-органических системах, как было показано
независимых экспериментах методом флуоресцентной спектроскопии и
спектроскопии кругового дихроизма.
66
Флуоресцентная флуктуационная спектроскопия
Методы флуоресцентной флуктуационной спектроскопии (FFS), широко
используются для исследования динамики белков в растворах и в составе
клеточных мембранах [71]. К методам FFS относятся метод флуоресцентной
корреляционной спектроскопии (FCS), который позволяет напрямую измерять
скорость трансляционной диффузии белков, и метод РСН (photon counting
histogram analysis), который позволяет получать статистические кривые
распределения флуорофоров в системе по их молекулярной интенсивности
флуоресценции.
локальной
Данные
концентрации
методы
белка,
позволяют
а также
получать
следить
информацию
за
о
агрегацией, за
взаимодействием с лигандами, за трансляционной диффузией и внутренней
подвижностью флуоресцентно меченных белковых молекул. Метод FCS
основан на том, что диффузия флуоресцентных молекул вызывает флуктуации
в интенсивности флуоресценции в малом элементе объема (0.1-0.5 фемта
литр), который создается в конфокальном микроскопе (рис. 2.28). Такие
флуктуации флуоресценции обрабатываются автокорреляционной функцией
G(t):
G(t) = <I>2+<I(t)*I(t+)>
<I>2
где I(t) – интенсивность флуоресценции при времени, t, I(t+) - интенсивность
флуоресценции после промежутка времени, .
Из
анализа
автокорреляционной
функции
G(t)
определяют
время
трансляционной диффузии, d, которое характеризует время пребывания
молекулы в рассматриваемом элементе объема:
G() = 1+
1
N*(1+d)(1+(/a2d))1/2
67
Рис. 2.28. Принцип метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии. А:
Сфокусированный лазерный луч освещает фиксированный малый объем измеряемой
системы (1 фемтолитр). В: Измерение флуктуации интенсивности флуоресценции в объеме
детекции (0.1-0.5 фемтолитр) как функция от времени. С: Автокорелляционный анализ
интенсивности позволяет определять среднее число частиц в объеме детекциии время
трансляционной диффузии исследуемых флуоресцентных молекул. Д: Статистический
анализ распределения частиц по молекулярной яркости (число детектируемых
флуоресцентных фотонов в пересчете на молекулу в секунду).
Благодаря высокому пространственному и временному разрешению,
данный метод позволяет проводить измерения на уровне отдельных молекул.
Исключительно высокая чувствительность и селективность методов FFS
позволяет исследовать на количественном уровне свойства биомолекул также
в
живых
клетках.
Применение
методов
FFS
для
систем
in
vivo
систематизировано в обзорах [72, 73].
Большое число работ посвящено изучению связывания белков с
мембранами живых клеток и транспорт и направлены на исследование и
оптимизацию систем доставки лекарств в организме. Методы флуоресцентной
флуктуационной спектроскопии представляются перспективным также при
исследовании динамики и локальной концентрации белков в составе
68
надмолекулярных структур, а также в гетерогенных и микрогетерогенных
системах коллоидных системах.
Следует
обеспечивают
подчеркнуть,
широкий
что
спектр
флуоресцентные
возможностей
методы
при
анализа
исследовании
конформационных переходов в белках. При изучении белок-содержащих
надмолекулярных
ансамблей
исключительно
информативными
представляются динамические методы TRFA и FCS, которые позволяет
получать детальную информацию о пространственной структуре, как всего
комплекса, так и его отдельных компонентов.
Таким образом, из рассмотренного выше литературного материала
следует, что функционирование ферментов и белков в коллоидных системах
привлекает все большее внимание исследователей. Такие исследования
открывают новые перспективы при изучении молекулярных механизмов
функционирования биополимеров в живых системах. Для изучения свойств
ферментов и белков на поверхности раздела фаз вода-воздух и вода масло
требуется применение специальных методов. Классическим методом для
исследования
адсорбционных
мономолекулярных
слоев
свойств
белков
Ленгмюра-Блоджетт.
является
также
Основными
метод
методами
слежения за адсорбцией белков на поверхностях раздела фаз являются
тензиометрия и эллипсометрия.
Однако в настоящее время практически отсутствуют прямые методы,
позволяющие изучать структурные свойства белков, адсорбированных на
поверхностях раздела фаз. В основном структурные свойства белков
изучаются путем перенесения белковой пленки, образованной на поверхности
раздела фаз в раствор или на другую поверхность, на которой могут
проводиться соответствующие измерения. В целом, информация о структуре
адсорбированных белков в литературе встречаются крайне редко и носит,
скорее качественный характер.
69
ГЛАВА 3.
РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПОДХОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ
И БЕЛОК-СОДЕРЖАЩИХ КОМПЛЕКСОВ НА ПОВЕРХНОСТИ ВОДАВОЗДУХ
Способность белков адсорбироваться на поверхностях раздела фаз вода-воздух
и вода-масло является молекулярной основой образования и стабилизации
белок-содержащих коллоидных систем, пен и эмульсий. Исследование
молекулярных механизмов адсорбции белков и взаимосвязи структурных
свойств белков с их адсорбционными свойствами является одним из основных
направлений коллоидной химии биополимеров. Работы в этой области тесно
связаны с исследованием молекулярных механизмов регуляции и обмена в
живых системах. Поскольку, как известно, в живых клетках именно на границах
раздела фаз локализованы многие биомолекулы, отвечающие за процессы
обмена, транспорта и другие жизненно важные функции. С практической точки
зрения изучение механизмов адсорбции белков открывает возможности
получать новые белок–содержащие коллоидные системы для пищевой
промышленности; в производстве косметики, пищевых добавок; для создания
новых лекарственных форм.
Для эффективного применения
белков в качестве стабилизаторов
коллоидных систем требуется детальное исследование взаимосвязи между
структурными свойствами белков и их функциональными, адсорбционными
свойствами, которые в свою очередь определяют макро-характеристики
коллоидных
систем:
условия
образования,
текстура,
стабильность,
вязкоэластичные свойства и др.
В данной работе адсорбцию белков на поверхности вода-воздух изучали на
примере модельных белков, овальбумина (ОВА) куриного яйца и молочного лактоглобулина
конформационным
(-lg),
существенно
свойствам,
различающихся
по
гидрофильно-липофильному
своим
балансу
поверхности, поверхностному заряду, и, как следствие, адсорбционным
свойствам. Так, в ряду модельных белков (лизоцим, β-казеин, бычий
70
сывороточный альбумин, глицинин) ОВА характеризуется относительно
низкой скоростью адсорбции, в то время как β-лактоглобулин – относительно
высокой. ОВА и β-lg - соответственно, слабый и сильный пенообразующий
агенты [74-75]. Оба белка ОВА и -lg широко используются для стабилизации
пищевых коллоидных систем, пен и эмульсий. Таким образом, использование
ОВА и β-lg (а также их модифицированных форм) в качестве модельных
объектов при изучении механизмов адсорбции белков позволит оценить
влияние особенностей структуры белка на адсорбцию белков и реологические
свойства белковых пленок.
Для изучения свойств белков на поверхности вода-воздух применяли
ленгмюровскую ванну, оснащенную автоматически управляемыми барьерами.
Система позволяет измерять и модулировать поверхностное давление. Для
исследования структурных и динамических свойств белков в процессе
адсорбции на поверхности вода-воздух в режиме реального времени были
применены
методы
ИК-спектроскопии
и
разрешенно-временной
флуоресцентной спектроскопии, реализованные в режиме внешнего отражения
(соответственно IRRAS и ER-TRFA) (рис. 3.1), а также метод флуоресцентной
корреляционной спектроскопии (FCS), позволяющий проводить фокусирование
на поверхности раздела фаз. Данные подходы, позволяющие следить за
структурой белков на поверхности раздела фаз, были разработаны впервые на
основе микроспектроскопических методов, применяемых в настоящее время
для изучения структурных свойств белков в гомогенных системах.
71
•ИРРАС
•ТРФА
Молекулярная информация
(Концентрация, конформация,
oриентация)
Реологические
свойства системы
Воздействие на пленку
(сжатие и расширение поверхности)
Рис. 3.1. Применение микроспектроскопических методов TRFA, IRRAS для проведения
экспериментов на поверхности раздела фаз при исследовании адсорбционных и структурных
свойств белков и их комплексов в процессе адсорбции на поверхности вода-воздух.
3.1.
Метод
инфракрасной
абсорбционно-рефлекционной
спектроскопии
(IRRAS) в настоящее время является одним из наиболее информативных (и в то
же время относительно простых с методической точки зрения, позволяющий
проводить
рутинные измерения)
поверхности
вода-воздух.
при
Метод
изучении
IRRAS
адсорбции
чувствителен
к
белков на
изменению
концентрации белка на поверхности вода-воздух, а также к изменениям во
вторичной структурой белка адсорбированного на поверхности. Глубина
проникания света в IRRAS составляет 500 нм – 1 мкм [45], что позволяет
изучать свойства белка не только в монослое, но также анализировать профиль
распределения
концентрации
белка
по
глубине
в
поверхностном
и
приповерхностных слоях при исследовании коллоидных систем с относительно
толстыми поверхностными слоями, с которыми имеют дело при изучении
многих природных, а также искусственных коллоидных систем (в первую
очередь, пищевых). Информация о распределении концентрации белка по
глубине в поверхностном слое необходима также при изучении молекулярных
и кинетических механизмов адсорбции белков.
Однако до настоящего времени метод IRRAS использовался для
получения качественной информации о свойствах белков адсорбированных на
72
поверхности
вода-воздух
в
связи
со
сложностью
количественной
интерпретации спектров отражения. В данной работе был разработан метод
количественного анализа IRRAS спектров, позволяющий получать детальную
количественную информацию о свойствах белков адсорбированных на
поверхности вода/воздух.
Спектр отражения (или рефлекционный спектр)
как
R  I R / I0
R( , 0 , pol , nˆ ) ,
- отношение интенсивности отраженного света
падающего света
I0 ,
IR
определяется
к интенсивности
является функцией длины волны (или частоты падающего
света), зависит от угла падения  0 , поляризации падающего света и оптических
свойств
материала,
преломления
спектров
n̂
которые
определяют
комплексный
коэффициент
и которые являются предметом изучения при измерении
отражения.
При
измерении
спектров
отражения
белков,
адсорбированных на поверхности вода-воздух, наиболее удобным способом
представления
экспериментальных
данные
является
рефлекционно-
абсорбционные спектры (РАС), которые выражаются следующим образом:
–log(Rprot/Rbuf)
(3.1),
где Rprot - спектр отражения образца (белка), Rbuf – спектр отражения фона
(водного буферного раствора). Экспериментальные данные представленные в
виде РАС спектров более чувствительны к сигналу белка, чем рефлекционные
спектры
R ()
за счет учета вклада воды.
На рисунке 3.2Б представлен ИК спектр отражения IRRAS овальбумина,
адсорбированного на поверхности вода-воздух в сравнении с ИК спектром
поглощения овальбумина (FTIR-ATR) (рис. 3.2А). В ИК спектре поглощения
ОВА присутствуют следующие характеристические для белков пики: амид А
пик - в интервале частот 3000-3300 см-1; амид 1 и амид 2 пики присутствуют в
интервалах частот 1600-1700 и 1500-1600, соответственно (рис. 3.2Б).
Интенсивность пиков пропорциональна концентрации белка в исследуемом
растворе, а форма пиков в амид 1 и амид 2 (в первую очередь, амид 1) области
ИК спектра чувствительна к изменениям во вторичной структуре белков. Для
73
количественного определения элементов вторичный структуры в ОВА в
растворе проводили деконволюционный анализ амид 1 пика ИК спектра
поглощения ОВА с использованием программного обеспечения GRAMS/IR
(Buck Scientific) и литературных данных по соотнесению пиков [31-32, 37].
Анализ ИК спектров поглощения ОВА показал, что вторичная структура ОВА
содержит 47% of -структуры и 35% -спиралей; полученные результаты
хорошо согласуются с литературными данными, полученными методом РСА
[75]. Полученный ИК спектр поглощения использовали далее для анализа
спектров отражения, IRRAS.
А
ИК спектр поглощения
Б
ИРРАС
0,05
-log (R/R0)
Ед. Абсорбции
0,08
0,05
0,03
0,01
0,02
-0,01
4000
3500
3000
2500
2000
1500
-0,01
4000
1000
cм-1
3500
3000
2500
2000
1500
1000
cм-1
С
ИК спектр поглощения
ИРРАС
Д
0,025
-log (R/Ro)
Ед. Абсорбции
0,09
0,06
0,02
0,015
0,03
0
1900
1800
1700
1600
1500
1400
1300
0,01
1900
cм-1
1800
1700
1600
1500
1400
1300
cм-1
Рис. 3.2. (A) Фурье ИК спектр поглощения (FTIR-ATR) высушенной пленки овальбумина
полученной из 100 мкл 10 мг/мл раствора овальбумина в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7.0;
(Б) ИК спектр отражения (IRRAS) овальбумина адсорбированного на поверхности водавоздух при объемной концентрации белка 10 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7.0,
время адсорбции 60 минут (Б). На рисунках (С) и (Д) представлены отдельно амид I и амид II
области спектров FTIR-ATR и IRRAS, соответственно (из работы Kudryashova et al. [76]) .
Из рисунка 3.2 можно видеть, что в отличие от спектров поглощения, в
IRRAS спектрах характеристические пики белка, имеют отрицательную
интенсивность («отрицательные» пики). «Положительный» пик «воды» на
74
частоте 3500 см-1 направлен в противоположную сторону по сравнению с
пиками белка. Это связано с тем, что IRRAS спектр измеряется и представлен
относительно спектра сравнения, водного раствора, не содержащего белка.
Противоположная направленность (недостаток воды по сравнению с исходным
раствором) отражает замещение молекул воды на поверхности вода-воздух
адсорбированными молекулами белка.
ИК спектры отражения (IRRAS) белков определяются оптическими
свойствами поверхности, которые в свою очередь, зависят от распределения
концентрации белка на поверхности раздела фаз, а также от структуры
адсорбированного белка, что позволяет определять данные параметры из
анализа IRRAS спектров. Однако анализ интенсивностей и позиций пиков в
IRRAS спектрах белков усложнен, т.к. концентрация белка в поверхностном
слое и его конформационные свойства связаны лишь косвенным образом с
интенсивностями и формами пиков в IRRAS спектрах, путем влияния свойств
белка на оптические свойства поверхности отражения. Оптические свойства
поверхности выражаются через комплексный коэффициент преломления,
ñ=n+ik, который зависит от длины волны, поляризации (параллельной или
перпендикулярной к поверхности) и угла падения света.
Для интерпретации IRRAS спектров на основе оптической теории,
созданной для анализа спектров отражения, применяли метод спектральной
симуляции IRRAS спектров с использованием экспериментальных ИК спектров
поглощения соответствующего белка. В дальнейшем будем называть этот
метод как «симуляционный анализ».
Оптическая теория, позволяющая проводить количественный анализ
спектров отражения подробно описана в работах [77-79]. Данная теория
использовалась ранее для анализа данных, полученных другими методами,
применяемыми в режиме отражения, для определения профилей распределения
адсорбированного вещества в поверхностном слое: методом эллипсометирии, а
также спектроскопии отражения нейтронов и рентгеновских лучей. Основы
оптической теории применительно к ИК спектроскопии подробно рассмотрено
75
в обзоре [79]. Здесь мы приводим модель оптической системы, которая была
использована для проведения обсчета IRRAS спектров исследуемых в работе
белков и основные положения симуляционного анализа IRRAS спектров.
Для
анализа
IRRAS
спектров
использовали
модель,
в
которой
рассматривали систему, как состоящую из определенного числа (N) гомогенных
слоев, толщиной (di) и концентрацией белка ci расположенных над объемной
фазой с концентрацией c0. (рис. 3.3). Оптические свойства каждого из слоев
описываются комплексным коэффициентом преломления ñ. Для слоя j
комплексный коэффициент преломления определяется как: ñ
j
= n
j
+ ik
j
.
Комплексный коэффициент преломления является функцией длины волны
падающего света, . Действительная часть nj – является показателем
преломления, который характеризует вклад оптического эффекта в IRRAS
спектр.
Мнимая
часть
представлена
kj
коэффициентом
экстинкции
исследуемого вещества, который связан с коэффициентом поглощения α
уравнением: α = 4πk/λ, где λ - длина волны ИК света. Коэффициент поглощения
α - параметр измеряемый методом ИК спектроскопии в режиме поглощения.
Симуляционный
анализ
IRRAS
спектров
с
применением
экспериментальных спектров поглощения основан на том, что система
уравнений Крамерс–Крониг (Крамерс–Крониг преобразования) позволяет
установить
взаимосвязь
комплексного
показателя
преломления
белок-
содержащего слоя и спектром отражения R(ν). Данный тип анализа
рефлекционных спектров подробно рассмотрен в работе [78]. Здесь мы
приведем результирующие уравнения, которые непосредственно используются
в компьютерном алгоритме для обсчета IRRAS спектров.
В случае поверхности вода-воздух (в условиях режима внешнего
отражения) уравнение, связывающее отражение
R
и фазовый сдвиг

падающим и отраженным лучом записывается следующим образом:
 ( ) 
2



0
ln R( ' )
 ' 2  2
76
d '
(3.2)
между
Комплексный коэффициент отражения
r̂
выражается через фазовый сдвиг φ и
отражение, R ( R  I R / I 0 ):
(3.3)
Согласно закону Френеля, комплексный коэффициент отражения,
показателями преломления
n̂0 и
n̂1 среды
r̂ ,
связан с
падения и отражения (рис. 3.3) ,
соответственно как:
rˆ 
nˆ 0 cos ˆ0  nˆ1 cos ˆ1
nˆ 0 cos ˆ0  nˆ1 cos ˆ1
(3.4)
nˆ 0 sinˆ0  nˆ1 sinˆ1
где ˆ0 и
ˆ1
(3.5)
- углы падения и преломления, соответственно.
Из уравнений (4) и (5), следует, что:
 rˆ  1 
2
sin ˆ0  
 cos ˆ0
ˆ
r

1


2
nˆ1  nˆ 0
2
В нашем случае среда падения – воздух, поэтому
Действительная
часть
комплексного
(3.6)
nˆ 0  n0  1
и
ˆ0   0 .
коэффициента
преломления,
n,
(описывающая вклад оптического эффекта в IRRAS спектр), может быть
определена из мнимой части, k, применяя уравнение:
(3.7)
где n(
) – базовая линия коэффициента преломления (не зависит от длины
волны).
В качестве исходных данных получения теоретических IRRAS спектров
оптические константы
Коэффициент
nˆ w  nw  i k w
преломления
для воды взяты из литературы [80].
водного
77
раствора
белков
nmix
определяли
экспериментально при варьировании концентрации белка
линейная зависимость коэффициента преломления
nmix
c.
Была получена
от концентрации белка
во всем изученном интервале концентраций белка вплоть до насыщающих
концентраций:
nmix  nw  .c
где
nw  1.332
коэффициент преломления воды,
  n / c  1.8  10 4 ml/mg .
(3.8)
c
концентрация белка в мг/мл и
Данная величина является постоянной для большинства
белков [15].
Для определения комплексного коэффициента преломления раствора белка
рассчитывали коэффициент экстинкции раствора
k mix ,
используя уравнение:
k mix   w .k w   prot.k prot
где
w
и
 prot
(3.9)
- относительные объемные концентрации воды и белка,
соответственно. Для оценки указанных относительных объемных концентраций
использовали следующие уравнения:
w 
1   .c /  w
1  v p c  ( h p   )c /  w
(3.10)
и
 prot 
где
vp
и
hp
v pc
(3.11)
1  v p c  ( h p   )c /  w
- параметры взятые из литературы [81]:
vp =
710-4 мл/мг -
парциальный объем белка (постоянный для большинства белков),
h p степень
гидратации равная 0.3 г(H20)/г(белка) (постоянна для большинства белков),  =
0.1 - коэффициент учитывающий относительное количество гидратационной
воды в сухом белке и
w 1
г/мл – плотность воды.
На основе приведенных выше уравнений проводили анализ IRRAS спектров
методом компьютерного моделирования IRRAS спектров, используя в качестве
78
вводных данных измеренные в отдельном эксперименте ИК спектры
поглощения соответствующего белка. Определение неизвестных параметров
проводили методом компьютерной итерации. В качестве критерия качества
обсчета использовали стандартные статистические функции и параметры: χ 2 ,
автокорреляционная функция «взвешенных остатков», а также визуальное
соответствие теоретической и экспериментальной кривой.
Параметрами, определяемыми в результате анализа IRRAS спектров,
являются число гомогенных слоев в системе N, концентрация белка в каждом
из слоев cj, и его толщина dj.
Для всех изученных в работе систем было установлено, что система
удовлетворительно описывается следующей моделью: воздух/поверхностный
слой белка/субфаза/объем раствора. Введение дополнительных слоев не
приводило к улучшению визуальных и статистических параметров обсчета
IRRAS спектров, в то время как использование системы состоящей только из
одного поверхностного слоя расположенного над объемной фазой оказалось не
достаточно для адекватного описания полученных IRRAS спектров. Таким
образом, в результате спектрального анализа в случае наших систем (белки или
их комплексы, адсорбированные на поверхности вода-воздух) получали
следующие
параметры
системы:
толщина
поверхностного
слоя
(d),
концентрация белка в поверхностном слое и в суб-фазе, соответственно c1 и c2.
Ошибка в определении параметров составляла 10–20%, в зависимости от
исходной концентрации белка в объеме раствора. В случае высоких объемных
концентраций белка (1 мг/мл и более) ошибка не превышала 10%.
79
Рис. 3.3. Схематическое представление оптической системы состоящей либо из
одной отражательной поверхности (А) либо из нескольких (N) параллельных
гомогенных слоев (Б). R - параметр отражения, является функцией угла падения
 0 , комплексного коэффициента преломления n̂ j , направления поляризации света
(pol) и длины волны света  . Среда падающего света – воздух ( nˆ0  1 ) (из работы
Meinders et al., 2001 [35]) .
Для изученных в работе белков: овальбумин (ОВА) и β-лактоглобулин (lg) (нативные или модифицированные формы) адсорбированные из водных
растворов
с
объемной
концентрацией
0,1-100
мг/мл,
система
удовлетворительно описывается двухслойной моделью: поверхностный слой,
обогащенный белком, толщиной d и концентрацией c1 и субфаза с
концентрацией с2, расположенные над объемной фазой с концентрацией белка
со, которая практически не изменяется даже при глубоких степенях адсорбции.
Введение дополнительных слоев не приводило к улучшению визуальных и
статистических параметров обсчета IRRAS спектров, в то время как
использование системы состоящей только из одного поверхностного слоя
расположенного над объемной фазой оказалось не достаточно для адекватного
описания полученных IRRAS спектров. Таким образом, в результате анализа
IRRAS спектров белков, адсорбированных на поверхности вода-воздух,
получали следующие параметры системы: толщина поверхностного слоя (d),
концентрация белка в поверхностном слое c1, и в суб-фазе c2, соответственно.
80
На рис. 3.4. представлены экспериментальные и симуляционные IRRAS
спектры ОВА при различных объемных концентрациях белка в квазиравновесных условиях (в условиях когда поверхностное давление практически
не изменялось со временем, после инкубации системы в течении 60 минут).
Анализируя вид IRRAS спектров при различные объемных концентрациях
белка (рис. 3.4), можно видеть, что с увеличением начальной концентрации
белка с0 «отрицательная» интенсивность амид 1 и амид 2 пиков белка и
«положительная» интенсивность пика воды увеличиваются. Т.е. интенсивности
рассматриваемых пиков кореллируют с концентрацией белка в системе. Кроме
того, при высоких концентрациях белка можно отчетливо видеть появление
-1
«острого» «положительного» пика при 1700 cм и «острого» «отрицательного»
-1
пика при 3700 cм . Данные пики, наблюдаемые в IRRAS спектрах при высоких
концентрациях белков являются характеристическими для рефлекционных
спектров
(обусловлены
оптическими
свойствами
поверхности,
а
не
структурными свойствами белков) и их интенсивность обратно коррелирует с
разницей в концентрации белка в поверхностном слое и в субфазе [35].
-log (R/Ro)
50 мг/мл
10 мг/мл
0.1 мг/мл
4100
3600
3100
2600
2100
1600
1100
-1
Длина волны (cм )
Рис. 3.4. Экспериментальные и теоретически полученные IRRAS спектры ОВА
адсорбированного на поверхности вода-воздух в зависимости от объемная концентрация
белка. Условия эксперимента: 10 мM фосфатном буфере, pH 7.0; время адсорбции 60 мин,
температура 22оС (из работы Kudryashova et al., 2003 [76]).
81
Количественный анализ IRRAS спектров ОВА, измеренных при
различных
объемных
концентрациях
белка,
проводили
методом
симуляционного анализа с использованием ИК спектров поглощения ОВА (как
описано выше).
Параметры системы, полученные в результате анализа IRRAS спектров
ОВА (рис. 3.4) суммированы в таблице 3.1.
Tаблица 3.1. Параметры, полученные на основе общего анализа IRRAS
спектров ОВА измеренных при различных объемных концентрациях белка
(C0): концентрация белка в поверхностном слое (C1), концентрация белка в
суб-фазе (C2), толщина поверхностного слоя (d).
C0 (мг/мл) 0.1 (мг/мл)
10 (мг/мл)
50 (мг/мл)
C1 (мг/мл) 17
111
236
C2 (мг/мл) ~0.1
16
86
350
90
85
d (нм)
Обнаружено, что адсорбция ОВА на поверхности вода-воздух приводит к
образованию поверхностного слоя обогащенного белком (толщина слоя
составляет 80-400 нм в зависимости от исходной концентрации белка), а также
субфазы, в которой концентрация белка равна или немного превышает
объемную концентрацию. При увеличении исходной объемной концентрации,
концентрация в поверхностном слое возрастает, в то время как соотношение
концентрации белка в поверхностном слое и субфазе уменьшается (Табл. 3.1).
Таким образом, скорость адсорбции, а также параметры системы (c1, c2, d),
можно варьировать путем изменения объемной концентрации белка.
82
3.2. Применение IRRAS спектроскопии для изучения кинетики адсорбции белков
на поверхности вода-воздух.
По изменению параметров системы: d, c1, с2, c1/с2 , следили за кинетикой
адсорбции белка на поверхности вода-воздух. При исследовании ОВА и -lg
было найдено, что в первые несколько минут адсорбции происходит
образование монослоя белка (толщина слоя 7-10 нм) и субфазы, обедненной
белком. Затем происходит накопление белка в поверхностном слое толщиной
300-400 нм. В процессе адсорбции толщина поверхностного слоя, d,
уменьшается, а концентрация в нем, c1, увеличивается (рис. 3.5). Скорость
установления стационарных параметров системы (d, c1 и c1/с2), отражающая
скорость адсорбции белка, увеличивается пропорционально концентрации
белка в объемной фазе, со. Из приведенных данных следует, что скорость
адсорбции, а также параметры системы: толщину поверхностного слоя,
концентрацию адсорбированного белка можно контролировать варьированием
концентрации белка в объемной фазе.
Качественно информацию о механизмах адсорбции белка на поверхности
вода-воздух можно извлечь из анализа зависимости концентраций c1 и с2 от
времени. Было найдено, что при низких со (0.1-1 мг/мл) концентрация белка в
субфазе,
долгое
время
остается
существенно
более
низкой,
чем
в
поверхностном слое с2 ‹‹ c1 (рис. 3.5С и рис. 3.6А). Это означает, что адсорбция
из субфазы происходит быстрее, чем диффузия из объема раствора в субфазу и
скорость-лимитирующая
стадия определяется
диффузией. При средних
исходных концентрациях белка (5-10 мг/мл) концентрация белка в субфазе,
начиная с определенного момента, практически не меняется во времени
(dc2/dt=0). То есть, скорость диффузии сопоставима со скоростью адсорбции
(смешанный диффузионно-кинетический механизм адсорбции). При высоких
исходных концентрациях белка (50-100 мг/мл) белок интенсивно накапливается
в субфазе со временем. Это означает что скорость адсорбции более низкая по
сравнению с диффузией и механизм адсорбции кинетически контролируемый.
83
650
А
Толщина слоя (нм)
550
450
0.1 мг/мл
350
1 мг/мл
250
5 мг/мл
50 мг/мл
150
50
0
100
200
300
Б
50 мг/мл
С1 (мг/мл)
400
300
5 мг/мл
200
1 мг/мл
100
0
50
100
150
200
250
300
350
10000
В
C1/C2
1000
100
1 мг/мл
5 мг/мл
10
50 мг/мл
1
0
50
100
150
200
250
300
350
Время, (мин)
Рис. 3.5. Зависимости толщины поверхностного слоя (d)
(А), концентрации белка в нем (с1) (Б) и соотношения
концентрации белка в поверхностном слое и в субфазе
(с1/с2) (В) от времени адсорбции.
84
OВА 1 мг/мл
А
Толщина слоя
Поверхностный
слой
Субфаза
Объемная фаза
1 мг/мл
Время
OВА 10 мг/мл
Поверхностный
слой
Толщина слоя
Б
Субфаза
Объемная фаза
10 мг/мл
Время
OВА 50 мг/мл
В
Толщина слоя
Поверхностный
слой
Субфаза
Объемная фаза
50 мг/мл
Время
Рис. 3.6. Профиль распределения концентрации белка при адсорбции ОВА на поверхности
вода-воздух. Интенсивность светло-серого цвета отражает концентрацию белка.
Интенсивность темно-серого – воды.
Количественный анализ кинетических кривых адсорбции ОВА проводили
согласно уравнениям (3.12) и (3.13) [82]. Уравнение (1) описывает кинетику
адсорбции белка в условиях низкого заполнения поверхности (Г<1 мг/м 2). В
случае
смешанного
диффузионно-кинетического
85
механизма
адсорбции
уравнение (3.13) позволяет определять активационный барьер адсорбции (Ea/kT) путем соотнесения кажущегося коэффициента диффузии,
D*,
полученного из уравнения (3.12), и истинного коэффициента диффузии D
(определенного прямыми физическими методами, литературные данные).
Г(t)=С0D*t/π
(3.12);
D*=De-Ea/kT
(3.13),
где Г – количество белка адсорбированного на поверхности; С0 – объемная
концентрация белка; D* - эффективный коэффициент диффузии (определенный
из данных по кинетике адсорбции); D - коэффициент диффузии равный 0.70.8*10-10 м2/с (литературные данные [83-84]; k- константа Больцмана; Tабсолютная температура.
Из анализа начальных участков кривых зависимости степени заполнения
поверхности белком от времени Г (t) (мг/м2) (рис. 3.7Б, при концентрации белка
0.1 мг/мл) было найдено, что в случае ОВА, уже при низких степенях
заполнения поверхности (Г<1 мг/м2), механизм адсорбции смешанный,
диффузионно-кинетически
контролируемый;
процесс
адсорбции
ОВА
характеризуется наличием активационного барьера порядка 10±2 кДж/моль. В
случае β-лактоглобулина, анализ зависимостей Г (t) (мг/м2) (рис. 3.7А, при
концентрации белка 0.005 мг/мл), показал, что механизм адсорбции при низких
степенях заполнения поверхности (Г<1 мг/м2) - диффузионно-контролируемый,
(D* ~ D = 1.0*10-10 м2/с [85], активационный барьер адсорбции равен нулю.
86
Рис. 3.7. Зависимости степени заполнения поверхности белком от времени Г (t) (мг/м2) при
адсорбции β-лактоглобулина (А) и овальбумина (Б) на поверхности вода-воздух. Объемные
концентрации белка (мг/мл), А: 0.5(▲), 0.1 (■), 0.05 (◊) и 0.005(х). Б: 0.5 (∆), 0.1 (□), 0.05 (◊).
Для
детального
изучения
механизма
адсорбции,
были
изучены
структурные и динамические свойства белков ОВА и β-лактоглобулина на
поверхности вода-воздух в сравнении со свойствами белков в объеме раствора.
3.3. Анализ вторичной структуры белков адсорбированных на поверхности
вода-воздух
За вторичной структурой белка при адсорбции следили в «амид 1» областях
IRRAS спектров. Для получения количественной информации о вторичной
структуре и агрегационном состоянии белка на поверхности вода-воздух также
применяли метод симуляционного анализа IRRAS спектров. Анализ проводили
следующим образом: на основе экспериментального ИК-спектра поглощения
соответствующего белка с применением метода спектральной симуляции
(описанного выше) получали теоретический IRRAS спектр (во всем изученном
87
диапазоне частот ИК спектра: 4000-1100 см-1), подбирая оптимальные «макропараметры» системы: толщину поверхностного слоя, d, и концентрации белка в
поверхностном слое, c1, и субфазе, с2. Далее, фиксировали найденные параметры
и проводили анализ непосредственно «амид 1» области IRRAS-спектра (17001550 см-1) для получения информации о вторичной структуре белка. Используя
базу данных по ИК спектрам поглощения белков (GRAMS/IR (Buck Scientific)),
а также литературные данные по соотнесению полос в ИК спектре поглощения
исследуемого белка, например, ОВА [37], варьировали содержание элементов
вторичной структуры в ИК спектре поглощения с шагом в 2%. Полученные
спектры далее применяли для получения теоретических IRRAS спектров (на
основе алгоритма описанного выше), различающихся содержанием вторичных
структур.
Методом
итерации
находили
теоретические
IRRAS
спектры
наибольшим образом соответствующих экспериментальному IRRAS спектру (на
основе стандартных статистических критериев, а также на основе визуального
анализа спектров). Примеры применения симуляционного анализа амид 1
области IRRAS спектров ОВА (при концентрациях белка 0.1, 10 и 50 мг/мл)
приведены на рис. 3.8. Из рисунка видно, что соотношение интенсивностей
пиков, соответствующих -спиралям и -структурам в экспериментальном
спектре, не соответствует таковым в теоретически полученном спектре
нативного ОВА, что свидетельствует о наличии конформационных изменений в
белке при адсорбции. Анализ спектра показывает, что на поверхности водавоздух ОВА принимает конформацию, в которой содержание -структуры на
10% меньше по сравнению с белком в объеме раствора. Показано, что такая
конформация образуется при адсорбции ОВА из исходных объемных
концентраций 0.1-10 мг/мл (рис. 3.8 А,Б). При адсорбции из высоких
концентраций белка (50-100 мг/мл) ОВА сохраняет нативную конформацию в
поверхностном слое, что объясняется отсутствием необходимого пространства в
поверхностном слое белка. По-видимому, уже на начальной стадии адсорбции
конформация белка фиксирована в поверхностном слое.
88
A
0. 1 мг/мл
ИРРАС
теор
эксп
теор -10% β-стр
1690
1650
1610
1570
cм-1
10 мг/мл
Б
ИРРАС
теор
эксп
теор -10% β-стр
1690
1650
1610
1570
cм-1
50 мг/мл
В
ИРРАС
теор
эксп
теор -10% β-стр
1690
1650
1610
1570
cм-1
Рис. 3.8. Определение вторичной структуры ОВА на поверхности вода-воздух на основе
анализа АМИД I области IRRAS спектров. Объемные концентрации ОВА 0.1мг/мл (А), 10
мг/мл (Б) и 50 мг/мл (В). Exp – экспериментальные IRRAS спектры; Sim – теоретические
кривые без учета конформационных изменений; Sim-10% s - теоретические IRRAS спектры,
в которых содержание -структуры снижено на 10% (из работы Kudryashova et al. [76]).
89
При адсорбции -lg также, как и в случае ОВА, при адсорбции на
поверхности наблюдаются изменения во вторичной структуре белка. На рис. 3.9.
приведены примеры IRRAS спектров -lg при концентрациях 1 и 10 мг/мл. При
адсорбции из низких и умеренных объемных концентраций (0.1 - 5 мг/мл)
происходит уменьшение содержание -структуры на 10-12 %. При высоких
концентрациях белка вторичная структура белка на поверхности вода-воздух не
изменяется, как и в случае ОВА.
Рис. 3.9. Определение вторичной структуры -lg при концентрациях 1 и 10 мг/мл на
поверхности вода-воздух на основе анализа АМИД I области IRRAS спектров. эксп –
экспериментально полученные IRRAS спектры; теор. – теоретические кривые без учета
конформационных изменений; теор.-10%  - стр - теоретические IRRAS спектры, в которых
содержание -структуры снижено на 10%.
Таким образом, разработка метода спектральной симуляции для анализа
IRRAS
спектров
открывает
принципиально
новые
возможности
при
исследовании свойств белков в процессе адсорбции на поверхности водавоздух. Позволяет в режиме реального времени следить за распределением
белка в поверхностном слое; вторичной структурой; кинетикой адсорбции.
90
3.4. Молекулярная подвижность белков на поверхности вода-воздух
При исследовании свойств белков адсорбированных на поверхности раздела фаз
одним из наиболее важных параметров является молекулярная подвижность
белка. Данный параметр характеризует структуру поверхностного слоя и
состояния
белка
в
нем.
Подвижность
белков
–
параметр,
который
существенным образом изменяется при адсорбции; фактически ограничение
подвижности отражает само существо адсорбции.
Нами были впервые разработаны подходы для изучения молекулярной
подвижности белков в процессе адсорбции на поверхности вода-воздух в
режиме
реального
времени
на
основе
высокочувствительных
микроспектроскопических флуоресцентных методов разрешенно-временной
флуоресцентной спектроскопии (TRFA) и флуоресцентной корреляционной
спектроскопии (FCS), применяемых для изучения свойств белков и других
биополимеров в растворах. С применением разработанных методов впервые
были определены количественно параметры, характеризующие молекулярную
подвижность белков (общую и внутреннюю) на поверхности вода-воздух.
Для
получения
информации
о
молекулярной
подвижности
и
пространственной структуры белков, адсорбированных на поверхности водавоздух, в представленной работе метод разрешенно-временной флуоресцентной
спектроскопии был впервые применен в режиме внешнего отражения,
(«external reflection» TRFA или ER-TRFA). Общий принцип установки для
проведения экспериментов в режиме отражения методом TRFA представлен на
рис. 3.10. Было установлено горизонтальное направление поляризации
возбужденного света, так чтобы плоскость поляризации была параллельна
плоскости поверхности вода-воздух. Поляризованный луч возбуждающего
света направлен под углом 100 к поверхности вода-воздух. Направление
детекции было установлено вертикальное по отношению к поверхности водавоздух. Данная конфигурация позволяет с максимальной селективностью
следить за деполяризационными процессами, происходящими на поверхности
вода-воздух и минимизировать вклад флуоресценции из объема раствора.
91
Данная установка была применена при изучении молекулярной подвижности
белка в процессе адсорбции на поверхности вода-воздух.
Рисунок 3.10. Общий принцип установки TRFA разработанный для проведения
экспериментов в режиме отражения при изучении вращательной подвижности белков
адсорбированных на поверхности вода-воздух в Ленгмюровской ванне (из работ
Kudryashova et al. 2003 и 2007 [76, 86]).
Метод TRFA основан на том, что при возбуждении флуорофоров
поляризованным светом, испускание флуоресценции также поляризовано. В
TRFA эксперименте измеряются независимо снижение параллельной и
перпендикулярной составляющих флуоресценции как функции от времени
разрешенные в наносекундной временной шкале. В TRFA эксперименте
определяется
величина
общей
флуоресценции
I(t)
и
флуоресцентной
анизотропии r(t) как функция от времени. Применительно к системе водавоздух, параметры общей флуоресценции I(t) и флуоресцентной анизотропии
r(t) выражаются следующим образом:
92
(3.14);
(3.15),
где I‖(t) и I(t) - наблюдаемые параллельная и перпендикулярная компоненты
флуоресценции относительно направления поляризации возбуждающего луча;
g
–
фактор,
учитывающий
чувствительность
системы
детекции
перпендикулярной компоненты по отношению к параллельной и определяется
в
независимом
эксперименте;
Е(t)
–
параметр,
характеризующий
инструментальную поправку.
В
общем
случае
деполяризация
флуоресценции
описывается
мультиэкспоненциальной зависимостью:
r(t) = jexp(-t/j),
(3.16),
где j - индивидуальные корреляционные времена вращения, отражающие
скорость вращательного движения флуорофора, а j - вклады соответствующих
компонентов в снидение анизотропии. В белках существует несколько причин
снижения
анизотропии
(или
деполяризации):
быстрое
движение
флуоресцентной метки относительно места ее прикрепления, более медленное
внутреннее движение сегментов белка, вращение всей молекулы белка,
подвижность белковых агрегатов. Для сферических частиц корреляционное
время вращения (белка) связано с общим объемом белковой молекулы (V) (или с
молекулярной массой частицы, М) соотношением Стокса-Эйнштейна:
белка VRv+hR

93
где v - удельный объем белка; - вязкость растворителя; h - величина
гидратации, R – универсальная газовая постоянная, T – абсолютная
температура. Для глобулярных белков корреляционное время вращения (белка,
нс) связано с молекулярной массой белка (М) эмпирическим уравнением: белка
= 36 * 10-5 * M.
За молекулярной подвижностью ОВА следили по флуоресцентной метке,
акридон 14, ковалентно введенной на поверхность белка со степенью
модификации N=1(±0.2) (рис. 3.11).
Рис. 3.11. Структурная формула метки Акридон 14. Флуоресцентное время жизни τ =14.2.
Было показано, что введение одной акридоновой метки на поверхность
белка практически не влияет на его адсорбционные свойства. С другой стороны,
использование акридоновой метки существенно повышает чувствительность
метода, что важно при работе с низкими концентрациями (менее 0.5 мгмл), а
также, при изучении свойств белка в поверхностном слое, в котором, за счет
низкой толщины слоя (10-100 нм), общее количество белка намного ниже по
сравнению с объемом раствора. Флуоресцентное время жизни акридоновой метки
равно 14.2 нс, что достаточно для измерения анизотропии комплексов белков с
ПЭ общей молекулярной массы до 200 кДа. При концентрациях более 0.5 белка
мгмл и более за динамикой белка следили по собственной флуоресценции белка
(по триптофановым остаткам). Было обнаружено, что в объеме раствора ОВА
проявляет свободное вращение. Корреляционное время вращения, белка= 22-25
нс, соответствует его геометрическому размеру согласно уравнению СтоксаЭйнштейна (уравнение (3.17)) [76, 87].
94
Адсорбция ОВА на поверхности вода-воздух приводит к увеличению
скорости вращения белка по сравнению с объемом раствора. При адсорбции из
относительно высоких концентраций (1-3 мг/мл) корреляционное время, белка,
снижается до 16 нс. Возможным объяснением данного эффекта может являться
частичная денатурация или агрегация, в результате чего вращение всей
молекулы белка ограничено (заморожено), при этом сохраняется вращательная
подвижность сегмента белковой молекулы.
С другой стороны, величина полученного корреляционного времени
вращения (16 нс) может являться следствием ограничения подвижности
молекулы белка в направлении более длинной оси. Молекула ОВА имеет
эллипсоидную форму 4.5×7×5 нм, и ограничение подвижности белка в
направлении его более длинной оси будет приводить к уменьшению
корреляционного времени вращения примерно в 1.5 раза, что и наблюдается в
нашем случае. Полученные данные являются указанием на то, что белок
преимущественно вертикально ориентирован на поверхности вода-воздух при
данных условиях адсорбции. Данные, подтверждающие это предположение –
наличие ненулевой остаточной анизотропии, т.е. кривые деполяризации не
доходят до нуля в наносекундной временной шкале, что указывает на
ограничение подвижности молекул в одном из направлений [55]. Следует
отметить, что аналогичное анизотропные вращательные свойства белков
эллипсоидной формы наблюдались ранее и описаны в литературе для ряда
систем, в частности при взаимодействии мембранных белков с липосомами, где
наблюдалась образование пространственно ориентированного белкового слоя
[55, 88-90]. Данное состояние белка адсорбированного на поверхности
(ограниченное вращение молекулы с корреляционным временем вращения 16
нс) остается неизменным, по крайней мере, в течение нескольких часов.
Иная картина наблюдается при адсорбции белка из низких объемных
концентраций (0.01-0.05 мг/мл). Адсорбция ОВА приводит к уменьшению
параметра белка до 5.1 нс, величина полученного значения белка соответствует
сегментальной
подвижности
белка. Вращения
95
всей
молекулы
ОВА
не
наблюдается в наносекундной временной шкале. Оказалось, что большая часть
молекулы белка неподвижна или иммобилизована на поверхности вода-воздух,
что в данном случае, наиболее вероятно, связано с денатурацией белка, что
наблюдалось также методом IRRAS при низких объемных концентрациях белка.
В отличие от ситуации, наблюдаемой при высоких исходных концентрациях
белка, при низких концентрациях нет никаких указаний, что ОВА принимает
упорядоченную ориентацию на поверхности. Это различие объясняется
невысокой плотностью белка на поверхности в случае низких концентраций.
Таким образом, в работе было впервые продемонстрировано, что метод
TRFA в режиме отражения, ER-TRFA, позволяет следить за свойствами белков
непосредственно в процессе адсорбции. Показано, что метод ER-TRFA
чувствителен к изменениям пространственной структуры, общей и внутренней
молекулярной подвижности белков, а также, состояния агрегации белков на
поверхности вода-воздух.
В то время как метод ER-TRFA позволяет получать информацию о
внутренней
молекулярной
подвижности,
что
в
наибольшей
степени
характеризует структуру белка на поверхности, не менее важной характеристикой
адсорбированных белков является общая молекулярная подвижность или
диффузионные
свойства,
которые
напрямую
характеризуют
структуру
поверхностного слоя, степень “конденсированности”; агрегатное состояние
адсорбированных молекул белка в слое.
Для получения информации об общей молекулярной подвижности белков
на поверхности вода-воздух был впервые адаптирован и применен метод
флуоресцентной флуктуационной спектроскопии (FFS), который до настоящего
времени применялся для измерения диффузии флуоресцентных молекул в
объемной фазе.
96
3.5. Трансляционная диффузия белка на поверхности вода-воздух.
Подвижность
белка
на
поверхности
вода-воздух
исследовали
методом
флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS), который позволяет
измерять
напрямую
скорость
трансляционной
диффузии
флуорофоров.
Благодаря высокому пространственному и временному разрешению возможна
детекция флуоресцентного сигнала на уровне отдельных молекул. Данный метод
широко используются для исследования динамики белков в растворах и в
составе клеточных мембран. В настоящей работе метод FCS впервые были
адаптирован и применен для изучения молекулярной динамики белков
адсорбированных на поверхности раздела фаз, в данном случае - на поверхности
вода-воздух. Метод FCS основан на том, что диффузия флуоресцентных молекул
вызывает флуктуации в интенсивности флуоресценции, за которыми следят в
элементе объема (0.1-1 фемта литр) создаваемом с помощью конфокального
флуоресцентного микроскопа. Измеренные как функции от времени флуктуации
флуоресценции обрабатываются автокорреляционной функцией G(t):
G(t) = <I>2+<I(t)*I(t+)>
<I>2
(3.18),
где I(t) – интенсивность флуоресценции при времени t, I(t+) - интенсивность
флуоресценции
после
промежутка
времени,
.
Статистический
анализ
флуктуаций флуоресценции (анализ автокорреляционной функции G(t) (ур.
3.19)) позволяет определять время трансляционной диффузии, d, которое
характеризует время пребывания молекулы в рассматриваемом элементе объема
и которое обратно пропорционально коэффициенту диффузии, D (d=W2xy/4D):
G() = 1+
1
N*(1+d)(1+(/a2d))1/2
(3.19),
где a2 – «структурный параметр» (характеристика системы), N - число частиц в
рассматриваемом элементе объема,d - время трансляционной диффузии,
97
d=W2xy/4D,
W2xy
определяется
из
–
геометрическая
калибровочных
характеристика
кривых
объема
детекции,
для
модельных
измеренных
флуорофоров с известным временем трансляционной диффузии [71].
Для проведения FCS-экспериментов на поверхности вода воздух измеряли
профиль распределения концентрации белка путем сканирования интенсивности
флуоресценции как функции расстояния от дна ячейки до поверхности раздела
фаз. На рис. 3.12 приведен пример профиля распределения концентрации для
OВА (А) и калибровочная кривая зависимости наблюдаемой интенсивности
флуоресценции в поверхностном слое от исходной объемной концентрации
белка (рис. 3.12Б).
10
В
Б
1000
1
С1, mг/мл
Инт. флуоресценции, у.е.
10000
100
10
0,1
0,01
1
0,001
0,1
-4
-3
-2
-5
-1
-4
-3
-2
-1
log(C0), mg/ml
log(C0), мг/мл
Рис. 3.12. (А): Профиль распределения концентрации ОВА меченного акридоном вблизи и на
поверхности вода-воздух полученный методом флуоресцентной микроспектроскопии. Из
анализа нескольких профилей концентрации (А) измеренных при разных объемных
концентрациях белка (С0) были получены калибровочная кривая (Б) и зависимость
концентрации белка на поверхности вода-воздух (в точке 2) от концентрации белка в объеме
раствора (В) (из работы Kudryashova et al., 2005 [91]).
Концентрация белка в поверхностном слое, найденная методом FCS, и ее
соотношение с объемной концентрацией (рис. 3.12В) согласуется с данными,
полученными методом IRRAS. Это доказывает применимость используемых
методов, FCS и IRRAS, для определения концентрации белка вблизи и на
поверхности вода-воздух.
98
Было обнаружено, что трансляционная диффузия ОВА на поверхности
вода-воздух в 30 раз более медленная, чем в объеме раствора (Рис. 3.13).
Времена трансляционной диффузии в объеме раствора и на поверхности водавоздух равны соответственно 0.3 и 9 мсек, что соответствует уменьшению
Автокорреляционная ф-ция
коэффициента диффузии от 0.8*10-10 м2/сек до 0.03*10-10 м2/сек.
3
2,6
2
2,2
1,8
1
1,4
1
0,001
0,1
10
1000
-3
Время, сек*10
Рис. 3.13. Автокорреляционные кривые (экспериментальные и симуляционные) полученные
методом FCS для ОВА в объеме раствора (1) и на поверхности вода-воздух (2) (из работы
Kudryashova et al., 2005. [91]) .
Сопоставляя данные, полученные методом FCS и ER-TRFA, мы можем
сделать вывод, что подвижность ОВА на поверхности вода-воздух существенно
ограничена. Ограничена как общая динамика белка (снижение коэффициента
диффузии в 30 раз), так и вращательная подвижность.
Следует
отметить,
что
найденные
параметры,
характеризующие
молекулярную подвижность, относятся к поверхностному слою белка,
полученному из разбавленных растворов, в котором белок находится на
поверхности в не агрегированном состоянии, как было найдено методом IRRAS.
А как будет изменяться молекулярная подвижность (внутренняя и общая)
при усилении белок-белковых взаимодействий и, в пределе, при образовании
агрегированного белкового слоя на поверхности вода-воздух? Этот вопрос
является крайне важным, поскольку, как обсуждалось выше, на поверхности
вода-воздух образуются высоко-концентрированные поверхностные слои с
99
локальной концентрацией вплоть до 300 мг/мл. Понятно, что в таких системах
белок-белковые взаимодействия и агрегация является одним из ключевых
факторов, влияющих на структуру поверхностного слоя и его реологические
свойства.
Применение разработанных нами микро-спектроскопических методов
IRRAS, ER-TRFA в режиме отражения и FCS в сочетании с методами
спектральной симуляции открывает новые возможности для выяснения
молекулярных деталей влияния агрегации на структурно-динамические
свойства белков, адсорбированных на поверхности.
3.6. Роль межмолекулярных взаимодействий в формировании и свойствах
поверхностного слоя белка при адсорбции на поверхности вода-воздух
Разработанные методы были применены далее для выяснения роли образования
белковых ассоциатов в формировании и свойствах поверхностного слоя белка
при адсорбции на поверхности вода-воздух. Для этой цели были рассмотрены три
препарата
овальбумина,
характеризующиеся
различной
способностью
образовывать агрегаты: нативный ОВА (N-ОВА), термоденатурированный ОВА
(Т-ОВА), полностью агрегированный ОВА, и ОВА, модифицированный
янтарным ангидридом (янт-ОВА), который не имеет склонности к агрегации из-за
высокой плотности отрицательного заряда на поверхности.
Структурные характеристики в объемной фазе.
Вторичная структура препаратов ОВА была изучена методами ИК- и КД
спектроскопии. ИК спектры ОВА, T-ОВА приведены на рис. 3.14А. Анализ
«амид 1» области ИК спектра (рис. 3.14Б) спектра показал, что вторичная
структура OВА содержит 47±3 % -структуры и 35±3% -спиралей, что
хорошо согласуется с данными полученными методом КД спектроскопии. В
препарате T-OВА содержание -структуры на 10-15% меньше по сравнению с
OВА. Появление пика на 1624 cм-1 в спектре T-OВА (рис. 3.14Б)
100
свидетельствует о наличии антипаралельных -слоев, что характерно для
агрегированного ОВА. Подробно состояние агрегации в T-OВА анализировали
методами гель-фильтрации, нативного и SDS-электрофореза. Оказалось, что TOВА
состоит
на
95-98%
из
нековалентно
агрегированного
белка.
Молекулярная масса агрегатов составляет 600–700 кДа, что соответствует 1216-меру. Модификация ОВА янтарным ангидридом не приводила к
изменениям во вторичной структуре и агрегационном состоянии белка.

anti 
r.c.
Интенсивность, у.е.


anti 
Т-ОВА
ОВА
1700
1660
1620
1580
Длина волны, cm-1
Рис. 3.14. А: ИК спектры поглощения ОВА и Т-ОВА. Б: Амид-I область ИК спектров
поглощения ОВА и Т-ОВА. Пунктирными линиями обозначены частоты в ИК спектре,
соответствующие элементам вторичной структуры белка: α - α-спирали; β - β-слои; r.c. статистический клубок; anti - антипаралельные β-слои (из работы Kudryashova et al., 2005
[91]).
3.6. Влияние агрегации на кинетику адсорбции белка на поверхности вода-воздух
на примере ОВА
Влияние агрегации на кинетику адсорбции белка на поверхности вода-воздух
было исследовано методами IRRAS и тензиометрии (в формате автоматической
капельной тензиометрии, ADT). Примеры экспериментальных и теоретически
полученных IRRAS спектров ОВА и Т-ОВА приведены на рис. 3.15.
Концентрация белка в поверхностном слое и в суб-фазе (c1 и c2, соответственно),
а также толщина поверхностного слоя (d) были определены как функция от
101
времени из анализа IRRAS спектров методом спектральной симуляции (как
описано выше).
ИРРАС
ОВА
теор
эксп
Т-ОВА
теор
эксп
4100
3600
3100
2600
2100
1600
1100
Длина волны, cм-1
Рис. 3.15. Экспериментальные и теоретически полученные IRRAS спектры ОВА и Т-ОВА
адсорбированные на поверхности вода-воздух. Объемная концентрация белка 10 мг/мл в 10
мM фосфатном буфере, pH 7.0. Время адсорбции 60 мин (из работы Kudryashova et al., 2005
[91]).
Зависимости
поверхностной
концентрации
белка
c1 ;
толщины
поверхностного слоя d, а также соотношения концентрации белка c1/c2 в
поверхностном слое и субфазе от времени адсорбции для нативного овальбумина
(N-ОВА) и термо-денатурированного овальбумина (Т-ОВА) представлены на рис.
3.16. Из рисунка следует, что в случае агрегированного Т-ОВА скорость
адсорбции белка более медленная по сравнению с N-OВА, что выражается в
более медленном установлении равновесных значений параметров адсорбции
(рис. 3.16). Одной из причин наблюдаемого эффекта является более медленная
скорость диффузии агрегатов Т-ОВА к поверхности по сравнению с молекулами
мономера. Диффузионные свойства Т-ОВА в сравнении с ОВА будут
обсуждаться далее.
102
Рис. 3.16. Зависимости (A) толщины поверхностного слоя (d), (Б) концентрации белка в
поверхностном слое (c1) и (В) соотношение концентраций белка в поверхностном слое и в
суб-фазе (c2) в зависимости от времени адсорбции. Указанные параметры получены из
анализа IRRAS спектров N-ОВА (○) и T-OВА (●). Концентрация белка в объеме раствора 10
мг/мл 10 мМ фосфатном буфере, pH 7.0 (из работы Kudryashova et al., 2005 [91]).
Кривые развития поверхностного давления при адсорбции препаратов
ОВА (Рис. 3.17) были получены методом тензиометрии (ADT). На рис. 3.17
сопоставлены зависимости поверхностной концентрации белка от времени и
кривые развития поверхностного давления для ОВА и Т-ОВА при адсорбции на
поверхности вода-воздух при идентичных условиях адсорбции. Из рис. 3.17
следует, что, несмотря на то, что концентрация белка в поверхностном слое (c1)
для Т-ОВА на начальной стадии адсорбции ниже по сравнению с N-OВА,
скорость увеличения поверхностного давления выше в случае Т-ОВА (рис.
3.17Б).
103
Концентрация ОВА на поверхности, мг/мл
А
Поверхностное давление,мN/М
Б
ОВА
0,12
20
ОВА
0,08
Т-ОВА
10
0,04
T-ОВА
0
0
0
120020
2400
40
3600
60
4800
80
0
Время, сек
1000
2000
3000
4000
5000
Время, сек
Рис. 3.17. Зависимости поверхностной концентрации белка (А) и поверхностного давления
(Б) от времени для ОВА и Т-ОВА при адсорбции на поверхности вода-воздух. Объемная
концентрация белка 0.1 мг/мл.
Разница в скорости изменения поверхностного давления и концентрации
белка в поверхностном слое обусловлена тем, что поверхностная концентрация
белка отражает число молекул в поверхностном слое (в единице объема), в то
время как поверхностное давление в большой степени зависит от площади
занимаемой поверхности молекулами белка на границе раздела фаз. Полученные
результаты означают, что поверхностная активность Т-ОВА (c) выше по
сравнению с OВА. На поверхностную активность белка может влиять различие в
агрегационном состоянии, в конформации, а также в молекулярной подвижности
белка на поверхности вода-воздух. Данные свойства препаратов ОВА (Т-ОВА,
янт-ОВА в сравнении с OВА) были исследованы спектроскопическими методами,
IRRAS и TRFA и FCS.
3.7. Конформационные свойства N- и Т-овальбумина на поверхности вода-воздух.
На рисунке 3.18 приведены примеры экспериментальных и теоретически
полученных IRRAS спектров ОВА и Т-ОВА в амид 1 и амид 2 областях.
104
А
ОВА
Б
Т-ОВА
теор
ИРРАС
ИРРАС
теор
эксп
эксп
теор -10% анти-β
теор -10%β
1900
1900
1800
1700
1600
1500
1400
1800
1700
1300
1600
1500
1400
1300
cм-1
cм-1
Рис. 3.18. Экспериментальные (эксп) и теоретически (теор) полученные IRRAS спектры в
амид 1 и амид 2 областях ОВА (А) и Т-ОВА (Б) на поверхности вода-воздух. Концентрация
белка 10 мг/мл, в 10мМ фосфатном буфере, рН 7.0. Теоретические IRRAS спектры ОВА и ТОВА были получены на основе ИК спектров поглощения, соответственно, ОВА и Т-ОВА в
объеме раствора. Кривая «теор -10%β» на графике (А) соответствует теоретически
полученному IRRAS спектру ОВА в котором содержание β-структуры на 10% ниже по
сравнению с объемом раствора. Кривая «теор -10%анти-β» на графике (Б) соответствует
теоретически полученному IRRAS спектру Т-ОВА в котором содержание антипаралельных
β-структур на 10% ниже по сравнению со структурой Т-ОВА в объеме раствора (из работы
Kudryashova et al., 2005 [91]).
В случае нативного ОВА адсорбция (при объемных концентраций 0.1-10
мг/мл) приводит к уменьшению содержания β-структуры на 10%. Из анализа
IRRAS
спектров
Т-ОВА
следует,
что
по
сравнению
с
частично
денатурированной конформацией, найденной для Т-ОВА в объемной фазе (рис.
3.14), при адсорбции Т-ОВА дальнейшей денатурации белка не наблюдается
(рис. 3.18). Снижение содержания антипаралельных β-слоев, наблюдаемое при
адсорбции Т-ОВА, объясняется диссоциацией агрегатов белка. Действительно,
было установлено [37], что в случае ОВА степень агрегации белка четко
коррелирует с содержанием антипаралельных β-слоев, которые имеют в «амид
1» области ИК спектров поглощения характеристический пик на длине волны
1624 cм-1 [37]. В представленной работе было показано, что найденные
корреляции
действительны
также
при
проведении
экспериментов
на
поверхности вода-воздух: интенсивность пика на длине волны 1624 cм-1 в
спектрах отражения (IRRAS) также коррелирует со степенью агрегации
препарата овальбумина. Степень агрегации препаратов ОВА варьировали путем
105
инкубирования белка при температурах 70-80оС в течение различного времени.
Степень агрегации полученных препаратов определяли в независимых
экспериментах методом гель-фильтрации.
В соответствии с вышесказанным за диссоциацией агрегатов Т-ОВА на
поверхности
вода-воздух
следили
по
уменьшению
содержания
антипаралельных β-слоев с течением времени адсорбции (рис. 3.19). На рис.
3.19Б представлена результирующая кривая изменения степени агрегации ТОВА адсорбированного на поверхности от времени инкубирования системы.
Степень агрегации адсорбированного белка определяли из анализа IRRAS
спектров Т-ОВА. Для этого учитывали вклад анти-параллельных -слоев во
вторичную структуру как дополнительного компонента вторичной структуры
белка. Начальная степень агрегации Т-ОВА (95-98%) была определена методом
гель-фильтрации. Степень агрегации в ОВА принимали за 0% также на
основании данных гель-фильтрационного анализа.
А
Степень агрегации Т-ОВА, %
Б
антипараллельные b-слои
N-ОВА
ИРРАС
T-ОВА 4 ч
T-ОВА 1 ч
T-ОВА 2 мин
1680
1630
100
80
60
40
20
0
0
1580
2
4
Время инкубации, часы
cм-1
Рис. 3.19. Дез-агрегация Т-ОВА при адсорбции на поверхности вода-воздух. А: Амид I
область IRRAS спектра Т-ОВА в зависимости от времени инкубации на поверхности. Б:
Степень агрегации Т-ОВА определенная методом симуляционного анализа IRRAS спектров.
Согласно результатам количественного анализа IRRAS спектров, через 1
час после начала адсорбции степень агрегации в T-ОВА уменьшилась от 95 до
65% (рис. 3.19Б). После 4 часов адсорбции остаточная степень агрегации TОВА составляла 25%. По-видимому, гидрофобные свойства поверхности
106
способствуют ослаблению межбелковых взаимодействий в T-ОВА, что
является основной причиной дез-агрегации адсорбированного Т-ОВА.
Диссоциация агрегатов Т-ОВА при адсорбции на поверхности водавоздух подтверждается также методом FCS. Для Т-ОВА в объемной фазе была
обнаружена одна фракция с диффузионным временем вращения 2.5 мс, которое
соответствует диффузии агрегированных молекул Т-ОВА с коэффициентом
диффузии
D = 0.09*10-10
м2/сек (найденный
коэффициент диффузии
согласуется с молекулярным весом агрегатов (600 кДа), определенным методом
гель-фильтрации.
Т-ОВА, адсорбированный на поверхности вода-воздух, характеризуется
двумя временами диффузии, d, (9 и 25 мс) (рис. 3.20Б). Величина времени
диффузии первой фракции, d =9 мс, совпадает с таковой для нативного ОВА,
адсорбированного на поверхности, и соответствует скорости диффузии
мономерных молекул на поверхности. Время диффузии, относящееся ко
второй фракции, d = 25 мс, соответствует диффузии крупных белковых
агрегатов (кластеров), которые практически неподвижны на поверхности
раздела фаз: скорость диффузии агрегатов на поверхности на 2 порядка ниже
по сравнению со скоростью диффузии ОВА в объеме раствора.
Автокорреляционная ф-ция
A
3
2,6
2
2,2
1,8
1
1,4
1
0,001
0,1
10
1000
-3
Время, сек*10
Рис. 3.20. Автокорреляционные кривые (экспериментальные и симуляционные)
полученные методом FCS для ОВА (А) и Т-ОВА (Б) в объеме раствора (1) и на поверхности
вода-воздух (2, 3) (из работы Kudryashova et al., 2005 [91]).
107
Вклад «долгого» времени диффузии при адсорбции на поверхности
уменьшается во времени по сравнению с объемом раствора, что отражает дезагрегацию Т-ОВА.
На основе полученных данных можно заключить, что агрегационное
состояние существенно влияет на поверхностную активность и адсорбционные
свойства белка. Как будут изменяться структурно-динамические свойства белка
при усилении белок-белковых взаимодействий и в пределе, при образовании
агрегированного белкового слоя на поверхности вода-воздух? Этот аспект
является важным, поскольку, как обсуждалось выше, при адсорбции на
поверхности вода-воздух образуются высоко-концентрированные белковые слои
с локальной концентрацией вплоть до 400 мг/мл. В таких системах белокбелковые взаимодействия и агрегация является одним из ключевых факторов,
влияющих на структуру поверхностного слоя и его реологические свойства.
Применение разработанных нами подходов для исследования структурных
свойств белков адсорбированных на поверхности открывает новые возможности
для выяснения молекулярных деталей влияния агрегации на адсорбционные
свойства белков. Для этой цели были рассмотрены три препарата ОВА,
характеризующиеся различной способностью образовывать агрегаты: нативный
ОВА, термоденатурированный полностью агрегированный ОВА (Т-ОВА), и
ОВА, модифицированный янтарным ангидридом (янт-ОВА), который не имеет
склонности к агрегации из-за высокой плотности отрицательного заряда на
поверхности.
3.8. Молекулярные свойства нативного и модифицированных препаратов
овальбумина в условиях сжатия пленки.
Для исследования механизма влияния агрегации на адсорбцию белка и
реологические свойства поверхностного слоя за молекулярным состоянием
ОВА, Т-ОВА и янт-ОВА следили в условиях механического сжатия пленки. На
рис. 3.21 представлен профиль изотермы сжатия (зависимость поверхностного
давления (П) как функция от площади доступной поверхности раздела фаз (А)),
108
полученной при сжатии поверхностного слоя овальбумина тефлоновыми
барьерами в Ленгмюровской ванне. Из рисунка видно, что изотерма сжатия ОВА
содержит два основных участка, с различным наклоном на изотерме сжатия, что
соответствует различной сжимаемости, т.е. различным агрегатным состояниям
белка в поверхностном слое. В интервале уменьшения площади поверхности от
230 до 130 см2 (участок I) поверхностное давление увеличивается слабо, от 15 до
20 мN/м; при дальнейшем уменьшении площади поверхности, от 130 до 100 cм2
(участок
II)
наблюдается
резкое
увеличение
поверхностного
давления.
Особенности молекулярных состояний ОВА (поверхностная концентрация,
конформация,
агрегационное
состояние,
молекулярная
подвижность)
на
участках I и II изучали методами TRFA и IRRAS в режиме реального времени (в
процессе измерения изотерм сжатия).
16 ns
II
30
I
7 ns
10 ns
8 ns
20
19 ns
, mN/m
11 ns
10
0,6
230
190
0,5
150
0,4
120
0,3
0,2
80
Площадь поверхности, cм2
Рис. 3.21. Изотерма сжатия, полученная для нативного ОВА при концентрации белка 0.1
мг/мл. Указаны корреляционные времена вращения в зависимости от площади доступной
поверхности определенные методом TRFA в режиме реального времени при сжатии
белковой пленки (из работы Kudryashova et al., 2005 [76]).
109
Б
А
40
400
300
d, нм
C1, мг/мл
30
200
20
10
220
220
210
200
190
180
170
160
210
200
190
180
170
160
100
150
150
Площадь поверхности, см2
Площадь поверхности, cм2
Рис. 3.22. Концентрация ОВА в поверхностном слое (А) и толщина поверхностного слоя
определенные из анализа IRRAS спектров ОВА в зависимости от площади доступной
поверхности на начальном участке изотермы сжатия (рис. 4.21) от 230 до 130 см -1. Объемная
концентрация белка 0.1 мг/мл.
парал -структ
антипар -структ
ИРРАС
теор
эксп
теор -12% β +25 антиβ
1700
1660
1620
1580
cм-1
Рис. 3.23. Вторичная структура ОВА на начальном участке изотермы сжатия (рис. 3.21) от
230 до 130 см-1. Объемная концентрация белка 0.1 мг/мл.
Было обнаружено, что на начальном этапе сжатия пленки (I) поверхностная
концентрация ОВА (рис. 3.22А) и толщина поверхностного слоя белка
практически не изменяются (рис. 3.22Б), что предполагает десорбцию белка с
поверхности. Наблюдаемый при этом рост поверхностного давления (рис. 3.21),
объясняется процессом агрегации белка. Агрегация белка была показана по
появлению характеристических пиков в амид I области IRRAS спектров (на
110
длинах волн 1694 и 1624 см-1), которые соответствуют анти-параллельным βслоям, и являются индикаторами агрегации овальбумина (рис. 3.22). Вклад антипараллельных β-слоев в общее содержание вторичной структуры белка при
сжатии пленки на начальном этапе увеличилась от 0 до 20-25% (рис. 3.23), что
соответствует увеличению содержания агрегированного белка от 0 до 80%.
Агрегация ОВА также проявляется в уменьшении корреляционного времени
вращения белка белка от 22-25 до 7-10 нс в TRFA экспериментах (см. подписи на
рис. 3.21). Найденная величина белка предполагает, что в условиях сжатии
пленки белок вращается не как целая молекула, а только как сегмент. Этот
эффект
является
следствием
образования
белковых
агрегатов,
которые
практически неподвижны и не вносят вклад во вращательное движение белка на
поверхности в наносекундной временной шкале. При этом сегменты белка
сохраняют свою подвижность. Размер таких сегментов уменьшается, что
указывает на прогрессирующую агрегацию в процессе сжатии пленки.
Только после того как основная масса белка перешла в агрегированное
состояние наблюдается увеличение концентрации белка в поверхностном слое
(участок II). Этот интервал сжатия пленки соответствует резкому скачку
поверхностного натяжения (рис. 3.21). Наблюдаемый скачок поверхностного
натяжения, а также величина наклона изотермы сжатия на данном участке
(∆π/∆А) указывает на переход белковой пленки в более конденсированное, гелеподобное агрегатное состояние. В условиях сжатия поверхностного слоя
молекулы белка, по-видимому, образуют прочную сеть межмолекулярных
взаимодействий, что препятствует десорбции белка с поверхности. В результате
при дальнейшем сжатии происходит интенсивное увеличение поверхностной
концентрации белка.
Интересно, что при подавлении агрегации белка путем введения на
поверхность большого числа отрицательно заряженных групп, увеличения
поверхностного давления не наблюдается, а происходит десорбция белка. Так, в
случае овальбумина модифицированного янтарным ангидридом, янт-ОВА,
который, как показано методами TRFA и IRRAS, не агрегирует на поверхности
111
вода-воздух, увеличения поверхностного давления не происходит даже при 3-х
кратном сжатии пленки (рис. 3.24Б). Сжатие пленки приводит к десорбции белка
с поверхности.
А
30
25
20
15
10
200
160
120
Поверхностное давление, mN/m
35
80
Площадь поверхности, cm 2
30
25
20
15
10
200
160
120
Площадь поверхности, cm
80
2
В
30
25
20
15
10
160
120
80
Поверхностное давление, m N/m
35
200
Поверхностное давление, mN/m
35
Б
Площа дь пове рх ности, cm 2
Рис. 3.24. Изотермы сжатия препаратов ОВА: ОВА (А), янт-ОВА (Б), Т-ОВА (В), полученные
после инкубации системы в течении 60 мин. Концентрация белка 0.1 мг/мл, 10мМ фосфатный
буфер, рН 7.0 (из работы Kudryashova et al., 2005 [91]).
112
В случае, когда белок исходно находится в агрегированном состоянии в
объеме раствора (Т-ОВА), его десорбция затруднена и поверхностное давление,
также как и поверхностная концентрация, увеличиваются уже на начальном
участке изотермы сжатия (при неизменной толщине поверхностного слоя, d)
(рис.
3.25).
При
этом
скачка
на
кривых
поверхностного
давления,
соответствующего переходу в новое агрегатное состояние, не наблюдается (рис.
3.24В).
Рис. 3.25. Концентрация Т-ОВА в поверхностном слое, С1, (А) и толщина поверхностного
слоя, d, определенные из анализа IRRAS спектров Т-ОВА, в зависимости от площади
доступной поверхности при измерении изотермы сжатия (рис. 3.24В). Объемная
концентрация белка 0.1 мг/мл (из работы Kudryashova et al., 2005 [91]) .
113
3.9. Взаимосвязь поверхностной активности белков с их пенообразующей
способностью.
С точки зрения практического приложения найденных закономерностей
адсорбции белков важно, сохраняются ли найденные закономерности при
переходе от модельной системы, поверхность вода-воздух, к соответствующим
коллоидным системам, пенам. Какова взаимосвязь между агрегационными
свойства белка и его пенообразующей способности?
В качестве количественного критерия пенообразующей способности
используется минимальная концентрация белка необходимая для образования
стабильной пены при стандартных условиях. На примере препаратов ОВА
показано, что пенообразующая способность коррелирует с поверхностной
активностью
белка.
Так,
пенообразующая
способность
Т-ОВА,
характеризующегося более высокой поверхностной активностью существенно
выше по сравнению с нативным ОВА (рис. 3.26). В случае ОВА для образования
стабильной пены необходимо использовать концентрацию белка 10 мг/мл, в то
время как в случае Т-ОВА минимальная концентрация составляет 1 мг/мл при
тех же условиях пенообразования.
Рис. 3.26. Пена, образованная в результате взбивания (30 сек) растворов
содержащих 1 мг/мл ОВА (А) или Т-ОВА (Б).
114
Полученные результаты демонстрируют, что адсорбционные свойства
белков (в частности поверхностная активность) могут быть использованы для
качественной оценки и предсказания пенообразующей способности белков при
разработке пищевых коллоидных систем.
Таким
образом,
полученные
данные
позволяют
сделать
вывод
о
молекулярном механизм влияния агрегации на адсорбцию белка и реологические
свойства пленки. На примере одного из модельных белков, овальбумина,
показано, что молекулярный механизм напрямую связан с влиянием агрегации
на обратимость адсорбции через образование геле-подобного поверхностного
слоя белка. Найденные закономерности открывают возможные пути для
целенаправленной регуляции адсорбционных свойств белков и стабильность
коллоидной системы в целом, что может быть в перспективе использовано при
разработке пищевых коллоидных систем.
Другим методом регуляции адсорбционных свойств белков является
переход от моно- к мульти-компонентным системам. Так эффективным подходом
для контроля адсорбции белков представляется метод комплексообразования с
ПЭ. При комплексообразовании с ПЭ существенно изменяются поверхностный
заряд, что непосредственно влияет на агрегационные свойства; кроме того,
увеличивается гидродинамический объем, происходит стабилизация структуры
белка. Таким образом, следует ожидать, что комплексообразования с ПЭ будет
существенным образом влиять на адсорбционные свойства белков и стабильность
коллоидной системы в целом.
3.10. Влияние комплексообразования с пектином на адсорбционные свойства
белков.
Для регуляции адсорбционных свойств белков на поверхности вода-воздух в
работе предложен метод, основанный на образовании комплексов белков с
полиэлектролитами полисахаридной природы. Следует сказать, что белок115
полисахаридные
поликатионные
комплексы
(содержащие
полисахариды)
широко
как
полианионные,
используются
при
так
и
создании
функциональных систем для применения в пищевой промышленности,
биологии и медицине. В первую очередь, это разработка систем адресной
доставки лекарств в клетки, разработка новых пищевых коллоидных систем,
совершенствование текстурных и вкусовых свойств, а также качества
продуктов питания и пищевых добавок. Образование белок-полисахаридных
комплексов (как частный случай белок-полиэлектролитных комплексов)
существенно изменяет физико-химические свойства белков, а также, является
эффективным методом регуляции межмолекулярных взаимодействий в белках.
На этом основан предложенный в работе подход для контроля
адсорбционных свойств белков и реологических свойств белковых пленок образование комплексов пищевых белков, ОВА и β-лактоглобулина с
пектином. Пектин широко применяется в пищевой промышленности в качестве
загустителя,
гелеобразующего
и
влагоудерживающего
агента.
Пектин
представляет собой линейный полимер α-галактуроновой кислоты, в котором
часть карбоксильных групп находится в метилированном состоянии. В данной
работе использовали пектин из лимонной кожуры, степень метилирования 30%,
молекулярный вес пектинов 120 ±10 кДа.
Рис. 3.27. Структурная формула низкометилированного пектина из лимонной кожуры.
Влияние ПЭ на кинетику адсорбции белков на поверхности вода-воздух
было изучено методом тензиометрии (ADT). Для иллюстрации влияния пектина
на скорость адсорбции белка на рис. 3.28. приведены тензиометрические116
кривые, полученные для свободного ОВА и ОВА в комплексе с пектином (при
концентрации белка 0.05 мг/мл). Обнаружено, что образование комплекса с
пектином значительно снижает скорость адсорбции: лаг-фаза на кривой  - t
увеличивается примерно в 2.5 раза. Равновесное значение поверхностного
натяжения снижается на 2-3 мN/М.
A
22
П, mN/М
18
14
1
2
10
6
2
-2 0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Время, сек
Б
6
1
2
П, mN/М
4
2
0
0
5000
10000
15000
20000
-2
Ве рмя, се к
Рис. 3.28. Кривые развития поверхностного давления, П, измененные методом тензиометрии
для ОВА (кривые 1) и ОВА в комплексе с пектином (кривые 2) в водном растворе (А) и в
системе содержащей 10% этанола (Б) (из работы Kudryashova et al., 2007 [92]) .
В случае β-lg, в отсутствии пектина на кривой развития поверхностного
давления лаг-фазы не наблюдается (при концентрации белка 0.05 мг/мл).
Комплексообразование с пектином приводит к появлению лаг-фазы при
адсорбции β-lg (~300 сек), а также, снижения равновесного значения  от 23 до
20 мN/м. Снижение скорости адсорбции белков и равновесного значения
поверхностного давления при образовании комплекса с пектином может быть
117
связано с целым рядом факторов, в первую очередь, подавление белок-белковых
мультимолекулярных взаимодействий; стабилизация конформации белка; более
медленная скорость диффузии к поверхности, более объемных частиц комплекса
по сравнению со свободным белком; изменение свойств поверхности белка.
Эффективность
влияния
комплексообразования
на
адсорбционные
свойства белков определяется соотношением белок/ПЭ. Так, максимальный
эффект комплексообразования с пектином на скорость адсорбции ОВА пектина
был обнаружен в условиях избытка белка (при соотношении ОВА/пектин 5/1 и
10/1 г/г), что, по-видимому, связано с образованием комплекса наиболее
жесткой структуры (конденсированного комплекса) при этих условиях. В то же
время, при приблизительно равных весовых соотношениях ОВА/пектин (1/11/2), а также при избытке пектина (ОВА/пектин - 10/1 г/г), скорость адсорбции
time (s) сек
Lag
Лаг-фаза
адсорбции,
ОВА практически не отличалась от таковой для свободного белка (рис. 3.29).
5000
102 ns
4000
28 ns
28 ns
3000
20 ns 21 ns 21 ns
2000
1000
0
1
1/10
пектин
ОВА
No
pectin
2
3
2/1
4
5/1
10/1
5
ОВА
OVA/Pectin weight ratio
ОВА/пектин, г/г
Figure 4
Рис. 3.29. Лаг-фазы при адсорбции ОВА в комплексе с пектином измеренные методом
тензиометрии в зависимости от соотношения ОВА/пектин в системе. Вверху указаны
соответствующие корреляционные времена вращения (φ, нс) полученные методом TRFA.
Объемная концентрация белка 0.05 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7.0 (из работы
Kudryashova et al., 2007 [93]).
Учитывая
электростатический
характер
взаимодействия
белков
с
полиэлектролитами, прочность комплексов можно эффективно регулировать
путем изменения физических параметров системы, полярности среды, ионной
силы, рН. Так, влияние пектина на адсорбцию белков полностью подавляется в
118
присутствии 0.2 М NaСl. И наоборот, при добавлении в систему небольших
количеств этанола (до 15 об. %) наблюдается значительное усиление влияния
ПЭ на адсорбцию белков (рис. 3.30). Если при комплексообразовании с
пектином в водном растворе лаг-фаза адсорбции ОВА увеличивается в ~2.5
раза, в 10% растворе этанола лаг-фаза адсорбции увеличивается ~ в 5 раз в
присутствии пектина. Зависимость лаг-фазы адсорбции ОВА в комплексе с
пектином от концентрации этанола в системе представлена на рис. 3.30. Из
рисунка видно, что увеличение концентрации этанола до 7 об. % приводит к
постепенному возрастанию лаг-фазы адсорбции. При дальнейшем увеличении
концентрации этанола до 10-15 об. % величина лаг-фазы практически не
возрастает.
Рис. 3.30. Соотношение лаг-фазы при развитии поверхностного давления для ОВА в
отсутствии пектина относительно ОВА в комплексе с пектином (при ОВА/пектин =10/1) как
функция от концентрации этанола в системе (из работы Kudryashova et al., 2007 [92]).
В соответствии с этим, система, содержащая 10 об. % этанола была
выбрана для дальнейшего более детального изучения влияния полярности
среды на адсорбционные свойства ОВА в комплексе с пектином.
Наблюдаемые различия в адсорбционных свойствах комплексов при
варьировании
условий
комплексообразования
(соотношения
белок/ПЭ
и
полярности среды), по-видимому, обусловлены тем, что пространственная
119
структура и стехиометрия комплексов существенно различается. Наиболее
вероятно,
что
при
увеличении
соотношения
белок/пектин
происходит
образование более жесткой и конденсированной структуры комплекса, что в
наибольшей степени влияет на свойства белка (в том числе и адсорбционные).
Добавление в систему этанола дополнительно усиливает эффективность
взаимодействия белка с пектином (за счет усиления электростатических
взаимодействий в среде с более низкой диэлектрической константой), что
проявляется
в
дополнительном
усилении
эффекта
полиэлектролита
на
адсорбцию белка. Альтернативным механизмом влияния комплексообразования
на адсорбционные свойства белков могут являться конформационные изменения
в белке, вызванные взаимодействием с пектином. Для выяснения молекулярных
деталей влияния комплексообразования с пектином на адсорбцию овальбумина
конформация белка, а также пространственная структура всего комплекса была
изучена в воде и в системе вода-этанол в зависимости от соотношения
ОВА/пектин.
3.11. Структура и стабильность ОВА в комплексе с пектином в водном
растворе и в системе вода-этанол
Возможные изменения в структуре белка при комплексообразовании с пектином
и в системе вода-этанол были изучены методом КД спектроскопии. Анализ
спектров КД (рис. 3.31A) в присутствии и отсутствии пектина позволяет сделать
вывод о том, что вторичная структура ОВА не изменилась при взаимодействии
белка с пектином. В обоих случаях содержание -спиралей составляет 32±3%, а
-структуры - 50±3%. Добавление в систему 10 об. % этанола вызывает лишь
небольшое увеличение содержание -спиралей (на 5 %) за счет уменьшения
вклада -структуры как в присутствии пектина, так и в случае свободного ОВА.
Изучение стабильности ОВА в экспериментах по титрованию мочевиной
при данных условиях показало, что как в присутствии пектина, так и в
присутствии 10 об. % этанола свободная энергия, G, ОВА увеличивается от
120
27.3 до 28.2 кДж/моль и от 27.3 дo 28.9 кДж/моль, соответственно. Свободная
энергия
комплекса
ОВА-пектин
в
присутствии
этанола
дополнительно
увеличивается до 29.0 кДж/моль.
Рис. 3.31. (А) Спектры кругового дихроизма в дальней УФ области ОВА в присутствии и
отсутствии этанола. Условия эксперимента 10мМ фосфатный буфер, рН 7.0. (Б) Титрование
мочевиной 0.1 мг/мл раствора ОВА (◊); ОВА в присутствии 10% этанола (▲); ОВА в
присутствии пектина при соотношении ОВА/пектин = 10/1; (□) и ОВА в присутствии
пектина при соотношении ОВА/пектин = 10/1 и 10% этанола (○) по изменению
интенсивности отрицательного пика КД спектра на длине волны 222 нм (из работы
Kudryashova et al., 2007 [92]).
Как видно, изменения в структуре и стабильности ОВА в присутствии
пектина и этанола являются несущественными и, очевидно, не могут являться
121
основной причиной наблюдаемых драматических эффектов замедления скорости
адсорбции ОВА на поверхности вода-воздух. Таким образом, наиболее вероятно,
что за адсорбционные свойства отвечает пространственная структура белок-ПЭ
комплексов.
Tаблица 3.2. Параметры G (кДж/моль), полученные в экспериментах по
титрованию мочевиной для OВА и OВА-пектин (при весовом соотношении
10/1) в присутствии или отсутствии 10 об. % этанола.

Препараты ОВА
G
(кДж/моль)
ОВА
27.3 ±0.5
ОВА-пектин
28.2 ±0.6
ОВА/EtOH
28.9 ±0.6
ОВАпектин/EtOH
3.12.
Пространственная
29.0 ±0.6
структура
комплексов
овальбумин-пектин
лактоглобулин-пектин в водном растворе и в системе вода-этанол
Пространственную структуру комплексов овальбумина и лактоглобулина с
пектином исследовали методом TRFA. Данный метод является исключительно
информативным для исследования структурной организации надмолекулярных
ансамблей. Он позволяет следить за вращательной динамикой, как всего
комплекса, так и каждого из фрагментов, обладающих независимым
вращением, и в итоге, получать детальную информацию о пространственной
структуре комплексов.
За динамикой белков в комплексе с пектином следили по флуоресцентной
метке (акридон 14), ковалентно введенной на поверхность белка со степенью
122
и
модификации 1 (±0.2). Акридон 14 характеризуется относительно долгим
флуоресцентным временем жизни (14.2 нс), что позволяет следить не только за
динамикой белка, но также, за относительно низкой общей подвижностью
белок-ПЭ комплексов (предполагаемое корреляционное время вращения
комплексов составляет порядка 100 нс). Анализ деполяризационных кривых
полученных
методом
вращательного
TRFA
движения
в
показал,
что
растворе:
ОВА
внутренняя
проявляет
два
подвижность
вида
белка
характеризуется быстрым корреляционным временем вращения, внут, и общее
вращение молекулы белка, которому соответствует долгое время вращения,
long 21.1 нс (Табл. 3.2). Долгое корреляционное время вращения хорошо
согласуется с теоретически рассчитанной величиной для белка с ММ 45 кДа
согласно эмпирическому уравнению: prot = 36 * 10-5 * M (нс).
Оказалось, что образование комплекса с пектином приводит к ограничению
как общей, так и внутренней подвижности овальбумина в зависимости от
соотношения
белок/ПЭ. В
условиях
избытка ОВА (при
соотношениях
ОВА/пектин 2/1 - 10/1 г/г) корреляционное время вращения long увеличивается от
21.1 до 28.1 нс (Табл. 3.3). Полученное значение long, по-видимому,
соответствует подвижности молекулы ОВА, связанной с участком цепи пектина с
ММ порядка 10 кДа. Это предполагает, что в условиях избытка ОВА структура
комплекса
представляет
собой
цепочку
идентичных
сегментов,
характеризующихся независимым вращением, в каждом из которых белок
окружен участком ПЭ. Предполагаемая структура комплекса ОВА-пектин при
соотношениях ОВА/пектин 2/1, 5/1 и 10/1 г/г схематически представлена на рис.
3.32А.
123
Taблица 3.3. Параметры общей флуоресценции (i, i) и флуоресцентной
анизотропии (i, i, Vh и D) полученные из анализа данных TRFA для ОВА и
комплекса ОВА-пектин в объеме раствора и на поверхности вода-воздух (Int), pH
7,0 (А) и pH 4,5 (Б). Длина волны возбуждения флуоресценции 390 нм.
Taблица 3.3.А.
ОВА/пектин 1
ОВА
ОВА/пектин
10/1
ОВА/пектин
2/1
ОВА/пектин
**int
(нс)
2
**2
Vh
long
(нм3) (нс -1) 1
(нс)
0.10 1.5
0.15 21.1
0.10 3.8
0.10 28.1
0.10 4.0
0.10 28.0
0.10 1.3
0.15 20.4
0.10 1.6
0.15 21.6
0.10 4.2
0.12 101.7
-
-
0.10 5.1
ОВА/пектин -
-
-
1/1
ОВА/пектин
1/2
ОВА/пектин
1/10
Int ОВА
D
*
1
(нс)
2
*2
(нс)
3
*3
(нс)
92.0 0.044 0.03 1.4 0.07 7.7 0.15 14.1
122.2 0.022
121.7 0.021
88.7 0.051
93.9 0.042
422.2 0.018
0.03 1.7 0.07 8.0
0.03 1.5 0.07 7.9
0.03 1.6 0.07 8.2
0.03 1.5 0.07 7.8
6.2
0.15
0.15
0.15
0.15
0.15
14.1
14.1
14.2
14.1
0,1
1.2 0,1
13.5
22.2 0
-
-
0.10 10.8
47.0 0
0.03 2.5 0.05 7.1 0.15 13.5
0.10 9.6
41.7 0
0.03 2.1 0.05 7.1 0.15 13.5
0.04 4.0 0.10 13.0
Int
10/1
Int
ОВА/пектин 1/10
124
Tаблица 3.3. Б.
ОВА/пектин 1
ОВА
**int
(нс)
**2 Vh
2
long
D
(нм3) (нс -1) 1
(нс)
1
(нс)
2
*2
(нс)
3
*3
(нс)
0.10 1.1
0.15 20.0
0.10 4.0
0.10 27.2
0.10 1.3
0.15 19.7
0.10 4.2
0.10 84.0
-
-
0.10 12.8
55.6 0
-
ОВА/пектин -
-
0.10 14.2
61.7 0
0.06 2.2 0.06 6.8 0.15 13.5
ОВА/пектин
2/1
ОВА/пектин
1/2
ОВА/пектин
1/10
Int ОВА
87.0 0.061
*
118.3 0.021
85.6 0.051
365.2 0.020
0.03 1.3 0.05 6.8 0.16 13.7
0.03 1.2 0.05 6.6 0.15 13.7
0.03 1.5 0.05 6.8 0.15 13.7
0.07 1.1 0.1
-
6.1 0.15 13.7
0.05 4.3 0.10 13.0
Int
10/1
*флуоресцентные времена жизни (i) и их коэффициенты (i) опрелеляли согласно ур. (2);
**корреляционные времена вращения (i), и их коэффициенты (i) опрелеляли согласно ур.
(4), гидродинамический объем (Vh) опрелеляли согласно ур. (7) и (8) и внутренний
коэффициент диффузии D опрелеляли согласно ур. 6. Разброс в определении
флуоресцентных времен жизни (i) корреляционных времен вращения (i) полученный в
результате статистического анализа данных (для 67% доверительного интервала) был в
пределах 10%.
125
Taблица 3.4. Параметры общей флуоресценции (i, i) и флуоресцентной
анизотропии (i, i) полученные из анализа данных TRFA для ОВА и комплекса
ОВА-пектин в объеме раствора и на поверхности вода-воздух (Int) (на
начальном участке адсорбции) в 10% растворе этанола по сравнению с водным
раствором.
1
Образец
0.0
ОВА в воде
3
ОВА/пектин в воде
0.0
3
 1*
(нс)
1.4
1.7
ОВА/EtOH
-
-
ОВА/пектин /EtOH
-
-
Int. ОВА в воде
-
-
Int. ОВА/пектин в воде
Int.
ОВА/EtOH
(нач.
0.0
3
2.5
-
-
Int. ОВА/пектин/EtOH -
-
стад.)
2
0.0
7
0.0
7
0.0
4
0.0
4
0.0
4
0.0
5
0.0
4
0.0
3
 2*
(нс)
7.7
8.0
3.0
3.9
4.0
7.1
3
(нс)
0.1 14.
5
1
0.1 14.
5
1
0.1 13.
4
0
0.1 13.
4
5
0.1 13.
0
0
0.1 13.
5
4.4 0.1
4.6
 3* 
5
13.
1
0.1 13.
0
1
1
1*
(нс)
0.10 1.5
0.10 3.8
0.10 0.7
0.10 1.3
-
-
-
-
-
-
-
-
2
0.1
5
0.1
0
0.1
4
0.1
5
0.1
0
0.1
0
0.0
5
2
long*
(нс)
21.1
28.1
12.6
13.6
5.1
10.8
4.5
0.1 6.2
*Разброс в определении флуоресцентных времен жизни (i) корреляционных времен
вращения (i) полученный в результате статистического анализа данных (для 67%
доверительного интервала) был в пределах 10%.
126
Иная ситуация наблюдается при избытке пектина. При соотношении
ОВА/пектин 1/10 г/г, величина long возрастает от 21.1 (в отсутствие пектина) до
~102 нс. Данное значение корреляционного времени вращения отражает
подвижность всего комплекса ОВА-пектин стехиометрического состава 1:1 М/М
и общей ММ 165 кДа, в котором молекула белка конденсирует вокруг себя
полиэлектролит. Предполагаемая структура комплекса в условиях избытка
пектина схематически изображена на (рис. 3.32Б). Отметим, что согласно
эмпирическому уравнению (2), для частиц с данной ММ величина long составляет
порядка 90 нс. Более высокое значение экспериментально найденного времени
вращения (102 нс) объясняется повышенной степенью гидратации, ожидаемой
для белок-полисахаридного комплекса с высоким содержанием полисахарида,
что может увеличивать гидродинамический объем частиц.
Б
A
вращение сегмента
ОВА-пектин, long=28нс
нм
ОВА-пектин, long=102 нс
Рис. 3.32. Предполагаемая пространственная структура комплексов ОВА-пектин: (А) в
условиях избытка ОВА; (Б) при избытке пектина (из работы Kudryashova et al., 2007 [93]).
Помимо существенного замедления общего вращения белка, (возрастания
долгого корреляционного времени вращения, long), образование комплекса ОВА
с пектином приводит к увеличению «короткого» внутреннего корреляционного
времени вращения, int от 1.5 до 4.2 нс (Табл. 3.3). Это соответствует уменьшению
коэффициента внутренней диффузии, D (ур. 3.9.) от 0.044 до 0.018 нс-1 (Таблица
3.3) и отражает ограничение внутренней подвижности флуоресцентной метки в
белке.
127
1S
D
int
(3.20),
где S2 – параметр порядка.
Данный эффект наблюдается для комплексов ОВА/пектин как при избытке ОВА,
так и при избытке пектина. Однако, при приблизительно равных весовых
соотношениях ОВА/пектин 1/1 и 1/2 взаимодействие с пектином практически не
изменяет динамику белка. Это означает, что при данной системе белок сохраняет
независимое вращение, внутренняя подвижность белка также не изменяется. Повидимому, при данных соотношениях ОВА/пектин жесткой структуры комплекса
не образуется, что проявляется также в отсутствии влияния пектина на кинетику
адсорбции ОВА. При рН 3.5, в условиях ниже изоэлектрической точки белка, где
электростатическое взаимодействие ОВА с пектином более эффективное,
гидродинамический объем комплексов ОВА-пектин меньше при всех изученных
соотношениях ОВА-пектин (Табл. 3.3), т.е. образующаяся структура комплексов
более компактная. Данный эффект наиболее ярко проявляется в случае комплекса
образованного в недостатке ОВА, при соотношении ОВА-Пектин 1/10. При этом
для ОВА реализуется возможность конденсировать вокруг себя полиэлектролит
более эффективно.
Влияние полярности среды на пространственную структуру комплекса ОВАпектин было изучено для комплекса с весовым соотношением ОВА/пектин 10/1,
что соответствует стехиометрическому соотношению ОВА/пектин 1/1 по
зарядам. При данном соотношении реализуется наибольший эффект пектина на
адсорбционные свойства ОВА. Оказалось, что добавление в систему 10% этанола
приводит к существенному уменьшению объема вращающегося фрагмента
комплекса
(Таблица
3.3).
Этот
эффект
отражает
образование
более
конденсированной структуры комплекса в среде с более низкой диэлектрической
константой. Более эффективная компенсация зарядов на полиэлектролите,
реализующаяся за счет усиления электростатических взаимодействий в среде
128
вода-этанол, по-видимому, также приводит к уменьшению объема гидратной
оболочки комплекса. Влияние этанола на динамику свободного белка выражено в
меньшей степени (Таблица 3.3). Это связано с существенно более высокой
жесткостью и компактностью молекулы белка по сравнению с менее плотной
структурой белок-полисахаридного комплекса.
3.13. Вращательная динамика комплексов ОВА-пектин и β-lg-пектин на
поверхности вода-воздух. Адсорбция на поверхности вода-воздух приводит к
заметным изменениям во вращательной динамике ОВА, как свободного, так и в
комплексе
с
пектином.
Примеры
экспериментальных
и
теоретических
деполяризационных кривых полученных для ОВА и ОВА в комплексе с пектином
представлены на рис. 3.33. Параметры, полученные в результате анализа
деполяризационных кривых суммированы в Таблице 3.4. Обнаружено, что, как и
в случае свободного ОВА, адсорбция ОВА в комплексе с пектином приводит к
ограничению
подвижности
белка
по
сравнению
с
объемом
раствора:
корреляционное время вращения, long, уменьшилось от 28.1 до 10.8 нс. Данное
значение long соответствует вращательному движению сегмента белка связанного
с участком цепи ПЭ. Если сравнить гидродинамический объем участков цепи
пектина связанного с белком в объеме раствора и на поверхности вода-воздух
(уравнения (3.21) и (3.22)) можно видеть, что соотношение Vпектин/Vкомплекс на
поверхности вода-воздух (53%) существенно превышает таковое найденное для
объема раствора (25%).
prot=(Rh)v/3kT=Vtot/kT
(3.21),
Vкомплекс=Vбелок+Vпектин
(3.22),
где kB константа Больцмана, T абсолютная температура,  v вязкость среды, Vбелок
– гидродинамический объем молекулы ОВА, полученный из уравнения (3.21) для
свободного ОВА.
129
A
Anisotropy
0,5
0,3
0,1
-0,1
0
20
40
60
80
-0,3
-0,5
Время, нс
Time, ns
Б B
Anisotropy
0,5
0,3
0,1
-0,1
0
20
40
60
80
-0,3
-0,5
Время, нс
Time,ns
В C
Anisotropy
0,5
0,3
0,1
-0,1
0
20
40
60
80
-0,3
-0,5
Время, нс
Time, nm
Г D
Anisotropy
0,5
0,3
0,1
-0,1
0
20
40
60
80
-0,3
-0,5
Время, нс
Time, ns
Figure 5
Рис. 3.33. Экспериментальные кривые деполяризации (в сером) и соответствующие
теоретически полученные кривые (в черном) для ОВА (A и Б) и ОВА в комплексе с пектином
(В и Г), адсорбированных на поверхности вода-воздух. A: OВА адсорбированный на
поверхности вода-воздух из водного раствора B: OВА адсорбированный из 10% раствора
этанола в воде, время адсорбции 25 мин; C: ОВА-пектин адсорбированный из водного
раствора; D: ОВА-пектин из 10% раствора этанола в воде, время адсорбции 55 мин. Условия
эксперимента: объемная концентрация белка 0.05 мг/мл; 10 мM натрий-фосфатный буфер, рН
7.0., температура 22оС; соотношение ОВА/пектин г/г было 10/1(из работы Kudryashova et al.,
2007 [93]) .
130
Объем раствора:
Корреляционное время, нс
Поверхность
вода/воздух:
Время адсорбции, мин
Рис. 3.34. Ограничение молекулярной подвижности ОВА в комплексе с пектином при
адсорбции на поверхности вода-воздух. Схематически показаны структуры комплексов в
объеме раствора и на поверхности вода-воздух. Корреляционные времена вращения как
функцию от времени адсорбции измеряли методом TRFA. Адсорбцию комплексов ОВАпектин проводили при различных соотношениях ОВА/пектин в объеме раствора,
ОВА/пектин - 10/1 и 1/10.
Ограничение подвижности вплоть до полной иммобилизации белка на
поверхности вода-воздух с течением времени адсорбции (после 40 минут)
наблюдается
также
в
случае
β-lg.
На
начальных
стадиях
адсорбции
корреляционное время вращения белка составляет 10 нс, что соответствует
вращению мономерной формы β-lg. По мере заполнения поверхностного слоя
белком наблюдается уменьшение вклада независимого вращательного движения
белка
в
деполяризацию
системы
и
появлении
неопределенно
долгого
корреляционного времени вращения (>1000 нс). Данное корреляционное время
отражает ограничение подвижности белка в плотном слое на поверхности водавоздух. В присутствие пектина данный эффект проявляется наиболее ярко. Вклад
независимого вращательного движения белка в деполяризацию системы в случае
комплекса β-lg –пектин существенно (в 4 раза) более низкий по сравнению со
свободным белком уже на начальной стадии адсорбции.
131
3.14. Влияние полярности среды на адсорбцию проявляется как в случае
свободного белка, так и в присутствии пектина. Однако, характер этого влияния
различный в силу различий в конформационной стабильности, а также,
способности реализации белок-белковых межмолекулярных взаимодействий. Так,
в случае ОВА включение в систему 10 об. % этанола вызывает ограничение
вращательного движения белка в одном из направлений (в направлении
перпендикулярном плоскости поверхности), что следует из появления отличной
от нуля остаточной анизотропии, r∞ (рис. 3.33В) [55]. Анализ значений
остаточной анизотропии позволяет рассчитать максимально возможный угол реориентации
вращающегося
сегмента
белка,
,
относительно
плоскости
поверхности:
r∞/r0 = {(3cos2-1)/2}2
(3.23).
Найдено, что во временном интервале адсорбции от 20 до 80 минут максимально
возможный угол вращения подвижного сегмента белка относительно плоскости
поверхности уменьшается от 18о до 11о, что отражает формирование
упорядоченной пространственной ориентации белка в поверхностном слое.
Поскольку молекула ОВА имеет эллипсоидальную форму, площадь поверхности
(в пересчете на молекулу) при вертикальной ориентации белка примерно в 1.5
раза меньше по сравнению со статистическим распределением молекул на
поверхности. Этот факт, по-видимому, является одной из причин снижения
скорости адсорбции и увеличения “лаг-фазы” на кривой развития поверхностного
давления в присутствии 10 об. % этанола (рис. 3.28Б). Образование
пространственно
ориентированного
белкового
слоя
при
адсорбции
на
поверхности вода-воздух можно рассматривать как альтернативный путь
частичной денатурации адсорбированных молекул. Один из этих двух путей
реализуются в зависимости от условий адсорбции. Например, если в водном
растворе при низкой концентрации белка адсорбция приводит к частичной
денатурации белка и ограничению его подвижности, то при адсорбции из
высоких концентраций белка, а также в системе вода-этанол, молекулы ОВА
132
принимают вертикальную ориентацию на поверхности. В первом случае это
связано с отсутствием необходимого пространства для конформационных
перестроек, а во втором - с образованием более жесткой и компактной
конформации белка в системе вода-этанол по сравнению с водным раствором
(как было продемонстрировано методами КД-спектроскопии и TRFA).
В отличие от свободного ОВА в системе вода-этанол, в присутствии пектина
образования пространственно ориентированного слоя белка не наблюдается. В
такой системе межмолекулярные взаимодействия в белке подавлены за счет
образования структуры комплекса, в которой каждая молекула белка окружена
участком пектина, и таким образом, пространственно отделена от других молекул
белка. Действие этанола проявляется в данном случае в том, что он усиливает
белок-ПЭ взаимодействия, что делает структуру комплекса более жесткой и
конденсированной. Образование максимально сконденсированной структуры
белок-ПЭ комплекса, в котором белок практически неподвижен, существенно
замедляет процессы обмена и установления равновесия между адсорбционным
слоем и субфазой, что, по-видимому, являются основной причиной наблюдаемого
резкого снижения скорости развития поверхностного давления в присутствии
пектина (а именно, увеличению индукционного периода адсорбции с 25 минут до
3 часов), (рис. 3.28Б).
С другой стороны, комплексообразование белка с ПЭ влияет также на
адсорбционные свойства ПЭ. Так, свободный пектин не обладает поверхностной
активностью, а взаимодействие с белком (в условиях насыщения ПЭ белком)
приводит к компенсации большей части зарядов на ПЭ и главное, к образованию
компактной структуры, что позволяет получать ПЭ-содержащие поверхностные
слои, которые обладают принципиально другими (и главное, контролируемыми)
реологическими свойствами по сравнению со свойствами белковых пленок.
133
Таким образом, представленные в книге новые современные методы
исследования структурно-динамических свойств белков в коллоидных системах:
методы разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии и инфракрасной
спектроскопии в режиме внешнего отражения, соответственно ER-TRFA и
IRRAS, а также метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS)
позволяют получать детальную информацию о структуре и функциональных
свойствах
биомолекул
в
гетерогенных
и
микрогетерогенных
системах.
Применение данных методов открывает чрезвычайно широкие возможности для
исследования на молекулярном уровне механизмов адсорбции белков и других
биомолекул на поверхностях раздела фаз, включая флюидные поверхности, водавоздух
и
вода-масло
и
открывает
пути
целенаправленной
регуляции
адсорбционных свойств белков и реологических свойств ленгмюровских пленок
образованных биологическими молекулами. Разработанные подходы открывают
принципиально новые возможности для изучения молекулярных механизмов
функционирования биомолекул в клетках, а также имеют практическую ценность
для разработки новых препаратов медицинского назначения.
134
ЛИТЕРАТУРА
1. Wierenga P. A., Meinders M. B. J., Egmond M. R., Voragen F. A. G. J., de
Jongh H. H.J. Protein exposed hydrophobicity reduces the kinetic barrier for
adsorption of ovalbumin to the air-water interface. //Langmuir 2003, 19, (21),
8964-8970.
2. Wierenga P.A., Meinders M.B.J., Egmond M.R., Voragen A.G.J., de Jongh
H.H.J. Quantitative description of the relation between protein net charge and
protein adsorption to air-water interfaces. //Journal Of Physical Chemistry B
2005, 109, (35), 16946-16952
3. Meinders M.B.J., De Jongh H.H.J. Limited conformational change of
betalactoglobulin when adsorbed at the air-water interface. //Biopolymers
2002. 67, (4-5), 319-322
4. Wierenga P.A.; Egmond M.R.; Voragen A.GJ.; de Jongh H.H., The adsorption
and unfolding kinetics determines the folding state of proteins at the air-water
interface and thereby the equation of state. //Journal Of Colloid And Interface
Science 2006. 299, (2), 850-857
5. Cohen Stuart M.A., Norde W., Kleijn J.M., van Aken G.A. Formation and
properties of adsorbed protein films: importance of conformational stability. In
FoodColloids: interaction, microstructure and processing, Dickinson, E., Ed.
The Royal Society of Chemistry: Cambridge, 2005. pp 99-119
6. Lad M.D., Birembaut F., Matthew J.M., Frazier R.A., Green R.J. The adsorbed
conformation of globular proteins at the air/water interface. //Physical
Chemistry Chemical Physics 2006, 8, (18), 2179-2186
7. Martin A.H., Meinders M.B.J., Bos M.A., Stuart M.A.C., van Vliet T.
Conformational aspects of proteins at the air/water interface studied by infrared
reflection absorption spectroscopy. //Langmuir 2003, 19, (7), 2922-2928
8. Fainerman V.B., Lucassen-Reynders E.H., Miller R., Description of the
adsorption behaviour of proteins at water/fluid interfaces in the framework of a
135
two-dimensional solution model. // Advances In Colloid And Interface Science
2003, 106, 237-259
9. de Feijter J.A., Benjamins J., Soft-Particle Model Of Compact Macromolecules
At Interfaces. //Journal Of Colloid and Interface Science 1982. 90. (1). 289292.
10.Dickinson E. Adsorbed protein layers at fluid interfaces: interactions, structure
and surface rheology. //Colloids And Surfaces B-Biointerfaces 1999. 15, (2),
161-176
11.Martin A. H., Grolle K., Bos M.A., Cohen Stuart M. A., van Vliet T. Network
forming properties of various proteins adsorbed at the air/water interface in
relation to foam stability. //Journal of Colloid and Interface Science. 2002, 254,
(1), 175-183
12.Graham, D. E.; Phillips, M. C., The Conformation of Proteins at the Air/Water
Interface and their role in Stabilizing Foams. In Foams, Akers, R. J., Ed.
Academic Press: London, 1976; p 237.
13.Измайлова В.Н., Ямпольская Г.П., Сумм Б.Д. Поверхностные явления в
белковых системах. М.: Химия, 1998, с. 240.
14.Beverung C.J., Radke C.J., Blanch H.W. Protein adsorption at the oil-water
interface: characterization of adsorption kinetics by dynamic interfacial tension
measurements // Biophysical Chemistry. 1999. 81. 59-80.
15.de Feijter J A.; Benjamins J.; Veer, F.A., Ellipsometry As A Tool To Study
Adsorption Behavior Of Synthetic And Biopolymers At Air-Water-Interface.
//Biopolymers 1978, 17, (7), 1759-1772
16.Elwing H, Protein absorption and ellipsometry in biomaterial research
//Biomaterials, 1998 19,(4-5), 397-406
17.Benjamins .JW, Thuresson K, Nylander T. Ellipsometry studies of nonionic
surfactant adsorption at the oil--water interface. //Langmuir. 2005 4; 21(1):14959.
18.Benjamins JW. New experimental setup to use ellipsometry to study liquidliquid and liquid-solid interfaces. // Langmuir (2002) 18 (16): 6437-6444.
136
19.Dickinson E., Horne D.S., Phipps J.S., Richardson R.M.. A neutron reflectivity
study of the adsorption of -casein at fluid interfaces. // Langmuir 1993. 9.
242-248.
20.Harzallah B., Aguié-Béghin V., Douillard R, Bosio L.. A Structural study of casein adsorbed layers at the air-water interface using X-ray and neutron
reflectivity. // International Journal of Biological Macromolecules 1998. 23:7384
21.Atkinson P.J., Dickinson E., Horne D.S., Richardson R.M. Neutron
Reflectivity of Adsorbed Beta-Casein And Beta-Lactoglobulin At The
Air/Water Interface. //Journal Of The Chemical Society-Faraday Transactions
1995, 91, (17), 2847-2854
22.Ganzevles R.A., Fokkink R, van Vliet T., Martien A. Stuart C, de Jongh1
H.H.J. Structure of mixed b-lactoglobulin/pectin adsorbed layers at air/water
interfaces; a spectroscopy study // J Colloid Interface Sci. 2008; 317(1). 137147.
23.Horne D.S., Atkinson P.J., Dickinson E., Pinfield V.J., Richardson R.M.
Neutron reflectivity study of competitive adsorption of beta-lactoglobulin and
nonionic surfactant at the air-water interface. // International Dairy Journal
1998. 8:73-77
24.Lu J.R., T.J. Su, R.K. Thomas, J. Penfold, J. Webster. Structural conformation
of lysozyme layers at the air/water interface studied by neutron reflection. //
Journal Of The Chemical Society Faraday Transactions. 1998. 94. 3279-3287.
25.Lu J.R., Thomas R.K. Neutron reflection from wet interfaces. // Journal Of The
Chemical Society Faraday Transactions 1998. 94. 995-1018.
26.Ren Y., Meuse, CW, Hsu, S.L. // J Phys Chem. 1994. 98: 8424-8430.
27.Gunning, AP, Wilde PJ, Clark DC, Morris VJ, Parker ML, Gunning PA.
Atomic Force Microscopy of Interfacial Protein Films. // J. Colloid Interface
science 1996. 183, 600–602
28.Waner MJ, Gilchrist M, Schindler M, Dantus M. // J Phys Chem B. 1998. 102:
1649-1657.
137
29.Ortega V. Tengvall P., Lundstorm. Molecular packing of HAS, IgG and
fibrinogen adsorbed on silicon by AFM imaging. //Thin Solid Films 1998. 324.
257-273.
30.Sterchi E.E., Stocker W. Proteolytic enzymes. Tools and targets. Berlin:
Springer Lab. Manual, 1999. P. 12–13.
31.Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., and Ruysschaert, J.M. Determination of
Soluble and Membrane Protein Structure by Fourier Transform Infrared
Spectroscopy. Hilderson, H. J. and Ralston, G. B. Subcellular Biochemistry
(23), 329-450. 1994. New York and London, Plenum Press. Physicochemical
Methods in the Study of Biomembranes. Harris, J. R. (GENERIC).
32.Goormaghtigh E, Raussens V, Ruysschaert J.M. Attenuated total reflection
infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes.//
Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1422. P. 105-185.
33.Barth A. Infrared spectroscopy of proteins. //Biochim Biophys Acta. 2007;
1767(9):1073-101
34.Manning MC. Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and
stability. // Expert Rev Proteomics. 2005 2(5):731-43. Review
35.Meinders M.B.J., van den Bosch G.G.M., de Jongh H.H.J. Molecular
properties of proteins at and near the air/water interface from IRRAS spectra of
protein solutions. // Eur. Biophys. J. (2001) 30: 256-267
36.Venyaminov S.Y., Kalnin N.N. Quantitative IR spectrophotometry of peptide
compounds in water (H2O) solutions. I. Spectral parameters of amino acid
residue absorption bands // Biopolymers. 1990. Vol. 30. P. 1242-1257.
37.Dong A., Meyer J.D., Brown J.L., Manning M.C., Carpenter J. F. Comparative
Fourier Transform Infrared and Circular Dichroism spectroscopic analysis of
a1l-proteinase inhibitor and ovalbumin in aqueous solution. // Arch. Biochem.
Biophys. (2000) 383: 148-155
38.Holzbaur I.E., English A.M., Ismail A. FTIR Study of the Thermal
Denaturation of Horseradish and Cytochrome c Peroxidases in D2O.
Biochemistry 1996, 35, 5488-5494
138
39.Vinogradov, A.A., Kudryashova, E.V., Levashov, A.V. and van Dongen,
W.M.A.M. Solubilization and refolding of inclusion body proteins in reverse
micelles. // Anal Biochem. 2003. 320, 234-8.
40.Adams, J., Kelso, R., Cooley, L. The kelch repeat superfamily of proteins:
propellers of cell function. // Trends Cell Biol. 2000. 10, 17-24.
41.Baekmark T.R., Wiesenthal T., Kuh P., Albersdorfer A., Nuyken, O., Merkel,
R. //Langmuir 1999. 15: 3616-3626.
42.Mendelsohn R., Flach C.R. Infrared reflection-absorption spectroscopy of
lipids, peptides, and proteins in aqueous monolayers // Current Topics in
Membranes, 2002, Vol. 52, 57-88
43.Flach C.R., Brauner J.W., Taylor J.W., Baldwin R.C., Mendelsohn R. External
reflection FTIR of peptide monolayer films in situ at the air/water interface:
experimental design, spectra-structure correlations, and effects of hydrogendeuterium exchange.//Biophys. J. 1994. 67: 402-410.
44.Cornut I., Desbat B, Turlet J.M., Dufourcq J. 1996. In situ study by
polarization modulated Fourier transform infrared spectroscopy of the structure
and orientation of lipids and amphipathic peptides at the air-water interface. //
Biophysical Journal 70:305-312.
45.Ulrich W.P. Vogel. H. Polarization-modulated FTIR spectroscopy of
lipid/gramicidin monolayers at the air/water interface. //Biophysical Journal
1999. 76.
46.Buffeteau T., Blaudez D., Pere E., Desbat B. Optical constant determination in
the infrared of uniaxially oriented monolayers from transmittance and
reflectance measurements. // Journal Of Physical Chemistry B 1999. 103.
5020-5027.
47.Dickinson, E., D.S. Horne, and R.M. Richardson. Neutron reflectivity study of
the competitive adsorption of beta-casein and water-soluble surfactant at the
planar air-water interface. // Food Hydrocolloids 1993.7. 497-505.
48.Kudryashova E.V., Gladilin A.K., Vakurov A.V., Heitz F., Levashov A.V.,
Mozhaev
V.V.
Enzyme-polyelectrolyte
139
cоmplexes
in
water-cosolvent
mixtures. Negatively charged groups artificially introduced into
-
chymotrypsin provide additional activation and stabilization effects. //
Biotechnology & Bioengineering. 1997. V. 55. P. 267–277.
49.Ren Y., Shoichet, M.S., McCarthy, T.J., Stidham, H.D., Hsu, S.L. //
Macromolecules 1995. 28: 358-364.
50.Saccani J., Buffeteau T., Desbat B., Blaudez D. Increasing detectivity of
polarization modulation infrared reflection-absorption spectroscopy for the
study of ultrathin films deposited on various substrates. // Appl Spectrosc.
2003; 57(10):1260-1265.
51.Wu F., Flach, C.R., Seaton, BA., Mealy, TR., Mendelsohn, R. Stability of
annexin V in ternary complexes with Ca2+ and anionic phospholipids: IR
studies of monolayer and bulk phases. //Biochemistry. 1999. 38: 792-799.
52.Pastrana RB, Taneva S., Keough, KMW, Mautone, AJ, Mendelsohn, R
Biophys J. 1995. 69: 2531-2540
53.de Jongh H., Meinders Marcel B.J., Proteins at air-water interfaces studied
using external reflection circular dichroism //Spectrochimica Acta Part A.
2002. 58 3197-3204
54.Суслов А.А.,. Чижик С.А. Сканирующие зондовые микроскопы (обзор) //
Материалы, Технологии, Инструменты 1997. Т.2 №3, С. 78–89.
55.Lakowicz J.R. // Principles of Fluorescence Spectroscopy (2-nd Ed.). N.Y.:
Plenum Press 1999.
56.Visser A.J.W.G., Van der Berg P., Visser N., Van Hoek A., Van den Burg H.
A., Parsonage D., Claiborn A. // J. Phys. Chem. B. 1998. Vol. 102. P. 1043110439.
57.Visser A.J.W.G., Vos K., Santema J.S., Bouwstra J., Van Hoek A. //
Photochem. Photobiol. 1987. Vol. 46. P. 457-461
58.Кудряшова E.В., Гладилин A.K., Левашов A.В. Белки (ферменты) в
надмолекулярных ансамблях: исследование структурной организации
методом разрешенно-временной анизотропии. // Усп. биол. химии. 2002.
Т. 42. С. 257–294.
140
59.Dorovska-Taran V.N., Veeger C,. Visser A.J.W.G. Reverse micelles as a
water-property-control system to investigate the hydration/activity relationship
of alpha-chymotrypsin //Eur. J. Biochem. 211 (1993) 47-55.
60.Kudryashova E.V., Gladilin A.K., Izumrudov V.A., van Hoek A., Visser
A.J.W.G., Levashov A. V. Formation of Quasi-Regular Compact Structure of
Poly(methacrylic acid) upon an Interaction with Chymotrypsin // Biochim.
Biophys. Acta. 2001. V. 1550. P. 129–143
61.Vos K., Laane C., Van Hoek A., Veeger C., Visser A.J.W.G. Spectroscopic
properties of horse liver alcohol dehydrogenase in reversed micellar
solutions.// Eur. J. Biochem. 1987. Vol. 169. P. 275-282
62.Haugland R.P., L. Stryer, in: G.N. Ramachandran (Ed.) Conformation of
Biopolymers, Academic Press, New York, 1967, pp. 321.
63.Datema KP, Visser AJ, van Hoek A, Wolfs CJ, Spruijt RB, Hemminga MA.
Time-resolved
tryptophan
fluorescence
anisotropy
investigation
of
bacteriophage M13 coat protein in micelles and mixed bilayers. //
Biochemistry. 1987. Vol. 26. P. 6145-6152.
64.Broos J., Visser A.J.W.G., Engbersen J.F.J., Verboom W., van Hoek A.,
Reinhoudt D.N.. Flexibility of enzymes suspended in organic solvents probed
by time-resolved fluorescence anisotropy. Evidence that enzyme activity and
enantioselectivity are directly related to enzyme flexibility. //J. Am. Chem.
Soc., 1995, v. 117, p. 12657-12663
65.Гладилин А.К., Левашов А.В. Катализ надмолекулярными ферментполимерными комплексами (ассоциатами) в органических средах. //
Успехи Биол. Хим., 1996. T.36. C. 161-141.
66.Khmelnitsky Yu.L.,Van Hoek. A., Veeger C., Visser A.J.W.G. // J. Phys.
Chem. 1989. Vol. 93. P. 872-878
67.Schauerte J.A., Schlyer B.D., Steel D.G., Gafni A. Nanosecond time-resolved
circular polarization of fluorescence: study of NADH bound to horse liver
alcohol dehydrogenase. // PNAS USA 1995. Vol. 92. P. 569-573
141
68.Digris A.V., Skakoun V.V., Novikov E.G., Van Hoek A., Claiborne A., Visser
A.J.W.G. Thermal stability of a flavoprotein assessed from associative analysis
of polarized time-resolved fluorescence spectroscopy. // Eur. Biophys. J. 1999.
Vol. 28. P. 526-531.
69.Holowka D., Wensel T, Baird B. A nanosecond fluorescence depolarization
study on the segmental flexibility of receptor-bound immunoglobulin E. //
Biochemistry. 1990. Vol. 29. P. 4607-4612
70.Chee C.K., Rimmer S., Soutar I., Swanson L. Time-resolved fluorescence
anistropy studies of the temperature induced intramolecular conformational
transition of poly(N-isopropylacrylamide) in dilute aqueous solution// Polymer,
Comms. 1997. 38, 483-486
71.Hess S.T., Huang S., Heikal A.A., Webb W.W. Biological and chemical
applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. //Biochemistry
2002.41: 697-705.
72.Medina MA, Schwille P. Fluorescence correlation spectroscopy for the
detection and study of single molecules in biology. // Bioessays. 2002. 24(8).
758-764.
73.Hink M.A., van Hoek A., Visser A.J.W.G. Dynamics of phospholipid
molecules in micelles: characterization with fluorescence correlation
spectroscopy and time-resolved fluorescence anisotropy. //Langmuir 1999. 15:
992-997
74.Benjamins J., Lyklema J., Lucassen-Reynders E.H., Compression/expansion
rheology of oil/water interfaces with adsorbed proteins. Comparison with the
air/water surface. //Langmuir 2006, 22, (14), 6181-6188.
75.Stein P.E., Leslie A.G.W., Finch J.T., Carell, R.W. Crystal structure of
uncleaved ovalbumin at 1.95 Å resolution. // J. Mol. Biol. 1991. 221: 941-959.
76.E.V. Kudryashova, M.B.J. Meinders, A.J.W.G. Visser, A. Hoek, H.H.J. de
Jongh. Structural properties and rotational dynamics of egg white ovalbumin
adsorbed at the air/water interface. 2003. Eur. Biophys. J, 32. 553-562.
77.Born, M.A. and E. Wolf. Principles of optics. 1975.Pergamon Press, Oxford,
142
78.Bardwell J.A., Dignam M.J. Extensions of the Kramers-Kronig transformation
that cover a wide range of practical spectroscopic applications. // Journal Of
Chemical Physics 1985. 83. 5468-5478.
79.Yamamoto K., Ishida H. Optical theory applied to infrared spectroscopy.
Vibrational Spectroscopy. 1994. 8. 1-3.
80.Bertie, J.E., M. Khalique Ahmed, and H.H. Eysel. 1989. Infrared Intensities of
liquids. 5. Optical and dielectric constants, integrated intensities and dipole
moment derivatives of H2O and D2O at 22 °C. Journal Of Chemical Physics
93:2210-2218.
81.Creighton, T.E. 1996. Proteins in Solution and in Membranes. In Proteins,
Structures and Molecular Properties. T.E. Creighton, editor. W.H. Freeman and
Company, New York, 262-266.
82.Eastoe J., Dalton J.S. Dynamic surface tension and adsorption mechanisms of
surfactants at the air/water interface. Adv. Colloidal and Interface Sci. 2000.
85: 103-144
83.de Feijter J.A., and Benjamins J. Adsorption kinetics of proteins at the airwater interface. In Food emulsions and foams. 1987. E. Dickinson Ed; Royal
Society of Chemistry London, United Kingdom,
84.Gibbs S.J., Chu, A.S., Lightfoot E.S., Root T. Ovalbumin diffusion at low
ionic strength. // J. of Phys. Chem. 1991. 95: 467-471
85.Broenrsen K, Voragen A.G.J., Hamer R., de Jongh H.H.J. Glycoforms of betalactoglobulin with improved thermostability and preserved structural packing.
//Biotechnology & Bioengineering. 2004. 86 (1), 78-87.
86.E.V. Kudryashova, A.J.W.G. Visser, A. Hoek, H.H.J. de Jongh. Molecular
details of ovalbumin-pectin complexes at the air/water interface: a
spectroscopic study. Langmuir. 2007. 23(15). 7942-7950.
87.H.H.J. de Jongh, H.A. Kosters, E.V. Kudryashova, M.B.J. Meinders, D.
Trofimova, P.A. Wierenga. Protein adsorption at air-water interface: a
combination of details. 2004. Biopolymers. 74. 131-135.
143
88. Brand L., Knutson J.R., Davenport L., Beechem J.M., Dale R.E., Walbridge
D.G., Kowalczyk A.A. Time-resolved Fluorescence spectroscopy: some
applications of associative behavior to studies of proteins and membrane. In
Spectr oscopy and the dynamics of molecular biological systems. P.M. Bayley
and R.E. Dale, editors. Acad. Press. London: (1985) pp. 259-305
89.Szabo A. Theory of fluorescence depolarization in macromolecules and
membranes.// J. Chem. Phys. (1984) 81: 150-167.
90.Harvey S.C., Cheung H.C. Fluorescence depolarization studies on the
Flexibility of Myosin Rod. // Biochemistry. (1977) 16: 5181-518
91.Kudryashova E.V., Visser A.J.W.G., de Jongh H.H.J. Reversible selfassociation of ovalbumin at air-water interfaces and the consequences for the
exerted surface pressure. 2005. Protein Science. 14(2). 483-493.
92.Kudryashova E.V., de Jongh H.H.J. Modulation of the adsorption properties of
the complex of egg white ovalbumin with pectin by the dielectric constant. J.
Coll. Int. Sci. 2007, 318(2). 430-439.
93.88 E.V. Kudryashova, A.J.W.G. Visser, A. Hoek, H.H.J. de Jongh. Molecular
details of ovalbumin-pectin complexes at the air/water interface: a
spectroscopic study. Langmuir. 2007. 23(15). 7942-7950.
144
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БТНА - п-нитроанилид N-бензоил-L-тирозина
ИК – инфракрасная спектроскопия
КД – спектроскопия кругового дихроизма
ММР – молекулярно-массовое распределение
ОВА – овальбумин из куриного яйца
ПА – полианион
ПАВ - поверхностно активное вещество
ПАК – полиакриловая кислота
ПК - поликатион
ПМА - полиметакриловая кислота
ПЭ - полиэлектролит
Т-ОВА – термоденатурированный овальбумин
ФАД – флавинаденин динуклеотид
ХТ – a-химотрипсин
ADT - автоматическая капельная тензиометрия
FCS – флуоресцентная корреляционная спектроскопия
FTIR-ATR – метод ИК-спектроскопии Фурье в режиме нарушенного полного внутреннего
отражения
Fusgalox - галактозооксидаза из Fusarium
β-lg - β-лактоглобулин из молока
IRRAS – ИК спектроскопия в режиме внешнего отражения (инфракрасная рефлекционноабсорбционная спектроскопия)
Sagalox –галактозооксидаза из Stigmatella aurantiaca
TRFA – разрешенно-временная флуоресцентная спектроскопия
ER-TRFA – разрешенно-временная флуоресцентная спектроскопия в режиме внешнего
отражения
145